BRPI0720468B1 - Nucleic acid constructs and methods for altering the length of the fiber of the plant and / or the height of the plant - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONSTRU-TOS DE ÁCIDO NUCLEICO E MÉTODOS PARA ALTERAR O COMPRIMENTO DA FIBRA DA PLANTA E/OU A ALTURA DA PLANTA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US 60/871.048, depositado em 20 de dezembro de 2006, cujo teor é aqui incorporado a título de referência, na íntegra.

CAMPO DE INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos campos de biologia molecular e alteração de expressão gênica em plantas transformadas. Mais especificamente, esta invenção refere-se à modificação do comprimento da fibra e/ou altura d planta de interesse industrial por regulação da expressão de genes que codificam cinases associadas à parede (WAKSs). ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A demanda crescente por produtos de madeira e produtos derivados de madeira constitui um problema de proporção global. É estimado que a taxa sustentável máxima de colheita das florestas no mundo já tenha sido alcançada. Assim, há uma necessidade iminente por mais plantas lenhosas, bem com uma necessidade de desenvolver métodos para aumentar as propriedades agronômicas das plantas florestais, tais como altura da planta aumentada, produção da biomassa aumentada, comprimento de fibra do xilema mais longo. Por exemplo, a uniformidade e resistência da fibra são exigências comuns na maioria dos usos industriais. Na fabricação da polpa, as características de resistência são determinadas em parte pelo comprimento da fibra. Fibras longas são ideais para produção de papel forte, aumento do rendimento de polpa, e redução do consumo de álcali, devido as suas propriedades de resistência e ligantes.

Como um exemplo da importância das plantas lenhosas, pode-se mencionar os eucaliptos que representam as maiores fontes de fibras usadas globalmente na indústria de papel (Bamber, 1985, Appita 38: 210-216). Há uma estimativa de dez a quinze milhões de hectares de terra plantados com eucalipto. Verhaegen e Plomion, 1996, Genome 39: 1051-1061. A maior vantagem do eucalipto é o seu crescimento rápido e capacidade de crescer em uma ampla faixa de condições, tanto tropicais como temperadas. As fibras de eucalipto têm, contudo, uma desvantagem em comparação com as fibras de outras fontes, como o pinheiro, que é seu comprimento signifi-cantemente mais curto. Assim, os papéis que são feitos de polpa de eucalipto são frequentemente fracos e requerem usualmente reforço com fibras mais longas de outras fontes, aumentando os custos de produção. O comprimento da fibra é controlado por regulação endógena do alongamento da célula, um processo que resulta da interação entre a pressão de turgescência interna e a resistência mecânica da parede celular, mas seu mecanismo e genes envolvidos não foram ainda totalmente compreendidos. Células de fibras de xilema se desenvolvem de iniciais fusifor-mes já bastantes alongadas localizadas dentro do câmbio vascular. Elas aumentam de diâmetro por extensão de suas paredes radiais, e, além disso, desenvolvem células de fibras que se alongam por crescimento da ponta intrusiva, o que resulta em até um aumento de várias vezes o comprimento da célula. Gray-Mitsumune etal., 2004, Plant Physiol. 135:1552-1564.

Em célula de crescimento de ponta, a expansão ocorre em uma área pequena da superfície da célula, que resultar em células tubulares, a-longadas. Por exemplo, as fibras do choupo se alongam intrusivamente na zona de expansão radial no xilema, alcançando 150% de seu comprimento celular inicial em média quando integralmente diferenciado, Hussey et al., 2006, Annu. Rev. Plant Biol. 57: 109-125; Mellerowicz et al., 2001, Plant Mol. Biol. 47: 239-274. A rápida expansão de células de fibra pode ser obtida por ação orquestrada da pressão contra a parede celular exercida por turgescência e afrouxamento da parede celular. Em fibras de algodão, a fase de alongamento celular segue uma elevação significante de turgescência, resultado do acúmulo observado de malato, açúcares, e K\ o principal osmótico, logo o influxo de água e a geração de alta turgescência nas células da fibra. Ruan et al., 2004, Plant Physiol. 136: 4104-4113.

Invertases vacuolares têm um papel importante na manutenção da turgescência e expansão da parede celular. Um trabalho recente na Ara-bidopsis thaliana mostrou que uma cinase associada à parede (WAK) pode regular uma invertase vacuolar estabelecendo assim uma ligação compor-tamental cruzada entre WAK e as invertase(s) vacuolar(es). Kohorn et al., 2006, Plant J. 46: 307-316.

As WAKs na Arabidopsis são codificadas por cinco genes firmemente ligados e altamente similares, e são expressos nas folhas, meris-temas, e nas células que passam por expansão. Wagner e Kohorn, 2001, Plant Ce//13: 303-318.

Semeaduras mutantes da Arabidopsis thaliana apresentando uma inserção de T-DNA no gene da WAK2 eram significantemente mais curta que as plantas do tipo selvagem, com as raízes mais afetadas que os hi-pocótílos. Kohorn etal., 2006, Plant J. 46: 307-316.

Essas plantas mutantes mostraram uma atividade de invertase vacuolar reduzida em 62%, e os autores propuseram que a WAK 2 regula a transcrição da invertase vacuolar como um constituinte de um mecanismo regulador das concentrações do soluto e da regulação de turgescência, proporcionando, assim, um mecanismo possível para WAK para regular a expansão celular. A expressão de uma WAK2 antissentido induzível na Arabidopsis levou a uma redução de 50% nos níveis de proteína WAK, com perda subsequente de alongamento celular e logo a plantas anãs. Resultados similares reportados quando um gene WAK4 foi usado para reduzir os níveis totais de proteína WAK. Wagner e Kohorn, 2001, Plant Cell 13: 303-318; Lal-ly etal., 2001, Plant Cell 13: 1317-1331.

Sabe-se que as cinases associadas à parede contêm domínios extracelulares que podem estar ligadas às moléculas de pectina da parede celular, englobar a membrana plasmática e ter um domínio de cinase cito-plasmática de serina/treonina. He et al. 1999, Plant Mol. Biol. 39: 1189-1196.

Quando as fibras são submetidas a alongamento significante em ambas as extremidades (crescimento de ponta intrusivo), as propriedades do limite de lamela média deste tipo de crescimento celular. Lamelas médias de células de madeira em desenvolvimento são ricas em pectinas, e o crescimento de ponta intrusivo requer a dissolução da lamela média. Vide Berthold et al., WO 2006/068603.

Por sua ligação de pectina, é possível que as WAKs possam detectar uma alteração no ambiente da parede celular, proporcionado assim um mecanismo molecular que ligar a parede celular detectando a regulação do metabolismo do soluto, que, por sua vez, sabe-se que está envolvido na manutenção da turgescência e da expansão celular nas células em crescimento. Tal informação pode ser inestimável para o ajuste da expansão celular ou turgescência. Huang et al., Funcional Plant Biology, 34: 499-507.

As características das fibras são controladas por um conjunto complexo de fatores genéticos e não são facilmente tratáveis por métodos de multiplicação clássica. Através da geração de árvores lenhosas tradicionais, é possível obter alguma modificação das características das fibras, Por exemplo, híbridos triplóides interespecíficos do choupo têm sido desenvolvidos com fibras mais longas que as espécies parentes. Aziz et al., 1996, Wo-od and pulp properties of aspen and its hybrids. TAPPÍ Proc. Pulping Confe-rence. p. 437-443. Ainda, considerando a desvantagem da multiplicação de árvores lenhosas tradicionais, tal como o progresso lento devido aos seus períodos longos de geração e a dificuldade de se produzir uma planta com uma característica desejável, os desenvolvimentos de tecnologia gênica podem reduzir de modo significante o tempo requerido para produzir uma nova variedade e possibilitar o alvejamento mais próximo das características consideradas desejáveis pelas indústrias florestais e de polpa em espécies de árvores específicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção proporcionar um construto de ácido nucleico que compreende uma sequência de polinucleotídeos de WAK ligada operavelmente a um promotor de preferido de xilema que causa a super-expressão da dita sequência de polinucleotídeos de WAK. Em uma modalidade, a promotor preferido de xilema é selecionado do grupo que consiste em promotor de gene TUB, promotor de gene SuSy, promotor de gene COMT e promotor de gene C4H. Em uma outra modalidade, uma planta transgênica compreende o construto de ácido nucleico e a planta tem um aumento do comprimento da fibra e/ou altura em comparação com uma planta não-transgênica da mesma espécie. Em outras modalidades, a planta é uma dicotiledônea, monocotiledônea, gimnoesperma, ou árvore de madeira de lei. A invenção contempla ainda a progênie da planta transgênica, bem como a polpa de madeira e a fibra de madeira produzidas da planta transgênica.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método para aumentar o comprimento da fibra e/ou a altura da planta, compreendendo: (a) introduzir em uma célula de planta um construto de ácido nucleico que compreende uma sequência de polinucleotídeos de WAK ligada operavel-mente a um promotor preferido de xilema que causa superexpressão da dita sequência de polinucleotídeos de WAK; (b) cultivar a dita célula da planta sob condições que promovem o crescimento de uma planta; e (c) selecionar uma planta transgênica que tem comprimento de fibra e/ou altura de planta, aumentados; e (c) selecionar uma planta transgênica em comparação com uma planta não-transgênica da mesma espécie.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra esquematicamente o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção que compreende uma promotor preferido de câmbio/xilema que aciona a expressão de uma sequência de nucleotídeos de cinase associada à parede da invenção. A Figura 2 mostra o comprimento da fibra de várias linhagens transgênicas transformadas com o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK e as respectivas plantas não-transgênicas. O asterisco denota os valores de comprimento médios de fibra mais altos estatisticamente significantes (P<0,05, teste t). A Figura 3 mostra o comprimento de fibra de dois genótipos de uma planta transgênica T1 (linhagem 51B) transoformadas com o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção. O asteris- co denota os valores de comprimento médios de fibra mais altos estatisticamente significantes (P<0,05, teste t). A Figura 4 mostra o comprimento de fibra de dois genótipos de uma planta transgênica T1 (linhagem 47B) transformada com o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção. O asterisco denota os valores de comprimento médios mais altos estatisticamente significantes (P<0,05, teste t). A Figura 5 mostra a altura da planta dos três genótipos de uma linhagem transgênica T1 (linhagem 51B) transformada com o vetor de plasmídeo de expressão de planta pALELLYX-WAK da invenção. O asterisco denota os valores de comprimento médios mais altos estatisticamente significantes (P<0,05, teste t). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENCAÕ A presente invenção refere-se a processos para a manipulação genética de comprimento de fibra em plantas e/ou aumento da altura da planta. A parede celular da planta é uma rede fibrilar forte que da a cada célula sua conformação estável. Para aumentar, as células seletivamente se afrouxam da célula, permitindo que ela ceda às forças expansivas geradas pela pressão de turgescência da célula. Conforme a célula se expande, há uma necessidade aumentada de ajuste compensador da turgescência, que é dependente do metabolismo do soluto da célula.

Uma cinase associada à parede (WAK) pode detectar a expansão da parede celular por sua ligação à pectina, proporcionando assim um mecanismo para transdução destes sinais aos sistemas que regulam as alterações no soluto, conforme descrição acima. Contudo, a trabalho anterior sobre WAKs não previu que a superexpressão de um gene de WAK na planta, em um modo específico de tecido, resulta em alterações significantes do comprimento da fibra, bem como alterações significantes da altura da planta. O resultado abre caminho para modificação das características do comprimento da fibra, bem como das alterações significativas da altura da planta. O resultado abre caminho para modificar características que são extremamen- te importantes para as indústrias de fibras vegetais, florestais, de polpa, e de papel.

De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para modificar o comprimento da fibra em tecidos de planta, tais como células de fibra do xilema de angiosperma lenhosa, células tra-queídes de xilema de gimnoesperma, e células de fibras de sementes algodão, por controle da atividade da cinase associada à parede. De acordo com esse aspecto da invenção, células de plantas ou plantas inteiras são geneticamente engenheiradas geneticamente com sequência de codificação da cinase associada à parede, que, quando expressa em células de fibras xila-res das angiospermas, traqueídes xilares de gimnospermas, ou células de fibras das sementes de algodão, provoca um aumento do comprimento da célula.

Todos os termos técnicos usados aqui são termos comumente usados em bioquímica, biologia molecular e agricultura, e podem ser entendidos por aquele com conhecimento ordinário na técnica ao qual esta invenção. Aqueles termos técnicos podem ser encontrados em: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook e Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience, Nova Iorque, 1988 (com atualizações periódicas); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5a ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997. Metodologia envolvendo técnicas de biologia de plantas é descrita aqui e descrita em detalhes em tratados tais como METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995. Várias técnicas usando PCR são descritas por técnicas usando PCR são descritas, por exemplo, por Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego, 1990 e por Dveksler, PCR PRIMER: A LABO RATO RY MANUAL, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y., 2003. Pares de primers em PCR podem ser derivados de sequências conhecidas por técnicas conhecidas, tal como usar programas pretendidos para este propósito, por exemplo, Primer, Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biome-dical Research, Cambridge, MA, Métodos para síntese química de ácidos nucleicos são discutidos, por exemplo, por Beaucage and Caruthers, 1981, Tetra. Letts. 22: 1859-1862, e Matteucci e Caruthers, 1981, J Am. Chem. Soc. 103: 3185.

Digestões de enzima de restrição, fosforilações, ligações e transformações foram feitas por Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Todos e materiais usados para o crescimento e manutenção de células bac-terianas foram obtidos da Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl), DIFCO Laboratories (Detroit, Ml), Invitrogen (Gaithersburg, MD), ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que de outro modo especificado.

Os termos "codificação" referem-se ao processo pelo qual um gene, através dos mecanismos de transcrição e de tradução, proporciona informação a uma célula do qual uma série de aminoácidos podem ser montada em um sequência de aminoácidos específica para produzir uma enzima ativa. Devido à degenerescência do código genético, são contempladas certas alterações de base em sequência de DNA não alteram a sequência de aminoácidos de uma proteína. Portanto, é entendido que modificações na sequência de DNA que codifica cinase associada à parede que não afetam substancialmente as propriedades funcionais da proteína.

Nessa descrição, "expressão" denota a produção do produto de proteína codificado por um gene. Alternativamente ou adicionalmente, "expressão" denota a combinação dos processos intracelulares, incluindo transcrição e tradução, sofridos por uma molécula de DNA codificação tal como um gene estrutural produzir um polipeptídeo. "Superexpressão" refere-se à expressão de uma sequência de genes particular na qual a produção do mRNA ou polipeptídeo em um organismo transgênico excede os níveis de produção em organismo não-transgênico. O termo "ácido nucleico heterólogo" refere-se a um ácido nuclei-co, DNA ou RNA, que foi introduzido em uma célula (ou o antepassado da célula) através dos esforços dos humanos. Tal ácido nucleico exógeno pode ser uma cópia de uma sequência que é naturalmente encontrado na célula na qual foi ele foi introduzido, ou fragmentos destes.

Em contraste, o termo "ácido nucleico endógeno" refere-se a um ácido nucleico, gene, polinucleotídeo, uma molécula de DNA, RNA, mRNA, ou cDNA que está presente em uma planta ou no organismo que é para ser geneticamente engenheirado. Uma sequência endógena é "nativa" para, isto é, indígena para, a planta ou o organismo que é para ser geneticamente engenheirado. O termo "sequências homólogas" refere-se a sequências de po-linucleotídeos ou de polipeptídeos que são similares devido à ancestralidade e conservação de sequências comuns. O termo "homólogo funcional" refere-se a sequências de polinucleotídeo ou de polipeptídeo que são similares devido à ancestralidade e conservação de sequências comuns e têm função idêntica ou similar nos níveis catalíticos, celulares, ou em organismos.

Sequências de Cinase Associadas à Parede Nessa descrição, o termo "sequências de polinucleotídeos de cinase associada à parede" denota qualquer ácido nucleico, gene, molécula de DNA, RNA, mRNA, ou de cDNA que codifica um polipeptídeo de cinase associada à parede cuja superexpressão altera o comprimento da fibra e/ou a altura da planta. O DNA ou o RNA pode ser de fita dupla ou de fita simples. DNA de fita simples pode ser a fita de codificação, também conhecida como a fita sentido, o pode ser a fita de não codificação, também chamada de a fita antissentido. Ilustrativos desta categoria são moléculas de polinucleotídeos que compreendem SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7 e 9, identificadas da Arabidopsis thaliana e que podem ser empregadas para aumentar o comprimento da fibra e/ou a altura da planta. A sequência de polinucleotídeo de cinase associada à parede adequada para a presente invenção pode ser identificada de uma miríade de organismos caracterizados pela presença de um gene de WAK. Embora as sequências de nucleotídeos mencionadas acima estejam descritas aqui, elas não devem ser consideradas como limitações da presente invenção. Assim, uma sequência de WAK pode ser identificada e funcionalmente anotada por comparação de sequências. Aquele versado na técnica pode prontamente identificar uma sequência de WAK em uma base de dados adequada, tal como GenBank, usando programas e parâmetros de análise de sequências publicamente disponíveis. Alternativamente, a seleção de bibliotecas de cD-NA ou de bibliotecas genômicas empregado sondas de hibridização adequadas ou primers com base em DNA ou sequências de proteínas descritas aqui devem levar à identificação de sequências de WAK funcionalmente relacionadas (homólogo funcional). É também apreciado no campo que as sequências com níveis reduzidos de identidade podem ser também isoladas com o auxílio de oligonucleotídeos degenerados e metodologia baseada em PCR. Embora os polinucleotídeos da invenção sejam isolados da Arabidop-sis thaliana, os homólogos funcionais de outras plantas podem ser empregadas para produzir plantas com comprimento de fibra e/ou altura de planta aumentados. Exemplos de espécies de plantas cujos genes de WAK podem ser isolados incluem dicotiledôneas, tais como Cucurbitaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Papilionaceae tal como alfalfa e Vigna unguiculata, Malvace-ae, Asteraceae, Malpighiaceae 8 tal como Populus, Myrtaceae tal como Eucalipto, e monocotiledôenas tais como as gramíneas, incluindo arroz, trigo, cana-de-açúcar, cevada e milho.

Nessa descrição, os termos "sequência de polinucleotídeos de cinase associada à parede", "sequência de polinucleotídeos de WAK", e "sequência de DNA de WAK" referem-se também a qualquer molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos capazes de hibridízarem sob condições estringentes com qualquer uma das sequências descritas aqui, e de codificarem um polipeptídeo com atividade de WAK equivalente à proteínas tendo sequências de aminoácidos descritas aqui sob SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8 ou 10. Os termos incluem também sequência que hibridizam de modo cruzado com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9, tendo, preferivelmente, pelo menos 65% de homologia ou identidade com uma ou mais das SEQ ID Nos: 1,3, 5, 6 ou 9. As sequências de nudeotídeos da invenção podem codificar uma proteína que seja homóloga ao produto de gene predito descrito aqui sob qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, ou 10. Ainda, as sequências de nudeotídeos da invenção incluem aquelas sequências que codificam uma polipeptídeo de WAK tendo uma sequências de aminoácidos que tem pelo menos 55%, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e de maior preferência pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos descrita aqui sob qualquer uma de SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8 e 10. A degenerescência do código genético permite maiores variações na sequência de nudeotídeos de um polinucleotídeo enquanto a sequência de aminoácidos da proteína codificada é mantida. A frase "condições estringentes" aqui diz respeito a parâmetros com os quais a técnica está familiarizada. Polinucleotídeos de fita simples hibridizam quando eles se associada com base em uma variedade de forças físico-químicas bem caracterizadas, tais como ligação de hidrogênio, exclusão com solvente, e empilhamento de base. A estringência de uma hibridi-zação reflete o grau de identidade da sequência dos ácidos nucleicos envolvidos, de modo que quando maior a estringência mais similares são as duas fitas de polinucleotídeo. A estringência é influenciada por uma variedade de fatores, incluindo temperatura, concentração e composição de sais, aditivos orgânicos e inorgânicos, solventes, etc. presentes tanto na hibridização e soluções de lavagem como nas incubações (e número). Aquele com conhecimento ordinário da técnica pode selecionar prontamente tais condições variando a temperatura durante a reação de hibridização e o processo da lavagem, a concentração de sal durante a reação de hibridização e o processo de lavagem, e assim por diante.

Para hibridização de ácidos nucleicos complementares que têm mais que 100 resíduos complementares, em um filtro em Southern ou Northern blot, as condições de hibridização "estringentes" são exemplificadas por uma temperatura que é de cerca de 5°C a 20°C inferiores ao ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica, em uma resistência iônica e pH definidos. Tm é a temperatura sob resistência iônica e pH definidos, onde 50% da sequência alvo hibridiza para uma sonda perfeitamente correspondente. Moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições estringentes hibridizarão tipicamente para um sonda com base ou no cDNA inteiro ou em porções selecionadas. Mais preferivelmente, "condições estringentes" referem-se aqui aos parâmetros com os quais a técnica está familiarizada, tais como hibridização em 3,3 x SSC, 1 x solução de Denhardt, tampão de fosfato de sódio 25mM (pH 7,0), SDS a 0,5%, e EDTA 2mM, por 18 horas a 65°C, seguido por quatro lavagens do filtro, a 65°C, por 20 minutos, em 2 x SSC e SDS a 0,1%, e uma lavagem final por até 20 minutos em 0,5 x SSC e SDS a 0,1% ou 0,3 x SSC e SDS a 0,1% para maior estringência, e 0,1 x SSC e SDS a 0,1% para uma estringência maior. Outras condições podem ser substituídas desde que o grau de estringência seja igual ao fornecido aqui, usando-se uma lavagem fina com 0,5 x SSC. Para identificação de homólogos menos intimamente relacionados pode ser realizada em uma temperatura inferior, por exemplo, 50°c. Em geral, a estringência é aumentada por elevação da temperatura de lavagem e/ou decréscimo da concentração de SSC.

Adicionalmente, a categoria de sequências de cinase associada à parede, adequadas, incluir uma molécula de ácido nucleico compreendida de uma variante de SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 7 ou 9 com uma ou mais bases deletadas, substituídas, inseridas ou adicionadas, cuja variante codifica um polipeptídeo quando superexpressado resulta na alteração do comprimento de fibra e/ou altura da planta. As "sequências de base com uma ou mais bases deletadas, substituídas, inseridas, ou adicionadas" referidas aqui são largamente conhecidas por aqueles versado na técnica para reter a atividade fisiológica mesmo quando a sequência de aminoácidos de uma proteína tendo geralmente esta atividade fisiológica tem um ou mais aminoácidos substituídos, deletados, inseridos, ou adicionados. Por exemplo, a cauda de poly A ou as regiões de não-tradução das extremidades 5' ou 3' podem ser deletadas, e as base podem ser deletadas desde que os aminoácidos sejam deletados. As bases podem ser também substituídas desde que não resulte em deslocamento de estrutura. As bases podem ser também "adicionadas" desde que os aminoácidos sejam adicionados. Contudo, é essencial que qualquer de tal modificação não resulte na perda de atividade fisiológica. Um DNA modificado neste contexto pode ser obtido por modificação das sequências de base de DNA da invenção de modo que os aminoácidos em sítios específicos sejam substituídos, deletados, inseridos, ou adicionados por mutagênese sítio-específica, por exemplo, Zoller & Smith, 1982, Nucleic Acid Res. 10: 6487-6500. Por conseguinte, o termo "variante" é uma sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos que desvia do padrão ou dada sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos de um gene ou proteína particular. A variante pode ter alterações "conservativas", em que um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas similares, por exemplo, reposição da leucina por isoleucina. Uma variante por ter alterações "não conservativas", por exemplo, reposição de uma glicina por um triptofano. Menores variações análogas podem incluir também deleções ou inserções de aminoácidos, ou ambas. A orientação cujos resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados pode ser encontrada usando programas de computador bem conhecidos da técnica tal como software Vector NTI Suíte (InforMax, MD). "Variante" pode também se referir a um gene "shuffled", conforme descrito, por exemplo, mas patentes US 6.506.603, US 6.132.970, US 6.165.793 e US 6.117.679.

Um outro modo de obter uma sequência de DNA de WAK é para sintetizá-la ab initio das bases apropriadas, por exemplo, pelo uso da sequência de cDNA apropriada como um molde.

Construtos de Ácido Nucleico A presente invenção inclui construtos recombinantes que compreendem uma ou mais sequências de ácidos nucleicos aqui. os construtos compreendem tipicamente um vetor, tal como um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus (por exemplo, um vírus de planta), um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), ou similares, nos quais uma sequência de ácidos nucleicos foi inserida, em uma orientação de avanço ou reversa. Números grandes de vetores adequados são conhecidos e estão comercialmente disponíveis e não precisam ser reiterados aqui.

Construtos de ácido nucleico recombinantes podem ser feitas usando-se técnicas padrão. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos para transcrição pode ser obtida por tratamento de um vetor contendo a dita sequência com enzimas de restrição para cortar o segmento apropriado. A sequência de nucleotídeos para transcrição pode ser também gerada por anelamento ou ligação de oligonucleotídeos sintéticos ou pelo uso de oligo-nucleotídeos sintéticos em uma reação em cadeia de polimerase (PCR) para dar sítios de restrição adequados em cada extremidade. A sequência de nucleotídeos é então clonada em vetor contendo elementos reguladores adequados, tais como sequências de promotores a montante e terminadores a jusante. Tipicamente, vetores de transformação de planta incluem uma ou mais sequências codificação de plantas clonadas (genômico ou cDNA) sob o controle transcricional de sequências reguladores 5' e 3' e um marcador se-lecionável. Tais vetores de transformação de plantas contêm também tipicamente um promotor, um sítio de partida de iniciação de transcrição, um sinal de processamento de RNA (tal como sequências de sinais de união), um sítio de terminação de transcrição e/ou um sinal de poliadenilação. Inten-sificadores e sequências de alvejamento podem estar também presentes. A invenção proporciona moléculas de ácido nucleico que provavelmente causam comprimento de fibra e altura de planta alterados em uma planta transformada. Um aspecto importante da presente invenção é o uso de construtos de ácido nucleico, em que uma sequência de nucleotídeos de codificação de cinase associada à parede está operavelmente ligada a um ou mais promotores, que acionam a expressão da sequência de codificação de um modo constitutivo ou em certos tipos de células, órgãos, ou tecidos de modo a alterar o comprimento da fibra de uma planta transformada em com- paração com o comprimento da fibra de uma planta não-transgênica.

Promotores de plantas constitutivos adequados, que podem ser úteis para expressar as sequências de cinase associada à parede, adequadas, para a presente invenção, incluem, mas sem limitação, o promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor (CaMV), o milho e os promotores de poli-ubiquitina da Populus, que conferem expressão constitutiva de alto nível na maioria dos tecidos de planta (vide, por exemplo, WO 2007/00611, Patente US 5.510.474; Odell et al., Nature, 1985, 313: 810-812); o promotor da sinta-se da nopalina (An et al. 1988, Plant Physiol. 88: 547-552); o promotor de FMV do vírus do mosaico da escrofulária (Patente US 5.378.619) e o promotor da sintase da octopina sintase (Fromm et al., Plant Ce//1: 977-984). O promotor pode ser também selecionado de modo que a expressão ocorre em um ponto de tempo determinado do desenvolvimento da planta, ou em um ponto de tempo determinado por influências externas, ou em um modo específico de tecido ou preferido de tecido. Por exemplo, pode ser assegura expressão específica e preferida em células de fibra (promotores específicos ou preferidos de fibra de algodão, de fibra de xilema, ou de fibra de xilaria).

Promotores específicos ou preferidos de fibra de algodão exemplares incluem, por exemplo, o promotor de gene CFACT1 de algodão (Patente US 6.995.256); o promotor de gene E6 (Patente US 6.096.950, John et al., 1996, Plant Mol. Biol. 30: 297-306; John et al., 1996, Proc. Natl Acad. ScL 93: 12768-12773); promotor de gene H6 (John et al., 1995, Plant Physiol. 108: 669-676); promotor de gene GhTUBI (Li et al., 2002, Plant Physiol. 130: 666-674) e FbL2A (Rinehart et al., 1996, Plant Physiol. 112: 1331-1341 e John et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Set USA 93: 12768-12773).

Promotores preferidos ou específicos do sistema vascular, tais como promotores específicos preferidos de xilema podem ser úteis para efetuar a expressão de moléculas de ácido nucleico da invenção, especificamente no tecido vascular, especialmente tecido de xilema. Assim, "preferido de xilema" significa que as moléculas de ácido nucleico da presente invenção são mais ativos no xilema que em qualquer outro tecido da planta. O promotor selecionado deve provocar a superexpressão da cinase associada à parede, de acordo com a presente invenção, de modo a modificar a comprimento do xilema da célula, para modificar a altura da planta hospedeira, ou ambos.

Promotores adequados são ilustrados por, mas sem limitação, ao promotor do gene de tubulina (TUB) preferido do xilema, o promotor do gene do ácido cafeico 3-O-metiltransferase (COMT), o promotor do gene de sacarose sintase (SuSy), e o promotor de gene de cumarato-4-hidroxilase (C4H) preferido do xilema. Outros promotores preferidos do xilema adequados estão descritos no Pedido de Patente Internacional WO 2005/096805, que a aqui incorporado a título de referência.

Promotores específicos que incluem regiões de nucleotídeos específicos conferindo expressão específica de tecido, ou preferida de tecido, podem ser também usados, conforme exemplificados por identificação de elementos reguladores dentro dos promotores maiores conferindo expressão preferida de xilema. Seguín et al., 1997, Plant Mol. Biol. 35: 281-291; Torres-Schumann et al., 1996, Plant J. 9: 283-296; e Leyva et al., 1992, Plant Cell 4: 263-271.

Embora a taxa de expressão gênica seja prontamente modulada pelo promotor, o aperfeiçoamento na expressão pode ser também obtido pela identificação e o uso de sequências intensificadoras, tais côo porções intrônicas de genes, que elevam o nível de expressão dos genes localizados próximos em uma orientação de modo independente. Nas plantas, a inclusão de alguns introns nos construtos de gene em um posição entre o promotor e a sequência de codificação de gene leva a aumentos de acúmulo de mRNA e de proteína. Introns conhecidos por elevarem a expressão nas plantas foram identificados em genes de milho, por exemplo, hsp70, tubAI, Adhl, Shl, UbH (Brown e Santino, Patentes US 5.424.412 e US 5.859.347; Jeon et al., 2000, Plant Physiol. 123: 1005-1014; Callis et al., 1987, Genes Dev. 1 :1183-1200; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91 :1575-1579), e em genes de planta dicotiledônea tal como rbcS da petúnia (Dean et al., 1989, Plant Cell 1: 201-208); ST-LSI da batata (Leon et al., 1991, Plant Physiol. 95: 968-972) e UBQ3 (Norris et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 895-906) e PATI da Arabidopsís thaliana (Rose e Last, 1997, Plant J. 11: 455-464).

De acordo com um aspecto da invenção, uma sequência de ci-nase associada à parede é incorporada em um construto de ácido nucleico que é adequada para transformação de planta. Por conseguinte, os constru-tos de ácido nucleico são proporcionadas compreendendo uma sequência de cinase associada à parede, sob o controle de uma região de iniciação transcricional operativa em uma planta, de modo que o construto pode gerar RNA em uma célula de planta hospedeira. Preferivelmente, a região de iniciação transcricional é parte de um promotor vascular ou preferido de xilema, tais como quais daqueles mencionados acima. Tal construto de ácido nucleico pode ser usada para modificar a expressão de gene de cinase associada à parede em plantas, conforme descrição acima.

Vetores de expressão podem conter também um marcador de seleção por meio do qual as células transformadas podem ser identificadas na cultura. O marcador pode ser associado à molécula de ácido nucleico, isto é, o gene ligado operavelmente a um promotor. Como usado aqui, o termo "marcador" refere-se a um gene que codifica uma característica ou um fenótipo que permite a seleção de, ou a triagem de, uma planta ou célula contendo o marcador. Nas plantas, por exemplo, o gene de marcador codificará resistência a antibiótico ou a herbicida. Isso permite a seleção de células transformadas dentre as células que não são transformadas ou transfec-tadas.

Exemplos de marcadores selecionáveis adequados incluem a-denosina, desaminase, diidrofolato redutase, higromicina-B-fosfotransferase, timidina cinase, xantina-guanina fosforribosiltransferase, resistência ao glifo-sato e resistência ao glufosinato, e amino-glicosídeo 3'-0-fosfotranserase (resistência à canamicina, neomicina ou G418). Esses marcadores podem incluir resistência a G418, higromicina, bleomicina, canamicina, e gentamici-na. o construto pode conter também o gene de marcador selecionável Bar, que confere resistência aos análogos de fosfinotricina como glufosinato de amônio. Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-23 (1987). Outros marcadores selecionáveis adequados são também conhecidos.

Marcadores visíveis, tal como proteína fluorescente verde (GFP), podem ser usados. Métodos para identificar ou selecionar plantas transformadas com base no controle da divisão celular foram também descritas. Vide John e Van Mellaert, WO 2000/052168, e Fabijansk et al., WO 2001/059086.

Sequências de replicação, de origem bacteriana ou viral, podem ser também incluídas para permitir que o vetor seja clonado em um hospedeiro bacteriano ou de fago. Preferivelmente, uma origem procariótica de faixa mais ampla de replicação é usada. Um marcador selecionável para bactéria pode ser incluído para permitir a seleção de células bacterianas contendo o construto desejada. Marcadores selecionáveis procarióticos adequados incluem também resistência a antibióticos tal como canamicina ou tetraciclina.

Outras sequências de DNA que codificam funções adicionais podem estar também presentes no vetor, conforme conhecidas da técnica. Por exemplo, quando Agrobacterium é o hospedeiro, sequências de T-DNA podem ser incluídas para facilitar a transferência subsequente a e incorporação nos cromossomos da planta.

Plantas para Engenharia Genética A presente invenção compreende a manipulação genética das plantas, especialmente árvores de madeira de lei, para superexpressar uma cinase associada à parede em vários tecidos vasculares via introdução de um gene associado à parede, preferivelmente sob o controle de um promotor preferido de xilema ou específico de xilema. O resultado é o comprimento de fibra e a altura da planta aumentados.

Nessa descrição, o termo "planta" denota qualquer material de planta contendo fibra que possa ser geneticamente manipulado, incluindo, mas sem limitação, células de plantas diferenciadas ou não diferenciadas, protoplastos, plantas inteiras, tecidos de planta, ou órgãos de plantas, ou qualquer componente de uma planta tal como folha, caule, raiz, tubérculo, fruta, rizoma, ou similares.

Plantas que podem ser engenheiradas de acordo com a invenção incluem, mas sem limitação, árvores, tal como espécies de Eucalipto (E alba, E. albens, E. amygdalina, E. aromaphloia, E. baileyana, E. balladonien-sis, E. bicostata, E. botryoides, E. brachyandra, E. brassiana, E. hrevistylis, E. brockwayi, E. camaldulensis, E. ceracea, E. cloeziana, E. coccifera, E. cordata, E. cornuta, E. corticosa, E. crebra, E. croajingolensis, E. curtisii, E. dalrympleana, E. deglupta, E. delegatensis, E. delicata, E. diversicolor, E. diversifolia, E. dives, E. dolichocarpa, E. dundasii, E. dunnii, E. elata, E. eryt-hrocorys, E. erythrophloia, E. eudesmoides, E. falcata, E. gamophylla, E. glaucina, E. globulus, E. globulus subsp. bicostata, E. globulus subsp. globu-lus, E. gongylocarpa, E. grandis, E. grandis x urophylla, E. guilfoylei, E. gun-nii, E. hallii, E. houseana, E. jacksonii, E. lansdowneana, E. latisinensis, E. leucophloia, E. leucoxylon, E. lockyeri, E. lucasii, E. maidenii, E. marginata, E. megacarpa, E. melliodora, E. michaeliana, E. microcorys, E. microtheca, E. muelleriana, E. nitens, E. nitida, E. obliqua, E. obtustflora, E. occidentalis, E. optima, E. ovata, E. pachyphylla, E. pauciflora, E. pellita, E. perriniana, E. petioiaris, E. piiuiaris, E. piperita, E. platyphylla, E. polyanthemos, E. popul-nea, E. preissiana, E. pseudo globulus, E. pulchella, E. radiata, E. radiata subsp. radiata, E. regnans, E. risdonii, E. robertsonii, E. rodwayi, E. rubida, E. rubiginosa, E. saligna, E. salmonophloia, E. scoparia, E. sieberi, E. spa-thulata, E. staeri, E. stoatei, E. tenuipes, E. tenuiramis, E. tereticornis, E. te-tragona, E. tetrodonta, E. tindaliae, E. torquata, E. umbra, E. urophylla, E. vernicosa, E. viminalis, E. wandoo, E. wetarensis, E. willisii, E. willisii subsp. faiciformis, E. willisii subsp. willisii, E. woodwardii), Populus spp. (P. alba, P. alba x P. grandidentata, P. alba x P. tremula, P. alba x P. tremula var. glan-dulosa, P. alba x P. tremuloides, P. balsamifera, P. balsamifera subsp. tri-chocarpa, P. balsamifera subsp. trichocarpa x P. deltoides, P. ciliata, P. del-toides, P. euphratica, P. euramericana, P. kitakamiensis, P. lasiocarpa, P. laurifolia, P. maximowiczii, P. maximowiczii x P. balsamifera subsp. trichocarpa, P. nigra, P. sieboldii x P. grandidentata, P. suaveolens, P. szechuani-ca, P. tomentosa, P. tremula, P. tremula x P. tremuloides, P. tremuloides, P. wilsonii, P. canadensis, P. yunnanensis), Coníferas tal como pinheiro teda (Pinus taeda), pinheiro da Flórida (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro lodgepole (Pinus contorta), e pinheiro Monterey (Pinus radiata)', Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii); cicuta do Ocidente (Tsuga canadensis); espruce Sitka (Picea glauca)·, madeira vermelha (Sequoia sem-pervirens)·, abetos verdadeiros tais como abeto prata (Abies amabilis) e abeto de bálsamo (Abies balsamea)·, e cedros tais como cedro vermelho do Oeste (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparís nootkaten-sis).

Plantas produtoras de fibras estão também incluídas neste contexto. Colheitas ilustrativas algodão (Gossipium spp.), linho (Linum usitatis-simum), urtiga ferrão (Urtica dioica), lúpulo (Humulus lupulus), árvores de limeira (Tília cordata, T. x. europaea e T. platyphyllus), sorgo espanhol (Spartium junceum), rami (Boehmeria nivea), amoreira de papel (Brousso-netya papyrifera), linho da Nova Zelândia (Phormium tenax), apócino (A-pocynum cannabinum), espécie de Iris (/. douglasiana, I. macrosiphon e I. purdyi), asclépias (espécies de Asclépia), abacaxi, banana e outros. São também contempladas colheitas de forragem, tais como alfafa, lólio, festuca e trevo.

Na presente descrição, "planta transgênica" refere-se a uma planta que foi incorporada uma sequência de ácidos nucleicos, incluindo, mas sem limitação, genes que não estão normalmente presentes em um genoma de planta hospedeira, sequências de ácidos nucleicos não normalmente transcritos em RNA ou traduzidos em uma proteína, ou quaisquer outros genes ou sequências de ácidos nucleicos que se deseja introduzir na planta tipo selvagem, tais como genes que normalmente podem estar presentes na planta do tipo selvagem, mas que se deseja ou engenheirar geneticamente ou ter a expressão alterada. A categoria de "planta transgênica" inclui tanto um transformador primário ou uma planta que inclui um transformador em sua linhagem, por exemplo, a título de introgressão padrão ou qualquer outro procedimento de multiplicação.

Uma "planta híbrida" refere-se a uma planta ou parte desta resultante de um cruzamento entre duas plantas parentes, em que uma planta parente é uma planta geneticamente engenheirada da invenção. Tal cruzamento pode ocorrer naturalmente, por exemplo, por reprodução sexual, ou artificialmente, por exemplo, uma fusão nuclear in vitro. Os métodos para multiplicação de plantas são bem conhecidos e dentro do nível de um de conhecimento ordinário da técnica da biologia da planta.

Em contraste, uma planta que não é geneticamente manipulada é uma planta de controle e é referida como uma planta "não-transgênica" ou de "controle". Planta não-transgênica pode ser uma planta cujo genoma não está modificado pela introdução de um construto compreendendo as sequências de polinucleotídeos nem fragmento destas da presente invenção. Pode ser também uma planta gerada a partir de células ou tecidos cultivados sem modificação anterior pela introdução de um construto que compreende as sequências de polinucleotídeos da invenção, ou pode compreender pro-gênie recessivo de homozigoto (isto é, não tem nenhuma cópia do transge-ne) resultante de autofertilização de uma planta transgênica. É contemplado que, em alguns casos, o genoma de uma planta transgênica inventiva será aumentado através da introdução estável de um transgene. Em outros casos, contudo, o gene introduzido substituirá uma sequência endógena. Um gene preferido com respeito à presente invenção, é uma sequência de DNA de cinase associada a uma parede, por exemplo, uma obtida de Arabidopsis thaliana. Métodos para Engenharia Genética Os construtos de acordo com a invenção podem ser introduzidos em qualquer célula da planta, usando uma técnica adequada. Tanto as células de planta da angiosperma ou da gimnosperma de monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser geneticamente engenheiradas de vários modos conhecidos da técnica. Por exemplo, vide Klein et al., 1993, Biotechnology 4: 583-590; Bechtold et al., 1993, C. R. Acad. Sei. Paris 316:1194-1199; Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396; Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2717-2722; Sagi et al., 1994, Plant Cell Rep. 13: 262-266.

Espécies de Agrobacterium tais como A. tumefaciens e A. rhiso-genes podem ser usadas, por exemplo, de acordo com Nagel et al., 1990, Microbiol Lett 67: 325. Em resumo, a Agrobacterium podem ser usada com um vetor de expressão de planta, por exemplo, eletroporação, depois da qual a Agrobacterium é introduzida nas células da planta através, por exemplo, do método bem conhecido de discos foliares.

Os métodos adicionais para obtenção disto que incluem, mas sem limitação, a transformação por Rhizobium, Sinorhizobium ou Mesorhi-zobium (Broothaerts et al., 2005, Nature 433: 629-633), eletroporação, bombardeio com pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, e fusão de glicol, transferências nos grãos de pólen germinantes, transformação direta (Lorz et al., 1985, Mol. Genet. 199: 179-182), e outros métodos conhecidos da técnica. Se um marcador de seleção, tal como resistência à cana-micina, for empregado, torna-se mais fácil determinar que células sejam transformadas com êxito.

Os métodos de transformação de Agrobacterium discutidos acima são conhecidos por serem úteis por dicotiledôneas transformadas. Adicionalmente, de La Pena et al., 1987, Nature 325: 274-276; Rhodes et al., 1988, Science 240: 204-207; e Shimamoto et al., 1989, Nature 328: 274-276, todos os quais são incorporados a título de referência, têm monocotiledô-neas cereais transformadas usando Agrobacterium. Vide Bechtold e Pelleti-er, 1998, Methods Mol. Biol. 82: 259-266, mostrando o uso de infiltração a vácuo para transformação mediada por Agrobacterium. A presença de uma proteína, polipeptídeo, ou molécula de ácido nucleico em uma célula particular pode ser medida para determinar se, por exemplo, uma célula foi transformada ou transfectada com sucesso. A capacidade de executar tal ensaio é bem conhecida e não precisa ser reiterada aqui.

Quantificação do Comprimento da Fibra ou Altura da Planta A palavra "fibra" é frequentemente usada para unificar um grupo diverso de tipos de células de planta que compartilham em comum as características de ter uma configuração alongada e celulose abundante nas paredes de células espessas, usualmente, mas nem sempre, descritas como paredes secundárias. Tais paredes podem ser ou não lignificadas e o proto- plasto de tais células pode permanecer vivo ou não na maturidade. Em algumas indústrias, o termo "fibra" inclui usualmente células condutoras de paredes espessas tais como vasos e traqueídes e agregados fibrilares de muitas células de fibras individuais. Para os propósitos da presente invenção, o termo "fibra" inclui: (a) células condutoras e não condutoras do xile-ma; (b) fibras de origem extraxilar, incluindo aquelas de floema, raspas, tecido triturado, e epiderme: e (c) fibras de caules folhas, raízes, sementes, e flores ou inflorescências.

Plantas transgênicas da invenção são caracterizadas pelo comprimento maior das fibras e, preferivelmente, altura maior também. O comprimento aumentado das fibras na planta geneticamente modificada é preferivelmente realizado através da superexpressão de WAK nos tecidos da planta, onde a expansão celular ocorre. Na descrição de uma planta da invenção, "comprimento aumentado das fibras" refere-se ao aumento no comprimento das células de fibra da planta quando comparado ao comprimento das células de fibra em uma planta tipo selvagem. Um aumento quantitativo do comprimento das fibras pode ser medido por diversas técnicas tal qual digitalização, procedimento de Kajaani e o Analisador de Qualidade de Fibras. Han et al., 1999, em: Kenaf Properties, Processing and Products, Mis-sissipi State University, Ag & Bio Engineering, páginas 149 a 167. O comprimento das fibras na planta modificada da invenção é de pelo menos 5 a 15% mais longo, preferivelmente de pelo menos 10 a 30% mais longo e, mais preferivelmente, de pelo menos 20 a 50% mais longo que o comprimento das fibras de uma planta tipo selvagem.

Como o aumento do comprimento das fibras pode ser seguido por um aumento na altura da planta, as plantas transgênicas da invenção podem ter maiores comprimento das fibras e alturas. Nessa descrição, portanto, a frase "aumento da altura da planta" conota um aumento quantitativo na altura da planta, quando comparado à altura de uma planta tipo selvagem. A altura de uma planta modificada da invenção pode ter sua altura aumentada em cerca de 5% a cerca de 90%, preferivelmente cerca de 10% a cerca de 75% e, mais preferivelmente, cerca de 15% a cerca de 65% em relação à altura da planta tipo selvagem.

Exemplos específicos de métodos para a obtenção de genes de cinase associada à parede são apresentados abaixo, assim como para a introdução do gene alvo, através de Agrobacterium, para produzir plantas transformadores. Eles devem ser considerados como exemplos e não como limitações à presente invenção.

Exemplo 1 Isolamento de uma sequência de DNA de cinase associada à parede da A-rabidoosis thaliana (a) preparação de RNA do embrião da Arabidopsis thaliana e síntese de cD-NA.

Cortes do caule de plantas de Arabidopsis thaliana de três meses de idade foram cortados em pequenos pedaços, congelados em nitrogênio líquido e usados para extração de DNA através do método de extração por brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB). Aldrich e Cullis, 1993, PlantMol. Biol. Report, 11:128 - 141. Um conjunto de cDNA foi usado em experimentos RT-PCR em que o RNA isolado total foi usado como modelo, e a trans-criptase reversa Superscript II (Invitrogen) e o primeroligo (dT) foram usados para sintetizar a primeira fita de cDNA. cDNA de fita dupla foi obtido por reação de polimerase subsequente, utilizando-se primers específicos de gene, conforme descrito abaixo. (b) Projeto do primer Uma sequência de cDNA representativa de 4 mRNA da cinase associada à parede de Arabidopsis thaliana foi determinada e depositada no GenBank sob número de acesso NM101974. Baseado nessa sequência, oligômeros de DNA foram sintetizados como primers para PCR, incluindo ou a região em volta do primeiro códon ATG ou a envolta do códon terminal do ORF principal que codifica a cinase associada à parede 4.

Primers foram projetados para amplificar a totalidade da região codificação da ORF 4 da cinase associada à parede, ou seja, de ATG até o códon de terminação de tradução. As sequências dos primers são dadas abaixo: WAK_NDE comprimento: 23SEQ ID NO: 11 CATATGAAAGTGCAGCGTCTGTT WAK_NDE comprimento: 23SEQ ID NO: 12 TCTAGATCAGCGGCCTGCTTCAA

(c) Amplificação de PCR A amostra de cDNA obtida em (a) foi usada como modelo, e os primers projetados em (b) foram usados para PCR. As etapas de PCR envolveram 40 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 50°C e 2 minutos a 72°C, seguido por uma etapa extra de alongamento a 72°C por 7 minutos. Os produtos PCR foram isolados por eletroforese em gel em agarose a 1,0%, seguido por coloração com brometo de etídio do gel que sofreu eletroforese e detecção das bandas amplificadas em um transiluminador de UV. A banda amplificada detectada foi checada e cortada do gel de agarose com uma tesoura. Os pedaços do gel foram transferidos para microtubos de 1,5 mL, e os fragmentos de DNA foram isolados e purificados utilizando-se um kit de limpeza e purificação de banda em gel PCR GFX (Amersham). Os fragmentos de DNA recuperados foram subclonados para o vetor de clonagem pGEM-T (Promega), transformados em E. coli, e então usados para preparar plasmídeo de DNA da maneira habitual, que foi então sequenciado pelo método didesóxi (Messing, 1983, Methods in Enzymol. 101: 20-78), utilizando-se química BigDye (Applied Biosystems), para que rendesse a sequência de DNA revelada aqui por SEQ ID NO: 1, para uso em conformidade com a invenção.

Exemplo 2 Preparação de plantas Nicotiana tabacum transaênicas O gene da cinase associada à parede obtido no Exemplo 1 acima foi introduzido em uma planta hospedeira para produzir plantas Nicotiana tabacum transgênicas. (a) Preparação de construtos e transformação da Agrobacterium Construtos de expressão foram preparados por divagem do gene da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 acima, com enzimas de restrição adequadas para incluir toda o quadro de leitura aberta e inserir o gene no vetor de transformação da planta pALELLYX-WAK (Figura 1) junto com um promotor apropriado. Por exemplo, o gene da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 foi clonado para vetor de expressão supramen-cionado a jusante para um promotor de gene tubulina preferido de xilema (TUB) da Populus deltoides, como revelado no Pedido Internacional WO 2005/096805. o construto de expressão resultante foi amplificada em E. coli, e então transformada por congelamento em Agrobacterium tumefaciens da cepa LBA4404. (b) Transformação da Nicotiana tabacum mediada por Agrobacterium A transformação da Nicotiana sp. Foi realizada utilizando-se o método de discos foliares de Horsch et ai., 1985, Science 227:1229, utilizando-se um construto de ácido nucleico que compreende o gene da cinase associada à parede obtido em (a) em uma ligação operável com o promotor TUB de um gene preferido de xilema. Os transformadores foram selecionados em meio Murashige e Skoog (Sigma, St. Louis, MO) contendo 100 mili-gramas/litro de canamicina e 500 mg/L de carbenicilina (Sigma). Permitiu-se que os brotos de tabaco transformados se enraizassem no meio Murashige e Skoog, e foram subsequentemente transferidos para o solo e cultivados em uma estufa. (c) Verificação de PCR de uma inserção de gene estranho no qenoma da planta hospedeira PCR pode ser usada para verificar a integração do construto de gene no genoma de plantas transgênicas. A mistura de reação de PCR continha 100 ng do DNA genômico da planta transformada, e 0,2 μΜ de cada primer descrito acima, 100 μΜ de cada desoxirribonucleotídeo trifosfato, 5 μΙ_ de tampão para PCR e 2,5 unidades de polimerase de DNA Amplitaq (Applied Biosystems) em um volume total de 50 μΙ_. Os parâmetros cíclicos foram os seguintes: 94°C por 1 minuto, 50°C por 1 minuto e 72°C por 3 minutos, por 40 ciclos, com uma extensão de 5 minutos a 72°C. Os produtos de PCR sofreram eletroforese em um gel de agarose a 1 %. (d) Determinação do nível de expressão transqênico em plantas transqêni-cas RT-PCR semiquantitativa foi usada para detectar a acumulação de transcritos de cinase associada à parede no tecido do caule das plantas transgênicas. O RNA total foi isolado de cortes de caule de plantas Nicotiana TO e T1 transgênicas de 3 meses de idade utilizando-se o método CTAB descrito em Aldrich e Culli, 1993, PlantMol. Biol. Report. 11:128-141. cDNA foi sintetizado a partir de 500 ng do RNA total utilizando-se Superscript II Rnase H- RT (Invitrogen, USA). Os primers descritos acima foram usados junto com primers para a codificação constitutiva do gene da desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) como um controle interno para normalizar a quantidade de RNA total utilizado em cada amostra. PCR foi feita com uma diluição de 12,5x do cDNA de primeira fita sob as seguintes condições: 94°C por 3 minutos e 27 ciclos de 94°C por 1 minuto, 52 a 60°C por 45 segundos, e 72°C por 1 minuto e 30 segundos.

Exemplo 3 Aumento do comprimento das fibras de plantas transgênicas de tabaco que superexpressam o gene da cinase associada à parede em tecidos vasculares Regiões de caule correspondentes a 50% da altura de plantas transgênicas e de controle de 5 meses de idade foram maceradas em uma solução de ácido acético-peróxido a 70°C por 48 horas ou até que células unitárias fossem obtidas. As células foram coloridas com safranina e examinadas sob um microscópio (Leica DMIL) com uma câmera (Sony) ligada a um computador pessoal. As células (cerca de 100 por linha) foram medidas diretamente na tela, usando o software "Image Tool".

Três dos eventos transgênicos, conhecidos por expressarem o transgene de acordo com o procedimento detalhado no exemplo 2, mostraram um aumento estatisticamente significativo do comprimento das fibras (Figura 2). O evento transgênico 43B exibiu um aumento de 21% do comprimento das fibras se comparado às plantas de controle (P<0,05, teste t). O evento transgênico 47B exibiu um aumento de 19% do comprimento das fibras se comparado às plantas de controle (Figura 2; P<0,05, teste t). Ademais, o evento transgênico 43B exibiu um aumento de 15% do comprimento das fibras se comparado às plantas de controle (Figura 2 P<0,05, teste t). É importante mencionar que outra estratégia para aumentar o comprimento das fibras por superexpressão de um gene de pectina metil esterase (Berthold et ai, WO 2006/068603) logrou um aumento de somente 5% no comprimento das fibras de plantas transgênicas quando comparadas às plantas de controle.

Após o cultivo até a maturidade, deixou-se que os eventos TO gerassem linhas T1. Plantas que têm homozigoto dominante apresentam um aumento significativo de 10% no comprimento das fibras (P<0,05, teste t) quando comparadas à plantas que têm homozigoto recessivo. Esses resultados foram observados em duas linhas diferentes (Figura 3 e Figura 4). Exemplo 4 Aumento da altura da planta em plantas de tabaco transgênicas que super-expressam o gene da cinase relacionada à parede em tecidos vasculares A progênie T1 resultante da autofertilização das plantas transgênicas foi individualmente envasada após a semeadura. O crescimento foi medido periodicamente até que a primeira flor fosse formada (as plantas tinham cerca de 5 meses de idade) e foi registrado como a altura total.

Os resultados apresentados são um exemplo do aumento da altura das plantas observadas nas plantas de homozigoto dominante de diferentes linhas. A altura da planta de três genótipos do evento 51B foi comparada. Plantas que têm homozigoto dominante são 12% mais altas que plantas que têm homozigoto recessivo. Plantas que são hemizigotos são 9% mais altas que as plantas que têm homozigoto recessivo (P<0,05, teste t) (Figura 5).

Exemplo 5 Preparação de plantas Pooulus transgênicas O gene obtido no exemplo 1 acima foi introduzido em uma planta hospedeira para produzir plantas Populus transgênicas. (a) Preparação de construtos e transformação da Aqrobacteríum Construtos de expressão foram preparados por divagem do gene da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 acima, com enzimas de restrição adequadas para incluir toda o quadro de leitura aberta e inserir o gene no vetor de transformação da planta pALELLYX-WAK (Figura 1) junto com um promotor apropriado. Por exemplo, o gene da cinase associada à parede obtido no exemplo 1 foi clonado para vetor de expressão supramen-cionado a jusante para um promotor de gene tubulina preferido de xilema (TUB) da Populus deltoides, como revelado no Pedido Internacional WO 2005/096805. O construto de expressão resultante foi amplificado em e. coli, e então transformado por congelamento em Agrobacterium tumefaciens da cepa LBA4404. (b) Transformação da Populus mediada por Agrobacterium Faia tipo selvagem foi transformada com Agrobacterium tumefaciens carregando um construto que compreende um gene da cinase associada à parede de Arabidopsis thaliana obtido no exemplo 1 ligado operavel-mente a um promotor do gene preferido de xilema (TUB). Pecíolos e segmentos de caulse internodais de plantas micropropagadas in vitro foram u-sados como explantes. Brotos transformados foram selecionados em meio de regeneração contendo 1.000 mg/L de canamicina e permitiu-se que enraizassem no meio Murashige e Skoog. Plantas selecionadas foram subsequentemente transferidas para o solo e cultivadas em estufa.

REIVINDICAÇÕES

Claims (4)

1. Construção de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeo WAK4, tal como definida pela SEQ ID N0:1 ligada operavelmente a um promotor heterólogo preferido de xilema, que causa superexpressão da dita sequência de polinucleotídeos de WAK4.

2. Construção de ácido nucleico, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito promotor preferido de xilema é selecionado do grupo que consiste em um promotor do gene TUB, promotor do gene SuSy, promotor do gene COMT e promotor do gene C4H.

3. Método para aumentar o comprimento das fibras e/ou da altura de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir uma construção de ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeos de WAK4, tal como definida pela SEQ ID NO: 1 ligada operavelmente a um promotor heterólogo preferido de xilema, que causa uma superexpressão da dita sequência de polinucleotídeos de WAK4; (b) cultivar a dita planta sob condições que promovam o crescimento· de uma planta; e (c) selecionar uma planta transgênica que possua comprimento da fibra e/ou altura da planta aumentados comparado a uma planta não-transgênica da mesma espécie.

4. Método, de acordo com reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito promotor preferido de xilema é selecionado do grupo que consiste em um promotor do gene TUB, promotor do gene SuSy, promotor do gene COMT e promotor do gene C4H.