DE68918533T2

DE68918533T2 - Überexpression von Phytochrom in transgenen Pflanzen.

Info

Publication number: DE68918533T2
Application number: DE68918533T
Authority: DE
Inventors: Howard P Hershey; Janis M Keller
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1988-07-29
Filing date: 1989-07-27
Publication date: 1995-03-30
Anticipated expiration: 2009-07-28
Also published as: WO1990001261A1; EP0354687A1; EP0430972A1; ATE112135T1; US5268526A; NZ230131A; JPH04500002A; DE68918533D1; EP0354687B1; AU3973489A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Herstellung ununterbrochener kodierender Sequenzen für Phytochrompolypeptide, rekombinante DNA-Konstrukte, die verwendet werden, um solche kodierende Sequenzen in Pflanzen einzuschleusen und überzuexprimieren, und transgene Pflanzen und ihre Samen, die Phytochrom überexprimieren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Pflanzen nehmen das Licht der Umgebung auf, indem sie eine Reihe von Photorezeptorsystemen einsetzen. Phytochrom ist unter diesen Photorezeptoren der am besten charakterisierte. Es zeigte sich, daß es eine kritische Rolle bei der Regulierung von Wachstum und Entwicklung während des Lebenszyklus der Pflanze spielt. Es wurde gezeigt, daß es funktionell an der Kontrolle eines umfangreichen Bereiches biologischer Funktionen und Entwicklungsfunktionen bei Pflanzen beteiligt ist, einschließlich solcher Prozesse, wie Deetiolierung keimender Sämlinge, Regulierung der Synthese eines Wirts für Plastidproteine, wie für diejenigen des Photosyntheseapparates, Kontrolle der Schattentoleranz und Regulierung des zeitlichen Eintritts von Blüten- und Fruchtproduktion [siehe Shropshire, W., Jr., und Mohr, H. (Hrsg.), Übersichtsartikel "Photomorphogenesis", Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, Bd. 16A und 16B, Springer Verlag, Heidelberg/Berlin 1983]. Es wird nun angenommen, daß das Phytochrommolekül ein Homodimer von Untereinheiten ist, die bekanntlich jeweils aus einem linearen Tetrapyrrol-Chromophor bestehen, der kovalent mit einer Polypeptidhauptkette über eine Thioetherbindung verknüpft ist. Die Größe des Polypeptidteils des Photorezeptors variiert bei Pflanzenspezies von 120-127 Kilodalton [Vierstra et al., Planta, 160: 521-528 (1984)]. Phytochrom kommt in Pflanzen in zwei unterschied-lichen spektralen Formen vor, in der Pr-Form mit einer Absorption im roten Bereich (λmax = 666 nm) des Spektrums und die Pfr- Form mit einer maximalen Absorption im Dunkelrotbereich des Spektrums (λmax = 730 nm). Die zwei Formen sind durch Licht reversibel ineinander umwandelbar, Pr wird durch Absorption von Rotlicht zu Pfr umgewandelt, und Pfr wird durch Absorption von dunkelrotem Licht zu Pr umgewandelt. In vivo induziert die Photokonversion von Pr zu Pfr durch Rotlicht eine umfangreiche Serie morphogener Reaktionen, wohingegen die Rekonversion von Pfr zu Pr durch dunkelrotes Licht die Auslösung dieser Reaktionen aufhebt. Es ist gerade diese Eigenschaft der unendlich wiederholbaren Photointerkonvertibilität, die eine Funktion von Phytochrom im wesentlichen als reversibler Regulationsschalter ermöglicht, wobei Pr und Pfr als die biologisch inaktiven bzw. aktiven Formen des Moleküls betrachtet werden. Für eine allgemeine Diskussion des Photokonversionsprozesses siehe Moses und Chua [Moses, P.B. und Chua, N.H., Sci. Amer., 258(4): 88-94 (1988)].
Obwohl der Weg von der Lichtaufnahme durch den Photorezeptor zu den Veränderungen des Transcriptionsmusters der Gene im Zellkern unbekannt bleibt, ist die Funktion von Phytochrom bezüglich seiner Regulierung einer umfangreichen Reihe biologischer Prozesse gut definiert. Folglich kann es sein, daß sich verändernde Phytochromkonzentrationen bei in Licht gezogenen Pflanzen eine einzigartige Möglichkeit bieten, das komplexe Entwicklungssystem, das die pflanzliche Entwicklung reguliert, nicht gewaltsam zu beeinflussen. Außerdem kann die Modifikation der Phytochrom- Gleichgewichtskonzentrationen in den Zellen lichtgezogener Pflanzen zur Erzeugung einer Reihe wünschenswerter Wachstums- und Entwicklungseigenschaften führen, die potentielle landwirtschaftliche Vorteile besitzen könnten, da das Phytochrom eine derart wichtige regulatorische Rolle im Lebenszyklus von Pflanzen spielt. Diese Vorteile können in Form gentechnisch erzeugter Pflanzen mit veränderten Phänotypen vorliegen, so daß diese neuen Phänotypen die Pflanzen mit Vorteilen auf diesem Gebiet im Vergleich zu ihren normalen Gegenstücken liefern, wodurch neue Pflanzenvarietäten entstehen, die einen verbesserten landwirtschaftlichen Wert besitzen.
Ferner ist bekannt, daß das Phytochromsystem auf einem noch unbekannten Weg mit den Prozessen in Wechselwirkung tritt, die die phytohormonellen Gleichgewichte in den Pflanzengeweben regulieren. Die Modifikation der Phytochrom- Gleichgewichtskonzentrationen in transgenen Pflanzen kann dieses Gleichgewicht zwischen verschiedenen endogenen Phytohormomen verändern, die sowohl die Pflanzenmorphologie als auch die Entwicklung steuern. Veränderungen der Phytochrom-Gleichgewichtskonzentrationen in den Geweben lichtgezogener Pflanzen können durch Störung der normalen Phytohormon-Gleichgewichte dramatische Auswirkungen auf Entwicklung und Morphologie modifizierter Pflanzen besitzen und dadurch potentiell Pflanzen mit neuen Eigenschaften, die landwirtschaftlichen Wert besitzen, entstehen lassen.
Die genetische Modifikation von Pflanzen zur Erzeugung neuer und nützlicher Phänotypen durch Veränderung der Phytochromkonzentrationen in lichtgezogenen Pflanzen durch Modifikation von Pflanzenwachstum und Morphologie ist ein neues Konzept. Hershey et al. [Hershey, H.P., Barker, R.F., Idler, K.B., Murray, M.G., und Quail, P.H., Gene 61: 339- 348, (1987)] berichteten über die erste Aufklärung der Sequenz und die Organisation eines Phytochromgens aus einer Pflanze. Die Nucleotidsequenz des Gens wird zusammen mit seiner Intron/Exon-Organisation dargestellt, die aus dem Vergleich der Gensequenz mit Sequenzen, die von den entsprechenden cDNA-Klonen stammen, bestimmt wird. Ferner werden Daten angegeben, die die Transcriptionsstartstelle des Gens zeigen. Es werden vorgeschlagen Sequenzelemente in der 5'-flankierenden Region des Phytochromgens vorgeschlagen, die an dessen Lichtregulierung beteiligt sein können, was auf der Homologie dieser Elemente mit weiteren lichtregulierten Genen basiert. Die Autoren diskutieren die Möglichkeit einer Expression von Phytochrom mit seinem nativen Promotor in einem transgenen System als Verfahren zum Studium der Rolle der vorgeschlagenen Promotorelemente bei der Lichtregulierung der Phytochrom-Gentranscription. Es liegt keine Schlußfolgerung vor über Wert oder Auswirkung von entweder Expression oder Überexpression von Phytochrom auf den Phänotyp von transformierten Pflanzen.
Nagy et al. [Nagy, F., Kay, S.A., and Chua, N.H., Trends in Genetics, 4: 37-42 (1988)] geben eine Übersicht über den Stand der Phytochromforschung mit besonderer Betonung der Aufklärung des Signalübertragungsweges, der von der rotlichtinduzierten Photokonversion von Pr zu Pfr über die Veränderungen der Expression von Genen, die durch Phytochrom reguliert werden, führt. Als Hintergrund für die Diskussion über die Signalübertragung diskutieren die Autoren die Eigenschaften des Photorezeptors, seine Proteinstruktur, seine Lokalisierung in der Pflanze und innerhalb der Zelle, seine verschiedenen Formen und den Stand der Bemühungen, die kodierenden Sequenzen für Phytochrom zu klonieren. Die Art der transcriptionalen Regulierung von Phytochrom-kontrollierten Genen wird unter Betonung der DNA-Sequenzen und übergreifender regulatorischer Proteine diskutiert, die an dieser Regulierung beteiligt sind. Modelle zur Genregulierung und Signalübertragung werden vorgeschlagen.
Nagy et al. (oben zitiert) diskutieren weitere Richtungen, die in der Phytochromforschung unter besonderer Betonung der Aufklärung des Signalübertragungsweges eingeschlagen werden sollen. Das Testen der Phytochromgene, die einer gezielten Mutagenese in transgenen Pflanzen unterzogen worden sind, wird als Weg zum besseren Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen zwischen Phytochrom-Proteinstruktur und veränderter Genexpression vorgeschlagen. In diesem Zusammenhang schlagen die Autoren die Überproduktion von Phytochrom und/oder die Expression des Photorezepors in ungeeigneten Zelltypen als Werkzeug vor, um zu studieren, wie diese Veränderungen der Expression weitere Phytochromkontrollierte Gene beeinflussen. Sie schlagen auch die Erzeugung dominanter Mutationen in dem Phytochromprotein vor, um den Signalübertragungsweg durch Veränderung der funktionellen Struktur des Photorezeptors zu studieren. Die Autoren konzentrieren ihre Diskussion und Spekulationen auf die Regulierung der Genexpression durch den Photorezeptor anstatt darauf, welche Auswirkung, sofern es eine gibt, die Expression von Phytochrom entweder auf die Genexpression oder auf die Reaktionen der gesamten Pflanze in transgenen Pflanzen haben würde. Ferner erscheint in dem Artikel keine Diskussion des potentiellen landwirtschaftlichen Nutzens, der sich aus der Phytochrom-Überexpression in ganzen Pflanzen ergeben könnte. Schließlich werden in dem Artikel von Nagy et al. (oben zitiert) keine Berichte über die Versuche bekanntgegeben, Phytochrom in transgenen Pflanzen entweder über seinen nativen Promotor oder durch Fusion einer Phytochrom-kodierenden Sequenz zu einem hochaktiven konstitutiven Promotor zu exprimieren.
Ein weiterer neuer Übersichtsartikel diskutiert das derzeitige Verständnis der Lichtregulierung von Kern- und Chloroplasten-Genexpression durch Phytochrom und UV-Licht- Photorezeptoren. [Jordan, B. Thomas and Partis, M.D., in 1986 BCPC Mono No. 34 Biotechnology and Crop Improvement and Protection, S. 49-59, (1986)]. Es werden Vorschläge für Verfahren gemacht, mit denen die lichtregulierten Gene zur Verbesserung der Ernteproduktivität manipuliert werden können. Diese umfassen 1) Veränderungen des RUBP-Carboxylasemoleküls durch Mutation und Photoinaktivierung weiterer, an der Photorespiration beteiligter Enzyme, 2) die gentechnologische Erzeugung der Thylakoidmembranproteine zur Übertragung einer Herbizidresistenz und zur Vergrößerung ihres reichlichen Vorhandenseins unter Niedriglicht-Bedingungen; 3) die Verwendung von Kontroll- (Promotor)-Sequenzen aus lichtregulierten Genen zur Kontrolle von Genen, die normalerweise nicht lichtreguliert sind und 4) die Manipulation der photoperiodischen Regulation der Blüten- und der Samenproduktion, so daß sich eine größere Kontrolle dieser Prozesse ergibt. Es wird kein spezieller Weg zur photoperiodischen Manipulation angegeben, und die Möglichkeit der gentechnologischen Veränderung eines bekannten Pflanzenphotorezeptors zur Modifikation der Ernteproduktivität findet keine Erwähnung.
Die einzigen bekannten Artikel, die Pflanzen mit Änderungen ihrer Phytochrom-Konzentrationen diskutieren, betreffen Tomaten- und Arabidopsismutanten, die anscheinend verringerte Niveaus an spektral nachweisbarem Phytochrom im Vergleich zu den Wildtyppflanzen aufweisen. Es wurde berichtet, daß die Mutanten einige Eigenschaften zeigen, die eine gewisse Ähnlichkeit mit denjenigen aufweisen, die bei etiolierten Pflanzen beobachtet werden, d.h. sie haben längere Hypokotyle, sind gelblicher als ihre normalen gesunden grünen Pendants und scheinen eine etwas vergrößerte Apikaldominanz zu besitzen [Koorneeff, M., Cone, J.W., Dekens, R.G., O'Herne-Robers, E.G., Sproit, C., J.P. and Kendricle, R.E., J. Plant Physiol, 120: 153-165 (1985)]. Es werden keine Daten angegeben, die die Wirkung der Mutation auf die Ausbeute oder eine weitere Eigenschaften von potentiellem landwirtschaftlichem Wert betrifft, und es wurde nur eine Verringerung der Photorezeptorkonzentration durch Mutation in Erwägung gezogen.
Bisher existiert nur ein Artikel über die Isolierung eines DNA-Fragments, das eine ununterbrochene kodierende Sequenz für ein vollständiges Phytochrompolypeptid enthält [Lissemore, J. L., Colbert, J.T., Quail, P.H., Plant Molecular Biology, 8: 485-496 (1987)]. Der Artikel beschreibt die Isolierung eines c-DNA-Klons in voller Länge für Phytochrom aus Cucurbita pepo (Zucchini). Doch steht die Expression des endogenen Cucurbita-Phytochromgens, anders als die Phytochromgenexpression in Avena (Hafer), unter schwacher, wenn überhaupt irgendeiner Phytochromkontrolle da sie fast keine Reaktion auf die Pr/Pfr- Photokonversion zeigte. Da die Forscher die Reaktivität weiterer Gene bei Zucchini, die bekanntermaßen unter Phytochromkontrolle in anderen Pflanzenspezies stehen, nicht testeten, bleibt es unbekannt, ob der Mangel an Reaktivität der Zucchini-Phytochromgene einfach auf einen Unterschied in der Lichtreaktivität der Gene zurückzuführen ist oder ob es irgendeinen grundlegenden Unterschied in der regulatorischen Funktion zwischen Cucurbita- und Avena- Phytochromen auf dem Niveau der nuclearen Genexpression gibt. Da weitere Daten fehlen, scheint es sinnvoll zu sein, daß Versuche zur Überexpression von Phytochrom in transgenen Pflanzen mit einer kodierenden Sequenz vom Avena-Typ vorgenommen werden, da sie für ein Polypeptid kodiert, das bekanntlich einen starken regulatorischen Einfluß auf die nucleare Genexpression in dessen nativen Spezies ausübt.
Verschiedene DNA-Fragmente, die teilweise kodierte Regionen von Avena enthalten, sind zugänglich und können kombiniert werden, um die notwendige Kodierungsinformation zur Synthese eines vollständigen Phytochrompolypeptids bereitzustellen. Während jedoch genomische Avena-Klone kombiniert werden können, so daß sich ein einziges DNA-Fragment ergibt, das für ein vollständiges Photorezeptormolekül kodiert, würde sich die kodierende Region auf eine Reihe von Exon verteilen, da alle bekannten Avena-Gene Introns enthalten. Dadurch werden die existierenden genomischen DNA-Fragmente zu schlechten Ausgangsmaterialien zur Erzeugung einer kodierenden Region, die im allgemeinen zur Expression in einer transgenen Pflanze geeignet ist, da ein neuerer Beweis dafür existiert, daß die Introns der Gene aus monokotyledonen Pflanzen (für die Avena ein Beispiel ist) in dikotylendonen Spezies schlecht prozessiert werden. [Keith, B. and Chua, N.H., EMBO J., 5:2419-2425 (1986)]. Darum ist es notwendig, eine ununterbrochene kodierende Sequenz für Avena-Phytochrom zur Expression in transgenen Pflanzen zu erzeugen, da keine Klone zugänglich sind, die eine allgemein geeignete kodierende Region für Protein enthalten.
Da es gut dokumentiert ist, daß lichtinduzierte Unterschiede in den Strukturen von Pr und Pfr hinsichtlich der Konformation fundamental am Mechanismus der Wirkung des Photorezeptors beteiligt sind, können sich Änderungen in der Aminosäurezusammensetzung von Phytochrom negativ auf die biologische Wirksamkeit des veränderten Proteins auswirken. Obgleich es bekannt ist, daß die Protein-Domänen, die an der Dimerisation der Untereinheiten von Phytochrom beteiligt sind, in den C-terminalen 30 Kilodalton des Proteins vorkommen, [Viersta et al., 1984, wie oben beshrieben, Jones and Quail, Biochemistrv, 25: 2987-2995 (1986)] und daß die Domänen, die für die Photokonversion von Pr/Pfr verantwortlich sind, in den N-terminalen 70 Kilodalton vorkommen [Viestra et al., 1984, wie oben, Wong et al., J. Biol. Chem., 261: 12089-12097 (1986)], müssen die genauen Aminosäuren, die an diesen Funktionen beteiligt sind, ebenso wie diejenigen, die an der Adaption und Aufrechterhaltung der Sekundärstruktur und der Strukturen höherer Ordnung von Pr und Pfr des Dimeren beteiligt sind, noch aufgeklärt werden. Da sich das in dieser Arbeit verwendete neue Phytochrompolypeptid von dem Phytochromtyp 3 in 5 Aminosäuren und von dem Phytochromtyp 4 in 20 Aminosäuren unterscheidet, war es daher unbekannt, ob das Protein aktiv sein würde, da jeder einzelne Aminosäureaustausch oder die Kombination von Änderungen die dreidimensionale Struktur des Proteins und somit seine biologische Aktivität nachteilig beeinflussen könnten. Tatsächlich war es sogar unbekannt, ob ein monokotyledones Phytochrom in dikotyledonen Spezies funktionieren würde, da nur eine 65%ige Proteinhomologie zwischen der einzigen bekannten monokotyledonen (Avena) und dikotyledonen (Cucurbita) Phytochromsequenz vorhanden ist [Sharrock et al., Gene, 47: 287-295 (1986)].
Trotz umfangreicher Forschung am Phytochrompeptid ist bisher noch keine kodierende Region isoliert worden, von der sich gezeigt hat, daß sie sowohl in monokotyledonen als auch dikotyledonen Pflanzen allgemein funktionell ist. Außerdem existieren keine Transformationskonstrukte zur Überexpression von Phytochrom in irgendwelchen Pflanzenspezies. Die landwirtschaftlichen Vorteile der Überexpression von Phytochrom sind darum noch nicht erzielt worden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde ein Mittel zur Produktion transgener Pflanzen gefunden, die relativ zur Wildtyppflanze Phytochrom im Dunkeln und im Licht überexprimieren. Solche transgenen Pflanzen besitzen eine Reihe wünschenswerter landwirtschaftlicher Eigenschaften, wie verringerte Apikaldominanz, Halbzwergenwuchs, verbesserte Schattentoleranz oder dunkelgrüne Farbe. Insbesondere durch Einführung eines Nucleinsäurefragments, das von einer monokotyledonen Pflanze stammt und eine einzige ununterbrochene kodierende Sequenz für ein Phytochrompolypeptid umfaßt, in eine Pflanze, wobei ein rekombinantes DNA-Konstrukt verwendet wurde, um die Transformation und Überexpression von Phytochrom zu erreichen, werden ein oder mehrere der vorgenannten wünschenswerten landwirtschaftlichen Eigenschaften erhalten.
Somit wird gemäß einem Gesichtspunkt unserer Erfindung eine transgene Pflanze bereitgestellt, die Phytochrom relativ zu der Wildtyppflanze im Dunkeln und im Licht überexprimiert und relativ zur Wildtyppflanze einen phänotypischen Charakter zeigt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus reduzierter Apikaldominanz, Halbzwergenwuchs, verbesserter Schattentoleranz und dunkelgrüner Farbe, wobei das Genom der genannten Pflanze eine einzige ununterbrochene kodierende Sequenz für ein Phytochrompolypeptid umfaßt, die stromaufwärts (5') mit dem 35-S-Bestandteil des Blumenkohlmosaikvirus-Promotors und stromabwärts (3') mit einer regulatorischen Sequenz, die ein Polyadenylierungssignal enthält, zweckorientiert verknüpft ist.
Während sowohl monokotyledone als auch dikotyledone Pflanzen verwendet werden können, um die Ausführungsformen der Erfindung zu erhalten, umfassen die bevorzugten monokotyledonen Pflanzen Mais, Hafersorten, Hirse, Weizen, Reis, Gerste, Amaranth, Zwiebel, Spargel und Zuckerrohr, und die bevorzugten dikotyledonen Pflanzen umfassen Alfalfa, Sojabohne, Petunie, Baumwolle, Zuckerrübe, Sonnenblume, Karotte, Sellerie, Kohl, Gurke, Paprika, Canola, Tomate, Kartoffel, Linse, Flachs, Broccoli, Tabak, Bohne, Salat, Raps, Bumenkohl, Spinat, Rosenkohl, Artischocke, Erbse, Okra, Squash, Rüben, Liebstöckel, Tee und Kaffee. Zierpflanzen stellen ebenfalls eine bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzenklasse dar. Samen, der durch Ziehen der oben genannten transgenen Pflanzen erhalten wird, stellt das bevorzugte Mittel dar, um die nützlichen landwirtschaftlichen Eigenschaften, die durch Überexpression von Phytochrom hervorgebracht werden, festzuhalten und zu übertragen.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung umfaßt ein Nucleinsäurefragment, das aus einer monokotyledonen Pflanze stammt und eine einzige ununterbrochene kodierende Sequenz für ein Phytochrompolypeptid umfaßt, wobei das genannte Nucleinsäurefragment in der Lage ist, in ein rekombinantes DNA-Konstrukt eingebaut zu werden, das verwendet wird, um eine Pflanze zu transformieren, so daß eine Überexpression von Phytochrom erreicht wird. Derartige kodierende Sequenzen aus monokotyledonen Pflanzen werden durch Deletion der Introns hergestellt und können aus Komponenten zusammengebaut werden, die sich von verschiedenen Klonen in einer Genbank und/oder cDNA-Genbank ableiten. Bevorzugte kodierende Sequenzen stammen aus Avena nach Deletion der Introns. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein rekombinantes DNA-Konstrukt, das in der Lage ist, eine Pflanze zu transformieren, die eine einzige ununterbrochene kodierende Sequenz für ein Phytochrompolypeptid umfaßt, das stromaufwärts (5') mit dem 35-S-Bestandteil des Blumenkohlmosaikvirus-Promotors und stromabwärts (3') mit einer regulatorischen Sequenz, die ein Polyadenylierungssignal enthält, zweckorientiert verknüpft ist, so daß bei Transformation die genannte Pflanze Phytochrom relativ zu der Wildtyppflanze im Dunkeln und im Licht überexprimiert, und daß die genannte Pflanze relativ zu der Wildtyppflanze eine phänotypische Eigenschaft zeigt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus verringerter Apikaldominanz, Halbzwergenwuchs, vergrößerter Schattentoleranz und dunkelgrüner Farbe.
Gegebenenfalls kann das Nucleinsäure-Promotorfragment einen Enhancer enthalten, um die Transcription und Expression noch zu stimulieren, wobei bevorzugte Enhancer aus einem Virus oder Agrobacterium erhalten werden. Mehr bevorzugte Enhancer werden aus dem 35-S-Bestandteil des Blumenkohlmosaikvirus oder der Opinsyntasegene von Agrobacterium erhalten. Am meisten bevorzugt aufgrund der Aktivität oder Leichtigkeit der Herstellung sind rekombinante DNA-Konstrukte, die einzelne ununterbrochene kodierende Sequenzen für das Phytochrompolypeptid umfassen, das von Avena stammt, und die zweckorientiert mit einem Nucleinsäurepromotorfragment, das aus dem 35-S-Bestandteil des Blumenkohlmosaikvirus erhalten wurde, und mit einer 3'-Polyadenylierungssignalsequenz, die aus dem Avena Phytochromgen erhalten wurde, verknüpft sind. Der Einbau der obigen rekombinanten DNA-Konstrukte in Transformationsvektoren, so daß sie mit der T-DNA-Region des Agrobacterium-tumefaciens-Ti-plasmid in Pflanzen eingeschleust werden, worauf sich eine Infektion der Pflanze durch die Bakterien anschließt, stellt das am meisten bevorzugte Mittel zur Transformation von Pflanzengewebe dar.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Akte dieses Patents enthält wenigstens eine Farbphotographie. Kopien dieses Patents mit der Farbphotographie werden vom Patent- und Warenzeichenamt auf Anfrage und nach Begleichen der notwendigen Gebühr bereitgestellt.
Figur 1 ist eine physikalische Karte von pCV35phyt, die Regionen von verschiedenen Klonen zeigt, die verknüpft wurden, um das rekombinante DNA-Konstrukt zu erzeugen.
Figur 2 ist eine physikalische Karte von pGP8.2-21, wie es sich von pGP8.2-2 ableitet.
Figur 3 ist eine physikalische Karte von pGP8.2-22, wie es sich von pGP8.2-21 ableitet.
Figur 4 ist eine physikalische Karte von pCV5, wie es sich von pGP8.2-1 und pMSPKr ableitet.
Figur 5 ist eine physikalische Karte von pCV5-8,2, wie es sich von pCV5 und pGP8.2-22 ableitet.
Figur 6 ist eine physikalische Karte von pCV5B, wie es sich von pCV5-8.2 und pAP3.1 ableitet.
Figur 7 ist eine physikalische Karte von pCV5B3, wie es sich von pGP2.1-1 und pVC5B ableitet.
Figur 8 ist eine physikalische Karte von pCV35P, wie es sich von pMSPKN und pUC35K ableitet.
Figur 9 ist eine physikalische Karte von pVC35phytA, wie es sich von pCV35P und pCV5B3 ableitet.
Figur 10 ist eine physikalische Karte von pCV35phyt, wie es sich von pCV35phytA und pCV5B3 ableitet.
Figur 11 ist eine Autoradiographie, die geschützte Avena- Typ-Phytochrom-RNA in transformierten Tabakpflanzen zeigt.
Figur 12 ist eine Farbphotographie, die die transformierten Pflanzen 7A und 9A zeigt.
Figur 13 ist ein Protein-Immunblot, welcher die Expression des Phytochrompolypeptids in transformierten Pflanzen zeigt, die entweder unter Wachstumsbedingungen mit Licht oder unter Wachstumsbedingungen im Dunkeln gezogen worden sind.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Vergrößerung der Gleichgewichtskonzentration von Phytochrom in Zellen gentechnologisch behandelter Pflanzen bereit, um das Wachstum und die morphologischen Eigenschaften zur Verbesserung ihres landwirtschaftlichen und kommerziellen Wertes zu modifizieren. Phytochrom ist ein lösliches Protein, das in allen Pflanzen vorkommt und durch eine regulatorische Fähigkeit zur Kontrolle einer breiten Vielzahl biologischer Prozesse wirkt. Die Analyse von Phytochrom aus verschiedenen Spezies zeigt, daß sie aus zwei identischen Untereinheiten bestehen, die jeweils aus einer Polypeptidkette mit Molekülmassen im Bereich von 120 bis 127 Kilodalton zusammengesetzt sind. Jede Untereinheit besteht aus einem linearen Tetrapyrrol-Chromophoren, der mit dem Protein über eine Thioetherbindung kovalent verknüpft ist. Die Gegenwart von Phytochrom in etiolierten Pflanzengeweben wird oft bestimmt, indem das charakteristische Differenzspektrum des Photorezeptors (das Spektrum, das durch Subtraktion des Pfr-Spektrums von demjenigen von Pr erhalten wird) gemessen wird. Das Vorliegen von sehr großen Mengen Chlorophyll in grünem Pflanzengewebe stört jedoch die spektralen Messungen des Photorezeptors. Die Erzeugung von sowohl polyklonalen Antikörpern, die Phytochrom einer Reihe von Pflanzenspezies erkennen, als auch von hochspezifischen monoklonalen Antikörpern, die nur Avena-Phytochrom erkennen, hat die Analyse des Photorezeptors in grünen Pflanzen erleichtert. Analysen der Avena-Phytochromexpression in transgenen Pflanzen werden in dieser Arbeit entweder immunchemisch oder spektral, je nach zu analysierendem Gewebe, durchgeführt.
Die Erfindung wird angewendet, um die intrazellulären Phytochromkonzentrationen in den Pflanzenspezies von Interesse zu erhöhen, indem ein Nucleinsäurefragment eingeschleust wird, das eine einzige ununterbrochene kodierende Sequenz für ein Phytochrompolypeptid enthält, das in einer gewünschten Pflanzenspezies zweckorientiert funktionell gemacht wurde durch seine Bindung an eine genetische Sequenz, die in der Lage ist, den Expressionsgrad der Phytochrom-kodierenden Sequenz zu erhöhen, und an eine Sequenz, die in der Lage ist, ein Polyadenylierungs-Signal für die richtige RNA-Prozessierung bereitzustellen. Wenn eine solche Kombination in einer Pflanze vorhanden ist, sollte die Pflanze eine Modifikation in gewünschter Weise von einer oder mehreren Wachstumseigenschaften und morphologischen Eigenschaften aufweisen, wie eine verringerte Apikaldominanz, Halbzwergenwuchs, vergrößerte Schattentoleranz und eine dunkelgrüne Farbe. Diese Modifikationen sind oft bei Feldfrüchten von großem Wert, bei denen der Windschaden an großen Spezies zu beträchtlichen Ernteverlusten führt, und bei Zierpflanzen, bei denen grünere, kürzere, buschigere Pflanzen stark erwünscht sind. Solche Modifikationen werden derzeit angestrebt, indem die Pflanzen Cytokinin-Hormonverbindungen ausgesetzt werden, die auch zahlreiche Nebenwirkungen hervorrufen.
Eine Konstruktion rekombinanter DNA, die ein chimäres Phytochromgen des vorstehend beschriebenen Typs darstellt, wurde geschaffen (wie in Figur 1 gezeigt), das aus einem 1-kbp-(1 000 Basenpaare)-35-S-Promotorfragment aus dem Blumenkohlmosaikvirus-35-S-Transcripts besteht, das mit einer chimären Phytochromsequenz zweckorientiert verknüpft ist. Die chimäre Phytochromsequenz besteht aus einer 1 438-bp-kodierenden Sequenz für Phytochrom aus dem genomischen Avena-Klon vom Typ 3, pGP8.2-2 (von der Acc I- bis zu der Eco RV-Schnittstelle des Plasmids), verknüpft mit der 1 862 bP-Avena-cDNA-Kodierungssequenz vom Typ 3 aus dem Klon pAP3.1 (das Eco RV- bis Xba I-Fragment aus diesem Plasmid) und terminiert mit dem genomischen Avena-Klon pGP2.4-1 vom Typ 4 (dem Xba I- bis Eco RI-Fragment von pGP2.4-1), das die kodierende Region vervollständigt und die Polyadenylierungssignale und alle weiteren regulatorischen Funktionen bereitstellt, die am 3'-Ende eines Pflanzengens erforderlich. sein können. Die resultierende Konstruktion kodiert für ein 1 129-Aminosäure-Phytochrompolypeptid in einer ununterbrochenen DNA-Sequenz. Die rekombinante DNA-Konstruktion wurde zur Transformation von Tabakpflanzen verwendet, wobei die von Agrobacterium ausgelöste Blattscheibeninfektion angewendet wurde. Die Tabakpflanzen, die sich aus der Transformation regenerierten, zeigen die Expression eines funktionellen chimären Phytochromproteins und vergrößerte Gleichgewichtskonzentrationen an Gesamtphytochrom sowohl im Licht als auch im Dunkeln. Die Tabaktransformanten, die das chimäre Gen exprimieren, zeigen eine vermehrte grüne Pigmentierung, eine verstärkte Bestengelung (mehr Stengel, die sich von der Basis der Pflanze bildeten), eine deutliche Verringerung der Apikaldominanz und einen verringerten internodalen Abstand, was zu Pflanzen eines halbzwergenwüchsigen Phänotyps führt, so daß die transformierten Pflanzen dieselbe Anzahl von Blattknoten zum Blütenstand besitzen, jedoch ungefähr die halbe Höhe von normalen Pflanzen.
Die Herstellung einer kodierenden Region für Phytochrom mit allgemeiner Verwendbarkeit wird erfindungsgemäß erreicht, indem Teile von zwei unabhängigen genomischen Avena-Phytochromklonen, die Stücke aus zwei verschiedenen Phytochromgenen darstellen, mit einem Avena-cDNA-Klon kombiniert werden. Der cDNA-Klon, der hier verwendet wird, wird mit pAP3.1 bezeichnet [Hershey et al., Nucleic Acids Res., 13: 8543-8559 (1985)] und kodiert für den zentralen Abschnitt des Phytochrompolypeptids. Es fehlen ihm jedoch sowohl die 5'- als auch 3'-Sequenzen, die für die N-terminale und C-terminale Proteindomäne des Photorezeptors kodieren. Ein Fragment aus dem genomischen Klon pGP8.2-2 (Hershey et al., 1985, wie vorstehend beschrieben), das die 5'-kodierenden Sequenzen von Exon 2 enthält, die auf dem cDNA-Klon fehlen, wurde verwendet, um die N-terminale kodierende Region des Photorezeptors zu vervollständigen und um einen am 5'-Ende nicht translatierten Leader für die kodierende Region bereitzustellen. Die 3'-kodierende Sequenz und die Polyadenylierungssequenzen, die bei pAP3.1 fehlen, stammen aus dem als AGP2.4 bezeichneten genomischen Klon. pGPs.4-1 ist das 5,5-kbp-Eco-RI-Fragment aus dem genomischen Klon pGP2.4, das in die Eco-RI-Schnittstelle von pBR322 subkloniert wurde (Hershey et al., 1985, wie vorstehend beschrieben). Die neue Proteinsequenz, die von der resultierenden DNA-Sequenz kodiert wird, ist ein Fusionsprotein, das aus Teilen von Typ 3- und Typ 4-Phytochromen besteht (Hershey et al., 1985) und in der Natur nicht vorkommt.
Die Erfindung umfaßt ferner eine Genkombination, wie oben beschrieben, die entweder im Pflanzengenom oder als replizierendes extrachromosomales Element vorhanden ist, für den Fall, in dem das produzierte Phytochromprotein ein natives Phytochromprotein der Spezies, in der es exprimiert wird, oder ein heterologes Protein, das sich aus der kodierenden Region einer anderen Pflanzenspezies ableitet, ist. Tatsächlich kann die kodierende Region für Phytochrom aus irgendeiner heterologen oder homologen kodierenden Region bestehen, die zur Produktion eines funktionellen Phytochroms in der gewünschten Pflanze führt.
Der Ursprung des zum Antreiben der Expression der kodierenden Region für Phytochrom gewählten Promotors ist nicht kritisch, solange er eine ausreichende transcriptionale Aktivität besitzt, um die Erfindung zu erreichen, indem die Gleichgewichtskonzentration von Phytochrom in Pflanzen erhöht wird, die in Licht und im Dunkeln gezogen worden sind. Die erfindungsgemäß verwendete Promotorregion stammt von dem 35-S-Transcript des Blumenkohlmosaikvirus ab.
Es wird beabsichtigt, daß die Einführung von Enhancern oder enhancerartigen Elementen in entweder den nativen Phytochrompromotor oder in weitere Promotorkonstrukte ebenfalls erhöhte Phytochrom-Konzentrationen bereitstellt, indem die transcriptionale Aktivität eines Gens, das für Phytochrom kodiert, erhöht wird, so daß die Erfindung erzielt wird. Einschließen würde dies virale Enhancer, wie diejenigen, die im 35-S-Promotor vorkommen, Odell et al., 1987 [Odell, J.T., Knowlton, S., Lin, W. and Mauvars, C.J., Plant Mol. Biol. 10: 263-272 (1988)], Enhancer der Octopinsynthase- oder Nopalinsynthasegene oder Enhancer aus jeder anderen Quelle, die zu einer erhöhten Transcription führen, wenn sie in einem Promotor angeordnet werden, der mit einer kodierenden Sequenz für Phytochrom zweckorientiert verknüpft ist.
Die kodierende Sequenz für Phytochrom kann Introns enthalten oder nicht, um die Erfindung zu erzielen. Einer kodierenden Region ohne Introns kann der Vorzug gegeben werden, da eine solche kodierende Region die mögliche posttranscriptionale Prozessierung des Phytochrom-Primär transcripts aufgrund potentieller Unterschiede bei den Mechanismen, die für die Introndeletion bei verschiedenen Pflanzenspezies verantwortlich sind, vermeidet. Es wird erwartet, daß jede kodierende Region für Phytochrom, die für die Expression eines aktiven Phytochroms in einer Pflanze sorgt, ohne Rücksicht auf die Quelle der kodierenden Region, ausreichen kann, um die Erfindung zu erzielen. Dies würde kodierende Regionen für Phytochrom aus monokotyledonen Pflanzen, die entweder in andere monokotyledone oder dikotylendone Spezies eingeschleust worden sind, und die Verwendung von dikotyledonen Phytochromen in entweder Dikotyledonen oder Monokotyledonen umfassen. Da die kodierenden Sequenzen für Phytochrom während der Evolution so funktionell konserviert worden sind, kann tatsächlich erwartet werden, daß die Phytochrome aus Algenspezies ebenfalls zum Erreichen der Erfindung geeignet sein können. Die einzige Anforderung für die verwendete kodierende Region ist, daß sie ein aktives Phytochrom in der gewünschten Pflanzenspezies bei Transformation einer Pflanze mit einer solchen kodierenden Region, die zweckorientiert mit den 5'- und 3'-regulatorischen Sequenzen, die für ihre richtige Expression erforderlich sind, verknüpft ist, bereitstellen kann.
Jede nicht kodierende 3'-Region, die in der Lage ist, ein Polyadenylierungssignal und weitere regulatorische Sequenzen bereitzustellen, die zur richtigen Expression der Phytochrom-Kodierungsregion erforderlich sein können, kann verwendet werden, um die Erfindung zu erreichen. Dies würde das native 3'-Ende des homologen Phytochromgens der zu modifizierenden Pflanzenspezies, das 3'-Ende eines heterologen Phytochromgens, das 3'-Ende aus viralen Genen, wie das 3'-Ende des 35-S- oder des 19-S-Blumenkohlmosaikvirus-Transcripts, das 3'-Ende aus Opinsynthasegenen, das 3'-Ende von RUBISCO- oder CAB-Genen oder die 3'-Endsequenzen aus jeder Quelle umfassen, so daß die eingesetzte Sequenz die notwendige regulatorische Information innerhalb ihrer Nucleinsäuresequenz liefert, so daß sich eine richtige Expression der Kombination aus Promotor/kodierender Region für Phytochrom ergibt, mit der sie zweckorientiert verknüpft ist.
Die nachstehend angegebenen Beispiele der Erfindung betreffen die Phytochromüberexpression in Tabak, Tomate und Kohl. Da jedoch Phytochrom im Pflanzenreich funktionell stark konserviert worden ist, kann die Erfindung mit einer umfangreichen Reihe von Pflanzenspezies durchgeführt werden, indem sie in einen Phänotyp der Phytochromüberexpression transformiert werden. Die Spezies mit landwirtschaftlicher Bedeutung, die durch vermehrte Photosyntheseaktivität, insbesondere unter Niedriglicht-Bedingungen, durch Zwergenwuchs oder eine reduzierte Apikaldominanz Nutzen ziehen würde, umfassen, Reis, Weizen, Mais, Sojabohne, Raps, Salat, Sonnenblume, Apfel und weitere Obstbaumvarietäten, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispielsweise wurde bei Reis gefunden, daß Varietäten, die halbzwergenwüchsig sind mit dunkelgrünen Blättern aufgrund der erhöhten Widerstandsfähigkeit gegenüber dem Standort die besten Ernten sowie eine verbesserte Photosyntheseleistung während der Kornproduktion ergeben [Übersichtsartikel siehe McKenzie et al., in Principle of Cultivar Development, (W. Fehr, ed.), Bd. 2, 487-532. MacMillan: New York 1987]. Die Fähigkeit, diese Eigenschaften in Reisvarietäten einzuschleusen, die natürlicherweise nicht zwergwüchsig sind, jedoch weitere vorteilhafte Eigenschaften aufweisen, wie eine Kälte- oder Schädlingstoleranz, wäre von großem landwirtschaftlichem Nutzen. Es wurde gefunden, daß Halbzwergenwuchs vorteilhaft ist zur Verbesserung der Ernte bei weiteren wichtigen Feldfruchtpflanzen, wie bei der Sojabohne [Fehr, W. in Principle of Cultivar Development, (W. Fehr, Hrsg.), Bd. 2, 533-576. MacMillan: New York 1987], bei der Sonnenblume [Miller, J.F., in Principle of Cultivar Development, (W. Fehr, Hrsg.), Bd. 2, 620668. MacMillan: New York 1987] und bei Weizen [Allan, in Principle of Cultivar Development, (W. Fehr, Hrsg.), Bd. 2, 699-748. MacMillan: New York 1987]. Ferner kann Weizen durch die Überproduktion von Phytochrom vorteilhaft beeinflußt werden, indem er gegenüber der Photoperiode (eine Phytochrom-abhängige Eigenschaft) weniger empfindlich gemacht wird und dadurch eine schnellere Reifung während der Saison ermöglicht wird. Außerdem kann die Induktion eines dunkelgrüneren Phänotyps durch Modifikation von Pflanzen, um Phytochrom überzuexprimieren, die Vermarktung von grünem Gemüse wie Salat und von Zierpflanzen wie Chrysanthemen aufgrund eines verstärkten Verbraucheranreizes verbessern. Es kann sein, daß eine verstärkte Photosyntheseaktivität bei Pflanzen, die als Viehfutter verwendet werden, wie Alfalfa und Klee, ebenso wie eine Steigerung der Ablagerung von Biomasse in Samen aus ihnen wertvollere Futterstoffe machen kann.
Im Kontext dieser Beschreibung wird eine Reihe von Bezeichnungen verwendet. Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Promotorregion" auf eine DNA-Sequenz, im allgemeinen stromaufwärts (5') zu der kodierenden Sequenz eines Strukturgens, die die Expression der kodierenden Region kontrolliert, indem die Erkennung für DNA-Polymerase und/oder für weitere Faktoren, die dafür erforderlich sind, daß die Transcription an der korrekten Stelle beginnt, bereitgestellt werden. Promotorsequenzen sind notwendig, genügen jedoch nicht immer, um die Expression eines Gens voranzutreiben. Ein "Promotorfragment" stellt eine Fraktion der DNA-Sequenz der Promotorregion dar. Ein "Enhancer" ist ein Typ von DNA-Fragment, das auf eine orientierungs- und ortsunabhängigen Weise arbeiten kann, um die Promotoraktivität zu stimulieren. Ein Enhancer kann ebenfalls eine Sequenz zur Stimulation der Transcription bezeichnen, wie bei Odell et al., Plant Molecular Biology, 10: 263-272 (1988) beschrieben. "Nucleinsäure" bezieht sich auf ein großes Molekül, das einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann und aus Monomeren (Nucleotiden) zusammengesetzt ist, die einen Zucker, ein Phosphat und entweder ein Purin oder Pyrimidin enthalten. "Nucleinsäurefragment" ist ein Bruchteil eines gegebenen Nucleinsäuremoleküls, der im allgemeinen durch Verdau mit Restriktionsendonuclease des größeren Nucleinsäuremoleküls erhalten wird. Bei höheren Pflanzen ist die Desoxyribonucleinsäure (DNA) das genetische Material, während Ribonucleinsäure (RNA) an der Translation der Information aus DNA in Proteine beteiligt ist. "Genom" ist die Gesamtheit des genetischen Materials, das in jeder Zelle eines Organismus enthalten ist. Die Bezeichnung "Nucleotidsequenz" bezieht sich auf ein DNA- oder RNA-Polymer, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und gegebenenfalls synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nucleotidbasen enthält, die zum Einbau in DNA- oder RNA-Polymere in der Lage sind. Wie hier verwendet, bezieht sich "DNA-Sequenzen für ausgewählte Genprodukte" auf ein Gen von DNA-Sequenzen, das für ein spezifisches Protein kodiert. "Regulatorische Sequenz", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die stromaufwärts (5') innerhalb und/oder stromabwärts (3') zu einer DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt angeordnet ist, dessen Transcription und Expression durch die regulatorische Sequenz in Verbindung mit dem Proteinsyntheseapparat der Zelle kontrolliert wird. Die Bezeichnung "Strukturgen" bezieht sich auf den Teil eines Gens, das für ein Protein, ein Polypeptid oder einen Teil davon kodiert, ausschließlich der regulatorischen Sequenzen, die den Start der Transcription und RNA-Prozessierung vorantreiben. Ein Strukturgen kann normalerweise in der Zelle oder an einem zellulären Ort vorkommen, indem es eingeschleust wurde, in welchem Fall es als heterologes Gen bezeichnet wird. Ein "heterologes Gen" kann ganz oder teilweise von irgendeiner, in der Technik bekannten Quelle stammen, einschließlich eines bakteriellen Genoms oder Episoms, einer eukaryotischen Kern- oder Plasmid-DNA, cDNA oder einer chemisch synthetisierten DNA. Das Strukturgen kann eine "ununterbrochene kodierende Sequenz" aufbauen, d.h. es erfordert keine Intronexcision aus der Messenger- RNA vor ihrer Translation in ein Proteinmolekül, oder es kann ein oder mehrere Introns umfassen, die durch geeignete Spleißstellen begrenzt sind. Ein "Intron" ist eine RNA-Sequenz, die in dem aus DNA synthetisierten Anfangstranscript auftritt, jedoch durch Spaltung und Religation der RNA in der Zelle unter Bildung der reifen Messenger-RNA entfernt wird, die dann in das Protein translatiert werden kann. Das Strukturgen kann ein Verbund von Segmenten sein, die von verschiedenen Quellen stammen, die natürlich vorkommen oder synthetisch sind. Falls ein Strukturgen aus einem Verbund von Segmenten besteht, die von verschiedenen Quellen stammen, wird es häufig als "chimäres Gen" bezeichnet. "Nicht translatierte 3'-Sequenz" bezieht sich auf den Teil eines Gens, der ein DNA-Segment umfaßt, das ein Polyadenylierungssignal und weitere regulatorische Signale enthält, die in der Lage sind, die Prozessierung der mRNA am distalen Promotorende der kodierenden Sequenz zu bewirken. Das Polyadenylierungssignal ist im allgemeinen dadurch gekennzeichnet, daß es die Addition von Polyadenylsäureabschnitten an das 3'-Ende der mRNA-Vorstufe beeinflußt. Polyadenylierungssignale werden im allgemeinen durch das Vorliegen einer Homologie mit der anerkannten Form 5'-AATAAA-3' erkannt, obwohl Variationen nicht ungewöhnlich sind. Die Bezeichnung "rekombinantes DNA-Konstrukt" bezieht sich auf ein Plasmid, einen Virus, eine autonome Replikationssequenz, einen Phagen oder eine Nucleotidsequenz, die linear oder zirkulär ist, einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder RNA, die aus irgendeiner Quelle stammt, bei welcher eine Reihe von Nucleotidsequenzen zu einer einzigartigen Konstruktion verbunden oder rekombiniert worden sind, die in der Lage ist, ein Promotorfragment und eine DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt zusammen mit der geeigneten, nicht translatierten 3'-Sequenz in eine Pflanzenzelle einzuschleusen.
Wie hier verwendet, bedeutet "monokotyledone Pflanze" eine Pflanze, deren Samen nur ein Keimblatt besitzt, oder ein Organ des Embryos, das Nahrung speichert und absorbiert. Eine "dikotyledone Pflanze" bedeutet eine Pflanze, deren Samen zwei Keimblätter besitzen. "Protoplast" bezieht sich auf eine Pflanzenzelle ohne Zellwand oder extrazelluläre Matrix. "Verringerte Apikaldominanz" bezieht sich auf einen Zustand in Pflanzen, bei dem das Hauptapikalmeristem weniger Einfluß auf die axiliären Knospen besitzt, so daß eine verstärkte Belaubung und ein verstärktes Verzweigen von dem Meristem der Pflanze aus auftritt. "Halbzwergenwuchs" bezieht sich auf Pflanzen, die um etwa die Hälfte kleiner sind als normale Pflanze derselben Spezies, jedoch sonst eine normale Struktur (d.h. dieselbe Anzahl von Stammnoden zum Blütenstand, dieselbe Anzahl von Blüten) besitzen.
Wie hier verwendet, bedeutet "Transformation" Prozesse, durch die die Zelle/das Gewebe/die Pflanze Eigenschaften annehmen, für die ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das in die Zelle/das Gewebe/die Pflanze transferiert worden ist. "Transferieren" bezieht sich auf Verfahren zum DNA-Transfer in Zellen, einschließlich Mikroinjektion oder Durchdringen der Zellmembran mit verschiedenen physikalischen (z.B. Elektroporation) oder chemischen (z.B. Polyethylenglycol, PEG) Behandlungen. Pflanzen, die neue Eigenschaften als Ergebnis der Transformation mit einer Nucleinsäure annehmen, werden als transgene Pflanzen bezeichnet. Wie hier verwendet, bezieht sich "Exponieren" eines Protoplasten oder einer Pflanze gegenüber einer chemischen Substanz auf das Behandeln, Inkubieren und Zusammenbringen des genannten Protoplasten oder der genannten Pflanze mit der Substanz.
Die Bezeichnung "zweckorientiert verknüpft" bezieht sich auf die chemische Fusion zweier DNA-Fragmente in richtiger Orientierung und auf den Leserahmen, der in die funktionelle RNA zu transcribieren ist. Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "homolog zu" auf Proteine mit ähnlichen Aminosäuressequenzen. Die Bezeichnung "Expression", wie hier verwendet, soll die Translation in ein Genprodukt aus einem Gen, das für die Sequenz des Genprodukts kodiert, bedeuten. Bei der Expression wird eine DNA-Kette, die für die Sequenz des Genprodukts kodiert, zunächst zu einer komplementären RNA transcribiert, die Messenger-RNA genannt wird, und anschließend wird die so transcribierte Messenger-RNA in das oben genannte Genprodukt translatiert. Die Expression, die konstitutiv ist und weiter durch ein extern kontrolliertes Promotorfragment verstärkt wird, wodurch Mehrfachkopien der Messenger-RNA und große Mengen des ausgewählten Gen-Produkts produziert werden, wird als "Überexpression" bezeichnet. Das "Startkodon der Translation" bezieht sich auf eine Einheit aus drei Nucleotiden (Kodon) in einer Nucleinsäure, die den Start der kodierenden Proteinsequenz festlegt.
Die DNA-Rekombinationstechniken, die bei der Erfindung angewendet werden, sind Fachleuten bekannt und werden allgemein bei Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1983), beschrieben.

Enzymatische Behandlung von DNA

1. Restriktionsenzymverdau

Die Puffer für den Restriktionsenzymverdau und die Bedingungen für den Restriktionsverdau, die verwendet werden, sind diejenigen, die vom Hersteller eines jeden bestimmten Enzyms mitgeliefert werden. Wenn es vom Hersteller empfohlen wird, wird Dithiothreitol (DTT) aus einer separaten sterilen Stammlösung bis zu der empfohlenen Konzentration zugegeben. Das Enzym wird zugegeben, so daß sich 5-10 Einheiten pro Mikrogramm DNA ergeben, und das Reaktionsgemisch wird auf das geeignete Endvolumen mit Wasser (im allgemeinen 10-20 ul) eingestellt. Die Restriktionsenzym-Reaktionsgemische, die routinemäßig verwendet werden, enthalten 0,7-2,0 ug Plasmid-DNA. Die Reaktionskomponenten werden vermischt und anschließend bei der geeigneten Temperatur 1-3 Stunden lang inkubiert. Der Verdau von DNA mit mehreren Enzymen wird gleichzeitig durchgeführt, wenn die optimalen Salz- und Temperaturbedingungen der getrennten Enzyme ähnlich sind. Wenn diese Bedingungen unterschiedlich genug sind, erfolgen die Verdaus nacheinander, beginnend mit dem Enzym, das die niedrigste Salzkonzentration erfordert. Die anschließenden Reaktionen werden mit den geeigneten Pufferbedingungen für das verwendete Enzym angereichert.

2. Reaktion für glatte Enden

Gelegentlich ist es notwendig, glatte Enden eines Restriktionsfragments vor der Ligation zu erzeugen. Für die Reaktion für glatte Enden wird das Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I verwendet. Das Reaktionsgemisch besteht aus einer Einheit des Klenow-Fragments pro ug DNA, jeweils 50 mM der vier Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0-50 mM NaCl, 5-10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, und wird bei Raumtemperatur (22 ºC) 15-30 Minuten lang inkubiert, um die 5'-Überhänge aufzufüllen oder 2 Stunden lang, um die 3'-Überhänge zu entfernen. Zweckmäßigerweise wird die Reaktion in demselben Reagensglas durchgeführt, in dem die Reaktion mit dem (den) Restriktionsenzym(en) stattfand. In diesen Fällen wird die Salzkonzentration auf eine Endkonzentration von weniger als 50 mM eingestellt. Wenn ein weiterer (weitere) Restriktionsverdau(s) durchgeführt werden soll(en), wird das Klenow-Fragment durch Erhitzen auf 65-70 ºC 10-15 Minuten lang vor der Zugabe des zweiten Restriktionsenzyms inaktiviert.

3. Phosphatase-Reaktionen

Während der Ligation katalysiert die DNA-Ligase die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen benachbarten Nucleotiden nur, wenn ein Nucleotid eine 5'-Phosphatgruppe und die andere eine 3'-Hydroxygruppe enthält. Eine erneute Zirkulierung der Plasmid-DNA kann darum durch Entfernung der 5'-Phosphate von beiden Enden der linearen DNA mit bakterieller alkalischer Phosphatase oder Kälberdarmphosphatase auf ein Minimum beschränkt werden. Deshalb kann kein Strang der Doppelhelix eine Phosphodiesterbindung ausbilden. Jedoch kann ein fremdes DNA-Segment mit 5'-terminalen Phosphaten wirksam mit der dephosphorylierten Plasmid-DNA ligiert werden, so daß sich ein offenes zirkuläres Molekül mit zwei Einzelstrangbruchstellen ergibt. Zirkuläre DNA (sogar zirkuläre DNA mit Einzelstrangbrüchen) transformiert viel wirksamer als lineare Plasmid-DNA. Folglich enthalten die meisten Transformanten rekombinante Plasmide.
Die Phosphatase-Behandlung wird nach den Verdaus mit Restriktionsendonuclease oder nach der Klenow-Behandlung durchgeführt, indem die DNA-haltige Lösung in Tris-HCl, pH 8,4, auf 0,1 M, pH 8,4, gebracht wird, und indem die Lösung mit 0,5 Einheiten alkalischer Kälberdarmphosphatase (CIP) pro Mikrogramm DNA (Boehringer Mannheim Biochemicals) 15 Minuten lang bei 55 ºC inkubiert wird. Die Phosphatase wird durch Erwärmen bei 70 ºC 15 Minuten lang inaktiviert, worauf sich die stufenweisen Extraktionen der DNA-Lösung mit gleichen Volumina Phenol (Phenol, wie hier verwendet, wird vor der Verwendung mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 gesättigt), Phenol:Chloroform (1:1) und Chloroform anschließt. Die DNA wird gefällt und durch Zugabe von Natriumacetat auf eine Endkonzentration von 0,3 M gebracht, worauf sich die Zugabe von zwei Volumina Ethanol anschließt.

4. Ligation

Für die Ligation von DNA-Fragmenten werden T4-DNA-Ligase (Pharmacia, Piscataway, N.J.) und Ligasepuffer (50 mM Tris- HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1,0 mM DTT und 1,0 mM ATP) verwendet. Werden DNAs mit glatten Enden ligiert, wird dem Ligationsgemisch Polyethylenglycol 8000 (PEG 8000) bis zu einer Endkonzentration von 5 % (Gewicht/Volumen) zugegeben. Zwei bis fünf Einheiten des Enzyms werden pro Mikrogramm DNA zugegeben. Die Reaktionsgemische werden bei 16 ºC über Nacht inkubiert.

Gelelektrophorese von DNA

Für die Polyacrylamid-Gelektrophorese von DNA wird Tris- Borat-EDTA (TBE)-Puffer (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD 20877) verwendet, der aus 89 mM Tris und 89 mM Borat (pH 8,3), 2,5 mM Na&sub2;EDTA besteht. Die verwendeten Gele bestehen aus 4,5 % Acrylamid und 0,15 % Bis- Acrylamid, aufgelöst in 100 ml 1 x TDE, enthaltend 25 % Glycerin. Zu dieser Lösung werden 0,05 g Ammoniumpersulfat und 35 ul N,N,N',N'-Tetramethylendiamin (TEMED) gegeben. Die Lösung wird in eine Gelform gegossen. Ein 2-mm-Kamm und Abstandhalter werden im allgemeinen verwendet, und etwa 10-15 ug DNA werden pro Geltasche aufgetragen. Die Elektrophorese wird bei 150-250 Volt in 1 X TBE durchgeführt. Nach der Elektrophorese wird das Gel in einer wäßrigen Lösung von Ethidiumbromid (1 ug/ml) angefärbt, und die DNA wird unter einer UV-Beleuchtungsvorrichtung sichtbar gemacht. Das Gel wird unter Verwendung einer Polaroid-Kamera und eines Polaroid-667-Films (Polaroid Tech. Photo, Cambridge, MA 01239) photographiert.
Die DNA wird aus den Polyacrylamidgelen wie folgt gewonnen: Die gewünschte Bande, die durch das Anfärben mit Ethidiumbromid (EtBr) sichtbar gemacht worden ist, wird aus dem Gel ausgeschnitten, in ein Eppendorf-Gefäß gegeben und mit einem Spatel vermischt. Ein gleiches Volumen Gelelutionspuffer (0,5 M Ammoniumacetat, 14 mM Mg-Acetat, 1 mM EDTA und 0,1 % SDS-Lösung) wird in das Gefäß gegeben und bei 37 ºC über Nacht unter kräftigem Schütteln inkubiert. Am folgenden Tag wird die Flüssigkeit von dem Acrylamid ablaufengelassen, indem sie durch eine 1-ml-Pipettenspitze hindurchgepreßt wird, die einen Stopfen aus Glaswolle enthält. Das Acrylamid wird mit einem zweiten Volumen Gelelutionspuffer gespült, und die Flüssigkeit wird aus der Spitze herausgepreßt, indem ein 1-ml-Pipetman-Pipettiergerät verwendet wird. Die DNA wird sodann durch Zugabe von zwei Volumina Ethanol gefällt und in Trockeneis-Ethanol inkubiert. Die DNA wird durch Zentrifugieren der Probe in der Mikrozentrifuge wie oben 15 Minuten lang bei 4ºC gesammelt. Das Pellet wird sodann mit 70 % Ethanol gespült, unter Vakuum getrocknet und in einem Puffer der Wahl, je nach Art der nächsten Bearbeitungsstufe, resuspendiert.
Die Agarosegelelektrophorese von DNA wird in 0,7- bis 1,2%igen Agarosegelen (je nach Größe der zu analysierenden DNA-Fragmente) unter Verwendung des vorstehend für die Polyacrylamidgele beschriebenen Puffers durchgeführt. Die Elektrophorese wird bei einer Spannung von 50-150 Volt, je nach Menge der DNA pro Spur und der gewünschten Laufzeit durchgeführt. Nach der Elektrophorese wird das Gel mit 1 ug/ml EtBr angefärbt, und die DNA wird unter einer UV-Beleuchtungsvorrichung sichtbar gemacht und wie vorstehend beschrieben photographiert.
DNA wird aus den Agarosegelen gewonnen, indem Agarose, die bei niedriger Temperatur geliert (Sea Plaque Agarose der Firma FMC, Marine Colliods Division, Rockland, ME 04841), verwendet wird. Das Elektrophoreseverfahren ist vorstehend angegeben. Nach dem Sichtbarmachen der DNA von Interesse wird die Bande ausgeschnitten und in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben. Das Röhrchen wird sodann bei -80 ºC 30 Minuten lang eingefroren und dann aufgetaut. Die Agarose wird sodann mit einem Spatel zerquetscht, und die Probe wird in einer Mikrozentrifuge 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird aus dem Röhrchen entfernt, ohne daß das Agarosepellet am Boden des Röhrchen aufgewirbelt wird. Die Probe wird durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol und anschließender 15- bis 30minütiger Inkubation bei -80 ºC gefällt. Die DNA wird durch Zentri-fugieren in einer Mikrozentrifuge für 15 Minuten bei 4 ºC wiedergewonnen. Das DNA-Pellet wird mit 70 % Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert.

Transformation von Bakterienzellen

Die Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA wurde mit kompetenten Zellen vom Bethesda Research Laboratory durchgeführt. Das befolgte Protokoll wird mit den Zellen mitgeliefert.
Die kompetenten Zellen werden aus der Lagerung in einem 80-ºC-Gefrierschrank genommen und auf Eis aufgetaut. Die erforderliche Anzahl von Polypropylen-Röhrchen von 17 x 100-mm (Falcon 2059) werden zur Vorkühlung auf Eis gegeben. Die Zellen werden vorsichtig gemischt, und sodann werden 100-ul-Aliquote in jedes Röhrchen gegeben. Die Ligations-gemische werden fünffach mit Wasser verdünnt, bevor sie zu den Zellen gegeben werden. 2 ul des verdünnten Ligationsgemisches werden zu den Zellen gegeben. Diese werden 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen werden sodann 45 Sekunden lang in einem 42 ºC warmen Wasserbad ohne Schütteln einem Hitzeschock ausgesetzt. Die Zellen werden 2 Minuten lang erneut auf Eis gegeben, bevor 0,9 ml S.O.C.-Medium zugegeben wird. S.O.C.-Medium besteht aus 2 % Bacto-Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgCl&sub2;, MgSO&sub4;, (jeweils 10 mM) und 20 mM Glucose. Die Zellen werden anschließend bei 225 upm bei 37 ºC 1 Stunde lang aufgeschüttelt. Nach dieser Wachstumsperiode werden die Zellen auf LB-Platten ausplattiert, die das geeignete Antibiotikum zur Selektion des transformierten Plasmids enthalten. Im allgemeinen werden mehrere verschiedene Volumina an Zellen pro Platte hinzugegeben (d.h. 1,5, 15 und 150 ul), und die Platten werden sodann bei 37 ºC über Nacht inkubiert, so daß sich Kolonien bilden.
Wenn es notwendig ist, DNA an einer Restriktionsschnittstelle zu spalten, an der die Endonuclease gegenüber einer dam-Methylierung empfindlich ist, wird das Plasmid, das das gewünschte DNA-Fragment enthält, in einen dam&supmin;-Stamm von E. coli angezogen. Der Stamm NS2626 wird in dieser Arbeit verwendet, jedoch kann irgendein üblicher erhältlicher dam&supmin;-Stamm von E. coli verwendet werden. Komptente dam&supmin;-Zellen werden durch Animpfen von 50 ml der LB-Nährlösung mit 100 ul einer über Nacht gewachsenen Kultur erhalten, indem sie bei 37 ºC unter Schütteln inkubiert werden, bis die O.D.&sub6;&sub5;&sub0; 0,250 beträgt, und indem die Zellen anschließend auf Eis auf 0 ºC abgekühlt werden. Die Bakterien werden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 1500 x g geerntet, worauf sich eine Resuspension in 25 ml 100 ml NaCl und eine 30minütige Inkubation auf Eis anschließen. Die Bakterien werden (wie oben) erneut zentrifugiert und in 1 ml 100 mM CaCl&sub2; resuspendiert. Nach 4 Stunden auf Eis werden 200 ul kompetente Zellen entnommen, 1 ug Plasmid-DNA wird zugegeben, und die Zellen werden 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen werden sodann 2 Minuten lang einem Hitzeschock in einem Wasserbad von 42 ºC ohne Schütteln unterzogen. Die Zellen werden vor der Zugabe von 1 ml S.O.C.-Medium wieder 2 Minuten lang auf Eis gegeben. Die Transformationsverfahren sind wie oben beschrieben.

Plasmidisolierung und Reinigung

1. Herstellung im Großmaßstab

Eine über Nacht gewachsene 25-ml-Kultur (oder eine exponentielle wachsende Kultur) der Bakterien, die das gewünschte Plasmid enthalten, wird hergestellt. Dann werden 2 ml der Übernachtkultur in 1 Liter M9CA oder L-Nährlösung (wie beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis T. et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) verdünnt und 16 Stunden lang (über Nacht) bei 37 ºC unter kräftigem Schütteln inkubiert. Die Bakterien werden durch 5minütiges Zentrifugieren bei 400 x g bei 4 ºC gesammelt. Die Pellets werden gut getrocknet und in einem Gesamtvolumen von 36 ml GTE-Puffer [50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl, ph 8 und 10 mM EDTA] resuspendiert. 4 ml 40 mg/ml Lysozym in GTE werden zu der Suspension gegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt. Die Zellsuspension wird auf Eis abgekühlt und 80 ml 0,2 N frisch hergestellte NaOH und 1 % SDS werden unter sanftem Schwenken hinzugegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. 40 ml 3 M Kaliumacetat in 2 M Essigsäure werden hirizugegeben und gut vermischt. Das Gemisch wird sodann 15 Minuten lang auf Eis inkubiert. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren bei 24 000 x g [12 k upm) 15 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand durch 4-5 Schichten eines Mulltuches abfiltriert. Die Nucleinsäuren werden durch Zugabe von 0,6 Volumina Isopropanol gefällt, der resultierende Niederschlag wird durch 10minütiges Zentrifugieren bei 12 000 upm bei 15 ºC gesammelt. Das Pellet wird mit 70 % Ethanol (in TE-Puffer) gewaschen und die DNA wie zuvor erneut pelletiert. Der Nucleinsäureniederschlag wird in 10 ml TE, pH 8, aufgelöst. Nach dem Auflösen der DNA werden 1,0 g CsCl für jeden ml aufgelöster DNA hinzugegeben. 0,32 ml Ethidiumbromid (EtBr) werden zu der DNA-Lösung aus einer Stammlösung von 10 mg/ml (Endkonzentration 600 ug/ml) gegeben. Die Plasmid-DNA wird durch Zentrifugieren bei 65 000 upm mindestens 15 Stunden lang in einem Beckman-70,1-Ti-Rotor oder einer entsprechenden Apparatur bei 20 ºC bandiert. Der Gradient enthält im allgemeinen 3 Banden. Die unterste Bande absorbiert kein Ethidiumbromid, während die beiden oberen Banden den Farbstoff absorbieren. Die weniger dichte oberste Bande, die der chromosomalen DNA entspricht, kann oft kaum gesehen werden. Die Plasmid-Bande, die die unterste der beiden absorbierenden Banden darstellt, wird aus dem Gradienten entfernt, indem die Seiten des Röhrchens unterhalb der Bande mit einer 20er Nadel angestochen und die DNA aus dem Röhrchen herausgezogen wird. EtBr wird durch wiederholte Extraktion der DNA mit 80 % Isopropanol, gesättigt mit NaCl (hergestellt durch Zugabe von 10 ml 50 mM Tis, pH 8,0, 1mM EDTA und 10 ml 5 M NaCl auf 80 ml 2-Propanol), entfernt. Das extrahierte Plasmid wird mit zwei Volumina TE, pH 8,0, verdünnt und die DNA mit zwei Volumina Ethanol bei -20 ºC wenigstens 1 Stunde lang gefällt. Die DNA wird durch 30minütiges Zentrifugieren bei 10 000 x g bei 4 ºC gewonnen. Die DNA wird in TE-Puffer resuspendiert und durch Zugabe von Natriumacetat bis 0,3 M und anschließend von zwei Volumina Ethanol erneut gefällt. Die DNA wird wie oben gewonnen, in TE-Puffer resuspendiert und bei -20 ºC aufbewahrt.

2. Herstellung im kleinen Maßstab

5-ml-Medium, das das entsprechende Antibiotikum enthält, wird mit einer einzigen Bakterienkolonie angeimpft und bei 37 ºC über Nacht unter kräftigem Schütteln inkubiert. 1,5 ml der Kultur werden in ein Eppendorf-Röhrchen gegossen und 20 Sekunden lang in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Das Medium wird durch Absaugen entfernt, wobei das Bakterienpellet so trocken wie möglich zurückbleibt. Eine Wiederholung erfolgt in demselben Röhrchen. Der Rest der Übernachtkultur wird bei 4 ºC aufbewahrt, oder es wird eine Stammplatte von jeder Entnahme auf einer numerierten Matrix hergestellt, um die Identität jeder Kolonie festzustellen. Das Pellet wird durch Verwirbeln in 100 ul einer eiskalten Lösung aus GTE-Puffer, die 4 mg/ml Lysozym (zugegeben zu der Lösung unmittelbar vor Verwendung) enthält, resuspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Deckel des Röhrchens braucht während dieses Zeitraums nicht geschlossen zu werden. Es werden 200 ul einer frisch zubereiteten Lysepufferlösung (0,2 N NaOH und 1 % SDS) zugegeben. Der Deckel des Röhrchens wird verschlossen, und der Inhalt durch rasches Umdrehen des Röhrchens zwei- oder dreimal vermischt. Es wird nicht verwirbelt. Das Röhrchen wird 5 Minuten lang auf Eis gelegt. Es werden 150 ul einer eiskalten Kaliumacetatlösung (pH 4,8) zugegeben, die wie folgt hergestellt wurde. Zu 60 ml 5 M Kaliumacetat werden 11,5 ml Eisessig und 28,5 ml H&sub2;O gegeben. Die resultierende Lösung ist dreimolar bezüglich Kalium und fünfmolar bezüglich Acetat. Der Deckel des Röhrchens wird verschlossen und durch mehrmaliges schnelles Umdrehen des Röhrchens gut vermischt. Es wird 5 Minuten lang auf Eis gelagert. Es wird 5 Minuten lang in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 4 ºC zentrifugiert. Der Überstand wird in ein frisches Röhrchen übergeführt und ein gleiches Volumen Phenol/Chloroform hinzugegeben. Es wird durch Verwirbeln gemischt. Nach dem 2minütigen Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge wird der Überstand in ein frisches Röhrchen übergeführt. Es werden zwei Volumina Ethanol bei Raumtemperatur hinzugegeben. Es wird durch Umdrehen vermischt und 2 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird 5 Minuten lang in einer Eppendorf-Zentrifuge bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Röhrchen in umgekehrter Stellung auf einem Papiertuch stehengelassen, so daß das Ausfließen der gesamten Flüssigkeit möglich ist. Es werden 250 ul 70%iges Ethanol hinzugegeben, kurz vermischt und sodann zentrifugiert. Wiederum wird der gesamte Überstand entfernt, das Pellet kurz in einem Vakuum-Exsikkator getrocknet. Es werden 50 ul TE (pH 8,0), der DNAse freie Pankreas-RNAse (20 ug/ml) enthält, zugegeben und kurz vermischt. 2 ul der Lösung werden in ein frisches Eppendorf-Röhrchen übergeführt. 6 ul Wasser, 1 ul des entsprechenden 10 X Restriktionspuffers und 1 ul des (der) gewünschten Restriktionsenzym(e) werden zugegeben. Es wird 1-2 Stunden lang bei geeigneter Temperatur (37 ºC) inkubiert. Der Rest der Präparation wird bei -20 ºC aufbewahrt. Die DNA-Fragmente werden in dem Restriktionsverdau durch Gelelektrophorese analysiert.

Triparentale Paarung

Um die DNA-Konstruktionen von Interesse in Pflanzen zum Testen ihrer Aktivität einzuschleusen, werden die Konstruktionen des E. coli-Stammes HB101 in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3850 mobilisiert. Der E.-coli-Stamm HB101, der das Plasmid pRK2013 enthält, wird als Helfer bei der Plasmidmobilisierung bei einer triparentalen Paarung verwendet. Jeder Bakterienstamm, HB101 (der das Konstrukt enthält), HB101 (pRK2013) und GV3850, wird getrennt über Nacht in 5 ml Luria-Bertani-(LB)-Nährlösung in Gegenwart des geeigneten selektiven Antibiotikums angezogen. Die Zellen aus den Kulturen werden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 4 000 X g bei 22 ºC geerntet und sodann in 5 ml LB-Nährlösung resuspendiert. Die Paarung wird durch Vermischen von jeweils 100 ul der drei Kulturen in einem 1,5-ml-Eppendof-Zentrifugenröhrchen durch Pipettieren des gesamten Gemisches auf sterile Nitrocellulosescheiben (Millipore-Filter vom HA-Typ) durchgeführt. Jede Nitrocellulosescheibe wird auf 6-8 sterile Filterpapierscheiben Nr. 1 von Whatman gelegt, um überschüssige Flüssigkeit aus der Kultur zu entfernen und dadurch die Bakterien in dem Gemisch zu konzentrieren. Die Nitrocellulosescheiben werden sodann auf LB-Agar in einer 100 mm Petrischale gelegt und etwa 16 Stunden lang bei 30 ºC inkubiert. Nach der Inkubation werden die Bakterien von den Nitrocellulosescheiben in ein steriles 10-ml-Polypropylen-Kulturröhrchen gespült, wobei 1 ml 10 mM MgSO&sub4; verwendet wird. Die Bakterien werden in einer Verdünnungsreihe verdünnt und verschiedene Verdünnungen auf LB-Agar-Platten ausplattiert, die jeweils 100 ug/ml Rifampacin, Spectinomycin und Streptomycin (oder eine andere geeignete Antibiotika-Kombination) enthielten. Nach dreitägiger Inkubation bei 30 ºC werden die resistenten Kolonien ausgewählt, und das Vorliegen der gewünschten Insert-DNA wird durch Southern-Blot-Analyse der PI-Plasmide bestätigt, die aus den einzelnen Kolonien unter Verwendung der Plasmidisolierung in kleinem Maßstab, wie oben beschrieben ist, hergestellt werden.

Transformation von Pflanzen

Die Konstruktionen werden in das pflanzliche Genom über eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens von Tabakblattscheiben mobilisiert. Standard-Asepsistechniken zur Manipulation von sterilen Medien und Reinkulturen von Pflanzen/Bakterien werden einschließlich der Verwendung einer Sterilbank bei allen Übertragungen angewandt. Die eingetopften Tabakpflanzen für die Blattscheibeninfektion werden in einer Wachstumskammer gezogen, die während eines Zyklus von 12 Stunden, 24 ºC Tag, 12 Stunden, 20 ºC Nacht, mit etwa 80 % relativer Feuchtigkeit unter einem Mischlicht von kaltem weißen Fluoreszenzlicht und Glühlicht gehalten werden. Tabakblattscheibeninfektionen werden im wesentlichen durch das Verfahren von Horsch et al. (Horsch, R.B., Fry, S.G., und Fraley, R.T. (1985) Science, 227, 1229-1231) durchgeführt.
Junge Blätter, die nicht voll entfaltet sind und etwa 4-6 in. lang sind, werden mit einem Skalpell von den etwa 4-6 Wochen alten Tabakpflanzen geerntet. Die Blätter werden oberflächlich 30 Minuten lang sterilisiert, indem sie in etwa 500 ml einer Lösung aus 10 % Chlorox, 0,1 % SDS eingetaucht und sodann 3mal mit sterilem deionisiertem Wasser abgespült werden. Blattscheiben eines Durchmessers von 6 mm werden unter Verwendung eines sterilen Papierlochers aus den ganzen Blättern hergestellt.
Die Blattscheiben werden angeimpft, indem sie mehrere Minuten lang in 20 ml einer 1:10 verdünnten Über-Nacht-LB- Flüssigkultur von Agrobacteria eingetaucht werden, die das Plasmid von Interesse enthält. Nach dem Animpfen werden die Blattscheiben in Petrischalen gelegt, die CN-Agarmedium (ein Beutel MS-Salze (Gibco) 30 g Saccharose, 8 g Agar, 0,1 ml 1 mg/ml NAA und 1 ml von 1 mg/ml PAP pro Liter, pH 5,8) enthielten. Die Platten werden mit Parafilm abgedichtet und unter gemischtem Fluoreszenz- und "Gro- und Sho"-Pflanzenlicht (General Electric) 2-3 Tage lang in einem Kulturraum, der bei etwa 25 ºC gehalten wird, inkubiert.
Um Agrobacteria von den Blattscheiben zu entfernen und nach dem Wachstum von transformierten Tabakzellen zu selektieren, werden die Blattscheiben in frisches CN-Medium übergeführt, das 500 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Kanamycin enthält. Cefotaxim wird als gefrorene Stammlösung von 100 mg/ml aufbewahrt und nach dem Autoklavieren aseptisch (filtersterilisiert durch einen 0,45-um-Filter) zu dem Medium gegeben. Eine frische Kanamycin-Stammlösung (50 mg/ml) wird für jede Verwendung bereitet und über ein Filter in das autoklavierte Medium sterilisiert.
Die Blattscheiben werden unter den oben beschriebenen Wachstumsbedingungen 3 Wochen lang inkubiert und anschließend in frische Medien derselben Zusammensetzung übergeführt.
Etwa 1-2 Wochen später werden Keime, die sich aus den Kanamycin-selektierten Explantaten entwickeln, mit einem sterilen Skalpell abgeschnitten und in A-Medium, (ein Beutel MS-Salze (Gibco) 10 g Saccharose und 8 g Agar pro Liter) gepflanzt. Die Keime, die in Kanamycin Wurzeln schlagen, werden in den Boden übertragen und wie oben beschrieben in der Wachstumskammer angezogen.

Isolierung pflanzlicher RNA

Zur Analyse der Expression der in Pflanzen über Blattscheiben-Animpfverfahren transformierten DNA wird RNA aus der Pflanze isoliert und auf das Vorliegen spezifischer RNA-Transcripte getestet, für die die Transformations-DNA kodiert. Nach dem Eintopfen in Erde und nachdem die Pflanzen etwa bis Blattstadium 10 gewachsen sind, wird 1 g Blattgewebe von jeder Pflanze geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das gefrorene Blattgewebe wird in einem Mörser mit Pistill gemahlen und sodann in 4 ml Proteinase-K-Lösung (250 ug pro ml Proteinase-K in 50 mM Tris-HCl, pH 9,0, 10 mM EDTA und 2 % SDS) 10 Minuten bei 50 ºC verdaut. Die Lösung wird sodann 2mal mit gleichen Volumina Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert, und die Nucleinsäuren werden aus der wäßrigen Phase mit 6 Volumina Isopropanol in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat gefällt. Nach einer Inkubation über Nacht bei -20 ºC werden die Nucleinsäuren durch Zentrifugieren bei 12 000 x g gesammelt, und der pelletisierte Niederschlag wird in 1,5 ml H&sub2;O resuspendiert. Die RNA wird selektiv von der DNA ausgefällt, indem 0,5 ml 8 M LiCl zugegeben werden und 2 Stunden lang auf Eis inkubiert wird. Der Niederschlag wird durch 20minütiges Zentrifugieren bei 4 ºC bei 12 000 x g gesammelt, in H&sub2;O resuspendiert und erneut wie oben mit derselben Konzentration von LiCl ausgefällt. Die RNA wird sodann in H&sub2;O resuspendiert und durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 6,0, und 2,5 Volumina Ethanol sowie Inkubation bei -20 ºC für mehr als 4 Stunden ausgefällt.

RNAse-Schutzanalyse

Ein RNAse-Schutzverfahren [Zinn et al., Cell 34, 865-879 1983, Melton et al., Nucleic Acids Res.12, 7035-7056 (1984)] wird verwendet, um die Botschaft von Haferphytochrom in der RNA, die aus den transformierten Pflanzen isoliert worden ist, nachzuweisen. Ein 800-bp-DNA-Fragment, das die Startstelle der Transcription des chimären Phytochromgens überlappt und stromabwärts in die kodierende Region des Phytochromgens übergeht, wird in pGEM3 (Pomega Biotec) in einer solchen Orientierung kloniert, daß die SP6 RNA-Polymerase ein Transcript erzeugt, das zu der Botschaft von Haferphytochrom komplementär ist. Nach der Hybridisierung zwischen Sonde und RNA, die aus den transformierten Pflanzen isoliert worden ist, entfernt eine anschließende RNAse-Behandlung jede nicht hybridisierende RNA und läßt nur hybridisierte doppelsträngige RNA zurück. Die geschützte Region kann durch Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Die Ribo-Sonde wird unter Verwendung von SP6-RNA- Polymerase und eines Promega Biotec-Kit, wie vom Hersteller beschrieben, in Gegenwart von [³²P] UTP (> 3 000 Ci/mM) erzeugt. 50 ug Gesamt-RNA aus den transformierten und den Kontrollpflanzen (hergestellt, wie oben beschrieben) werden mit 1 x 10&sup6; cpm Ribo-Sonde vermischt und 16 Stunden lang bei 45,5 ºC in 30 ul in einer Lösung vermischt, die 400 mM PIPES (pH 6,4), 40 mM NaCl und 80 % Formamid enthält. Die resultierenden Hybride werden 30 Minuten lang bei 30 ºC mit RNAse verdaut, indem 350 ul Lösung hinzugegeben werden, die 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 40 ug/ml RNAse A und 2 ug/ml RNAse T1 enthält. Nach der Inkubation wird die RNAse durch Zugabe von SDS bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % und durch 30minütige Behandlung mit 50 ug Proteinase K bei 37 ºC zerstört. Die RNAse- und Proteinase-K-behandelten Hybride werden sodann mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) extrahiert und mit 2,5 Volumina Ethanol gefällt. Die RNA-Proben werden auf einem 4,5%igem Acrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthält, analysiert.

Proteinanalyse

Die Gegenwart einer Avena-Phytochromexpression in den transformierten Pflanzen kann auch mit Hilfe des Proteinniveaus beurteilt werden, indem das Avena-Protein mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen wird, oder kann bewertet werden, indem die Zunahmen in der spektralen Gesamtphytochromaktivität im Dunkeln und in Licht getestet werden. Phytochromprotein-Niveaus wurden unter Verwendung eines Immunblot-Verfahrens bestimmt, wobei entweder monoklonale oder polyklonale Antiphytochrom-Antikörper [beschrieben bei Shanklin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 359-363 (1987)] verwendet wurden. In Kaninchen wurden polyklonale Antikörper gegen hochgereinigtes Avena- Phytochrom erzeugt und sodann unter Verwendung einer Affi- Gel-10-Säule, die immobilisiertes Avena-Phytochrom enthielt, gereinigt. Die Proteine wurden aus dem gefrorenen Gewebe durch Homogenisieren bei 4 ºC 30 Sekunden lang in einer Lösung von 50 % Ethylenglycol, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 140 mM Ammoniumsulfat, 20 mM Natriummetabisulfit, 10 mM EDTA und frisch zugegebenem 4 M Phenylmethylsulfonylfluorid (Puffer A) homogenisiert. Der Extrakt wurde zu Polyethylenimin durch Zugabe einer 10%igen Lösung (Gew./Vol.) (pH 7,8) auf 0,1 % (Gew./Vol.) gebracht, 5 Minuten lang gerührt und bei 50 000 x g 20 Minuten lang geklärt. Die Proteinkonzentration des Überstandes wurde unter Verwendung des Reagens für den Bradford-Proteintest (Biorad) bestimmt. Volumina von jedem Extrakt, der 35 ug Protein enthielt, wurden 1:1 (Vol./Vol.) mit einer Lösung von 10 % Glycerin, 3 % SDS, 0,25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,2 mg/ml Bromphenolblau vermischt, mit 0,7 M β-Mercaptoethanol 3 Minuten lang gekocht und auf einem 7 % SDS-Polyacrylamidgel laufen gelassen. Nach der SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese wurden die Proteine elektrophoretisch auf Nitrocellulose (HAHY 304 FO, Millipore) übertragen. Die immunreaktiven Phytochrombanden wurden colorimetrisch unter Verwendung von Kaninchen-Antiphytochrom-Immunglobulinen in Verbindung mit alkalischen Phosphatase-konjugierten Ziegen- IgGs, die gegen Kaninchen-Immunglobuline gerichtet waren, und den Phosphatasesubstraten Nitroblau-Tetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat sichtbar gemacht.
Die Spektralanalyse der Phytochromaktivität wurde unter Verwendung von Proteinen durchgeführt, die wie vorstehend beschrieben zur Immunblotanalyse extrahiert worden waren, außer daß das Phytochrom nach der Zugabe von Polyethylenimin und Klärung durch Zentrifugieren durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 250 mg/ml ausgefällt wurde und durch Zentrifugieren bei 50 000 x g wie vorstehend beschrieben gesammelt wurde. Das Pellet wurde in einem halb so starken Puffer A (oben angegeben) resuspendiert, der 14 mM β-Mercaptoethanol anstelle von Natriummetabisulfit enthielt. Die spektrale Mengenbestimmung von Phytochrom wurde in diesem Puffer unter Anwendung einer Zwei-Wellenlängen-Spektroskopie (A&sub7;&sub3;&sub0;/A&sub6;&sub6;&sub6;) und anschließender sättigender Bestrahlungen im Rot- oder Dunkelrot-Bereich durchgeführt, wobei ein Shimadzu UV3000- Spektrophotometer verwendet wurde. Der Extinktionskoeffizient von 1,2 x 10&sup5; Liter/mol/cm für Pr und ein Photogleichgewicht von 86 % Pfr in Rotlicht wurden für alle Berechnungen des Phytochromgehaltes verwendet.
Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen beschrieben, in denen sich alle Teile und Prozentangaben auf das Gewicht beziehen, und die Grade in ºC angegeben sind, wenn nicht anderweitig angegeben. Selbstverständlich sind diese Beispiele, obschon sie die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung angeben, nur zur Erläuterung bestimmt. Aus der obigen Beschreibung und aus diesen Beispielen kann ein Fachmann die wesentlichen Eigenschaften der Erfindung, ohne von deren Geist und Umfang abzuweichen, herausfinden und verschiedene Änderungen und Modifikationen der Erfindung durchführen, um sie an verschiedene Anwendungen und Bedingungen anzupassen.

BEISPIEL 1

Konstruktion der Plasmide pGP8.2-21, pGP8.2-22, pCV5, pCV5B und CV5B3 zur Erlangung eines DNA-Konstrukts, das eine ununterbrochene kodierende Region für Phytochrom enthält

Die Plasmide pAP3.1, pGP2.4-1, pGP8.2-1 und pGP8.2-2 wurden von Hershey et al. [Nucl. Acids Res., 13: 8543-8559 (1985)] und Hershey et al. [Gene 61: 339-348 (1987)] beschrieben und wurden am 27. Mai 1988 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD 20852-1776 deponiert. Plasmid pAP3.1 trägt die ATCC-Zugangsnummer 67713, pGP2.4-1 trägt die ATCC-Zugangsnummer 67715, pGP8.2-1 trägt die ATCC-Zugangsnummer 67714, und pGP8.2-2 trägt die ATCC- Zugangsnummer 67716. Sequenzen aus genomischen Hafterphytochromklonen pGP8.2-1, pGp8.2-2 und pGP2.4-1 und dem cDNA-Klon pAP3.1 wurden zur Erzeugung eines chimären Gens verwendet, das 1 kbp der 5'-Promotorsequenz des Phytochromgens vom Typ 3, einen 5'-nichttranslatierten Leader, eine ununterbrochene kodierende Region, bestehend aus den zwei kodierenden Phytochromsequenzen Typ 3 und 4, und 1 kbp der 3'-flankierenden Sequenz der Avena-Phytochromgene vom Typ 4 enthielt.
Der 5'-transcribierte Teil des Phytochromgens vom Typ 3 wurde durch Spalten von 2,5 ug pGP8.2-2 mit Xba I, Eco RI und Pst I in einem Hochsalzpuffer erhalten. Xba I schneidet einen Teil des pGp8.2-2-Plasmids, das nicht kloniert und beim Verdau verwendet wurde, um die Anzahl von Klonen zu verringern, die unerwünschte Inserts enthielten. Der Verdau ergab die 5'-transcribierte Region, die auf einem 2,56-kbp-Fragment vorhanden war. Die Produkte des Verdaus von pGP8.2-2 wurden 1:1 (Gewicht:Gewicht) mit dem Vektor pUC18 vermischt, der vollständig mit Eco RI und Pst I verdaut worden war. Nach der Behandlung mit Ligase über Nacht wurde das Gemisch verwendet, um E. coli JM107 zu transformieren. Transformierte Bakterien wurden auf LB-Agarplatten, die 5-Dibrom-4-chlor-3-indolyl-1-galactosid (X-gal) und Isopropylthiogalactosid (IPTG) enthielten, ausplattiert. Die Plasmid-DNA wurde aus weißen Kolonien unter Verwendung eines Plasmid-DNA-Isolierungsverfahren für den kleinen Maßstab hergestellt. Dies wurde erreicht, indem 5-ml-Aliquote LB-Medium, das das geeignete Antibiotikum (Ampicillin) enthielt, mit einzelnen Bakterienkolonien angeimpft wurden. Nach einer Inkubation bei 37 ºC unter kräftigem Schütteln über Nacht wurden 1,5 ml von jeder Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegossen. Die Röhrchen wurden 20 Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, und die Medien wurden durch Absaugen entfernt, wobei die Bakterienpellets so trocken wie möglich zurückblieben. Weitere 1,5 ml der Kultur wurden zu dem Röhrchen gegeben, und die obigen Stufen wurden wiederholt. Die Pellets wurden in 100 ul einer eiskalten GTE-Pufferlösung (50 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0) mit 5 mg/ml Lysozym (zugegeben zu der Lösung unmittelbar vor der Verwendung) unter Verwirbeln resuspendiert. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wurden 200 ul frisch hergestellte Lösung von Lysepuffer (0,2 M NaOH und 1 % SDS) zu dem Röhrchen gegeben und der Inhalt durch 2- bis 3maliges schnelles Umdrehen vermischt. Die Röhrchen wurden 5 Minuten lang auf Eis gestellt, anschließend erfolgte die Zugabe von 150 ul einer eiskalten Kaliumacetatlösung, pH 4,8, (hergestellt durch Zugabe von 11,5 ml Eisessig und 28,5 ml H&sub2;O zu 60 ml 5 M Kaliumacetat). Der Inhalt wurde durch mehrmaliges kräftiges Umdrehen der Röhrchen vermischt. Nach 5 Minuten auf Eis wurden die Röhrchen 5 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge bei 4 ºC zentrifugiert. Die Überstände wurden in frische Röhrchen übergeführt, und ein gleiches Volumen von Phenol/Chloroform wurde jeweils unter Mischen hinzugegeben. Die resultierenden Emulsionen wurden 2 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, und die Überstände wurden in frische Röhrchen übergeführt. Zwei Volumina Ethanol wurden zugegeben und der Inhalt der Röhrchen gut vermischt. Nach 2 Minuten bei Raumtemperatur wurde die DNA durch 5minütiges Zentrifugieren bei Umgebungstemperatur in einer Mikrozentrifuge gesammelt. Die Überstände wurden verworfen, und die Röhrchen in umgekehrter Stellung auf einem Papiertuch stehen gelassen, so daß ein Abfließen der gesamten Flüssigkeit möglich war. Die Pellets wurden mit 250 ul 70 % Ethanol gewaschen, und die Röhrchen wurden anschließend erneut zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen, und die Pellets kurz in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Die rohen Plasmid-DNAs wurden in 50 ul TE, pH 8,0, aufgelöst und durch einen geeigneten Restriktionsenzymverdau analysiert, bis ein Plasmid identifiziert wurde, das das gewünschte Insert enthielt. Dieses Plasmid wurde als pGP8.2-21 bezeichnet (siehe Figur 2).
10 ug pGP8.2-21 wurden teilweise mit der Restriktionsendonuclease Acc I verdaut, wobei 0,8 Einheiten des Enzyms pro ug DNA 5, 10, 15 und 20 Minuten lang bei 37 ºC eingesetzt wurden. Unter diesen Bedingungen des Verdaus war von allen Zeitpunkten teilweise verdaute DNA vorhanden, so daß die DNA von allen Zeitpunkten zur anschließenden Verarbeitung vereinigt wurde. Der 5'-Überhang der Acc I-Schnittstelle wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 10 X Klenow-Salzen (0,5 M Tris-HCl, pH 7,2 oder pH 7,5, 0,1 M MgSO&sub4;, 10 mM DTT), 1/20 Volumen 5 mM Desoxynucleotidtriphosphat-Gemisch (alle 4 dNTPs) und von einer Einheit Klenow-Fragment der DNA-Polymerase-I pro ug DNA aufgefüllt. Das aufgefüllte Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Die resultierende DNA mit glatten Enden wurde mit Pst I gespalten und mit dem Vektor pUC18 ligiert, der vollständig mit Pst I und Hind III verdaut worden war. Ein Aliquot des Ligationsgemisches wurde zur Transformation von E.-coli-JM107 verwendet. Aliquote des Transformationsgemisches wurden auf LB-Agar plus X-gal und IPTG ausplattiert, und einzelne Plasmide von weißen Kolonien wurden analysiert, bis eines identifiziert wurde, das das gewünschte 1,9-kbp-Insert enthielt. Das resultierende Plasmid, das als pGP8.2-22 bezeichnet wurde, enthielt 1,9 kbp des Phytochromgens einschließlich 38 bp der 5'-nichttranslatierten Sequenz und 1,86 kb der proteinkodierenden Sequenz (siehe Figur 3).
Eine Region des Phytochromgens vom Typ 3, die die Stelle des Transcriptionsstartes enthielt, die ersten 85 bp der 5'-nichttranslatierten Leadersequenz und 1 kbp der stromaufwärtigen Promotorsequenz wurden durch vollständigen Verdau von 10 ug des Plasmids pGP8.2-1 mit Kpn I in einem Niedrigsalzpuffer erhalten. Der 3'-Überhang der Kpn-I-Stelle wurde durch 2stündige Inkubation der DNA mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase-I unter Verwendung der zuvor in diesem Beispiel beschriebenen Reaktionsbedingungen mit glatten Enden versehen. Die Polymerase wurde hitzeinaktiviert, und die DNA mit den glatten Enden wurde vollständig mit Hind III verdaut. Die resultierende DNA wurde in einem 1:1 (Gew./Gew.) Verhältnis mit pUC18 ligiert, der mit Hind II und Hind III gespalten worden war. E. coli-JM107 wurde mit einem Aliquot der Ligation transformiert und auf LB-Agar, der X-gal und IPTG enthielt, transformiert. Weiße Kolonien wurden von den Transformationsplatten analysiert, und ein Plasmid, das pJ-I genannt wurde und den 1,1 kbp-Promotor von pGP8.2-1 enthielt, wurde erhalten. Das Ergebnis dieses Klonierungsschrittes bestand in der Addition der Restriktionsenzym- Erkennungsstellen aus dem pUC18-Polylinker zum Ende des 1,1-kbp-Fragments, wodurch viele dieser Polylinkerstellen in pUC18 bei den anschließenden Klonierungsschritten zugänglich gemacht wurden. Das Plasmid pJ-I wurde mit Xba I und Hind III gespalten, und die 1,1-kbp-Promotorregion wurde in den Klonierungsvektor pMSPrK (hinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, 10852 am 8. Juni 1968, ATCC-Hinterlegungsnummer 67723) religiert, der vollständig mit Xba I und Hind III in einem Hochsalzpuffer verdaut worden war. pMSPrK ist ein Plasmidvektor, der den pUC19-Polylinker, den pBR-322-Ursprung der Replikation, eine Sequenz für Spectinomycin/Streptomycin (spec/strep)-Resistenz und die Neomycin- Phosphotransferase-II (NPT II) kodierende Sequenz enthält, die von der stromaufwärts gelegenen Promotorregion und dem stromabwärts gelegenen Polyadenylierungssignal aus dem Blumenkohlmosaikvirus-35-S-Transcript als Selektionsmarker für Pflanzen (siehe Figur 4) eingerahmt wurde. Ein Aliquot des Ligationsgemisches wurde verwendet, um E. coli-HB101 zu transformieren, und die einzelnen spec/strep-resistenten Kolonien wurden analysiert, bis ein Plasmid identifiziert wurde, das den Vektor mit dem gewünschten 1,1-kbp-Insert enthielt. Das Plasmid wurde als pCV5 (siehe Figur 4) bezeichnet.
Die Plasmide pCV5 (1,5 ug und pGp8.2-22 (3 ug) wurden beide vollständig mit Pst I und Xba I verdaut, und 1/10 der DNA aus jedem Verdau wurde in Ligationspuffer vermischt und über Nacht bei 16 ºC ligiert. Ein Aliquot des Ligationsgemisches wurde zur Transformation von E. coli-HB101 verwendet, und einzelne spec/strep-resistente Kolonien wurden anaylsiert, bis ein Plasmid identifiziert wurde, das das gewünschte 1,9-Kbp-Pst-I-Xba-I-Fragment aus pGP8.2-22 enthielt, das in pCV5 inseriert war (siehe Figur 5). Dieses Plasmid wurde als pCV5-8.2 bezeichnet.
pCV5-8.2 und pAP3.1 (jeweils 5 ug) wurden vollständig mit dem Restriktionsenzym Eco RV in Hochsalzpuffer verdaut. pCV5-8.2 wurde sodann dephosphoryliert, indem der Restriktionsverdau in Tris-HCl, pH 8,4, auf 0,1 M gebracht wurde, und die DNA mit 0,5 Einheiten alkalischer Kälberdarmphosphatase (CIP) pro ug DNA (Boehringer Mannheim Biochemicals) bei 55 ºC 30 Minuten lang inkubiert wurde.
Die Phosphatase wurde durch sequentielle Extraktionen der DNA-Lösung mit gleichen Volumina Phenol (Phenol, wie hier verwendet, wird vor der Verwendung mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, gesättigt), Phenol:Chloroform (1:2) und Chloroform inaktiviert. Die DNA wurde durch Zugabe von Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M und durch anschließende Zugabe von 2 Volumina Ethanol gefällt. Nach dem Zentrifugieren und Resuspendieren von Eco-RV-verdautem und dephosphoryliertem pCV5-8.2 wurden 0,5 ug sowohl dieser DNA als auch von Eco-RV-verdautem pAP3.1 vermischt und ligiert. Ein Aliquot dieses Ligationsgemisches wurde zur Transformation von E.-coli-HB101 verwendet, und einzelne spec/strep-resistente Kolonien wurden analysiert, bis ein Plasmid identifiziert wurde, das das gewünschte 3,0-kbp- Eco-RV-Fragment aus pAP3.1 (das die Hauptmasse der für Phytochromprotein kodierenden Region und einen Teil der pBR322-Plasmid-DNA enthielt) in pCV5-8.2 enthielt. Dieses Plasmid wurde als pCV5B bezeichnet (siehe Figur 6).
pCV5B (5 ug) wurde teilweise mit der Restriktionsendonuclease Xba I in Hochsalzpuffer verdaut, wobei 20 Einheiten Enzym pro ug DNA bei 37 ºC verwendet wurden. Aliquote wurden nach 10, 15, 20, 25 und 30 Minuten Verdau abgenommen und durch Zugabe von 1 ul 0,5 M EDTA, pH 8, zu jedem Aliquot gestoppt. Die Zeitpunkte 10, 15 und 20 Minuten wiesen meistens linearisiertes Plasmid auf, so daß sie vereinigt und mit Methanol gefällt wurden. Die resultierende DNA wurde vollständig mit Eco RI verdaut. 10 ug Plasmid pGp2.4-1 wurde vollständig mit Xba I und Eco RI verdaut und auf einem präparativen 4,5%igen Acrylamidgel laufengelassen. Eine 1,7-kbp-Bande, die die Sequenzinformation für die C-terminale kodierende Region, das promotordistale Intron und die 3'-Prozessierungssignale aus dem Phytochromgen vom Typ 4 enthielt, wurde aus dem Gel gewonnen, indem es zunächst mit Ethidiumbromid angefärbt wurde, um die DNA sichtbar zu machen. Ein Gelstück, das das gewünschte 1,7-kbp-Fragment enthielt, wurde mit einer Rasierklinge ausgeschnitten und mit einem Spatel zerdrückt. Die DNA wurde aus dem Gelfragment durch Suspendieren der zerdrückten Gelstücke in 400 ul Elutionspuffer (1,25 mM Ammoniumacetat, 1,5 mM Magnesiumacetat, 0,25 mM EDTA und 0,1 % SDS) und Schütteln der resultierenden Aufschlämmung über Nacht bei 37 ºC eluiert. Die Gelfragmente wurden durch Filtration über Glaswolle aus der Aufschlämmung entfernt, und die DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen. Das eluierte 1,7-Kbp-Eco-RI-Xba-I-Fragment wurde in 10 ul TE resupendiert, und 1 ul wurde mit 0,25 ug der verdauten pCV5B-DNA in einem 20-ul-Ligationsgemisch ligiert. 1 ul des Ligationsgemisches wurde zur Transformation von E.-coli- HB101 verwendet. Einzelne spec/strep-resistente Kolonien wurden analysiert, bis ein Plasmid identifiziert wurde, das das 1,7-Kbp-Xba-I-Eco-RI-Fragment von pGp2.4-1, inseriert an der korrekten Xba-I-Schnittstelle in pCV5B, enthielt (siehe Figur 7). Das resultierende Plasmid wurde pCV5B3 genannt und enthält eine vollständige für Phytochrom kodierende Region und jeweils 1 Kbp von der 5'- und 3'-Sequenz der Phytochromgene.

Beispiel 2

Konstruktion des Plasmids pCV35phyt

Das Plasmid pCV35phyt wurde durch Entfernen des Phytochrompromotors aus dem pCV5B3-Plasmid und durch Ersetzen mit DNA aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) zwischen den Nucleotiden 6493 und 7454 konstruiert. Diese Sequenz enthält die Promotoraktivität für das 35-S-Transcript in CaMV [Odell et al., Nature 313: 810-812 (1985)] und wird als 35-S-Promotor bezeichnet. Sie ist zwischen den Hind-III- und Eco-RI-Restriktionsendonuclease-Schnittstellen im Plasmid pUC35K (hinterlegt am 7. Januar 1987 bei der American Type Cuture Collection (ATCC), Rockville, MD, 10852-1776, ATCC-Hinterlegungsnummer 67285) enthalten. Das Plasmid pUC35K (10 ug) wurde mit Hind III vollständig verdaut, die 5'-überhängenden Enden wurden mit dem Klenow- Fragment, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgefüllt. Das resultierende Fragment mit glatten Enden wurde vollständig mit Eco RI verdaut, auf einem 4,5%igen Acrylamidgel laufengelassen, und ein 960 bp-Fragment, das den 35-S-Promotor enthielt, wurde gereinigt. Der 35-S-Promotor wurde in den Klonierungsvektor pMSPKN inseriert (hinterlegt am 8. Juni 1988, bei der ATCC (Hinterlegungsnummer 67722)), der analog zu pMSPrK ist, außer daß der 35-S-Promotor und die Polyadenylierungssignale, die mit der NPT-II-kodierenden Sequenz in pMSrK zweckorientiert verknüpft sind, durch den Nopalin-Synthasepromotor und die Polyadenylierungssignale im pMSPKN ersetzt sind. pMSPKN wurde zur Vermeidung irgendeiner potentiellen internen homologen Rekombination, die zwischen dem 35-S-Promotor des NPT II-Gens in pMSPrK und dem 35-S-Promotor, der mit der Phytochrom-kodierenden Region verknüpft ist, auftreten könnte, verwendet. Jeder Klonierungsvektor, der für die oben dargestellten Klonierungsschritte geeignete Restriktionsschnittstellen und entweder die pBR322-Sequenzen oder die Sequenzen zur autonomen Replikation in Agrobacterium tumefaciens enthält, kann anstelle von pMSPKN verwendet werden. Der Klonierungsvektor wurde zur Insertion des 35-S-Promotorfragments durch vollständigen Verdau von 5 ug davon mit Kpn I vorbereitet. Der resultierende 3'-Überhang wurde, wie für die Kpn-I- Schnittstellen in Beispiel 1 beschrieben, mit glatten Enden versehen, und die resultierende DNA wurde vollständig mit Eco RI (siehe Figur 8) verdaut, mit Phosphatase behandelt und in 1/10 des Volumens des gelgereinigten 35-S-Fragments in einem 20 ul Ligationsgemisch, das 5 % PEG enthielt, ligiert. Die einzelnen Plasmide wurden analysiert, bis eines identifiziert wurde, das den 35-S-Promotor in pMSPKN enthielt. Die resultierende Konstruktion wird pCV35P genannt.
pCV5B3 (10 ug) und pCV35P (5 ug) wurden beide vollständig mit Xba I in einem Hochsalzpuffer gespalten. pCV35B wurde sodann mit Phosphatase behandelt, und 0,1 ug der resultierenden DNA wurde gemischt und mit 0,2 ug der verdauten pCV5B3-DNA ligiert. 1 ul der Ligation wurde zur Transformation von E.-coli-HB101 verwendet. Einzelne spec/strepresistente Kolonien wurden analysiert, bis ein Plasmid gefunden wurde, das das große (2,8 kbp) Promotor-proximale Xba-I-Fragment aus pCV5B3 in einer solchen Orientierung enthielt, so daß der 35-S-Promotor die Transcription des Phytochrom-kodierenden Stranges steuert. Das resultierende Plasmid wird pCV35phytA genannt (siehe Figur 9).
Um nichtmethylierte DNA und eine Bcl-I-Schnittstelle in dem Phytochrom-Geninsert, das einer Spaltung zugänglich ist, zu erhalten, wurde das pCV35phytA-Plasmid in einen dam&supmin;-E. coli-Stamm transformiert. NS26262 wurde bei dieser Arbeit verwendet, jedoch kann jeder allgemein verfügbare dam&supmin;Stamm von E. coli verwendet werden, um die Erfindung zu erzielen. Kompetente dam&supmin;-Zellen wurden hergestellt, indem 50 ml LB-Nährlösung mit 100 ul einer Über-Nacht-Kultur von NS2626 angeimpft wurden und die Kultur bei 37 ºC unter Schütteln inkubiert wurde, bis sie die O.D.650 von 0,25 erreichte. Die Zellen wurden auf Eis auf 0 ºC gekühlt, und die Bakterien durch 10minütiges Zentrifugieren bei 1 500 x g geerntet, in 25 ml 100 mM CaCl&sub2; resuspendiert und auf Eis 30 Minuten lang inkubiert. Die Bakterien wurden wie oben zentrifugiert, in 1 ml 100 mM CaCl&sub2; resuspendiert und auf Eis gestellt. Nach 4 Stunden auf Eis wurden 200 ul der kompetenten Zellen entfernt, die Transformations-DNA wurde zugegeben, und die Zellen wurden 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Das Transformationsgemisch wurde 2 Minuten lang in einem 42 ºC Wasserbad ohne Schütteln einem Hitzeschock unterzogen. Die Zellen wurden wieder für 2 Minuten auf Eis gestellt, bevor 1 ml S.O.C.-Medium zugegeben wurde. Die Transformation verlief dann weiter wie in Beispiel 1 beschrieben. 20 ug unmethyliertes pCV35phytA wurde vollständig mit Sal I in hoher Salzkonzentration verdaut und anschließend mit Ethanol gefällt. Die resultierende Plasmid-DNA wurde aufgrund einer Bcl-I-Schnittstelle in dem spec/strepr-Teil des Klonierungsvektors teilweise mit Bcl I verdaut. Hierzu wurde das Pellet in 100 ul resuspendiert und 5 Minuten lang mit 18,2 Einheiten Bcl I bei 37 ºC verdaut, wobei die vom Hersteller des Enzyms beschriebenen Salzbedingungen angewendet wurden. pCV5B3 wurde ebenfalls in NS2626 transformiert, und die unmethylierte Form des Plasmids wurde vollständig mit Bcl I und Sal I verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Elektrophorese in einem 0,8%igen niedrigschmelzenden Agarosegel aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid angefärbt, und ein Stück Agarose, das das gewünschte 2,5-kbp-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde anschließend bei -80 ºC 30 Minuten lang eingefroren und aufgetaut. Die Agarose wurde anschließend mit einem Spatel zerdrückt und das Röhrchen in einer Mikrozentrifuge 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde aus dem Röhrchen ohne Aufwirbeln des Agarosepellets am Boden des Röhrchens entfernt. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol und anschließender 15- bis 30minütiger Inkubation bei -80 ºC gefällt. Die DNA wurde erneut durch 15minütiges Zentrifugieren in einer Mikro-zentrifuge bei 4 ºC gewonnen. Das DNA-Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Die resultierende pCV5B3-DNA wurde mit der pCV35P-DNA ligiert, die teilweise mit Bcl I und vollständig mit Sal I verdaut worden war. Ein Aliquot des Ligationsgemisches wurde verwendet, um E.-coli-HB101 zu transformieren. Einzelne Plasmide wurden analysiert, bis eines identifiziert wurde, das das gewünschte 2,5-kbp-Bcl-I-Sal-I-Fragment aufgenommen hatte, das das 3'-Ende des Phytochromgens aus pCV5B3 enthielt, das an der Bcl I-Schnittstelle innerhalb der Phytochrom-kodierenden Sequenz in pCV35P inseriert worden war (siehe Figur 10). Das resultierende Plasmid wurde pCV35phyt genannt und enthält die vollständige Phytochrom-kodierende Sequenz für pCV5B3, die zweckorientiert mit dem 35-S-Blumenkohlmosaikpromotor verknüpft ist.

BEISPIEL 3

Überexpression von Phytochrom in transgenem Tabak

pCV35phyt wurde aus E.-coli-HB101 in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3850 durch die triparentale Paarungstechnik mobilisiert. Der E.-coli-Stamm HB101, der das Plasmid pRK2013 enthielt, wurde als Helfer für die Plasmidmobilisierung während der triparentalen Paarung verwendet. Jeder Bakterienstamm, HB101, der das pCV35phyt-Konstrukt enthielt, Hb101, der pRK2013 enthielt, und GV3850 wurden über Nacht in getrennten Luria-Bertani-(LB)-Nährlösungskulturen von 5 ml in Gegenwart des geeigneten selektiven Antibiotikums gezogen. Die Zellen aus den Kulturen wurden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 4 000 x g bei 22 ºC geerntet und sodann in 5 ml LB-Nährlösung resuspendiert. Die Paarung wurde durchgeführt, indem jeweils 100 ul der drei Kulturen in einem 1,5-ml-Eppendorf-Zentrifugenröhrchen vermischt wurden, und das Gesamtgemisch auf sterile Nitrocellulosescheiben (Filter vom Typ Millipore HA) pipettiert wurde. Jede Nitrocellulosescheibe wurde auf 6-8 sterile Filterpapierscheiben Nummer 1 von Whatman gegeben, um überschüssige Flüssigkeit von der Kultur zu entfernen und dadurch die Bakterien in dem Gemisch zu konzentrieren. Die Nitrocellulosescheiben wurden sodann auf LB-Agar in eine 100 ml Petrischale gegeben und etwa 16 Stunden bei 30 ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Bakterien aus den Nitrocellulosescheiben in ein steriles 4-ml-Polypropylen- Kulturröhrchen gespült, wobei 1 ml 10 mM MgSO&sub4; verwendet wurde. Die Bakterien wurden in einer Verdünnungsreihe verdünnt, und verschiedene Verdünnungen wurden auf LB-Agarplatten ausplattiert, die jeweils 100 ug/ml Rifampacin, Spectinomycin und Streptomycin enthielten. Nach 3tägiger Inkubation bei 30 ºC wurden die resistenten Kolonien, die auf den Platten wuchsen, ausgewählt, und das Vorliegen der gewünschten Insert-DNA wurde durch Southern Blot Analyse der Ti-Plasmide bestätigt, die aus den einzelnen Kolonien hergestellt worden waren, indem die in Beispiel 1 beschriebene Plasmid-Isolierung im kleinen Maßstab angewendet wurde. Eine Bakterienkolonie, die die pCV35phyt-Konstruktion in ihrem Ti-Plasmid enthielt, wurde identifiziert und als GV3850-35phyt bezeichnet.
Das chimäre 35-S-Promotor/Phytochromgen wurde in das pflanzliche Genom über eine Agrobacterium-tumefaciens- Infektion von Tabakblattscheiben unter Verwendung von GV3850-35phyt mobilisiert. Aseptische Standardtechniken zur Manipulation der sterilen Medien und Reinkulturen von Pflanzen/Bakterien wurden befolgt, einschließlich der Verwendung einer Sterilbank für sämtliche Übertragungen. Eingetopfte Tabakpflanzen für die Blattscheibeninfektionen wurden in einer Wachstumskammer, die bei einem Zyklus von 12 Stunden, 24 ºC Tag, 12 Stunden, 20 ºC Nacht gehalten wurde, mit einer relativen Feuchtigkeit von ungefähr 80 % unter einem Gemisch von kaltem weißem Fluoreszenzlicht und Glühlicht gezogen. Die Tabakblattscheibeninfektionen wurden im wesentlichen durch das Verfahren von Horsch et al. (Horsch, R.B:, Fry, J.E., Hoffman, N.L. Eichholtz, D., Rogers, S.G., and Fraley, R.T. (1985) Science, 227, 1229- 1231) durchgeführt.
Junge, noch nicht vollständig entfaltete Blätter von einer Länge von etwa 4-6 in. wurden mit einem Skalpell von den etwa 4-6 Wochen alten Tabakpflanzen geerntet. Die Blätter wurden 30 Minuten lang durch Eintauchen in etwa 500 ml einer Lösung von 10 % Chlorox, 0,1 % SDS und anschließendes dreimaliges Abspülen mit sterilem deionisiertem Wasser oberflächensterilisiert. Blattscheiben von 6 mm Durchmesser wurden aus den ganzen Blättern unter Verwendung eines sterilen Papierlochers hergestellt.
Die Blattscheiben wurden angeimpft, indem sie mehrere Minuten lang in 20 ml einer 1:10-Verdünnung einer Über- Nacht-LB-Nährlösungskultur von Agrobacteria, die die pCVV35phyt-Konstruktion trugen, eingetaucht wurden. Nach dem Animpfen wurden die Blattscheiben in Petrischalen gegeben, die CN-Agarmedium (1 Beutel MS-Salze (Gibco), 30 g Saccharose, 8 g Agar, 0,1 ml von 1 mg/ml Naphthalinessigsäure und 1 ml von 1 mg/ml Benzyladenin pro Liter, pH 5,8) enthielten. Die Platten wurden mit Parafilm luftdicht verschlossen und unter einem Mischlicht von Fluoreszenz- und "Gro und Sho"-Pflanzenlicht (General Electric) 2-3 Tage lang in einem Kulturraum, der bei etwa 25 ºC gehalten wurde, inkubiert.
Um die Blattscheiben von Agrobacteria zu vernichten und um auf das Wachstum von transformierten Tabakzellen zu selektieren, wurden die Blattscheiben in frisches CN-Medium übergeführt, das 500 mg/l Cefotaxim und 100 mg/ml Kanamycin enthielt. Cefotaxim wurde als gefrorene Stammlösung von 100 mg/ml aufbewahrt und aseptisch (filtersterilisiert über einen 0,45 um-Filter) nach dem Autoklavieren zu dem Medium gegeben. Eine frische Kanamycin-Stammlösung (50 mg/ml) wird für jede Verwendung hergestellt und in die autoklavierten Medien sterilfiltriert.
Blattscheiben wurden unter den vor stehend beschriebenen Wachtsumsbedingungen 3 Wochen lang inkubiert und anschließend in frische Medien derselben Zusammensetzung übergeführt. Etwa 1-2 Wochen später wurden 53 Knospen, die sich aus den 80-Kanamycin-selektierten Blattscheiben entwickelten, mit einem sterilen Skalpell entfernt und in A-Medium (ein Beutel MS-Salze (Gibco), 10 g Saccharose, 8 g Agar pro Liter), das 100 mg/l Kanmycin enthielt, eingepflanzt. 4 Sprossen, die in Kanamycin Wurzeln schlugen, wurden in Erde übergeführt und in einer Wachstumskammer, wie oben beschrieben, wachsen gelassen. Die Pflänzchen wurden mit 7A, 9a, 9B und 54 A bezeichnet und in Erde eingepflanzt. Einzelne transformierte Pflanzen wurden auf das Vorliegen der Avena-Phytochromexpression analysiert, indem ein RNAse-Schutzverfahren verwendet wurde. Hierzu wurde ein DNA-Fragment, das sich mit dem Start der Transcription des Avena-Phytochromgens vom Typ 3 überlappt, aus pCV5B3 isoliert (in Beispiel 3 beschrieben), indem 10 ug des Plasmids mit Hind III und Sal I in einem Hochsalzpuffer gespalten wurden, die verdaute DNA auf einem 4,5%igen Polyacrylamidgel laufengelassen wurde und das gewünschte 800-bp-Fragment gereinigt wurde. Das DNA-Fragment wurde sodann mit pGEM 3 (Promeg Biotec) ligiert, das mit Hind III und Sal I geschnitten und mit Phosphatase behandelt worden war. Einzelne Plasmide wurden analysiert, bis eines identifziert wurde, das das Sal-I-Hind-III-Fragment von pCV5B3 in einer solchen Orientierung enthielt, daß Sp6-RNA- Polymerase RNA synthetisiert wurde, die zu der chimären Phytochtrom-Message komplementär ist. Das resultierende pGEM-Plasmid wurde pSP3.3 (als "Sonde" in Figur 11 abgebildet) genannt. Das Plasmid pSP3.3 wurde durch Spaltung mit Eco RI linearisiert, und eine [³²P]-Sonde wurde daraus erzeugt, indem ein Promega-Biotec-Kit verwendet wurde, wobei die Vorschrift des Herstellers befolgt wurde.
Zur Analyse der Expression des Haferphytochroms in Pflanzen, die über das Blattscheiben-Animpfverfahren transformiert worden waren, wurde aus jeder Kanamycin-resistenten Pflanze RNA isoliert und auf das Vorliegen eines spezifischen Phytochrom-RNA-Transcripts getestet, für das die transformierende DNA kodiert.
Nach dem Einpflanzen der Pflanzen in Erde und nach dem Wachsen bis zu ungefähr dem 10. Blattstadium wurde 1 g Blattgewebe von jeder Pflanze geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das gefrorene Blattgewebe wurde mit Mörser und Pistill zu einem Pulver vermahlen und in 4 ml Proteinase-K-Lösung (250 ug/ml Proteinase K in 50 mM Tris-HCl, pH 9,0, 10 mM EDTA und 2 % SDS) 10 Minuten lang bei 50 ºC suspendiert. Die Lösung wurde sodann zweimal mit gleichen Volumina Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert, und die Nucleinsäuren wurden aus der wäßrigen Phase mit 0,6 Volumina Isopropanol in Gegenwart von 3 M Natriumacetat gefällt. Nach einer Inkubation bei -20 ºC über Nacht wurden die Nucleinsäuren durch Zentrifugieren bei 12 000 x g gesammelt, und das Pellet wurde in 1,5 ml H&sub2;O resuspendiert. Anders als die DNA wurde die RNA durch Zugabe von 0,5 ml 8 M LiCl und 2stündiger Inkubation auf Eis gefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren bei 4 ºC für 20 Minuten bei 12 000 x g gesammelt, in H&sub2;O resuspendiert und wie oben wieder mit derselben LiCl-Konzentration gefällt. Die RNA wurde sodann in H&sub2;O resuspendiert und durch Zugabe von 1/10 Volumen 3,0 M Natriumacetat, pH 6,0, und 2,5 Volumina Ethanol sowie Inkubation bei -20 ºC für mehr als 4 Stunden gefällt. Die RNA wurde in H&sub2;O resuspendiert und bei -80 ºC gelagert.
Ein RNAse-Schutzverfahren (Zinn et al., Cell 34, 865-879, Melton et al., Nucleic Acids Res. 12, 7035-7056, 1984) wurde sodann angewendet, um die Avena-Phytochrom-Message in der RNA nachzuweisen, die aus den transformierten Pflanzen isoliert worden war. 50 ug RNA von jeder Transformante wurden mit 1 x 10&sup6; cpm einer Ribosonde hybridisiert, die aus dem pSP3.3-Plasmid mit 30 ul Lösung, die 40 mM PIPES (pH 6,4), 400 mM NaCl und 80 % Formamid enthielt, 16 Stunden lang bei 45,5 ºC erzeugt wurde. Die resultierenden Hybride wurden 30 Minuten lang bei 30 ºC mit RNAse verdaut, indem 350 ul Lösung, die 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 40 ug/ml RNAse A und 2 ug/ml RNase T1 enthielt, zugegeben wurden. Nach der Inkubation wurde die RNAse zerstört, indem das verdaute Gemisch auf 0,5 % SDS gebracht wurde und mit 50 ug Proteinase K 30 Minuten lang bei 37 ºC behandelt wurde. Die mit RNAse und Proteinase K behandelten Hybride wurden anschließend mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert und mit 2,5 Volumina Ethanol gefällt. Die RNA-Proben wurden auf einem 4,5%igen Acrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthielt, analysiert. Ein 645-bp-Fragment, das sich von der Xba-I-Schnittstelle an der 35-S-Phytochromsequenz-Verbindungsstelle in pCV35Sphyt zu der ersten Hind-III-Schnittstelle innerhalb der Phytochromsequenz (siehe Figur 11) erstreckte, wird erwartungsgemäß durch die Sonde in Pflanzen geschützt, die das 35Sphyt-Konstrukt exprimierten.
Die Ergebnisse einer solchen Analyse sind in Figur 11 gezeigt. 10 ug Gesamt-RNA, isoliert aus etiolierten Avena- Keimlingen 2 Stunden nach Bestrahlung mit Rotlicht, wurden in dem Experiment als positive Kontrolle zur Expression eines Phytochroms der Sorte Avena laufengelassen. Wildtyptabak-RNA und RNA, die aus der Pflanze 7A isoliert worden war, zeigten unter den beschriebenen experimentellen Bedingungen keine Hybridisierung mit der pSP3.3-Sonde. Jedoch zeigten die RNA der Pflanzen 9A, 9B und 54A starke Hybridisierungssignale, die das vorhergesagte, von 645 Basen geschützte Fragment ergaben. Das Ergebnis zeigt, daß die Pflanzen 9A, 9B und 54A hohe Konzentrationen von stabiler Phytochrom-RNA der Sorte Avena sogar im Licht produzieren, wenn die Phytochromkonzentrationen normalerweise extrem niedrig liegen.
Die mit,dem 35-S-Phytochromkonstrukt transformierten Tabakpflanzen wurden bis zur Reife wachsen gelassen. Zu diesem Zeitpunkt wurde beobachtet, daß sich die Pflanzen 9A, 9B und 54A, von denen sich während der RNAse-Schutzanalyse zeigte, daß sie Phytochrom überexprimieren, morphologisch von Wildtyptabak (siehe Figur 12) unterschieden. Pflanze 7A, die Phytochrom nicht überexprimierte, war jedoch morphologisch nicht von Tabak der Sorte Wildtyp zu unterscheiden. Im Vergleich zu Wildtyppflanzen zeigten die drei Pflanzen die Phytochrom überexprimierten, allesamt eine verstärkte grüne Pigmentierung, verstärkte Bestengelung (mehr Stämme, gebildet aus der Basis der Pflanze), eine reduzierte Apikaldominanz und einen verringerten Internodalabstand. Letzteres Merkmal ergab sich bei den Pflanzen, die dieselbe Anzahl von Blattnoden zu Blütenständen aufwies, die jedoch etwa die Hälfte der Höhe von normalen Pflanzen erreichten.
Die Pflanzen 9A, 9B und 54A besaßen etwas schmalere Blätter als die nicht-exprimierenden Pflanzen 7A. Sie blühten jedoch zu etwa dem gleichen Zeitpunkt und besaßen pro Blütenstand eine vergleichbare Samenausbeute.
Aus den ursprünglich transformierten Pflanzen und/oder aus den Sämlingen, die aus den Samen gezogen worden waren, die durch Selbstbefruchtung der transformierten Pflanze erzeugt wurden, wurde Gewebe geerntet. Das Vorliegen von Avena- Phytochromexpression in den Geweben dieser Pflanzen wurde auf Proteinebene durch Nachweis des Avena-Proteins mit spezifischen Antikörpern oder durch Test auf Zunahmen der spektralen Phytochrom-Gesamtaktivität im Dunkeln und in Licht bewertet. Phytochrom-Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Immun-Blot-Verfahrens bestimmt, bei dem entweder monoklonale oder polyklonale Antiphytochrom- Antikörper eingesetzt wurden (beschrieben bei Shanklin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US 84, 359-363, 1987). Polyklonale Antikörper wurden in Kaninchen gegen hochgereinigtes Avena-Phytochrom erzeugt und anschließend unter Verwendung einer Affi-Gel-10-Säule, die immobilisiertes Avena-Phytochrom enthielt, gereinigt. Proteine wurden aus gefrorenem Pflanzengewebe durch 30sekündiges Homogenisieren bei 4 ºC in einer Lösung von 50 % Ethylenglycol, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 140 mM Ammoniumsulfat, 20 mM Natriummetabisulfit, 10 mM EDTA und frisch zugegebenem 4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Puffer A) extrahiert. Der Extrakt wurde in Polyethylenimin auf 0,1 % (Gew./Vol.) gebracht, indem eine 10%ige (Gew./Vol.) Lösung, pH 7,8, hinzugegeben und 5 Minuten lang gerührt wurde und bei 50 000 x g 20 Minuten geklärt wurde. Die Proteinkonzentration des Überstands wurde unter Verwendung des Bradford- Protein-Testreagens (Biorad) bestimmt. Gleiche Volumina jedes Extraktes, der 35 ug Protein enthielt, wurden 1:1 (Vol./Vol.) mit einer Lösung von 10 % Glycerin, 3 % SDS, 0,25 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,2 mg/ml Bromphenolblau und 0,7 M β-Mercaptoethanol vermischt. Die resultierenden Proben wurden 3 Minuten lang gekocht, und die Proteine durch SDS-Polyacrylamidgel auf einem 7%igen Gel aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulose (HYHY 304 FO, Millipore) elektrophoretisch transferiert. Immunreaktive Phytochrombanden wurden colorimetrisch unter Verwendung von Kaninchen-Antiphytochrom-Immunglobulinen in Verbindung mit alkalischer-Phosphatase-konjugierten Ziegen- IgG, die gegen Kaninchen-Immunglobuline gerichtet waren, und Phosphatasesubstraten, Nitroblautetrazolinium und 5-Brom-4-chrom-3-indolylphosphat sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse einer solchen Analyse sind in Figur 13 gezeigt. Die transformierten Pflanzen 9A und 54A produzieren deutlich Phytochrom in voller Länge in viel höheren Konzentrationen als die Wildtyppflanzen oder die Pflanze 74, sowohl in den Keimen, die am Licht gezogen wurden, als auch in den an Dunkelheit angepaßten Keimen. Erhöhte Proteinkonzentrationen in den Pflanzen 9A und 54A beruhen auf dem Avena-artigen Transformationsgen, wie unter Verwendung monoklonaler Antikörper bewiesen, die Avena, jedoch nicht das endogene Tabakphytochrom erkennen. Phytochrom in voller Länge vom Avena-Typ wird von einer zweiten Generation von Sämlingen von 9A produziert, was anzeigt, daß das Gen stabil über die Samen übertragen wird. Pflanze 9B wurde in diesen Experimenten nicht getestet.
Die spektrale Aktivität von Phytochrom in den transformierten Pflanzen wurde bei den Extrakten der Sämlinge, die aus Samen gezogen worden waren, die aus der Selbstbefruchtung der Pflanze 9A abstammten, gemessen. Proteinextrakte wurden wie vorstehend für die Immun-Blot-Analyse mit den folgenden Modifikationen hergestellt. Nach Zugabe von Polyethylenimin und Klärung durch Zentrifugation wurde das rohe Phytochrom durch Zugabe von Amoniumsulfat zu 250 mg/ml gefällt und durch Zentrifugieren bei 50 000 x g wie vorstehend beschrieben gesammelt. Das Pellet wurde in Puffer A der halben Stärke (oben angegeben) resuspendiert, der 14 mM β-Mercaptoethanol anstelle von Natriummethylbisulfit enthielt. Die spektrale Quantifizierung von Phytochrom wurde in diesem Puffer durchgeführt, indem die 2-Wellenlängen- (A730/A666)-Spektroskopie unter Verwendung eines UV-Dreiphasenspektrophotometers von Shimadzu eingesetzt wurde, nachdem die Phytochromproben Sättigungsgbestrahlungen im roten oder dunkelroten Bereich ausgesetzt worden waren. Der Extinktionskoeffinzient von 1,2 x 10&sup5; Liter/mol/cm für Pr und ein Photogleichgewicht von 86 % Pfr im Rotlicht wurde für alle Berechnungen des Phytochromgehaltes herangezogen.
Die Ergebnisse solcher Analysen zeigen, daß 50 % mehr Phytochromaktivität in dunkelgezogenen 9A-Sämlingen im Vergleich mit dem Wildtyp vorhanden ist, wobei sowohl Avena-Typ- als auch Tabak-Phytochrome vorhanden sind. Bei im Licht gezogenen Pflanzen ist jedoch eine wenigstens 10fach höhere Phytochromaktivität in A9-Sämlingen als bei den lichtgezogenen Wildtyppflanzen auf einer Basis von 1 ug Protein vorhanden. Ferner wird, auf der Basis der monoklonalen Antikörper-Analyse, das gesamte nachweisbare Phytochrom in diesen lichtgezogenen Pflanzen von dem chimären Gen produziert.

BEISPIEL 4

Das Plasmid pNPT35phyt wurde durch Entfernen des gesamten 35-S-Phytochromgenkonstrukts aus pCV35phyt und Reklonieren in einen binären Vektor konstruiert. Der binäre Vektor pZS96, der zur Herstellung von pNPT35phyt verwendet wurde, ist nur ein Beispiel für eine größere Anzahl von binären Vektoren, die verfügbar sind und für diesen Zweck verwendet werden können. pZS96 enthält ein linkes Grenzfragment auf dem Octopin-Ti-Plasmid pTiA6 und ein rechtes Grenzfragment von pTiAch5 [van den Elzen, P., Lee, K.Y., Townsend, J., und Bedbrook J. Plant Molecular Biology, 5: 149-154, 1985]. Die Grenzfragmente begrenzen das DNA-Segment, das in das Wirtspflanzengenom während des Verfahrens der durch Agrobacterium vermittelten Transformation eingeschleust wird. Ein chimäres Markergen (NOS(NPT II/OCS), das die Kanamycinresistenz in Pflanzenzellen festlegt, und β-Galactosidase-(Lac Z)-Gen, das durch die Polylinkersequenz von pUC18 unterbrochen wird, werden zwischen den linken und rechten Grenzfragmenten angeordnet. Das Ampicillin- Resistenzgen und der pBr322-Ursprung der Replikation liegen außerhalb der T-DNA-Seguenzen für die Selektion und Amplifikation des Vektors in E. coli. Sequenzen, die eine Stabilisierung (sta) und Replikation (rep) in Agrobacterium tumefaciens erlauben, sind ebenfalls in pZS96 enthalten und wurden aus dem Plasmid pVS1 von Pseudomonas aeruginosa erhalten [Itoh, Y. Watson, J.M., Haas, D., und Leisinger, T., Plasmid 11: 206-220, 1984].
pZS96 (10 ug) und pCV35phyt (10 ug) wurden vollständig mit Eco RI und- Sal I in einem Hochsalzpuffer gespalten. pZS96 wurde sodann mit alkalischer Phosphatase, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt, und 0,1 ug des resultierenden Plasmids wurde über Nacht mit 0,2 ug pCV35phyt ligiert. 1 ug der Ligation wurde verwendet, um E. coli-HB101-Zellen zu transformieren, und auf LB-Agarplatten, die 50 ug/ml Ampicillin enthielten, ausplattiert. Einzelne Kolonien wurden analysiert, bis ein Plasmid identifiziert wurde, das das 35-S-Phytochromgen, inseriert in pZS96, enthielt (siehe Figur 14).
pNTP35phyt wurde von E.-coli-HB101 in den Agrobacterium- Stamm LBA 404 mobilisiert [Hoekema, A. Hirsch, R.R., Hooykass, P.J.J., und Schilperoort, R.A., Nature 303: 179- 180, 1983], wobei ein triparentales Paarungsverfahren (siehe Beispiel 3) angewendet wurde. LBA 404 wurde in minimalem A-Medium mit Saccharose (1 x M9-Salze [angegeben bei Maniatis, T. et al., (1982) Molecular Cloning, S. 440], 1 mM MgSO&sub4;, 1 mM CaCl&sub2; und 0,5 % Saccharose) gezogen. LBA 404-NPT35phyt-Konjuganten wurden auf minimalem A-Agar, der 10 ug Carbenicillin enthielt, selektiert.

Beispiel 5

Überexpression von Phytochrom in transgener Tomate

Aseptische Standardtechniken zur Manipulation von sterilem Medium und axenischen Pflanzen/Bakterienkulturen wurden befolgt, einschließlich der Verwendung einer Sterilbank für alle Transfers.
Tomatensamen (Lvcopersicon esculentum var. Herbst Red Cherrs) wurden 34 Minuten in einer Lösung von 10 % Clorox, 0,1 % SDS oberflächensterilisiert und 3 x mit sterilem deionisiertem Wasser gespült. Die Samen wurden in Magenta- Schalen (Magenta Corp.), die 85 ml OMS-Agarmedium enthielten, gepflanzt und unter einem gemischten Fluoreszenz- und "Gro und Sho"-Pflanzenlicht (General Electric) in einem Kulturraum gekeimt, der bei etwa 25 ºC gehalten wurde. Kotyledonen von 10-15 Tagen alten Sämlingen wurden zur Animpfung mit Agrobacterium verwendet.
Den Kotyledonen wurde eine Wunde beigebracht, indem etwa 2 mm Gewebe von jedem Ende des Kotyledons mit einem sterilen Skalpell entfernt wurden. Die verwundeten Kotyledonen wurden in Petrischalen auf CTM-Agarmedium entweder mit oder ohne 75 mM Acetosyringon (Aldrich Chemical) gepflanzt.
Bei der Vorbereitung der kotyledonen Animpfung wurde eine einzelne Kolonie von LBA4404-NPT35phyt (beschrieben in Beispiel 4) von einer Min A + Tetracyclin (1 ug/ml)-Agarplatte in ein Röhrchen überimpft, das 3-5 ml Min-A-Nährlösung enthielt, und 2 Tage lang bei 28 ºC auf einem New-Brunswick-Plattformschüttler gezogen. Am Morgen nach dem Animpfen der Kotyledonen wurde die Bakterienkultur mit steriler Min-A-Nährlösung auf eine OD&sub6;&sub5;&sub0; von 0,1 verdünnt, und es wurde eine Vermehrung bis zu einer OD von 0,3 unter den zuvor beschriebenen Wachstumsbedingungen ermöglicht. Diese Kultur wurde sodann unverdünnt zu Animpfung der kotyledonen Explantate verwendet.
CTM-Agarplatten, die die kotyledonen Explantate enthielten, wurden mit 5 ml der LBA4404-NPT35phyt-Bakterienlösung etwa 5 Minuten lang vor Entfernen der Lösung gespült. Die Platten wurden sodann mit Time Tape (Shamrock Scientific Specialty) an zwei Seiten der Schale fest verschlossen und unter gemischten Fluoreszenz- und "Gro und Sho"-Pflanzenlicht (General Electric) bei etwa 25 ºC 2 Tage lang inkubiert.
Um den Überschuß von Agrobacteria von den Pflanzenkulturen zu entfernen, wurden die kotyledonen Explantate etwa 10 Minuten lang in flüssigen OMS-Medien behandelt, die 500 mg/l Cefotaxim enthielten. Sie wurden anschließend in frisches CTM-Medium übergeführt, das 500 mg/l Cefotaxim und 50 mg/l Kanamycin enthielt, und unter denselben, oben beschriebenen Kulturbedingungen etwa 3 Wochen lang inkubiert. Die Kotyledonen wurden in frischen Medien derselben Zusammensetzung und derselben selektiven Mittel wie CTM, jedoch mit 1/10 der Zeatin-Konzentration übergeführt. Nach etwa 2-4 Wochen wurden die Keimlinge, die sich aus dem Kanamycin-selektierten Kotyledonen entwickelten, abgeschnitten und in OMS-Medien gepflanzt, die 500 mg/l Cefotaxim und 0 oder 50 mg/l Kanamycin enthielten. Tomatenkeime, die etwa 2-3 Wochen gekeimt hatten, wurden in Erde in 8-in.-Töpfe übergeführt und mit Plastiktüten bedeckt. Die Pflanzen werden unter gemischtem Fluoreszenz- und Glühlicht während eines Zyklus von 12 Stunden, 24 ºC Tag, 12 Stunden, 20 ºC Nacht unter etwa 80 % RH 1 Woche lang gezogen, bevor die Plastiktüten entfernt werden.
Es wird natürlich erwartet, daß wie im Falle von Tabak die Kanamycin-resistenten Tomatenpflanzen, die sich regenerierten, das 35-S-Phytochrom-Konstrukt exprimieren und darum ein funktionelles monokotyledones Phytochrom im Dunkeln und im Licht überexprimieren. Es wird erwartet, daß diese Pflanzen dieselben phänotypischen Änderungen zeigen, die mit einer Phytochromexpression verbunden sind, die in Beispiel 3 mit CV35phyt-transformiertem Tabak erhalten wurde. Diese Veränderungen umfassen eine verringerte Apikaldominanz, Halbzwergenwuchs, eine verstärkte Schattentoleranz und eine dunkelgrünere Farbe.

CTM-Medium

1 pkg MS-Salze (Gibco)
1 ml B5-Vitamine (pro 100 ml: Nicotinsäure 100 mg, Thiamin-Hydrochlorid 1 000 mg, Pyridoxin-Hydrochlorid 100 mg, M-Inosit 10 000 mg)
3 mM MEs
3 % Glucose
0,7 Agar
pH 5,7
Autoklavieren und Zugeben von 1 ml 1 mg/ml Zeatin- Stammlösung

OMS-Medium

1 pkg MS-Salze (Gibco)
1 ml B5-Vitamine (siehe oben)
3 mM MES
3 % Saccharose
0,8 % Agar
pH 5,7

Min A + Tetracyclin (1 ug/ml)-Medium

1. Zugeben von 7,5 g Agar zu 400 ml Wasser
2. Erstellen der Stammlösung
KPPO&sub4; 5,25 g
KH&sub2;PO&sub4; 2,25 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0,5 g
Natriumcitrat x 2H&sub2;O 0,25 g
100 ml
3. Herstellen von MgSO&sub4; x 7H&sub2;O-Stammlösung = 20 g/100 ml, autoklaviert
4. Herstellung von Glucose-Stammlösung = 20%ige Lösung, autoklaviert
5. Herstellen von Tetracyclin-Stammlösung = 1,0 mg/ml in Ethanol/H&sub2;O, 50 % (Vol./Vol.), filtersterilisiert

Min A Medium + 1 ug/ml Tetracyclin

Vermischen von (1) und (2)
Zugeben von 0,5 ml (3), 5 ml (4) und 0,5 ml (5)

Beispiel 6

Überexpression von Phytochrom in transgenem Kohl

Aseptische Standardtechniken zur Manipulation von sterilem Medium und Pflanzen/Bakterien-Reinkulturen wurden befolgt, einschließlich der Verwendung einer Sterilbank für alle Übertragungen.
Canolasämlinge (Brassica napus var. Westar) wurden in einer Lösung von 10 % Clorox, 0,1 % SDS 30 Minuten lang sterilisiert. Nach dem sorgfältigen Abspülen mit sterilem Wasser wurden die Sämlinge in Kristallisierschalen aus Glas ausgepflanzt, die Keimungsmedium (30 mM CaCl&sub2;, 1,5 % Agar) enthielten, wobei 75 Sämlinge pro Schale verwendet wurden. Die Sämlinge wurden anschließend 5 Tage lang im Dunkeln bei 25 ºC gehalten.
Eine Über-Nacht-Kultur des Agrobacterium-Stamms LB440-NPT35phyt wurde angesetzt, indem 3 ml steriles flüssiges Min-A-Medium mit Saccharose (siehe Beispiel 4), das 100 ug/ml Carbencillin enthielt, mit einer einzigen Kolonie angeimpft wurde. Die Kultur wurde bei 28 ºC 18-20 Stunden lang geschüttelt.
Die Hypokotyledonen der Sämlinge wurden in 1 cm lange Abschnitte geschnitten und sofort auf Platten gegeben, die 22,5 ml Bakterienverdünnungsmedium (MS flüssig, das 100 uM Acetosyringon enthält) enthielten. Ein 2,5-ml-Aliquot der LBA4404-NPT35phyt-Übernachtkultur (OD&sub6;&sub5;&sub0; = 1,= bis 2,0) wurde zu jeder Platte des Bakterien-Verdünnungsmediums gegeben, das die Hypokotyledonenstücke enthielt. Nach 30 Minuten wurden die Hypokotyledonenstücke aus der Bakteriensuspension entfernt und in 2-cm-Rillen gelegt, die auf die Oberfläche von frischen BC-Platten, die 100 uM Acetosyringon enthielten, eingeritzt wurden. Die Platten wurden kurz getrocknet, indem sie in einer Sterilbank 30 Minuten vor der Verwendung offen stehen gelassen wurden. Es wurde ermöglicht, daß die getrocknete Oberfläche der Agarose die überschüssige Flüssigkeit auf den Hypokotyledonenstücken aufsaugte, und die Platten wurden anschließend 3 Tage lang bei 25 ºC in schwachem Licht inkubiert.
Die Explantate wurden aus BC-1-Schalen in Schalen übergeführt, die Explantatwaschlösung (flüssiges MS, das 500 mg/l Cefotaxim enthielt) enthielten. Die Schalen wurden langsam 3 Stunden lang geschüttelt, um Agrobacteria von den Explantaten abzuwaschen. Die Explantate wurden sodann auf BC-1-Platten übergeführt, die 100 mg/l Vancomycin, 50 mg/l Kanamycin enthielten, und unter 16:8 Stunden Licht:Dunkel in eine Kammer bei 25 ºC gegeben.
Nach 21 Tagen wurden die Explantate auf frische BC-1- Platten übergeführt, die 100 mg/l Vancomycin, 50 mg/l Kanamycin enthielten. Die Platten wurden anschließend noch 21 Tage lang in einer Wachstumskammer bei 25 ºC unter Anwendung eines 16:8-Licht:Dunkel-Zyklus inkubiert. Als die Kalli wenigstens 5 mm Durchmesser besaßen, wurden sie in BS-5-Keimungsinduktionsmedien übergeführt, das 200 mg/l Vancomycin und 25 mg/l Kanamycin enthielt. Die Kulturen wurden anschließend in kontinuierlichem Licht bei 25 ºC während der Induktionsperiode gehalten. Die Explantate wurden alle 2 Wochen auf frisches BS-5-Medium übergeführt. Erkennbare Sprossanlagen begannen nach 3-10 Wochen Wachstum auf BS-5 aufzutreten. Die Sprossen wurden noch etwas wachsengelassen, bevor sie vom Kalli abgeschnitten wurden.
Als sie zuerst von BS-5 entfernt wurden, waren die Sprossen im allgemeinen stark gläsern - dick, durchscheinend - glasige Blätter und Stammgewebe. Sie wurden wenigstens 2-3 Wochen auf MSV-1A-Medium subkultiviert, um die Pflänzchen zu normalisieren. Die Sprossenspitzen und mehrere Internodien unterhalb wurden jeweils in eine Subkultur übergeführt und in einer Kammer wachsen gelassen, indem ein kurze Photoperiode - 10 Stunden Licht/14 Stunden Dunkel oder 12 Stunden Licht/12 Stunden Dunkel - angewendet wurde. Die Behandlung verhindert ebenfalls ein Blühen in Kultur.
Nach der Normalisierung der Sprossen wurden sie direkt in ein Blumenerdegemisch eingepflanzt, ohne daß versucht wurde, daß sie in vitro Wurzeln zogen. Die Sprossen wurden nahe der Agaroberfläche abgeschnitten, und die abgeschnittenen Oberflächen wurden in Rootone (Security Lawn und Garden Products, Atlanta, GA) eingetaucht. Die Sprossen wurden in wassergesättigtes Metro-Mix in 8 in. Töpfen gepflanzt und mit Plastikbeuteln 2 Wochen lang abgedeckt, bis die Pflanzen richtig wuchsen.
Die RNA wurde aus dem Blattgewebe einer Reihe von Brassica- Transformanten extrahiert und auf das Vorliegen von Avena- Phytochromexpression unter Verwendung der RNA-Extraktions- und RNA-Schutzverfahren, die in Beispiel 3 beschrieben wurden, analysiert. Wildtyp-Brassica-RNA zeigte keinen Schutz der pSp3.3-Sonde unter den beschriebenen experimentellen Bedingungen. Jedoch zeigte die RNA aus allen drei transformierten Pflanzen, die durch RNAse-Schutz getestet worden waren, starke Hybridisierungssignale, was das vorausgesagte, geschützte 645-Basenfragment ergab. Das Ergebnis beweist, daß diese drei Pflanzen stabile Avena- Phytochrom-RNA sogar in Licht produzieren, wenn die Phytochromkonzentrationen normalerweise extrem gering bis nicht nachweisbar wären.
Wie im Falle von Tabak wird stark erwartet, daß die Kanamycin-resistenten B. napus-Regenerate das Avena-Phytochromprotein exprimieren und darum ein funktionelles monokotyledones Phytochrom im Dunkeln und im Licht überexprimieren. Folglich sollten diese Pflanzen, wenn sie reifen dieselben phänotypischen Veränderungen aufweisen, die mit einer Phytochromüberexpression einhergehen, die in Beispiel 3 mit Tabak, der mit CV35phyt transformiert worden war, erhalten wurde. Diese Veränderungen umfassen eine verringerte Apikaldominanz, Halbzwergenwuchs, verstärkte Schattentoleranz und dunkelgrünere Farbe. KOHL-GEWEBEKULTURMEDIEN MS-Hauptsalze Bestandteile Endkonzentration K3-Hauptsalze Bestandteile Endkonzentration CaCl&sub2;-2H&sub2;O Bestandteile Endkonzentration MS-Spurenelemente Bestandteile Endkonzentration Fe-EDTA Bestandteil Endkonzentration I-Vitamine Bestandteile Endkonzentration Myo-Inosit Thiamin Glycin Nicotinsäure Pyridoxin Folsäure Biotin B5-Vitamine (X 1000) Bestandteile Endkonzentration Nicotinsäure Thiamin-Hydrochlorid Pyridoxin-Hydrochlorid M-Inosit T-Vitamine (10 000fache Stammlösung) Bestandteile Endkonzentration Biotion Pyridoxin-Hydrochlorid Thiamin-Hydrochlorid Nicotinsäure Folsäure Glycin M-Inosit K3-Vitamine (In 10 000fach) Bestandteile Endkonzentration Thiamin-Hydrochlorid Nicotinsäure M-Inosit T-Vitamine Bestandteile Endkonzentration Xylose Sucrose Agarose Qualitätsgrad DNA pH 5,7 Zugabe nach Autoklavieren: Zeatin MS-1AV pro Liter: Bestandteile Endkonzentration Sucrose T-Vitamine Agarose, Qualitätsgrad DNA pH 5,8 Minimales organisches MS-Medium Bestandteile Endkonzentration MS-Hauptsalze MS-Spurenelemente Myo-Inosit Thiamin BC-1-Medium Bestandteile Endkonzentration Minimales organisches MS-Medium Sucrose Mannit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure Kinetin Agarose, Qualitätsgrad DNA BS-5-Medium Bestandteil Endkonzentration K3-Macro-Nährelemente MS-Spurenelemente

Claims

1. Transgene Pflanze, die Phytochrom im Vergleich zu der Wildtyppflanze im Dunkeln und im Licht überexprimiert, die im Vergleich zu der Wildtyppflanze ein phänotypisches Merkmal aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer verringerten Apikaldominanz, Halbzwergenwuchs, verstärkter Schattentoleranz und dunkelgrüner Farbe, wobei das Genom der genannten Pflanze eine einzige nichtunterbrochene kodierende Sequenz für ein Phytochrom-Polypeptid umfaßt, das stromaufwärts (5') zweckorientiert mit dem 35S- Bestandteil des Blumenkohl-mosaikvirus-Promotors und stromabwärts (3') mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist, die ein Polyadenylierungssignal enthält.

2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, die eine monocotyledone Pflanze ist.

3. Transgene Pflanze nach Anspruch 2, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Mais, Hafer, Hirse, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum, Amaranth, Zwiebel, Spargel und Zuckerrohr.

4. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, die eine dicotyledone Pflanze ist.

5. Transgene Pflanze nach Anspruch 4, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alfalfa, Sojabohne, Petunie, Baumwolle, Zuckerrohr, Sonnenblume, Karotte, Sellerie, Kohl, Gurke, Pfeffer, Kanola, Tomate, Kartoffel, Linsen, Flachs, Brokkoli, Tabak, Bohne, Salat, Ölsamen, Raps, Blumenkohl, Spinat, Rosenkohl, Artischocke, Erbse, Okra, Grünkohl, Gemüsekohl, Tee und Kaffee.

6. Transgene Pflanze, die ein Zierpflanze ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Geranie, Nelke, Orchidee, Rose, Springkraut, Petunie, Begonie, Fuchsie, Ringelblume, Chrysantheme, Gladiole, Astromerie, Salbei, Veronika, Gänseblümchen und Iris.

7. Samen, der durch Züchten einer transgenen Pflanze nach Anspruch 1 erhalten wird.

8. Samen, der durch Züchten einer transgenen Pflanze nach Anspruch 2 oder 3 erhalten wird.

9. Samen, der durch Züchten einer transgenen Pflanze nach Anspruch 4 oder 5 erhalten wird.

10. Rekombinates DNA-Konstrukt, das in der Lage ist, eine Pflanze zu transformieren, die eine einige nichtunterbrochene kodierende Sequenz für ein Phytochrom-Polypeptid umfaßt, das stromaufwärts (5') zweckorientiert mit dem 35S-Bestandteil des Blumenkohlmosaikvirus- Promotors und stromabwärts (3') mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist, die ein Polyadenylierungssignal enthält, so daß bei der Transformation die genannte Pflanze Phytochrom im Vergleich zu der Wildtyppflanze im Dunkeln und im Licht überexprimiert und die genannte Pflanze im Vergleich zu der Wildtyppflanze ein phänotypisches Merkmal aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer verringerten Apikaldominanz, Halbzwergenwuchs, einer verstärkten Schattentoleranz und einer dunkelgrünen Farbe.

11. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, worin das Nukleinsäurepromotorfragment auch ein Verstärkerelement enthält, das aus dem 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus stammt.

12. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 10 oder 11, worin die einzige ununterbrochene kodierende Sequenz für ein Phytochrompolypeptid durch Deletion der Introns aus einer kodierenden Sequenz für ein Phytochrom-Polypeptid erhalten wird, das aus einer monocotyledonen Pflanze stammt.

13. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 12, bei dem die kodierende Sequenz für ein Phytochrom-Polypeptid aus Avena stammt.

14. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, das im wesentlichen die folgende Struktur, wie in Figur 1 gezeigt, aufweist:

1438 bp der kodierenden Sequenz für Phytochrom aus der kodierenden Sequenz vom Avena Typ 3, pGP8.2-1 (von der Acc I- zu der Eco RV-Schnittstelle des Plasmids), verknüpft mit 1862 bp der kodierenden Sequenz der cDNA des Avena-Typs 3 aus dem Klon pAP3.1 (das Fragment von Eco RV bis zu Xba I dieses Plasmids) und terminiert mit 1733 bp aus dem genomischen Klon pGP2.4-1 des Avena-Typs 4 (das Fragment Xba I bis Eco RI von pGP2.4-1), das die kodierende Region vervollständigt und Polyadenylierungssignale und sämtliche weitere regulatorischen Funktionen bereitstellt, die am 3'-Ende erforderlich sein können.

15. Verwendung des rekombinanten DNA-Konstrukts nach einem der Ansprüche 10 bis 14 zur Produktion einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 6.