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BRPI0720468A2 - Construtos de ácido nucleico e métodos para alterar o comprimento da fibra da planta e/ou a altura da planta - Google Patents

Construtos de ácido nucleico e métodos para alterar o comprimento da fibra da planta e/ou a altura da planta Download PDF

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BRPI0720468A2
BRPI0720468A2 BRPI0720468-0A BRPI0720468A BRPI0720468A2 BR PI0720468 A2 BRPI0720468 A2 BR PI0720468A2 BR PI0720468 A BRPI0720468 A BR PI0720468A BR PI0720468 A2 BRPI0720468 A2 BR PI0720468A2
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BR
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Prior art date
Application number
BRPI0720468-0A
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English (en)
Inventor
Paulo Arruda
Isabel Rodrigues Gerhardt
Original Assignee
Alellyx Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Alellyx Sa filed Critical Alellyx Sa
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONSTRU- TOS DE ÁCIDO NUCLEICO E MÉTODOS PARA ALTERAR O COMPRI- MENTO DA FIBRA DA PLANTA E/OU A ALTURA DA PLANTA".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US 60/871.048, depositado em 20 de dezembro de 2006, cujo teor é aqui incor- porado a título de referência, na íntegra.
CAMPO DE INVENÇÃO
A presente invenção refere-se aos campos de biologia molecular e alteração de expressão gênica em plantas transformadas. Mais especifi- camente, esta invenção refere-se à modificação do comprimento da fibra e/ou altura d planta de interesse industrial por regulação da expressão de genes que codificam cinases associadas à parede (WAKSs). ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A demanda crescente por produtos de madeira e produtos deri- vados de madeira constitui um problema de proporção global. É estimado que a taxa sustentável máxima de colheita das florestas no mundo já tenha sido alcançada. Assim, há uma necessidade iminente por mais plantas le- nhosas, bem com uma necessidade de desenvolver métodos para aumentar as propriedades agronômicas das plantas florestais, tais como altura da planta aumentada, produção da biomassa aumentada, comprimento de fibra do xilema mais longo. Por exemplo, a uniformidade e resistência da fibra são exigências comuns na maioria dos usos industriais. Na fabricação da polpa, as características de resistência são determinadas em parte pelo compri- mento da fibra. Fibras longas são ideais para produção de papel forte, au- mento do rendimento de polpa, e redução do consumo de álcali, devido as suas propriedades de resistência e ligantes.
Como um exemplo da importância das plantas lenhosas, pode- se mencionar os eucaliptos que representam as maiores fontes de fibras usadas globalmente na indústria de papel (Bamber, 1985, Appita 38: 210- 216). Há uma estimativa de dez a quinze milhões de hectares de terra plan- tados com eucalipto. Verhaegen e Plomion, 1996, Genome 39: 1051-1061. A maior vantagem do eucalipto é o seu crescimento rápido e capacidade de crescer em uma ampla faixa de condições, tanto tropicais como temperadas. As fibras de eucalipto têm, contudo, uma desvantagem em comparação com as fibras de outras fontes, como o pinheiro, que é seu comprimento signifi- 5 cantemente mais curto. Assim, os papéis que são feitos de polpa de eucalip- to são frequentemente fracos e requerem usualmente reforço com fibras mais longas de outras fontes, aumentando os custos de produção.
O comprimento da fibra é controlado por regulação endógena do alongamento da célula, um processo que resulta da interação entre a pres- são de turgescência interna e a resistência mecânica da parede celular, mas seu mecanismo e genes envolvidos não foram ainda totalmente compreen- didos.
Células de fibras de xilema se desenvolvem de iniciais fusifor- mes já bastantes alongadas localizadas dentro do câmbio vascular. Elas 15 aumentam de diâmetro por extensão de suas paredes radiais, e, além disso, desenvolvem células de fibras que se alongam por crescimento da ponta intrusiva, o que resulta em até um aumento de várias vezes o comprimento da célula. Gray-Mitsumune et al., 2004, Plant PhysioL 135: 1552-1564.
Em célula de crescimento de ponta, a expansão ocorre em uma 20 área pequena da superfície da célula, que resultar em células tubulares, a- longadas. Por exemplo, as fibras do choupo se alongam intrusivamente na zona de expansão radial no xilema, alcançando 150% de seu comprimento celular inicial em média quando integralmente diferenciado, Hussey et al., 2006, Annu. Rev. Plant BioL 57: 109-125; Mellerowicz et al., 2001, Plant MoL 25 Biol. 47: 239-274.
A rápida expansão de células de fibra pode ser obtida por ação orquestrada da pressão contra a parede celular exercida por turgescência e afrouxamento da parede celular. Em fibras de algodão, a fase de alonga- mento celular segue uma elevação significante de turgescência, resultado do 30 acúmulo observado de malato, açúcares, e K+, o principal osmótico, logo o influxo de água e a geração de alta turgescência nas células da fibra. Ruan et al., 2004, Plant Physiol. 136: 4104-4113. Invertases vacuolares têm um papel importante na manutenção da turgescência e expansão da parede celular. Um trabalho recente na Ara- bidopsis thaliana mostrou que uma cinase associada à parede (WAK) pode regular uma invertase vacuolar estabelecendo assim uma ligação compor- 5 tamental cruzada entre WAK e as invertase(s) vacuolar(es). Kohorn et al., 2006, Plant J. 46: 307-316.
As WAKs na Arabidopsis são codificadas por cinco genes fir- memente ligados e altamente similares, e são expressos nas folhas, meris- temas, e nas células que passam por expansão. Wagner e Kohorn, 2001, Plant Cell 13: 303-318.
Semeaduras mutantes da Arabidopsis thaliana apresentando uma inserção de T-DNA no gene da WAK2 eram significantemente mais cur- ta que as plantas do tipo selvagem, com as raízes mais afetadas que os hi- pocótilos. Kohorn et al., 2006, Plant J. 46: 307-316.
Essas plantas mutantes mostraram uma atividade de invertase
vacuolar reduzida em 62%, e os autores propuseram que a WAK 2 regula a transcrição da invertase vacuolar como um constituinte de um mecanismo regulador das concentrações do soluto e da regulação de turgescência, pro- porcionando, assim, um mecanismo possível para WAK para regular a ex- pansão celular.
A expressão de uma WAK2 antissentido induzível na Arabidop- sis levou a uma redução de 50% nos níveis de proteína WAK, com perda subsequente de alongamento celular e logo a plantas anãs. Resultados simi- lares reportados quando um gene WAK4 foi usado para reduzir os níveis 25 totais de proteína WAK. Wagner e Kohorn, 2001, Plant Cell 13: 303-318; Lal- Iy et al., 2001, Plant Ce//13: 1317-1331.
Sabe-se que as cinases associadas à parede contêm domínios extracelulares que podem estar ligadas às moléculas de pectina da parede celular, englobar a membrana plasmática e ter um domínio de cinase cito- plasmática de serina/treonina. He et al. 1999, Plant Mol. Biol. 39: 1189-1196.
Quando as fibras são submetidas a alongamento significante em ambas as extremidades (crescimento de ponta intrusivo), as propriedades do limite de lamela média deste tipo de crescimento celular. Lamelas médias de células de madeira em desenvolvimento são ricas em pectinas, e o cresci- mento de ponta intrusivo requer a dissolução da lamela média. Vide Berthold et al., WO 2006/068603.
5 Por sua ligação de pectina, é possível que as WAKs possam
detectar uma alteração no ambiente da parede celular, proporcionado assim um mecanismo molecular que ligar a parede celular detectando a regulação do metabolismo do soluto, que, por sua vez, sabe-se que está envolvido na manutenção da turgescência e da expansão celular nas células em cresci- 10 mento. Tal informação pode ser inestimável para o ajuste da expansão celu- lar ou turgescência. Huang et al., Funcional Plant Biology, 34: 499-507.
As características das fibras são controladas por um conjunto complexo de fatores genéticos e não são facilmente tratáveis por métodos de multiplicação clássica. Através da geração de árvores lenhosas tradicio- nais, é possível obter alguma modificação das características das fibras, Por exemplo, híbridos triplóides interespecíficos do choupo têm sido desenvolvi- dos com fibras mais longas que as espécies parentes. Aziz et al., 1996, Wo- od and pulp properties of aspen and its hybrids. TAPPI Proc. Pulping Confe- rence. p. 437-443. Ainda, considerando a desvantagem da multiplicação de árvores lenhosas tradicionais, tal como o progresso lento devido aos seus períodos longos de geração e a dificuldade de se produzir uma planta com uma característica desejável, os desenvolvimentos de tecnologia gênica po- dem reduzir de modo significante o tempo requerido para produzir uma nova variedade e possibilitar o alvejamento mais próximo das características con- sideradas desejáveis pelas indústrias florestais e de polpa em espécies de árvores específicas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a invenção proporcionar um construto de ácido nucleico que compreende uma seqüência de polinucleotídeos de WAK Iiga- da operavelmente a um promotor de preferido de xilema que causa a super- expressão da dita seqüência de polinucleotídeos de WAK. Em uma modali- dade, a promotor preferido de xilema é selecionado do grupo que consiste em promotor de gene TUB1 promotor de gene SuSy1 promotor de gene COMT e promotor de gene C4H. Em uma outra modalidade, uma planta transgênica compreende o construto de ácido nucleico e a planta tem um aumento do comprimento da fibra e/ou altura em comparação com uma 5 planta não-transgênica da mesma espécie. Em outras modalidades, a planta é uma dicotiledônea, monocotiledônea, gimnoesperma, ou árvore de madei- ra de lei. A invenção contempla ainda a progênie da planta transgênica, bem como a polpa de madeira e a fibra de madeira produzidas da planta transgê- nica.
Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método para
aumentar o comprimento da fibra e/ou a altura da planta, compreendendo: (a) introduzir em uma célula de planta um construto de ácido nucleico que compreende uma seqüência de polinucleotídeos de WAK ligada operavel- mente a um promotor preferido de xilema que causa superexpressão da dita
seqüência de polinucleotídeos de WAK; (b) cultivar a dita célula da planta sob condições que promovem o crescimento de uma planta; e (c) selecionar uma planta transgênica que tem comprimento de fibra e/ou altura de planta, aumentados; e (c) selecionar uma planta transgênica em comparação com uma planta não-transgênica da mesma espécie.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 ilustra esquematicamente o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção que compreende uma promotor preferido de câmbio/xilema que aciona a expressão de uma se- qüência de nucleotídeos de cinase associada à parede da invenção.
A Figura 2 mostra o comprimento da fibra de várias linhagens
transgênicas transformadas com o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK e as respectivas plantas não-transgênicas. O aste- risco denota os valores de comprimento médios de fibra mais altos estatisti- camente significantes (P<0,05, teste t).
A Figura 3 mostra o comprimento de fibra de dois genótipos de
uma planta transgênica T1 (linhagem 51B) transoformadas com o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção. O asteris- co denota os valores de comprimento médios de fibra mais altos estatistica- mente significantes (P<0,05, teste t).
A Figura 4 mostra o comprimento de fibra de dois genótipos de uma planta transgênica T1 (linhagem 47B) transformada com o vetor de 5 plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção. O asteris- co denota os valores de comprimento médios mais altos estatisticamente significantes (P<0,05, teste t).
A Figura 5 mostra a altura da planta dos três genótipos de uma linhagem transgênica T1 (linhagem 51B) transformada com o vetor de plas- mídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção. O asterisco denota os valores de comprimento médios mais altos estatisticamente signi- ficantes (P<0,05, teste t).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENCAÕ
A presente invenção refere-se a processos para a manipulação genética de comprimento de fibra em plantas e/ou aumento da altura da planta.
A parede celular da planta é uma rede fibrilar forte que da a cada célula sua conformação estável. Para aumentar, as células seletivamente se afrouxam da célula, permitindo que ela ceda às forças expansivas geradas 20 pela pressão de turgescência da célula. Conforme a célula se expande, há uma necessidade aumentada de ajuste compensador da turgescência, que é dependente do metabolismo do soluto da célula.
Uma cinase associada à parede (WAK) pode detectar a expan- são da parede celular por sua ligação à pectina, proporcionando assim um 25 mecanismo para transdução destes sinais aos sistemas que regulam as alte- rações no soluto, conforme descrição acima. Contudo, a trabalho anterior sobre WAKs não previu que a superexpressão de um gene de WAK na plan- ta, em um modo específico de tecido, resulta em alterações significantes do comprimento da fibra, bem como alterações significantes da altura da planta. 30 O resultado abre caminho para modificação das características do compri- mento da fibra, bem como das alterações significativas da altura da planta. O resultado abre caminho para modificar características que são extremamen- te importantes para as indústrias de fibras vegetais, florestais, de polpa, e de papel.
De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcio- nado um método para modificar o comprimento da fibra em tecidos de plan- 5 ta, tais como células de fibra do xilema de angiosperma lenhosa, células tra- queídes de xilema de gimnoesperma, e células de fibras de sementes algo- dão, por controle da atividade da cinase associada à parede. De acordo com esse aspecto da invenção, células de plantas ou plantas inteiras são geneti- camente engenheiradas geneticamente com seqüência de codificação da 10 cinase associada à parede, que, quando expressa em células de fibras xila- res das angiospermas, traqueídes xilares de gimnospermas, ou células de fibras das sementes de algodão, provoca um aumento do comprimento da célula.
Todos os termos técnicos usados aqui são termos comumente usados em bioquímica, biologia molecular e agricultura, e podem ser enten- didos por aquele com conhecimento ordinário na técnica ao qual esta inven- ção. Aqueles termos técnicos podem ser encontrados em: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed„ vol. 1-3, ed. Sambrook e Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience, Nova Iorque, 1988 (com atualizações periódicas); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIO- LOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5a ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. 1-
2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har- bor, N.Y., 1997. Metodologia envolvendo técnicas de biologia de plantas é descrita aqui e descrita em detalhes em tratados tais como METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL, ed. 30 Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995. Várias técnicas usando PCR são descritas por técnicas usando PCR são descritas, por exemplo, por Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego, 1990 e por Dveksler, PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press1CoId Spring Harbor, N. Y., 2003. Pares de primers em PCR podem ser derivados de seqüências conhecidas por 5 técnicas conhecidas, tal como usar programas pretendidos para este propó- sito, por exemplo, Primer, Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biome- dical Research, Cambridge, MA. Métodos para síntese química de ácidos nucleicos são discutidos, por exemplo, por Beaucage and Caruthers, 1981, Tetra. Letts. 22: 1859-1862, e Matteucci e Caruthers, 1981, J Am. Chem. 10 Soc. 103: 3185.
Digestões de enzima de restrição, fosforilações, ligações e trans- formações foram feitas por Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LA- BORATORY MANUAL, 2a ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Todos e materiais usados para o crescimento e manutenção de células bac- 15 terianas foram obtidos da Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl), DIFCO Labo- ratories (Detroit, Ml), Invitrogen (Gaithersburg, MD), ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que de outro modo especificado.
Os termos "codificação" referem-se ao processo pelo qual um gene, através dos mecanismos de transcrição e de tradução, proporciona 20 informação a uma célula do qual uma série de aminoácidos podem ser mon- tada em um seqüência de aminoácidos específica para produzir uma enzima ativa. Devido à degenerescência do código genético, são contempladas cer- tas alterações de base em seqüência de DNA não alteram a seqüência de aminoácidos de uma proteína. Portanto, é entendido que modificações na 25 seqüência de DNA que codifica cinase associada à parede que não afetam substancialmente as propriedades funcionais da proteína.
Nessa descrição, "expressão" denota a produção do produto de proteína codificado por um gene. Alternativamente ou adicionalmente, "ex- pressão" denota a combinação dos processos intracelulares, incluindo trans- 30 crição e tradução, sofridos por uma molécula de DNA codificação tal como um gene estrutural produzir um polipeptídeo. "Superexpressão" refere-se à expressão de uma seqüência de genes particular na qual a produção do mRNA ou polipeptídeo em um organismo transgênico excede os níveis de produção em organismo não-transgênico.
O termo "ácido nucleico heterólogo" refere-se a um ácido nuclei- co, DNA ou RNA, que foi introduzido em uma célula (ou o antepassado da 5 célula) através dos esforços dos humanos. Tal ácido nucleico exógeno pode ser uma cópia de uma seqüência que é naturalmente encontrado na célula na qual foi ele foi introduzido, ou fragmentos destes.
Em contraste, o termo "ácido nucleico endógeno" refere-se a um ácido nucleico, gene, polinucleotídeo, uma molécula de DNA, RNA, mRNA, 10 ou cDNA que está presente em uma planta ou no organismo que é para ser geneticamente engenheirado. Uma seqüência endógena é "nativa" para, isto é, indígena para, a planta ou o organismo que é para ser geneticamente en- genheirado.
O termo "seqüências homólogas" refere-se a seqüências de po- linucleotídeos ou de polipeptídeos que são similares devido à ancestralidade e conservação de seqüências comuns.
O termo "homólogo funcional" refere-se a seqüências de polinu- cleotídeo ou de polipeptídeo que são similares devido à ancestralidade e conservação de seqüências comuns e têm função idêntica ou similar nos níveis catalíticos, celulares, ou em organismos.
Seqüências de Cinase Associadas à Parede
Nessa descrição, o termo "seqüências de polinucleotídeos de cinase associada à parede" denota qualquer ácido nucleico, gene, molécula de DNA, RNA, mRNA, ou de cDNA que codifica um polipeptídeo de cinase 25 associada à parede cuja superexpressão altera o comprimento da fibra e/ou a altura da planta. O DNA ou o RNA pode ser de fita dupla ou de fita sim- ples. DNA de fita simples pode ser a fita de codificação, também conhecida como a fita sentido, o pode ser a fita de não codificação, também chamada de a fita antissentido. Ilustrativos desta categoria são moléculas de polinu- 30 cleotídeos que compreendem SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7 e 9, identificadas da Arabidopsis thaliana e que podem ser empregadas para aumentar o com- primento da fibra e/ou a altura da planta. A seqüência de polinucleotídeo de cinase associada à parede adequada para a presente invenção pode ser identificada de uma miríade de organismos caracterizados pela presença de um gene de WAK. Embora as seqüências de nucleotídeos mencionadas acima estejam descritas aqui, elas não devem ser consideradas como limitações da presente invenção. Assim, uma seqüência de WAK pode ser identificada e funcionalmente anotada por comparação de seqüências. Aquele versado na técnica pode prontamente identificar uma seqüência de WAK em uma base de dados adequada, tal como GenBank, usando programas e parâmetros de análise de seqüências publicamente disponíveis. Alternativamente, a seleção de bibliotecas de cD- NA ou de bibliotecas genômicas empregado sondas de hibridização ade- quadas ou primers com base em DNA ou seqüências de proteínas descritas aqui devem levar à identificação de seqüências de WAK funcionalmente re- lacionadas (homólogo funcional). É também apreciado no campo que as se- quências com níveis reduzidos de identidade podem ser também isoladas com o auxílio de oligonucleotídeos degenerados e metodologia baseada em PCR. Embora os polinucleotídeos da invenção sejam isolados da Arabidop- sis thaliana, os homólogos funcionais de outras plantas podem ser empre- gadas para produzir plantas com comprimento de fibra e/ou altura de planta aumentados. Exemplos de espécies de plantas cujos genes de WAK podem ser isolados incluem dicotiledôneas, tais como Cucurbitaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Papilionaceae tal como alfalfa e Vigna unguiculata, Malvace- ae, Asteraceae, Malpighiaceae 8 tal como Populus, Myrtaceae tal como Eu- calipto, e monocotiledôenas tais como as gramíneas, incluindo arroz, trigo, cana-de-açúcar, cevada e milho.
Nessa descrição, os termos "seqüência de polinucleotídeos de cinase associada à parede", "seqüência de polinucleotídeos de WAK", e "se- qüência de DNA de WAK" referem-se também a qualquer molécula de ácido nucleico com uma seqüência de nucleotídeos capazes de hibridízarem sob 30 condições estringentes com qualquer uma das seqüências descritas aqui, e de codificarem um polipeptídeo com atividade de WAK equivalente à proteí- nas tendo seqüências de aminoácidos descritas aqui sob SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8 ou 10. Os termos incluem também seqüência que hibridizam de modo cruzado com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9, tendo, preferivelmente, pelo menos 65% de homologia ou identidade com uma ou mais das SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 6 ou 9. As seqüências 5 de nucleotídeos da invenção podem codificar uma proteína que seja homó- loga ao produto de gene predito descrito aqui sob qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, ou 10. Ainda, as seqüências de nucleotídeos da invenção incluem aquelas seqüências que codificam uma polipeptídeo de WAK tendo uma seqüências de aminoácidos que tem pelo menos 55%, preferivelmente 10 pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivel- mente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e de maior preferência pelo menos 95% de identidade de seqüência com uma seqüên- cia de aminoácidos descrita aqui sob qualquer uma de SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8 e 10. A degenerescência do código genético permite maiores variações na 15 seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo enquanto a seqüência de aminoácidos da proteína codificada é mantida.
A frase "condições estringentes" aqui diz respeito a parâmetros com os quais a técnica está familiarizada. Polinucleotídeos de fita simples hibridizam quando eles se associada com base em uma variedade de forças físico-químicas bem caracterizadas, tais como ligação de hidrogênio, exclu- são com solvente, e empilhamento de base. A estringência de uma hibridi- zação reflete o grau de identidade da seqüência dos ácidos nucleicos envol- vidos, de modo que quando maior a estringência mais similares são as duas fitas de polinucleotídeo. A estringência é influenciada por uma variedade de fatores, incluindo temperatura, concentração e composição de sais, aditivos orgânicos e inorgânicos, solventes, etc. presentes tanto na hibridização e soluções de lavagem como nas incubações (e número). Aquele com conhe- cimento ordinário da técnica pode selecionar prontamente tais condições variando a temperatura durante a reação de hibridização e o processo da lavagem, a concentração de sal durante a reação de hibridização e o pro- cesso de lavagem, e assim por diante.
Para hibridização de ácidos nucleicos complementares que têm mais que 100 resíduos complementares, em um filtro em Southern ou Nor- thern blot, as condições de hibridização "estringentes" são exemplificadas por uma temperatura que é de cerca de 5°C a 20°C inferiores ao ponto de fusão térmica (Tm) para a seqüência específica, em uma resistência iônica e 5 pH definidos. Tm é a temperatura sob resistência iônica e pH definidos, onde 50% da seqüência alvo hibridiza para uma sonda perfeitamente correspon- dente. Moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições estringen- tes hibridizarão tipicamente para um sonda com base ou no cDNA inteiro ou em porções selecionadas. Mais preferivelmente, "condições estringentes" 10 referem-se aqui aos parâmetros com os quais a técnica está familiarizada, tais como hibridização em 3,3 x SSC, 1 x solução de Denhardt, tampão de fosfato de sódio 25mM (pH 7,0), SDS a 0,5%, e EDTA 2mM, por 18 horas a 65°C, seguido por quatro lavagens do filtro, a 65°C, por 20 minutos, em 2 x SSC e SDS a 0,1%, e uma lavagem final por até 20 minutos em 0,5 x SSC e 15 SDS a 0,1% ou 0,3 x SSC e SDS a 0,1% para maior estringência, e 0,1 x SSC e SDS a 0,1% para uma estringência maior. Outras condições podem ser substituídas desde que o grau de estringência seja igual ao fornecido aqui, usando-se uma lavagem fina com 0,5 x SSC. Para identificação de homólogos menos intimamente relacionados pode ser realizada em uma 20 temperatura inferior, por exemplo, 50°c. Em geral, a estringência é aumenta- da por elevação da temperatura de lavagem e/ou decréscimo da concentra- ção de SSC.
Adicionalmente, a categoria de seqüências de cinase associada à parede, adequadas, incluir uma molécula de ácido nucleico compreendida 25 de uma variante de SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 7 ou 9 com uma ou mais bases deletadas, substituídas, inseridas ou adicionadas, cuja variante codifi- ca um polipeptídeo quando superexpressado resulta na alteração do com- primento de fibra e/ou altura da planta. As "seqüências de base com uma ou mais bases deletadas, substituídas, inseridas, ou adicionadas" referidas aqui 30 são largamente conhecidas por aqueles versado na técnica para reter a ati- vidade fisiológica mesmo quando a seqüência de aminoácidos de uma prote- ína tendo geralmente esta atividade fisiológica tem um ou mais aminoácidos substituídos, deletados, inseridos, ou adicionados. Por exemplo, a cauda de poly A ou as regiões de não-tradução das extremidades 5' ou 3' podem ser deletadas, e as base podem ser deletadas desde que os aminoácidos sejam deletados. As bases podem ser também substituídas desde que não resulte em deslocamento de estrutura. As bases podem ser também "adicionadas" desde que os aminoácidos sejam adicionados. Contudo, é essencial que qualquer de tal modificação não resulte na perda de atividade fisiológica. Um DNA modificado neste contexto pode ser obtido por modificação das se- qüências de base de DNA da invenção de modo que os aminoácidos em sítios específicos sejam substituídos, deletados, inseridos, ou adicionados por mutagênese sítio-específica, por exemplo, Zoller & Smith, 1982, Nucleic Acid Res. 10: 6487-6500. Por conseguinte, o termo "variante" é uma se- qüência de nucleotídeos ou de aminoácidos que desvia do padrão ou dada seqüência de nucleotídeos ou de aminoácidos de um gene ou proteína parti- cular. A variante pode ter alterações "conservativas", em que um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas similares, por exemplo, reposição da Ieucina por isoleucina. Uma variante por ter alterações "não conservativas", por exemplo, reposição de uma glicina por um triptofano. Menores variações análogas podem incluir também deleções ou inserções de aminoácidos, ou ambas. A orientação cujos resíduos de aminoácidos po- dem ser substituídos, inseridos ou deletados pode ser encontrada usando programas de computador bem conhecidos da técnica tal como software Vector NTI Suíte (InforMax, MD). "Variante" pode também se referir a um gene "shuffled", conforme descrito, por exemplo, mas patentes US 6.506.603, US 6.132.970, US 6.165.793 e US 6.117.679.
Um outro modo de obter uma seqüência de DNA de WAK é para sintetizá-la ab initio das bases apropriadas, por exemplo, pelo uso da se- qüência de cDNA apropriada como um molde.
Construtos de Ácido Nucleico A presente invenção inclui construtos recombinantes que com-
preendem uma ou mais seqüências de ácidos nucleicos aqui. os construtos compreendem tipicamente um vetor, tal como um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus (por exemplo, um vírus de planta), um cromossomo artifi- cial bacteriano (BAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), ou simi- lares, nos quais uma seqüência de ácidos nucleicos foi inserida, em uma orientação de avanço ou reversa. Números grandes de vetores adequados 5 são conhecidos e estão comercialmente disponíveis e não precisam ser rei- terados aqui.
Construtos de ácido nucleico recombinantes podem ser feitas usando-se técnicas padrão. Por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos para transcrição pode ser obtida por tratamento de um vetor contendo a dita 10 seqüência com enzimas de restrição para cortar o segmento apropriado. A seqüência de nucleotídeos para transcrição pode ser também gerada por anelamento ou ligação de oligonucleotídeos sintéticos ou pelo uso de oligo- nucleotídeos sintéticos em uma reação em cadeia de polimerase (PCR) para dar sítios de restrição adequados em cada extremidade. A seqüência de nu- 15 cleotídeos é então clonada em vetor contendo elementos reguladores ade- quados, tais como seqüências de promotores a montante e terminadores a jusante. Tipicamente, vetores de transformação de planta incluem uma ou mais seqüências codificação de plantas clonadas (genômico ou cDNA) sob o controle transcricional de seqüências reguladores 5' e 3' e um marcador se- 20 lecionável. Tais vetores de transformação de plantas contêm também tipi- camente um promotor, um sítio de partida de iniciação de transcrição, um sinal de processamento de RNA (tal como seqüências de sinais de união), um sítio de terminação de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação. Inten- sificadores e seqüências de alvejamento podem estar também presentes.
A invenção proporciona moléculas de ácido nucleico que prova-
velmente causam comprimento de fibra e altura de planta alterados em uma planta transformada. Um aspecto importante da presente invenção é o uso de construtos de ácido nucleico, em que uma seqüência de nucleotídeos de codificação de cinase associada à parede está operavelmente ligada a um 30 ou mais promotores, que acionam a expressão da seqüência de codificação de um modo constitutivo ou em certos tipos de células, órgãos, ou tecidos de modo a alterar o comprimento da fibra de uma planta transformada em com- paração com o comprimento da fibra de uma planta não-transgênica.
Promotores de plantas constitutivos adequados, que podem ser úteis para expressar as seqüências de cinase associada à parede, adequa- das, para a presente invenção, incluem, mas sem limitação, o promotor 35S 5 do vírus de mosaico da couve-flor (CaMV), o milho e os promotores de poli- ubiquitina da Populus, que conferem expressão constitutiva de alto nível na maioria dos tecidos de planta (vide, por exemplo, WO 2007/00611, Patente US 5.510.474; Odell etal., Nature, 1985, 313: 810-812); o promotor da sinta- se da nopalina (An et al. 1988, Plant Physiol. 88: 547-552); o promotor de 10 FMV do vírus do mosaico da escrofulária (Patente US 5.378.619) e o promo- tor da sintase da octopina sintase (Fromm et al., Plant Cell 1: 977-984).
O promotor pode ser também selecionado de modo que a ex- pressão ocorre em um ponto de tempo determinado do desenvolvimento da planta, ou em um ponto de tempo determinado por influências externas, ou
em um modo específico de tecido ou preferido de tecido. Por exemplo, pode ser assegura expressão específica e preferida em células de fibra (promoto- res específicos ou preferidos de fibra de algodão, de fibra de xilema, ou de fibra de xilaria).
Promotores específicos ou preferidos de fibra de algodão exem- 20 piares incluem, por exemplo, o promotor de gene CFACT1 de algodão (Pa- tente US 6.995.256); o promotor de gene E6 (Patente US 6.096.950, John et al., 1996, Plant Mo!. Biol. 30: 297-306; John et al., 1996, Proc. Natl Acad. ScL 93: 12768-12773); promotor de gene H6 (John et al., 1995, Plant Physi- ol. 108: 669-676); promotor de gene GhTUBI (Li et al., 2002, Plant Physiol. 25 130: 666-674) e FbL2A (Rinehart et al., 1996, Plant Physiol. 112: 1331-1341 e John et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Set USA 93: 12768-12773).
Promotores preferidos ou específicos do sistema vascular, tais como promotores específicos preferidos de xilema podem ser úteis para efe- tuar a expressão de moléculas de ácido nucleico da invenção, especifica- 30 mente no tecido vascular, especialmente tecido de xilema. Assim, "preferido de xilema" significa que as moléculas de ácido nucleico da presente inven- ção são mais ativos no xilema que em qualquer outro tecido da planta. O promotor selecionado deve provocar a superexpressão da cinase associada à parede, de acordo com a presente invenção, de modo a modificar a com- primento do xilema da célula, para modificar a altura da planta hospedeira, ou ambos.
5 Promotores adequados são ilustrados por, mas sem limitação,
ao promotor do gene de tubulina (TUB) preferido do xilema, o promotor do gene do ácido cafeico 3-O-metiltransferase (COMT), o promotor do gene de sacarose sintase (SuSy), e o promotor de gene de cumarato-4-hidroxilase (C4H) preferido do xilema. Outros promotores preferidos do xilema adequa- 10 dos estão descritos no Pedido de Patente Internacional WO 2005/096805, que a aqui incorporado a título de referência.
Promotores específicos que incluem regiões de nucleotídeos específicos conferindo expressão específica de tecido, ou preferida de teci- do, podem ser também usados, conforme exemplificados por identificação 15 de elementos reguladores dentro dos promotores maiores conferindo ex- pressão preferida de xilema. Seguin et al., 1997, Plant Mol. Biol. 35: 281- 291; Torres-Schumann et al., 1996, Plant J. 9: 283-296; e Leyva et al., 1992, Plant Cell 4: 263-271.
Embora a taxa de expressão gênica seja prontamente modulada pelo promotor, o aperfeiçoamento na expressão pode ser também obtido pela identificação e o uso de seqüências intensificadoras, tais côo porções intrônicas de genes, que elevam o nível de expressão dos genes localizados próximos em uma orientação de modo independente. Nas plantas, a inclu- são de alguns introns nos construtos de gene em um posição entre o promo- tor e a seqüência de codificação de gene leva a aumentos de acúmulo de mRNA e de proteína. Introns conhecidos por elevarem a expressão nas plantas foram identificados em genes de milho, por exemplo, hsp70, tubAI, Adhl, Shl, UbH (Brown e Santino, Patentes US 5.424.412 e US 5.859.347; Jeon et al., 2000, Plant Physiol. 123: 1005-1014; Callis et al., 1987, Genes Dev. 1 :1183-1200; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91 :1575-1579), e em genes de planta dicotiledônea tal como rbcS da petúnia (Dean et al., 1989, Plant Cell 1: 201-208); ST-LSI da batata (Leon et al., 1991, Plant Physiol. 95: 968-972) e UBQ3 (Norris et al., 1993, Plant Moi Biol. 21: 895-906) e PATI da Arabidopsis thaliana (Rose e Last, 1997, Plant J. 11: 455-464).
De acordo com um aspecto da invenção, uma seqüência de ci- nase associada à parede é incorporada em um construto de ácido nucleico 5 que é adequada para transformação de planta. Por conseguinte, os constru- tos de ácido nucleico são proporcionadas compreendendo uma seqüência de cinase associada à parede, sob o controle de uma região de iniciação transcricional operativa em uma planta, de modo que o construto pode gerar RNA em uma célula de planta hospedeira. Preferivelmente, a região de inici- 10 ação transcricional é parte de um promotor vascular ou preferido de xilema, tais como quais daqueles mencionados acima. Tal construto de ácido nuclei- co pode ser usada para modificar a expressão de gene de cinase associada à parede em plantas, conforme descrição acima.
Vetores de expressão podem conter também um marcador de 15 seleção por meio do qual as células transformadas podem ser identificadas na cultura. O marcador pode ser associado à molécula de ácido nucleico, isto é, o gene ligado operavelmente a um promotor. Como usado aqui, o termo "marcador" refere-se a um gene que codifica uma característica ou um fenótipo que permite a seleção de, ou a triagem de, uma planta ou célula 20 contendo o marcador. Nas plantas, por exemplo, o gene de marcador codifi- cará resistência a antibiótico ou a herbicida. Isso permite a seleção de célu- las transformadas dentre as células que não são transformadas ou transfec- tadas.
Exemplos de marcadores selecionáveis adequados incluem a- 25 denosina, desaminase, diidrofolato redutase, higromicina-B-fosfotransferase, timidina cinase, xantina-guanina fosforribosiltransferase, resistência ao glifo- sato e resistência ao glufosinato, e amino-glicosídeo 3-O-fosfotranserase (resistência à canamicina, neomicina ou G418). Esses marcadores podem incluir resistência a G418, higromicina, bleomicina, canamicina, e gentamici- 30 na. o construto pode conter também o gene de marcador selecionável Bar, que confere resistência aos análogos de fosfinotricina como glufosinato de amônio. Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-23 (1987). Outros marcadores selecionáveis adequados são também conhecidos.
Marcadores visíveis, tal como proteína fluorescente verde (GFP)1 podem ser usados. Métodos para identificar ou selecionar plantas transfor- madas com base no controle da divisão celular foram também descritas. Vi- 5 de John e Van Mellaert1 WO 2000/052168, e Fabijansk et al., WO 2001/059086.
Seqüências de replicação, de origem bacteriana ou viral, podem ser também incluídas para permitir que o vetor seja clonado em um hospe- deiro bacteriano ou de fago. Preferivelmente, uma origem procariótica de 10 faixa mais ampla de replicação é usada. Um marcador selecionável para bactéria pode ser incluído para permitir a seleção de células bacterianas contendo o construto desejada. Marcadores selecionáveis procarióticos ade- quados incluem também resistência a antibióticos tal como canamicina ou tetraciclina.
Outras seqüências de DNA que codificam funções adicionais
podem estar também presentes no vetor, conforme conhecidas da técnica. Por exemplo, quando Agrobacterium é o hospedeiro, seqüências de T-DNA podem ser incluídas para facilitar a transferência subsequente a e incorpora- ção nos cromossomos da planta.
Plantas para Engenharia Genética
A presente invenção compreende a manipulação genética das plantas, especialmente árvores de madeira de lei, para superexpressar uma cinase associada à parede em vários tecidos vasculares via introdução de um gene associado à parede, preferivelmente sob o controle de um promotor 25 preferido de xilema ou específico de xilema. O resultado é o comprimento de fibra e a altura da planta aumentados.
Nessa descrição, o termo "planta" denota qualquer material de planta contendo fibra que possa ser geneticamente manipulado, incluindo, mas sem limitação, células de plantas diferenciadas ou não diferenciadas, 30 protoplastos, plantas inteiras, tecidos de planta, ou órgãos de plantas, ou qualquer componente de uma planta tal como folha, caule, raiz, tubérculo, fruta, rizoma, ou similares. Plantas que podem ser engenheiradas de acordo com a inven- ção incluem, mas sem limitação, árvores, tal como espécies de Eucalipto (E. alba, E. albens, E. amygdalina, E. aromaphloia, E. baileyana, E. balladonien- sis, E. bicostata, E. botryoides, E. brachyandra, E. brassiana, E. hrevistylis, 5 E. brockwayi, E. camaldulensis, E. ceracea, E. cloeziana, E. coccifera, E. cordata, E. cornuta, E. corticosa, E. crebra, E. croajingolensis, E. curtisii, E. dalrympleana, E. deglupta, E. delegatensis, E. delicata, E. diversicolor, E. diversifolia, E. dives, E. dolichocarpa, E. dundasii, E. dunnii, E. elata, E. eryt- hrocorys, E. erythrophloia, E. eudesmoides, E. falcata, E. gamophylla, E. 10 glaucina, E. globulus, E. globulus subsp. bicostata, E. globulus subsp. globu- lus, E. gongylocarpa, E. grandis, E. grandis x urophylla, E. guilfoylei, E. gun- nii, E. hallii, E. houseana, E. jacksonii, E. lansdowneana, E. latisinensis, E. leucophloia, E. leucoxylon, E. lockyeri, E. lucasii, E. maidenii, E. marginata, E. megacarpa, E. melliodora, E. michaeliana, E. microcorys, E. microtheca, 15 E. muelleriana, E. nitens, E. nitida, E. obliqua, E. obtustflora, E. occidentalis, E. optima, E. ovata, E. pachyphylla, E. pauciflora, E. pellita, E. perriniana, E. petiolaris, E. pilularis, E. piperita, E. platyphylla, E. polyanthemos, E. popul- nea, E. preissiana, E. pseudo globulus, E. pulchella, E. radiata, E. radiata subsp. radiata, E. regnans, E. risdonii, E. robertsonii, E. rodwayi, E. rubida, 20 E. rubiginosa, E. saligna, E. salmonophloia, E. scoparia, E. sieberi, E. spa- thulata, E. staeri, E. stoatei, E. tenuipes, E. tenuiramis, E. tereticornis, E. te- tragona, E. tetrodonta, E. tindaliae, E. torquata, E. umbra, E. urophylla, E. vernicosa, E. viminalis, E. wandoo, E. wetarensis, E. willisii, E. willisii subsp. falciformis, E. willisii subsp. willisii, E. woodwardii), Populus spp. (P. alba, P. 25 alba x P. grandidentata, P. alba x P. tremula, P. alba x P. tremula var. glan- dulosa, P. alba x P. tremuloides, P. balsamifera, P. balsamifera subsp. tri- chocarpa, P. balsamifera subsp. trichocarpa x P. deltoides, P. ciliata, P. del- toides, P. euphratica, P. euramericana, P. kitakamiensis, P. lasiocarpa, P. laurifolia, P. maximowiczii, P. maximowiczii x P. balsamifera subsp. tricho- 30 carpa, P. nigra, P. sieboldii x P. grandidentata, P. suaveolens, P. szechuani- ca, P. tomentosa, P. tremula, P. tremula x P. tremuloides, P. tremuloides, P. wilsonii, P. canadensis, P. yunnanensis), Coníferas tal como pinheiro teda (Pinus taeda), pinheiro da Flórida (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro Iodgepole (Pinus contorta), e pinheiro Monterey (Pinus radiata); Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii); cicuta do Ocidente (Tsuga canadensis); espruce Sitka (Picea glauca); madeira vermelha (Sequoia sem- 5 pervirens); abetos verdadeiros tais como abeto prata (Abies amabilis) e abe- to de bálsamo (Abies baisamea)\ e cedros tais como cedro vermelho do Oeste (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkaten- sis).
Plantas produtoras de fibras estão também incluídas neste con- 10 texto. Colheitas ilustrativas algodão (Gossipium spp.), linho (Linum usitatis- simum), urtiga ferrão (Urtica dioica), lúpulo (Humulus lupulus), árvores de limeira (Tilia cordata, T. x. europaea e T. platyphyllus), sorgo espanhol (Spartium junceum), rami (Boehmeria nivea), amoreira de papel (Brousso- netya papyrifera), linho da Nova Zelândia (Phormium tenax), apócino (A- 15 pocynum cannabinum), espécie de Iris (/. douglasiana, I. macrosiphon e I. purdyi), asclépias (espécies de Asclépia), abacaxi, banana e outros. São também contempladas colheitas de forragem, tais como alfafa, lólio, festuca e trevo.
Na presente descrição, "planta transgênica" refere-se a uma planta que foi incorporada uma seqüência de ácidos nucleicos, incluindo, mas sem limitação, genes que não estão normalmente presentes em um genoma de planta hospedeira, seqüências de ácidos nucleicos não normal- mente transcritos em RNA ou traduzidos em uma proteína, ou quaisquer ou- tros genes ou seqüências de ácidos nucleicos que se deseja introduzir na planta tipo selvagem, tais como genes que normalmente podem estar pre- sentes na planta do tipo selvagem, mas que se deseja ou engenheirar gene- ticamente ou ter a expressão alterada. A categoria de "planta transgênica" inclui tanto um transformador primário ou uma planta que inclui um transfor- mador em sua linhagem, por exemplo, a título de introgressão padrão ou qualquer outro procedimento de multiplicação.
Uma "planta híbrida" refere-se a uma planta ou parte desta re- sultante de um cruzamento entre duas plantas parentes, em que uma planta parente é uma planta geneticamente engenheirada da invenção. Tal cruza- mento pode ocorrer naturalmente, por exemplo, por reprodução sexual, ou artificialmente, por exemplo, uma fusão nuclear in vitro. Os métodos para multiplicação de plantas são bem conhecidos e dentro do nível de um de 5 conhecimento ordinário da técnica da biologia da planta.
Em contraste, uma planta que não é geneticamente manipulada é uma planta de controle e é referida como uma planta "não-transgênica" ou de "controle". Planta não-transgênica pode ser uma planta cujo genoma não está modificado pela introdução de um construto compreendendo as se- 10 quências de polinucleotídeos nem fragmento destas da presente invenção. Pode ser também uma planta gerada a partir de células ou tecidos cultivados sem modificação anterior pela introdução de um construto que compreende as seqüências de polinucleotídeos da invenção, ou pode compreender pro- gênie recessivo de homozigoto (isto é, não tem nenhuma cópia do transge- 15 ne) resultante de autofertilização de uma planta transgênica.
É contemplado que, em alguns casos, o genoma de uma planta transgênica inventiva será aumentado através da introdução estável de um transgene. Em outros casos, contudo, o gene introduzido substituirá uma seqüência endógena. Um gene preferido com respeito à presente invenção, 20 é uma seqüência de DNA de cinase associada a uma parede, por exemplo, uma obtida de Arabidopsis thaliana.
Métodos para Engenharia Genética
Os construtos de acordo com a invenção podem ser introduzidos em qualquer célula da planta, usando uma técnica adequada. Tanto as célu- 25 Ias de planta da angiosperma ou da gimnosperma de monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser geneticamente engenheiradas de vários modos conhecidos da técnica. Por exemplo, vide Klein et al., 1993, Biotechnology 4: 583-590; Bechtold et al., 1993, C. R. Acad. Sei. Paris 316:1194-1199; Koncz e Schell, 1986, MoL Gen. Genet. 204: 383-396; Paszkowski et al., 1984, 30 EMBO J. 3: 2717-2722; Sagi et al., 1994, Plant Cell Rep. 13: 262-266.
Espécies de Agrobacterium tais como A. tumefaciens e A. rhiso- genes podem ser usadas, por exemplo, de acordo com Nagel et al., 1990, Microbiol Lett 67: 325. Em resumo, a Agrobacterium podem ser usada com um vetor de expressão de planta, por exemplo, eletroporação, depois da qual a Agrobacterium é introduzida nas células da planta através, por exem- plo, do método bem conhecido de discos foliares.
5 Os métodos adicionais para obtenção disto que incluem, mas
sem limitação, a transformação por Rhizobium, Sinorhizobium ou Mesorhi- zobium (Broothaerts et al., 2005, Nature 433: 629-633), eletroporação, bom- bardeio com pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, e fusão de glicol, transferências nos grãos de pólen germinantes, transformação di- 10 reta (Lorz et al., 1985, Moi. Genet. 199: 179-182), e outros métodos conhe- cidos da técnica. Se um marcador de seleção, tal como resistência à cana- micina, for empregado, torna-se mais fácil determinar que células sejam transformadas com êxito.
Os métodos de transformação de Agrobacterium discutidos aci- 15 ma são conhecidos por serem úteis por dicotiledôneas transformadas. Adi- cionalmente, de La Pena et al., 1987, Nature 325: 274-276; Rhodes et al., 1988, Science 240: 204-207; e Shimamoto et al., 1989, Nature 328: 274-276, todos os quais são incorporados a título de referência, têm monocotiledô- neas cereais transformadas usando Agrobacterium. Vide Bechtold e Pelleti- 20 er, 1998, Methods Moi. Biol. 82: 259-266, mostrando o uso de infiltração a vácuo para transformação mediada por Agrobacterium.
A presença de uma proteína, polipeptídeo, ou molécula de ácido nucleico em uma célula particular pode ser medida para determinar se, por exemplo, uma célula foi transformada ou transfectada com sucesso. A capa- cidade de executar tal ensaio é bem conhecida e não precisa ser reiterada aqui.
Quantificação do Comprimento da Fibra ou Altura da Planta
A palavra "fibra" é frequentemente usada para unificar um grupo diverso de tipos de células de planta que compartilham em comum as carac- terísticas de ter uma configuração alongada e celulose abundante nas pare- des de células espessas, usualmente, mas nem sempre, descritas como pa- redes secundárias. Tais paredes podem ser ou não Iignificadas e o proto- plasto de tais células pode permanecer vivo ou não na maturidade. Em al- gumas indústrias, o termo "fibra" inclui usualmente células condutoras de paredes espessas tais como vasos e traqueídes e agregados fibrilares de muitas células de fibras individuais. Para os propósitos da presente inven- 5 ção, o termo "fibra" inclui: (a) células condutoras e não condutoras do xile- ma; (b) fibras de origem extraxilar, incluindo aquelas de floema, raspas, teci- do triturado, e epiderme: e (c) fibras de caules folhas, raízes, sementes, e flores ou inflorescências.
Plantas transgênicas da invenção são caracterizadas pelo com- primento maior das fibras e, preferivelmente, altura maior também. O com- primento aumentado das fibras na planta geneticamente modificada é prefe- rivelmente realizado através da superexpressão de WAK nos tecidos da planta, onde a expansão celular ocorre. Na descrição de uma planta da in- venção, "comprimento aumentado das fibras" refere-se ao aumento no com- primento das células de fibra da planta quando comparado ao comprimento das células de fibra em uma planta tipo selvagem. Um aumento quantitativo do comprimento das fibras pode ser medido por diversas técnicas tal qual digitalização, procedimento de Kajaani e o Analisador de Qualidade de Fi- bras. Han et al., 1999, em: Kenaf Properties, Processing and Products, Mis- sissipi State University, Ag & Bio Engineering, páginas 149 a 167.
O comprimento das fibras na planta modificada da invenção é de pelo menos 5 a 15% mais longo, preferivelmente de pelo menos 10 a 30% mais longo e, mais preferivelmente, de pelo menos 20 a 50% mais longo que o comprimento das fibras de uma planta tipo selvagem.
Como o aumento do comprimento das fibras pode ser seguido
por um aumento na altura da planta, as plantas transgênicas da invenção podem ter maiores comprimento das fibras e alturas. Nessa descrição, por- tanto, a frase "aumento da altura da planta" conota um aumento quantitativo na altura da planta, quando comparado à altura de uma planta tipo selva- 30 gem. A altura de uma planta modificada da invenção pode ter sua altura au- mentada em cerca de 5% a cerca de 90%, preferivelmente cerca de 10% a cerca de 75% e, mais preferivelmente, cerca de 15% a cerca de 65% em relação à altura da planta tipo selvagem.
Exemplos específicos de métodos para a obtenção de genes de cinase associada à parede são apresentados abaixo, assim como para a introdução do gene alvo, através de Agrobacterium, para produzir plantas transformadores. Eles devem ser considerados como exemplos e não como limitações à presente invenção.
Exemplo 1
Isolamento de uma seqüência de DNA de cinase associada à parede da A- rabidopsis thaliana
(a) preparação de RNA do embrião da Arabidopsis thaliana e síntese de cD- NA.
Cortes do caule de plantas de Arabidopsis thaliana de três me- ses de idade foram cortados em pequenos pedaços, congelados em nitrogê- nio líquido e usados para extração de DNA através do método de extração 15 por brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB). Aldrich e Cullis, 1993, Plant Moi. Biol. Report, 11:128 - 141. Um conjunto de cDNA foi usado em experimen- tos RT-PCR em que o RNA isolado total foi usado como modelo, e a trans- criptase reversa Superscript Il (Invitrogen) e o primer oligo (dT) foram usados para sintetizar a primeira fita de cDNA. cDNA de fita dupla foi obtido por rea- 20 ção de polimerase subsequente, utilizando-se primers específicos de gene, conforme descrito abaixo.
(b) Projeto do primer
Uma seqüência de cDNA representativa de 4 mRNA da cinase associada à parede de Arabidopsis thaliana foi determinada e depositada no 25 GenBank sob número de acesso NM101974. Baseado nessa seqüência, oligômeros de DNA foram sintetizados como primers para PCR1 incluindo ou a região em volta do primeiro códon ATG ou a envolta do códon terminal do ORF principal que codifica a cinase associada à parede 4.
Primers foram projetados para amplificar a totalidade da região codificação da ORF 4 da cinase associada à parede, ou seja, de ATG até o códon de terminação de tradução. As seqüências dos primers são dadas abaixo: WAK NDE comprimento: 23SEQ ID NO: 11 CAT AT GAAAGTGCAGCGT CT GTT WAK NDE comprimento: 23SEQ ID NO: 12 TCTAGATCAGCGGCCTGCTTCAA 5 (c) Amplificação de PCR
A amostra de cDNA obtida em (a) foi usada como modelo, e os primers projetados em (b) foram usados para PCR. As etapas de PCR en- volveram 40 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 50°C e 2 minutos a 72°C, seguido por uma etapa extra de alongamento a 72°C por 7 minutos. Os pro- 10 dutos PCR foram isolados por eletroforese em gel em agarose a 1,0%, se- guido por coloração com brometo de etídio do gel que sofreu eletroforese e detecção das bandas amplificadas em um transiluminador de UV. A banda amplificada detectada foi checada e cortada do gel de agarose com uma tesoura. Os pedaços do gel foram transferidos para microtubos de 1,5 mL, e 15 os fragmentos de DNA foram isolados e purificados utilizando-se um kit de limpeza e purificação de banda em gel PCR GFX (Amersham). Os fragmen- tos de DNA recuperados foram subclonados para o vetor de clonagem pGEM-T (Promega), transformados em E coli, e então usados para preparar plasmídeo de DNA da maneira habitual, que foi então sequenciado pelo mé- 20 todo didesóxi (Messing, 1983, Methods in EnzymoL 101: 20-78), utilizando- se química BigDye (Applied Biosystems), para que rendesse a seqüência de DNA revelada aqui por SEQ ID NO: 1, para uso em conformidade com a in- venção.
Exemplo 2
Preparação de plantas Nicotiana tabacum transgênicas
O gene da cinase associada à parede obtido no Exemplo 1 aci- ma foi introduzido em uma planta hospedeira para produzir plantas Nicotiana tabacum transgênicas.
(a) Preparação de construtos e transformação da Agrobacterium Construtos de expressão foram preparados por clivagem do ge-
ne da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 acima, com enzimas de restrição adequadas para incluir toda o quadro de leitura aberta e inserir o gene no vetor de transformação da planta pALELLYX-WAK (Figura 1) junto com um promotor apropriado. Por exemplo, o gene da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 foi clonado para vetor de expressão supramen- cionado a jusante para um promotor de gene tubulina preferido de xilema 5 (TUB) da Populus deltoides, como revelado no Pedido Internacional WO 2005/096805. o construto de expressão resultante foi amplificada em E. coli, e então transformada por congelamento em Agrobacterium tumefaciens da cepa LBA4404.
(b) Transformação da Nicotiana tabacum mediada por Agrobacterium A transformação da Nicotiana sp. Foi realizada utilizando-se o
método de discos foliares de Horsch et ai., 1985, Science 227:1229, utilizan- do-se um construto de ácido nucleico que compreende o gene da cinase associada à parede obtido em (a) em uma ligação operável com o promotor TUB de um gene preferido de xilema. Os transformadores foram seleciona- 15 dos em meio Murashige e Skoog (Sigma, St. Louis, MO) contendo 100 mili- gramas/litro de canamicina e 500 mg/L de carbenicilina (Sigma). Permitiu-se que os brotos de tabaco transformados se enraizassem no meio Murashige e Skoog, e foram subsequentemente transferidos para o solo e cultivados em uma estufa.
(c) Verificação de PCR de uma inserção de gene estranho no genoma da planta hospedeira
PCR pode ser usada para verificar a integração do construto de gene no genoma de plantas transgênicas. A mistura de reação de PCR con- tinha 100 ng do DNA genômico da planta transformada, e 0,2 μΜ de cada 25 primer descrito acima, 100 μΜ de cada desoxirribonucleotídeo trifosfato, 5 μΙ_ de tampão para PCR e 2,5 unidades de polimerase de DNA Amplitaq (Applied Biosystems) em um volume total de 50 μΙ_. Os parâmetros cíclicos foram os seguintes: 94°C por 1 minuto, 50°C por 1 minuto e 72°C por 3 mi- nutos, por 40 ciclos, com uma extensão de 5 minutos a 72°C. Os produtos 30 de PCR sofreram eletroforese em um gel de agarose a 1 %.
(d) Determinação do nível de expressão transqênico em plantas transgêni-
cas RT-PCR semiquantitativa foi usada para detectar a acumulação de transcritos de cinase associada à parede no tecido do caule das plantas transgênicas. O RNA total foi isolado de cortes de caule de plantas Nicotiana TO e T1 transgênicas de 3 meses de idade utilizando-se o método CTAB 5 descrito em Aldrich e Culli, 1993, Plant Moi. Bioi Report. 11:128-141.
cDNA foi sintetizado a partir de 500 ng do RNA total utilizando- se Superscript Il Rnase H- RT (Invitrogen, USA). Os primers descritos acima foram usados junto com primers para a codificação constitutiva do gene da desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) como um controle interno 10 para normalizar a quantidade de RNA total utilizado em cada amostra. PCR foi feita com uma diluição de 12,5x do cDNA de primeira fita sob as seguin- tes condições: 94°C por 3 minutos e 27 ciclos de 94°C por 1 minuto, 52 a 60°C por 45 segundos, e 72°C por 1 minuto e 30 segundos.
Exemplo 3
Aumento do comprimento das fibras de plantas transgênicas de tabaco que superexpressam o gene da cinase associada à parede em tecidos vascula- res
Regiões de caule correspondentes a 50% da altura de plantas transgênicas e de controle de 5 meses de idade foram maceradas em uma 20 solução de ácido acético-peróxido a 70°C por 48 horas ou até que células unitárias fossem obtidas. As células foram coloridas com safranina e exami- nadas sob um microscópio (Leica DMIL) com uma câmera (Sony) ligada a um computador pessoal. As células (cerca de 100 por linha) foram medidas diretamente na tela, usando o software "Image Tool".
Três dos eventos transgênicos, conhecidos por expressarem o
transgene de acordo com o procedimento detalhado no exemplo 2, mostra- ram um aumento estatisticamente significativo do comprimento das fibras (Figura 2). O evento transgênico 43B exibiu um aumento de 21% do com- primento das fibras se comparado às plantas de controle (P<0,05, teste t). O 30 evento transgênico 47B exibiu um aumento de 19% do comprimento das fibras se comparado às plantas de controle (Figura 2; P<0,05, teste t). Ade- mais, o evento transgênico 43B exibiu um aumento de 15% do comprimento das fibras se comparado às plantas de controle (Figura 2 P<0,05, teste t).
É importante mencionar que outra estratégia para aumentar o comprimento das fibras por superexpressão de um gene de pectina metil esterase (Berthold et al., WO 2006/068603) logrou um aumento de somente 5% no comprimento das fibras de plantas transgênicas quando comparadas às plantas de controle.
Após o cultivo até a maturidade, deixou-se que os eventos TO gerassem linhas T1. Plantas que têm homozigoto dominante apresentam um aumento significativo de 10% no comprimento das fibras (P<0,05, teste t) 10 quando comparadas à plantas que têm homozigoto recessivo. Esses resul- tados foram observados em duas linhas diferentes (Figura 3 e Figura 4). Exemplo 4
Aumento da altura da planta em plantas de tabaco transgênicas que super- expressam o gene da cinase relacionada à parede em tecidos vasculares A progênie T1 resultante da autofertilização das plantas transgê-
nicas foi individualmente envasada após a semeadura. O crescimento foi medido periodicamente até que a primeira flor fosse formada (as plantas ti- nham cerca de 5 meses de idade) e foi registrado como a altura total.
Os resultados apresentados são um exemplo do aumento da 20 altura das plantas observadas nas plantas de homozigoto dominante de dife- rentes linhas. A altura da planta de três genótipos do evento 51B foi compa- rada. Plantas que têm homozigoto dominante são 12% mais altas que plan- tas que têm homozigoto recessivo. Plantas que são hemizigotos são 9% mais altas que as plantas que têm homozigoto recessivo (P<0,05, teste t) 25 (Figura 5).
Exemplo 5
Preparação de plantas Pooulus transgênicas
O gene obtido no exemplo 1 acima foi introduzido em uma planta hospedeira para produzir plantas Populus transgênicas.
(a) Preparação de construtos e transformação da Agrobacterium
Construtos de expressão foram preparados por clivagem do ge- ne da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 acima, com enzimas de restrição adequadas para incluir toda o quadro de leitura aberta e inserir o gene no vetor de transformação da planta pALELLYX-WAK (Figura 1) junto com um promotor apropriado. Por exemplo, o gene da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 foi clonado para vetor de expressão supramen- 5 cionado a jusante para um promotor de gene tubulina preferido de xilema (TUB) da Populus deltoides, como revelado no Pedido Internacional WO 2005/096805. O construto de expressão resultante foi amplificado em e. coli, e então transformado por congelamento em Agrobacterium tumefaciens da cepa LBA4404.
(b) Transformação da Populus mediada por Agrobacterium
Faia tipo selvagem foi transformada com Agrobacterium tumefa- ciens carregando um construto que compreende um gene da cinase associ- ada à parede de Arabidopsis thaliana obtido no exemplo 1 ligado operavel- mente a um promotor do gene preferido de xilema (TUB). Pecíolos e seg- 15 mentos de caulse internodais de plantas micropropagadas in vitro foram u- sados como explantes. Brotos transformados foram selecionados em meio de regeneração contendo 1.000 mg/L de canamicina e permitiu-se que enra- izassem no meio Murashige e Skoog. Plantas selecionadas foram subse- quentemente transferidas para o solo e cultivadas em estufa. LISTAGEM DE SEQÜENCIA
GERHARDT, Isabel Rodrigues ARRUDA, Paulo
CONSTRUTOS DE ÁCIDO NUCLEICO E MÉTODOS PARA ALTERAR TO DA FIBRA DA PLANTA E/OU A ALTURA DA PLANTA
US 60/871,048 2006-12-20 12 1
2217
DNA
Arabidopsis thaliana mRNA
(1)...(2217)
Cinase 4 associada à parede, cDNA,
<110>
<120>
5
<130>
<14 0>
<141>
<150>
<151>
<160>
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>
atg aaa gtg Met Lys Val 1
atg cag ctg Met Gln Leu
ggc aac gtt Gly Asn Val 35
cgt gcc gaa Arg Ala Glu
50
1
cag cgt ctg ttc Gln Arg Leu Phe 5
gtc aag ggg caa Val Lys Gly Gln 20
aca ctt gag tac Thr Leu Glu Tyr
gat cct agt ttc Asp Pro Ser Phe 55
tta gta gct att ttc Leu Val Ala He Phe 10
acc ttg cct cgt tgc Thr Leu Pro Arg Cys 25
cct ttt ggc ttt tct Pro Phe Gly Phe Ser 40
aat ctc agt tgt gtg Asn Leu Ser Cys Val 60
CD completo
tgc ctc tct tat Cys Leu Ser Tyr 15
ccc gaa aaa tgt Pro Glu Lys Cys 30
cca ggt tgt tgg Pro Gly Cys Trp 45
aac gag aat cta Asn Glu Asn Leu
COMPRIMEN-
48
96
144
192 ttc tat aag ggc ctt Phe Tyr Lys Gly Leu 65
cgc gtc cta tat cct Arg Val Leu Tyr Pro
85
ttc gct aaa ggg act Phe Ala Lys Gly Thr 100
tcc ggc aac aac acg Ser Gly Asn Asn Thr 115
gtg tcc tct aat gga Val Ser Ser Asn Gly
130
tgt gat gct ctt tcc Cys Asp Ala Leu Ser 145
tgc tgc cag aac ccc Cys Cys Gln Asn Pro
165
tca tat cgc ttt gac Ser Tyr Arg Phe Asp
180
caa tgc atc tac gcc Gln Cys Ile Tyr Ala 195
gct tcg gac aaa tat Ala Ser Asp Lys Tyr
210
gtg gtc ttg gat tgg Val Val Leu Asp Trp
gaa gtg gtc gaa ata tct Glu Val Val Glu Ile Ser 70 75
gca tcc tac att tgc tac Ala Ser Tyr Ile Cys Tyr 90
tac tac tgg agt aat cta Tyr Tyr Trp Ser Asn Leu 105
att act gca tta ggc tgt Ile Thr Ala Leu Gly Cys 120
act cga aga aac tca gtt Thr Arg Arg Asn Ser Val 135
cat gaa gca aat gga gaa His Glu Ala Asn Gly Glu 150 155
gtc cct gca ggg aac aat Val Pro Ala Gly Asn Asn 170
aac gac acg tca gtg caa Asn Asp Thr Ser Val Gln 185
ttt ctc gtt gaa aat ggc Phe Leu Val Glu Asn Gly 200
tct tat ctg cag aat agg Ser Tyr Leu Gln Asn Arg 215
tct att agg gga gag aca Ser Ile Arg Gly Glu Thr
cac age age cag tta His Ser Ser Gln Leu 80
aac age aaa gga aag Asn Ser Lys Gly Lys 95
ggt aat ttg act ctc Gly Asn Leu Thr Leu 110
aac tcg tac gct ttt Asn Ser Tyr Ala Phe 125
gga tgc ata tca gca Gly Cys Ile Ser Ala 140
tgt aat ggt gaa ggc Cys Asn Gly Glu Gly 160
tgg tta ata gtc aga Trp Leu Ile Val Arg 175
cct atc tct gag ggt Pro Ile Ser Glu Gly 190
aag ttt aag tac aat Lys Phe Lys Tyr Asn 205
aat gtg ggg ttt cct Asn Val Gly Phe Pro 220
tgt ggg caa gtt gga Cys Gly Gln Val Gly
240
288
336
384
432
480
528
576
624
672
720 225 230 235 240 gaa aag aaa tgc ggt gtg aat ggc ata tgt tcc aat tct gct agt ggg
Glu Lys Lys Cys Gly Val Asn Gly Ile Cys Ser Asn Ser Ala Ser Gly
245 250 255 atc ggg tat aca tgc aaa tgc aaa gga ggt ttc cag ggg aat cca tat
Ile Gly Tyr Thr Cys Lys Cys Lys Gly Gly Phe Gln Gly Asn Pro Tyr
260 265 270
ctt caa aac ggt tgc caa gac atc aat gag tgt act act gct aat cct Leu Gln Asn Gly Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Thr Thr Ala Asn Pro
275 280 285
atc cat aaa cat aac tgc tcg ggt gac age acc tgt gaa aac aag ttg
Ile His Lys His Asn Cys Ser Gly Asp Ser Thr Cys Glu Asn Lys Leu
290 295 300
gga cac ttc cgt tgt aat tgt cga tct cgt tac gaa tta aat acc acc
Gly His Phe Arg Cys Asn Cys Arg Ser Arg Tyr Glu Leu Asn Thr Thr
305 310 315 320
act aat acc tgc aaa cct aaa ggc aat cct gaa tac gtt gaa tgg act
Thr Asn Thr Cys Lys Pro Lys Gly Asn Pro Glu Tyr Val Glu Trp Thr
325 330 335
aca att gtt ctt gga acc act atc ggc ttc ttg gtc att ctg ctt gcc
Thr Ile Val Leu Gly Thr Thr Ile Gly Phe Leu Val Ile Leu Leu Ala
340 345 350
att age tgt ata gaa cat aaa atg aag aac acc aag gac acc gag ctc
Ile Ser Cys Ile Glu His Lys Met Lys Asn Thr Lys Asp Thr Glu Leu
355 360 365
cga caa caa ttc ttc gag caa aat ggt ggc ggc atg ttg atg cag cga
Arg Gln Gln Phe Phe Glu Gln Asn Gly Gly Gly Met Leu Met Gln Arg
370 375 380
ctc tca gga gca ggg cca tca aat gtt gat gtc aaa atc ttc act gag
Leu Ser Gly Ala Gly Pro Ser Asn Val Asp Val Lys Ile Phe Thr Glu
385 390 395 400
gaa gga atg aag gaa gca act gat ggt tat gat gag aac aga atc ttg
768
816
864
912
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248 Glu Gly Met Lys Glu Ala Thr Asp Gly Tyr Asp Glu Asn Arg Ile Leu 405 410 415
ggc cag gga ggc caa gga aca gtc tac aaa ggt ata tta ccg gac aac Gly Gln Gly Gly Gln Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Leu Pro Asp Asn 420 425 430
tcc ata gtt gct ata aag aaa gct cgg ctt gga gac aat age caa gta Ser Ile Val Ala Ile Lys Lys Ala Arg Leu Gly Asp Asn Ser Gln Val 435 440 445
gag cag ttc atc aat gaa gtg ctt gtg ctt tca caa atc aac cat agg Glu Gln Phe Ile Asn Glu Val Leu Val Leu Ser Gln Ile Asn His Arg 450 455 460
aac gtg gtc aag ctc ttg ggc tgc tgt cta gag act gaa gtt ccc ttg Asn Val Val Lys Leu Leu Gly Cys Cys Leu Glu Thr Glu Val Pro Leu 465 470 475 480
ttg gtc tat gag ttc att tcc agt ggg acc ctt ttc gat cac tta cac Leu Val Tyr Glu Phe Ile Ser Ser Gly Thr Leu Phe Asp His Leu His 485 490 495
ggt tct atg ttt gat tct tct cta aca tgg gaa cat cgt ttg aga atg Gly Ser Met Phe Asp Ser Ser Leu Thr Trp Glu His Arg Leu Arg Met 500 505 510
gct gta gaa ata gct gga act ctt gct tat ctt cac tcc tct gct tct Ala Val Glu Ile Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Leu His Ser Ser Ala Ser 515 520 525
ata cca atc atc cat cgc gat atc aaa act gca aat att ctt ctg gat Ile Pro Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Thr Ala Asn Ile Leu Leu Asp 530 535 540
gaa aac tta act gca aaa gta gct gac ttt ggt gct tca agg ctg ata Glu Asn Leu Thr Ala Lys Val Ala Asp Phe Gly Ala Ser Arg Leu Ile 545 550 555 560
cca atg gat aaa gaa gac ctc gca act atg gtg caa gga act cta ggt Pro Met Asp Lys Glu Asp Leu Ala Thr Met Val Gln Gly Thr Leu Gly 565 570 575
1296
1344
1392
1440
1488
1536
1584
1632
1680
1728 tac cta gac cca gaa tat tac aac aca ggg ttg cta aac gaa aag age
Tyr Leu Asp Pro Glu Tyr Tyr Asn Thr Gly Leu Leu Asn Glu Lys Ser
580 585 590
gat gtt tat age ttt ggg gta gtc cta atg gaa ctg tta tca ggt caa
Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met Glu Leu Leu Ser Gly Gln
595 600 605
aag gca ttg tgc ttt gaa agg cca cag act tca aaa cat ata gtg agt
Lys Ala Leu Cys Phe Glu Arg Pro Gln Thr Ser Lys His Ile Val Ser 610 615 620
tac ttt gcc tca gcc acg aaa gag aat agg ttg cac gag att att gat
Tyr Phe Ala Ser Ala Thr Lys Glu Asn Arg Leu His Glu Ile Ile Asp
625 630 635 640
ggc caa gtg atg aac gag aat aat cag agg gag atc cag aaa gct gca
Gly Gln Val Met Asn Glu Asn Asn Gln Arg Glu Ile Gln Lys Ala Ala
645 650 655
aga att gct gtt gag tgt aca aga ttg acg gga gaa gaa agg cca ggg
Arg Ile Ala Val Glu Cys Thr Arg Leu Thr Gly Glu Glu Arg Pro Gly
660 665 670
atg aag gaa gta gct gca gag ctt gag gcc ttg aga gtc aca aaa acc
Met Lys Glu Val Ala Ala Glu Leu Glu Ala Leu Arg Val Thr Lys Thr
675 680 685
aaa cat aag tgg tca gat gag tat cct gaa cag gag gat act gag cac
Lys His Lys Trp Ser Asp Glu Tyr Pro Glu Gln Glu Asp Thr Glu His 690 695 700
ttg gtt ggt gtt caa aaa tta tca gca caa ggc gaa acc age age age
Leu Val Gly Val Gln Lys Leu Ser Ala Gln Gly Glu Thr Ser Ser Ser
705 710 715 720
att ggc tat gat agt atc agg aat gta gca ata ctg gac att gaa gca
Ile Gly Tyr Asp Ser Ile Arg Asn Val Ala Ile Leu Asp Ile Glu Ala
725 730 735
ggc cgc tga Gly Arg
1776
1824
1872
1920
1968
2016
2064
2112
2160
2208
2217 <210> 2
<21Χ> 738
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<400> 2
Met Lys Val Gln Arg Leu Phe Leu Val Ala Ile Phe Cys Leu Ser Tyr 5 10 15
Met Gln Leu Val Lys Gly Gln Thr Leu Pro Arg Cys Pro Glu Lys Cys
20 25 30
Gly Asn Val Thr Leu Glu Tyr Pro Phe Gly Phe Ser Pro Gly Cys Trp
40 45
Arg Ala Glu Asp Pro Ser Phe Asn Leu Ser Cys Val Asn Glu Asn Leu
50 55 60
Phe Tyr Lys Gly Leu Glu Val Val Glu Ile Ser His Ser Ser Gln Leu
65 70 75 80
Arg Val Leu Tyr Pro Ala Ser Tyr Ile Cys Tyr Asn Ser Lys Gly Lys
85 90 95
Phe Ala Lys Gly Thr Tyr Tyr Trp Ser Asn Leu Gly Asn Leu Thr Leu
100 105 110
Ser Gly Asn Asn Thr Ile Thr Ala Leu Gly Cys Asn Ser Tyr Ala Phe 115 120 125
Val Ser Ser Asn Gly Thr Arg Arg Asn Ser Val Gly Cys Ile Ser Ala 130 135 140
Cys Asp Ala Leu Ser His Glu Ala Asn Gly Glu Cys Asn Gly Glu Gly 145 150 155 160
Cys Cys Gln Asn Pro Val Pro Ala Gly Asn Asn Trp Leu Ile Val Arg
165 170 175
Ser Tyr Arg Phe Asp Asn Asp Thr Ser Val Gln Pro Ile Ser Glu Gly 180 185 190
Gln Cys Ile Tyr Ala Phe Leu Val Glu Asn Gly Lys Phe Lys Tyr Asn 195 200 205 Ala Ser Asp Lys Tyr Ser Tyr Leu Gln Asn Arg Asn Val Gly Phe Pro 210 215 220
Val Val Leu Asp Trp Ser Ile Arg Gly Glu Thr Cys Gly Gln Val Gly 225 230 235 240
Glu Lys Lys Cys Gly Val Asn Gly Ile Cys Ser Asn Ser Ala Ser Gly
245 250 255
Ile Gly Tyr Thr Cys Lys Cys Lys Gly Gly Phe Gln Gly Asn Pro Tyr 260 265 270
Leu Gln Asn Gly Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Thr Thr Ala Asn Pro
275 280 285
Ile His Lys His Asn Cys Ser Gly Asp Ser Thr Cys Glu Asn Lys Leu 290 295 300
Gly His Phe Arg Cys Asn Cys Arg Ser Arg Tyr Glu Leu Asn Thr Thr 305 310 315 320
Thr Asn Thr Cys Lys Pro Lys Gly Asn Pro Glu Tyr Val Glu Trp Thr
325 330 335
Thr Ile Val Leu Gly Thr Thr Ile Gly Phe Leu Val Ile Leu Leu Ala 340 345 350
Ile Ser Cys Ile Glu His Lys Met Lys Asn Thr Lys Asp Thr Glu Leu 355 360 365
Arg Gln Gln Phe Phe Glu Gln Asn Gly Gly Gly Met Leu Met Gln Arg 370 375 380
Leu Ser Gly Ala Gly Pro Ser Asn Val Asp Val Lys Ile Phe Thr Glu 385 390 395 400
Glu Gly Met Lys Glu Ala Thr Asp Gly Tyr Asp Glu Asn Arg Ile Leu
405 410 415
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Leu Pro Asp Asn 420 425 430
Ser Ile Val Ala Ile Lys Lys Ala Arg Leu Gly Asp Asn Ser Gln Val 435 440 445
Glu Gln Phe Ile Asn Glu Val Leu Val Leu Ser Gln Ile Asn His Arg 450 455 460 Asn Val Val Lys 465
Leu Val Tyr Glu
Gly Ser Met Phe 500
Ala Val Glu Ile 515
Ile Pro Ile Ile 530
Glu Asn Leu Thr 545
Pro Met Asp Lys
Tyr Leu Asp Pro 580
Asp Val Tyr Ser 595
Lys Ala Leu Cys 610
Tyr Phe Ala Ser 625
Gly Gln Val Met
Arg Ile Ala Val 660
Met Lys Glu Val
675
Lys His Lys Trp
690
Leu Val Gly Val 705
Leu Leu Gly Cys Cys Leu 470
Phe Ile Ser Ser Gly Thr 485 490
Asp Ser Ser Leu Thr Trp 505
Ala Gly Thr Leu Ala Tyr 520
His Arg Asp Ile Lys Thr 535
Ala Lys Val Ala Asp Phe 550
Glu Asp Leu Ala Thr Met 565 570
Glu Tyr Tyr Asn Thr Gly 585
Phe Gly Val Val Leu Met 600
Phe Glu Arg Pro Gln Thr 615
Ala Thr Lys Glu Asn Arg 630
Asn Glu Asn Asn Gln Arg 645 650
Glu Cys Thr Arg Leu Thr 665
Ala Ala Glu Leu Glu Ala 680
Ser Asp Glu Tyr Pro Glu 695
Gln Lys Leu Ser Ala Gln 710
Glu Thr Glu Val Pro 475
Leu Phe Asp His Leu
495
Glu His Arg Leu Arg 510
Leu His Ser Ser Ala 525
Ala Asn Ile Leu Leu 540
Gly Ala Ser Arg Leu 555
Val Gln Gly Thr Leu
575
Leu Leu Asn Glu Lys 590
Glu Leu Leu Ser Gly 605
Ser Lys His Ile Val 620
Leu His Glu Ile Ile 635
Glu Ile Gln Lys Ala 655
Gly Glu Glu Arg Pro 670
Leu Arg Val Thr Lys 685
Gln Glu Asp Thr Glu 700
Gly Glu Thr Ser Ser 715
Leu
480
His
Met
Ser
Asp
Ile
560
Gly
Ser
Gln
Ser
Asp
640
Ala
Gly
Thr
His
Ser
720 Ile
Gly Arg <210> 3
<211> 2208
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana <220>
<221> mRNA
<222> (1) . . . (2208)
<223> Cinase 1 associada à
<4 00> 3
atg aag gtg cag gag ggt ttg ttc
Met Lys Val Gln Glu Gly Leu Phe
5
gcg tgt acg cag ctg gtg aag ggg Ala Cys Thr Gln Leu Val Lys Gly 20
caa aat aaa tgt ggc aac atc aca Gln Asn Lys Cys Gly Asn Ile Thr 40
tca ggt tgt tac tat ccc gga aat Ser Gly Cys Tyr Tyr Pro Gly Asn 50 55
gaa gat agg cca cat gtc tta age Glu Asp Arg Pro His Val Leu Ser 65 70
cac age ggc cag cta caa gtt ctg His Ser Gly Gln Leu Gln Val Leu
85
gac gag caa gga aaa aaa act gag Asp Glu Gln Gly Lys Lys Thr Giu
730 735
parede, cDNA, CDS completo
ttg gtg gct att ttc ttc tcc ctt Leu Val Ala Ile Pne Phe Ser Leu 10 15
caa cat caa cct ggt gag aat tgc Gln His Gln Pro Gly Glu Asn Cys 25 30
ata gag tac cct ttt ggc att tct Ile Glu Tyr Pro Phe Gly Ile Ser 45
gaa agt ttc agt atc acc tgt aag Glu Ser Phe Ser Ile Thr Cys Lys 60
gac att gaa gtg gca aac ttt aat Asp Ile Glu Val Ala Asn Phe Asn 75 80
ctt aat cga tcc tct act tgc tac Leu Asn Arg Ser Ser Thr Cys Tyr 90 95
gag gac agt tct ttt aca ctg gaa Glu Asp Ser Ser Phe Thr Leu Glu
Gly Tyr Asp Ser Ile Arg Asn Val Ala Ile Leu Asp Ile Glu Ala 725
96
144
192
240
288
336 100 105 110
aat tta tct ctt tcc gcc aac aac aag tta act gca gta ggc tgt aac Asn Leu Ser Leu Ser Ala Asn Asn Lys Leu Thr Ala Val Gly Cys Asn 115 120 125
gct tta tca ctt ctg gac act ttt gga atg caa aac tac tca act gca Ala Leu Ser Leu Leu Asp Thr Phe Gly Met Gln Asn Tyr Ser Thr Ala 130 135 140
tgc ttg tca tta tgc gat tct ccc cca gag gct gat gga gaa tgt aat Cys Leu Ser Leu Cys Asp Ser Pro Pro Glu Ala Asp Gly Glu Cys Asn 145 150 155 160
ggt aga ggt tgc tgc aga gtc gac gtt tct gcc ccg ttg gat age tat Gly Arg Gly Cys Cys Arg Val Asp Val Ser Ala Pro Leu Asp Ser Tyr 165 170 175
aca ttc gaa act aca tca ggt cgc atc aag cac atg act tct ttt cac Thr Phe Glu Thr Thr Ser Gly Arg Ile Lys His Met Thr Ser Phe His 180 185 190
gac ttt agt cct tgc acc tac gct ttt ctc gtt gaa gat gat aag ttc Asp Phe Ser Pro Cys Thr Tyr Ala Phe Leu Val Glu Asp Asp Lys Phe 195 200 205
aac ttc agt tct aca gaa gat ctt ctg aat ctg cga aat gtc atg agg Asn Phe Ser Ser Thr Glu Asp Leu Leu Asn Leu Arg Asn Val Met Arg 210 215 220
ttc cct gtg tta cta gat tgg tct gtt gga aat cag aca tgc gag caa Phe Pro Val Leu Leu Asp Trp Ser Val Gly Asn Gln Thr Cys Glu Gln 225 230 235 240
gtt gga age aca age ata tgc ggt ggg aac age act tgt ctc gat tct Val Gly Ser Thr Ser Ile Cys Gly Gly Asn Ser Thr Cys Leu Asp Ser 245 250 255
act cct aga aac ggg tat atc tgc aga tgc aat gaa ggc ttt gat ggg Thr Pro Arg Asn Gly Tyr Ile Cys Arg Cys Asn Glu Gly Phe Asp Gly 260 265 270
aat cca tac ctt tca gct ggt tgc caa gac gtc aat gag tgt act act
284
432
480
528
576
624
672
720
768
816
864 Asn Pro Tyr 275
agt agt act Ser Ser Thr
290
aac aag gtt Asn Lys Val 305
gat acc acc Asp Thr Thr
att ctt ctt Ile Leu Leu
gcc tgt ata
Ala Cys Ile 355
gaa caa ttc Glu Gln Phe
370
tca gga gca
Ser Gly Ala 385
ggc atg aag
Gly Met Lys
cag ggt ggc Gln Gly Gly
ata gtt gct
Ile Val Ala 435
Leu Ser Ala Gly
atc cat aga cat Ile His Arg His 295
gga ggc ttc tat Gly Gly Phe Tyr 310
act atg age tgc Thr Met Ser Cys 325
gta acc acc atc Val Thr Thr Ile 340
caa cag aga atg Gln Gln Arg Met
ttc gag caa aat Phe Glu Gln Asn 375
ggg ccg tca aat Gly Pro Ser Asn 390
aaa gca aca aat Lys Ala Thr Asn 405
caa gga aca gtg Gln Gly Thr Val 420
ata aag aaa gcc Ile Lys Lys Ala
Cys Gln Asp Val Asn
280
aac tgt tcg gat ccc Asn Cys Ser Asp Pro 300
tgt aag tgt caa tct Cys Lys Cys Gln Ser 315
aag cgt aaa gag ttt Lys Arg Lys Glu Phe 330
ggc ttc ttg gtc att Gly Phe Leu Val Ile 345
aag cac ctg aag gac Lys His Leu Lys Asp 360
ggt ggc ggc atg ttg Gly Gly Gly Met Leu 380
gtt gat gtc aaa atc Val Asp Val Lys Ile 395
ggt tat gct gag age Gly Tyr Ala Glu Ser 410
tac aaa ggg ata ttg Tyr Lys Gly Ile Leu 425
cga ctt gga gac agt Arg Leu Gly Asp Ser 440
Glu Cys Thr Thr 285
aaa acc tgt aga
Lys Thr Cys Arg
ggt tac cgc tta Gly Tyr Arg Leu 320
gca tgg act aca Ala Trp Thr Thr 335
ctg ctt ggc gtt Leu Leu Gly Val 350
acc aag ctc cga Thr Lys Leu Arg 365
aca caa cga ctc Thr Gln Arg Leu
ttt act gag gat Phe Thr Glu Asp 400
agg atc ctg ggt Arg Ile Leu Gly 415
ccg gac aac tcc Pro Asp Asn Ser 430
age caa gta gag Ser Gln Val Glu 445
912
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1296
1344 cag ttc atc aat gaa gtg ctc gtg ctt tca caa atc aac cat agg aac Gln Phe Ile Asn Glu Val Leu Val Leu Ser Gln Ile Asn His Arg Asn 450 455 460
gta gtc aag ctc ttg ggc tgc tgt cta gag act gaa gtt ccc ttg ttg Val Val Lys Leu Leu Gly Cys Cys Leu Glu Thr Glu Val Pro Leu Leu 465 470 475 480
gtc tat gag ttc atc acc aat ggc acc ctt ttc gat cac ttg cat ggt Val Tyr Glu Phe Ile Thr Asn Gly Thr Leu Phe Asp His Leu His Gly 485 490 495
tcc atg att gat tct tcg ctt aca tgg gaa cac cgt ctg aag ata gca Ser Met Ile Asp Ser Ser Leu Thr Trp Glu His Arg Leu Lys Ile Ala 500 505 510
ata gaa gtc gct gga act ctt gca tat ctt cac tcc tct gct tct att Ile Glu Val Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Leu His Ser Ser Ala Ser Ile 515 520 525
cca atc atc cat cgg gat atc aaa act gca aat att ctt ctg gat gta Pro Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Thr Ala Asn Ile Leu Leu Asp Val 530 535 540
aac tta act gca aaa gta gct gac ttt ggt gct tca agg ctg ata cca Asn Leu Thr Ala Lys Val Ala Asp Phe Gly Ala Ser Arg Leu Ile Pro 545 550 555 560
atg gat aaa gaa gag ctc gaa act atg gtg caa ggc act cta ggt tac Met Asp Lys Glu Glu Leu Glu Thr Met Val Gln Gly Thr Leu Gly Tyr 565 570 575
cta gac cca gaa tat tac aac aca ggg ttg tta aac gaa aag age gat Leu Asp Pro Glu Tyr Tyr Asn Thr Gly Leu Leu Asn Glu Lys Ser Asp 580 585 590
gtt tat agt ttt ggg gtc gtc cta atg gaa ctg ctc tca ggt caa aag Va.l Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met Glu Leu Leu Ser Gly Gln Lys 595 600 605
gca ttg tgc ttt aaa cgg cca cag tcc tca aaa cat ctg gtg agt tac Ala Leu Cys Phe Lys Arg Pro Gln Ser Ser Lys His Leu Val Ser Tyr
1392
1440
1488
1536
1584
1632
1608
1728
1776
1824
1872 610 615
ttt gcg act gcc aca aaa gag aat Phe Ala Thr Ala Thr Lys Glu Asn 625 630
5 gaa gtg atg aac gag gat aat ctg Glu Val Met Asn Glu Asp Asn Leu 645
att gct gca gag tgt aca agg cta Ile Ala Ala Glu Cys Thr Arg Leu 10 660
aaa gaa gta gct gca aag cta Lys Glu Val Ala Ala Lys Leu 675
cat aag tgg tcg gat cag tac 15 His Lys Trp Ser Asp Gln Tyr 690 695
ggt cac atc ttg tca gca caa Gly His Ile Leu Ser Ala Gln 705 710
20 gac age atc aag aat gta Asp Ser Ile Lys Asn Val 725
<210> 4
<211>
25 <212>
<213>
<220>
<4 00>
Met Lys
30
Ala Cys
620
agg ttg gat gag att att ggc ggc Arg Leu Asp Glu Ile Ile Gly Gly 635 640
aag gag atc cag gaa gct gca aga Lys Glu Ile Gln Glu Ala Ala Arg 650 655
atg gga gag gaa agg cca agg atg Met Gly Glu Glu Arg Pro Arg Met 665 670
gcc ttg agg gtc gaa aaa acc aaa Ala Leu Arg Val Glu Lys Thr Lys 685
gag gag aat gaa cac ttg att ggt Glu Glu Asn Glu His Leu Ile Gly
700
gaa acc agt age age att ggc tat Glu Thr Ser Ser Ser Ile Gly Tyr 715 720
ttg gac att gaa act ggc cgc tga Leu Asp Ile Glu Thr Gly Arg 730 735
Ser Leu 15
Asn Cys
gaa Glu 680 cct Pro
ggc Gly
gca ata Ala Ile
735 PRT
Arabidopsis thaliana 4
Val Gln Glu Gly Leu Phe Leu Val Ala Ile Phe Phe 5 10
Thr Gln Leu Val Lys Gly Gln His Gln Pro Gly Glu 20 25 30
1920
1968
2016
2064
2112
2160
2208 Gln Asn Lys Cys Gly Asn Ile Thr Ile Glu Tyr Pro Phe Gly Ile Ser 35 40 45
Ser Gly Cys Tyr Tyr Pro Gly Asn Glu Ser Phe Ser Ile Thr Cys Lys 50 55 60
Glu Asp Arg Pro His Val Leu Ser Asp Ile Glu Val Ala Asn Phe Asn 65 70 75 80
His Ser Gly Gln Leu Gln Val Leu Leu Asn Arg Ser Ser Thr Cys Tyr 85 90 95
Asp Glu Gln Gly Lys Lys Thr Glu Glu Asp Ser Ser Phe Thr Leu Glu 100 105 110
Asn Leu Ser Leu Ser Ala Asn Asn Lys Leu Thr Ala Val Gly Cys Asn 115 120 125
Ala Leu Ser Leu Leu Asp Thr Phe Gly Met Gln Asn Tyr Ser Thr Ala 130 135 140
Gly Arg Gly Cys Cys Arg Val Asp Val Ser Ala Pro Leu Asp Ser Tyr
165 170 175
Thr Phe Glu Thr Thr Ser Gly Arg Ile Lys His Met Thr Ser Phe His 180 185 190
Asp Phe Ser Pro Cys Thr Tyr Ala Phe Leu Val Glu Asp Asp Lys Phe 195 200 205
Asn Phe Ser Ser Thr Glu Asp Leu Leu Asn Leu Arg Asn Val Met Arg 210 215 220
Phe Pro Val Leu Leu Asp Trp Ser Val Gly Asn Gln Thr Cys Glu Gln 225 230 235 240
Val Gly Ser Thr Ser Ile Cys Gly Gly Asn Ser Thr Cys Leu Asp Ser
245 250 255
Thr Pro Arg Asn Gly Tyr Ile Cys Arg Cys Asn Glu Gly Phe Asp Gly 260 265 270
Asn Pro Tyr Leu Ser Ala Gly Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Thr Thr 275 280 285
Ser Ser Thr Ile His Arg His Asn Cys Ser Asp Pro Lys Thr Cys Arg 290 295 300 Asn Lys Val Gly Gly Phe Tyr Cys Lys Cys Gln Ser Gly Tyr Arg 305 310 315
Asp Thr Thr Thr Met Ser Cys Lys Arg Lys Glu Phe Ala Trp Thr 325 330 335
Ile Leu Leu Val Thr Thr Ile Gly Phe Leu Val Ile Leu Leu Gly 340 345 350
Ala Cys Ile Gln Gln Arg Met Lys His Leu Lys Asp Thr Lys Leu 355 360 365
Glu Gln Phe Phe Glu Gln Asn Gly Gly Gly Met Leu Thr Gln Arg 370 375 380
Ser Gly Ala Gly Pro Ser Asn Val Asp Val Lys Ile Phe Thr Glu 385 390 395
Gly Met Lys Lys Ala Thr Asn Gly Tyr Ala Glu Ser Arg Ile Leu 405 410 415
Gln Gly Gly Gln Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Leu Pro Asp Asn 420 425 430
Ile Val Ala Ile Lys Lys Ala Arg Leu Gly Asp Ser Ser Gln Val 435 440 445
Gln Phe Ile Asn Glu Val Leu Val Leu Ser Gln Ile Asn His Arg 450 455 460
Val Val Lys Leu Leu Gly Cys Cys Leu Glu Thr Glu Val Pro Leu 465 470 475
Val Tyr Glu Phe Ile Thr Asn Gly Thr Leu Phe Asp His Leu His 485 490 495
Ser Met Ile Asp Ser Ser Leu Thr Trp Glu His Arg Leu Lys Ile 500 505 510
Ile Glu Val Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Leu His Ser Ser Ala Ser 515 520 525
Pro Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Thr Ala Asn Ile Leu Leu Asp 530 535 540
Asn Leu Thr Ala Lys Val Ala Asp Phe Gly Ala Ser Arg Leu Ile 545 550 555
Leu
320
Thr
Val
Arg
Leu
Asp
400
Gly
Ser
Glu
Asn
Leu
480
Gly
Ala
Ile
Val
Pro
560 Met Asp Lys Glu Glu Leu Glu Thr Met Val Gln Gly Thr Leu Gly Tyr 565 570 575
Leu Asp Pro Glu Tyr Tyr Asn Thr Gly Leu Leu Asn Glu Lys Ser Asp 580 585 590
Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met Glu Leu Leu Ser Gly Gln Lys 595 600 605
Ala Leu Cys Phe Lys Arg Pro Gln Ser Ser Lys His Leu VaI Ser Tyr 610 615 620
Phe Ala Thr Ala Thr Lys Glu Asn Arg Leu Asp Glu Ile Ile Gly Gly 625 630 635 640
Glu Val Met Asn Glu Asp Asn Leu Lys Glu Ile Gln Glu Ala Ala Arg 645 650 655
Ile Ala Ala Glu Cys Thr Arg Leu Met Gly Glu Glu Arg Pro Arg Met 660 665 670
Lys Glu Val Ala Ala Lys Leu Glu Ala Leu Arg Val Glu Lys Thr Lys 675 680 685
His Lys Trp Ser Asp Gln Tyr Pro Glu Glu Asn Glu His Leu Ile Gly 690 695 700
Gly His Ile Leu Ser Ala Gln Gly Glu Thr Ser Ser Ser Ile Gly Tyr 705 710 715 720
Asp Ser Ile Lys Asn Val Ala Ile Leu Asp Ile Glu Thr Gly Arg 725 730 735
<210> 5
<211> 2199
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> mRNA
<222> (1)...(2199)
<223> Cinase 2 associada à parede, cDNA, CDS completo
<400> 5
atg aag gta cag gag ggt ttg ttc gtg gtg gct gtt ttc tac ctt gct 48 Met Lys Val Gln Glu Gly Leu Phe Val Val Ala Val Phe Tyr Leu Ala
5 10 15
tat acg cag cta gtc aag ggg caa cct cgc aag gag tgc caa act aga
Tyr Thr Gln Leu Val Lys Gly Gln Pro Arg Lys Glu Cys Gln Thr Arg 20 25 30
tgt ggc aat gtc gca gtt gag tac cct ttt ggt act tct cca ggt tgt
Cys Gly Asn Val Ala Val Glu Tyr Pro Phe Gly Thr Ser Pro Gly Cys 35 40 45
tac tat ccc gga gat gaa agt ttc aat ctt act tgc aac gag caa gag
Tyr Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Phe Asn Leu Thr Cys Asn Glu Gln Glu 50 55 60
aag ctc ttc ttt ggc aac atg cca gtc atc aac atg tct ctc age ggc
Lys Leu Phe Phe Gly Asn Met Pro Val Ile Asn Met Ser Leu Ser Gly
65 70 75 80
cag ctt cgt gtt cgg cta gtt aga tcc aga gtt tgc tac gat agt caa
Gln Leu Arg Val Arg Leu Val Arg Ser Arg Val Cys Tyr Asp Ser Gln
85 90 95
gga aaa cag act gac tac att gcc cag cgg acc acc ctg ggt aat ttc
Gly Lys Gln Thr Asp Tyr Ile Ala Gln Arg Thr Thr Leu Gly Asn Phe 100 105 110
act ctc tct gaa ctt aac aga ttt act gta gta ggt tgt aac agt tac
Thr Leu Ser Glu Leu Asn Arg Phe Thr Val Val Gly Cys Asn Ser Tyr 115 120 125
gca ttt ctc cgc aca tct gga gtt gaa aaa tac tca act gga tgc ata
Ala Phe Leu Arg Thr Ser Gly Val Glu Lys Tyr Ser Thr Gly Cys Ile 130 135 140
tca ata tgt gat tct gcc aca acg aaa aac gga tca tgt tct ggt gaa
Ser Ile Cys Asp Ser Ala Thr Thr Lys Asn Gly Ser Cys Ser Gly Glu
145 150 155 160
ggt tgc tgc cag atc cct gtc cct aga gga tac tct ttt gtc aga gta
Gly Cys Cys Gln Ile Pro Val Pro Arg Gly Tyr Ser Phe Val Arg Val
165 170 175
144
192
240
288
336
384
432
480
528 10
aaa cca cat age ttt cac aac cat cct act gtg cat ctg ttt aat cct Lys Pro His Ser Phe His Asn His Pro Thr Val His Leu Phe Asn Pro 180 185 190
tgc acc tac gcc ttt ctc gtt gaa gat ggt atg ttt gac ttc cat gct Cys Thr Tyr Ala Phe Leu Val Glu Asp Gly Met Phe Asp Phe His Ala 195 200 205
ttg gaa gat ctc aac aat ctg cga aat gtt act acg ttc cct gta gta Leu Glu Asp Leu Asn Asn Leu Arg Asn Val Thr Thr Phe Pro Val Val 210 215 220
cta gat tgg tct atc gga gac aag act tgc aaa caa gta gaa tac agg Leu Asp Trp Ser Ile Gly Asp Lys Thr Cys Lys Gln Val Glu Tyr Arg 225 230 235 240
ggc gtg tgt ggt ggt aac age aca tgt ttc gat tct act ggt gga acc Gly Val Cys Gly Gly Asn Ser Thr Cys Phe Asp Ser Thr Gly Gly Thr 245 250 255
ggg tat aac tgc aaa tgt tta gaa ggt ttt gag ggg aat cca tac ctt Gly Tyr Asn Cys Lys Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Asn Pro Tyr Leu 260 265 270
cca aac ggt tgt caa gac atc aat gaa tgt att agt agt aga cat aac Pro Asn Gly Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Ile Ser Ser Arg His Asn 275 280 285
tgt tcg gag cat agt acc tgt gaa aac acg aag ggg age ttc aac tgt Cys Ser Glu His Ser Thr Cys Glu Asn Thr Lys Gly Ser Phe Asn Cys 290 295 300
aac tgc cca tct ggt tac cgc aaa gat tcc ctt aat age tgt act cgt Asn Cys Pro Ser Gly Tyr Arg Lys Asp Ser Leu Asn Ser Cys Thr Arg 305 310 315 320
aaa gtc agg cct gaa tac ttt aga tgg act caa att ttt ctt gga acc Lys Val Arg Pro Glu Tyr Phe Arg Trp Thr Gln Ile Phe Leu Gly Thr 325 330 335
acc atc ggc ttc tcg gtt atc atg ctt ggg att age tgt cta caa cag Thr Ile Gly Phe Ser Val Ile Met Leu Gly Ile Ser Cys Leu Gln Gln
576
624
672
720
768
816
864
912
960
1008
1056 340 345 350
aaa att aag cac cgg aag aac aca gag ctc cga caa aaa ttc ttc gag Lys Ile Lys His Arg Lys Asn Thr Glu Leu Arg Gln Lys Phe Phe Glu 355 360 365
caa aat ggt gga ggc atg ttg ata cag cga gtc tcg gga gca ggg cca Gln Asn Gly Gly Gly Met Leu Ile Gln Arg Val Ser Gly Ala Gly Pro 370 375 380
tca aat gtt gat gtc aaa atc ttc act gag aaa gga atg aag gaa gca Ser Asn Val Asp Val Lys Ile Phe Thr Glu Lys Gly Met Lys Glu Ala 385 390 395 400
act aat ggt tac cat gag age aga atc ctg ggt cag gga ggc caa gga Thr Asn Gly Tyr His Glu Ser Arg Ile Leu Gly Gln Gly Gly Gln Gly 405 410 415
aca gtg tac aaa ggg ata ttg ccg gac aac tcc ata gtt gct ata aag Thr Val Tyr Lys Gly Ile Leu Pro Asp Asn Ser Ile Val Ala Ile Lys 420 425 430
aaa gct cgg ctt gga aac cgt age caa gta gag cag ttc atc aac gaa Lys Ala Arg Leu Gly Asn Arg Ser Gln Val Glu Gln Phe Ile Asn Glu 435 440 445
gtg cta gtg ctt tca caa atc aac cat agg aac gtg gtc aag gtc ttg Val Leu Val Leu Ser Gln Ile Asn His Arg Asn Val Val Lys Val Leu 450 455 460
ggg tgt tgt tta gag aca gaa gtc ccc ttg ttg gtc tat gag ttc att Gly Cys Cys Leu Glu Thr Glu Val Pro Leu Leu Val Tyr Glu Phe Ile 465 470 475 480
aac agt ggt acc ctt ttc gat cac ttg cac ggt tcc ttg tat gat tct Asn Ser Gly Thr Leu Phe Asp His Leu His Gly Ser Leu Tyr Asp Ser 485 490 495
tca ctt aca tgg gag cac cgt ctg agg ata gca aca gaa gta gca gga Ser Leu Thr Trp Glu His Arg Leu Arg Ile Ala Thr Glu Val Ala Gly 500 505 510
agt ctt gca tat ctt cac tct tct gct tct att cca atc atc cac cga
1104
1152
1200
1248
1296
1344
1392
1440
1488
1536
1584 Ser Leu Ala Tyr Leu His Ser Ser Ala Ser Ile Pro Ile Ile His Arg 515 520 525
gat atc aag act gct aat att ctc ctg gat aaa aac tta act gca aaa Asp Ile Lys Thr Ala Asn Ile Leu Leu Asp Lys Asn Leu Thr Ala Lys 530 535 540
gta gct gac ttt ggt gca tca aga ttg ata ccg atg gat aaa gag cag Val Ala Asp Phe Gly Ala Ser Arg Leu Ile Pro Met Asp Lys Glu Gln 545 550 555 560
ctc aca aca ata gtg caa ggc act cta ggt tac cta gac cca gaa tat Leu Thr Thr Ile Val Gln Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Glu Tyr
565 570 575
tac aac aca ggg ttg tta aac gaa aag age gat gtt tat agt ttt ggg Tyr Asn Thr Gly Leu Leu Asn Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly 580 585 590
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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Glu
160
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240
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Leu
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Cys
Arg
320
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Pro
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96
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2io
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260 265 270
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325 330 335
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Leu Leu Gly Thr Thr Ile Gly Phe Leu Ile Ile Leu Leu Thr Ile Ser
340 345 350
tat ata caa caa aaa atg agg cac cga aaa aac acc gag ctg cga caa
Tyr Ile Gln Gln Lys Met Arg His Arg Lys Asn Thr Glu Leu Arg Gln
355 360 365
caa ttc ttc gag caa aat ggt ggt ggc atg ttg ata cag cga ctc tca
Gln Phe Phe Glu Gln Asn Gly Gly Gly Met Leu Ile Gln Arg Leu Ser 370 375 380
gga gca ggg cca tca aat gtg gat gtc aaa atc ttt act gaa gaa ggc
Gly Ala Gly Pro Ser Asn Val Asp Val Lys Ile Phe Thr Glu Glu Gly
385 390 395 400
atg aag gaa gca act gat ggt tat aat gag age aga atc cta ggc cag
Met Lys Glu Ala Thr Asp GIy Tyr Asn Glu Ser Arg Ile Leu Gly Gln
405 410 415
gga gga caa gga aca gtc tac aaa ggg ata ttg caa gat aac tcc att
Gly Gly Gln Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Leu Gln Asp Asn Ser Ile
420 425 430
gtt gct ata aag aaa gct cga ctt gga gac cgt age caa gta gag cag
864
912
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1296
1344 Val Ala Ile Lys Lys Ala Arg Leu Gly Asp Arg Ser Gln Val Glu Gln 435 440 445
ttc atc aac gaa gtg cta gtg ctt tca caa ata aac cac agg aac gtg Phe Ile Asn Glu Val Leu Val Leu Ser Gln Ile Asn His Arg Asn Val 450 455 460
gtc aaa ctc ttg ggc tgt tgt cta gag act gaa gtt ccc ttg ttg gtc Val Lys Leu Leu Gly Cys Cys Leu Glu Thr Glu Val Pro Leu Leu Val 465 470 475 480
tat gag ttc att tcc agt ggc act ctt ttt gat cac ttg cac ggt tct Tyr Glu Phe Ile Ser Ser Gly Thr Leu Phe Asp His Leu His Gly Ser
485 490 495
atg ttt gat tct tcg ctt aca tgg gaa cac cgt ctg agg ata gcc ata Met Phe Asp Ser Ser Leu Thr Trp Glu His Arg Leu Arg Ile Ala Ile 500 505 510
gaa gtt gct gga act ctt gca tat ctt cac tcc tat gct tct att cca Glu Val Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Leu His Ser Tyr Ala Ser Ile Pro 515 520 525
atc atc cac cga gat gtc aag act gct aac att ctc ctc gat gaa aac Ile Ile His Arg Asp Val Lys Thr Ala Asn Ile Leu Leu Asp Glu Asn 530 535 540
tta act gca aaa gta gct gat ttt ggt gca tca agg ctg ata ccg atg Leu Thr Ala Lys Val Ala Asp Phe Gly Ala Ser Arg Leu Ile Pro Met 545 550 555 560
gac caa gag cag ctc aca act atg gtt caa gga act ctt ggc tat tta Asp Gln Glu Gln Leu Thr Thr Met Val Gln Gly Thr Leu Gly Tyr Leu
565 570 575
gac cct gaa tac tac aat aca ggg ctt ctg aac gaa aag age gat gtt Asp Pro Glu Tyr Tyr Asn Thr Gly Leu Leu Asn Glu Lys Ser Asp Val 580 585 590
tat age ttt ggg gta gtc ctc atg gaa ctg ctc tca ggt gaa aag gca Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met Glu Leu Leu Ser Gly Glu Lys Ala 595 600 605
1392
1440
1488
1536
1584
1632
1680
1728
1776
1824 tta tgc ttt gaa cgg cca caa age tca aaa cat cta gtg agt tac ttt
Leu Cys Phe Glu Arg Pro Gln Ser Ser Lys His Leu Val Ser Tyr Phe 610 615 620
gtt tet gcc atg aaa gaa aat agg ttg cat gag att att gac ggt caa
Val Ser Ala Met Lys Glu Asn Arg Leu His Glu He He Asp Gly Gln
625 630 635 640
gtt atg aac gag tat aat cag agg gag ate cag gaa tet gea aga att
Val Met Asn Glu Tyr Asn Gln Arg Glu He Gln Glu Ser Ala Arg Ile
645 650 655
gct gtt gag tgt aca aga att atg gga gag gaa agg cca agt atg aaa
Ala Val Glu Cys Thr Arg He Met Gly Glu Glu Arg Pro Ser Met Lys
660 665 670
gaa gta gct gea gag tta gag gcc ttg aga gtc aaa aca acc aaa cat
Glu Val Ala Ala Glu Leu Glu Ala Leu Arg Val Lys Thr Thr Lys His
675 680 685
cag tgg tca gat caa tat ccc aag gag gtt gag cat ttg ctt ggt gtt
Gln Trp Ser Asp Gln Tyr Pro Lys Glu Val Glu His Leu Leu Gly Val 690 695 700
caa ate tta tcg acg caa ggt gat acc agt age att ggc tat gac age
Gln He Leu Ser Thr Gln Gly Asp Thr Ser Ser He Gly Tyr Asp Ser
705 710 715 720
ate cag aat gta aca agg ttg gac att gaa act ggc cgc tga
He Gln Asn Val Thr Arg Leu Asp He Glu Thr Gly Arg 725 730
<210> 10
<211> 733
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <220>
<4 00> 10
Met Lys Val His Ser Leu Phe Leu Met Ala He Phe Phe Tyr Leu Ala 5 10 15
1872
1920
1968
2016
2064
2112
2160
2202 Tyr Thr Gln Leu Val Lys Ala Gln Pro Arg Asp Asp Cys Gln Thr 20 25 30
Cys Gly Asp Val Pro Ile Asp Tyr Pro Phe Gly Ile Ser Thr Gly 35 40 45
Tyr Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Phe Asn Ile Thr Cys Glu Glu Asp 50 55 60
Pro Asn Val Leu Ser Asn Ile Glu Val Leu Asn Phe Asn His Ser 65 70 75
Gln Leu Arg Gly Leu Ile Pro Arg Ser Thr Val Cys Tyr Asp Gln 85 90 95
Thr Asn Asn Asp Phe Glu Ser Leu Trp Phe Arg Leu Asp Asn Leu 100 105 HO
Phe Ser Pro Asn Asn Lys Phe Thr Leu Val Gly Cys Asn Ala Trp 115 120 125
Leu Leu Ser Thr Phe Gly Ile Gln Asn Tyr Ser Thr Gly Cys Met 130 135 140
Leu Cys Asp Thr Pro Pro Pro Pro Asn Ser Lys Cys Asn Gly Val 145 150 155
Cys Cys Arg Thr Glu Val Ser Ile Pro Leu Asp Ser His Arg Ile 165 170 175
Thr Gln Pro Ser Arg Phe Glu Asn Met Thr Ser Val Glu His Phe 180 185 190
Pro Cys Ser Tyr Ala Phe Phe Val Glu Asp Gly Met Phe Asn Phe 195 200 205
Ser Leu Glu Asp Leu Lys Asp Leu Arg Asn Val Thr Arg Phe Pro 210 215 220
Leu Leu Asp Trp Ser Ile Gly Asn Gln Thr Cys Glu Gln Val Val 225 230 235
Arg Asn Ile Cys Gly Gly Asn Ser Thr Cys Phe Asp Ser Thr Arg 245 250 255
Lys Gly Tyr Asn Cys Lys Cys Leu Gln Gly Phe Asp Gly Asn Pro 260 265 270
Arg
Cys
Lys
Gly
80
Gln
Ser
Ala
Ser
Gly
160
Glu
Asn
Ser
Val
Gly
240
Gly
Tyr Leu Ser Asp Gly Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Thr Thr Arg Ile His 275 280 285
Asn Cys Ser Asp Thr Ser Thr Cys Glu Asn Thr Leu Gly Ser Phe His 290 295 300
Cys Gln Cys Pro Ser Gly Ser Asp Leu Asn Thr Thr Thr Met Ser Cys 305 310 315 320
Ile Asp Thr Pro Lys Glu Glu Pro Lys Tyr Leu Gly Trp Thr Thr Val 325 330 335
Leu Leu Gly Thr Thr Ile Gly Phe Leu Ile Ile Leu Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Tyr Ile Gln Gln Lys Met Arg His Arg Lys Asn Thr Glu Leu Arg Gln 355 360 365
Gln Phe Phe Glu Gln Asn Gly Gly Gly Met Leu Ile Gln Arg Leu Ser 370 375 380
Gly Ala Gly Pro Ser Asn Val Asp Val Lys Ile Phe Thr Glu Glu Gly 385 390 395 400
Met Lys Glu Ala Thr Asp Gly Tyr Asn Glu Ser Arg Ile Leu Gly Gln 405 410 415
Gly Gly Gln Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Leu Gln Asp Asn Ser Ile
420 425 430
Val Ala Ile Lys Lys Ala Arg Leu Gly Asp Arg Ser Gln Val Glu Gln 435 440 445
Phe Ile Asn Glu Val Leu Val Leu Ser Gln Ile Asn His Arg Asn Val 450 455 460
Val Lys Leu Leu Gly Cys Cys Leu Glu Thr Glu Val Pro Leu Leu Val 465 470 475 480
Tyr Glu Phe Ile Ser Ser Gly Thr Leu Phe Asp His Leu His Gly Ser 485 490 495
Met Phe Asp Ser Ser Leu Thr Trp Glu His Arg Leu Arg Ile Ala Ile
500 505 510
Glu Val Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Leu His Ser Tyr Ala Ser Ile Pro 515 520 525 Ile Ile His Arg Asp Val Lys Thr Ala Asn Ile Leu Leu Asp Glu Asn 530 535 540
Leu Thr Ala Lys Val Ala Asp Phe Gly Ala Ser Arg Leu Ile Pro Met 545 550 555 560
Asp Gln Glu Gln Leu Thr Thr Met Val Gln Gly Thr Leu Gly Tyr Leu
565 570 575
Asp Pro Glu Tyr Tyr Asn Thr Gly Leu Leu Asn Glu Lys Ser Asp Val 580 585 590
Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met Glu Leu Leu Ser Gly Glu Lys Ala 595 600 605
Leu Cys Phe Glu Arg Pro Gln Ser Ser Lys His Leu Val Ser Tyr Phe 610 615 620
Val Ser Ala Met Lys Glu Asn Arg Leu His Glu Ile Ile Asp Gly Gln 625 630 635 640
Val Met Asn Glu Tyr Asn Gln Arg Glu Ile Gln Glu Ser Ala Arg Ile
645 650 655
Ala Val Glu Cys Thr Arg Ile Met Gly Glu Glu Arg Pro Ser Met Lys 660 665 670
Glu Val Ala Ala Glu Leu Glu Ala Leu Arg Val Lys Thr Thr Lys His 675 680 685
Gln Trp Ser Asp Gln Tyr Pro Lys Glu Val Glu His Leu Leu Gly Val 690 695 700
Gln Ile Leu Ser Thr Gln Gly Asp Thr Ser Ser Ile Gly Tyr Asp Ser 705 710 715 720
Ile Gln Asn Val Thr Arg Leu Asp Ile Glu Thr Gly Arg
725 730
<210> 11 <211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético (iniciador de PCR WAK_NDE) <400> 11
catatgaaag tgcagcgtct gtt 23
<210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Seqüência artificial <22 0> <223> Oligonucleotídeo sintético <400> 12 tctagatcag cggcctgctt caa 23

Claims (18)

1. Construto de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo WAW ligada operavelmente a um promotor preferido de xilema, que causa superexpressão da dita seqüência de polinucleotídeos de WAK.
2. Construção de ácido nucleico, de acordo com reivindicação 1, em que o dito promotor preferido de xilema é selecionado do grupo que con- siste em um promotor do gene TUB, promotor do gene SuSy, promotor do gene COMT e promotor do gene C4H.
3. Planta transgênica compreendendo o construto de ácido nu- cleico como definido na reivindicação 1, em que a dita planta apresenta um aumento no comprimento das fibras e/ou na altura comparada a uma planta não-transgênica da mesma espécie.
4. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 3, em que o promotor preferido de xilema é selecionado do grupo que consiste em um promotor do gene TUB, promotor do gene SuSy, promotor do gene COMT e promotor do gene C4H.
5. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 3, em que a dita planta é uma planta dicotiledônea.
6. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 3, em que a dita planta é uma planta monocotiledônea.
7. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 3, em que a dita planta é uma gimnosperma.
8. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 3, em que a dita planta é uma árvore de madeira de lei.
9. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 8, em que a dita árvore de madeira de Iei é uma árvore de Eucalyptus.
10. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 8, em que a dita árvore de madeira de Iei é uma árvore Populus.
11. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 7, em que a dita gimnosperma é uma árvore Pinus.
12. Parte da planta transgênica como definida na reivindicação .3, em que a dita parte é selecionada do grupo que consiste em uma folha, um caule, uma flor, um ovário, uma fruta, uma semente e um calo.
13. Progênie da planta transgênica como definido na reivindica- ção 3.
14. Progênie, de acordo com a reivindicação 13, em que tal pro- gênie é uma planta híbrida.
15. Método para aumentar o comprimento das fibras e/ou da al- tura de uma planta, compreendendo: (a) introduzir um construto de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos de WAK ligada operavelmente a um promotor preferido de xilema, que causa uma superexpressão da dita se- qüência de polinucleotídeos de WAK; (b) cultivar a dita planta sob condições que promovam o cresci- mento de uma planta; e (c) selecionar uma planta transgênica que possua comprimento da fibra e/ou altura da planta aumentados comparado a uma planta não- transgênica da mesma espécie.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o dito promotor preferido de xilema é selecionado do grupo que consiste em um promotor do gene TUB, promotor do gene SuSy, promotor do gene COMT e promotor do gene C4H.
17. Polpa de madeira obtida de uma planta transgênica como definida na reivindicação 3.
18. Fibra de madeira obtida de uma planta transgênica como definido na reivindicação 3.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8648231B2 (en) * 2008-11-24 2014-02-11 The Regents Of The University Of California Wall-associated kinase-like polypeptide mediates nutritional status perception and response

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1339684C (en) 1988-05-17 1998-02-24 Peter H. Quail Plant ubquitin promoter system
DK0426641T3 (da) 1989-10-31 2000-10-23 Monsanto Co Promotor til transgene planter
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
US6096950A (en) 1992-05-18 2000-08-01 Monsanto Company Cotton fiber-specific promoters
US6165793A (en) 1996-03-25 2000-12-26 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
EP1161541A4 (en) 1999-02-26 2004-11-24 Cropdesign Nv METHOD FOR MODIFYING THE MORPHOLOGY, BIOCHEMISTRY OR PHYSIOLOGY OF PLANTS USING SUBSTRATES COMPRISING CDC25
BR0015634A (pt) 1999-11-17 2002-12-31 Mendel Biotechnology Inc Planta, polinucleotìdeo, vetor, célula, composição, polipeptìdeo, métodos para produzir uma planta e para identificar um fator que é modulado por, ou interage com, um polipeptìdeo codificado por um polinucleotìdeo, uma molécula que module a atividade ou a expressão de um polinucleotìdeo ou polipeptìdeo de interesse e uma sequência similar ou homóloga a um ou mais polinucleotìdeos e sistema integrado, meio computadorizado ou legìvel em computador
JP2003521940A (ja) 2000-02-08 2003-07-22 株式会社サカタのタネ 植物形質転換のための新規方法および構築物
SE0000751D0 (sv) * 2000-03-07 2000-03-07 Swetree Genomics Ab Transgenic trees and methods for their production
AU782244B2 (en) 2000-08-01 2005-07-14 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Isolation and characterization of a fiber-specific actin promoter from cotton
EP1406483A4 (en) 2000-08-22 2005-05-25 Mendel Biotechnology Inc GENE FOR CHANGING THE PROPERTIES OF PLANTS
WO2003000898A1 (en) 2001-06-22 2003-01-03 Syngenta Participations Ag Plant genes involved in defense against pathogens
SE0301233D0 (sv) * 2003-04-28 2003-04-28 Swetree Technologies Ab Tissue specific promoters
ES2584316T3 (es) 2004-04-06 2016-09-27 Fibria Celulose S/A Promotores preferidos del cámbium/xilema y usos de los mismos
AP2691A (en) * 2004-08-18 2013-07-16 Alellyx Sa Polynucleotides, Dna constructs and methods for the alteration of plant lignin content and/or composition
SE0403132D0 (sv) 2004-12-21 2004-12-21 Swetree Technologies Ab New transgenic plants and methods for their production
GB0513248D0 (en) 2005-06-29 2005-08-03 Boc Group Plc Gas dispenser

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