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ES2584316T3 - Promotores preferidos del cámbium/xilema y usos de los mismos - Google Patents

Promotores preferidos del cámbium/xilema y usos de los mismos Download PDF

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ES2584316T3
ES2584316T3 ES12191983.1T ES12191983T ES2584316T3 ES 2584316 T3 ES2584316 T3 ES 2584316T3 ES 12191983 T ES12191983 T ES 12191983T ES 2584316 T3 ES2584316 T3 ES 2584316T3
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ES
Spain
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plant
xylem
seq
cambium
sequence
Prior art date
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Application number
ES12191983.1T
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English (en)
Inventor
Fabio Papes
Isabel Rodrigues Gerhardt
Paulo Arruda
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Fibria Celulose SA
Original Assignee
Fibria Celulose SA
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Publication date
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la capacidad de iniciar, en una planta, la transcripción de un gen de una manera preferida de tejido de xilema y/o cámbium, en la que dicha molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3.

Description

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DESCRIPCION
Promotores preferidos del cambium/xilema y usos de los mismos Campo de la invencion
La invencion se refiere, en lmeas generales, al campo de biologfa molecular, bioqmmica y agricultura. Mas particularmente, la invencion se refiere a polinucleotidos adecuados para la regulacion de la expresion genica en plantas y la generacion de plantas transgenicas con calidad y productividad mejoradas.
Antecedentes y tecnica anterior de la invencion
La modificacion de un rasgo en plantas, a traves de modificacion por ingeniena genetica, depende de la insercion, en el genoma de la planta, de una construccion polinucleotidica que contiene el gen de interes, unido operativamente a un promotor que es funcional en la planta transgenica. Dentro del genoma de una planta, cualquier gen sencillo esta, en general, unido operativamente a un promotor, que determinara cuando y donde, debe expresarse el gen dentro de los tejidos y organos de la planta. Por lo tanto, si se quiere expresar un gen de interes en los tejidos u organos espedficos dentro de una planta transgenica y de una manera temporalmente regulada, deben usarse promotores preferidos de tejido. Por otro lado, la expresion en todos los tejidos de la planta, a lo largo del ciclo de vida de la planta, se conseguina usando promotores constitutivos.
En diversas situaciones, la expresion de genes particulares en tejidos u organos particulares, confiere a la planta un fenotipo de interes espedfico. Por ejemplo, si se quiere mejorar la calidad nutricional de semillas de cereales, se inserta un gen que confiere dicho fenotipo usando promotores espedficos de semillas, en lugar de usar promotores constitutivos, que permitinan al gen expresarse en todos los tejidos de la planta produciendo, en algunos casos, fenotipos no deseables. En otro ejemplo, si se quiere aumentar la cantidad de celulosa en los tejidos vasculares en desarrollo de un arbol forestal, en el genoma de la planta debe introducirse un promotor preferido de xilema y/o cambium unido operativamente a un gen heterologo que codifica una enzima implicada en el metabolismo de celulosa, de tal manera que podnan producirse mas moleculas de celulosa en el xilema de la planta en desarrollo. En otro ejemplo, el fenotipo deseado podna obtenerse inhibiendo la expresion de un gen endogeno dentro de un tejido espedfico de la planta. Eso podna realizarse introduciendo una construccion que comprendiese un promotor preferido de tejido unido operativamente a un polinucleotido que inhibiese la expresion del gen endogeno, bien mediante hibridacion antisentido o bien mediante silenciamiento de ARN (Matzke (ed.) et al. (2000) Plant Gene Silencing. Kluwer Academic Publishers).
El documento WO 99/09188 desvela un promotor espedfico de xilema derivado del gen de la CCoAOMT del alamo.
Hasta ahora, la produccion de plantas modificadas por ingeniena genetica que expresan rasgos utiles y/o deseables requiere la disponibilidad de promotores que permitan al gen o genes de interes expresarse de una manera espedfica de tejido y sincronizacion. Por tanto, el aislamiento y la caracterizacion de promotores preferidos de tejido, particularmente preferidos de cambium/xilema, que pueden servir como regiones reguladoras para la expresion de secuencias nucleotfdicas heterologas de interes de una manera preferida de tejido, es esencial para la modificacion de plantas, mediante ingeniena genetica, que exhiben rasgos particulares.
Sumario de la invencion
Un primer objeto de la invencion se refiere a una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que tiene la capacidad de iniciar, en una planta, la transcripcion de un gen de una manera preferida de tejido de xilema y/o cambium, en el que dicha molecula de acido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleotidos como se expone en la SEQ ID NO: 3.
Un segundo objeto de la invencion se refiere a un vector de expresion, preferentemente un plasmido, que comprende:
i) la molecula de acido nucleico aislada, como se define anteriormente; y
ii) una molecula de acido nucleico que codifica una protema de interes, en la que (i) y (ii) estan en union operativa, en la que (i) no regula normalmente (ii).
Un tercer objeto de la invencion se refiere a una celula de planta hospedadora recombinante, en la que dicha celula hospedadora recombinante se transforma o transfecta con y comprende
i) la molecula de acido nucleico aislada, como se define anteriormente; y
ii) una molecula de acido nucleico que codifica una protema de interes, en la que (i) y (ii) estan en union operativa, en la que (i) no regula normalmente (ii).
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Un cuarto objeto de la invencion se refiere a una celula hospedadora recombinante, en la que dicha celula hospedadora recombinante se transforma o transfecta con, y comprende, el vector de expresion como se define anteriormente.
Otro objeto de la invencion se refiere a un metodo de preparacion de una celula de planta hospedadora recombinante, comprendiendo dicho metodo transformar o transfectar una celula con el vector de expresion como se define anteriormente.
Otro objeto de la invencion se refiere a un metodo de preparacion de una protema codificada por el vector de expresion como se define anteriormente que comprende transformar o transfectar una celula con dicho vector de expresion, y cultivar dicha celula en condiciones favorables para la expresion de dicha protema.
Otro objeto de la invencion se refiere a un metodo para la preparacion de una protema, comprendiendo dicho metodo cultivar una planta o una parte de la planta, que comprenda una celula de planta hospedadora recombinante como se define anteriormente, en condiciones que favorezcan la produccion de dicha protema por dicha planta o parte de planta.
Otro objeto de la invencion se refiere a una planta o a una parte de la planta que comprende la celula de planta recombinante como se define anteriormente.
La presente memoria descriptiva describe moleculas de acido nucleico reguladoras aisladas del genoma de Populus sp, y metodos para regular la expresion de secuencias nucleotidicas heterologas en tejidos de plantas, tal como de una manera preferida de xilema y/o cambium. En el presente documento se describen moleculas de acido nucleico aisladas que representan promotores con capacidad para dirigir la expresion espedfica de tejido de genes de interes. Las moleculas de acido nucleico reguladoras descritas en el presente documento corresponden a secuencias promotoras de genes que se expresan preferentemente en el cambium y/o en el xilema de Populus sp. Se descubrio que, los genes que codificaban isoformas de sacarosa sintasa (SuSy), alfa-tubulina (TUB), protema arabinogalactanica (ARAB), acido cafeico 3-O-metiltrasferasa (COMT), cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD), cinamato 4-hidroxilasa (C4H), cinamoil CoA reductasa (CCR), ferulato-5-hidroxilasa (F5H), sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD), UDP-D-glucuronato carboxi-liasa (UDP), protema de transferencia de lfpidos (LTP) y ag-13 (AG13), se expresaban en el tejido del cambium/xilema de Populus sp y sus promotores, se habfan aislado, clonado y validado. Cuando estos promotores se asociaban en una planta transgenica con genes distintos a aquellos con los que se uman originalmente, los genes en cuestion se expresaban preferentemente en el cambium y/o en el xilema de dicha planta transgenica. Se proporcionan metodos de uso de los promotores preferidos de cambium/xilema, desvelados en el presente documento, para la regulacion, en una planta, de la expresion de secuencias de nucleotidos heterologas, de una manera preferida de cambium y/o xilema.
Los promotores preferidos de cambium/xilema se identificaron mediante el analisis de un conjunto de etiquetas de secuencia expresada (EST, acronimo del ingles Expressed Sequence Tag) de Populus sp, que representan tejidos del brote apical, la corteza, el cambium, la semilla, el xilema, la hoja y la rafz. Basandose en el perfil de expresion de estas EST entre los diferentes tejidos, se mostro que los doce genes indicados anteriormente se expresaban de manera elevada y preferentemente en el cambium y/o xilema de Populus.
Los promotores preferidos de cambium/xilema descritos en el presente documento se exponen en las SEQ ID NOS.: 1-12. Tambien se describen fragmentos de estas secuencias de nucleotidos, es decir, los expuestos en las SEQ ID NOS.: 1-12 que comprenden al menos 20 nucleotidos consecutivos. Los fragmentos mas pequenos, aunque no necesariamente codifican promotores o protemas con actividad promotora, pueden actuar como moleculas antisentido y desactivar genes expresados y de origen natural. Las composiciones descritas comprenden adicionalmente secuencias de nucleotidos que tienen una identidad de al menos 65 % con las secuencias expuestas en las SEQ ID NOS.: 1-12 o con un fragmento de las mismas, y secuencias de nucleotidos que hibridan en condiciones de alta rigurosidad con una cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.
“Condiciones rigurosas”, como se usa en el presente documento, se refieren a parametros con los que la tecnica esta familiarizada, tales como hibridacion en 3,5xSSC, solucion 1xDenhardt, tampon fosfato sodico 25mM (pH 7,0), SDS al 0,5 % y EDTA 2mM durante 18 horas a 65 ° C, seguido de 4 lavados del filtro a 65 ° C durante 20 minutos, en 2XSSC, SDS al 0,1 %, y un lavado final durante hasta 20 minutos en 0,5xSSC, SDS al 0,1 % o 0,3xSSC y SDS al 0,1 % para mayor rigurosidad, y 0,1xSSC, SDS al 0,1 % para incluso mayor rigurosidad. Otras condiciones pueden sustituirse, siempre que el grado de rigurosidad sea igual al proporcionado en el presente documento, usando un lavado final de 0,5xsSc.
Otras facetas de la presente invencion incluyen construcciones, tales como vectores de expresion que comprenden los promotores unidos operativamente a una secuencia de nucleotidos de interes, que codifica una protema deseada. El promotor desvelado en el presente documento tiene la capacidad de dirigir la expresion de polinucleotidos de interes en una celula de planta y dicho promotor comprende una cualquiera de las secuencias de nucleotidos de la presente invencion.
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Tambien son una parte de la invencion plantas recombinantes o celulas de plantas que tienen, en sus genomas, incorporada de manera estable la construccion descrita anteriormente o el propio promotor.
Los metodos de la invencion tambien incluyen metodos para incorporar en las celulas, de manera estable, los productos de la invencion.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 ilustra esquematicamente el vector plasirndico pAPROMATG+promotor que comprende el gen indicador GUS unido operativamente a una secuencia promotora. Los promotores se clonaron en este vector plasirndico en sustitucion de la secuencia promotora representada.
La Figura 2 muestra el perfil de expresion de genes SuSy, TUB, ARAB, UDP, LTP y AG13, en un conjunto de tejidos de Populus, que estan bajo el control de los promotores descritos en el presente documento en Populus.
La Figura 3 muestra el perfil de expresion de genes COMT; CAD, C4H, CCR, F5H y SAD, en un conjunto de tejidos de Populus, que estan bajo el control de los promotores de la memoria descriptiva en Populus.
La Figura 4 ilustra esquematicamente el vector plasirndico pALELLYXgi que es otro aspecto de la divulgacion.
Las Figuras 5A y 5B muestran actividad beta-glucuronidasa en el tallo en floracion de plantas de Arabidopsis transformadas de acuerdo con el Ejemplo 3.
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
Las composiciones descritas en el presente documento comprenden nuevas secuencias de nucleotidos para promotores de plantas, particularmente promotores preferidos de cambium/xilema para los genes de Populus (alamo lenoso) que codifican sacarosa sintasa (SuSy), alfa-tubulina (TUB); protema arabinogalactanica (ARAP), acido cafeico 3-O-metiltrasferasa (COMT), cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD), cinamato 4-hidrolasa (C4H), cinamoil CoA reductasa (CCR), ferulato-5-hidroxilasa (F5H), sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD), UDP-D-glucuronato carboxi-liasa (UDP), protema de transferencia de lfpidos y ag-13 (AG13). Las secuencias de nucleotidos de estos promotores se exponen en las SEQ ID NOS.: 1-12, respectivamente. Estos promotores se aislaron de la region no traducida 5' que flanquea los sitios de inicio de la transcripcion de sus genes respectivos. En la tecnica se conocen bien metodos para el aislamiento de los promotores e incluyen herramientas bioinformaticas, tales como Phred, Phrap, Consed (Gordon et al. (1998) Genome Research. 8:195-202) para el ensamblaje de genes, alineamiento de secuencias (Durbin et al. (1998) Biological sequence analysis - probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, Cambridge, UK), busqueda funcional (Altschul et al. (1997) Nucleic Acid Res: 25:33893402) y tecnicas de PCR (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning - a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Algunos de estos metodos se describen en el Ejemplo 1 anteriormente.
Se describen moleculas de acido nucleico aisladas que abarcan 0,1 kb, 0,5 kb, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb o 5 kb que comienzan en el codon de inicio ATG para la region codificante de los genes en cuestion. En el presente documento, las moleculas de acido nucleico aisladas reciben el nombre de promotores. Los promotores corresponden a las moleculas de acido nucleico cuya funcion es regular la expresion de un gen. Un promotor generalmente comprende secuencias de senalizacion espedficas denominadas cajas, que se disponen a lo largo de la secuencia promotora, de tal manera que su composicion determina la expresion temporal y espacial de un gen que esta bajo su control regulador. “Promotor” o “region de inicio de la transcripcion” significa una region reguladora de ADN que normalmente comprende una caja TATA que tiene la capacidad de dirigir la ARN polimerasa 2 para iniciar la smtesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripcion apropiado para una secuencia codificante particular. Un promotor puede comprender adicionalmente otras secuencias de reconocimiento, generalmente ubicadas cadena arriba o en direccion 5' hacia la caja TATA, denominadas elementos promotores cadena arriba, que influyen en la velocidad de inicio de la transcripcion. Se reconoce que, habiendo identificado las secuencias de nucleotidos para las regiones promotoras desveladas en el presente documento, el aislar e identificar elementos reguladores adicionales en la region no traducida 5', cadena arriba desde las regiones promotoras particulares identificadas en el presente documento, se encuentra dentro de la ultima tecnologfa.
Por tanto, las regiones promotoras desveladas en el presente documento, en general, tambien se definen por elementos reguladores cadena arriba adicionales, tales como los responsables de la expresion temporal y tisular de la secuencia codificante, potenciadores y similares. De la misma manera, los elementos promotores, que facilitan la expresion en el tejido deseado, tal como xilema y/o cambium, pueden identificarse, aislarse y utilizarse con otro promotor principal para conferir expresion preferida en el cambium/xilema.
En el presente documento se identificaron promotores que regulaban la expresion de genes espedficamente en el cambium y/o xilema, y se aislaron de Populus sp.
El gen SuSy codifica una isoforma de sacarosa sintasa, una enzima implicada en la transformacion de sacarosa en UDP-glucosa en el xilema en desarrollo. La UDP-glucosa es el bloque funcional de la celulosa que se sintetiza y deposita en la pared celular de la planta. El gen SuSy desvelado en el presente documento se expresa
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preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 2).
El gen TUB codifica una isoforma de alfa-tubulina, una protema globular estructural implicada en la formacion de microtubulos, que forman parte del citoesqueleto. El gen TUB desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium y/o xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 2).
El gen ARAB codifica una isoforma de protema arabinogalactanica, miembro de una gran familia de glucoprotemas asociadas a la pared celular de las plantas de funcion desconocida. El gen ARAB desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 2).
El gen COMT codifica una isoforma de acido cafeico 3-O-metiltransferasa implicado en la metilacion tanto del acido cafeico como del acido 5-hidroxiferulico. Estos son compuestos intermedios de la biosmtesis de lignina. El gen COMT desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen CAD codifica una isoforma de cinamil alcohol deshidrogenasa, una enzima que cataliza la etapa final en la smtesis de monolignoles, transformando de este modo los cinamaldehndos en sus alcoholes correspondientes. El gen CAD desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen C4H codifica una isoforma de cinamato 4-hidroxilasa, un miembro de la superfamilia de monooxigenasas del citocromo P450 implicado en la catalisis de la primera reaccion oxidativa en el metabolismo de los fenilpropanoides, en concreto, en la transformacion del acido trans-cinamico en acido p-coumarico. El gen C4H desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen CCR codifica una isoforma de cinamoil CoA reductasa, que cataliza la transformacion de esteres de cinamoil CoA en sus cinamaldetndos correspondientes, la primera etapa espedfica en la smtesis de monomeros de lignina. El gen CCR desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen F5H codifica una monooxigenasa dependiente de P450 que cataliza la hidroxilacion de acido ferulico en una biosmtesis dirigida hacia acido sinapico y siringil lignina. El gen F5H desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen SAD codifica una sinapil alcohol deshidrogenasa que actua como mediadora en la reduccion de sinapaldehndo en siringil monolignoles en angiospermas. El gen SAD gene desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen UDP codifica la enzima UDP-D-glucuronato carboxi-liasa implicada en la degradacion de UDP-D- glucuronato en UDP-D-xilosa y CO2. El gen UDP desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen LTP codifica una isoforma de protema de transferencia de lfpidos, un miembro de una familia que se piensa que participa en la formacion de cutina, embriogenesis, reacciones de defensa contra fitopatogenos, simbiosis, y en la adaptacion de las plantas a diversas condiciones ambientales. El gen LTP desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen AG13 codifica una protema ag-13 de funcion desconocida, cuya expresion se ha asociado con el proceso de maduracion en diversas especies de plantas. El gen AG13 desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
Las secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema descritas en el presente documento dirigen la expresion de secuencias de nucleotidos unidas operativamente de una manera preferida de cambium/xilema. El Ejemplo 4 ilustra la expresion del gen indicador GUS en el complejo de vasos/fibras del cambium/xilema de Arabidopsis thaliana transformado con una construccion que contiene el gen indicador GUS unido operativamente a dos promotores preferidos de cambium/xilema de la invencion, es decir, los promotores TUB (sEq ID NO.: 2) y C4H (SEQ ID NO.: 6). El ejemplo 4 tambien resume resultados que muestran la expresion del gen indicador GUS en plantas de Arabidopsis transformadas con construcciones que contienen el gen indicador GUS unido operativamente
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a cada una de las secuencias promotoras desveladas en el presente documento. Por tanto, las secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema desveladas en el presente documento pueden usarse para expresar una secuencia de interes unida operativamente en el cambium y/o en el xilema. Por tanto, pueden usarse promotores preferidos de cambium/xilema para mejorar la calidad de la madera de los arboles, bien aumentado la smtesis de celulosa o disminuyendo la smtesis de lignina. “Disminuyendo la smtesis de lignina” significa disminuir el contenido total de lignina de los arboles lenosos de entre cualquiera de 1-90 %, preferentemente entre aproximadamente 8090 % con respecto al contenido de lignina en plantas normales cultivadas en campos. “Aumentando la smtesis de celulosa” significa aumentar el contenido total de celulosa de arboles lenosos en 1,90%, preferentemente entre aproximadamente 80-90 %, en comparacion con plantas normales cultivadas en campos.
Ademas, los promotores preferidos de cambium/xilema pueden usarse para inhibir la expresion de genes implicados en el metabolismo del xilema en desarrollo. La inhibicion de dichos geles disminuye la concentracion de lignina y/o cambia la relacion entre guayacilo y siringilo, los bloques funcionales de las ligninas. La composicion monomerica de las ligninas es una caractenstica importante desde el punto de vista industrial, porque las ligninas ricas en unidades siringilo se degradan mas facilmente durante el proceso de pulpeo, ya que contienen enlaces de carbono 5-5' menos fuertes. Por tanto, la determinacion de la proporcion de siringilo con respecto a guayacilo (S/G) es util en la evaluacion de la calidad de la madera para la produccion de celulosa y la fabricacion de papel (Boudet et al., 1998). “El cambio de la relacion entre siringilo y guayacilo” se refiere a aumentar la proporcion de siringilo/guayacilo en 190 %, preferentemente de aproximadamente 80-90 % en comparacion con plantas normales cultivadas en campos.
Otras moleculas de acido nucleico descritas en el presente documento son variantes y/o fragmentos de las secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema, tales como las que codifican fragmentos, analogos o derivados de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema nativas desveladas en el presente documento. Dichas variantes y/o fragmentos pueden ser, por ejemplo, variantes de origen natural de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema, o variantes de origen no natural de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema. Por ejemplo, la secuencia de nucleotidos de dichas variantes y/o fragmentos puede incluir deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o mas nucleotidos en comparacion con las secuencias promotoras nativas preferidas de cambium/xilema. Dichas variantes y/o fragmentos puede conservar la actividad biologica y por tanto conducir, de una manera preferida de cambium/xilema, la expresion de secuencias de nucleotidos unidas operativamente. Los fragmentos de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema comprenden de aproximadamente 10, a aproximadamente 4.000 nucleotidos o hasta el numero de nucleotidos en las secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema de longitud completa desveladas en el presente documento, tal como los 700-3.500 nucleotidos de las SEQ ID NOS.: 1-12.
Por “variantes” se entiende la inclusion de secuencias sustancialmente similares. Las “variantes” de origen natural y no natural de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema , son moleculas de acido nucleico que tienen una identidad de secuencia de al menos 65 % con las secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema nativas desveladas en el presente documento, es decir, SEQ ID NOS.: 1-12. Las “variantes” tambien incluyen moleculas de acido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas, como se define en el presente documento, con las secuencias de acido nucleico promotoras preferidas de cambium/xilema de SEQ ID NOS.: 1-12 o con el complemento de las secuencias de SEQ ID NOS.: 1-12. Por ejemplo, dichas “variantes” pueden ser moleculas de acido nucleico que hibridan con la secuencia de SEQ ID NOS.: 1-12 o con el complemento de las secuencias de SEQ ID NOS.: 1-12 en condiciones de rigurosidad baja, en condiciones de rigurosidad moderada, o en condiciones de rigurosidad alta. Como alternativa, dichos acidos nucleicos son los que tienen una secuencia de nucleotidos que es el complemento de la longitud completa o de partes de las secuencias de SEQ ID NOS.: 1-12. Otras variantes de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema descritas en el presente documento son polinucleotidos que comparten una identidad de secuencia de al menos 65 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 %, y lo mas preferentemente al menos 95 %, con las secuencias de SEQ ID NOS.: 1-12 o el complemento de las secuencias de SeQ ID NOS.: 1-12.
Las “condiciones rigurosas”, como las usadas en el presente documento, se refieren a los parametros expuestos anteriormente.
Para los fines de la presente invencion, la identidad de secuencia de cualquiera de las secuencias promotoras desveladas en el presente documento se realiza preferentemente usando metodologfas conocidas en la tecnica tales como el programa BLAST, o cualquier programa de alineamiento de secuencias que permita el alineamiento de nucleotidos identicos y la verificacion de emparejamientos erroneos entre nucleotidos no identicos de manera que pueda calcularse el porcentaje de identidad de las secuencias comparadas.
Los promotores preferidos de cambium/xilema descritos en el presente documento pueden usarse para expresar un gen de interes. Por ejemplo, usando promotores preferidos de cambium/xilema, la expresion de genes nativos y/o no nativos podna regularse en los tejidos del cambium y/o xilema de una planta, alterando de este modo el contenido de celulosa, el contenido lignina, la resistencia a patogenos o a insectos, el desarrollo y calidad de la madera, y similares, de la planta:
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Los genes nativos y/o no nativos incluyen aquellas enzimas codificantes, transportadores; cofactores, factores de la trascripcion y diversos otros genes que afectanan a la deposicion de celulosa y/o lignina en la planta o a la resistencia a patogenos o a insectos.
Para la presente invencion, los “genes de interes” incluyen aquellos que estan implicados en el metabolismo de la celulosa y de la lignina. Se reconoce que cualquier gen de interes puede estar unido operativamente al promotor de la invencion y expresarse en los tejidos del cambium y/o xilema de la planta.
Cuando los promotores preferidos de cambium/xilema de la presente invencion estan unidos operativamente a un gen de interes e incorporados de manera estable en el genoma de una planta, dirigen la expresion preferida de cambium y/o xilema de dicho gen de interes. Se entiende que, la expresion preferida de cambium y/o xilema significa que la expresion del gen de interes es mas abundante en el cambium y/o en el xilema, aunque en otros tejidos de la planta puede aparecer algun nivel de expresion del gen de interes. El cambium incluye cualquier parte del tejido del cambium o procambium en cualquier organo de la planta, incluyendo, pero sin limitacion, la rafz, brote, tallo, madera, hoja, peciolo y similares. Xilema significa cualquier parte del tejido del xilema, incluyendo pero sin limitacion, traqueidas, elementos traqueales, vasos, fibras anastomosadas y medula. Algunos de los promotores desvelados en el presente documento pueden dirigir, de forma perceptible, la expresion de genes, al xilema secundario en lugar de al xilema primario.
Las construcciones que contienen los promotores preferidos de cambium/xilema desvelados en la presente invencion y un gen de interes unido operativamente, pueden proporcionarse en casetes de expresion como se representa en las figuras. Dichos casetes de expresion comprenden el promotor preferido de cambium/xilema de la presente invencion, o variantes o fragmentos del mismo, unido operativamente a un gen de interes cuya expresion se dirige al cambium y/o xilema. Dicho casete de expresion puede contener sitios de restriccion para la insercion del gen de interes bajo el control transcripcional de los promotores preferidos de cambium/xilema. El casete de expresion puede contener adicionalmente diversas otras secuencias de acido nucleico, incluyendo genes marcadores de seleccion; secuencias de inicio de la transcripcion y de la traduccion y una secuencia de terminacion de la transcripcion y la traduccion de la planta. La region de terminacion puede ser nativa con la secuencia de ADN de interes o puede ser la del plasmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones terminadoras de la octopina sintasa y de la nopalina sintasa (Gielen et al., EMBO J., 3:835-846 (1984), Depicker et al., Mol. y Appl. Genet., 1:561-573 81982))
En los casetes de expresion pueden incluirse genes indicadores o genes marcadores de seleccion. Pueden encontrarse ejemplos de genes indicadores adecuados conocidos en la tecnica, por ejemplo, en Jefferson et al. (1991) en Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pag. 1-33. Los genes marcadores de seleccion para la seleccion de celulas o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes marcadores de seleccion adecuados incluyen, pero sin limitacion, genes que codifican resistencia a sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136), bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423), glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481) y a fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518).
Los casetes de expresion de la presente invencion, unidos operativamente a un gen de interes, son utiles para la transformacion de diversas plantas. Dichas plantas, incluyen, pero sin limitacion, especies de Eucaliptus (E. alba, E. albens, E. amygdalina, E. aromaphloia, E. baileyana, E. balladoniensis, E. bicostata, E. botryoides, E. brachyandra, E. brassiana, E. brevistylis, E. brockwayi, E. camaldulensis, E. ceracea, E. cloeziana, E. coccifera, E. cordata, E. cornuta, E. corticosa, E. crebra, E: croajingolensis, E. curtisii, E. dalrympleana, E. deglupta, E, delegatensis, E. delicata, E. diversicolor, E.diversifolia, E. dives, E. dolichocarpa, E. dundasii, E. dunnii, E. elata, E. erythrocorys, E. erythrophloia, E. eudesmoides, E. falcata, E. gamophylla, E. glaucina, E. globulus, E. globulus subsp. bicostata, E. globulus subsp. globulus, E. gongylocarpa, E. grandis, E. grandis x urophylla, E. guilfoylei, E. gunnii, E. hallii, E, houseana, E. jacksonii, E. lansdowneana, E. latisinensis, E. leucophloia, E. leucoxylon, E. lockyeri, E. lucasii, E. maidenii, E. marginata, E. megacarpa, E. melliodora, E. michaeliana, E. microcorys, E. microtheca, E. muelleriana, E. nitens, E. nitida, E. obliqua, E. obtusiflora, E. occidentalis, E. optima, E. ovata, E. pachyphylla, E. pauciflora, E. pellita, E. perriniana, E. petiolaris, E. pilularis, E. piperita, E. platyphylla, E. polyanthemos, E. populnea, E. preissiana, E. pseudoglobulus, E. pulchella, E. radiata, E. radiata subsp. radiata, E. regnans, E. risdonii, E. robertsonii, E. rodwayi, E. rubida, E. rubiginosa, E. saligna, E. salmonophloia, E. scoparia, E. sieberi, E. spathulata, E. staeri, E. stoatei, E. tenuipes, E. tenuiramis, E. tereticornis, E. tetragona, E. tetrodonta, E. tindaliae, E. torquata, E. umbra, E. urophylla, E. vernicosa, E. viminalis, E. wandoo, E. wetarensis, E. willisii, E. willisii subsp. falciformis, E. willisii subsp. willisii, E. woodwardii), especies de Populus (P. alba, P. alba x P. grandidentata, P. alba x P. tremula, P. alba x P. tremula var. glandulosa, P. alba x P. tremuloides, P. balsam^fera, P. balsam^fera subsp. trichocarpa, P. balsam^fera subsp. trichocarpa x P. deltoides, P. ciliata, P. deltoides, P. euphratica, P. euramericana, P. kitakamiensis, P. lasiocarpa, P. laurifolia, P. maximowiczii, P. maximowiczii x P: balsam^fera subsp. trichocarpa, P. nigra, P. sieboldiix P. grandidentata, P. suaveolens, P. szechuanica, P. tomentosa, P. tremula, P. tremula x P. tremuloides, P. tremuloides, P. wilsonii, P. canadensis, P. yunnanensis) y comferas, tales como, por ejemplo, pino del lodazal (Pinus taeda), pino del incienso (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino lodgepole (Pinus contorta) y pino Monterey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); cicuta occidental (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); secuoya (Sequoia sempervirens); abeto verdadero, tal como abeto de navidad (Abies amabilis)
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y abeto balsamico (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis).
Los casetes de expresion pueden incorporarse de manera estable en los genomas de las plantas mediante transformacion mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:4803-4807) o mediante el metodo biobalfstico (Klein et al. (l987) Nature. 327:70-73).
Todos los terminos tecnicos que se utilizan en el presente documento son terminos comunmente usados en bioqmmica, biolog^a molecular y agricultura, y un experto habitual en la materia, a la cual pertenece la presente invencion, los conoce. Estos terminos tecnicos pueden encontrarse en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook y Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience, Nueva York, 1988 (con actualizaciones periodicas); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 5th ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al., John Wiley y Sons, Inc., 2002; Genome Analysis: A Laboratory Manual, vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997. En el presente documento se describen metodos que implican tecnicas de biologfa vegetal y se describen con detalle en tratados de metodologfa, tales como Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1995. Se describen diversas tecnicas que usan PCR, por ejemplo, en Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990 y en Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003. Los pares de cebadores de PCR pueden proceder de secuencias conocidas usando programas informaticos disenados para ese proposito (por ejemplo, Primer, version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Se analizan metodos de smtesis qmmica de acidos nucleicos, por ejemplo, en Beaucage y Caruthers (1981) Tetra. Lett. 22:1895-1862 y en Matteucci y Caruthers (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185.
La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos espedficos. Los ejemplos se proporcionan unicamente como ilustracion y no debe considerarse que limitan, de ningun modo, el ambito o contenido de la invencion.
EJEMPLO 1
Perfil de expresion de genes que se expresan preferentemente en el Cambium/Xilema
Las etiquetas de secuencia expresada (EST) de Populus sp se agruparon usando el programa CAP3 (Huang and Madan (1999) Genome Res. 9:868-877). Dichas EST se obtuvieron de bibliotecas que representaban los siguientes tejidos: brote apical, corteza, cambium, semilla, xilema, hoja y rafz. El conjunto de grupos asf generados se investigo para los grupos compuestos por al menos el 90 % de las EST de bibliotecas que representaban tejidos de xilema y cambium de Populus. Se seleccionaron 12 grupos basandose en su nivel de expresion alto y preferido en el cambium y/o xilema de Populus. Despues, se realizo una busqueda con BLASTX frente a la base de datos del GenBank no redundante con cada uno de los doce grupos, y se llego a la conclusion de que representaban secuencias expresadas de los siguientes genes: sacarosa sintasa (SuSy), alfatubulina (TUB), protema arabinogalactanica (ARAB), acido cafeico 3-O-metiltrasferasa (COMT), cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD), cinamato 4-hidroxilasa (C4H), cinamoil CoA reductasa (CCR), ferulato-5-hidroxilasa (F5H), sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD), UDP-D-glucuronato carboxi-liasa (UDP), protema de transferencia de lfpidos (LTP) y ag-13 (AG13). Las Figuras 2 y 3 muestran el perfil de expresion en diversos tejidos de Populus para cada uno de los grupos que representan los genes cuyos promotores se desvelan en el presente documento. La serie de histogramas en las Figuras 2 y 3 representan finalmente la abundancia relativa de cada gen en genotecas de ADNc que representan los tejidos anteriormente mencionados (brote apical, corteza; cambium, semilla, xilema, hoja y rafz). Por tanto, los histogramas componen un conjunto de datos de expresion digitales que es una aproximacion del nivel de expresion relativa de los doce genes cuyos promotores se desvelan en el presente documento.
EJEMPLO 2
Aislamiento de secuencias promotoras
Se realizo BLASTN para cada uno de los doce grupos frente a las secuencias genomicas de Populus trichocarpa disponibles en el Joint Genome Institute US Department of Energy como parte del "Proyecto de Secuenciacion del Genoma de Populus" (
http://genome.jgi-psf.org/poplar0/poplar0.info.html). Las regiones de nucleotidos
seleccionadas de cada grupo, correspondientes a supuestos exones, se usaron como secuencias conductoras en la recuperacion de lecturas de secuencia genomica que comprendfan la region de inicio de la transcripcion y secuencias promotoras aguas arriba adyacentes. Estas lecturas genomicas se ensamblaron usando el programa PHRAP (Gordon et al. (1998) Genome Res. 8:195-202) para obtener un contigo que inclma aproximadamente de 700 a 3.500 nucleotidos de la supuesta region promotora aguas arriba desde el punto de inicio de la transcripcion (+1 nucleotido, que correspondfa al inicio del ARNm respectivo). Se llego a la conclusion de que estos contigos, que conteman las regiones promotoras de cada uno de los genes que codifican los ARNm representados por los doce
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grupos, se expresaban preferentemente en los tejidos del cambium y/o xilema de Populus. Estas doce regiones promotoras corresponden a las secuencias desveladas en el presente documento como SEQ ID NOS: 1-12.
Para el aislamiento de regiones promotoras espedficas, se disenaron pares de promotores espedficos de genes (normalmente de una longitud de 30 nt) de las secuencias de los contigos promotores descritos anteriormente, para ampliar por PCR un fragmento de 700 a 3.500 nucleotidos desde la region promotora de cada uno de los doce genes cuyas secuencias promotoras se desvelan en el presente documento. La primera ronda de PCR se realizo sobre una muestra de aDn genomico de Populus deltoides o P. trichocarpa, que se preparo de hojas usando el metodo de extraccion del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) (Aldrich y Cullis (1993) Plant Mol. Biol. Report. 11:128-141). Los cebadores se disenaron para amplificar la region aguas arriba de la region codificante, es decir, la region no traducida 5' y la region promotora del gen seleccionado. A continuacion se ofrecen las secuencias de los cebadores usados para cada promotor:
sacarosa sintasa (SuSy)
5’- GCCATAGCTCCTTAAGAGAAACAGAAAGCAA -3’ (SEG ID NO: 13) 5’- CAATATAGAATCAATGAACAGCACTAGTTTGC -3’ (SEQ ID NO: 14) 5’- TCATGTCCTATCCAACGGCG - 3’ (SEQ ID NO: 15)
alfatubulina (TUB)
5- CTCATTTTCTCTCAAAGCTCAAAG -3’ (SEQ ID NO: 16)
5 - G AC AACTAGTCT AAAGTT AAAACTT AG ACC -3’ (SEQ ID NO: 17) 5- CCCTGGAGGTTGGGGTGAGT- 3’ (SEQ ID NO: 18)
protema arabinogalactanica (ARAB)
5 - GCGTTCATCTACAAaACCCTQCTCC -3' (SEQ ID NO' 19) 5'- TTCATCCTTATTTTTTTGGGATA -3' (SEQ ID NO 20)
5'- CAAAGGATCATGGAGTTGGA - 3' (SEQ ID NO: 21)
acido cafeico 3-O-metiltrasferasa (COMT)
5'- TATACTAATATGACCTAATAACTTAGAAGTGTGG -3’ (SEQ ID NO: 22) 5’- CATCTTGATCAAGATTGAATTC -3’ (SEQ ID NO: 23)
5’- CATAATATCAAAACTTAAGC - 3’ (SEQ ID NO: 24)
cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD)
5 - T GAATTG AT GACGT AGG AAAC AT GAT AAAC AT G -3' (SEQ ID NO: 25) 5'- CATTTTCTTG AAAC AATG AG GC T AAG AG -3’ (SEQ ID NO: 26)
cinamato 4-hidroxilasa (C4H)
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cinamoil CoA reductasa (CCR)
5’- GCGCTCGGGTTGTCACCATAGTTTC -3’ (SEQ ID NO: 29) 5’- CATGTTGTTATATTTAGATAAATGTA-3’ (SEQ ID NO: 30)
ferulato-5-hidroxilasa (F5H)
5’- TTCATCAAGCAATAATAATAAGGTGAGGC -3’ (SEQ ID NO: 31) 5’- CATGGATGCAGATTTTTGTGTTTGTG -3’ (SEQ ID NO: 32)
5’- TTCAGTGAACATGCTGCCACAATGAC - 3’ (SEQ ID NO: 33)
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sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD)
5 - AATCGAAACCGATCGATTTGAACTGG -3' (SEQ ID NO: 34)
5- CATGGTGCTTGCTTCAGATAG -3’ (SEQ ID NO: 35)
UDP-D-glucuronato-carboxi-liasa (UDP)
5T- GGAAATGTCAACACTTGTGTGACCACAC -3’ (SEQ ID NO: 36)
5T- GACATTCTTGTCCAATTTCTGAA -3’ (SEQ ID NO: 37)
protema de transferencia de Kpidos (LTP)
5’- GGAGCCTCCATATTTCTGTATCTC -3’ (SEQ ID NO: 38)
5’- CAAGACGATGAAATGAAGAACTGATAGC -3’ (SEQ ID NO: 39)
ag-13 (AG13)
5T- GACATTCCTTGACTTAATATGATGCT -3T (SEQ ID NO: 40)
5’. GAATTCGCATCCATGCGGTGAGTTCG -3’ (SEQ ID NO: 41)
La PCR se realizo usando reactivos disponibles en el comercio y los parametros de ciclo de 5 minutos a 94 °C seguido de 35 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, despues una temperatura de hibridacion modificada, como se describe mas adelante durante un minuto, despues 72 °C durante 3 minutos. La temperatura (T) de hibridacion se ajusto para cada par de cebadores y vario de 50 °C a 59 °C. Finalmente, las muestras se mantuvieron a 72 °C durante 7 minutos, despues a 4 °C hasta analisis posterior. Diez pl de cada uno de los fragmentos de ADN amplificados resultantes se procesaron en un gel de agarosa al 0,8 %, se purificaron usando el kit de Purificacion de gel GFX (Amersham), se subclonaron en el vector pGEM-T-Easy (Promega) y despues en sitios EcoRI y BgIII del vector pAPROM-ATG. Las secuencias finales se determinaron en los plasmidos resultantes. La Figura 1 ilustra esquematicamente el casete de expresion pAPROM-ATG que comprende el gen GUS unido operativamente a un promotor desvelado en el presente documento. La Figura 4 ilustra esquematicamente el vector plasmfdico que comprende un gen de interes unido operativamente a un promotor de la invencion.
EJEMPLO 3
Transformacion de plantas de Arabidopsis
Usando un protocolo de transformacion mediado por Agrobacterium tumefaciens (Bechtold et al., (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316:1194-1199; Bent et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396) se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana Columbia con construcciones individuales que conteman uno cualquiera de los promotores de la invencion unido operativamente a un gen de interes. Las construcciones tambien conteman el gen marcador de seleccion Bar que confiere resistencia a analogos de fosfinotricina herbicida como glufosinato de amonio (Thompson et al. (1987) EMBO J. 9:2519-2523). En este ejemplo, el gen de interes unido operativamente a los promotores preferidos de cambium/xilema de la invencion es el gen indicador GUS que codifica la enzima beta-glucuronidasa (GUS) (Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405) que posibilita la inspeccion visual del fenotipo deseable, es decir, la expresion de GUS de una manera preferida de cambium/xilema.
Se sembraron semillas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia en macetas que conteman vermiculita. Las plantas se cultivaron en un regimen de oscuridad/luz de 16/8 horas a 22 °C. Despues de 4-5 semanas, las plantas se transformaron con la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con Bent et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396; que lleva el vector plasmfdico que comprende el gen de interes unido operativamente a cada uno de los promotores descritos en el presente documento.
Para la transformacion de la planta, 1 litro de medio LB que contema rifampicina, gentamicina y kanamicina se inoculo con una alfcuota de cultivo iniciador de Agrobacterium durante una noche. Despues, el cultivo se dejo crecer durante una noche a 28 °C en un agitador rotativo, hasta que la DO600 fue > 8,0. La Agrobacterium se precipito por centrifugacion y el sedimento bacteriano se resuspendio en ~300 ml de sacarosa al 5 % y Silwet L-77 al 0,03 %. Esta suspension de Agrobacterium se pulverizo sobre las plantas. Las macetas se colocaron en una bandeja que se cubrio con una envoltura de plastico para mantener la humedad y las plantas se dejaron crecer bajo el regimen anterior para madurar y asentar las semillas.
Las semillas se recogieron y la superficie se esterilizo con una solucion que contema lejfa 50 % y Triton X-100 al 0,02 % durante 7 minutos. Despues, las semillas se lavaron 3 veces con agua destilada esteril y se sembraron en placas en medio MS que contema 6 mg/l de Finale como agente de seleccion. Despues de 5 a 7 dfas, los
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transformantes eran visibles como plantas verdes. Las plantas transformadas se transfirieron sobre nuevas placas de seleccion y despues de 6-10 d^as se transfirieron a macetas que conteman vermiculita y se cultivaron en condiciones de 16 horas de luz/ 8 horas de oscuridad a 22 °C.
EJEMPLO 4
Ensayo de expresion de GUS en plantas de Arabidopsis
Tallos con inflorescencias de las plantas transformadas descritas en el Ejemplo 3 se cortaron y se tineron histologicamente para determinar la actividad GUS. Esquejes posteriores indujeron la formacion de xilema secundario en la base de plantas que tambien pudieron tenirse histologicamente para determinar la actividad GUS.
En las Figuras 5A y 5B, se muestra la actividad de la beta-glucuronidasa en tallos en floracion de plantas transgenicas de Arabidopsis. Estas plantas transgenicas de Arabidopsis se transformaron con una construccion que contema el gen GUS unido operativamente a promotores preferidos de cambium/xilema descritos en el presente documento, en concreto TUB (SEQ ID.:2) (A) y C4H (SEQ ID NO.:6) (B). Bandas mas oscuras a lo largo del eje longitudinal del tallo (cabezas de flecha) representan haces vasculares primarios tenidos de azul despues del ensayo cromogenico, indicando la funcionalidad y especificidad tisular del promotor respectivo en cada una de las lmeas transgenicas.
La siguiente tabla resume datos del ensayo GUS obtenidos mediante el analisis de esquejes de tallos con inflorescencias de plantas de Arabidopsis thaliana transformadas con construcciones de expresion de acuerdo con el EJEMPLO 2 que comprendfan el gen GUS bajo el control de secuencias promotoras desveladas en el presente documento. Para todos los promotores ensayados, se observo un patron de expresion de GUS vascular. En algunos casos, la actividad de GUS fue notablemente alta en tipos espedficos de celulas vasculares, tales como elementos de los vasos, como por ejemplo en plantas transformadas con construcciones que compendian los promotores LTP (SEQ ID NO.:11), c4h (SEQ ID NO.:6) o TUB (SEQ ID NO.:2). En otros casos, se observo un patron vascular pero no pudo senalarse ningun tipo espedfico de celula como el sitio principal de expresion GUS.
Patron de expresion
Promotor
Numero de eventos analizados Total de eventos positivos a GUS Solo elementos de los vasos Elementos de los vasos + otros tipos de celulas vasculares Tipos de celulas no vasculares
SUSY
92 21 1 17 3
LTP
75 38 19 14 5
C4H
89 43 14 28 1
TUB
78 20 9 10 1
COMT
72 24 2 15 7
CAD
79 37 8 16 13
SAD
75 30 4 13 13
UDP
72 20 4 14 2
CCR
74 22 4 14 4
Otros aspectos de la invencion seran obvios para los expertos en la materia y no es necesario que se repitan en este documento.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> PAPES, Fabio GERHARDT, Isabel Rodrigues ARRUDA, Paulo
<120> PROMOTORES PREFERIDOS DEL CAMBIUM/XILEMA Y USOS DE LOS MISMOS
<130> 39125P EP-WO
<140>
<141>
<150> US 60/560,227 <151>
<150> 05 714 408.1 <151>
<160> 41
<170> PatentIn version 3.2 5
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 1 <211> LONGITUD: 3035 <212> TIPO: ADN
10 <213> ORGANISMO: Populus sp.
15
20
<220> RASGO:
<221> NOMBRE/CLAVE: promotor <222> LOCALIZACION: (1)...(3035)
<223> OTRA INFORMAClON: Promotor de sacarosa sintasa (SUSY) <400> SECUENCIA: 1
tcatgtccta tccaacggcg atgcaaactt cgctgtcccg cactttttca taggacgagg tgaagtttag 70
ctatatatct ttttttttta atttaaattg ttaattcttt atatttttat attcttttaa ttttatattt 140
ttatattatt ttgatatatt acatcaagaa taaattttaa aaaaataatt tttaaaattt acttaaccac 210
gcaatacata aaaaataata gaacccacca acctaagaat acttgtcaat gcatagaagt acacctgcta 280
gttcttaaaa ccaacaaaag gaagcaaagt agatctctga gtcaaaaacc agaggaaacc atagaaacac 350
ataataataa taataataat aataataata aaattaattt aacttggtgt aataataaaa ttaatttaat 420
tacaaagagt gtaactcaac tagtcatgtt ctaaatttat tctctagaga ttactagttt gagttttaca 490
aattttaagg ccactgaaga tttatatagt cattaatttc agaatatata agattagttg agttacgtat 560
aaattgatta aaaaatcata ttaataaaaa taaaaaaatt aatttaaagg tttaagaaat caaattaaga 630
gaaaagagtg gtgttttatt tttcatcgtg ccctctctca acagacaagt agaatgatga gagagagagg 700
gtaaagaaat ggatttatga gaacattgac cacagggaaa gagagaagcg gttttgtgaa aggaacaatg 770
aaaccacagg aaggtaaagc ggtaatgata tatttcacga atactaaaac tagaacaaca agttttttaa 840
tcaaattaaa ccacgagtgc aaggccgtct tctctgtgta taaaagggtc cttcttcttt ctcatttccc 910
attctcatct gcaaacttct cctttgcaat ctttctttct tgcgttctgt gtgttcgttg tgatttgtgt
980
tcattcttct tgtctattag cttgtcccoc cgtccgactg otttctgtat ttattotggc attaagctta 1050
aggtaaagat ccotoaacta tcccaagcaa tttattctgt ttttatgtga tcttgaggga tcttcotott 1120
5
ggatgcgctt 1190
tttatttttt cttcctcctt cttcctgctc cttcttacct tgtatctgat cccccagacg
aaaatgtttt 1260
ttgttttttt aattagctca acaaatcaaa aacattcaca taataacaca gctcgaaaga
aatctgatac 1330
agttttaatc tgttgtattt taaaaatcat tacagttcat gcatgctgat actttaccat
gtcatgaaat 1400
taaatcccag catccttttc catagccaaa gaaggatcag cagcatgctg atagtttacc
atgtcatgaa 1470
attaaatccc agcatccttt tccatagcca aagaaagatc agcagcatgc ttgcttatac
aaggtcttcg 1540
cttgcttatc aaggccactg aaacatcatc atcgtcataa ctatgataga acccgcctac
tgccggcatt 1610
gaaaacatca tcactagtgt ctctacatta aaaaacaccc actgtctaat ttcotatttt
tttactctta 1680
aaatgtcttt cggcttgagc tcctcgggct ccacggatgg caactgctgt attatatata
tatatatata 1750
tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatttccc tgttggctac
atagacctgt 1820
taataccgta taaatagata atattaatat atagaattca tgtatctttc cgagattaag
cgatgccgta 1890
taaataatat taatatcttt gaatcagtat gtatattaat taaaattaat ttttttcaaa
gtaattttaa 1960
gagcgcattt tcaacatcca tttagttttt ttttaataat aaatctctct ttgoattaat
cctaacgttt 2030
gaacttagta aattaaaaaa aggaaaatac ctttttcacc aatatagaat caatgaacag
cactagtttg 2100
cttgaaataa aaataaaaat aaaatctaat aagacatttc gaaatcatcc ttatccgcaa
atcactacat 2170
tagtatagta tcttgaaaga taagcaagga tcatgcaagt ttataataat taaacttaaa
acgtactatg 2240
acgtgtgcat cattcattca ttctgcatga aactctccac aagtctagcc tttgcatcat
tcattctact 2310
tcattttatt ttttcctcta atggtttcga ttgatttttc tttcttagag tctggtcttt
tagttcaact 2380
ttacatgttt taggctcgta ttttgagaga aaaaaaagaa aaaagtatgc agateatgat
tctgcaaaat 2450
actgaactag tgttctgatg aattaacatg tagcatgtat aatgctggaa gaactaaaga
gcagttgggc 2520
tgccatgacc aaaagaaact tcgactgatt ataaatgtca aaacttgggc ccattctttg
gtttctgtct 2590
gttgttttat gccatggcaa aactctgctt atttttcaac gtccaacgtc aaatgggaga
ggtttaaatt 2660
ctattgttat gtctaaacca cgtggttgtt atctatatct gaccgaacat tcaagctttt
ggtattccac 2730
aagaagggtt ttctctcttc tttcttttca taattgtaat gtgtttaatt tgtttcttgc
ccaataatct 2800
tctctgcttc aaactaactt taattgttcg atctcttgcg ttattttaga catgtgcaat
cacctttcac 2870
tgttgaaaaa atggttggtg aggtgaggtg gtaggttttg aagtcttcta gaataatgtg
gtttctctgt 2940
tgctcttgac ttcttcttgt agatcatttc tggctggcta agctatccat acccccccgc
ccctacaaat 3010
aatattgagt tgttgctggt cttaattcct attatctgtt attactccca ctgattgctt
tctgtttctc 3035
ttaaggagct atggc
<200> CARACTERfSTICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 2
<211> LONGITUD: 2513
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
<221> NOMBRE/CLAVE: promotor <222> LOCALIZACION: (1)...(2513)
<223> OTRA INFORMACION: promotor de alfa tubulina (TUB) <400> SECUENCIA: 2
ccctggaggt 70 tttttaataa 140
tggggtgagt gaaataagag ggttaaatat tttttttgga ttaaaccatt caaagtgaat
aatctcatag
gctgattaaa tgaaattcct ttagagtcat catacggtaa atttgatgtt
agtttggtgt 210
tatagtgcaa attacttttt aattaaaaga tagcaatgct tccagcatgg tggactcgtt
tttcaaatcg 280
aaagctgctt cttcttcttt gttttttttt tttaatcttg tttttctaat ttcataaaaa
ccaatcatta 350
tttcgcaggt caggtagtta aatttgttag gctaattgat ccagaaacct ccggaaagtc
aaactcaaat 420
aaactgctga cctttttatt tatttttatt ttttgaattc taattcgtcg gactatctgg
tcaagataat 490
ccacctctca tgcgaatact tcttagagtg ccatccatta taccctgtta agttgccggt
gattgcacat 560
gtttgaccac cctccctccc ctaattttca cggcggaaag gggcttgttt gggcttgttt
taaattataa 630
taatagtgat gatttaaagt attttttatt taaaaatata ttaaaataat tttttttatt
ttttaaaaat 700
tatttttaac atcaaaacaa catgaaaaca taaaaaaatt gttttcattc tttttaaaaa
tatttttttt 770
ctatttttat tcaatattat tatatagttt tcttattttt atttttctat taagtattat
taggtttttc 840
tgtttttttt tttaatttaa aggaaataat tttttttcta ttcaatatta ttagaaattt
otaatttttt 910
ctatataaag gattttaaaa ttgtaataac attttgacaa gaaatttaat gaataaaaat
taaatattct 980
agatatctct tcacagttat gacattcttg gttttaattt ataataaatc gcattatcat
taaccctcgg 1050
ctaaattatc tatttattta tgaccatgga aacacaagtg cgtgtgtatt tggggaggtg
tgggtttaaa 1120
gcctgcaata taattgaaga aaaaatttaa gaatttttcc gcgttgatga aaccctgatt
gaaggttgga 1190
gcatgcctca ataggcagac gggcgaaact tagaaaccag gaataaacgt gaaacacggg
attcacacga 1260
atttggaaat ccaogcttgt aaagaaaacc aaaccgcata attttattto ctatttgttt
tcgcgtcttg 1330
tttttaaaaa atttaaattt tattttattt ttttttcttt aaattaatat ttttttgata
attttagatc 1400
attttaatat gctgatatca aaaataaatt ttaaaaaata aaaaaaatat attattttaa
tatatttcta 1470
aataaaaaac acttcaaaaa acaattataa ccatattttc aaacaagtac tattaaaaaa
gtgatggaca 1540
agagaaatca aggggtcgcg gatgcgcttc agcaatagtg aatgacaact agtctaaagt
taaaacttag 1610
acctcctcgc gtaaatttta tatttatatt tttaatatta atacattaaa ataattaaaa
aataatttaa 1680
aaatcattaa ttcatacaaa atttttaaag catattaaaa agagaataaa cggcaaaaac
aaacctacgc 1750
taattgtgaa ataaaagatt aatctatgca cacggtatcg ttttacttea ctggtcggtg
taataatttc 1820
tctaacctta tgacccaaca attcactatt ttgaaaccct tgttattatt ttttttatca
accattttct 1890
taatctccat ttcactcatt ccagttgcct ggacagtgga catggtggcg gtgcctcttg
atcttttcta 1960
gttgggccac atgaatacac ttcaagggat ttgaaactag gcctaatcga ttgaaacgta
gaatccactc 2030
tctaattgag aggacggccc accctcctgg gcgacgtgcc ctctcatcca ccaggaccac
cgccatcatg 2100
ccttctctgc tccttcctca cgcctcccaa cagaatgaca ttattagcct ccatcccaac
tatagaccgg
cagtggcaca actgcaattt cctacaaccc aagacgatcc ccaaaactaa attcaaaaat
2170
caaaatggag cgggcaacta accatggtta aaataacgat tcggccaacc tggcaaaatc aagaattagg 2240
tggottggga aacggcatoa ttggcatgca cctaatttga cccgtggtta aactaaccot ggttagctaa 2310
accacacact ccctocgtoc cctaatttct ctccotctga aagtatataa acccoataot cacagaccta 2380
aaagctcacc cctgaaattt cataggcgtc ttgataaacg ccaccctccc tcagcatcaa ttccaattgt 2450
ctttgctttc gattttctct tcttttaata tctgttgatc tttgtgcttt gagagaaaat gag 2513
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 3 5 <211> LONGITUD: 2041
<212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
10 <221> NOMBRE/CLAVE: promotor
<222> LOCALIZACION: (1) ..(2041)
<223> OTRA INFORMAClON: promotor de la protema arabinogalactanica (ARAB)
<400> SECUENCIA: 3 15
caaaggatca 70
tggagttgga atccccacca tccctatttt atttgataaa aattaagcac cagggtggta
gggatctatg 140
caagttccaa gttcaaagga cttttcactg gaagtgatat gtcagagaat aatatataaa
ttatttcttg 210
gaatctcacc aatccctatt tatttgataa aaattaagta caaggtagtg cgaaacctgt
acaagtttta 280
agcctaaagg gctttcactt gaagaggtgt gttagagaat aatataaatc atatcttaga
accttaccta 350
acatcttaag ctattgagat gagatgattc tttgacatgg tatcagaact ttaatgacca
aacagtcatg 420
agtttgaatc tcaccatccc tatttatttg ataaaaatta agcacaagat agtgtgggca
tgtgcaagtt 490
tcaagcttaa ttgactttta cttgaggggt gtgtgttaga gaatgatata aatcatatct
tggaatctta 560
cctaataact taagttattg gattgagatg attatttgac gatcagagaa gacaaagcat
gcattaagga 630
gggtagagag aaaggaaaag gaggttgcag gacaatggtg aaagcaaata tttcattaca
agtttttgaa 700
gtggttggaa tcaaaatgtt gttctcttta atctgtaaga ttatatatgg ttctgctgac
aacatttgaa 770
tgcgaggctg aacataatgc aaaagagtag aaaatgctaa ttatcaagaa atcaggcttc
tgaaacagaa 840
ctacctttac taggttatct cttgaaottc tactaaactt aatgtgaaca aatctgctgt
attgctctca 910
cacaggaacc ttttaagttt cctcagaatg aatttttctc tagtttaagc aatcccacat
caggttaagt 980
tcttttctcc tgtttcaaaa ctgctggtgt tgataattag agaaaagaga gtgttagaga
gcataggatt 1050
gttactttaa gcttgaggaa gtggattcca atcagtaaaa ttgtcgaggt tatatcacaa
ttttcataaa 1120
ctgaatgtga cagacgactg ccagaaaaac ccttctatga tttgctgcat tatggaggaa
aatcatggtt 1190
ttggtggaag catgatccat tcatcctagt acgtttaaca tgaataaaag gcttgagctc
tagtacagaa 1260
tcccttgcct caactccctt catccttcot cctccgcgtt catctacaaa accctcctcc
aocgcctttt 1330
ctttcatcct ctccatgaat aaaagactat tatgccattc aacatcatgt aaaagaacac
aattcctttt 1400
acttcgaaat ggctatctta aagtttcaag acttgcgttt gcatactgca aaatcacttt
tatcaatagc 1470
atgacctcta cgggctcatg tacataaggt aagtgtttct tcatgaagtt gtgttaagtg
atggtctggt 1540
gtgagatttg atttctgagc gtgcgaatct agaaaattag tgatctatca atgtctgtca
aggattaagg 1610
atgtaaatat tcgttctttt aagctaaaag agcaaagact tggctattta cgatacaaag
gtcagtttag 1680
atcgcttgtc taaatcttct gtcattatag atgatttgtt ttgatgttaa gaagcatgct
cagctgttct 1750
gctagtgatg attcacaatc atggacatct ttatttgttg tcacagccac ttgaaatcta
ccttttagaa 1820
cctttttttt ttgcctgctt ttccaaggaa agtagttgct gcagcattgt taaatttccc
tctccattga 1890
tgaccctaca gcttttggag tgagataagg tactagcaat ctagttgtat aactaaaatt
gtatattgca 1960
cctaacttga tcctctgtcc actactataa aaacctcact ctatctcatc tttacacatc
aaacacttta 2030 ataaggatga 2041
tgattgaaat a caatttgcat tagtatattt gaattgtttc gagcatttta tcccaaaaaa
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 4 5 <211> LONGITUD: 2422
<212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
<221> NOMBRE/CLAVE: promotor <222> LOCALIZACION: (1)...(2422)
5 <223> OTRA INFORMAClON: promotor de acido cafeico 3-O-metiltransferasa (COMT)
<400> SECUENCIA: 4
cataatatca 70
aaacttaagc agatcaaatt gaaatatatt tgtaattttt atataaatta gcactgatat
gtcaaaataa 140
agacttcaaa ttcaaaactt aagtagacca aactgaaata tatttgtaat tcctatagaa
atcaacattg 210
gtataccaaa ataaagagtt tagatttctg atctagcctg cagcagcaga gtaaaacaaa
aataaagtct 280
gaataggaat cacgaaataa aatgaaatga agaattgcaa aatcataatt aaatgaagtc
tgaagtttca 350
aaatcctgac caggtataaa attaagatgc aaaaaacaaa atcttatcag aactaaagtt
agataatcga 420
aagtaaagta gaatctagat ttaattaatg tattggaggg gaacaattgt tcatattcga
tcaaggaaat 490
taacacctaa ttaaataaaa aggctcgaag atgagaagga cggtgcatgg atggtcaaaa
aacgaagcag 560
cagaagagaa tggtcggtgg tgcacagtca tgttaaatgt ccaaattaaa aacaaaaaaa
aggtttaatt 630
atgaaaatat ttcattctta acgaatatat caaactgcca aaccccccac cggttccatt
tatatgggag 700
gagtgattga tatttttatt aaactcaatt tatttataat ttaatttaaa atotgattga
tgtcttataa 770
taaattttaa aaaaatatat agataaaggt tgatctagtc aattcaagag tcaataatga
ttttatcaaa 840
atttaattta atttttttaa aaacaaaaca taattccaaa acaatgttgt ttggattttt
tttttaaaaa 910
aaaacataat ccacccatgt cattaattta ccaaactcct aacacaatca tgtttaataa
cccttcaatt 980
ttcaaaaata atttcagttc ttatatttat ttttatttgc aaattagtcc ttgtttgaat
tttcttttta 1050
gttcttatac tttacaaaaa ttatagttta tttttttatt gtgattcttt ttattataat
taaggtccct 1120
acatgctttt ttttttatgt aatgcttttt aatgtaataa atcattctga ttgtaatcat
caattatata
attattttga caattacata attaaatata gaaatataat aaattattac gttacatgat
1190 ctattactaa
gtacccaagt ctctacgtca atgttcaatt ttcagcaggt ggttctgtta gaatgtccca
1260 tccaaaatat
ggattcattg atacgatttt taagtccaaa caaccctcat attaagcaaa accctcatat
1330 taagcaaaag
attattatta ttattattat tattattatt tattattatt attattgttt ttgttgttgt
1400 gcttcttctt
tttctcaatc aacaaaattt ttaccaactt caagattttt ttttttatgg ttaaaggtat
1470 actaatatga
cctaataact tagaagtgtg gattatagat aaaattagca attcgtgcta tatagtgggt
1540 tggatattta
tttatataaa aaaattatat atataagttt ttttttatgc atacttgtac aaaaaaaaaa
1610 tataaataca
aatcaaatat ttattcaatc aaatgataat agaaccagat atatatgaaa ttgattaaaa
1680 aaaatatatc
atgttaggtc aacatattag aaatactata caaaaataaa tatttatatg tatataacac
1750 atacaaagat
tttctatagc gtgtgtttat tcagtgagtt tcatttatat taactttaaa atcattagtt
1820 ttataggatg
taaatttatc ttttattaat tttaaatgtg ttcaataaat acaatcgggt gaatgtatca
1890 ttatgtgatt
gaatatctta atctgcattt atctcttaat tttttcagtt ttttttttgt tattgttaat
1960 gaattttttt
ttatttatat aaatgattat tgatttattt aattagatgc tttatacttt aattttttat
2030 atataaaaaa
acatattaaa acaatctata tacctgatat ttttattttt aaaaattata acccatgata
2100 aagaagtttt
ataaacctac ctgcttgaca tattacatca tgttccaata gtctcccctg aaacaggtta
2170 aaaaaaaaaa
agtttggcaa ataagacgag gaaaaatata tagaaaaaaa ggtagggagt cagttctagg
2240 aagaagacat
ttgtgcatca agtagagagg agggaccaac cacaaggtgg ttgagcactt caccatatat
2310 agcaccactt
tgcaacctct ttttcagtat totcatatcc tcttcacttc ttttcttttc accttcttca
2380 accttttgtt 2422
tccttaaaga attcaatctt gatcaagatg gg
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 5 5 <211> LONGITUD: 793
<212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
10 <221> NOMBRE/CLAVE: promotor
<222> LOCALIZACION: (1)...(793)
<223> OTRA INFORMAClON: promotor de cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD)
<400> SECUENCIA: 5 15
ttgaattgat gacgtaggaa acatgataaa catgtaatct aaatatatct catgtctagg tcatgggttt 70
cacgtattag tccagcttta tccaaaataa tttttttatt tgttattatt gttaccttat tttttcatca 140
tattattaaa ttaattaaaa tttaatcaaa acattaattt tttcttactt ttttttaaaa tataatcttc
210
tcttaaattt cttttttcat gtttaaaaaa atttcagtcg acggcacaac aatccagtaa ataccaaggg 280
tatattgtcg ccactcacca ccaactacgt caattaagca aataatataa ttaggcaact gtgtaaccac 350
catggaaatt aagatattcc tttcatgaaa tacttaatta gtgacgtata catgatgctc caaacctcat 420
cacagattca gtgttcttaa ctattatgtt cccttttgtt tcccaagaac catgagttaa tcaggaccat
490
cgatactaot gaggccccac caatgttttg atcatgtgga caatgttcac ttgattttca actttgaaga
560
aatgacccat ggttgtggaa gcagaggatg gcgccactcc atcacatttc acctaccacc acccgtaaaa 630
tatgcggagc tgtccttgtc ttttttgttg ccaagtaacc tttgccattc tttattgtgc ttttgtatat 700
atactcatcc atagtggctt ataattcttc aactctccac agaaactcca taggtctctc ttagcctcat 770
tgtttcaaga aaatggtaga tct 793
<200> CARACTERfSTICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 6 5 <211> LONGITUD: 984
<212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
10 <221> NOMBRE/CLAVE: promotor
<222> LOCALIZACION: (1)...(984)
<223> OTRA INFORMAClON: promotor de cinamato 4-hidroxilasa (C4H)
<400> SECUENCIA: 6 15
5
10
15
tgatatgaga 70 ggaaacacgt 140
aactaacgtt gcttgaattc aagatagaaa ttgaccttgc aagaagacaa acgtattctt
attaataaat
acaaagtagt ttgtcacact acgggagaaa atatctaata aaagtaagac
cttatagttt 210
caggaggtta ggttgatatt taaagagaga tttcttttat taacttttta tatatgttga
aatcttgaaa 280
ttaatattaa aaagatttgt taatcctttt ctcttgaata ctttggattg atgtgaggga
ttcacattta 350
aactattctt aaatgaatct tgaagctgta tgtttgatat tgtgttttta aaatgtattt
atctttaaaa 420
aatatcaaat taatgatttt ttaatgtttt ttaaagattt gaaagtatta atttaaaaaa
taaaataaaa 490
ttattttaat atatttttaa ataaaaaata tttttgaaga gcagactgca ccctatactt
gatctcaatt 560
ttaaagagat ttggagaaca caagaattaa aaaagaaaag gataggaaaa aaaaactttc
ttgtttgata 630
gccttattac ttgaagctga aatcatcata gattagtggc gcccacatta catcttgtat
agaaatatag 700
aaaggcctgg caaattaatt aatatgatga ccatatgaca ttttcggcca ccaacccgcc
ttacctacta 770
ctatccatga tcatcaatgt cactctccta ccacctcaaa tgtaacgccg ttaactcccc
cccccccaca 840
cacacacaca accctagcta gtagccacac gctccaccac ctaacgtgtg aaattcaact
tcatttcctc 910
tctaattttt gtagcttata aaacccaagc tctcctcgtc ctgttgctcc catccaacaa
ccatcactct 980 atct 984
tcttacctca aaaatcccca cctctttctg acaaagaaac cagttccaat attatggtag
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 7 <211> LONGITUD: 1007 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
<221> NOMBRE/CLAVE: promotor <222> LOCALIZACION: (1) ..(1007)
<223> OTRA INFORMAClON: promotor de cinamoil CoA reductasa (CCR) <400> SECUENCIA: 7
5
10
15
tgcgctcggg 70
ttgtcaccat agtttcattt cttaatttat taagttaaat taagatacaa
acgttttaaa 140
gcaaagagaa acaggaaatg ggtaaaaagc aacataaatt ctctttcaca
accaggttct 210
ttgttggtct aggagtatta attaattaat gctttgacat tgatttattc
ttaaaacact 280
gaattaaatc caatccacac acaaaatgaa atgggggtag gtgatgtggg
ttattcggtt 350
tgatttttat taaaaaaaat aaccaaactg aattattata tttttaaaaa
ggttcaaacc 420
ggtcggtttc aattcggttt tttaggacaa caaccggttc aaaccacttt
aggtttgatt 490
cggttcgatt tttttgattt taggtttata aaacggaaat tgaactgaac
tttaaaaatt 560
ttaaatttaa ttttttaatt attttctttt taattttttg attttatcag
ttttttttca 630
cttaagagag gccatggtca tcatgtacct tcaaagaaga gagagaaata
tggtgacgtt 700
gtgttgacga ttcacattac aaagacccat actcctactt cacaaacctt
ataataataa 770
taataataat aatagtaata agagaaaaaa ctagaaaaac aaaaacaaag
ctctttcctc 840
tctctcagag gcgaatattt accagtagta ggtgaggatg gtaacttcta
tacatccact 910
ccaccatgtc tttccttgta acatccactt ttcaagccaa gataagaaga
cctctcctct 980 atctaaatat 1007
ttctctctgt aacaacatgg ctgttctcca tagatct ctttcccagt □accaaactc gtatacatat
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 8 <211> LONGITUD: 2081 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
<221> NOMBRE/CLAVE: promotor <222> LOCALIZACION: (1) ..(2081)
<223> OTRA INFORMAClON: promotor de ferulato-5-hidroxilasa (F5H) <400> SECUENCIA: 8
taagttggtc
tttttttgtc
gttaattctt
tgattatttt
aactaaaacc
ggctcggttt
cggttaattt
tttttcaaat
gcaaagcaca
aataataata
agagaagaat
accttataaa
aaagacatct
aattacattt
ttcagtgaac 70 atatcttttg 140
atgctgccac aatgacatat atatcatcac aaattaatta atgtetaett taatgctgat
tttattattt
tttttcctat catgggaaat gagatcaact ttttoagatg aaaattacta
attaaactat 210
catatttcca gtttaatcaa agatatggaa totttattto actaaagata ttattattca
taagaatttg 280
atgagttctt gcattatttg ttagattatc ttcaccctct tgcaattagt gcttcatgga
ctcctttttt 350
tcttgtgaaa gtagtttgcc atttaaatat agaaatatet catgctttac aaaatataat
aatctcccct 420
aagatataat aaattgaact gagatgcaat taagtcggtt aaaaggcctg gatactgcca
gtgaataaga 490
tttacacaaa atattggatt ttttcccgtc ctgaaagcta attattgtea gaaaaatacg
ttttgaaata 560
gttgattttt attgatatgg tggaataaaa acatcaatgg ttccaatgtc taaccacgaa
aatgacttgt 630
aaaatttata ataaggteta tttttttcat caagcaataa taataaggtg aggcatcaaa
atctctcact 700
ttttgcttct gatcaaagat cactaagcag aacttgcatg gaacctcatc tototototo
tccccctctc 770
tctctctccc cctctccctc tetatatata tatatatata tatatatata tatgcaagta
ttagtcacat 840
tgcatgagta cgtggcagtt ttggatatgc tttgataacg gataacaccg agagtacaaa
acaaaatctg 910
ggtaggtage tggctcaatt gcaaccaaat aataataaga aattttagot gcaagcaatt
aagaaaatga 980
aagattgeae ctatgtcaac cactgggtta atatttatga tettaatett ttttttttgt
ataatttctt 1050
ttatatgccg tgaaatgaag tcagccctta agttttacat aaatgtttag gttaattaga
aaggagttaa 1120
ttetatatat aataagttgt tgattgaaac aaaatatggt ctgtcactct atttttgggt
tgctttttat 1190
tgcatagtac ttctgcccta ttgattcagt gaaccctttc gtatttataa tataataaag
tagaccttga 1260
ataaatattg acatgtaact taaaacatta attgtcctcg ttttgacaac ataaaatctg
tatcaacgta 1330
cgtgctcttg tttagggttt tctttagaoa aotttatato tagaaaacgt aattcaatca
aaaaagatat 1400
atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatagac agacgacata
acaaaaatgt 1470
tcgggtcaga actctggact actgatcgaa gttgtttcaa atatattgaa tggtatatct
taccatagta 1540
attaactgag ttatttcaag atattacaca gacataacat attttgttct tgatcaaaat
atattttatt 1610
taaaaatata ttaaaataat atatttttta tttttaaaaa tatattttta atatcaatac
attaaaataa 1680
tttaaaatat aaaaatacaa aaatattttt taaccacaaa aaaaaaaaac tatgaaaatt
aatgttctta 1750
aatattgttc tccatccaga ttttggtacg tatgcgttcc oagtgtgtac ttgtttatga
aagtctactc 1820
ttatttttca acttttctca agacattgaa ttagtaaacc aatgttttac gaattggata
cgaaaccttc 1890
caaaataata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata
tatatatata 1960
tatatatata aagagggagg gagggggtgg gggaggtcac aaaaaacctg tatataaage
cccgtaatat 2030
ctttctcagc ttagcaacat ctgaaagttg caattaatca gtggtgtgta ctgtgatgca
cacaatacaa 2081
tacataccat agacacaaac acaaaaatct gcatccatgg a
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 9 5 <211> LONGITUD: 995
<212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
<221> NOMBRE/CLAVE: promotor <222> LOCALIZACION: (1)...(995)
5 <223> OTRA INFORMaCiON: promotor de sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD)
<400> SECUENCIA: 9
taatcgaaac 70 acccctaata 140 agaatgatta 210
cgatcgattt gaactggttt cttttttttt ttaattttgg tttggttgct tttttttgtc
attatatata
ataatataaa taaaattatt taccattatt tgtctgagat tttttttaat
aaatgatatt
gtaaaaaaaa cctaataata ccatactttt caaataatat tttttactat
tattagtgat 280
tggtttgctg tcaaagttgt tttttttttt tttactattc ttaggagttt gtttctttta
ccctagtcta 350
caggagtttg ttagttacta tcatttcttt aaaaaggaaa ctcatatgga aaaggaaaaa
ttgattaaat 420
acaaaaaatt ataaaattac atagagtttt tatttatttg aacgattgag tttaatttta
acttaataaa 490
atataattaa ttacaggtaa aacaagtact tatcaatcat tataagtata ttataaaaca
tattaattat 560
gagttcagca aagatttgtg ctgatttctt gtctcttcta aactacatgt gacaagatag
aaaaaacatc 630
taaatgctaa tgattcttta atatatgact atgcaagtca tttatcttat ttaaatacat
taatttaaat 700
caaacttaat tttaaattat tggattctaa tataattgtg ttttaaaaca cttaggtagc
ttccttgttg 770
gacccgaaac tggttcatga actgaaataa tctatgcgaa taacgttttc ccacaaaaag
aagaacgact 840
tgctttttta gcgacaatca tgcctccttc gacctcaccg atgacaccac ctgtgagtgc
tgtttgccag 910
taacatcacc tccttgtccc tatgtgtata tagaaagaca aacttgccaa gcataaaaaa
gaagaagaag 980 accatggtag 995
aagtcatact atcta atatatttcc tgccttcctt ctcgacgata tttctctatc tgaagcaagc
10
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 10 <211> LONGITUD: 1269 <212> TIPO: ADN
15 <213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
<221> NOMBRE/CLAVE: promotor <222> LOCALIZACION: (1)...(1269)
20 <223> OTRA INFORMaCiON: promotor de UDP-D-glucuronato carboxi-liasa (UDP)
<400> SECUENCIA: 10
ggaaatgtca 7D
acacttgtgt gaccacacgc acactgtaga cgctacctta cctggccaga ccccgtcgoo
# u cagggattac 140
aatttaattt gaatttgata atatcatctc aactaacttg aatgaatatt ctttttttaa
cagttgtatt 210
gottcatgga aaataaatat tgtatatatt aggatattta atttgaaata aatattatca
aatatgactc 280
aaaacccagt ctaatatatt tatattttga atatgataca atataaacct ttttagtatt
aacataatgc 350
atgtgttgaa taaatatttt tttttattaa ataataaata tggattgaat gtcgaaaaga
gaaataaata 420
gtgtactcat agttacccca tgtacaagtt gagtacaaca acagatgtag tcaaaataaa
agaaaactcg 490
gtctgacgtg tcgttaccat tactgtcatt ggacagtaaa gtctttcgat tgtaacagaa
catgttctcc 560
ttctctctgg ccagtaacga ccgcgaatta ogcttcctcg aaatttcaat ctaaccttga
acactatata 630
agtatatgcc ctgtctctca tcatocgctg tccttaaatc ccttcaaaat actacaacaa
aatatttttt 700
tccctcaatt tatttcagca gcaaaagtct acgtggtaat taaatctcaa tttccattcg
tttttatagg 770
gatttttggt tgtctggaga aaaaaataat ggtcatggga ttgagagatt ttgagattca
gatctgaagt 840
ttgtttttaa ttttttcaat aactggtggg gtatggtttt tcgttgattt gaagcattgt
acatttcgtg 910
tttttgaagt ctcatttaat ttatgcgtcc ctccttttct ctctcactag ctggtgttgt
ttgttggtgt 980
gtttattatc atgattagtt gttaaccatc tattttttaa tctaatttgg ttacaatcga
gttctttata 1050
taaagctgta gtctttgagt ttcatgactc gcagcgaaaa aagtttgaga ttttgactct
attttttcac 1120
accactcagg tgaactggat ttattatcat gtttttaatt gaaacttgtt ggctggtttg
atttaaggtt 1190
tttgatttgt gggttattta tgaatgtgag gattatgcaa tgttttgttt ctgggttgtt
tttacaattt 1260 gatctgata 1269
atggtggatt gatttttttt tttaattttc atgattttca gaaattggac aagaatgtca
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 11 5 <211> LONGITUD: 1025
<212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
10 <221> NOMBRE/CLAVE: promotor
<222> LOCALIZACION: (1)...(1025)
<223> OTRA INFORMAClON: promotor de protema de transferencia de Kpidos (LTP)
<400> SECUENCIA: 11 15
5
10
15
gaattcgatt acgatgaaat gaagaactga tagcataatc 70
tttttcgaac aatattcaat gcatgatgat tatatgtcgg 140
ggggtactta agtaaataat aataataata ataatgaatg 210
agaatcacat tccaagcttc atgaacaatc taatgttcaa 280
tctcaacaat acaagaatca ttggcatcgc aagatatttt 350
aacatccttt aaggtatata tattagttcg aaaataatta
420
tttcggccat tcaggcgggt gacccgggat cgttccccag 490
cttgaaagtt ttcttaattc ttggcgctgg ctttttgggt 560
gccactaatt gggcaagata atggcatgtc tgtgttgcgg 630
tggtaatatt ggagttctag tcttctagag acccactgag 700
tttgcgctgt cattaaaatg gtaacatctg gatatatgca 770
ccaacctttg attggactgg aaagaactat aatttacaac 840
atatcaactt gtctcttgtt gtagtgctag ccccattttg 910
atcttgcagt ataaaagctg tccataggag taggagcatt 980
ttcatatata tagttgagat acagaaatat ggaggctcca 1025
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 12 <211> LONGITUD: 2341 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Populus sp.
<220> RASGO:
<221> NOMBRE/CLAVE: promotor <222> LOCALIZACION: (1)...(2341)
<223> OTRA INFORMACION: promotor de ag-13 (AG13)
<400> SECUENCIA: 12
gaattcgcat ccatgcggtg 70
ttagcataac aatcctttat 140
agatagactt ccactggaac 210
gtttctgttt oaaccttctc 280
cttcgactgc aacctccgct
agttcgcatt ggtttgatcc taaaccacta gctagacatg catgcagcat tctcccgtga ctctgtttca acaggcttot tcttctgccg gtgcctcacc
aatcagaaga
atcaataaat
ccttagcatc
tgacatttga
ccctaagcaa
tgtgttaatc
caacggcgtc
ggaaggaacg
tagttggctc
atggctggat
atggaatggg
actaattttc
attagtggac
gcattcccat
gatct
aagtggaaca
caagattcaa
tgacctcatt
gttcttcott
aggccctgta
ttgataatta ttcaaaataa aatcaattta atgtaaaaaa taaaattcgc tatttttaga tatttttaat aattcaagaa gctctaaaat ccccgtacaa ttcatgtgca gtggtgagta agttttaatt tttatgtttt cggtgttgcg aaaggtaatg aaaggggagc tttgtggtgg aatgagcttc aagggttaat atgatatggc acccaaatca taaagccaag tgctgcaata tgggcatcga gttgaggttc acagcaagaa aatcaatttg
tttccatacc cacaccccca cctacacaca agaacccact actcagtctt ttctaotggg ttcttcttot tcctttgggg gtctctttag cctcctcgac
350 aacaggctct 420
acgggtatat coggctcotc ttttgtotcc tcaacaaccg gctctggtgt ttccttaggt
gtctcctcct 490
cagttttctc tagtaccgtt ggctcttctg cagcgatctt ggtctcttcg agcacttctt
tagtttcagc 560
ttcagctggg gcctcgggct ctggtgccac gggctcctca gatgctgcaa ctttctctgc
ttcttttggc 630
tcttcatgag ttactgcctc tggtgctgca gtgaccgctt cttctgtggt ggtctcaacc
ttgattggtt 700
gttcattttt ttcctctaca agtgcattct gcgctgacac aacctgcagg atacgttatt
aaaagaaaag 770
aatgttcacc aaaatgctga tgaggtotta ccatttgtta tatatataga gatgaatata
cgaattttca 840
aatatgaaca tocacgaatt aaagatcata attaagatgg aggtgttgat cttgatgtac
attccatcag
cataaaactt atcagagtta tatatataaa tatatttaat gacttggaag aagtaataga
910 tgaaatctgt 980
taaataaact tctcaagagg gagattaaat cattcttagt gaatgagtta cctcaacagt
ggccattgga 1050
actagaagga aaataaagca cagctgggat gcaaaagaaa actgtaagaa gcaaaaaggt
acgttggagt 1120
aattatcaca gaagaggatg aagaaattgc tttgagtatt tgatgcagag tactgatgaa
cgagggtgga 1190
tttatataga gatgtagggg gctcactcga gcgagggagg gagtgagtga gagaagagag
ctaccgtccg 1260
aggaatcttg ggatctgaca ccatagctga tgtcattaaa gaattgttgg aagtgaattc
ctttttagaa 1330
tattttttat ttataaatat attataataa tattttttat tttttaaaat ttattttgat
atatgtatat 1400
taaaaagaat aaaaataaaa attaaatttt aacaaatctc catttgggca oacgatttaa
tttgaaaagg 1470
ctaaaataat ggaggccatt ttcatcttag ccatcatctt cttttggtcg cgtgtgctga
tgtgctttgt 1540
gcagtcggtc atgtaggtga ttatcatcca ttcatgttct caacttgcca ttcgtcatta
acaactcctc 1610
cctttttttt cttttttttt taaggataaa tgaattaatt ttttaagaaa ataatgaaaa
taatttgtca 1680
aaaattttag aaataaaaaa ttccaacaat gctgggtcac taaaattatt aataatattt
aagaaataaa 1750
agcaattgac caaaagaact ttcaaaaaaa gctatcttta tttttttttt taatatttct
caatatttgc 1820
ttgcactata aactagtact gtgattttct catgttaaat aataataata ataataataa
tcacccttaa 1890
ccaataggca taatttactt caaacaagcg aataaaactc tgacgtggaa atttaagttg
gtcccacgct 1960
ctctctcggc cattgcttta tcaattatgg tatttcataa aaaatttaat tttttttaaa
tagttttaat 2030
atattaatat taaaaataat ttttaaaata aaaaatatta ttttaatata tctttaaatt
aaaactactt 2100
taataaacaa gctatcacat tatcaaacgc tatttaaagt cggcggatcc cacgagatgc
agggatagca 2170
acattagtgt aggactggat cagctgagct ggagctggtg gacggccatg tccacggatt
tcgtcgctgt 2240
cgattacgtg tcaacagttt ttttttatat tattttcttc tacttttcca gatggatcca
agcctccaag 2310
aacgaaacat tggctacagt ttgaaaactc ttaaaaatgt taagattaat aagattagca
gcatcatatt 2341
aagtcaagga atgtcagatc t
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 13 5 <211> LONGITUD: 31
<212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> SECUENCIA: 13
5?- GCCATAGCTC CTTAAGAGAA ACAGAAAGCA A -3?
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 14 <211> LONGITUD: 32 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 14
5?- CAATATAGAA TCAATGAACA GCACTAGTTT GC -3?
<200> CARACTER^STICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 15 <211> LONGITUD: 20 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 15
5?- TCATGTCCTA TCCAACGGCG - 3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 16 <211> LONGITUD: 24 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 16
5?- CTCATTTTCT CTCAAAGCTC AAAG -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 17 <211> LONGITUD: 30 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 17
5?- GACAACTAGT CTAAAGTTAA AACTTAGACC -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 18 <211> LONGITUD: 20 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 18
5?- CCCTGGAGGT TGGGGTGAGT - 3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 19 <211> LONGITUD: 25 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5?- GCGTTCATCT ACAAAACCCT CCTCC -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 20 <211> LONGITUD: 23 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 20
5?- TTCATCCTTA TTTTTTTGGG ATA -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 21 <211> LONGITUD: 20 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 21
5?- CAAAGGATCA TGGAGTTGGA - 3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 22 <211> LONGITUD: 34 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 22
5?- TATACTAATA TGACCTAATA ACTTAGAAGT GTGG -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 23 <211> LONGITUD: 22 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 23
5?- CATCTTGATC AAGATTGAAT TC -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 24 <211> LONGITUD: 20 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 24
5?- CATAATATCA AAACTTAAGC - 3'
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 25 <211> LONGITUD: 33 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5?- TGAATTGATG ACGTAGGAAA CATGATAAAC ATG -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 26 <211> LONGITUD: 28 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 26
5?- CATTTTCTTG AAACAATGAG GCTAAGAG -3'
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 27 <211> LONGITUD: 29 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 27
5?- GACATGAGAA ACTAACGTTG CTTGAATTC -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 28 <211> LONGITUD: 33 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 28
5?- CATAATATTG GAACTGGTTT CTTTGTCAGA AAG -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 29 <211> LONGITUD: 25 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 29
5?- GCGCTCGGGT TGTCACCATA GTTTC -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 30 <211> LONGITUD: 26 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 30
5?- CATGTTGTTA TATTTAGATA AATGTA -3'
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 31 <211> LONGITUD: 29 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5?- TTCATCAAGC AATAATAATA AGGTGAGGC -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 32 <211> LONGITUD: 26 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 32
5?- CATGGATGCA GATTTTTGTG TTTGTG -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 33 <211> LONGITUD: 26 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 33
5?- TTCAGTGAAC ATGCTGCCAC AATGAC - 3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 34 <211> LONGITUD: 26 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 34
5?- AATCGAAACC GATCGATTTG AACTGG -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 35 <211> LONGITUD: 21 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 35
5?- CATGGTGCTT GCTTCAGATA G -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 36 <211> LONGITUD: 28 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 36
5?- GGAAATGTCA ACACTTGTGT GACCACAC -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 37 <211> LONGITUD: 23 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
5?- GACATTCTTG TCCAATTTCT GAA -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 38 <211> LONGITUD: 24 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 38
5?- GGAGCCTCCA TATTTCTGTA TCTC -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 39 <211> LONGITUD: 28 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 39
5?- CAAGACGATG AAATGAAGAA CTGATAGC -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 40 <211> LONGITUD: 26 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 40
5?- GACATTCCTT GACTTAATAT GATGCT -3?
<200> CARACTERISTICAS DE SECUENCIA: <210> SEQ ID NO 41 <211> LONGITUD: 26 <212> TIPO: ADN
<213> ORGANISMO/FUENTE: sintetica <221> NOMBRE/CLAVE: cebador/oligonucleotido
<400> SECUENCIA: 41
5?- GAATTCGCAT CCATGCGGTG AGTTCG -3? 25697179.1 1

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que tiene la capacidad de iniciar, en una planta, la transcripcion de un gen de una manera preferida de tejido de xilema y/o cambium, en la que dicha molecula de acido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleotidos como se expone en la SEQ ID NO: 3.
  2. 2. Un vector de expresion, preferentemente un plasmido, que comprende:
    (i) la molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 1, y
    (ii) una molecula de acido nucleico que codifica una protema de interes, en la que (i) y (ii) estan en union operativa, en la que (i) no regula normalmente (ii).
  3. 3. Una celula de planta hospedadora recombinante, en la que dicha celula hospedadora recombinante se transforma o transfecta con y comprende
    (i) la molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 1 y
    (ii) una molecula de acido nucleico que codifica una protema de interes, en la que (i) y (ii) estan en union operativa, en la que (i) no regula normalmente (ii).
  4. 4. Una celula hospedadora recombinante, en la que dicha celula hospedadora recombinante se transforma o transfecta con y comprende el vector de expresion de la reivindicacion 2.
  5. 5. Un metodo de fabricacion de una celula de planta hospedadora recombinante, comprendiendo dicho metodo transformar o transfectar una celula con el vector de expresion de la reivindicacion 2.
  6. 6. Un metodo de fabricacion de una protema codificada por el vector de expresion de la reivindicacion 2, que comprende transformar o transfectar una celula con dicho vector de expresion y cultivar dicha celula en condiciones favorables para la expresion de dicha protema.
  7. 7. Un metodo de fabricacion de una protema, comprendiendo dicho metodo cultivar una planta o una parte de planta que comprende una celula hospedadora de planta recombinante de la reivindicacion 3, en condiciones que favorezcan la produccion de dicha protema por dicha planta o parte de planta.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que dicha planta es una dicotiledonea, una monocotiledonea o una gimnosperma.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que dicha planta es Eucaliptus, Populus o Pinus.
  10. 10. Una planta o parte de planta que comprende la celula de planta recombinante de la reivindicacion 3.
  11. 11. La planta de la reivindicacion 10, en la que dicha planta es una monocotiledonea, una dicotiledonea o una gimnosperma.
  12. 12. La planta de la reivindicacion 11, en la que dicha dicotiledonea es Eucaliptus, Populus o Pinus.
  13. 13. La parte de planta de la reivindicacion 10, en la que dicha parte de planta es una semilla.
  14. 14. La celula hospedadora recombinante de la reivindicacion 3, en la que dicha celula hospedadora recombinante es una celula de polen.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 7, en la que dicha parte de planta se selecciona del grupo que consiste en una rafz, un tallo, una hoja, una flor y un fruto.
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