DE10050233A1

DE10050233A1 - Verfahren zur genetischen Modifizierung einer Pflanze

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Publication number: DE10050233A1
Application number: DE10050233A
Authority: DE
Inventors: John M Ward; Andreas Weise; Laurence Barker; Waltraud Schulze; Christina Kuehn; Wolf-Bernd Frommer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2001-10-11
Also published as: ZA200207639B; KR20030072206A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die einen Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transporter codieren, Vektoren und Wirtzellen, die diese Nucleinsäuremoleküle enthalten sowie mit den beschriebenen Nucleinsäuremolekülen und Vektoren transformierte Pflanzenzellen und Pflanzen. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Modifizierung des Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transports, in Pflanzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremo leküle, die einen Saccharid-, insbesondere Saccha rose-Transporter codieren, Vektoren und Wirtszel len, die diese Nucleinsäuremoleküle enthalten sowie mit den beschriebenen Nucleinsäuremolekülen und Vektoren transformierte Pilze, Pflanzenzellen und Pflanzen. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfah ren zur Modifizierung des Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transports, in Pflanzen.

Höhere Pflanzen weisen heterotrophe Gewebe auf, die von autotrophen Geweben mit Kohlenhydraten versorgt werden. Die Haupttransportform der Kohlenhydrate stellt die Saccharose und ihre Derivate dar. Die Versorgung der heterotrophen Gewebe erfolgt über das Phloem, das die Organe, welche Photoassimilate, also Kohlenhydrate, im Überschuss zur Verfügung stellen und die diese exportieren können, also so genannte Source-Organe mit Organen, die in ihrer Nettobilanz Photoassimilate importieren müssen, al so sogenannte Sink-Organe, verbindet. Source-Organe sind beispielsweise ausgewachsene Blätter und kei mende Samen. Sink-Organe stellen beispielsweise junge Blätter, junge Knollen, Wurzeln, Früchte, Blüten und sonstige reproduktive Organe dar. Das Phloem ist aus verschiedenen Zelltypen wie Siebele menten, Geleitzellen, Parenchymzellen und Bündel scheidenzellen aufgebaut. In den Siebelementen be wegt sich der Translokationsstrom der Photoassimi late von Orten des Exports zu Orten des Imports. Sowohl die Beladung des Phloems mit Photoassimila ten als auch die Entladung kann dabei grundsätzlich auf apoplastischem und symplastischem Wege erfol gen, wobei eine Vielzahl von Faktoren wie osmoti sche Verhältnisse, Konzentrationsgefälle, zu pas sierende Plasmamembranen etc. Einfluss auf die Be- und Entladung nehmen. Sowohl die Beladung des Phloems als auch die Versorgung der Sink-Organe mit Photoassimilaten sind demgemäss hochkomplexe Vor gänge, die offensichtlich eine Vielzahl von eng miteinander verknüpften und regulierten Transport schritten umfassen. Diese Transportschritte verlau fen unter Beteiligung unterschiedlicher Plasma membranproteine, insbesondere von Transportprotei nen. So sind z. B. aus Pflanzen unterschiedlicher Familien jeweils mehrere Mitglieder aus der Familie der Saccharose-Transporter bekannt, z. B. SUT1 (sucrose transporter). Die SUT-Gene codieren hydro phobe Proteine, die 12 Transmembrandomänen aufwei sen und deutlich von den Mitgliedern der Hexose- Transporterfamilie unterschieden werden können. La londe et al. (The Plant Cell (1999) 11, 707-726) lässt vermuten, dass die Mitglieder der SUT-Familie hohe Affinität für Saccharose aufweist. Es wird da bei angenommen, dass insbesondere der Saccharose- Transporter SUT1 aus Lycopersicon esculentum, Nico tiana tabacum und Solanum tuberosum für den Lang streckentransport im Phloem zuständig ist (Riesmei er et al., Plant Cell (1993) 5, 1591-1598). Die WO94/00574 offenbart die DNA- und Aminosäuresequen zen von SUT1 aus Spinat und Kartoffel. Dieser in der Plasmamembran der Siebelemente des Phloems lo kalisierte Saccharose-Transporter stellt eine es sentielle Komponente für den Langstreckentransport von Saccharose im Phloem dar, wie sich beispiels weise in Antisense-Inhibitionsexperimenten in transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen zeigt (Riesmeier et al., EMBO J (1994) 13, 1-7) (Lalonde et al., a. a. O.). Das Expressionsmuster von SUT1, insbesondere die Expression im gesamten Phloem be legt, dass SUT1 an der Aufrechterhaltung des Kon zentrationsgradienten von Saccharose zwischen Be- und Entladungszonen (Blättern, respektive Sink- Organen) verantwortlich ist. SUT1 scheint daher we niger für die (erstmalige) Beladung des Phloems in Source-Organen als vielmehr für die Rückführung aus dem Phloem abgewanderter Saccharose verantwortlich zu sein. Diese Funktion wird weiterhin durch die relativ hohe Affinität und die damit verbundene niedrige Transportkapazität bestätigt. SUT1 kann also sehr geringe Mengen Saccharose aus dem Apoplasten in das Phloem (zurück) importieren und hält somit die apoplastischen Konzentrationen nied rig. Da er bei diesen geringen Konzentrationen ar beitet, kann er nicht für hohe Transportraten ver antwortlich sein. Die Kinetiken der Saccharose- Aufnahme in Blattscheiben zeigen deutlich diese be schriebene hochaffine (Km 2.7 mM) Aufnahme mit niedriger Kapazität (Vmax 0.7 nmol cm^-2 min^-1) (Delrot & Bonnemain, Plant Physiol. (1981) 67, 560-564). Dieses System wird auch als HAS (high af finity/low capacity system) bezeichnet. Die Einbin dung von SUT1 in das gesamte Transport- und Regula tionssystem des Saccharose-Transports ist jedoch völlig unklar (Ward et al., Int. Rev. Cytology (1998) 178, 41-71, Kühn et al., J. Exp. Bot. (1999) 50, 935-953). Dies gilt ebenfalls für die Identifi zierung eines (Erst-)Beladungscarriers, der für eine eventuell vorhandene zweite kinetische Kompo nente HCS (high capacity/low affinity system) ver antwortlich ist. Hinzu kommen aller Wahrscheinlich keit nach vorliegende große Unterschiede in den Saccharose-Transportmechanismen zwischen den unter schiedlichen Pflanzenspezies (Lalonde et al., a. o. O.) und die Vielzahl potenzieller Regulationsmecha nismen sowie Einflussfaktoren auf transcriptionel ler und post-transcriptioneller Ebene (Kühn et al., Science (1997)275, 1298-1300). In Lalonde et al. (a. o. O.) wird gemutmaßt, dass neben den Saccharo se-Transportern weitere funktionelle Elemente am Saccharose-Transport beteiligt sind, beispielsweise Regulator- und Sensorelemente. Die außerordentliche Komplexität des Saccharose-Transportsystems erlaubt bisher jedoch keine gezielte Zuordnung von Struktu ren zu Funktionen und eine Vorhersage von deren Wechselwirkungen in einer Art und Weise, die es er möglicht, gezielte Eingriffe in den Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transport mit dem Ziel vor zunehmen, hinsichtlich bestimmter Eigenschaften verbesserte Pflanzen zu erhalten. Dies lässt sich am deutlichsten daran erkennen, dass eine Überex pression von SUT1 keine Änderungen in der Allokati on von Assimilaten erbrachte, sondern lediglich ei nen Einfluss auf das Blühverhalten zeigte (US 6,025,544; P 44 39 748.8).

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht also darin, Verfahren und Mittel für die Herstellung einer gentechnisch modifizierten Pflanze bereitzustellen, die es er lauben, gezielt in die Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transportströme der Pflanze dergestalt einzugreifen, dass eine Pflanze mit verbesserten Eigenschaften, z. B. höheren Zuckergehalten in Sink-Organen, insbesondere in den Ernteorganen, er zeugt werden kann.

Die Erfindung löst dieses Problem durch die Bereit stellung eines Verfahrens zur Modifizierung des Saccharid-Fluxes und/oder der Saccharid- Konzentration, insbesondere Saccharose-Flux und/oder -konzentration in Geweben einer Pflanze, gemäß dem in einer Pflanze eine modifizierte Akti vität eines Saccharid-Transporters mit geringer Saccharid-Affinität, aber hoher Saccharid- Transportkapazität erzeugt wird. Die erfindungsge mäße Lehre stellt erstmals Mittel und Verfahren zur Verfügung, ganz gezielt den Saccharid-Flux und die Saccharid-Konzentration in den verschiedenen Gewe ben der Pflanze durch Modifizierung der Aktivität eines Saccharid-Transporters mit niedriger Saccha rid-Affinität und hoher Saccharid-Transport kapazität zu beeinflussen, d. h. zu modifizieren, wobei im Verlauf dieses Verfahrens eine modifizier te Pflanze hergestellt wird. Die vorliegende Erfin dung stellt erstmals ein HCS-System, also ein Sac charose-Transportsystem mit hoher Transportkapazi tät für Saccharose, aber niedriger Affinität zu Saccharose, bereit das, insbesondere in Mikrovenen einer Pflanze, exprimiert wird.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Modifizierung der Aktivität des Saccha ridtransports, insbesondere eines Saccha ridtransporters eine gegenüber der Wildtyp- Aktivität erfolgte Veränderung der normalerweise vorliegenden Aktivität verstanden, z. B. eine voll ständige Unterdrückung, Reduzierung oder Aktivi tätssteigerung. Diese Aktivitätssteigerung kann auf eine veränderte Aktivität des Proteins selbst zu rückzuführen sein, bewirkt z. B. durch posttransc riptionelle Modifikationen wie Phosphorylierungen oder Dephosphorylierungen. Sie kann aber auch auf eine geänderte Expressionsrate des codierenden Gens, eine geänderte Stabilität oder Translations rate der gebildeten mRNA oder ähnliches, also auch auf eine geänderte Menge vorhandenen Saccharid- Transporters in einem Gewebe zurückgehen. Die Modi fizierung der Aktivität des Saccharid-Transporters kann auch durch die Modifizierung der Aktivität ei nes die Aktivität des Saccharid-Transporters kon trollierenden oder regulierenden Elements, z. B. ei nes Sensor- oder Regulatorproteins erfolgen.

Unter einem Saccharid wird in bevorzugter Ausfüh rungsform Saccharose und unter einem Saccharid- Transporter ein Saccharose-Transporter, insbesonde re, falls nicht anders angegeben, SUT4 (Sucrose transporter 4) verstanden, also ein Transporter mit geringer Affinität zu Saccharose und hoher Trans portkapazität für Saccharose.

Geringe oder niedrige Affinität im Sinn der vorlie genden Erfindung ist eine Affinität, die unterhalb der SUT1-Affinität liegt, z. B. um 50%, vorzugsweise 80%, 100%, 200%, 300% oder 400% unterhalb der von SUT1 liegt, z. B. eine Affinität K_m < 2,7 mM, vorzugsweise < 4 mM, < 6 mM, < 8 mM, < 10 mM, < 15 mM, < 20 mM und bevorzugt < 25, insbesondere 26 mM. Hohe Transportkapazität im Sinn der vorliegenden Erfindung ist eine oberhalb der Transportkapazität von SUT1 liegende Transportkapazität, z. B. um 50%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500% ober halb der von SUT1. Bevorzugt ist eine Transportka pazität V_max von < 0,7, insbesondere < 1, < 1.5, < 2, < 3, < 3,5 insbesondere 3,6 nmol cm^-2 min^-1.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis und die daraus abgeleitete Lehre zugrunde, mit technischen, insbe sondere gentechnischen, Mitteln, eine gegebenen falls nur endogen vorhandene Aktivität des genann ten Saccharid-Transporters zu beeinflussen oder ei ne solche Aktivität in eine Pflanze neu einzufüh ren.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer den unter dem Begriff Sink-Organe Organe oder Gewe be von Pflanzen verstanden, die in ihrer Nettobi lanz Photoassimilate importieren müssen. Derartige Pflanzenorgane oder Gewebe sind junge Blätter, Knollen, Früchte, Wurzeln, Blüten, reproduktive Or gane, Holz, Markgewebe, Knospen, Samen, Rüben etc.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer den unter dem Begriff Source-Organ Organe oder Ge webe von Pflanzen verstanden, die in ihrer Nettobi lanz Photoassimilate im Überschuss aufweisen und diese exportieren können. Source-Organe sind z. B. ausgewachsene Blätter und keimende Samen, Knollen und Zwiebeln.

Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expressionsrate des erfindungsgemäß modifi zierten Saccharid-Transporters beziehungsweise eine erhöhte Transportrate beispielsweise in Geleitzel len und/oder Siebelementen die Saccharid-, insbe sondere Saccharose-Beladung des Phloems, insbeson dere unter hoher Lichtintensität oder CO₂-Konzent ration, beträchtlich erhöht, wodurch vorteilhafter weise Pflanzen mit Ernteorganen erhalten werden können, die einen erhöhten Saccharose-Gehalt auf weisen. Die Erfindung löst das Problem also insbe sondere durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Modifizierung des Saccharid-Fluxes und/oder der Saccharid-Konzentration in Geweben einer Pflanze, wobei die Aktivität eines Saccharid-Transporters mit niedriger Affinität zum Saccharid und hoher Transportkapazität für das Saccharid modifiziert wird durch das Transformieren mindestens einer Pflanzenzelle mit mindestens einem Vektor, der die Modifizierung des Saccharid-Transporters ermögli chende Nucleotidsequenzen enthält, und wobei die diese Nucleotidsequenzen stabil integriert enthal tende Pflanzenzelle zu einer Pflanze regeneriert wird, in deren Gewebe ein modifizierter Saccharid- Flux und/oder eine modifizierte Saccharid- Konzentration, jeweils im Vergleich mit einer Wild typ-Pflanze, also einer nicht erfindungsgemäß transformierten Pflanze, vorhanden ist. Die Erfin dung stellt also die Lehre bereit, einen Saccharid- Transporter mit hoher Transportkapazität für das Saccharid und mit niedriger Affinität zu dem Sac charid gezielt zu modifizieren, wobei dies mittels einer gentechnischen Manipulation der Pflanze ge schieht.

Erfindungsgemäß kann dies geschehen, indem eine Pflanzenzelle mit mindestens einem die codierenden Nucleotidsequenzen des Saccharid-Transporters ent haltenden Vektor transformiert wird, der vorzugs weise nach stabiler Integration der Nucleotidse quenzen in das Genom der transformierten Zelle eine Überexpression des Saccharid-Transporters in trans formiertem Gewebe ermöglicht.

Die Überexpression der erfindungsgemäß eingesetzten Nucleotidsequenz des genannten Saccharid- Transporters, z. B. in Siebelementen oder Geleit zellen, führt zu einer verstärkten Saccharose- Beladung des Phloems. Mittels der erfindungsgemäßen Verfahrensweise hergestellte Pflanzen weisen z. B. einen höheren Kohlenhydratgehalt in Sink-Organen, beispielsweise Wurzeln, Früchten, Knollen, Blüten oder Samen auf. In vorteilhafter Weise ergibt sich ein höherer Kohlenhydratgehalt insbesondere in Ern teorganen der Pflanze, die häufig Sink-Organe sind. Wird die erfindungsgemäße Verfahrensweise in einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung bei ölhaltigen Pflanzen, z. B. Raps, eingesetzt, kann ein erhöhter Ölgehalt in den Ernteorganen festgestellt werden. Als besonders vorteilhaft er weist sich die Beobachtung, dass die Anzahl der Ernteorgane pro Pflanze gesteigert und auch deren Gewicht vergrößert werden kann.

Die erfindungsgemäß vorgesehene Überexpression des Saccharid-Transporters der genannten Art in Source- Organen kann vorteilhafterweise auch dazu führen, dass die Blütezeit der transformierten Pflanze ver ändert wird.

Da der Transport von Zucker im Phloem häufig rezip rok mit dem Aminosäuretransport im Phloem gekoppelt ist, kann durch die erfindungsgemäß vorgesehene Er höhung des Saccharid-Gehaltes im Phloem der uner wünschte Aminosäuregehalt in Sink-Organen, z. B. Kartoffelknollen oder Pfahlwurzeln der Zuckerrübe, gesenkt werden. Schließlich ermöglicht es die er findungsgemäße Verfahrensweise, die Glycosylie rungsrate endogen in Pflanzen vorhandener Substan zen oder auch exogen applizierter Substanzen wie Xenobiotika, z. B. Herbizide oder Pestizide, zu er höhen und so deren Mobilität zu steigern.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die vorstehend be schriebene Überexpression in Source-Organen dadurch erreicht, dass SUT4-codierende Nucleotidsequenzen unter der Kontrolle Source-spezifischer Promotoren, also insbesondere blattspezifischer und/oder ge leitzellenspezifischer Promotoren, in einen Vektor cloniert, in mindestens eine Pflanzenzelle trans formiert und, vorzugsweise stabil, in das Genom der Pflanzenzelle integriert werden.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann vorgesehen sein, konstitutiv exprimierende Promoto ren wie den 35SCaMV-Promotor, den geleitzellenspe zifischen rolC-Promotor aus Agrobakterium oder den Enhanced PMA4-Promotor (Morian et al., Plant J (1999) 19, 31-41) einzusetzen.

Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, die Modifizierung des Saccha rid-Transports dadurch vorzunehmen, dass die Akti vität des Saccharid-Transporters durch Überexpres sion in Blattmesophyllgewebe und/oder Blattepider mis modifiziert wird. Die spezifische Expression SUT4-codierender Nucleotidsequenzen in diesen Gewe ben führt zu einem kompetitiven Effekt hinsichtlich des endogenen in den Siebelementen aktiven Saccha rose-Transporters, so dass der Kohlenhydrat-Gehalt in den Blättern erhöht wird. Die auf diese Weise hergestellten Pflanzen haben größere Blätter, die überdies ein verbessertes Schutzpotential gegenüber Pathogenen aufweisen. Dies liegt unter anderem dar an, dass Gene mit Abwehrfunktion durch einen erhöh ten Zuckergehalt aktiviert werden. Zudem ergibt sich eine dickere Cuticula und ein höherer Gehalt an Sekundärmetaboliten, die unter anderem als Vor läufer für die Herstellung bioabbaubarer Kunststof fe wie PHA (Polyhydroxyalkanoate) dienen. Die in dieser bevorzugten Ausführungsform vorgesehene Ex pression in Blattmesophyll und -epidermis kann durch die in einer besonders bevorzugten Ausfüh rungsform vorgesehene Verwendung des StLS1/L700- Promotors (Stockhaus et al., Plant Cell (1989) 1, 805-813), anderer epidermisspezifischer Promotoren oder des PFP-Promotors (Palisaden-Parenchym) (WO 98/18940) zur Expression der SUT4-codierenden Nuc leotidsequenzen erreicht werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, eine Überex pression des Saccharid-Transporters spezifisch in sink-Zellen oder Organen, insbesondere sich entwi ckelnden Samen einer Pflanze vorzusehen. Dadurch kann unter anderem eine verbesserte Keimungsrate erzielt werden, da sowohl der Kohlenhydrat- als auch insbesondere der Ölgehalt der Samen erhöht wird.

Die in dieser Ausführungsform bevorzugt einzuset zenden gewebespezifischen Promotoren für die Ex pression der SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen in Samengewebe sind z. B. der Vicilin-Promoter aus Pi sum sativum (Newbigin et al., Planta (1990) 180, 461-470).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein vorgenanntes Verfah ren vorgesehen, wobei eine Überexpression des Sac charid-Transporters durch Verwendung gewebespezifi scher regulatorischer Elemente für Epidermis und Parenchym von Sink-Organen vorgesehen ist. Die ver stärkte Expression des erfindungsgemäß eingesetzten Saccharid-Transporters in Sink-Organen erhöht deren Saccharid-Aufnahmekapazität und den Saccharid-Flux in das Sink-Gewebe. Erfindungsgemäß hergestellte Pflanzen weisen daher beispielsweise größere, far bigere und/oder eine höhere Zahl von Blüten, größe re Samen, größere Knollen oder größere Pfahlwurzeln auf. Die Sink-Organe können sich ferner durch einen höheren Kohlenhydrat- und Ölgehalt, eine verbesser te Struktur, insbesondere Festigkeit, ein schnelle res Wachstum und/oder gegebenenfalls verbesserte Kältetoleranz aufgrund des höheren Gehalt osmotisch aktiver Substanzen auszeichnen. Zudem ist es mög lich, die Blütezeit und -dauer ebenso wie die Ent wicklung der Früchte zu beeinflussen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung vor, für die vorgenannte Über expression in Sink-Epidermis und -Parenchym den AAP-1 (Aminosäurepermease 1)-Promotor, z. B. den A-rabidopsis-Promoter AtAAP1 (Expression in Endosperm und während früher Embryoentwicklung) oder AtAAP2 (Expression in Phloem des Funiculus) (Hirner et al., Plant J. (1998) 14, 535-544, den B33 (Pata tin)-Promotor (Rocha-Sosa et al., EMBO J. (1998) 8, 23-29) (Zugangsnummer: X14483; alle hier genannten Zugangsnummern beziehen sich auf folgende Genbank, falls nicht anders angegeben: National Center for Bictechnology Information, National Library of Me dicine, Bethesda, MD 20894, USA), insbesondere für Knollen und Pfahlwurzeln, den Vicilin (Speicherpro tein)-Promotor aus Pisum sativum (Newbigin et al., Planta (1990) 180, 461-470)(Zugangsnr. M73805) und/oder Samen- und Blüten-spezifische Promotoren einzusetzen.

Die Erfindung betrifft auch die Modifizierung der Saccharid-Transport-Aktivität in Geweben einer Pflanze, wobei die Aktivität eines Saccharid- Transporters, insbesondere Saccharose-Transporters, mit hoher Transportkapazität für Saccharose und niedriger Affinität zu Saccharose unterdrückt oder reduziert, insbesondere inhibiert oder cosuppri miert wird.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Aktivität des Saccharid-Transports dadurch un terdrückt bzw. reduziert werden, dass Pflanzenzel len mit Vektoren transformiert werden, die den er findungsgemäß eingesetzten Saccharid-Transporter- codierende Nucleotidsequenzen oder für eine Anti sense-Repression ausreichende Teile davon in Anti sense-Orientierung zu einem Promotor aufweisen und vorzugsweise stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert werden. Die Expression dieser Antisense- RNA unterdrückt bzw. reduziert die Bildung des ge nannten endogen vorhandenen Saccharid-Transporters, sodass der durch diesen Transporter bewirkte Sac charid-Flux manipuliert werden kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, die Aktivität dieses Saccharid- Transporters durch in die Pflanze eingeführte Co suppressionseffekte zu reduzieren bzw. zu unterdrü cken. Zur Erzielung dieser Cosuppressionseffekte werden in bevorzugter Ausführungsform mehrere Ko pien eines Vektors in mindestens eine Pflanzenzel le, insbesondere stabil in deren Genom, einge bracht, der den Saccharid-Transporter-codierende Nucleotidsequenzen oder Teile davon aufweist und wobei diese Kopien im Genom integriert werden.

In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, die Aktivität des Saccharid-Transporters da durch zu unterdrücken bzw. zu reduzieren, dass, vorzugsweise gewebespezifisch, endogen vorhandene, also im nicht-transformierten Wildtyp bereits vor liegende Nucleotidsequenzen des erfindungsgemäß eingesetzten Saccharid-Transporters mutagenisiert werden, beispielsweise durch Transposonmutagenese.

Schließlich kann erfindungsgemäß vorgesehen sein, die Aktivität oder Expression des Saccharose- Transporters durch RNA-Doppelstrang-Inhibierung zu reduzieren oder zu unterdrücken.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die vorgenannten Techniken zur Unterdrückung oder Reduzierung der Aktivität des Saccharid-Transporters mit geringer Affinität zu Saccharose, aber hoher Saccharose- Transportkapazität eingesetzt, um beispielsweise in Source-Geweben, z. B. Blättern, einen höheren Ge halt an Kohlenhydraten, insbesondere Saccharose, aufzubauen. Dies kann in besonderer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch vorstehend be schriebene Reduzierung oder Unterdrückung der Sac charid-Transportkapazität in Source-Organen gesche hen. Dadurch wird die Struktur und Festigkeit von Sink-Organen reduziert, während der Saccharose- bzw. Kohlenhydratgehalt in Source-Organen ansteigt. Hierdurch kann eine höhere Süße von Ernteorganen bestimmter Pflanzen erreicht werden, deren Blätter als Nahrungsmittel dienen, z. B. Salat oder Spinat. Zudem können - durch Kompetition erzielte - Vorteile erreicht werden, wie sie vorstehend bereits für die Überexpression des Saccharid-Transporters in Blatt mesophyll und Epidermis beschrieben wurden. Schließlich kann durch den reduzierten Saccharose- Flux in den Stamm einer Pflanze dessen Länge redu ziert werden, was insbesondere für die Herstellung von Zwergvarianten von Pflanzen, z. B. bei bestimm ten Apfelsorten, oder ähnlichem wünschenswert ist.

In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, die Aktivität des Saccharid-Transporters in den Schließzellen zu unterdrücken oder zu reduzie ren, beispielsweise durch in Schließzellen vorge nommene Mutagenese endogen vorhandener Nucleotidse quenzen, die den Saccharid-Transporter codieren, durch Cosuppressions-Effekte, RNA-Doppelstrang- Inhibierung oder durch Verwendung von Antisense- Konstrukten. Durch die Modifizierung von Saccharid- Transportvorgängen und den damit verbundenen Verän derungen in der Bereitstellung von Energie und os motisch aktiven Stoffen in Schließzellen kann die Kapazität zur Öffnung oder zum Schließen der Stoma ta geändert werden, insbesondere erhöht oder redu ziert werden. Eine höhere Öffnungsrate der Stomata erlaubt eine verbesserte Zufuhr für CO₂, so dass die Photosyntheserate verbessert wird. Wird erfin dungsgemäß das Öffnen der Stomata verhindert oder in seiner Frequenz reduziert, kann eine erhöhte Trockenresistenz der Pflanze erzielt werden. In be sonders bevorzugter Weise wird für die Erzielung der vorgenannten Effekte ein Vektor verwendet, in dem den erfindungsgemäß eingesetzten Saccharid- Transporter-codierende Nucleotidsequenzen in Sense- oder Antisense-Orientierung z. B. unter der Kon trolle eines Schließzellen-spezifischen Promotors, z. B. des KAT1-Promotors (Nakamura et al., Plant Physiol. (1995) 109, 371-374) stehen.

Da der Saccharidtransporter SUT4 auch in sink- Organen exprimiert wird, kann vorgesehen sein, den Saccharid-Import in die sink-Zellen oder Organe oder bevorzugt in bestimmte sink-Zellen oder Orga ne, besonders bevorzugt in die Blüte zu reduzieren. Dadurch kann erreicht werden, daß in Source-Zellen oder Organen Kohlenhydrate akkumulieren, die für andere Synthesewege nützlich sind und es kann die relative Aktivität einzelner sink-Zellen zugunsten anderer verschoben werden um somit die Erträge qua litativ und quantitativ zu verbessern.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ferner vorgesehen, die vorgenannten Verfahren durchzuführen, wobei zusätz lich zu den oder anstelle der den erfindungsgemäß eingesetzten Saccharid-, insbesondere Saccharose- Transporter, besonders bevorzugt SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen weitere Nucleotidsequenzen zur Transformation verwendet werden, die im funktionel len Zusammenhang mit der Saccharose-Konzentration und dem Saccharose-Flux in Geweben eine Pflanze stehen.

In besonders bevorzugter Ausführungsform sind dies Nucleotidsequenzen, die SUT1 oder SUT2 codieren, z. B. genomische oder cDNA-Nucleotidsequenzen.

SUT1-genomische und cDNA-Sequenzen sind z. B. aus der WO94/00574 (Kartoffel, Spinat), Riesmeier et al., a. a. O. (Kartoffel), Riesmeier et al., (EMBO J. (1992)11, 4705-4713 (Spinat)), Bürkle et al., (Plant Physiol. (1998)118, 59-68 (Tabak)), Hirose et al., (Plant Cell Physiol. (1997)38, 1389-1396 (Reis)), Weig und Komor (J. Plant Physiol. (1996)147, 685-690 (Ricinus)), Weber et al., (The Plant Cell (1997)9, 895-908 (Vicia faba)), Shakya und Sturm (Plant Physiol. (1998)118, 1473-1480 (Ka rotte)), Tegeder et al. (The Plant Journal (1999) Plant J. (1999) 18, 151-161 (Pisum sativum)), Noi raud et al. (Poster abstract 11^th Inter. Workshop on Plant Membrane Biology, Cambridge, UK (1998) (Apium graveolens)), Picaud et al., (Poster abstract 11^th Inter. Workshop on Plant Membrane Biology, Cam bridge, UK (1998) (Vitis vinifera)) und Zuckerrübe (Zugangsnummer: X83850) bekannt, die hinsichtlich der Nucleotidsequenzen, der Aminosäuresequenz von SUT1 und deren Gewinnung vollständig in den Offen barungsgehalt der vorliegenden Lehre mit einbezogen sind und für die im Zusammenhang mit der vorliegen den Lehre auch Schutz begehrt wird. Erfindungsgemäß eingesetzte SUT1-codierende Nucleiotidsequenzen ebenso wie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 22 und 23 sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. SUT1 stellt einen Saccharose-Transporter mit hoher Affinität zu Saccharose, aber geringer Transportkapazität für Saccharose dar. Eine Coexpression von Saccharose- Transportern mit unterschiedlichen Affinitäten zu Saccharose in ein und demselben Gewebe, z. B. in Siebelementen, erlaubt eine regulierte und den tat sächlichen in der Pflanze vorhandenen Gegebenheiten gerecht werdende Manipulation des Saccharose- Fluxes.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor zur Trans formation der mindestens einen Pflanzenzelle ver wendet, der SUT2-codierende Nucleotidsequenzen auf weist. SUT2 fungiert erfindungsgemäß insbesondere als Regulator und Sensor. SUT2 weist überdies die biologische Aktivität eines niedrig affinen Saccha rose-Transports auf. Die Transport-Raten von SUT2 sind ebenfalls niedrig. Ohne durch die Theorie ge bunden zu sein, ist SUT2 ein Regulator und/oder Sensor des Saccharose-Transporters, der insbesonde re seine eigene Transportaktivität feststellen und gegebenenfalls weiter vermitteln kann. Seine Trans portaktivität kann einerseits als funktionaler Be standteil seiner Sensoraktivität und andererseits kann seine Sensoraktivität als funktionaler Be standteil seiner Transportaktivität angesehen wer den. SUT2 mit seiner niedrigen Affinität für Sac charose ist erfindungsgemäß ein Flux-Sensor, der möglicherweise ein Substrat, nämlich Saccharose, transportiert und eine Signalkaskade verwendet be ziehungsweise Bestandteil selbiger darstellt, die die Transportrate misst. Die Affinität von SUT2 für Saccharose ist geringer als die von SUT4. Erfin dungsgemäß konnte in besonders bevorzugter Ausfüh rungsform gezeigt werden, dass die N-Termini von Proteinen der SUT/SUC-Genfamilie eine modifizierte Affinität gegenüber ihrem Substrat, insbesondere Saccharose vermitteln. Insbesondere die N-Termini von SUT2, aber auch von SUT1 vermitteln eine modi fizierte Saccharose-Affinität, im Fall von SUT2 niedrige und im Fall von SUT1 hohe Affinität für Saccharose.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von N-Termini von Saccharose-Transportern bezie hungsweise diese codierender Nucleotidsequenzen, insbesondere pflanzlichen Saccharose-Transportern zur Modifizierung des Saccharose-Transports oder des Saccharose-Sensings in Pflanzen, insbesondere zur Herstellung modifizierter Saccharose- Transporter und -Sensoren mit modifizierter Affini tät für Saccharose in Pflanzen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von SUT2 und/oder SUT2-codierenden DNA-Sequenzen, insbeson dere des SUT2-loops als Regulator und Sensor des Saccharose-Transports, insbesondere zur Regulation der SUT4- und/oder SUT1-Aktivität z. B. in Pflanzen- oder Pilzzellen. Überdies konnte erfindungsgemäß gezeigt werden, dass SUT2 durch Saccharose indu zierbar ist. SUT2 reguliert die relative Aktivität von in demselben Zelltyp, z. B. in den Siebelemen ten vorhandenen Saccharose-Transportern. Insbeson dere reguliert SUT2 die Aktivität des Saccharose- Transporters SUT1, der hohe Saccharose-Affinität, aber geringe Transportkapazität aufweist und den SUT4-Saccharose-Transporter mit hoher Transportka pazität, aber geringer Saccharose-Affinität. Diese Regulation kann über die Kontrolle der Expression, der Proteinaktivität, z. B. durch Proteinmodifika tion oder der turnover-Rate von mRNA oder Protein erfolgen und in einer Aktivitätssteigerung oder -reduzierung resultieren. SUT2 wird in Pflanzen insbesondere in den großen Blattadern ausgewachse ner Blätter, Blüten und Sink-Organen exprimiert.

Die Erfindung betrifft daher auch die vorgenannten N-Termini und Zentralschleifen beziehungsweise Loops von Proteinen aus der SUT/SUC-Genfamilie, insbesondere von SUT1, SUT2 und/oder SUT4 sowie die diese Bereiche codierenden Nucleotidsequenzen. Die se sind in bevorzugter Ausführungsform dargestellt in SEQ ID Nr. 24, 25 und 26. Die N-Termini von LeSUT2 (Lycopersicon esculentum) und StSUT2 (Sola num tuberosum) umfassen die ersten 62 Aminosäuren des Proteins und sind codiert durch die Nucleotide 1 bis 186 von SEQ ID Nr. 4 (Lycogersicon esculen tum) beziehungsweise Nr. 29 (Solanum tuberosum). Die Zentralschleife von LeSUT2 wird durch die Nuc leotide 844 bis 1131 von SEQ ID Nr. 4 und von StSUT2 durch die Nucleotide 847 bis 1134 von SEQ ID Nr. 29 codiert.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, die, vorzugsweise in einem Vektor, an geordneten SUT1-, SUT4- und/oder SUT2-codierenden Sequenzen in Sense- oder Antisense-Orientierung zu mindestens einem regulatorischen Element, insbeson dere einem Promotor, z. B. je nach gewünschter Ge webespezifität einen der vorgenannten Promotoren, in Pflanzenzellen zu transformieren, wobei nach In tegration im Genom und Expression des Produktes die Aktivität von cotransformierten und/oder endogen vorhandenen SUT4 modifiziert wird.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein vorge nanntes Verfahren, wobei ein Vektor in die Pflan zenzelle transformiert wird, welcher SUT2- codierende Nucleotidsequenzen enthält, vorzugsweise in Sense- oder Antisenseorientierung unter der ope rativen Kontrollen eines regulatorischen Elementes, insbesondere eines Promotors. Es kann dabei vorge sehen sein, den die SUT2-codierenden Nucleotidse quenzen enthaltenden Vektor ohne weitere Vektoren, die z. B. SUT4- oder SUT1-codierende Nucleotidse quenzen enthalten, zu transformieren. Die Transfor mation, Integration und Expression der SUT2- codierenden Nucleotidsequenzen führt aufgrund der erfindungsgemäßen Lehre, dass SUT2 insbesondere ein Saccharosekonzentrations-Sensor und -regulator mit den vorstehend genannten Transportereigenschaften sowie Saccharose-Flux-Sensor und -regulator ist, zu einer Modifizierung der Aktivität des Saccharo setransports in der transformierten Pflanze, insbe sondere der endogen vorhandenen Saccharose- Transporter, nämlich SUT4 oder/und SUT1. Diese Re gulation kann auf transkriptionellem oder posttranskriptionellem Niveau erfolgen, beispiels weise durch direkte Proteininteraktion oder indi rekt über Signaltransduktion.

Selbstverständlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung der SUT2-codierenden Nucleotidsequenzen oder von Teilen davon, insbesondere der den N-terminalen Proteinbereich codierenden Nukleotidse quenz, zur Transformation von Pflanzenzellen, wobei diese zusammen mit SUT1- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen transformiert werden können. Auch in einem solchen Fall kann die Überexpression, Cosuppression oder Antisense-Repression von SUT2 die Aktivität von SUT1 und/oder SUT4 modifizieren, z. B. erhöhen oder reduzieren. In besonders bevor zugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann vorgesehen sein, Teile der SUT2-codierenden Nucleotidsequenzen, insbesondere die den N-terminalen Proteinbereich codierenden Nucleotidse quenzen von SUT2 (SEQ ID Nr. 24) oder die den zent ralen, cytoplasmatischen Loop-codierenden Nucleo tidsequenzen (SEQ ID Nr. 26) im Rahmen von chimären Genkonstrukten einzusetzen, die Proteine mit der biologischen Aktivität eines Saccharose- Transporters codieren und zum Beispiel als N-Terminus beispielsweise die SUT2 codierenden Nucle otidsequenzen sowie im Zentralbereich und am C-terminalen Ende Nucleotidsequenzen eines anderen Saccharose-Transporters, zum Beispiel von SUT1 oder SUT4 aufweisen. Derartige SUT2-Nucleotidsequenzen, die SUT2 oder Teile von SUT2 enthalten, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch als modifi zierte SUT2-Nucleotidsequenzen bezeichnet.

Als Regulator interagiert SUT2 mit anderen Protei nen, insbesondere mit Regulatoren, Signaltransduk tionsfaktoren und anderen Saccharosetransportern. Daher können unter Nutzung von SUT2 durch Interak tionsklonierung weitere Regulatoren identifiziert werden, für die ebenfalls Schutz begehrt wird.

Die Erfindung betrifft auch vorzugsweise isolierte und gereinigte Regulatorproteine und Sensorprotei ne sowie diese codierende Nucleotidsequenzen, die die zentrale cytoplasmatische Schleife von SUT2 enthalten, insbesondere chimäre Proteine und Nuk leinsäuren mit N- und C-terminalen Bereichen von anderen Sacharosetransportern, beziehungsweise die se codierende Nucleotidsequenzen, wobei diese chi mären Proteine beziehungsweise Nucleinsäuren die Zentralschleife (loop) von SUT2 enthalten. Dem zentralen cytoplasmatischen Loop oder Schleife kommt eine biologische Aktivität als Regulatorele ment und/oder Sensor und/oder Signaltransduktor zu.

Die Erfindung betrifft in einer Ausführungsform al so die vorgenannten Verfahren zur Modifizierung der Aktivität eines Saccharose-Transporters mit niedri ger Affinität zu Saccharose, aber hoher Transport aktivität für Saccharose im Rahmen dessen bekannte bzw. modifizierte SUT4-, SUT1- und/oder SUT2- codierende Nucleotidsequenzen eingesetzt werden, um die Modifizierung zu erreichen und eine verbesserte transgene Pflanze zu erhalten.

Die Erfindung betrifft also in einer weiteren Aus führungsform auch Verfahren zur Herstellung trans gener, modifizierter Pflanzen, die eine veränderte Aktivität des genannten Saccharose-Transporters aufweisen und, vorzugsweise stabil im Genom integ riert, modifizierte SUT1-, SUT2- und/oder SUT4- Nucleotidsequenzen enthalten. Die Erfindung be trifft auch die so hergestellten transgenen Pflan zen, Pflanzenzellen, Organe oder Teile von Organen und Pflanzen, die sich durch die veränderte Aktivi tät des genannten Saccharose-Transporters auszeich nen und mindestens eine der genannten Nucleotidse quenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Nucleotidsequenzen, insbesondere Genen für Sac charid-Transporter, wie SUT- und SUC-Genen, vor zugsweise für SUT1; SUT2; SUT4; SUT1 und SUT2; SUT1 und SUT4; SUT2 und SUT4; SUT1 und SUT2 und SUT4 in modifizierter Form enthalten. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer modifi zierten Nucleotidsequenz eine von der Wildtyp- Sequenz, insbesondere dem Wildtypgen, abweichende Nucleotidsequenz verstanden, beispielsweise eine Abweichung, die auf Nucleotidinsertionen, -inversionen, -deletionen, -austauschen, -additionen oder ähnlichem beruhen. Beispielsweise stellen mo difizierte Nucleotidsequenzen auch solche Gene dar, die die codierende Nucleotidsequenz des Wildtypes enthalten, wobei diese codierende Nucleotidsequenz operativ in Sense- oder Antisense-Orientierung mit einem heterologen Promotor z. B. einem gewebespezi fischen oder konstitutiv exprimierenden Promotor verknüpft sind. Im Zusammenhang mit der vorliegen den Erfindung kann eine modifizierte Nucleotidse quenz auch dann vorliegen, wenn sie exakt der Wild typ-Sequenz entspricht, jedoch in zusätzlicher Ko pienzahl oder/und an einem anderen Ort im Genom als die natürlicherweise vorkommende Sequenz vorliegt.

Eine modifizierte Nucleotidsequenz liegt auch dann vor, wenn die natürlicherweise endogen vorkommenden Nucleotidsequenz durch Mutagenese, beispielsweise Transposon-Mutagenese, geändert wurde. Im Zusammen hang mit der vorliegenden Erfindung werden unter modifizierten Genen also solche Nucleotidsequenzen verstanden, die in der Nucleotidsequenz ihrer regu latorischen und/oder Protein-codierenden Bereiche Abweichungen, z. B. Insertionen, Additionen, Dele tionen, Austausche oder ähnliches gegenüber der Wildtypsequenz enthalten, also auch als Mutanten, Derivate oder funktionelle Äquivalente bezeichnet werden können. Modifizierte Nucleotidsequenzen be ziehungsweise modifizierte Gene können auch chimäre Nucleotidsequenzen oder Gene sein, also beispiels weise solche Protein codierende Bereiche, die sich aus zwei oder mehreren unterschiedlichen natürli cherweise nicht zusammen vorkommenden Nucleotidse quenzen zusammensetzen, beispielsweise Konstrukte, die als N-terminale Nukleotidsequenz SUT2 codieren de Sequenzen (SEQ ID Nr. 24) und als Zentral- und 3'-terminalen Bereich SUT1-codierende Sequenzen aufweisen. Erfindungsgemäß werden unter modifizier ten Genen aber auch solche verstanden, die als 5'- codierenden Bereich Sequenzen des SUT1-Gens (zum Beispiel SEQ ID Nr. 25) und als Mittelbereich oder/und 3'-Bereich Sequenzen des SUT2-Gens enthal ten.

Modifizierte Gene können demgemäss z. B. die Wild typ-codierenden Sequenzen und heterologe Promotoren z. B. aus anderen Organismen oder von anderen Genen enthalten.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Gen eine unter der operativen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes stehende Protein codierende Nucleotidsequenz verstanden.

Die Erfindung betrifft auch Mittel zur Modifizie rung des Saccharose-Transports. Diese Mittel sind Nucleinsäuremoleküle, codierend einen Saccharid- Transporter mit niedriger Saccharid-Affinität und hoher Transportkapazität für das Saccharid oder Teile davon, insbesondere Saccharose, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID Nr. 1, 2 oder 27 dargestellte Nucleotidse quenz umfassen, eines Teils oder eines kom plementären Strangs davon,
b) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter SEQ ID Nr. 5, 6 oder 28 darge stellten Aminosäuresequenz codieren und
c) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem der unter a) und b) genannten Nucleinsäuremole küle hybridisieren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Saccharid-Transporter ein Saccharose- Transporter, insbesondere SUT4, z. B. aus Arabi dopsis (Arabidopsis thaliana, At), Tomate (Lycoper sicon esculentum, Le) oder Kartoffel (Solanum tube rosum, St). Die vorgenannten Nucleinsäuremoleküle werden auch als SUT4-codierende Sequenzen bezeich net.

Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, codierend einen Sensor und/oder Regulator für den Saccharose-Transport in Pflanzen und mit den Eigen schaftes eines niedrig affinen Saccharose- Transporters mit niedrigen Transport-Raten oder Teile davon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID Nr. 3, 4, 24, 26 oder 29 dargestellte Nuc leotidsequenz umfassen, eines Teils oder eines komplementären Strangs davon,
b) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter SEQ ID Nr. 7, 8 oder 30 darge stellten Aminosäuresequenz codieren und
c) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem der unter a) und b) genannten Nucleinsäuremole küle hybridisieren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Saccharid-Sensor und/oder -Regulator ein Sac charose-Sensor und/oder Regulator, insbesondere SUT2, z. B. aus Kartoffel, Tomate oder Arabidopsis. Die vorgenannten Nucleinsäuremoleküle werden auch als SUT2 codierende Sequenzen bezeichnet.

Die erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß einge setzten Nucleinsäuremoleküle können aus natürlichen Quellen isoliert und gereinigt werden, vorzugsweise aus der Kartoffel, oder sie können nach bekannten Verfahren synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken ist es möglich, verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemä ßen oder die bereits bekannten erfindungsgemäß ein gesetzten Nucleinsäuremoleküle einzufügen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell verän derten biologischen Eigenschaften kommt, die eben falls von der Erfindung erfasst werden. Mutationen im Sinne der Erfindung betreffen auch alle Deleti onsmutationen, die zu verkürzten Proteinen führen. Durch andere molekulare Mechanismen wie Insertio nen, Duplikationen, Transpositionen, Genfusion, Nucleotidaustausch aber auch durch Gentransfer zwi schen verschiedenen Mikroorganismenstämmen und an dere kann es beispielsweise zu Modifikationen der Aktivität und/oder der Regulierung des Proteins kommen. Auf diese Weise können beispielsweise mut ante Proteine hergestellt werden, die eine verän derte Transportkapazität oder Saccharose-Affinität besitzen und/oder den normalerweise in den Zellen vorliegenden Regulationsmechanismen nicht mehr oder in veränderter Form unterliegen. Des weiteren kön nen erfindungsgemäß mutante Proteine hergestellt werden, die eine veränderte Stabilität, Substrat- Spezifität oder ein verändertes Effektorenmuster oder ein modifiziertes Aktivitäts-, Temperatur-, pH-Wert- und/oder Konzentrations-Profil aufweisen. Weiterhin bezieht sich die erfindungsgemäße Lehre auf Proteine, die eine veränderte aktive Protein konzentration, prä- und posttranslationelle Modifi kationen zum Beispiel Signal- und/oder Transport peptide und/oder andere funktionelle Gruppen auf weisen.

Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, die mit den vorgenannten erfindungsgemäßen Nuclein säuremolekülen hybridisieren. Hybridisierung bedeu tet im Rahmen der Erfindung eine Hybridisierung un ter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, wie sie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A labo ratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe, 1989) beschrieben sind, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen. Gemäß vorliegender Erfindung spricht man von einer Hybridisierung, wenn nach Waschen für 15 Minuten mit 2 × SSC und 0,1% SDS bei 52°C, vorzugsweise bei 60°C und beson ders bevorzugt bei 65°C, insbesondere für 15 Minu ten in 0, 5 × SSC und 0, 1% SDS bei 52°C, vorzugs weise bei 60°C und besonders bevorzugt bei 65°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer der in den Sequenzprotokollen angegebenen Nucleotidsequenzen hybridisierende Nucleotidsequenz ist eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz.

Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nuc leinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder von Teilen dieser Moleküle beziehungsweise des komple mentären Stranges erfolgen. Als Hybridisierungspro be können zum Beispiel Nucleinsäuremoleküle verwen det werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 4 dargestellten Nuc leotidsequenzen oder Teile dieser Sequenz aufwei sen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Frag mente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetech niken hergestellt werden und deren Sequenz im we sentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nuclein säuremoleküls übereinstimmt. Die mit den erfin dungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und al lelische Varianten der oben beschriebenen Nuclein säuremoleküle, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um das beschriebene Protein zu codieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet im Zusammenhang mit der Erfindung, dass sich die Sequenzen dieser Moleküle von den Sequenzen der oben beschriebenen Nuclein säuremoleküle an einer oder mehreren Positionen un terscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet da bei eine Sequenzidentität von mindestens 70%, ins besondere eine Identität von mindestens 75%, vor zugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90% 95%, 97% oder 99% auf Nukleinsäureebene. Da bei weisen die durch diese Nucleinsäuremoleküle co dierten Proteine eine Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 5, 6, 7 oder 8 angegebenen Aminosäurese quenz von mindestens 80%, vorzugsweise 85% und besonders bevorzugt von über 90%, 95%, 97% und 99% auf Aminosäureebene auf. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftre tende Variationen handeln, beispielsweise um Se quenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufge treten sein können oder durch gezielte Mutagenese (UV- oder Röntgenstrahlen, chemische Agenzien oder andere) eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequen zen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten han deln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varian ten. Die von den verschiedenen Varianten der erfin dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Protei ne weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf, wie Aktivität, aktive Proteinkonzentration, posttranslationelle Modifikationen, funktionelle Gruppen, Molekulargewicht, immunologische Reaktivi tät, Konformation und/oder physikalische Eigen schaften, wie das Laufverhalten in Gelelektrophore sen, chromatographisches Verhalten, Sedimentations koeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigen schaften, Stabilität, pH-Wert-Optimum, isoelektri scher pH-Wert, Temperatur-Optimum und/oder andere.

Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich sowohl um DNA- als auch um RNA- Moleküle handeln. Erfindungsgemäße DNA-Moleküle sind beispielsweise genomische DNA- oder cDNA- Moleküle.

Die Erfindung betrifft ferner Vektoren, die erfin dungsgemäße Nucleinsäuremoleküle enthalten.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kön nen Vektoren z. B. Plasmide, Liposomen, Cosmide, Viren, Bacteriophagen, Shuttle-Vektoren und andere in der Gentechnik übliche Vektoren sein. Die Vekto ren können noch weitere Funktionseinheiten besit zen, die eine Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors in einem Wirtsorganismus bewirken oder dazu beitragen.

In einer besonderen Ausführungsform werden erfin dungsgemäß auch die Vektoren erfasst, bei denen das in ihnen enthaltene Nucleinsäuremolekül mit mindes tens einem regulatorischen Element operativ verbun den ist, das die Transcription und Synthese trans latierbarer Nucleinsäuremoleküle in pro- und/oder eucaryotischen Zellen gewährleistet. Derartige re gulatorische Elemente können Promotoren, Enhancer, Operatoren und/oder Transcriptionsterminations signale sein. Selbstverständlich können die Vekto ren auch Antibiotikum-Resistenzgene, Herbizidre sistenzgene also z. B. Selektionsmarker, enthalten.

Die Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausfüh rungsform auch die vorgenannten Vektoren, wobei diese neben der unter Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes stehenden Nucleinsäurese quenzen, welche das erfindungsgemäße SUT4 und/oder SUT2 codieren, eine ebenfalls unter der Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes stehende Nucleinsäuresequenz enthält, die SUT1 codiert. Ein derartiger Vektor weist also die genetische Infor mation für mindestens zwei mit dem Saccharose- Transport befasste Proteine auf. Solche Vektoren erlauben es in besonders einfacher Weise, gezielt und umfassend das System des Saccharose-Transports in einer Pflanze zu modifizieren.

Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die eines der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder ei nen der erfindungsgemäßen Vektoren stabil integ riert oder transient beinhalten beziehungsweise mit diesem transformiert sind und vorzugsweise in der Lage sind, SUT4 und gegebenenfalls SUT1 und/oder SUT2 zu exprimieren. Weiterhin betrifft die Erfin dung Wirtszellen, die von einer mit den erfindungs gemäßen Nucleinsäuremolekülen oder den erfindungs gemäßen Vektoren transformierten Wirtszelle abstam men. Die Erfindung betrifft also Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten, wobei unter einer Wirtszelle ein Organismus verstanden wird, der in der Lage ist, in vitro rekombinante Nucleinsäuremoleküle aufzunehmen und gegebenenfalls die von den erfin dungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codierten Prote ine zu synthetisieren. Vorzugsweise sind dies pro caryotische oder eucaryotische Zellen. Vor allem betrifft die Erfindung Mikroorganismen, die die er findungsgemäßen Vektoren, Derivate oder Teile der Vektoren enthalten, die diese zu einer Synthese von Proteinen mit Saccharose-Transportaktivität befähi gen. Die erfindungsgemäße Wirtszelle kann auch da durch gekennzeichnet sein, dass das eingeführte er findungsgemäße Nucleinsäuremolekül entweder hetero log in bezug auf die transformierte Zelle ist, das heißt natürlicherweise nicht in dieser Zelle vor kommt, oder aber an einem anderen Ort oder einer anderen Kopienzahl im Genom lokalisiert ist als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist diese Wirtszelle also eine procaryotische Zelle, vorzugs weise eine gram-negative procaryotische Zelle, be sonders bevorzugt eine Enterobakterienzelle. Die Transformation procaryotischer Zellen mit exogenen Nucleinsäuresequenzen ist einem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch auch eine eucaryotische Zelle sein, wie eine Pflan zenzelle, eine Pilzzelle, zum Beispiel Hefe oder eine tierische Zelle. Verfahren zur Transformation beziehungsweise Transfektion eucaryotischer Zellen mit exogenen Nucleinsäuresequenzen sind dem Fach mann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig.

Die Erfindung betrifft auch Zellkulturen oder Kal lusgewebe, die mindestens eine der erfindungsgemä ßen Wirtszellen aufweisen, wobei die erfindungsge mäße Zellkultur oder des Kallus insbesondere in der Lage ist, ein Protein mit Saccharose- Transportaktivität zu produzieren.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist die er findungsgemäß eingesetzte Nucleotidsequenz im Vek tor verknüpft mit einem Nucleinsäuremolekül, das eine funktionale Signalsequenz zur Weiterleitung des Proteins an unterschiedliche Zellkompartimente oder die Plasmamembran codiert. Diese Modifikation kann beispielsweise in einer Addition einer N-terminalen Signalsequenz einer höheren Pflanze be stehen, aber auch jede andere Modifikation, die zur Fusion einer Signalsequenz an das codierte Protein führt, ist Gegenstand der Erfindung.

Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäure moleküle in procaryotischen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli, oder in eucaryotischen Zellen, z. B. in Hefe, ist insofern interessant, als dass auf diese Weise z. B. eine genauere Charakterisie rung der Aktivitäten der Proteine, die von diesen Moleküle codiert werden, ermöglicht wird.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform sind, vorzugsweise gereinigte und isolierte Peptide oder Proteine, codiert durch die erfindungsgemäßen Nuc leotidsequenzen, insbesondere mit den Aminosäurese quenzen der SEQ ID Nr. 5 bis 8, 23 bis 26, 28 oder 30, vorzugsweise mit der Aktivität eines Saccharo se-Transporters, insbesondere eines Saccharose- Transporters mit geringer Affinität gegenüber Sac charose und hoher Transportkapazität für Saccharo se, beziehungsweise mit der Aktivität eines Sensors oder Regulators des Saccharosetransports sowie Ver fahren zu deren Herstellung, wobei eine erfindungs gemäße Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese des Proteins erlauben und anschließend das Protein aus den kultivierten Zel len und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.

Ferner betrifft die Erfindung die mit diesen Prote inen spezifisch reagierenden monoclonalen oder po lyclonalen Antikörper.

Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nuc leinsäuremoleküle ist es möglich, mit Hilfe gen technischer Methoden den Saccharose-Transport in Geweben einer beliebigen Pflanze so zu modifizie ren, wie es durch konventionelle, z. B. züchteri sche Maßnahmen bei Pflanzen nicht möglich war, und ihn dahingehend zu verändern, dass es zur gezielten Saccharose-Konzentrationsänderung in bestimmten Ge weben einer Pflanze kommt. Durch eine Erhöhung der Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine, bei spielsweise durch Überexpression entsprechender Nucleinsäuremoleküle, oder durch die Bereitstellung von Mutanten, die nicht mehr den zelleigenen Regu lationsmechanismen unterliegen und/oder unter schiedlicher Temperaturabhängigkeiten in bezug auf ihre Aktivitäten besitzen, besteht die Möglichkeit der Ertragssteigerung in entsprechend gentechnisch veränderten Pflanzen. Möglich ist somit die Expres sion der erfindungsgemäß eingesetzten Nucleinsäure moleküle in pflanzlichen Zellen, um die Aktivität der entsprechenden Saccharose-Transporter zu erhö hen, oder die Expression in Zellen, die dieses Pro tein normalerweise nicht exprimieren. Ferner ist es möglich, die erfindungsgemäß eingesetzten Nuclein säuremoleküle nach dem Fachmann bekannten Methoden zu modifizieren, um erfindungsgemäße Proteine zu erhalten, die nicht mehr den zelleigenen Regulati onsmechanismen unterliegen, bzw. veränderte Tempe raturabhängigkeiten oder Substrat- bzw. Produktspe zifitäten aufweisen. Die Erfindung sieht auch vor, dass das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment oder der Plasmamembran der pflanzli chen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisie rung in einem bestimmten Kompartiment bzw. der Plasmamembran zu erreichen, muss die codierende Re gion gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment bzw. der Plasmamembran gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispiels weise Braun et al., EMBO J. (1992)11, 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)85, 846-850; Sonnewald et al., Plant S. (1991)1, 95-106).

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflanzenzellen, die mit einem oder mehre ren erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß einge setzten Nucleinsäuremolekül(en) transformiert wur den, sowie transgene Pflanzenzellen, die von derar tigen transformierten Zellen abstammen. Derartige Zellen enthalten ein oder mehrere erfindungsgemäß eingesetzte oder erfindungsgemäße Nucleinsäuremole kül(e), wobei diese(s) vorzugsweise mit regulatori schen DNA-Elementen verknüpft ist/sind, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor. Die Erfindung be trifft auch transgene Pflanzenzellen, deren Genom mindestens zwei stabil integrierte modifizierte Ge ne aus der Familie der SUT- und/oder SUC-Gene ent hält. Derartige Zellen lassen sich von natürlicher weise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unter scheiden, dass sie mindestens ein erfindungsgemäßes oder erfindungsgemäß eingesetztes Nucleinsäuremole kül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zel len nicht vorkommt, oder dadurch, dass ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es natürlicherweise nicht vor kommt, d. h. in einer anderen genomischen Umgebung oder in einer anderen als der natürlichen Kopien zahl vorliegt. Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen er hältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung betrifft auch Pflanzen, die mindestens eine, bevorzugt jedoch ei ne Vielzahl von Zellen enthalten, die die erfin dungsgemäßen oder die erfindungsgemäß eingesetzten Vektorsysteme oder Derivate oder Teile davon ent halten, und die aufgrund der Aufnahme dieser Vek torsysteme, Derivate oder Teile der Vektorsysteme zu einer Synthese von Proteinen befähigt sind, die eine modifizierte Saccharose-Transportaktivität, insbesondere SUT4-Aktivität, bewirken. Die Erfin dung ermöglicht also die Bereitstellung von Pflan zen der verschiedensten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen, die die vorgenannten Charak teristika aufweisen. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebi gen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monocoty le als auch dicotyle Pflanzen, wie Graminae, Pini dae, Magnoliidae, Ranunculidae, Caryophyllidae, Ro sidae, Asteridae, Aridae, Liliidae, Arecidae und Commelinidae ebenso wie Gymnospermae, Algen, Moose, Farne oder auch Calli, Pflanzenzellenkulturen etc., sowie Teile, Organe, Gewebe, Ernte- oder Vermeh rungsmaterialien davon. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, insbesondere um stärkesynthetisie rende bzw. stärkespeichernde Pflanzen, wie z. B. Weizen, Gerste, Reis, Mais, Topinambur, Zuckerrübe, Zuckerrohr oder Kartoffel. Die Erfindung betrifft aber auch andere Pflanzen wie Tomate, Arabidopsis, Erbse, Raps, Sonnenblume, Tabak, Roggen, Hafer, Ma niok, Salat, Spinat, Wein, Apfel, Kaffee, Tee, Ba nane, Kokos, Palmen, Bohnen, Pinien, Pappel, Euka lyptus etc. Die Erfindung betrifft ebenfalls Ver mehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungs gemäßen Pflanzen, beispielsweise Blüten, Früchte, Samen, Knollen, Wurzeln, Blätter, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc.

Zur Expression der erfindungsgemäßen oder erfin dungsgemäß eingesetzten Nucleinsäuremoleküle in sense- oder antisense-Orientierung z. B. in pflanz lichen Zellen werden diese mit regulatorischen DNA- Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Ex pression der SUT1-, SUT2- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen jeder in Pflanzen aktive Promo tor in Betracht, z. B. ein Promotor, der konstitutiv exprimiert, oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promo tor homolog oder heterolog sein. Einsetzbare Promo toren sind z. B. der Promotor der 35S RNA des Cau liflower Mosaic Virus (CaMV) und der Ubiquitin- Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, besonders bevorzugt der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., a.a.O.) für eine knollenspezi fische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z. B. der ST-LS1- Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987)84, 7943-7947, Stockhaus et al., EMBO J. (1989)8, 2445-2451) oder für eine endosperm spezifische Expression der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promo toren von Zein-Genen aus Mais. Im Vektor kann zudem eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, um dieses zu stabilisieren. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (Gielen et al., EMBO J. (1989)8, 23-29) und sind beliebig austauschbar. Weitere Promotoren werden vorstehend beschrieben.

Für die Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transfor mierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp- Serien, pACYC181 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von z. B. E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend ge erntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewon nen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid DNA werden im allgemeinen Re striktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden einge setzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA- Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden cloniert werden. Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Bei der Injektion und Elektroporati on von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmi de gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus der artig transformierten Zellen ganze Pflanzen regene riert werden, sollte ein selektierbarer Marker vor handen sein.

Je nach Einführungsmethode der SUT1-, SUT2- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erfor derlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwen det, so muss mindestens die rechte Bordersequenz, häufig jedoch die rechte und linke Bordersequenz der Ti- und -Ri-Plasmid-T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Wer den für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen inter mediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequen zen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri- Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Diese enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agro bakterien replizieren. Sie enthalten ein Selekti onsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Borderregi on eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. (1978)163, 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transfor mierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist be schrieben in EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters. B. V., Alblasserdam (1985), Chapter V, Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al. EMBO J. (1985)4, 277-287. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizo genes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial z. B. Blattstücke, Stengelsegemen te, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensi ons-kultivierte Pflanzenzellen können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Mög lichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwen dung des biolistischen Verfahrens oder durch Pro toplastentransformation sind bekannt (Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants, In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim New York Basel Cambridge). Alter native Systeme zur Transformation von monocotylen Pflanzen sind die elektrisch oder chemisch indu zierten DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektro poration von partiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikro injektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimende Pollen und die DNA- Aufnahme in Embryonen durch Quellung (Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269-273). Während die Trans formation dicotyler Pflanzen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefa ciens etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, dass auch monocotyle Pflanzen der Transforma tion mittels Agrobacterium basierter Vektoren zu gänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. (1993)22, 491-506; Hiei et al., Plant J. (1994)6, 271-282; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1987)84, 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology (1990)8, 33-38; Gould et al., Plant. Physiol. (1991)95, 426-434; Mooney et al.; Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. (1991)25, 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol. (1992)20, 1037-1048). Einige der genannten Transformationssysteme sind für ver schiedene Getreide etabliert worden: die Elektropo ration von Geweben, die Transformation von Proto plasten und der DNA-Transfer durch Partikel- Beschuss in regenerierbare Gewebe und Zellen (Jähne et al.; Euphytica 85 (1995), 35-44). Die Transfor mation von Weizen wird in der Literatur beschrieben (Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science (1995)14(2), 149-178) und von Mais in Brettschneider et al. (Theor. Appl Genet. (1997)94, 737-748) und Ishida et al. (Nature Biotechnology (1996) 14, 745-750).

Die Erfindung betrifft auch Identifizierungs- bzw. Screeningverfahren für Modulatoren des Saccharo sestoffwechsels, bevorzugt potenzielle Pestizide und Herbizide, wobei SUT4- und/oder SUT2- exprimierende Zellen oder Gewebe, insbesondere er findungsgemäße Wirtszellen oder Pflanzen, z. B. er findungsgemäße Hefe- oder Pflanzenzellen in Kontakt mit dem zu untersuchenden potenziellen Modulator, z. B. Pestizid oder Herbizid gebracht und die Wir kung, insbesondere die inhibitorische Wirkung des potenziellen Modulators, z. B. Pestizids oder Herbi zids, auf die Aktivität von SUT1, SUT2 und/oder SUT4 quantitativ oder qualitativ nachgewiesen wird. Ebenso kann SUT2 und/oder SUT4 zur Entwicklung von Systemen dienen, die eine verbesserte Mobilisierung von Pestiziden ermöglichen. Durch Durchmusterung chemischer Bibliotheken nach Substanzen, die spezi fisch das Wachstum von Hefen blockieren, die nied rig affine Saccharosetransporter wie SUT4 exprimie ren, oder die Kombinationen von anderen Saccharo setransportern z. B. SUT4 und SUT2 oder SUT2 und SUT1 oder SUT4 und SUT1 coexprimieren, können Inhi bitoren identifiziert werden. Diese Inhibitoren könnten als Herbizide eingesetzt werden oder als Vorstufen von neuen Herbiziden dienen. Auf Basis der Tests können auch potentielle Pestizide identi fiziert werden, die über diese Transporter in der Pflanze mobilisiert und so besser zu ihrem Zielort gelangen können.

Die Erfindung umfasst auch die Beeinflussung der Kimeraplasty, d. h. die Beeinflussung der Aktivität der Transporter in der Pflanze durch Verwendung von gemischten Oligonukleotiden, wodurch die Aktivität der Saccharosetransporter entweder erhöht, ernied rigt oder deren biochemischen Eigenschaften verän dert werden. Ein derartiges Verfahren ist in der WO99/07865 beschrieben, die hinsichtlich dieses Verfahrens vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Lehre mit einbezogen ist und für das im erfindungsgemäßen Kontext Schutz begehrt wird.

Die Erfindung betrifft also auch die Verwendung von SUT2-codierenden Nucleotidsequenzen oder von SUT2 zur Identifizierung von Modulatoren, insbesondere Induktoren, Aktivatoren oder Inhibitoren des Sac charose-Transportes, insbesondere der Sensorik und/oder Regulation des Saccharose-Transportes in einer Pflanze, wobei die Aktivität des von den SUT2-codierenden Nucleotidsequenzen codierter Pro teins in Anwesenheit und Abwesenheit eines poten ziellen Modulators nachgewiesen wird. Es kann dabei auch vorgesehen sein, nicht die Aktivität von SUT2, sondern eines von SUT2 regulierten Saccharose- Transporters z. B. SUT1 oder SUT4 nachzuweisen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von SUT1- codierenden Nucleotidsequenzen, insbesondere der SEQ ID Nr. 22 und/oder von SUT4-codierenden Nucleo tidsequenzen und/oder von SUT1 und/oder SUT4 zur Identifizierung von Modulatoren der Saccharose- Transportaktivitäten in einer Pflanze, insbesondere eines Inhibitors der niedrig-affinen, hoch kapazitiven Beladung des Phloems mit Saccharose, wobei die Aktivität eines von den SUT4- Nucleotidsequenzen codierten Proteins in Anwesen heit und Abwesenheit des potenziellen Modulators nachgewiesen wird.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der er findungsgemäßen SUT1-, SUT2- und SUT4-Nucleotid sequenzen zur Identifizierung von homologen Genen in anderen Pflanzen, z. B. aus cDNA- oder genomi schen Banken.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Gene und der umgebenden Regionen als molekulare Marker für Kreuzungsprogramme. Sowohl SUT2- als auch SUT4- Loci liegen in Regionen von QTL-Loci für hohen Koh lenhydratgehalt und hohen Ertrag bei Kartoffelknol len. Daher sind beide geeignet, um in Züchtungspro grammen aus Wildformen oder Hochleistungssorten ge eignete Chromosomenfragmente einzukreuzen und so Pflanzen mit verbesserten Erträgen zu erzeugen.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Das Sequenzprotokoll enthält:

SEQ ID Nr. 1: die codierende DNA-Sequenz des SUT4- Gens aus Arabidopsis thaliana.
SEQ ID Nr. 2: die codierende DNA-Sequenz des SUT4- Gens aus Lycopersicon esculentum.
SEQ ID Nr. 3: die codierende DNA-Sequenz des SUT2- Gens aus Arabidopsis thaliana.
SEQ ID Nr. 4: die codierende DNA-Sequenz des SUT2- Gens aus Lycopersicon esculentum.
SEQ ID Nr. 5: die Aminosäuresequenz von SUT4 aus Arabidopsis thaliana.
SEQ ID Nr. 6: die Aminosäuresequenz von SUT4 aus Lycopersicon esculentum.
SEQ ID Nr. 7: die Aminosäuresequenz von SUT2 aus Arabidopsis thaliana.
SEQ ID Nr. 8: die Aminosäuresequenz von SUT2 aus Lycopersicon esculentum.
SEQ ID Nr. 9: einen T-DNA-spezifischen Primer.
SEQ ID Nr. 10: einen SUT4-spezifischen Primer.
SEQ ID Nr. 11: einen SUT4-spezifischen Primer.
SEQ ID Nr. 12 bis 15 stellen weitere SUT4-Primer dar.
SEQ ID Nr. 16 und 17 stellen die Aminosäuresequenz von Abschnitten von LeSUT4 dar.
SEQ ID Nr. 18 bis 21 stellen Clonierungsprimer dar.
SEQ ID Nr. 22: die codierende DNA-Sequenz des SUT1-Gens aus Solanum tuberosum.
SEQ ID Nr. 23: die Aminosäuresequenz von SUT1 aus Solanum tuberosum.
SEQ ID Nr. 24: die den N-terminalen Bereich von SUT2 codierende DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 mit den Nucleotiden 1 bis 239.
SEQ ID Nr. 25: die den N-terminalen Bereich von SUT1 codierende DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 22 mit den Nucleotiden 1 bis 149.
SEQ ID Nr. 26: die die Zentralschleife codierende DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 mit den Nucleotiden 843 bis 1130.
SEQ ID Nr. 27: die codierende DNA-Sequenz des SUT4- Gens aus Solanum tuberosum.
SEQ ID Nr. 28: die Aminosäuresequenz von SUT4 aus Solanum tuberosum.
SEQ ID Nr. 29: die codierende DNA-Sequenz des SUT2- Gens aus Solanum tuberosum.
SEQ ID Nr. 30: die Aminosäuresequenz von SUT2 aus Solanum tuberosum.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und der dazugehörigen Figuren näher erläutert.

Die Fig. 1 bis 4 zeigen schematisch den Aufbau erfindungsgemäß eingesetzter Genkonstrukte.

Die Fig. 5 und 6 zeigen grafische Darstellungen der Proteinaktivitäten von SUT4.

Die Fig. 7 stellt erfindungsgemäße chimäre SUT2- und SUT1-Genkonstrukte dar.

Beispiel 1 Isolierung von SUT4 cDNA

In der Datenbank (Genbank) wurden bisher nicht cha rakterisierte Sequenzen identifiziert, die entfern te Homologie zu SUT1 aufwiesen.
Genomische Sequenz: AtSUT4 AC000132.

Eine cDNA wurde von einer Arabidopsis-Sämling-Bank mittels PCR amplifiziert (Minet et al., Plant J. (1992) 2, 417-422). Primer auf Basis der genomi schen Sequenz (5'-gactctgcagcgagaaatggctacttccg SEQ ID Nr. 12, 5'-taacctgcaggagaatctcatgggagagg SEQ ID Nr. 13) wurden entworfen. Die Primer beinhalten je weils eine PstI-Restriktionsschnittstelle (unter strichen) und sind so entworfen, dass die gesamte Codiersequenz von AtSUT4 amplifiziert wird. Ein Produkt mit der erwarteten Größe von 1566 bp wurde mit PstI geschnitten und in die PstI-Stelle des Vektors pBC SK+(Stratagene) ligiert. AtSUT4 wurde in die PstI-Stelle von pDR196 subcloniert. Die AtSUT4- cDNA in pDR196 wurde in beide Richtungen sequen ziert. Ecotyp-Unterschiede zwischen dem SUT4-Gen in Columbia und Landsberg erecta wurden durch die Se quenzierung von AtSUT4 aus Landsberg erecta verifi ziert.

Eine Tomaten-(Lycopersicon esculentum cv. UC82b) cDNA-Bank (Blüten) wurde mit einem 300-bp-Eco- RIBglII-Fragment des genomischen Tabakclons NtSUT3 (Lemoine et al., FEBS Lett. (1999)454, 325-330) un ter reduzierter Stringenz durchmustert. Drei unab hängige von LeSUT1 verschiedene Clone wurden iso liert und als LeSUT4 bezeichnet. Mit Primern der LeSUT4-Sequenz wurde die orthologe Sequenz durch RT-PCR aus Kartoffel isoliert und als StSUT4 be zeichnet. StSUT4 wurde als PstI/NotI-Fragment in pBC SK-(Stratagene) cloniert und als XhoI/SacII- Fragment in den Hefeexpressionsvektor pDR195 subc loniert, welcher einen URA3-Marker, PMA1-Promotor und ADH1-Terminator (Rentsch et al., FEBS Lett. (1995) 370, 264-268) aufweist. Für das Amplifizie ren von StSUT4 (ORF, = cDNA-Sequenz)wurden verwen det: 5'-SUT4-PstI 5'-GAGACTGCAGATGCCGGAGATAGAAAGGC 3' (SEQ ID Nr. 14) 5'-SUT4-NotI 5'- TATGACAGCGGCCGCTCATGCAAAGATCTTGGG-3' (SEQ ID Nr. 15).

Beispiel 2 Isolierung von SUT2-cDNA

In der Datenbank (Genbank) wurden bisher nicht cha rakterisierte Sequenzen identifiziert, die entfern te Homologie zu SUT1 aufwiesen.
Genomische Sequenz: AtSUT2 AC004138.

Es wurden auf der Basis von detaillierten Sequenz vergleichen andere bekannte homologe Primersequen zen identifiziert, die eine Klonierung der poten ziellen cDNA-Sequenz über RT-PCR aus Blatt mRNA er möglichen könnten.

Primer auf Basis der genomischen Sequenz (5- TACGAGAATTCGATCTGTGTGTTGAGGACG, SEQ ID Nr. 20, 5'- AGAGGCTCGAGTGGTCAAAAAGAATCG, SEQ ID Nr. 21) wurden entworfen. Die Primer enthalten eine EcoRI- bzw. eine XhoI-Restriktionsschnittstelle (unterstrichen) und sind so entworfen, dass die gesamte Codierse quenz von AtSUT2 amplifiziert wird. Ein Produkt mit der erwarteten Größe von 1785 bp wurde mit EcoRI und XhoI geschnitten und gerichtet in den Vektor pDR196 ligiert.

Beispiel 3 Funktionsanalyse des SUT4

Der Hefestamm SUSY7/ura3 ist eine modifizierte Ver sion des SUSY7 (Riesmeier et al. 7 EMBO J. (1992) 11, 4705-4713), welcher eine Deletion eines Teils des URA3-Gens enthält und dadurch eine Selektion für Uracil-auxotrophie ermöglicht. Für die Analyse von Hefewachstum auf Saccharose-Medium wurden Medien verwendet, die 1,7 g/l Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (Difco), 2% Saccharose, 20 mg/l Tryp tophan und 1,5% Agarose, pH 5,0 enthielten.

Für die Saccharoseaufnahme-Tests wurde Hefe in flüssigem Minimalmedium, welches Glucose enthielt, bis zu einer OD₆₂₃ von ≅ 0,8 kultiviert. Zellen wur den durch Zentrifugation gesammelt, in 25 mM Natri umphosphatpuffer gewaschen (pH 5, 5) und in selbigem Puffer zu einer OD₆₂₃ von 20 suspendiert. Die Auf nahme-Tests wurden initiiert durch das Hinzufügen von Glucose bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zu den Hefezellen eine Minute vor dem Hinzufügen von ¹⁴C-Saccharose. Nach Inkubation bei 30°C unter Rühren wurden Zellen durch Vakuumfiltration auf Glasfaserfiltern gesammelt (1-5 Minuten), zweimal mit 4 ml 10 mM Saccharose (um den Gefrierpunkt) ge waschen und Radioaktivität durch einen Flüssig- Szintillationszähler festgestellt. Die AtSUT4-Ex pression erlaubte Hefe-Wachstum auf Saccharose. At- SUT4 und StSUT4 erwiesen sich als funktionale Sac charosetransporter. Der zeitliche Verlauf der Auf nahme von ¹⁴C-Saccharose der AtSUT4 oder StSUT4 exprimierenden Hefe ist in Fig. 5A gezeigt. Es zeigt sich ein signifikanter Unterschied zu den Vektorkontrollen.

Daten für die kinetische Analyse wurden für SUT4 aus einer nichtlinearen Regression der Aufnahmemes sungen mit der Michaelis-Menten-Gleichung erhalten. Der K_m wurde als Durchschnitt von acht Bestimmungen unter Verwendung von drei unabhängigen Transforman ten ± Standardabweichung dargestellt. Der ermittel te K_M-Wert für Saccharose beträgt für SUT4 aus Ara bidopsis 11,6 ± 0,6 mM (bei pH 5.5) und 5,9 ± 0,8 mM (bei pH 4.0). Für SUT4 aus Solanum tuberosum er gab sich ein K_M-Wert von 6,0 ± 1,2 mM (pH 4.0) (vergleiche Fig. 5B).

Die Stimulation der Aufnahme von ¹⁴C-Saccharose über SUT4 durch Glucose und die Inhibition durch einen Elektronen-Transportinhibitor (Antimycin A und den Protonophoren CCCP ist in Fig. 5C gezeigt). Fig. 6 stellt das pH-Optimum von SUT4-vermitteltem Sac charose-Transport dar.

Beispiel 4 Herstellung einer SUT4-Insertionsmutanten (Arabi dopsis thaliana)

Samen von 12.800 T-DNA-mutagenisierten Arabidopsis- Pflanzen (entsprechen 19.200 Insertionsvorgängen) wurden von Dupont Co. und von Arabidopsis Biologi cal Resource Center (ABRC), Ohio State Universität, erhalten. Die Pflanzen wurden in Gruppen von je 100 untersucht. Die Pflanzen wurden in steriler Kultur wachsen gelassen und genomische DNA isoliert. Die DNA aus den 140 Gruppen von je 100 Pflanzen wurde in 14 Übergruppen (superpool) zusammengefasst und nach der Methode von Krysan et al. (Proc. Natl. A- cad. Sci. USA (1996) 93, 8145-8150) gescreent, wo bei genspezifische und T-DNA-spezifische Primer verwendet wurden. Eine PCR wurde durchgeführt mit der Superpool-DNA als Template, einem T-DNA-spezi fischen Primer (LB, linke Borderregion SEQ ID Nr. 9) und einem genspezifischen Primer (AtSUT4r2 SEQ ID Nr. 10). Die PCR-Produkte wurden durch Agarose gelelektrophorese getrennt und auf eine geladene Nylonmembran überführt. Die Membran wurde mit einem PCR-Produkt von 2,46 kb Länge hybridisiert, herge stellt aus WS (Wassilewskija) genomischer DNA als Template und den Primern AtSUT4r2 (siehe oben) und AtSUT4f2(ATGGCTACTTCCGATCAAGATCGCCGTC SEQ ID Nr. 11). Diese Sonde wurde mit ³²P-CTP markiert.

Ein Superpool wurde durch Hybridisierung der mar kierten Sonde mit dem Blot identifiziert. DNA aus den Pools von 100 Pflanzen, die den Superpool bil den, wurden anschließend auf gleiche Weise durch mustert: PCR wurde durchgeführt mit DNA aus Pools von 100 als Template und AtSUT4r2 und LB als Pri mer, DNA-Blot-Hybridisierung wurde mit der AtSUT4- genomischen Sonde (2,46 kb) durchgeführt zur Detek tion von amplifizierten Produkten.

Positive Hybridisierung wurde bei Pool CS2165 beo bachtet, welcher 100 T-DNA-mutagenisierte Linien umfasst. Einzelne Pflanzen von CS2165 wurden kulti viert und genomische DNA präpariert. Die DNA ein zelner Pflanzen wurde wie dargestellt durchmustert. PCR wurde durchgeführt mit DNA der einzelnen Pflan zen als Template und AtSUT4r2 und LB als Primer. PCR-Produkte wurden auf Agarosegel durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Das PCR- Produkt wurde mit AtSUT4r2 und LB als Sequenzprimer sequenziert. Eine mit dem AtSUT4-Gen identische Se quenz deutet auf eine T-DNA-Insertion in dem At- SUT4-Gen hin.

In der Gruppe CS2615 (Ohio State University, ABRC) wurde eine Pflanze erhalten, die ein positives Er gebnis sowohl mit einem T-DNA-spezifischen Primer (LB 5'-GATGCACTCGAAATCAGCCAATTTTAGAC) (SEQ ID Nr. 9) als auch mit einem SUT4-spezifischen Primer (At- SUT4r2 5'-TCATGGGAGAGGGATGGGCTTCTGAATC) (SEQ ID Nr. 10) ergab. Einzelne Pflanzen wurden isoliert und die Insertionsstelle der T-DNA sequenziert, wobei gezeigt werden konnte, dass die linke Bordersequenz der T-DNA etwa 480 Basenpaare stromaufwärts des ATG des SUT4-Gens vorhanden war. Die Mutante wurde zweimal mit WS (Wassilewskija) zurückgekreuzt. Da bei konnte gezeigt werden, dass die Kanamycin- Resistenz in einem Verhältnis 2,9 : 1 (427 : 147) segregierte, was die Anwesenheit eines einzelnen markierten Locus anzeigt. Homozygote Pflanzen wur den erhalten. Diese enthielten signifikant mehr Stärke als der WS-Wildtyp, was durch KI (Kaliumjo did)-Färbung nachgewiesen werden konnte. Zudem zeigten die Pflanzen ein stärkeres Sprosswachstum unter Licht. Beide Ergebnisse zeigen deutlich, dass AtSUT4 beim Saccharose-Export aus Source-Organen, nämlich Blättern, eine bedeutende Rolle spielt. RT- PCR zeigt, dass die mRNA von SUT4 in der Mutante vorhanden ist und dass die Mutante demgemäss keine "Knockout"-Pflanze ist.

Beispiel 5 Isolation und RNase-Schutz-Analyse

RNA wurde von verschiedenen Organen einer im Ge wächshaus kultivierten Tomate (L. esculentum, cv. Moneymaker) nach der Methode von Schwacke (Schwacke et al., Plant Cell (1999) 11, 377-392) isoliert. Reverse Transcription wurde durchgeführt mit dem MAXIscript™ SP6/T7 in-vitro-Transcription-Kit (Am bion), unter Verwendung von α-³²P UTP. Ein 600-bp- PCR-Produkt wurde von pSport erhalten, welches das 340-bp-LeSUT4-Fragment enthielt. Dies wurde als Template verwendet. Die Sonde wurde nicht weiter aufgereinigt, und 300.000 CPM wurden pro Probe hybridisiert. Hybridisierung wurde über Nacht mit 20 µg RNA bei 45°C durchgeführt. Nach RNA-Verdau w 17364 00070 552 001000280000000200012000285911725300040 0002010050233 00004 17245urde die geschützte RNA auf einem 5%-Polyacryla midgel (13 × 15 cm) bei 150 mv aufgetrennt. Die Ge le wurden getrocknet und Röntgenfilmen ausgesetzt.

Sowohl bei einer RNA-Blot-Analyse als auch bei der RNA-Schutz-Analyse wurde die stärkste Expression von SUT4 in Sink-Blättern, Stiel, Cotyledonen und unreifen Früchten gefunden. In Source-Blättern konnte nur geringe Expression nachgewiesen werden.

Beispiel 6 Herstellung von anti-SUT4-Antiseren und Immunoloka lisation

Kaninchen wurde immunisiert mit synthetischen mit KLH gekoppelten Peptiden, entsprechend entweder dem N-Terminus (MPEIERHRTRHNRPAIREPVKPR SEQ ID Nr. 16) oder dem zentralen Loop (GSSHTGEEIDESSHGQEEAFLW SEQ ID Nr. 17) von LeSUT4. Eine Affinitätsreinigung der Antisera wurde wie vorher beschrieben (Kühn et al., (1997) a.a.O.) mittels synthetischer Peptide ver bunden mit CNBr-aktivierten Sepharose-4B-Säulen (Pharmacia) durchgeführt. Präimmunserum wurde durch die gleiche Methode gereinigt, mit Ausnahme, dass Protein-A-Sepharose (BioRad) anstatt der Peptidaf finitätschromatographie verwendet wurde.

Fluoreszenz-Immunodetektion von SUT4 in Kartoffel und Tomate wurde durchgeführt wie beschrieben (Stadler et al., Plant Cell (1995) 7, 1545-1554) mit den nachstehend beschriebenen Modifikationen. Von Hand geschnittene Abschnitte (1 mm) aus Toma ten- oder Kartoffelstiel wurden über Nacht im Vaku um in Mops-Puffer (50 mM Mops/NaOH pH 6,9, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl₂) beinhaltend 0,1% Glutaraldehyd und 6% Formaldehyd fixiert. Nach dreimaligem Wa schen mit Mops-Puffer auf Eis wurden die Fragmente dehydriert durch Inkubation in einer Ethanolserie, gefolgt von zwei Inkubationen in 96% Ethanol. Nach Inkubation über Nacht in 1 : 1 Ethanol: Methylacry latgemisch (75% [v/v] Butylmethylacrylat, 25% [v/v] Methylmethacrylat, 0,5% Benzoinethylether, 10 mM DTT) wurde das Material in 100% Methylacrylatge misch eingebettet. Die Polymerisation fand über Nacht unter UV-Licht (365 nm) bei 4°C statt. Halb dünne Sektionen (1 µm) wurden auf vorgewärmte Histobond-Objektträger (Camon) aufgebracht und bei 50°C getrocknet.

Um das Methylacrylat von den Sektionen zu entfer nen, wurden die Objektträger für 30 Sekunden in Aceton inkubiert, rehydriert über eine Ethanolserie und blockiert für 1 Stunde mit 2% BSA in PBS (100 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 100 mM NaCl). Nach der Inbukation über Nacht mit affinitätsgereinigten An tikörpern gegen LeSUT4 wurden die Objektträger zweimal in PBS-T (PBS mit 0,1% Tween) und einmal mit PBS, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit Antikaninchen-Konjugat IgG-FITC (Fluorescini sothio-cyanat) gewaschen. Nach drei Waschschritten mit PBS-T, PBS und destilliertem Wasser wurden Auf nahmen gemacht mit einem Fluoreszenzphasenmikroskop (Zeiss, Axiophot) und einem Erregerlicht von 450-490 nm.

Fluoreszenzsignale konnten nur in Siebelementen nachgewiesen werden (Tomate und Kartoffel)

Beispiel 7 Herstellung von transgenen Pflanzen Das AtSUT2-Überexpressionskonstrukt (oAtSUT2_35S)

AtSUT2 cDNA wurde mittels PCR amplifiziert - das Produkt war 1.785 bp lang entsprechend dem erfin dungsgemäßen Codierungsbereich von ATG (Position 1) bis TGA (Position 1785). Das Fragment wurde in Sense-Orientierung cloniert in eine 35S-Promotor- Expressionskassette (pBin.Ar35S), welche als Eco- RI/HindIII-Fragment von pBinAr (Höfgen und Willmit zer, Plant Sc.(1990) 66, 221-230) isoliert wurde. Dieses Kontrukt wurde mit Hindlil und EcoRI ge schnitten und in das HindIII/EcoRI-geschnittene pGTPV-bar cloniert (Becker et al., a.a.O. Plant Mol. Biol. (1992) 20, 1195-1197). Pflanzen wurden transformiert.

Das AtSUT2-Antisensekonstrukt (αAtSUT2_35S)

AtSUT2 cDNA (ATTS5034EST Zugangsnummer) wurde mit SacI und BamHI geschnitten und in Antisense- Orientierung in die pBinAr35S-Expressionskassette cloniert. Dieses Konstrukt wurde mit HindIII und EcoRI geschnitten und in das HindIII/EcoRI- geschnittene pGPTV-bar cloniert (Becker et al., a.a.O.). Pflanzen wurden transformiert.

Das AtSUT4-Überexpressionskonstrukt (oAtSUT4_AtSUC2)

AtSUT4 cDNA wurde amplifiziert. Das 1.533-bp- Fragment beginnt mittels PCR bei Position 1 der er findungsgemäßen AtSUT4cDNA-Sequenz und endet bei TAG-Position 1533. Der SUC2-Promotor wurde aus Ara bidopsis (Columbia-Ecotyp) genomischer DNA mittels der folgenden Primer getrennt: (reverse 5'- ATGGCTGACCAGATTTGAC; SEQ ID Nr. 18 und forward 5'- GTTTCATATTAATTTCAC; SEQ ID Nr. 19). Das 1,533 kb- Fragment wurde in Sense-Orientierung hinter dem At- SUC2-Promotor (X79702) cloniert. Dieses Konstrukt wurde mit HindIII und EcoRI geschnitten und in das HindIII/EcoRI-geschnittene pGPTV-bar cloniert (Be cker et al., a.a.O.). Pflanzen wurden transfor miert.

Das LeSUT4-Antisense-Konstrukt (αLeSUT4_35S)

Die LeSUT4 cDNA wurde mit BamHI geschnitten, wobei ein 1,3-kb-Fragment erhalten wurde, welches geglät tet und in die SmaI-Schnittstelle von pBinAR clo niert wurde (Bevan, Nucleic Acids Research (1983) 12, 8711-8721).

Die Fig. 1 bis 4 stellen die vorgenannten Kon strukte dar.

Beispiel 8 8.1. Herstellung eines chimären Proteins zwischen AtSUT2 und StSUT1

Das offene Leseraster von AtSUT2 wurde mittels RT- PCR aus Arabibopsis thaliana (Columbia Ecotyp) Blättern isoliert und in den Hefeexpressionssektor pDR196 (Barker et al., (2000) Plant Cell 12 : 1153-1164) cloniert. Das offene Leseraster von StSUT1 wurde von der StSUT1 cDNA in pDR195 (Riesmeier et al., (1993) a.a.O.) amplifiziert, wobei Primer mit den Restriktionsschnittstellen für SmaI und XhoI verwendet wurden. Das offene Leseraster wurde in den Hefeexpressionsvektor pDR196 ligiert.

Es wurden chimäre Konstrukte hergestellt, in denen der N-terminus von AtSUT2, also der erfindungsgemä ße N-terminale Bereich von SUT2 (codiert von SEQ ID Nr. 24) mit der entsprechenden N-terminalen Domäne von StSUT1 (codiert von SEQ ID Nr. 25), also der erfindungsgemäße N-terminale Bereich von SUT1 aus getauscht wurden und umgekehrt, wobei mittels PCR- Restriktionsschnittstellen innerhalb einer konser vierten Region der ersten Transmembrandomäne von AtSUT2 und StSUT1 hergestellt wurden. Anschließend wurden PCR-Fragmente des N-terminalen Bereichs und des Restes der Sequenz in den Hefeexpressionsvektor pDR196 cloniert, wobei die Schnittstellen SmaI und PstI für die N-terminalen Bereiche und PstI (SdaI für AtSUT2) und XhoI für den restlichen Bereich des offenen Leserasters verwendet wurden. Diese chimä ren Konstrukte werden im Folgenden als At- SUT2/StSUT1-N und StSUT1/AtSUT2-N bezeichnet und sind in Fig. 7 dargestellt.

Das Konstrukt StSUT1/AtSUT2-N weist die Nucleotide 1 bis 239 von SEQ ID Nr. 3 fusioniert zu den Nucle otiden 150 bis 1548 von StSUT1, dargestellt in SEQ ID Nr. 22 auf, wobei das Konstrukt aufgrund clonie rungstechnischer Gegebenheiten einen Nucleoti daustausch von t zu c aufweist. Im Folgenden ist der Fusionsbereich des Konstruktes sequenzmäßig dargestellt, wobei die kleinen Buchstaben die Se quenzen von SUT2 und die großen Buchstaben die Se quenzen von SUT1 sind (obere Zeile: ohne Austausch, untere Zeile: mit Austausch):
. . . tgggcattgca/GCTCTCTT . . .
. . . tgggcactgca/GCTCTCTT . . .

AtSUT2/StSUT1-N weist die Nucleodide 1 bis 149 von StSUT1, dargestellt in SEQ ID Nr. 22, fusioniert zu den Nucleotiden 240 bis 1785 von AtSUT2 dargestellt in SEQ ID Nr. 3 auf. Aufgrund clonierungstechni scher Gegebenheiten weist das Konstrukt gegenüber der Wildtypsequenz 3 Nucleotidaustausche auf. Im Folgenden ist der Fusionsbereich dargestellt, in der oberen Zeile das theoretisch erhältliche Kon strukt und in der unteren Zeile der tatsächlich hergestellte Fusionsbereich. Die Großbuchstaben be ziehen sich auf Sequenzen von SUT1 und die Klein buchstaben auf Sequenzen von SUT2:
. . . TGGGCTCTTCA/actttct
. . . TGGGCTCTGCA/ggtttct.

Es wurden weiterhin chimäre Konstrukte hergestellt, in denen der zentrale cytoplasmatische Bereich, insbesondere Loop, von AtSUT2, der in SEQ ID# 26 dargestellt ist, mit dem kleineren cytoplasmati schen Bereich, insbesondere Loop, von StSUT1 ausgetauscht wurden und umgekehrt. Dabei wurden Re striktionsschnittstellen mittels PCR innerhalb kon servierter Bereiche der transmembranen Regionen VI und VII verwendet. Die N-terminale Hälfte, der cy toplasmatische Loop und die C-terminale Hälfte des offenen Leserasters wurden mittels PCR unter Ver wendung der Pfu-Polymerase (Stratagene) amplifi ziert und in den Hefeexpressionsvektor cloniert durch Ligieren der ersten drei Fragmente unter Ver wendung von Sac I und BclI/BglII für AtSUT2 mit dem StSUT1-Loop und SacI und BamHI/BglII für StSUT1 mit dem AtSUT2-Loop. Die chimäre DNA wurde dann in den Hefeexpressionsvektor pDR196 unter Verwendung von SmaI und XhoI ligiert. Diese chimären Konstrukte werden weiterhin als AtSUT2/StSUT1-Loop und StSUT1/AtSUT2-Loop bezeichnet und in Fig. 7 darge stellt.

Das Konstrukt AtSUT2/StSUT1-Loop weist die Nucleo tide 1 bis 842 von AtSUT2 (SEQ ID Nr. 3), 750 bis 893 von StSUT1 (SEQ ID Nr. 22) und Nucleotide 1131 bis 1785 von AtSUT2 (SEQ ID Nr. 3). Die im Folgen den verwendete Darstellung in Groß- und Kleinbuch staben entspricht der vorgenannten Verwendung. Ebenso stellt die obere Linie jeweils die Sequenz des theoretisch erhältlichen Konstruktes und die jeweilige untere Linie die tatsächlich aufgrund clonierungstechnischer Gegebenheiten erzielte Se quenz des Konstruktes dar.

1. Fusionsstelle

. . . tgctaaagagat/CCCGGAGA . . .
. . . tgctaaagagct/CCCGGAGA . . .

2. Fusionsstelle

. . . GTTTGAACTG/gttatcctgg
. . . GTTTGAACTT/gatctcctgg
Das Konstrukt StSUT1/AtSUT2-Loop weist die Nucleo tide 1 bis 749 von StSUT1 (SEQ ID Nr. 22), Nucleo tide 843 bis 1130 von AtSUT2 (SEQ ID Nr. 3) und Nucleotide 894 bis 1548 von StSUT1 (SEQ ID Nr. 22) auf.

1. Fusionsstelle

. . . AACGAGCT/tcctttta . . .
. . . AACGAGCT/ccctttta . . .

2. Fusionsstelle

. . . ctcttacatg/GATCGCGT . . .
. . . ctcttacatg/GATCTCGT . . .

8.2. Funktionale Analyse von AtSUT2 und chimärer Proteine

Für Saccharoseaufnahmetests wurde der Hefestamm SEY6210 (Banakaitis (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83, 9075 - 9070) verwendet, der die entspre chenden cDNAs im Expressionsvektor pDR196 aufwies. Die Aufnahme von 14-C-Saccharose erfolgte wie be schrieben (Weise et al., (2000) Plant Cell 12: 1345-1355). Expressionsanalyse der Proteine in Hefe ergab vergleichbare Mengen für alle untersuchten Proteine.

Es konnte gezeigt werden, dass die Saccharoseauf nahme durch Hefezellen, die AtSUT2 exprimieren, in den ersten fünf Minuten des Tests linear war. In dieser Zeit akkumulierten in 10⁸ Zellen 0,1 nmol Saccharose. Die Saccharoseaufnahme durch AtSUT2 war signifikant (p < 0,05) höher als bei Hefezellen, die nur den leeren Vektor pDR196 exprimierten. Im Gegensatz dazu war die Transportrate bei StSUT1 exprimierenden Zellen 400-fach höher als bei At- SUT2-exprimierenden Zellen. Kinetische Studien, offenbarten eine sehr geringe Affinität von AtSUT2 für Saccharose. Unter Verwendung der Michaelis- Menten-Gleichung und einer nichtlinearen Regressi onsanalyse wurde ein K_M-Wert von 11,7 ± 1,2 mM (V_max = 1,5 nmol.min^-1 10⁸ Zellen^-1) für AtSUT2 bei einem pH-Wert von 4 bestimmt. Im Gegensatz dazu zeigte StSUT1 einen 10-fach niedrigeren K_M-Wert für Sac charose bei 1,7 mM (V_max. = 210,2 nmol.min^-1 10⁸ Zellen^-1).

Die Saccharose-Aufnahme durch AtSUT2 war pH- abhängig, wobei die höchsten Aufnahmeraten bei ei nem pH-Wert von 4,0 gemessen wurden. Die Saccharo se-Aufnahme fiel bei alkalischen pH-Werten stark ab und bei einem pH-Wert von 6 konnte keine Saccharo se-Aufnahme mehr gemessen werden. Zur Bestimmung der Substratspezifität vom AtSUT2 wurde die Saccha rose-Aufnahme (1 mM Saccharose) mit anderen Zuckern und Zuckeralkoholen kompetitiv gemessen. Von den getesteten Substraten (Saccharose, Maltose, Isomal tulose, Glucomannitol, Glucosorbitol, Raffinose, Galactose, Lactose, Mannitol, Sorbitol, Glucose) kompetierte nur Saccharose und zu einem geringeren Ausmaß Maltose signifikant mit ¹⁴C-Saccharose. Der Saccharose-Transport durch AtSUT2 konnte durch CCCP und durch den Inhibitor der mitochondrialen ATP- Bildung, Antimycin A, inhibiert werden. Diese Daten sprechen für einen Protonen-gekoppelten Transport mechanismus von AtSUT2.

8.5. Saccharoseaufnahme-Kinetiken der Saccharose- Aufnahme chimärer Proteine

Die Ergebnisse für AtSUT2, StSUT1 und die chimären Proteine sind in der Tabelle dargestellt:

Tabelle

K_M-Werte für Saccharose der Saccharosetransporter StSUT1 und AtSUT2 sowie chimärer Proteine, in denen die N-terminalen Bereiche oder zentralen cytoplas matischen Loops zwischen den beiden Transportern ausgewechselt wurden. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardfehler bestimmt aus wenigstens drei un terschiedlichen Messungen angegeben. Unterschied liche Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede (p < 0,05) an.

Das von dem chimären Konstrukt AtSUT2/StSUT1-N co dierte chimäre Protein zeigt einen signifikant ge ringeren K_M-Wert für Saccharose von 3,4 ± 1,6 mM (V_max. = 0,3 nmol.min^-1 10⁸ Zellen^-1) verglichen mit AtSUT2. Im Vergleich dazu zeigte das von dem chimä ren Konstrukt StSUT1/AtSUT2-N codierte chimäre Pro tein einen signifikant höheren K_M-Wert für Saccha rose von 8,08 ± 1,4 mM (V_max. = 72,9 nmol.min^-1 10⁸ Zellen^-1) verglichen mit StSUT1. AtSUT2/StSUT1-Loop wies einen höheren K_M-Wert (6,75 mM ± 1,9) (V_max. = 0,4 nmol.min^-1 10⁸ Zellen^-1) für Saccharose auf, während StSUT1/AtSUT2-Loop einen niedrigen K_M-Wert (1,4 mM ± 0,3) (V_max. = 5,5 nmol.min^-1 10⁸ Zellen^-1) für Saccharose aufwies.

8.6. Bedeutung der N-Termini von Saccharose- Transportern

Die vorstehend beschriebenen Expressions- Experimente der chimären Proteine in Hefe erlauben folgende Rückschlüsse. Der Ersatz des N-Terminus des hoch-affinen Transporters StSUT1 durch den des niedrig affinen AtSUT2 führte zu einer Erhöhung des K_M-Wertes von 1,7 mM auf 8,1 mM (p < 0,05). Der StSUT1-N-Terminus verlieh hohe Affinität an AtSUT2, was sich an einem von 11,7 mM auf 3, 4 mM verringer ten K_M-Wert ablesen lässt (p < 0,05). Strukturelle Unterschiede im N-Terminus zwischen StSUT1 und At- SUT2 scheinen daher einen Großteil der Substrataf finitätsunterschiede zu bewirken. Wahrscheinlich, ohne durch die Theorie gebunden zu sein, beein flusst der N-Terminus der Saccharose-Transporter die Affinität zur Saccharose durch intramolekulare Interaktionen mit anderen cytosolischen Domänen oder durch Kontrolle der Position des ersten Trans membrandurchgangs.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Modifizierung des Saccharid-Fluxes und/oder der Saccharid-Konzentration in Geweben ei ner Pflanze, wobei die Aktivität eines Saccharid- Transporters mit hoher Transportkapazität für das Saccharid und niedriger Affinität zu dem Saccharid modifiziert wird, indem mindestens eine Pflanzen zelle mit mindestens einem Vektor transformiert und daraus eine Pflanze regeneriert und erhalten wird, in deren Gewebe ein modifizierter Saccharid-Flux und/oder eine modifizierte Saccharid-Konzentration vorhanden ist und wobei der Vektor eine Nucleotid sequenz aufweist, deren Expression eine Modifizie rung der Transportaktivität des Saccharid- Transporters bewirkt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vektor SUT4-codierende Nucleotidsequenzen, Teile davon oder eine komplementäre Sequenz davon enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Vek tor SUT2-codierende Nucleotidsequenzen, Teile davon oder eine komplementäre Sequenz davon enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Vektor SUT1-codierende Nucleotidsequenzen, Teile davon oder eine komplementäre Sequenz davon ent hält.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü che, wobei die codierenden Nucleotidsequenzen cDNA- oder genomische DNA-Sequenzen sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wo bei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine blattspezifische Überexpression der codierenden Nucleotidsequenz gewährleistenden Vektor transfor miert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wo bei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Überexpression der codierenden Nucleo tidsequenz in Schließzellen gewährleistenden Vektor transformiert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wo bei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Expression oder Mutagenese der codie renden Nucleotidsequenzen in Schließzellen gewähr leistenden Vektor transformiert und durch Co suppression, Mutagenese, RNA-Doppelstrang-Inhi bierung oder Antisense-Expression eine reduzierte Expression mindestens einer endogen vorhandenen SUT1-, SUT2- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidse quenz erreicht wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wo bei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Überexpression der codierenden Nucleo tidsequenzen in Sink-Gewebe und/oder Parenchym ge währleistenden Vektor transformiert wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wo bei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Expression oder Mutagenese der codie renden Nucleotidsequenzen in sink-Zellen gewähr leistenden Vektor transformiert und durch Co suppression, Mutagenese, RNA-Doppelstrang-Inhi bierung oder Antisense-Expression eine reduzierte Expression mindestens einer endogen vorhandenen SUT1-, SUT2- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidse quenz erreicht wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wo bei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Expression oder Mutagenese der codie renden Nucleotidsequenzen in Blättern gewährleis tenden Vektor transformiert und durch Cosuppressi on, Mutagenese, RNA-Doppelstrang-Inhibierung oder Antisense-Expression eine reduzierte Expression mindestens einer endogen vorhandenen SUT1-, SUT2- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidsequenz erreicht wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wo bei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine Samen-spezifische Überexpression der codierenden Nucleotidsequenzen gewährleistenden Vektor trans formiert wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wo bei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Überexpression der codierenden Nucleo tidsequenzen in Blatt-Mesophyll und/oder Blattepi dermis gewährleistenden Vektor transformiert wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü che, wobei die codierenden Nucleotidsequenzen unter der operativen Kontrolle mindestens eines regulato rischen Elementes stehen, das die Expression einer RNA in pro- und/oder eukaryotischen Zellen gewähr leistet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die codieren den Nucleotidsequenzen in Sense- oder Antisense- Orientierung unter der operativen Kontrolle des mindestens einen regulatorischen Elementes stehen.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das mindes tens eine regulatorische Element ein Promotor ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Promotor der GAS, SUC2, SUT1, CaMV35S, rolC, enhanced PMA4, KAT1, StLS1/L700, PFP, patatin-B33, AAP1 oder Vici lin-Promotor ist.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü che, wobei das Saccharid Saccharose ist.

19. Nucleinsäuremolekül, codierend einen Saccharid- Transporter mit niedriger Saccharid-Affinität und hoher Transportkapazität für das Saccharid, ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus

20. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 19, wobei der Saccharid-Transporter ein Saccharose-Transporter, insbesondere SUT4, ist.

21. Nucleinsäuremolekül, codierend einen Regulator und/oder Sensor des Saccharid-Transports, insbeson dere Saccharose-Transports in Pflanzen oder einem Teil davon, insbesondere SUT2, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

22. Nucleinsäuremolekül codierend wenigstens den N-terminalen Bereich von SUT1, dargestellt in SEQ ID Nr. 22 und 25.

23. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei das Molekül ein DNA- oder RNA-Molekül ist.

24. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 23, wobei das DNA-Molekül eine cDNA oder eine genomische DNA ist.

25. Nucleinsäuremolekül, das ein chimäres Protein codiert, wobei der 5'-terminale Bereich der codie renden Region des Nucleinsäuremoleküls den N-terminalen Bereich des SUT2-Proteins und der Rest einen codierenden Bereich eines mit dem Saccharose- Stoffwechsel- und/oder -Transport in Verbindung stehenden Gens darstellt.

26. Nucleinsäuremolekül, das ein chimäres Protein codiert, wobei der 5'-terminale Bereich der codie renden Region des Nucleinsäuremoleküls den N-terminalen Bereich des SUT1-Gens und der Rest einen codierenden Bereich eines mit dem Saccharose- Stoffwechsel und/oder -Transport in Verbindung ste henden Gens darstellt.

27. Nucleinsäuremolekül, welches ein chimäres Nuc leinsäuremolekül darstellt und das für ein chimäres Protein codiert, dessen N-terminaler Bereich der N-terminale Bereich von SUT2 und dessen Rest codie rende Sequenz von SUT1 ist.

28. Nucleinsäuremolekül, welches ein chimäres Nuc leinsäuremolekül darstellt und das für ein chimäres Protein codiert, dessen N-terminaler Bereich von SUT1 und dessen Rest codierende Sequenz von SUT2 ist.

29. Nukleinsäuremolekül, welches ein chimäres Nuc leinsäuremolekül darstellt und das für ein chimäres Protein codiert, dessen zentrale cytoplasmatische Domäne, die zwischen Membranspanne VI und VII liegt, von SUT2 codiert wird, und dessen andere Be reiche von einem anderen Saccharosetransporter-Gen, insbesondere von SUT1 oder SUT4, codiert werden.

30. Vektor, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 19 bis 29.

31. Vektor nach Anspruch 30, enthaltend zusätzlich eine Saccharid-Transporter-codierende Nucleotidse quenz, einen Teil oder eine komplementäre Nucleo tidsequenz davon.

32. Vektor nach einem der Ansprüche 30 bis 31, wo bei das Nucleinsäuremolekül mit mindestens einem regulatorischen Element operativ verknüpft ist, das die Expression einer RNA in pro- und/oder eukaryo tischen Zellen gewährleistet.

33. Vektor nach Anspruch 32, wobei das regulatori sche Element ein Promotor ist.

34. Vektor nach Anspruch 33, wobei der Promotor der GAS, SUC2, SUT1, CaMV35S, rolC, enhanced PMA4, KAT1, StLS1/L700, PFP, patatin-B33, AAP1 oder Vici lin-Promotor ist.

35. Vektor nach einem der Ansprüche 30 bis 34, wo bei das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprü che 19 bis 29 und/oder eine Saccharid-Transporter- codierende Nucleotidsequenz oder Teile davon in operativer Antisense-Orientierung zu dem mindestens einen regulatorischen Element angeordnet sind.

36. Wirtzelle, enthaltend einen der Vektoren nach einem der Ansprüche 30 bis 35.

37. Wirtzelle nach Anspruch 36, die eine Pflanzen zelle, Bakterienzelle oder Hefezelle ist.

38. Saccharid-Transporter mit niedriger Saccharid- Affinität und hohem Saccharid-Transportumsatz, co diert von einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 19 oder 20.

39. Protein mit der biologischen Aktivität eines Regulators und/oder Sensors des Saccharid transports, codiert von einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 21.

40. Chimäres Protein, codiert von einem der Nuclein säuremoleküle nach einem der Ansprüche 25 bis 29.

41. Transgene Pflanzenzelle, die mit einem Nuclein säuremolekül nach einem der Ansprüche 19 bis 29 oder einem der Vektoren nach einem der Ansprüche 29 bis 34 transformiert wurde oder die von einer sol chen Zelle abstammt.

42. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 41, die mit einem Vektor, enthaltend eine SUT/SUC- codierende, bevorzugt eine SUT1-codierende Nucleo tidsequenz transformiert wurde oder die von einer solchen Zelle abstammt.

43. Transgene Pflanzenzelle, deren Genom mindestens zwei stabil integrierte modifizierte Gene aus der SUT/SUC-Genfamilie enthält.

44. Transgene Pflanzenzelle, deren Genom mindestens zwei stabil integrierte modifizierte Gene enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SUT1/SUT2; SUT1/SUT4, SUT2/SUT4 und SUT1/SUT2/SUT4.

45. Transgene Pflanze, enthaltend mindestens eine Pflanzenzelle nach Anspruch 41, 42, 43 oder 44, oder hergestellt nach einem der Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 18.

46. Transgene Pflanze nach Anspruch 45, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Unterklasse der Gra minae, Pinidae, Magnoliidae, Ranunculidae, Cary ophyllidae, Rosidae, Asteridae, Aridae, Liliidae, Arecidae und Commelinidae.

47. Transgene Pflanze nach Anspruch 45, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Zuckerrübe, Zuckerrohr, Topinambur, Arabidopsis, Sonnenblume, Tomate, Tabak, Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Reis, Kartoffel, Raps, Maniok, Sa lat, Spinat, Wein, Apfel, Kaffe, Tee, Banane, Ko kos, Palmen, Erbsen, Bohnen, Pinien, Pappel, Euka lyptus etc.

48. Vermehrungs- oder Erntematerial einer Pflanze nach einem der Ansprüche 45, 46 oder 47, enthaltend mindestens eine Pflanzenzelle nach einem der An sprüche 41, 42, 43 oder 44.

49. Verwendung einer Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 19 oder 20 zum Identifizieren eines Modulators, insbesondere Inhibitors, des Saccharid- Transports in Pflanzen, insbesondere von SUT4.

50. Verwendung einer Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 19 oder 20 zum Identifizieren eines Interaktors, der wiederum zur Beeinflussung des Saccharid-Transports benutzt wird.

51. Verwendung nach Anspruch 49, wobei der Inhibi tor die Phloembeladung in Source-Organen und/oder die Entladung in Sinkorganen inhibiert.

52. Verwendung einer Nucleotidsequenz nach Anspruch 21 zum Identifizieren eines Modulators, insbesonde re Inhibitors des Saccharid-Transports in Pflanzen, insbesondere von SUT2.

53. Verwendung nach Anspruch 52, wobei der Inhibi tor die Regulation oder Sensorik des Saccharid- Transportsystems inhibiert.

54. Verwendung einer Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 19 bis 29 als molekularer Marker für Kreuzungsprogramme.

55. Verwendung einer 5'-terminalen Nucleotidsequenz eines Protein-codierenden Bereiches eines Gens aus der SUT/SUC-Genfamilie zur Modifikation der Affini tät eines beliebigen Proteins, insbesondere aus der Familie der SUT/SUC-Proteine, gegenüber einem Sub strat, insbesondere Saccharose.

56. Verwendung nach Anspruch 54, wobei das Gen SUT1, SUT2 oder SUT4 ist.

57. Verwendung nach Anspruch 54 oder 55, wobei die N-terminale Nucleotidsequenz die in SEQ ID-Nr. 24 oder 25 dargestellte Nucleotidsequenz ist.

58. Verwendung der zentralen cytoplasmatischen Schleife von SUT2 zur Regulation oder Signaltrans duktion, insbesondere im Zuckerstoffwechsel.