JPH0279983A - 植物のユビキチンプロモーター系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、植物の分子生物学の分野に属し１組換えＤＮ
Ａ技術による植物の遺伝子工学に関する。

植物のユビキチン遺伝子の上流の転写されない領域由来
のＤＮＡセグメントの同定と特徴とについて述べる。こ
のセグメントは、単子葉植物と双子葉植物の両者由来の
組換え体ＤＮＡを有する組織中の。

近くの発現可能な植物遺伝子の転写を開始させ駆動する
ことができる。ここに記載したＤＮＡセグメントは、植
物組織の所望の構造遺伝子を選択して発現し調節するこ
とができる。

（従来の技術） ユビキチンは、真核細胞中に見い出される８、５ｋＤａ
のタンパクであり、遊離のモノマー状態か。

または種々の細胞質タンパク、核タンパク、もしくは膜
タンパクと共有結合している。このタンパクは、７６個
のアミノ酸残基を有し、そのアミノ酸の配列は、異常に
高度に保護されている。ユビキチンの配列は、ヒト、ウ
シ、チチュウ力イミバエ。

アフリカッメガエルおよびニワトリのような多種類の種
の間で同一である〔ニー　ボンドおよびエム　シュレジ
ンガー（Ｕ、Ｂｏｎｄ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｓｃｈｌｅｓｉ
ｎｇｅｒ）。

Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ、　　Ｂｉｏｌ、　　５巻、　９４
９−９５６頁、　　１９８５年〕。

酵母とヒトのユビキチンは、３個の異なるアミノ酸だけ
が違っている〔ケイ、オズケイナツクら（Ｋ、０ｚｋａ
ｙｎａｋ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１２
巻、　６６３−６６６頁、　　１９８４年〕。

他方、植物のユビキチンは、酵母のユビキチンと２個の
アミノ酸が異なっている。配列内のこの２個または３個
のアミノ酸の相違によって、動物。

植物および酵母の少なくとも３種のユビキチンがあるこ
とは明らかである。

ユビキチンは、３つの主要な細胞の区画、つまり細胞質
膜、細胞質および核、で見出されている。

このタンパクは、細胞内タンパクのＡＴＰ依存性分解、
つまり、損傷したかまたは異常なタンパク。

および半減期が短かい正常なタンパクを細胞から除去す
る非リソシーム経路において、必要とされる〔エイ　ハ
ーシュコら（Ａ、　Ｈｅｒｓｈｋｏ　ｅｔ　ａｌ）　。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　
ｔｌｓＡ、　　８１巻、　　１６１９−１６２３頁、　
１９８４年；デイ　ファインレイら（Ｄ、　Ｆｉｎｌｅ
ｙｅｔ　ａｌ　）　、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｌ、　Ｓ
ｃｉ、　　１０巻、　３４３−３４７頁。

１９８５年〕。ユビキチンは、標的タンパクに結合し。

これに分解のための標識をつける。その共有結合は、ユ
ビキチンのカルボキシル末端（グリシン）と標的タンパ
ク中のリシル側鎖のε−アミノ基とのイソペプチド結合
による。

ユビキチンは、また、熱ショック、および金属（亜ヒ酸
塩）の濃度の増大のようなストレスに対する細胞の反応
で１つの役割をはだす〔デイ、ファインレイら（Ｄ、　
Ｆｉｎｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ）前出、　　１９８５年〕。

はとんどの生きている細胞は、ストレス（例えば。

正常な生理的温度より数度高い温度、または重金属、エ
タノール、オキシダントおよびアミノ酸類似体の高濃度
への暴露）に反応して、小さなセットの遺伝子を活性化
して１選択的に、ストレスタンパク（または熱ショック
タンパクともよばれる）を合成する。はとんどの生物に
おいて、このようなストレスタンパクは、　８９．７０
および２３ｋＤａの分子量のサブユニットを有すること
が見い出された（ニー　ボンドおよびエム　シュレジシ
ガー。前出、　１９８５年）。ユビキチンは、約８．５
ｋＤａの分子量を有し、これもまたストレスに反応する
。その理由は、異なる種（酵母、マウス、アレチネズミ
およびニワトリの胚線維芽細胞）では、ユビキチンｍＲ
ＮＡおよびユビキチンタンパクのレベルが、ストレス条
件が変化するために増大するからである。

真核系では、遺伝子の発現は、プロモーターと呼ばれる
ＤＮＡ配列の領域で誘導される。一般に。

プロモーターは、ＤＮＡの一部とみなされ、コドン領域
より上流にあり、　ＲＮＡポリメラーゼ■の結合部位を
有し、そして、　ＤＮＡの転写を開始する。プロモータ
ー領域はまた。遺伝子発現の調節遺伝子として働く他の
要素をも含有する。これらは、約−３０の近傍にＴＡＴ
Ａボックスの共通配列を有し、また転写開始部位、すな
わちキャップ部位に対して５°側の約−７５ｂｐの位置
にＣＡＡＴボックスの共通配列を持っている場合が多く
、これは＋１と定義される〔アール　ブリースナツバお
よびピー　チャンボン（Ｒ，Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ　ａ
ｎｄ　Ｐ、　Ｃｈａｍｂｏｎ）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　５０巻、　３４９−３８３頁、　
　１９８１年；ジエイメレディスおよびエイ　ホレンダ
−（Ｔ、Ｋｏｓｕｇｅ。

Ｃ１Ｐ、　Ｍｅｒｅｄｉｔｈ　ａｎｄ　Ａ、　Ｈｏ１ｌ
ａｅｎｄｅｒ）編、　２１１−２２７頁、　　１９８３
年〕。植物では、　ＣＡＡＴボックスは、　ＡＧＧＡボ
ックスで置換されることがある（ジェイ　メシングら、
　１９８３年、前出）。存在する他の調節要素は、照明
もしくは栄養入手可能性のような環境刺激、または熱シ
ョック、嫌気生活もしくは重金属の存在のような不利な
条件に応答して遺伝子の発現に影響する要素である。さ
らに１発育中もしくは組織特異的な様式で、遺伝子発現
を制御するＤＮＡ配列が存在する。見出されているその
他の調節要素は、エンハンサ−（動物系中）もしくは上
流の活性化配列（酵母中）であり、これら調節要素は、
近傍の遺伝子の全発現を、その近傍の遺伝子に対する位
置や方向とは無関係に、高める働きを有する。動物のエ
ンハンサ−コアの共通配列、５゛ＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡ
　（またはＴＴＴ　’）　Ｇ−３’と相同の配列は。

植物について発表されている。例えば、転写開始部位に
対して約−１８０の位置の豆しグミン遺伝子中に見出さ
れており〔ジー　ライセットら（Ｇ。

しｙｃｅｔｔ　　ｅｔ　　ａｌ　　）　　、　　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　１２巻。

４４９３−４５０６頁、　　１９８４年〕、そして、転
写開始部位からそれぞれ約−２００および一１７０ｂｐ
の位置のトウモロコシのＡｄｈｌおよびＡｄｈ２の遺伝
子にも見出されている。一般に、プロモーターは、対応
する遺伝子のコドン領域の開始点に対して５゛側すなわ
ち上流に見出され、このプロモーター領域はすべての補
助調節要素を有し、１０〜１０００またはそれ以上のヌ
クレオチドを有し得る。

遺伝子の発現を制御する調節要素の中で、熱ショック要
素は、おそらく最も広く研究されている要素である。熱
ショックに対して細胞が例外なく反応するということは
、はとんど１０年前から知られているが、ストレスを与
えられた細胞によって選択的に合成される熱ショックタ
ンパクの機能については、まだほとんど知られていない
。ストレスタンパク合成の誘発は、転写レベルで起こり
。

その反応は、細菌、真菌、昆虫および哺乳類については
類似していることが知られている〔イーフレイブ（Ｅ、
Ｃｒａｉｇ）　、　ＣＴＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、。

１８巻、　２３９−２８０頁、　１９８５年〕。ストレ
スに応答して、従来の熱ショックタンパクが合成され蓄
積されるのに加えて、ストレスが加えられた細胞はまた
。プロテアーゼ類とユビキチンとを合成する。

イー　コリ内では、　ＡＴＰ依存性タンパク加水分解活
性を有する９４ｋＤａの酵素が１発現が熱ショックレギ
ユロンの制御下にあるｔｏｎ　（ｃａｐＲ）遺伝子でコ
ードされている〔イー　オズケイナックら（Ｂ。

口ｚｋａｙｎａｋ　　ｅｔ　　ａｌ　　）　　、　　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　　３１２巻、　　６６３　〜６６６頁、
　１９８４年〕。ニワ）　ＩＪの胚線維芽細胞では、ユ
ビキチンｍＲＮＡのレベルは、熱ショック後もしくは５
０μＭの亜ヒ酸塩に暴露後には５倍に増大した〔ニー　
ボンドら（Ｌｌ、Ｂｏｎｄ　ｅｔ　ａｔ　）　、　Ｍｏ
１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　　５巻、　９４９〜９５６頁、　　１９８
５年〕。各ｍＲＮＡは。

縦方向に繰返した同一のポリペプチドを有し、このｍＲ
ＮＡは、ポリュビキチン分子として翻訳する際。

多重ユビキチン分子を生じ、遺伝子情報を増幅する特有
の機構を与える。ユビキチンｍＲＮＡの高レベルは熱シ
ョック後の回復時は持続せず、このことは、ストレスに
反応している間の遊離ユビキチンに対する過渡的な役割
を示している。

熱ショックタンパク遺伝子の活性化を引き起こす代謝ス
トレスは９通常の機構で作用するとみなされている〔ジ
エイ　アナサンら（Ｊ、Ａｎａｔｈａｎｅｔ　ａｌ）　
、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２巻、　５２２−５２４頁
、　　１９８６年〕。

熱ショック遺伝子を活性化する代謝ストレスは。

細胞内タンパクの変性を起こすが、異常タンパクが蓄積
して、熱ショック遺伝子を活性化するシグナルとして働
く。異常タンパクを分解すべき標的とするユビキチンの
役割と１種々のタンパク分解酵素の役割とは、熱ショッ
クタンパク遺伝子の調節のこのようなモデルと適合する
。

熱ショック遺伝子に関する初期の研究のほとんどは、シ
ョウジヨウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａ）種で行わ
れた。特に、ショウジヨウバエｈｓρ７０遺伝子は組換
えの研究に広く使用された。相同系において。

ショウジヨウバエｈｓｐ　７０遺伝子が、イー　コリβ
−ガラクトシダーゼ構造遺伝子と融合され、その雑種遺
伝子の活性が、受容体のショウジヨウバエ中の５つの常
在性ｈｓｐ　７０熱ショック遺伝子から区別された。シ
ョウジヨウバエの熱ショック遺伝子はまた。非相同系１
例えばサルｃｏｓ　ｍ胞およびマウス細胞にも導入され
た〔エイチ　ペルハム（ＨｌＰｅｌｈａｍ）　、　Ｃｅ
１ｌ、　３０巻、　５１７−５２８頁、　　１９８２年
〕。

熱ショックによる調節は、ショウジヨウバエ生殖系列に
組み込まれた雑種ｈｓｐ７０−１ａｃＺ遺伝子において
観察された。この遺伝子には、　ｈｓｐ７０構造遺伝子
の中央部に７ｋｂのイー　コリ　β−ガラクトシダーゼ
ＤＮＡ断片が挿入されている。その形質転換体で得られ
たガラクトシダーゼ活性は、熱ショックによって調節さ
れることがわかった〔ジエイリスら（Ｊ、　Ｌｉｓ　ａ
ｔ　ａｌ）　、　Ｃｅ１ｌ　３５巻、　４０３〜４１０
頁、　　１９８３年〕。

熱ショック反応を与えるＤＮＡ配列は、ショウジヨウバ
エｈｓｐ７０熱ショックプロモーターに欠失変異を作っ
て分析することによって５°−ＣＴＧＧＡＡＴ　ＴＴＣ
ＴＡＧＡ−３’　であると同定された〔エイチ　ペルハ
ムら、　）ｆｅａｔ　５ｈｏｃｋ　Ｆｒｏｍ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉａ　ｔｏ　Ｍａｎ、　　コールドスプリング　ハ
ーバ−ラボラトリ−、４３−４８頁。

１９８２年〕。このＤＮＡ配列は遺伝子の−６６、〜−
４７の領域、すなわちＴＡＴＡボックスの約２６塩基上
流に位置している。この要素の化学的に合成されたコピ
ーは、ヘルペスウィルス　チミジンキナーゼ遺伝子のＴ
ＡＴＡボックスの上流に１通常の上流のプロモーター要
素の代わりに配置すると、サルＣＯ８細胞とアフリカッ
メガエルの卵母細胞のチミジンキナーゼ遺伝子に、充分
に、熱誘発性を与えるということが証明された（チミジ
ンキナーゼ遺伝子は。

通常、熱誘発性ではない）これらの熱ショック配列は、
熱ショックタンパクを誘発させる熱ショック特異的転写
因子と相互作用する〔シー　パーカーら（Ｃ，Ｐａｒｋ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｃｅ１１．３７巻、２７３〜
２８３頁、　１９８４年〕。熱ショック遺伝子の誘発物
質は、細胞内の熱ショックタンパクの濃度を変化（減少
）させて、熱ショック遺伝子の転写と翻訳とを制御する
因子であり得る。

高等植物では、ストレス反応が、大豆、エントウ豆、キ
ビ、トウモロコシ、ヒマフリ。ワタ、および小麦内で熱
ショックに反応してタンパクの合成が増大することによ
って証明された〔ティーバーネットら（Ｔ、Ｂａｒｎｅ
ｔｔ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｄｅｗ、Ｇｅｎｅｔ。

１巻、　３３１−３４０頁、　１９８０年；ジエイ　キ
イら（Ｊ。

Ｋｅｙ　ｅｔ　ａｌ）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ、　７８巻。

３５２６〜３５３０頁、　１９８１年〕。植物の種によ
って見い出される熱ショック反応の主な相違は９次のと
おりである。（ａ）ストレスに反応して合成される全タ
ンパクの量；（ｂ）合成される各種タンパクの大きさの
分布、；（Ｃ）熱ショックタンパクを誘発する最適温度
；および（６）致死（切断点）温度［１ｅｔｈａｌ　（
ｂｒｅａｋｐａｉｎｔ）　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　）
である。高分子量のタンパクは９種が異なっても電気泳
動性が類似していることがわかっている。低分子量（１
５〜２７ｋＤａ）の熱ショックタンパクは９種によって
、電気泳動性の非相同性が高分子量のものよりも大きい
。植物においては、高分子量タンパクは、ショウジヨウ
バエ内で産生されるタンパクと似ている。しかし、植物
およびショウジヨウバエの低分子量熱ショックタンパク
の複雑性には著しい差がある。２２゜３４、３６および
２７ｋＤａの４つの熱ショックタンパクがショウジヨウ
バエ内で合成されるが、大豆は。

１５〜１８ｋＤａの範囲の分子量を有する２０種を越え
る熱ショックタンパクを産生ずる。大豆の低分子量タン
パクの遺伝子は、熱ショック条件下で、最も活発に発現
され、適切に調節される遺伝子である〔エフシＥｌ　”
／フルら　（Ｆ、５ｃｈｏｆｆｌ　ｅｔ　ａｌ）、　Ｊ
、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、　　１巻、　３０１〜３１４
頁、　　１９１１１２年〕。

キイら（Ｋｅｙ　ｅｔ　ａｌ）　（特願昭６０−７０１
２７号、　１９８５年４月１２日出願）は、植物の熱シ
ョック遺伝子のプロモーター領域を研究した。４つの大
豆熱ショック遺伝子（１５〜１８ｋＤａＯ熱ショックタ
ンパクをコードする３つの遺伝子および、　１７．３ｋ
Ｄａの熱ショックタンパクをコードする１つの遺伝子）
がクローン化され配列が決定された。４つの熱ショック
遺伝子のコード配列とそれに隣接する配列が決定された
。これらの４つの遺伝子のプロモーター領域が、サブク
ローン化され、　Ｔ−［］ＮＡシャトルベクターに連結
され、アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に
形質転換された。１５〜１８ｋＤａのタンパクをコード
する大豆熱ショック遺伝子の組換え体クローンの１つは
、４６２個のヌクレオチドの読取り枠と、　ＡＴＧ翻訳
開始コドンの上流の２９１個のヌクレオチドのプロモー
ター領域とを有していた。このプロモーターは、　ＴＡ
ＴＡボックス、　ＣＡＡＴボックス、転写開始部位、お
よび５°−ＣＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣＡ＆−３’の配列を有
するＡＴＧ翻訳開始コドンの上流に熱ショック共通配列
１３１〜１４４のヌクレオチドを備えている。４つのク
ローンの内３つだけがこのプロモーター領域内でかなり
の相同性を示したが、４つのクローン全部の熱ショック
共通配列は、著しく類似していた。４つの大豆熱ショッ
ク遺伝子の、コード配列。

上流のプロモーター領域および下流の隣接領域は。

ショウジヨウバエ熱ショック遺伝子の対応する領域とは
ほとんど類似していなかったことは重要である。ショウ
ジヨウバエおよび大豆の熱ショック遺伝子のプロモータ
ー領域の共通配列は類似しているが、大豆熱ショック遺
伝子のプロモーター領域は、ショウジヨウバエ遺伝子の
特徴である逆方向反復塩基配列をもっていない。

大豆熱ショック遺伝子のプロモーター領域は。

大豆遺伝子と外来遺伝子（大豆中には通常見られない遺
伝子）とを活性化するのに用いられ、ストレスによる反
応の調節が示された〔キイら、特願昭６０−７９１２７
号、　　１９８５年４月１２日出願〕。このプロモータ
ーが、転写開始点から下流に延びる６５ｋｂのＤＮＡ断
片として大豆５Ｂ１３熱ショック遺伝子から単離された
。これには翻訳されないリーダー配列の主要部分が含ま
れているが、翻訳の開始コドン・は含まれていない。β
−ガラクトシダーゼ遺伝子は。

Ａ、ツメファシェンス内に存在する安定形のＴｉプラス
ミドのＴ−［］ＮＡ中の熱ショックプロモーターの制御
下におかれており１次いで植物もしくは植物細胞培養物
に移入される。ＤＮＡ移入が起こったことは、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄガラクトシダ
ーゼ基質分子を含有する培地内で熱処理後に青色を呈す
るβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現によって確識され
た〔エム　ローズら（Ｍ、Ｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ　）　
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔ
ｌｓＡ７８巻、　２４６０−２４６４頁、　１９８１年
〕。

１つの植物の種の遺伝子が種々の種での発現について試
験される。交差発現の実験によって、特異的な機能の理
解の範囲が広くなった。これらの実験では、自らのプロ
モーターの制御下にある遺伝子か、または異なるプロモ
ーターもしくは非天然のプロモーターに人工的に融合さ
せた遺伝子を挿入することが示されている。１９８３年
にムライら（Ｍｕｒａｉ　ｅｔ　ａｌ　）は（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　　２２２巻、　　４７６〜４８２頁）、ヒマワ
リ　（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）の組織内でファセオラス
　ブルガリス　Ｌ、　（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　　ｖｕｌ
ｇａｒｉｓＬ、）由来のインゲン豆遺伝子を１次の２つ
の条件下で発現させた：’（ｉ）インゲン豆遺伝子がそ
れ自身のプロモーターの制御下にある場合；および（ｉ
ｉ）該遺伝子がスプライスされ、　Ｔ−ＤＮＡプロモー
ターの制御下にある場合。その後の実験で、その天然プ
ロモーターの制御下にあるインゲン豆の構造遺伝子をタ
バコ内で発現させることができ。

この非相同宿主（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｈｏｓｔ
）　（タバコ）内の組織特異的発現が本来の宿主（マメ
）内のそれと類似していることがわかった〔シー　セン
グプターゴパレンら（Ｃ４Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａ
ｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ）　。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　
ロＳＡ、　　８２巻、　　３３２０〜３３２４頁、　　
１９８５年〕。

その後の実験〔ジエイ　ジョーンズら（Ｊ、Ｊｏｎｅｓ
ｅｔら）　、　ＢＭＢＯＪ、　　４巻、　２４１１〜２
４１８頁、　　１９８５年〕で、オクトピン　シンテタ
ーゼ遺伝子（ＯＣＳ）が。

再生された形質転換相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）植物
（ペチュニア）と非相同（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）
植物（タバコ）内で発現することが発表された。この研
究で。

ＯＳＣ遺伝子がペチュニアのクロロフィルａ／ｂ結合タ
ンパクのプロモーターに融合された。交差発現が、ダブ
り二　カ°−リイら（戴Ｇｕｒｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ）　
。

Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、６巻、　５５９−５６
５頁、　１９８６年；およびキイら、特願昭６０−７９
１２７号（１９８５年４月１２日出Ｕ）に記載されてい
る。後者には、それ自身のプロモーターの制御下にある
大豆熱ショック遺伝子のヒマワリの腫瘍組織内での強い
転写が報告されている。この場合においては９機能活性
は。

正確な熱誘発反応として測定された。

双子葉植物宿主中の単子葉植物プロモーターから開始さ
れた転写の最初の情報は、マツグら（Ｍａｔｚｋｅｅｔ
　ａｌ）　、εＭＢＯＪ、　　３巻、　　１５２５−１
５３１頁、　　１９８４年。

により刊行された。これらの研究者らは、トウモロコシ
　ゼインＺ４遺伝子をクローン化し、Ｔｉ由来のベクタ
ーにこれを組み込み、そしてヒマワリの小茎に導入した
。得られたゼインｍＲＮＡは次いで小麦細胞系内で翻訳
することができたが、形質転換されたヒマワリのカルス
内では翻訳できなかった。

その後の研究で、主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク
をコードする小麦遺伝子ｗｈＡＢ　１．６が、　Ｔ−Ｄ
ＮＡ含有ベクターにクローン化され、ペチュニアおよび
タバコの両方に形質転換された〔ジー　ランパら（Ｇ、
Ｌａｍｐｐａ　ｅｔ　ａｌ）　Ｎａｔｕｒｅ、　３１６
巻、　７５０〜７５２頁、　１９８５年〕。上記の単子
葉植物と双子植物の宿主の両方で発現が起こり、光誘導
性および組織特異的であることが決定された。さらに最
近の研究〔ロチニスターら（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ　ｅｔ
　ａｌ）、　ＥＭＢＯＪ。

５巻、　４５１−４５８頁、　１９８６年〕では、遺伝
子移入ペチュニア内でトウモロコシの熱ショックｈｓｐ
　７０遺伝子が発現された。トウモロコシｈｓｐ　ＴＯ
ｍＲＮＡは、熱ストレスにのみ反応して合成された。上
記の３つの研究が、トランスジェニック双子葉植物中に
単子葉植物の遺伝子を発現させることに成功したことを
記載した報告のすべてである。しかし。

トウモロコシのアルコール、デヒドロゲナーゼ遺伝子は
、タバコの宿主内ではごくわずかかまたは全く発現しな
かったと述べた否定的な報告もあり〔レウエリンら（Ｌ
ｌｅｗｅｌｌｙｎ　ｅｔ　ａｌ）、　Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＦｏｒｍ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ、　　エルパン　ブロテン
ードティング、シイ　ニス　グルートおよびティー　ホ
ール（Ｌ、ｖａｎ　Ｖｌｏｔｅｎ−Ｄｏｔｉｎｇ。

Ｇ、Ｓ、Ｇｒｏｏｔ　ａｎｄ　Ｔ、Ｈａｌｌ）編、　Ｐ
ｌｅｎｕｍ　ＰｕｂｌｉｓｉｎｇＣｏｒｐ、　５９３〜
６０８頁、　　１９８５年；ジェイ　ジイーエリスら（
Ｊ、Ｇ、旧１ｉｓ　ｅｔ　ａｌ）、　ＢＭＢＤ　Ｊ、６
巻、　１１１６頁、　１９８７年〕、このことは単子葉
植物および双子葉植物のプロモーターの間には、固有の
種に特異的な差が存在する可能性を示唆している。

熱ショック反応は、その外の点では容認されない温度に
対して熱保護性もしくは耐熱性を与えるものと考えられ
ている〔エム　シュレジンガーらｔｏ　Ｍａｎ、　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、　　米国ニューヨーク州、コールド　スプリング
　ハーバ−、３２９頁、　１９８２年〕。容認しうる熱
ショック温度は、熱ショック反応を誘発するのに充分高
い温度であるが、死に至る程高い温度ではない。植物の
芽生えの耐熱性は１次のような各種の処理法で得ること
ができる。（ａ）　４０℃での連続的熱ショックに１〜
２時間さらした後、４５℃で保温する方法；（ｂ）４０
℃で３０分間熱ショックを与えた後、２８℃で２〜３時
間処理してから４５℃に移行する方法；（ｃ）４５℃で
１０分間熱ショックを与え１次に２８℃で約２時間処理
し、４５℃に移行する方法；および（６）芽生えを５０
μＭの亜ヒ酸塩で、２８℃にて３時間またはそれ以上処
理し、４５℃に移行する方法。枯死に至る可能性のある
温度で保温する前に、予備処理する間に、熱ショックタ
ンパクが合成され、蓄積される。さらに植物の芽生えが
上記のように予め処理されると、熱ショックｍＲＮ＾と
熱ショックタンパクの合成が４５℃で起こる。温度が生
理学的レベル（例えば、２８℃）に戻されると、正常な
転写と翻訳とが再開され、正常温度で３〜４時間経過す
ると熱ショックタンパクの検出可能な合成はもはや詔め
られない〔ジ°エイ　キイら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、　７８巻、　３２５６〜３５３０頁
、　１９８１年；エムシコレジンガーら、　Ｔｒｅｎｄ
ｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、　１巻。

２２２〜２２５頁、　　１９８２年〕。４０℃での熱シ
ョック処理中に合成された熱ショックタンパクは、非常
に安定ですぐには分解しない。

ユビキチンは、環境ストレス（熱ショックを含む）に応
答して調節されるが、ユビキチンの転写調節は、従来の
熱ショックタンパクの転写の調節とは異なっている。ユ
ビキチンと熱ショックタンパクのｍＲＮＡのレベルは細
胞のストレスに反応して増大する。しかし、従来の熱シ
ョックタンパクは。

熱ショックを与えている間は蓄積し９回復期には存続す
るが、熱ショックを与えている間に蓄積されたユビキチ
ンｍＲＮＡは、ストレス処理後、数時間以内に急速に分
解する。この不安定なｍＲＮＡの転写は、熱ショック中
におけるユビキチンの特別の過渡的な役割を示唆し、ユ
ビキチン遺伝子のプロモーター領域における唯一のＤＮ
Ａ配列に関連があり。

ストレスに対する細胞の反応中の特別な調節制御を規定
している。

（以下余白） 発明の構成 この発明の第１の目的は当業者が、植物組織中で構造遺
伝子を選択的に発現させることができる調節プロモータ
ー系からなる新規ＤＮＡセグメントおよび構築物とを提
供することにある。上記のプロモーターは、プロモータ
ーの制御下にある遺伝子の転写を開始し調節する。植物
ユビキチン遺伝子の５゛側の非転写領域由来のＤＮＡ配
列をもっている。その好ましい実施態様では、このプロ
モーターの配列は、トウモロコシのユビキチン遺伝子の
上流領域由来のものである。

植物中で活性であり下流遺伝子の発現を制御および調節
するプロモーターの単離と特徴付けについて５本発明で
開示する。このＤＮＡ配列は、トウモロコシのゲノム・
ライブラリィから分離されたユビキチン構造遺伝子の上
流に天然に存在する領域である。Ｓ１ヌクレアーゼマツ
ピングで決定された転写開始部位すなわちキャップ、！
Ａ位は塩基１と呼称され、転写開始部位の５゛側の約８
９９の塩基と５°側の１訳開始部位を除いたキャップ部
位の３゛側の約１０９３塩基内に包含された配列がユピ
キチンプロモーターを構成している。上記のほぼ２ｋｂ
のプロモーター領域には、　ＴＡＴＡボックス（−３０
）　　２つの重複する熱ショックコンセンサス要素（−
２０４と−２１４）　、転写開始部位に隣接する８３ヌ
クレオチドのリーダー配列、および塩基８４から塩基１
０９３までのびるイントロンか位置している。

この発明の他の目的は、植物の発現可能なプロモーター
と植物の発現可能な構造遺伝子とからなる１組替え体Ｄ
ＮＡ分子を提供することにある。ここで構造遺伝子は、
プロモーターの転写開始要素および転写活性化要素全体
の調節制御下にある。

特に、植物のユビキチンのプロモーターは、各種のＤＮ
Ａ配列１代表的なものとしては構造遺伝子と結合するこ
とができ、前記ＤＮＡ配列の転写と翻訳を調節し、高温
でストレスが与えられた際に発現を調節制御するＤＮＡ
構築物を提供する。

上記の組換え体ＤＮＡ分子は、植物組織に導入され、プ
ロモーター／構造遺伝子の組合せを発現する。この発明
の方法は、単子葉植物と双子葉植物の両者における構造
遺伝子の発現に一般に適用できると考えられる。

本発明のＤＮＡ配列は、植物ユビキチン調節システムを
含む２ｋｂ以下のＤＮＡ配列であって、該調節システム
は熱ショック要素およびイントロンを含む。

該記熱ショック要素は、好ましくは熱ショックコンセン
サス配列に対して少なくとも７５％の相同性を有する。

本発明のＤＮＡ構築物は、植物ユビキチン調節システム
を含む２ｋｂ以下のＤＮＡ配列と、植物発現性構造遺伝
子とを有するＤＮＡ構築物であって、該調節システムは
熱ショック要素およびイントロンを含み、そして、該構
造遺伝子は該植物ユビキチン調節システムの調節制御下
に置かれている。

本発明はさらに、植物細胞における構造遺伝子を構成的
に発現させるための、および選択されたストレス誘導に
よる該構造遺伝子の発現を増強するための方法を提供す
る。該方法は、（ａ）熱ショック要素およびイントロン
を含む植物ユビキチン調節システムと、該植物ユビキチ
ン調節システムの調節制御下にある植物発現性構造遺伝
子とを含むＤＮＡ構築物で該植物細胞を形質転換するこ
と、およびら）該形質転換した植物細胞にストレス状態
を選択的に与え、該構造遺伝子の発現増強を誘導するこ
と、を包含する。

（以下余白） （発明の構成） 以下の定義は１本発明の明細書と特許請求の範囲に用い
る用語の目的と範囲についてあいまいさを除くために行
うものである。

発現とは、構造遺伝子の転写および／または翻訳を意味
する。

プロモーターとは、転写の開始を指示する。構造遺伝子
の５゛末端に存在するヌクレオチド配列を意味する。プ
ロモーター配列は、下流の遺伝子を発現させるために必
要であるが、必ずしも充分ではない。一般に、真核系の
プロモーターは、転写開始（キャップ）部位の５°側に
約ｌＯ〜３０ｂｐのコンセンサス５°−ＴＡＴＡＡＴ−
３°　（ＴＡＴＡ）ボックスに相同の特徴的なりＮＡ配
列を有する。キャップ部位は便宜上＋１と番号を付しで
ある。キャップ部位に対して３°側の塩基には正の数字
を付け、一方キャップ部位に対して５“側の塩基には負
の数字を付け、その数字は、キャップ部位からの各塩基
の距離を表している。もう１つのプロモーター要素であ
るＣＡＡＴボックスは、　ＴＡＴＡボックスの５′側の
約３０〜７０ｂｐの位置に見出されることが多く、標準
形の５”−ＣＣＡＡＴ−３′　に対して相同である（Ｊ
、　Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）。

ｉｎ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｂｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏ
ｆ　Ｐｌａｎｔｓ、　Ｔ、　Ｋｏｓｕｇｅら（ｍ著）　
、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ９．２１１−２２
７　）。

植物中で、　ＣＡＡＴボックスは、　ＡＧＧＡボックス
として知られている配列で、かつトリプシン）Ｇ　　（
またはＴ）ＮＧに対称的に隣接するアデニン残基を有す
る領域で置換される場合がある（Ｒ１Ｂｒ６ａｔｈｎａ
ｃｈとＰ、Ｃｈａｍｂｏｎ　（１９８１）　Ａｎｎ、Ｒ
ｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５０：３４９−３８３）。

転写に対して調節効果を与える別の配列が、プロモータ
ー領域内に見出され、キャップ部位から、　１０００ｂ
ｐもしくはそれ以上延びて存在している。

調節制御とは、転写開始部位（の５゛側）の上流に、最
初に、ただし排他的ではなく１位置するＤＮＡ配列要素
によって誘発される遺伝子発現の変調を意味する。調節
によって、１！境の刺激に対して全てが無かの応答が生
じるか、または遺伝子発現のレベルが変化する。この発
明において、熱ショック調節要素は、急激な温度上昇に
反応して、下流の遺伝子の発現のレベルを一時的に促進
する作用をする。

プロモーターもしくは調節要素の調節制御下に構造遺伝
子を置くということは、遺伝子の発現がこれらの配列で
制御されるように構造遺伝子を位置させることを意味す
る。一般にプロモーターは。

プロモーターが制御する遺伝子に対し５°側（上流）に
位置することが知られている。したがって、異種のプロ
モーター／構造遺伝子の組合わせを構築する際には、プ
ロモーターは、該遺伝子の上流に位置するのが好ましく
、プロモーターの転写開始部位からの距離は、プロモー
ターが自然のセツティングで制御する遺伝子との距離と
ほぼ等しくする。当該技術分野で知られているように、
プロモーターの機能の損失がなければ、上記の距離はい
くらか変えてもよい。同様に、その制御下にある異種遺
伝子に対する調節要素の好ましい位置は。

調節要素が自然に調節する構造遺伝子に対するその自然
の位置を反映している。当該技術分野で知られているよ
うに、この距離もいくらか変えてもよい。

プロモーターの調節制御下での構造遺伝子の発現中のプ
ロモーターの機能は、転写段階では、　ＤＮＡ−ＲＮＡ
ハイブリダイゼーション検定法（“ノーザン”プロット
法）を用い、ｖＡ訳段階では１合成タンパクに対する特
定の機能検定法を用いて（例えば酵素活性によるかまた
は該タンパクの免疫検定法による）試験をすることがで
きる。

構造遺伝子は、タンパク、ポリペプチドまたはその一部
分をコードするＤＮＡセグメントからなる遺伝子の部分
であり、転写を開始させる５゛側の配列を除く。構造遺
伝子は１通常細胞内に見出される遺伝子か、またはそれ
が導入される細胞の位置に通常は見出されない遺伝子で
あり、後者の場合。

異種遺伝子と呼ばれる。異種遺伝子は、当該技術分野で
公知のあらゆる起源からその全体もしくは部分を得るこ
とができる。それらの起源には、細菌のゲノムもしくは
エビソーム、真核ＤＮＡ、核ＤＮＡ。

プラスミドＤＮＡ、　ｃＤＮＡ、　　ウィルスＤＮＡま
たは化学的に合成されたＤＮＡが包含される。構造遺伝
子は。

コーディング領域もしくは非翻訳領域に１つ以上の修飾
部分を持っていてもよい。この修飾部分は。

発現産物の生物学的活性もしくは化学的構造１発現速度
または発現制御のしかたに影響する。かような修飾部分
としては、限定はしないが、１つ以上のヌクレオチドの
変異部分、挿入部分、欠失部分および置換部分がある。

構造遺伝子は、途切れないコーディング配列を形成する
か、または、適当なスプライス接合で結合された１つ以
上のイントロンを有している。構造遺伝子は、複数の起
源由来のセグメントの複合体でもよく、また天然に生成
したものまたは合成のものでもよい。構造遺伝子は、融
合タンパクをコードしてもよい。植物組織に、プロモー
ター／構造遺伝子／ポリアデニル化シグナルの複合体を
有する組換え体ＤＮＡ分子を導入することには、構造遺
伝子とそのプロモーターが各々異なる植物種由来のもの
である構造物を構築することが包含されると考する。

植物ユビキチンの調節系とは、トウモロコシ・ユビキチ
ン遺伝子の１訳開始部位の５°側の約１ｋｂのヌクレオ
チド配列を意味し、転写の開始、転写の調節１発現レベ
ルの制御、ストレス遺伝子の誘発、およびストレスに応
答した発現の促進とを導く配列で構成されている。調節
系は、プロモーターと調節の両方の機能をもっており、
遺伝子発現の調節制御すなわち変調を行うＤＮＡ配列で
ある。

植物ユビキチンの調節系の調節制御下に構造遺伝子があ
るということは、遺伝子の調節された発現がユビキチン
の調節系からなる配列によって制御されるような位置に
構造遺伝子があることを意味する。

ポリアデニル化シグナルとは、　ｍＲＮＡ処理を行うこ
とができる核酸配列を意味し９通常、　ｍＲＮＡ前駆体
の３”末端にポリアデニル酸のからなる領域を付加して
いることで特徴付けられる。ポリアデニル化シグナルの
ＤＮＡセグメントは、それ自体、天然生成もしくは合成
の数種の起源に由来するセグメントの複合体であって、
ゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを起源と
する。ポリアデニル化シグナルは、標準形の５°−ＡＡ
ＴＡＡ−３°に対する相同性の存在によって通常認識さ
れるが、距離の変動９部分的な“読み過し”および多重
タンデム標準配列はまれなことではない（ＪｏＭｅｓｓ
ｉｎｇら、前記文献）。

標準の“ポリアデニル化シグナル”は、実際に。

転写の終結を起こすが、ポリアデニル化反応自体を起さ
ないということは認識されるべきである（Ｃ，Ｍｏｎｔ
ｅｌｌら（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　　３０５：６０
０−６０５）。

植物組織には、限定はないが、根、新芽２葉。

花粉１種子、腫瘍組織、ならびに培養中の各種形態の細
胞、原形質体、胚およびカルス組織のような単細胞を包
含する。植物の分化した組織と分化していない組織が含
まれる。植物組織は、イン・プランタ（ｉｎ　ｐｌａｎ
ｔａ　）または器官内の組織もしくは細胞培養物である
。

相同性は１本願で用いる場合、ヌクレオチドおよび／ま
たはアミノ酸配列が同一もしくはほぼ同一であることを
意味する。当該技術分野で理解されているように、ヌク
レオチドの不整合がコドン内の３番目の塩基すなわちゆ
らぎ塩基に起こることがあるが、最終的なポリペプチド
配列においてアミノ酸の置換を起こすことはない。また
、遺伝子配列のいくつかの領域における小さなヌクレオ
チドの修飾（例えば置換、挿入もしくは欠失）は。

このような修飾によるアミノ酸配列の変化が、最終生成
物の機能を変えない限り、許容することができ、かつ重
要でないと考えられる。遺伝子配列の全体もしくは一部
分の化学的に合成されたコピーが、遺伝子の機能を損な
うことなく、天然の遺伝子中の対応する領域と置換し得
ることが分かっている。特定のＤＮＡ配列の同族体は、
当該技術分野で周知の厳密の条件下での核酸のクロスハ
イブリダイゼーション試験法を用いて、当業者によって
同定することができる（ｔｌａｍｅｓと旧ｇｇｅｎｓ編
集（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒ
ｉｄｉｓａｔｉｏｎ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

英国、オックスフォードに記載されている）。相同性の
程度は、比較される配列間の同一性の百分率によって評
価されることが多い。したがって。

本開示では、小さな配列の変動が相同配列の中に存在し
得ることが分かる。

ここで使用されている「〜に由来する」とは起源から取
り出された。得られた。受けとられた。

複写された。複製された。伝来したことを意味している
（化学的に、および／または生物学的に）。

誘導物は元の起源の化学的または生物学的操作（置換、
添加、挿入、欠失、抽出、単離、変異、および複製を含
むがこれらに限定はされない）によって調製され得る。

ＤＮＡ配列に関する［化学的に合成された」とは成分ヌ
クレオチドがｉｎ　ｖｉｔｒｏで組み立てられたことを
意味している。手作業的ＤＮＡ化学合成は既に確立され
ている方法（Ｍ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８３）、　
Ｍｅｔｈ。

ｄｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ、　Ｗｅｉｓｓｍａｎ　（編著）　、　
Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　（Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ）第１章）で実施され、また自動化された化学合
成は種々の市販装置の一つを使用して行われ得る。

熱ショック要素とは突然の温度上昇というストレスに応
じて遺伝子発現を調節するＤＮＡ配列を指す。応答は下
流遺伝子の発現レベルの一過性であるが急な上昇として
表れる。熱ショック遺伝子についての最初の研究はショ
ウジヨウバエ属（Ｄｒｏ−ｓｏｐｈｉｌａ　）を使用し
て行われたが、植物を含む他の多くの種もストレスに対
し同様の応答を示す（Ｔ、Ｂａｒｎｅｔｔら　（１９８
０）　Ｄｅｖ、　　Ｇｅｎｅｔ、１　：　３３１−３４
０）。

熱ショック要素の必須第１成分はショウジヨウバエ属で
はコンセンサス配列５”−ＣＴＧＧＡＡＴ−ＴＴ［：Ｔ
ＡＧＡ−３’を有し、転写開始部位の上流の残基−６６
から一４７ｂｐまでの領域に位置していると記述されて
いる（ＨｏＰｅｌｈａｍとＭ、Ｂｉｅｎｚ　（１９８２
）前記文献）。このコンセンサス配列の化学合成された
オリゴヌクレオチドのコピーは熱ショック誘導性に関し
ては天然配列に取って代わることができる。他の系では
プロモーター領域内に多重の熱ショック要素がみとめら
れている。例えば、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒら（１９８６
）前記文献は、トウモロコシのｈｓｐ７０の遺伝子に２
個の熱ショック要素を確認している。

リーダー配列とは転写開始部位と翻訳開始部位の間に位
置する約１００個のヌクレオチドから成るＤＮＡ配列を
意味している。リーダー配列内にはリポソーム結合部位
を特定する領域が包含されている。

イントロンあるいは介在配列とは本件の場合は。

コード配列（エキソン）と−緒に転写されるが。

その後成熟ｍＲＮＡの形成に際して取り除かれるような
りＮＡ配列の領域を言う。イントロンは転写された配列
内のいたる所、つまり同じまたは異なる遺伝子のコード
配列間、遺伝子のコード配列内に存在してそのアミノ酸
配列を遮断し分断している。

またプロモーター領域内、（翻訳開始部位の５°側）に
も存在し得る。イントロンは一次転写の際に切除され、
同時に且つ正確にコード配列が連結され。

成熟ｍＲＮＡを形成する。イントロンとエキソンの連結
部がスプライス部位となる。イントロンの塩基配列はＧ
ｌｌで始まり、　ＡＧで終わる。同じスプライシング信
号は高等真核生物の多くに認められる。

本発明は植物細胞に於けるＤＮＡコードセグメントの発
現に有用な組み換えベクターの開発に関する。本発明で
は、ベクターは挿入されたＤＮＡコードセグメントの発
現を制御するのにトウモロコシのユビキチンプロモータ
ーを採用している。転写調節配列を既定宿主の染色体外
複製系と結合することができる。遺伝子挿入のための制
限部位をもつ他のＤＮＡ配列を加えて、該宿主に於て挿
入された遺伝子の転写と翻訳を調節するためのベクター
とすることができる。このベクターにはまた原核細胞宿
主で増殖を可能とならしめる原核細胞複製系０選択のた
めのマーカー、および他のＤＮＡ領域が含まれる。これ
により植物および哺乳類宿主を形質変換する以前に、特
徴付けられた細菌系で大量のベクターを増殖させること
ができる。プロモーターと遺伝子配列が互いに適切に位
置付けられているベクターを構築する原理は当業者によ
く知られている事柄である。ある条件では、所望の構造
遺伝子にプロモーター系を結合し、得られた構造ＤＮＡ
を直接宿主に導入するのが望ましい。この直接導入法に
は、これらに限定されるものではないが、原形質体形質
変換、エレクトロポレーシコン法、　ＤＮＡの核への直
接注入、およびカルシウム沈澱による同時形質転換が包
含される。

本発明は植物ユビキチンプロモーターの単離と特徴づけ
に関する最初の報告である。本発明に記載されているト
ウモロコシユビキチンプロモーターは、　ＲＮＡポリメ
ラーゼ認識および結合部位、転写開始配列（キャップ部
位）、誘発転写を引きおこす調節配列、および転写開始
部位と翻訳開始部位との間の翻訳されない介在配列（イ
ントロン）を包含する。二重の熱ショックコンセンサス
配列が転写開始部位の５゛側（−２１４と−２０４）に
位置する。

キャップ部位のすぐ隣りには８３ヌクレオチドのエキソ
ンが存在し、これに大きいイントロン（約１ｋｂ）が続
いている。

ユビキチンプロモーター並びにユビキチン構造遺伝子は
トウモロコシゲノムの２個の約２ｋｂＰｓｔ断片上に単
離することができる（図１）。断片全体はｍＲＮＡまた
はタンパクの発現を監視することによりプロモーター機
能を示すために用いられ得る。

ユビキチン翻訳開始コドンの下流に異種遺伝子を導入す
ることによって融合タンパクが発現する。

ユビキチンプロモーターと翻訳開始コドンとの間に異種
遺伝子（それ自身の開始コドンと停止コドンを有する）
を挿入すると、挿入された遺伝子に対応する自然のポリ
ペプチドが発現する。所望の構造遺伝子を挿入するには
遺伝子の末端に平滑末端のリンカ−を使用すると最も好
都合に実施できる。

代わりに、ユビキチン遺伝子断片を特に構造遺伝子の開
始直前の部位、または転写開始部位の前の部位で制限す
ることもできる。例えば１本発明ではプロモーター断片
を約２ｋｂＰｓｔｒ断片としてユビキチン遺伝子から誘
導した。プロモーター断片に翻訳開始コドンが欠けてい
ることを確実にするため、５゛側領域を有する断片を所
望の数のヌクレオチド対を除去する様に制御された条件
下で二本鎖エキソヌクレアーゼで選択的に消化した。好
ましくはユビキチン翻訳開始コドンを取り除き。

その結果挿入された遺伝子の翻訳はそれ自身の開始部位
から開始する。次にリンカ−またはホモポリマーテーリ
ングを使用して単離された（かつ。

短くなった）プロモーター断片をベクターに挿入し、ベ
クターの残余領域と適合する所望の制限部位を導入する
。一般には、プロモーター断片を特殊制限酵素で開裂し
、その結果化じた短いＤＮＡ断片についてプロモーター
機能をテストし、無傷プロモーターの機能と比較する。

さらに、　ＤＮＡコドンを加え、および／または現存の
配列に変更を加えて、プロモーター機能を保持する誘導
ＤＮＡ断片を調製する。

得られたＤＮＡ構築物は植物宿主に於ける目的の構造遺
伝子に対するクローニング用の媒体として役に立つもの
である。本発明では、トウモロコシユビキチンプロモー
ターまたはカリフラワーモザイクウィルスプロモーター
の制御下で、　ＣＡＴをコードしている構造遺伝子をオ
ート麦とタバコ細胞で発現させた。ユビキチンプロモー
ターを採用した場合、双子葉宿主より単子葉宿主に於け
る方が発現の度合が大きく、カリフラワーモザイクウィ
ルスプロモーターを使用した場合は単子葉より双子葉宿
主で発現の度合が大きくなった。発現レベルの差異は異
なるプロモーターが持つ固有の相違。

並びに単子葉類と双子葉類間の発現調節と過程に於ける
基本的な細胞の相違に由来している。現在までのところ
、単子葉類プロモーターが双子葉類の宿主細胞内でうま
く機能するか否かは定常的でなく不明確で、予測できな
い。

酵素、ホルモンなどの所望のタンパクの生成のために多
くの構造遺伝子が本願のＤＮＡクローニングベクターに
導入され得る。さらに、この型のＤＮＡ構成物は特殊な
遺伝子由来のＤＮＡの産生を増加させるために、並びに
ｃＤＮＡ産生に使用することができるｍＲＮへの産生を
増加させるために使用することができる。特殊ＤＮＡ配
列を有するこのようなベクターは広く応用されており、
非常に有用である；例えばこれらは細菌に於ける遺伝子
増幅、あるいはさらに付加的な細胞機能を発揮できる高
等細胞に於ける発現に使用することができる。医用およ
び農業用に有用なタンパクを商業生産するのに高等真核
生物の組み換え系を利用する利点は原核生物や下等真核
生物宿主に於ては複写することが難しい翻訳後の正確な
修飾が確保できることである。

本発明でトウモロコシユビキチンプロモーターが単子葉
類と双子葉類の例としてオート麦とタバコで機能を果た
すことが示され、そしてこのプロモーターが他の細胞で
も同様に機能を果たすと考えられる。このような系には
、これに限定されるものではないが１例として述べると
、ユビキチン遺伝子が単離でき、高度に維持されること
が判明している細胞１例えばトウモロコシに加えて他の
単子葉類、タバコ以外の双子葉類、酵母のような下等真
核生物および哺乳類細胞が包含される。トウモロコシユ
ビキチンプロモーターと共に使用するのに適した細胞系
のスクリーニングは、ここに記した方法に従って、実施
され得、過度の実験を必要としない。個々の系に於てＤ
ＮＡコードセグメントの発現に適したベクターの構築に
ついては既に詳細に論述されている。複数の宿主内で複
製可能なシャトルベクター、例えば酵母と哺乳類細胞の
両方、植物と動物細胞、および植物と細菌細胞に対する
シャトル発現ベクターについても論述されている。さら
に、植物プロモーターとしての機能に関してはトウモロ
コシュビキチン遺伝子と類似している。他の系由来のユ
ビキチン遺伝子がユビキチンプロモーター配列のための
起源として採用できることが理解されるだろう。

本発明はまた。トウモロコシユビキチンプロモーターの
熱ショックプロモーターとしての利用に関する。２個の
熱ショックコンセンサス配列はトウモロコシュビキチン
遺伝子の上流、　−２１４と−２０４の位置に存在する
。多くの真核生物では、熱ショックコンセンサス配列と
相同の天然に存在する配列および化学合成された配列が
遺伝子発現の誘導を調節することが判明している。ユビ
キチンプロモーターは熱ショック要素の配列と同一の配
列を含有しているが、このプロモーターは（１）転写開
始部位の３°側に非翻訳イントロンを有し、（２）ユビ
キチン発現を構成的並びに誘発的に調節する点で従来の
熱ショックプロモーターとは区別される。熱ショック要
素とプロモーター領域内に存在する大きなイントロン間
の機能的関係は現在までの技術段階では解明されていな
い。これらの特徴的な配列間のヌクレオチドの距離およ
び一方の要素の他方に対する方向と位置づけは本発明に
於ては派生した調節断片の基本的プロモーター機能が活
性に保たれている限りは、可変であると仮定する。

プロモーター領域内のイントロンの存在は未処理のｍＲ
ＮＡ転写物の相対的安定性に関連し９間接的に９合成さ
れたタンパクのレベルに関連する（Ｃａ１１ｉｓ　ｅｔ
　ａｌ、（１９８７）　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ　１　：１１８３−１２００）。構成的
に発現したユビキチンｍＲＮＡはニワトリ胎児の線維芽
細胞では安定レベルに保たれ、一方、ストレスに応答し
て形成されたユビキチンｍＲＮＡの半減期は約１．５〜
２時間であると報告されている。

酵母に於ては４個の明確なユビキチンコード遺伝子座が
報告されている。構成的に発現されたユビキチンはユビ
キチン遺伝子の３個のうちの１個以上のものによってコ
ードされている。３個のうちの２個はコード領域のすぐ
内側に約４００ｂｐのイントロンを含有している。４個
目のユビキチン遺伝子は非翻訳イントロンを欠いている
が多重の熱ショック要素から成っており、主としてスト
レスに応答してユビキチン発現を誘導する働きをする。

後者のユビキチン遺伝子は構成的に機能するのではなく
、むしろ熱ショックやストレス信号に応答して機能する
（Ｂ、　Ｄｚｋａｙｎａｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７
）　ＢＭＢＯＪ、　　６　：　１４２９−１４３９）。

トウモロコシではユビキチンは小さい多重遺伝子核によ
ってコードされる。本発明ではユビキチン遺伝子の１個
についてのヌクレオチド配列が記載されている。転写お
よび翻訳開始部位間の大きなイントロン（約１　ｋｂ）
並びにコンセンサス熱ショック配列に対応するヌクレオ
チド配列がトウモロコシユビキチンプロモーター領域内
にみとめられる。これら２つの特殊な領域は多分ユビキ
チン合成と、外部の影響に対応してユビキチンレベルを
調節するのにかかわっている。ユビキチンプロモーター
内に包含されているイントロンと熱ショック要素との間
の機能上の関係は解明されていない。本発明ではトウモ
ロコシユビキチンプロモーターが正常条件下および熱シ
ョック条件下の両方でｍＲＮＡの合成を調節すること、
および転写調節の変化が熱ショック後ユビキチン合成が
増大した理由となっていることについて報告する。

以下に本発明を例示するために、実施例を示すが、これ
らは本発明を限定するものではない。

（以下余白） （実施例） Ａ、植物の成長 トウモロコシの近文系Ｂ７３を、暗所にて２５℃で４〜
５日間、湿潤バーミキュライトにおいて成長させた。中
茎節から茎頂までの実生苗の部分を採取し、液体窒素中
で凍結させ、−８０℃で保存した。

Ｂ、　ＲＮＡの単離および分析 チオシアン酸グアニジン法を用いて凍結組織から全細胞
ＲＮＡを抽出した。ポリローセファデックス（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓ−ｂｕｒｇ、　ＭＯ）カラムを
通過させることにより、全細胞ＲＮＡからポリ　（Ａ）
　”　ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡあるいはポリ　（Ａ
）　”　ＲＮＡを、３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ホルムアルデ
ヒドを含む１．５％アガロースゲルで電気泳動した。２
５ｏ＋Ｍリン酸ナトリウム　（ｐＨ６，５）を用いた毛
細管プロッティングにより、　ＲＮＡをＧｅｎｅＳｃｒ
ｅｅｎ”　（口ｕＦｏｎｔ）に移した。

プロットは、５０％ホルムアミド、　　５ＸＳＳＣ，１
０Ｏμｇ変性サケＤＮＡ　、　４０ｍＭリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ６，８）。

０．５％ＢＳＡ　、Ｊ３よび１％ＳＯ８中でプレハイブ
リダイズさせた。プロットは、５０％ホルムアルデビド
。

５　ｘＳＳＣ，１００μｇ　／ｍｊ！変性サケＯす＾、
　４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）、および１
０％硫酸デキストラン中でハイブリダイズさせた。

Ｃ０ｃＤＮＡライブラリーの構成 二本鎖ｃＤＮＡをＭｕｒｒａｙら（１９８３）、　　Ｐ
ｌａｎｔ　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ。

２　ニア５−８４の方法の改良法によって、ポリ　（Ａ
）　”　ＲＮＡから合成した。二本鎖ｃＤＮＡのオリゴ
（ｄＣ）ティリングと、オリゴ（ｄＧ）テイルｐＢＲ３
２２によるオリゴ（ｄＣ）テイルｃＤＮＡのアニーリン
グとを、標準的技術を用いて実施した。了ニールしたＤ
ＮＡを、　Ｂ、ｃｏｌｉＨｅ　１０１に形質転換し、テ
トラサイクリン（１５μｇ／ｄ）を含むＬ寒天プレート
上のニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
、　）ＩＡＴＦ；０．４５　μｍ　）に直接プレートし
た。

Ｄ、ユビキチンｃＯＮＡの同定 分別ハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングして、潜在的に光調節されたｍＲＮ
Ａを表現する数多くのｃＤＮＡを得た。これらのｃＤＮ
Ａの一部を選択し、　ＲＮ＾プロット分析によってさら
にスクリーンして光調節を確認した。１つのＣ口ＮＡク
ローン、　Ｐ２Ｈ４，２ｂｌは、赤色光調節ｍＲＮＡを
表現しないが、大きさおよび生産量の異なる３つのポリ
　（Ａ）　”　ＲＮＡとハイブリダイズしたことから注
目された。ニックトランスレーションしたｐ６ｔ７．２
ｂｌは、２．１００ヌクレオチドおよび１．６００ヌク
レオチドのｍＲＮＡとは強くハイブリダイズしたが、８
００ヌクレオチドの転写物とはわずかじかハイブリダイ
ズしなかった。しかしながら、　ｐ６Ｔ７．２ｂｌのｃ
ＤＮＡ挿入物をｐＳＰ６４にサブクローン化して構築し
たプラスミドである線形ｐＣ＾２１０のＳＰ６ボリメラ
ーゼ転写により生成される一重鎖３２ｐ−標識ＲＮＡと
のノーザンプロットのハイブリダイゼーションは、３つ
の転写物全部を容易に検出した。

ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリ
ッドよりも熱に安定であることが知られているので、ノ
ーザンブロットハイプリダイゼーシコンにおいては、ニ
ックトランスレーションしたＤＮＡプローブではなく一
重鎖ＲＮＡプローブを使用した。

やはり、プロットがニックトランスレーションしたＤＮ
Ａあるいは一重鎖ＲＮＡプローブのいずれとハイブリダ
イズしたかにかかわらず、ノーザンプロット法で測定さ
れるように、　１，６００塩基の転写物は、　２．１０
０塩基の転写物の約３分の１しか認められなかった。最
も少ない転写物は、　ＲＮＡプローブとハイブリダイズ
したプロットにおける２、　１００塩基のｍＲＮＡの約
半分であった。

制限断片をＭ１３　ｍｐｌＢおよび／あるいはｍｐ１９
にサブクローン化し、ジデオキシヌクレオチド鎮終結法
によって配列決定した。クローンの配列分析は。

ＴＡＡ停止コドンで終結する８１８ｂｐの単一の長いオ
ープンリーディングフレームを明らかにした　Ｎａｔｉ
ｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎのライブラリーを、　Ｄ　ｆａｓｔ
　Ｐプログラムを用いて、推定アミノ酸配列と相同なタ
ンパク配列について検索した。トウモロコシｃＤＮＡク
ローンの推定アミノ酸配列と。

ウシおよびヒトのユビキチン配列との間には、９５％以
上の相同性が認められた。

Ｅ、ゲノムライブラリーの構築およびスクリーニング 高分子量のトウモロコシＤＮＡを、凍結トウモロコシ実
生苗から単離した。ＤＮＡを５ａｕ３Ａによって部分的
に消化させ、大きさによって分別し、　［ｈａ−ｒｏｎ
　３５　（Ｌｏｅｎｅｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ２６：
１７１−１７９）のＢａｍ８１部位にクローン化した。

約２　Ｘ　１０’ｐｆｕのライブラリーを、ユビキチン
ｃＤＮＡクローンをハイブリダイゼーションプローブと
して用いて、　　ｉｎ　　５ｉｔｕプラークハイブリダ
イゼーシヨンにより、ユビキチンｃＤＮＡクローンと相
同の配列を含む組換え体ファージについてスクリーニン
グした。ブロス溶解産物から組換え体ファージを精製し
、標準的技術を用いてファージＤＮＡを単離した。制限
エンドヌクレアーゼの消化は、製造業者の指示書に従っ
て実施した。

Ｆ、ゲノミックサザンプロット分析 単離した高分子量のトウモロコシＤＮＡを、　Ｅｃ。

旧、　Ｈｉｎｄ［Ｉｌ、およびＳａｃ　Ｉで消化し、０
．７％アガロースゲル上で分画し、これらのＤＮＡ断片
をＧｅｎｅ５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ”（ＤｕＰｏｎｔ）
に移した。フィルターを。

６　ｘＳＳＣ（１ｘｓｓｃ　　＝０．１５Ｍ　ＮａＣ！
、　　０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム）、５×デンハ
ート培地、１００μｇ／ｍ１の音波処理した変性サケＤ
ＮＡ　、　２０Ｍｇ／ｍｌポリアデニル酸、　１０ｍＭ
　ＥＤＴＡニナトリウム、および０．５％ＳＯ３中で、
６５℃にて６〜８時間ブレハイブリダイズさせた。フィ
ルターは、新鮮な緩衝液中で６５℃にて、３２ｐ−標識
プラスミドＤＮＡ　　（ｐ［”Ａ２１０）とハイブリダ
イズさせた。Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ＯＭＡＴＡＲフィルムお
よび口ｕＰｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ
Ｐｌｕｓ増感スクリーンを１枚使用して、−８０℃でオ
ートラジオグラフィーを行った。各消化物において、８
〜１０の制限断片が、ニックトランスレーションしたｐ
ＣＡ２１０プローブとハイブリダイズした。このことは
。

ユビキチンが小さな多重遺伝子群によってコードされる
ことを示唆している。ユビキチンが小さな多重遺伝子群
によってコードされるという証拠は。

ツメガエル、大麦、および酵母についても報告されてい
る。

各消化物中の２〜３の断片はプローブと強くハイブリダ
イズしたが、残りの断片は弱くハイブリダイズした。ハ
イブリダイゼーション強度の差は配列相同性の相違を反
映すると考えられ、そのためｃＤＮＡプローブはそれが
誘導された遺伝子と優先的にハイブリダイズする。

酵母およびツメガエル由来のユビキチン遺伝子の特徴付
けが行われており、それぞれ６個および少なくとも１２
個のユビキチンリピートを有している。ノーザンプロッ
トで検出された３つの転写物に相当するトウモロコシ遺
伝子は、　２．１ｋｂ、　１．６ｋｂ。

および０．８ｋｂのｍＲＮＡに、それぞれ７個、５個、
および１または２個のユビキチンリピートを有しうる。

本発明中で述べるトウモロコシ・ユビキチン遺伝子は７
個のリピートをコードする。従って。

サザンプロットで観察されたハイブリダイゼーション強
度の差は、制限断片が異なる数のユビキチンリピートを
含むことの結果である。

部位を含まなかった。しかしながら、トウモロコシのユ
ビキチン遺伝子は、ゲノム消化物において使用される制
限エンドヌクレアーゼによって切断されるイントロンを
含みつる。この結果、ユビキチンのエクソンが異なる断
片に存在することになり、サザンプロットで観察された
ハイブリダイゼーション強度の差が説明される。

Ｇ、ユビキチン配列の分析および転写開始部位の分析 ＤＮＡポリメラーゼ１　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）のクレノー断片を使用して、ジデオキシ
ヌクレオチド鎮終結法による配列決定を実施した。ｃＤ
ＮＡクローンｐ６Ｔ７．２ｂ、　１に相同なゲノミック
クローン７．２ｂｌ（第１図Ｂ参照）の１．８５ｋｂ　
　Ｐｓｔｌ断片と、　ＡＣ３８９Ｍ１３ＲＦと命名され
た直ぐ上流の２ｋｂＰｓｔｌ断片とを。

両方向でＭ１３ｍｐ１９にサブクローン化した。組換え
体ファージＲＦ　ＤＮＡをプラスミドＤＮＡに関して調
製した。これらのＰｓｔｌ断片の両方の鎖を配列決定す
るために、一方向進行性欠失クローンを調製した。エキ
ソヌクレアーゼ■とエキソヌクレアーゼ■とは、それぞ
れＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏｌａｂｓおよびＢｅ
ｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓより入手した。ｌ１ｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｗｉ
ｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
　Ｇｒｏｕｐより提供されたプログラムを用いてＤＮＡ
配列のコンピューター分析を実施１７た。

ユビキチン遺伝子の転写開始部位およびこの遺伝子の５
°非翻訳領域のイントロンとエキソンとの３°接合部を
、　Ｓｔヌクレアーゼマツピングによって決定した。Ｓ
１プローブに適した断片は以下のように調製した。ユビ
キチンＤＮＡをＢｑｌｌｌまたはＸｈｏ　ｌのいずれか
で消化した。次に、　　−”Ｆ　ＡＴＰ（６，０００Ｃ
ｉ／ｍｍｏ１．　Ｎｅｗ　Ｂｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ
ａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ。

ＭＡ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ　
［！ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いて、これらを
３２．で標識した。ＢｑｌＩＩおよびＸｈｏ　Ｉ切断部
位をキナーゼ処理した断片を、それぞれｐｓｔｌおよび
Ｂｃｏ　Ｒ１でさらに消化すると、　９４６　ｂＪ）の
Ｐｓｔｌ　−Ｂｑｌ　ＩＩｌ断片よび６４３ｂｐのＢｃ
ｏＲＩ−Ｘｈｏ　ｌ断片が生成した。５％ポリアクリル
アミドゲルを通して電気泳動することにより、これらの
断片を他の末端標識断片から分離した。９４６　ｂｐの
Ｐｓｔｆ　−Ｂｑｌ　ＩＩｌ断片よび６４３　ｂｐのＢ
ｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　ｌ断片を含む切片を、ゲルから切除
し、標＠　１）ＮＡをゲルから溶出した。末端標識ＤＮ
Ａ断片（１０〜２０ｆｍｏｌ）を、８０％の脱イオン化
ホルムアミドを含有するＪＦｌｆ液３０μｍ、０．４Ｍ
塩化すｌラム、　４０ｍＭ　ＰＩＰＢＳ（ｐＨ６，４）
、および１　ｍＭ　ＢＤＴＡ（ｐＨ８゜０）中で、２μ
ｇのポリ　（Ａ）　”　ＲＮＡとハイブリダイズさせた
。核酸溶液を８０℃にて約１６時間加熱した。２８０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、　５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４
，６＞、　４．５ｍＭ硫酸亜鉛、および２０μｇ／−の
一本鎖ＤＮＡを含む水冷Ｓ１消化緩衝液（３００μＩり
を添加し、　ＤＮＡを２５０単位／ｒｎｌの３１ヌクレ
アーゼ（Ｎｅｗ　Ｂｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）で
消化した。２゜５Ｍ酢酸アンモニウムおよび５０ｍＭ　
ＥＤＴＡを含むＳ１終結混合物７５μｌで反応を停止さ
せた。次に、　ＳＬヌクレアーゼ消化産物を６％ポリア
クリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で分離し、オートラジオ
グラフィーにより可視化した。ユビキチン配列中の８１
保護断片の終点は、　Ｓｌプローブとして使用した末端
標識断片にマクサム／ギルバート塩基修飾−切断反応を
実施して生成した梯子形配列と比較することによって決
定された。

トウモロコシのユビキチンー１遺伝子、　７．２ｂｌの
ＤＮＡ配列を第２図に示す。この配列は、翻訳開始部位
の上流にある８９９塩基、５°非非翻訳列およびイント
ロン配列の１９９２塩基、３°配列の２４９塩基に先行
する７個のユビキチンタンパクリピートをコードする１
９９９塩基とを有するｒＴＡＴＡＪボックスは、−３０
位に位置し、２個の重複する熱ショック要素は、　−２
１４位と一２４０位とに位置する。

トウモロコシに由来するユビキチンー１遺伝子。

７、２ｂｌのコーディングおよび３゛領域のＤＮＡ配列
を第３図に示す。トウモロコシ、ユビキチンの誘導され
たアミノ酸配列は上方に示され、７個のユビキチンリピ
ートのヌクレオチド配列はその下に並べられている。ゲ
ラミックＤＮＡ中の７個の完全なユビキチン単位の構成
の概要を第１図Ｃに示す。

すべてのユビキチンリピートの誘導されたアミノ酸配列
は同じである（第３図）。末端（７番目）のユビキチン
リピートは、　ＴＡＡ停止コドンの前に、付加的な７７
番目のアミノ酸であるグルタミンを含む。この付加的な
アミノ酸は成熟ユビキチンには見られず、明らかにプロ
セッシングの間に除去される。ヒト遺伝子における最終
リピートの７７番目のアミノ酸はバリンであり、２つの
ニワトリ遺伝子においてはチロシンおよびアスパラギン
である。酵母ならびに大麦も、それぞれ余分なアミノ酸
、アスパラギンおよびリジンを持っている；しかしなが
ら、ツメガエル遺伝子では余分なアミノ酸は見られなか
った。この余分なアミノ酸は。

未処理のポリュビキチンの標的タンパクへの接合に対す
るブロックとして機能すると言われている。

ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＴ）は、停止コド
ンから１１３　ｂｐの３”非翻訳配列に存在する。

７個のリピートはすべて同じアミノ酸配列をコードする
が、これらのリピートのヌクレオチド配列は３９個もの
ヌクレオチドが変化している。これは、ユビキチン遺伝
子間のヌクレオチド配列の相同性について報告されてい
るのと同様である。ユビキチンリピート間におけるヌク
レオチド不整合の約８０％は、コドンの第３　（ゆらぎ
）塩基におけるものである。残りのヌクレオチドミス不
整合は。

ロイシン（５コドン）、セリン（３コドン）および、ア
ルギニン（３コドン）に対する代替コドンの使用によっ
て説明される。

トウモロコシ、ユビキチンのアミノ酸配列は。

他の２つのより高等な植物である燕麦および大麦に関し
て決定されたものと同じである。この配列は、酵母に関
して報告された配列とは２個のアミノ酸が異なっている
；２８位および５７位のセリンがアラニンに置換されて
いる。また、トウモロコシの配列は、すべての動物由来
のユビキチンについて報告されている配列ともわずかに
異なる；１９位のプロリンがセリンに、２４位のグルタ
ミン酸がアスパラギン酸に、５７位のセリンがアラニン
に置換されている。従って、配列に基づけば、３種類の
ユビキチンが存在すると思われる：植物、動物。

および酵母。

Ａ、プロモーターの単離およびｐＨＢ−ＣＡＴの構築ユ
ビキチン遺伝子上流領域−クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子融合物の構築に
使用した手順の概略を第４図に示す。

ＣＡＴ遺伝子と、ツバリンシンターゼ（ＮＯ３）の３″
非翻訳領域と、　ｐＮ［］５−ＣＡＴのポリアデニル化
シグナル（Ｆｒｏｍｍら（１９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、８２にサブクローン化した
。この構築物をｆｌｕｅ−ＣＡＴと命名した。

トウモロコシ・ユビキチン遺伝子？、２ｂｌ　（７）ユ
ビキチンポリタンパクコード領域の直ぐ上流にある約２
．Ｏｋｂ　Ｐｓｔｌ切断を、　Ｍ１３ｍｐ１９にサブク
ローン化した。このＤＮＡセグメントは、第２図に示し
たトウモロコシ・ユビキチン配列のヌクレオチド−８９
９〜１０９２に及ぶ。この組換え体ＤＮＡはＡＣ３ｔＩ
９Ｍ１３ＲＦと命名され、ユビキチンプロモーターと、
５′非翻訳リ一ダー配列と、第４図で０８１−５’と名
付けられた約１ｋｂのイントロンとを含む。

ユビキチンプロモーター−ＣＡＴ　リポータ−遺伝子融
合物を、　Ｔ、　ＤＮＡポリメラーゼでＡＣ３８９Ｍ１
３ＲＦの２．０　ｋｂ　　Ｐｓｔ　Ｉ断片を平滑末端化
し、この断片をＳｍａ　Ｉ消化のｐＵｃ１８−ＣＡＴに
クローン化することによって構築した。この構築物をｐ
ＵＢ−ＣＡＴと命名した。

Ｂ、燕麦およびタバコのプロトプラストへの組換え体Ｄ
ＮＡの導入 ５〜６日齢の黄化した燕麦実生苗の葉（２ｇ）をカミソ
リの刃で細かく切り刻んだ。この組織を消化培地（３ｍ
Ｍ　ＭＢＳ、　ｐＨ５，７，１０ｍＭ塩化カルシウム、
０．５Ｍマンニトール、および２ｍｇ／ｍｊ！アルギニ
ン）で数回洗浄し１次いで２％セルラーゼを含む２０ｍ
ｊ！の消化培地とともに室温で４時間インキュベートし
た。この組織を時々攪拌してプロトプラストを放出させ
た。この材料を６３μｍのメツシュで濾過し、５０Ｘｇ
で５分間遠心分離した。上澄み液を取り除き、プロトプ
ラストを消化培地で２回洗浄し１次いでエレクトロポレ
ーション緩衝液中に懸濁して、各エレクトロポレーショ
ンにつき０．５−のプロトプラスト懸濁液を調製した。

エレクトロポレーション緩衝液は次のものから構成され
ていた：　１０ｍＭ　）ＩＢＰＢｓ、　ｐＨ７，２，１
５０ｍＭ塩化ナトリウム。

４ｍＭ塩化カルシウム、および０．５Ｍマンニトール。

エレクトロポレーション緩衝液中のプロトプラスト（０
，５ｍｆ）を氷上で、４０ＭｇのプラスミドＤＮＡと、
　１００μｇの音波処理したサケＤＮＡとを含む０．５
−のエレクトロポレーション緩衝液と混合した。

これらのプロトプラストを、　３５０　Ｖ、　７０ｍ５
ｅｃパルスにより、氷上でエレクトロポレーションした
。

これらのプロトプラストを氷上でさらにｌＯ分間インキ
ュベー）１．．１０ｍＡ’のムラシゲ−スクーグ（ＭＳ
　）培地中に希釈して、室温で２４時間インキュベート
した。

プロトプラストを５０Ｘｇで５分間遠心分離してペレッ
ト化した。上澄み液を取り除き、これらのプロトプラス
トをＭＳ培地で１回洗浄した。このプロトプラストペレ
ットを２００μｌの緩衝液Ａ　（０，２５Ｍ　Ｔｒｉｓ
、　　ｐＨ７，８，１ｍＭ　ＢＤＴＡ、　　１　ｍＭ　
　β−メルカプトエタノール）中に懸濁し、微小遠心分
離管に移した。最低出力で５〜ＩＯ秒間音波処理してプ
ロトプラストを粉砕した。プロトプラストの破片を４℃
で５分間遠心分離してペレット化した。上澄み液を取り
除き、１０分間６５℃に加熱し、−２０℃で保存した。

Ｃ１形質転換したプロトプラストのＣＡＴ活性の測定エ
レクトロポレーションしたプロトプラスト抽出物（組換
え体ＤＮＡで形質転換した細胞の抽出物）のアリフォラ
）　（１００μＩりを、８０μｌの緩衝液Ａと、　２０
μｍ　１４Ｃ−クロラムフェニコール（４０〜６０ｍＣ
ｉ／ｍＭ）　、　　２　ｍｇアセチルＣｏＡ、および２
３０μｆ緩衝液Ａの混合物２０μｌとに添加した。この
反応物を３７℃で９０分間インキュベートした。反応生
産物を６００μｌの酢酸エチルで抽出し、この酢酸エチ
ルを蒸発させ、１０μｌの酢酸エチルに再懸濁すること
により濃縮した。クロロホルム：メタノール（９５：５
．　ｖ／ｖ）溶媒を使用して薄層クロマトグラフィーに
より反応生産物を分離し、オートラジオグラフィーによ
って検出した。

プロモーター−遺伝子融合構築物内に含まれる構造遺伝
子により発現される酵素活性の量を測定することにより
、宿主細胞の形質転換を測定した。

本実施例では、　ＤＮＡ構築物において、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする構造
遺伝子を使用した。組換え体ＤＮＡ融合構築物において
使用したプロモーターの効力を試験するために、トウモ
ロコシ・ユビキチンプロモーター−ＣＡＴ遺伝子融合物
ｐＬＩｃ−ＣＡＴと、　Ｖ、Ｗａｌｂｏｔ。

５ｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより人手した
カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター−Ｃ
ＡＴ遺伝子融合物ｐＣａＭＶ−ＣＡＴ　（Ｆｒｏｍｍら
（１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２：５８２４−５８２８）とのいずれ
かを使用して。

平行エレクトロポレーションを実施した。第５図に示す
ように、燕麦のプロトプラストにおいては。

発現される酵素活性の量から判定すると、ユビキチンプ
ロモーターはＣａＭＶプロモーターよりも「強力」であ
る。

実施例３：熱ショック反応 Ａ、熱ショック処理 熱ショックを与えるために、４〜５日齢の黄化した実生
苗を４２℃のインキュベーターに移し、１゜３、および
８時間後に採取した。全ＲＮＡ（７μｇ）を単離し、変
性し、１．５％アガロース３％ホルムアルデヒドゲルに
通して電気泳動した。このＲＮＡをＧｅｎｅ　５ｃｒｅ
ｅｎに移し、　ＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼを用いて線
状ｐｃＡ２１０から転写された一本鎖ＲＮＡをプローブ
として調べた。（組換え体プラスミドｐｃＡ２１０は、
　ＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼがユビキチンｍＲＮＡと
のハイブリダイゼーションに特異的なＲＮＡプローブを
合成するように、　ｐ６Ｒ７，２ｂｌの９７５１）ｐ挿
入物をｐＳＰ６４　（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローン
化することによって構築した。）オートラジオグラフィ
ーを実施した後、バンドを切断し、フィルターに結合し
た放射能の量を液体シンチレーションによって測定した
。ノーザンプロットの分析から、３つのユビキチン転写
物のレベルを決定した。

４２℃に移してから１時間後に、２．１ｋｂ転写物のレ
ベルは、２．５〜３倍に上昇した。１．６ｋｂ転写物に
ついては約２倍の上昇が見られたが、０．８ｋｂ転写物
では上昇が見られなかった。実生苗を高温に移してから
３時間後までに、大きい方の２つのユビキチン転写物の
レベルは、ショックを与えていない組織で見い出された
レベルに戻っており、少なくともさらに５時間は、その
レベルのままであった。トウモロコシでの熱ショック反
応に右けるユビキチンの一過性の性質は、ユビキチンが
熱ショックにおいて特殊な役割を持ち、短期間だけのユ
ビキチンレベルの上昇が必要であることを示している。

Ｂ、熱ショック配列 トウモロコシのユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列を
第２図に示す。プロモーター領域内では。

ヌクレオチド配列は、異種プロモーターの上流に位置す
る場合にストレス誘発性を与えることが示されている（
Ｐｅｌｈａｍ　（１９８２）前出）コンセンサス熱ショ
ック配列と相同である。ショウジヨウバエの熱ショック
要素に対するコンセンサス配列は。

５’−ＣＴＧＧＡＡＴ　　ＴＴＣＴＡＧＡ−３’であり
、一般に転写開始部位より約２６塩基上流に見い出され
る。

トウモロコシ・ユビキチンプロモーターの転写開始部位
に対して５°側の９００塩基内に位置するのは、２つの
重複する熱ショック配列であるニー２１４位のヌクレオ
チドに始まる５’−ＣＴＧＧＡ　ＣＣＣＣＴＣＴＣＧＡ
−３’　、および 一２４０位のヌクレオチドに始まる５’−ＣＴＣＧＡ　
ＧＡＧＴＴＣＣＧＣＴ−３’。

ニワトリの胚線維芽細胞由来のユビキチンプロモーター
も、２つの重複する熱ショックコンセンサスプロモータ
ー配列を含むことが見い出された：３６９位のヌクレオ
チドに始まる５°−ＣＴ［ｌ’ＧＡ　ＡＴＣＴＴＣＣＡ
Ｇ−３’　、および 一３５９位のヌクレオチドに始まる５”−ＣＣＡＧＡ　
ＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴ−３’。

酵母のユビキチン遺伝子ＬＩＢ１４（Ｂ、０ｚｋａｙｎ
ａｋら（１９８７）前出）の５°隣接領域は、１訳開始
部位から３６５塩基上流にある１８ｋｂの回転対称（回
文対構造）配列、　５”−ＴＴＣＴＡＧＡＡＣＧＴＴＣ
ＴＡＧＡＡ−３’　を有する。

この１８ｂｐ配列の中央の１４塩基（下線部）は、推定
される転写開始部位の約２８４ヌクレオチド上流から始
まる回転対称コンセンサス「熱ショックボックス」ヌク
レオチド配列に対する厳密な相同性を有する。

転写開始コドンに関する熱ショック配列の相対的な位置
、および熱ショックや他のストレスに対する誘発反応の
程度への最終的な影響は、大部分が不明のままであるが
、熱ショック要素が転写開始部位から５°側へ遠く位置
すればするほど、ストレスに対する反応の誘発レベルは
より小さいことが示唆されている。（Ｕ、　Ｂｏｎｄら
（１９８６）前出）。

本発明においては、熱ショック配列がユビキチンプロモ
ーター内の異なる位置に任意に配置されうろこと、およ
び改変されたプロモーター配列がストレス条件下および
非ストレス条件下での転写の開始、方向づけ、および調
節を含むユビキチンプロモーター機能を保持する限り、
配列を化学的に変化させるか、あるいは合成相同配列で
置き換えうることを仮定する。ヌクレオチドを挿入およ
び／あるいは欠失し、得られたＯＮ＾断片を操作するの
に必要な生化学的技術は、遺伝子再設計に関する当業者
には周知である。

トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターは。

転写開始部位より約２００　ｂｐ上流の２つの重複する
熱ショック配列の存在と、転写開始部位および翻訳開始
コドンの間の大型（約１　ｋｂ）イントロンの存在とに
より構造的に特徴付けられる。このプロモーター構造は
、ニワトリ胚線維芽細胞由来のユビキチンプロモーター
について報告されているもの（Ｕ、　Ｂｏｎｄら（１９
８６）前出）と非常に類似している。ニワトリ胚線維芽
細胞では、２つの重複する熱ショック配列が転写開始部
位の約３５０　ｂｐ上流に位置し、　６７４　ｂｐのイ
ントロンが転写開始コドンと翻訳開始コドンとの間に含
まれている。最近（Ｅ。

０ｚｋａｙｎａｋら（１９８７）前出）、酵母ユビキチ
ン０８１４遺伝子由来のプロモーター領域のヌクレオチ
ド配列が決定され、転写開始部位の約２８０ｂρ上流に
熱ショック配列を含むことが明らかになったが。

この酵母ユビキチンプロモーターは、転写開始部位と翻
訳開始部位との間に大型イントロンを有さなかった。し
かしながら、イントロンを含む他の２つの酵母ユビキチ
ン遺伝子は、　Ｐｅｌｈａｍの「熱ショックボックス」
配列と相同な配列を欠いていることが見い出された。

ユビキチンプロモーターは、酵母、ニワトリ胚線維芽細
胞、およびトウモロコシにおいて、熱ショックに応答し
てユビキチンの発現を上昇調節することが示されている
。３つの系全部において。

ユビキチンｍＲＮＡのレベルは、熱ショック処理後に上
昇し、トウモロコシおよびニヮ）　ＩＪ胚線維芽細胞で
はユビキチンレベルの上昇は約３倍と測定された。この
熱ショック応答したユビキチン発現の増強は、他の熱シ
ョック遺伝子で得られるものよりも有意に低い。ニワ）
　ＩＪ胚線維芽細胞では、４５℃に曝露した細胞中のユ
ビキチンｍＲＮＡのレベルは。

２．５時間にわたって２．５倍に上昇するが、　Ｈ３Ｐ
７０ｍＲＮＡのレベルは同じ熱ショック条件下で１０倍
に上昇することが見い出された。さらに、３時間の熱シ
ョックから細胞が回復する間（半減期：約１．５〜２時
間）におけるユビキチンｍＲＮＡの相対的な不安定性は
、安定であると見い出されたＨ３Ｐ７０　ｍＲＮＡの不
安定性とは有意に異なることが判明した。

ユビキチンプロモーターとは対照的に、　Ｈ３Ｐ７０遺
伝子が転写開始コドンと翻訳開始コドンとの間に大型イ
ントロンを含まないのは興味深いことである。ユビキチ
ンプロモーターと他の熱ショックプロモーターとの間の
もう１つの相違点は、ユビキチンが構成的かつ誘導的に
発現されるのに対して、従来の熱ショックタンパクの発
現は、主として熱ショックあるいは他のストレスに応答
して起こることである。本発明によれば、当業者は、ユ
ビキチンの構成的および／あるいは誘導的発現を変化さ
せるために、イントロン配列および熱ショック配列の両
方の組成配列ならびに位置を改変することができる。ま
た、得られた改変ＤＮＡのプロモーター機能を保持また
は向上させるように、トウモロコシのユビキチンプロモ
ーター領域内のヌクレオチド配列を再配置したり、化学
的に変化させたりするためには、標準的な組換え技術が
使用できる。ユビキチンプロモーター機能に関する試験
は、実施例２で述べたように実施できる。

（以下余白） （発明の要約） トウモロコシのユビキチン遺伝子の上流非翻訳領域由来
のＤＮＡセグメントが開示されている。このユビキチン
プロモーター領域は、熱ショックコンセンサス要素を含
み、該プロモーターの制御下に置かれている遺伝子の転
写の開始および調節を行なう。また、高温のストレスを
受けた場合に。

構造遺伝子の発現の調節および発現の調節制御を行なう
ために、ユビキチンプロモーターが植物発現可能な構造
遺伝子と結合されているような組換えＤＮＡ分子につい
て述べられている。このような組換えＤＮＡ分子が植物
組織中に導入され、プロモーター／構造遺伝子の組合せ
が発現される。

【図面の簡単な説明】

第１図ＬＪ、　　）ウモロコシュビキチンのゲノムクロ
ーンの分析図である。すなわち（Ａ）はユビキチン遺伝
子７．２ｂｌの制限地図；　（Ｂ）はユビキチン遺伝子
１０２つのサブクローン化されたＰｓｔｌ断片の制限地
図；　（Ｃ）はトウモロコシのユビキチン遺伝子１の構
成の概略図である。５°　側の非翻訳エキソンは白４角
で、縦列のユビキチンをコードする領域は１番号を付け
た４角でそれぞれ示しである。 第２図はユビキチン遺伝子１のＤＮＡ配列と推定のアミ
ノ酸配列を示す。Ｓ１ヌクレアーゼマツピングで決定さ
れた転写開始点は、塩基ｌと表示されている。推定の°
“ＴＡＴ＾”ボックス（−３０）を示す配列と、２つの
重複する熱ショックコンセンサス配列（−２１４と−２
０４）には下線を付けである。イントロンは塩基８４か
ら塩基１０９３へと延び、ボリュピキチンタンパクをコ
ードする配列は、塩基１０９４から塩基２６９３へと延
びている。 第３図はユビキチンをコードする７つの反復部分全部が
、同じアミノ酸配列をコードすることを示す。上記の７
つの反復部分のヌクレオチド配列を、誘導されたアミノ
酸配列の下に並べて示しである。追加の７７番のアミノ
酸、グルタミンが、終止コドンの前の７番目の反復部分
内に存在している。ポリアデニル化シグナル、＾ＡＴＡ
ＡＴは、終止コドンから１１３ｂｐの位置の３”側非翻
訳領域内に存在している。 第４図は、トウモロコシュビキチンのプロモーター領域
とクロラムフェニコールアセチントランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）遺伝子との融合体を構築するのに用いられた手
順の概略図である。 第５図は、ユビキチンプロモーターの検定法を示す。Ｃ
ａＭＶ−ＣＡＴは、カリフラワーモザイクウィルス３５
ＳプロモーターとＣＡＴ遺伝子の融合体；　ＩＩＢＱ−
ＣＡＴは、トウモロコシユビキチンプロモーターとＣＡ
Ｔ遺伝子の融合体を示す。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物ユビキチン調節システムを含む２ｋｂ以下のＤ
   ＮＡ配列であって、 該調節システムが熱ショック要素およびイントロンを含
   む、 ＤＮＡ配列。 ２、前記熱ショック要素が、熱ショックコンセンサス配
   列に対して少なくとも７５％の相同性を有する、請求項
   １に記載のＤＮＡ配列。 ３、前記熱ショック要素が、転写開始部位の５’側にあ
   る約２１４個以下のヌクレオチドである、請求項１に記
   載のＤＮＡ配列。 ４、前記調節システムが２つの熱ショック要素を含む、
   請求項３に記載のＤＮＡ配列。 ５、前記熱ショック要素が重複するように位置する、請
   求項４に記載のＤＮＡ配列。 ６、前記イントロンが約１ｋｂの長さである、請求項１
   に記載のＤＮＡ配列。 ７、前記イントロンがトウモロコシユビキチンプロモー
   ターのイントロンである、請求項６に記載のＤＮＡ配列
   。 ８、前記イントロンが、転写開始部位から８３個以下の
   ヌクレオチドだけ３’側に位置する、請求項６に記載の
   ＤＮＡ配列。 ９、前記熱ショック要素が前記転写開始部位の上流に位
   置し、前記イントロンが該転写開始部位の下流に位置す
   る、請求項１に記載のＤＮＡ配列。 １０、植物ユビキチン調節システムを含む、２ｋｂ以下
   のＤＮＡ配列と、植物発現性構造遺伝子とを有するＤＮ
   Ａ構築物であって、 該調節システムが熱ショック要素およびイントロンを含
   み、そして、 該構造遺伝子が該植物ユビキチン調節システムの調節制
   御下に置かれている、 ＤＮＡ構築物。 １１、前記構造遺伝子が、本来は熱ショック制御下には
   ない遺伝子をコードする、請求項１０に記載のＤＮＡ構
   築物。 １２、植物細胞における構造遺伝子を構成的に発現させ
   るための、および選択されたストレス誘導による該構造
   遺伝子の発現を増強するための方法であって、 （ａ）熱ショック要素およびイントロンを含む植物ユビ
   キチン調節システムと、該植物ユビキチン調節システム
   の調節制御下にある植物発現性構造遺伝子とを含むＤＮ
   Ａ構築物で該植物細胞を形質転換すること、および （ｂ）該形質転換した植物細胞にストレス状態を選択的
   に与え、該構造遺伝子の発現増強を誘導すること、 を包含する方法。