DE69132758T2

DE69132758T2 - Plasmide zur Herstellung von transgenen Pflanzen welche in Habitus und Ertrag verändert sind

Info

Publication number: DE69132758T2
Application number: DE69132758T
Authority: DE
Inventors: Dr. Sonnewald; Prof. Dr. Willmitzer
Original assignee: Aventis CropScience GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1991-11-04
Publication date: 2002-09-05
Anticipated expiration: 2011-11-05
Also published as: IE913884A1; US5492820A; IE20020633A1; AU8702191A; EP0485044B1; JPH05236971A; ES2164636T3; EP1114866A3; KR920009983A; DE4035756A1; JP3431177B2; HU215255B; CA2055150A1; DE69132758D1; HU913508D0; EP0485044A2; ATE206761T1; HUT60774A; EP0485044A3; AU655209B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Plasmide zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die in Habitus und Ertrag verändert sind.
Das Wachstum, die Entwicklung und der Ertrag einer Nutzpflanze oder einer Zierpflanze hängt von der Energie ab, die diese Pflanze durch die Fixierung von CO&sub2; in Kohlenhydrate während der Photosynthese gewinnt. Die primären Orte für die Photosynthese sind das Blatt und zu einem geringeren Ausmaß das Stammgewebe, wohingegen andere Organe von Pflanzen, wie Wurzeln, Samen oder Knollen nicht wesentlich zur Bildung von Photoassimilaten beitragen, sondern im Gegenteil in ihrem Wachstum von der Versorgung durch photosynthetisch aktive Organe abhängig sind. Dieses bedeutet, dass es einen Fluss von photosynthetisch gewonnener Energie von photosynthetisch aktiven Geweben zu photosynthetisch inaktiven Teilen einer Pflanze gibt.
Die photosynthetisch aktiven Gewebe werden als Quellen oder "sources" bezeichnet. Sie werden als Nettoexporteure des fixierten Kohlendioxids definiert. Die photosynthetisch inaktiven Teile einer Pflanze werden als Senken oder "sinks" bezeichnet. Sie werden als Nettoimporteure des photosynthetisch fixierten Kohlendioxids definiert.
Es ist anzunehmen, dass sowohl die effiziente Nutzung von Photosyntheseprodukten als auch ihre Verteilung innerhalb einer Pflanze diese in mehrerer Hinsicht stark beeinflusst. Als Beispiel seien genannt der Habitus von Pflanzen. Sich neu entwickelnde Organe wie sehr junge Blätter oder auch andere Bereiche wie Wurzel und Samen sind völlig von der Syntheseleistung der "sources" abhängig. Das bedeutet, dass die Entwicklung solcher Organe abhängig ist von der Verteilung der in den "sources" gebildeten Photoassimilate innerhalb der Pflanze. Die Möglichkeit der Ausbildung von jungen Blättern oder auch der Ausbildung von Wurzeln könnte drastische Auswirkungen auf den Habitus einer Pflanze wie z. B. die Größe einer Pflanze, den Internodienabstand, die Größe und Form eines Blattes, das Aussehen eines Blattes und die Menge und Form der gebildeten Wurzel haben. Weiterhin sollte die Verteilung von Photoassimilaten von ganz entscheidender Bedeutung für den Ertrag einer Pflanze sein. So hat sich die Gesamtphotosyntheseleistung des Weizens in den letzten Jahrzehnten nicht wesentlich verändert, während der für den Menschen erntebare Ertrag der Weizenpflanzen angestiegen ist. Dies ist im wesentlichen darauf zurückzuführen, dass das Verhältnis zwischen konkurrierenden "sinks" dahingehend geändert wurde, dass die für den Ertrag wichtigen "sinks" wie Samen wesentlich mehr Photoassimilat aufnahmen als andere, für den Ertrag unbedeutende Bereiche der Pflanze, wie z. B. der Stengel. Durch eine in diesem Fall Verkürzung des Halmes konnte somit ein für den Menschen sehr viel günstigeres "sink"- zu "source"-Verhältnis bei Weizen erzielt werden. Dieses unterstreicht die Wichtigkeit der Verteilung von in den primären "sources" gebildeten Photoassimilaten in höheren Pflanzen in Bezug auf sowohl Habitus als auch Ertrag von Pflanzen.
Die Veränderungen des Habitus, der Resistenz gegen Trockenheit und/oder Frost und insbesondere die Veränderung des Ertrages der Pflanzen stellen wesentliche Verbesserungen gegenüber bekannten Pflanzen dar.
Biotechnologische Verfahren zur genetischen Veränderung dikotyler und monokotyler Pflanzen sind bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244, 1293-1299).
Es ist unbekannt, durch welche biochemischen Mechanismen das Verhältnis von "sink" und "source" reguliert wird.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, Pflanzen bereitzustellen, die in ihrem Habitus wie Größe, Blattform, Internodienabstand, Zellwandaufbau, Samen-, Knollen- und Wurzelausbildung, sowie insbesondere in ihrem Ernteertrag verändert sind.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Pflanze, enthaltend eine DNA, die für ein Protein zur Modifizierung des Zuckermetabolismus oder der Zuckerpartitionierung (-verteilung) kodiert. Die DNA-Sequenz wird in der erhaltenen transgenen Pflanze exprimiert und führt beispielsweise in diesen transgenen Pflanzen zu einem Anstieg des Anteils von Photoassimilaten, die in den "source"- Blättern in der Form von löslichen Zuckern vorliegen.
Hierzu werden Plasmide bereitgestellt, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für ein die Biosynthese löslicher Zucker modifizierendes Protein kodiert, wobei diese Plasmide in Pflanzenzellen eingeführt werden und diese Zellen zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die von der DNA-Sequenz kodierten Produkte greifen in den Phosphat/Pyrophosphat-Metabolismus ein, wobei die DNA- Sequenz eine DNA-Sequenz eines anorganischen Pyrophosphatase- Gens ist.
Bei den meisten Pflanzen werden Photoassimilate innerhalb einer Pflanze in Form von Zuckern, und zwar präferentiell in der Form von Saccharose, verteilt. Da Saccharose die wichtigste Transportform für Kohlenhydrate von "source" nach "sinks" darstellt, könnte eine andere wesentliche Determinante für die Stärke einer "source", und damit die effiziente Versorgung von "sinks", die Verfügbarkeit und der Gehalt an löslichen Zuckern (verschiedene Mono-, Di- und Trisaccharide, wie z. B. Fructose, Glucose und Saccharose), in den Blättern sein. So sollte z. B. ein höherer Gehalt an Saccharose in den "source"-Blättern zu einer verstärkten Versorgung der "sinks" führen und damit auch zu einem erhöhten Anteil an Photoassimilaten in den erntebaren Organen. Dies würde zu einer Ertragssteigerung führen.
Für die Partitionierung von Kohlehydraten zwischen "sink" und "source"-Teilen einer Pflanze sollte das Verhältnis zwischen löslichen Zuckern und Stärke in den "source"-Blättern von entscheidender Bedeutung sein. Eine effizientere Versorgung von "sinks" mit Saccharose aus den "source"-Blättern sollte zu einer Veränderung des Habitus der Pflanze, insbesondere aber zu einer Erhöhung des Ertrages führen, der in den meisten Fällen durch den "sink"-Speicher, wie Samen und Knolle oder Wurzel, festgelegt wird.
Einer der wesentlichen Kontrollpunkte bei der Saccharosebiosynthese ist die Konversion des Fructose-1,6-diphosphates (Fru- 1,6-P2) in Fructose-6-phosphat (Fru-6-P). Eines der an diesem Schritt beteiligten Enzyme ist die Pyrophosphat : Fructose-6- Phosphat-1-Phosphotransferase (PFP). Dieses Enzym kann auf der einen Seite Fru-1,6-P2 in Fru-6-P, unter Freisetzung anorganischen Pyrophosphats, überführen, auf der anderen Seite Fru-6-P in Fru-1,6-P2, unter Verbrauch anorganischen Pyrophosphats, aufphosphorylieren. Die Richtung der Reaktion, die durch PFP katalysiert wird, wird durch den relativen Gehalt an anorganischem Pyrophosphat und anorganischem Phosphat gesteuert.
Eine fortwährende Entfernung des anorganischen Pyrophosphats durch eine anorganische Pyrophosphatase sollte eine Verschiebung des obigen Gleichgewichts in Richtung Fru-6-P und damit eine verstärkte Bildung von löslichen Zuckern, wie z. B. Hexosen und/oder Saccharose, bewirken. Eine Verschiebung der Partitionierung der Photoassimilate durch Entfernung des Pyrophosphats durch eine anorganische Pyrophosphatase sollte auch bewirken, dass die von der UDP-Glucose-Pyrophosphorylase katalysierte Reaktion
Glucose-1-Phosphat + UTP → UDP-Glucose + PPi
in Richtung UDP-Glucose verschoben wird. Die dadurch erfolgte vermehrte Bereitstellung von UDP-Glucose führt zu weiteren veränderten Eigenschaften der Pflanze, wie z. B. dickeren Zellwänden. Dies geschieht durch erhöhte Bereitstellung der Precursor für die Zellwandbiosynthese. Die Verdickung der Zellwände führt zu einer Erhöhung der Trockenresistenz in diesen Pflanzen, bedingt durch einer verringerte Transpirationsrate.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssytem in E. coli und einen Marker, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt, aufweisen. Die Vektoren umfassen z. B. pBR 322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACY 184 usw. Dementsprechend kann die Sequenz an einer passenden Restriktionsstelle in den Vektor eingefügt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli- Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethoden werden im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse, Elektrophoresen und weitere biochemischmolekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden. Je nach Einführungsmethode der gewünschten Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ii- und Ri-Plasmid T-DNA, als Flankenbereich der einzuführenden Gene verbunden werden.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset-druckerij Kanters B. V., Alblasserdam, 1985, Kap. V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46 und An et al. EMBO J. (1985) 4: 277-287 beschrieben worden.
Ist die eingeführte DNA erst einmal im Genom integriert, so ist sie dort auch relativ stabil und springt in der Regel nicht mehr heraus. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Chloramphenicol u. a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.
Es wurde nun gefunden, dass ein Plasmid mit einer DNA-Sequenz, die an die regulatorische Region eines oder mehrerer anderen Gene fusioniert werden und dort die Expression des Gens in einer Pflanzenzelle oder in einer Pflanze bewirken kann (bereitgestellt werden kann). Die regulatorische Region enthält die Promotorregion eines Pflanzengens und das Terminatonssignal desselben oder eines unterschiedlichen Pflanzengens.
Es ist möglich, einen Promotor zu verwenden, beispielsweise den Cauliflower-Mosaikvirus-Promotor (cauliflower mosaic virus promotor; CaMV), der eine konstitutive Expression bewirkt, und ein pflanzliches Terminationssignal. Andere mögliche Promotoren sind Promotoren, die eine Expression spezifisch nur in photosynthetisch aktiven Zellen bewirken (z. B. der ST-Ls 1-Promotor, Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445-2451), wobei dies besonders vorteilhaft sein sollte, wenn die Änderung des Saccharose- Metabolismus in Blättern erreicht werden soll, ein "source"- spezifischer Promotor, der nur während des Aufladens von "sink"- Organen aktiv ist (d. h. während einer bestimmten Entwicklungsphase), ein wurzelspezifischer Promotor, wenn eine spezifische Expression in Wurzelzellen beispielsweise wegen einer erforderlichen dickeren Zellwand vorteilhaft ist, ein speicher("sink")- spezifischer Promotor (der beispielsweise nur in den Knollen der Kartoffel, der Pfahlwurzel (tap root) von Zuckerrüben oder Tomatenfrüchten aktiv ist (wie z. B. der Klasse I-Patatin-Promotor), wenn die zu erreichenden Änderungen für das "sink"-Gewebe besonders vorteilhaft sind.
Ein pflanzliches Terminationssignal kann das 3'-Ende der poly-A- Seite des Octopin-Synthasegens enthalten.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion, die Injektion oder die Elektroporation sowie weitere Möglichkeiten. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid integriert werden. Das Ti- oder Ri-Plasmid enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können sich nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sich sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker- Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. (1978), 163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann enthalten sein. Das so transformierte Bakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen benutzt. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Begriffe und Abkürzungen

Abkürzungen

bp, kb = Basenpaare, Kilobasen
DNA = Desoxyribonukleinsäure, Träger der genetischen Information
HEPES = N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure
SDS = Natriumdodecylsulfat
Tris = Tris(2-aminoethyl)amin
EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure
U = Unit (Enzymeinheit)
Am 20.08.1990 und am 10.10.1991 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide hinterlegt (Hinterlegungsnummer):
Plasmid p 35S-Ω-ppase (DSM 6141) - 20.08.1990
Plasmid L 700 : ppa (DSM 6733) - 10.10.1991

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1

zeigt die Struktur des 4,0 kb großen Plasmids p35S-Ω-ppase. Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
A = Fragment A (529 bp): Beinhaltet den 35S Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
B = Fragment B (73 bp): Enthält 61 Nukleotide der Sequenz: TTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAAT TA, den am 5'-Ende befindlichen Asp 718 Linker der Sequenz GGTACC und den am 3'-Ende befindlichen NcoI-Linker der Sequenz CCATGG.
C = Fragment C (554 bp): Enthält die proteinkodierende Region der anorganischen Pyrophosphatase (ppa) aus E. coli (Nukleotide Position +39 bis +565 der Sequenz nach Lahti et al.).
D = Fragment D (192 bp): Enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5.
Es werden ferner die im Ausführungsbeispiel beschriebenen Schnittstellen gezeigt.

Fig. 2

zeigt den Nachweis der vom Pyrophosphatase-Gen kodierten RNA in transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen mittels Northern-Blot- Analyse.
Positionen 1-19: Proben der aus Blättern gewonnenen Gesamt-RNA von Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid p 35S-Ω-ppase transformiert und regeneriert wurden.
Positionen 20-28: Proben der aus Blättern gewonnenen Gesamt- RNA von Tabakpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-Ω-ppase transformiert und regeneriert wurden.
Position A: Probe einer nicht transformierten Kartoffelpflanze
Position B: Probe einer nicht transformierten Tabakpflanze
Die schwarzen Flecken zeigen die von der Pyrophosphatase kodierte RNA.

Fig. 3

zeigt den Nachweis des Auftretens einer neuen Pyrophosphataseaktivität in Proteinextrakten aus Blättern der mit dem p35S-Ω- ppase-Plasmid transformierten transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen in einem SDS-Polyacrylamid-Gel.
Positionen 1-7: Proteinextrakt aus Blättern transformierter Kartoffelpflanzen
Positionen 8-9: Proteinextrakt aus Blättern transformierter Tabakpflanzen
Position A: Proteinextrakt aus Blättern nicht-transformierter Tabakpflanzen
Positionen B und C: Proteinextrakt aus Blättern nichttransformierter Kartoffelpflanzen
Positionen X und Y: Proteinextrakt aus E. coli.

Fig. 4

zeigt den Vergleich des Gehalts an Glucose, Fructose, Saccharose und Stärke in mmol/m² in einer das p35S-Ω-ppase Gen exprimierenden Tabakpflanze ( ) und einer nicht transformierten Tabakpflanze ( ) in Blättern verschiedenen Alters.
In der Abbildung bedeuten: 1 = sehr junge Blätter
2-4 = ausgereifte Blätter
5-6 = alte Blätter

Fig. 5

zeigt den Einfluss der Expression des p35S-Ω-ppase Gens in transgenen Kartoffelpflanzen (Positionen 1-12) auf das Saccharose/Stärke-Verhältnis in den Blättern transformierter Pflanzen.
C = nichttransformierte Kartoffelpflanze.

Fig. 6

zeigt die Struktur des 5,0 kb großen Plasmids L 700 : ppa.
Das Plasmid enthält die nachstehenden Fragmente:
A = Fragment A (1585 bp): enthält den Promotor des ST-LS1 Gens. Das Fragment umfasst die Nukleotide, Positionen +1 bis +1585 des ST-LS 1 Gens.
B = Fragment B (528 bp): enthält die proteinkodierende Region der anorganischen Pyrophosphatase (ppa). Das Fragment umfasst die Nukleotide, Positionen +39 bis +565.
C = Fragment C (192 bp): enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5; Nukleotide, Positionen 11749 bis 11939.
Es werden ferner die in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrunde liegenden Ausführungsbeispiele wird zunächst eine Aufstellung aller für diese Versuche notwendigen und an sich bekannten Verfahren gegeben:

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung wurde der Vektor pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103-119) benutzt.
Zur Pflanzentransformation wurden die Genkonstrukte in den binären Vektor BIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984), 12, 8711-8720) kloniert.

2. Bakterienstämme

Für die pUC-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977), 24, 6342-6346) oder TB1 benutzt. TB1 ist ein Rekombinationsnegatives, Tetracyclin-resistentes Derivat des Stammes JM101 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33-, 103-119). Der Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, pers. Mitteilung): F (traD36, ProAB, lacI, lacZΔM15), Δ(lac, pro), SupE, thiS, recA, Sr1:Tn10(TcR).
Die Pflanzentransformation wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan, M., Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721 (1984); BIN19 Derivat) durchgeführt.

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens.

Bei BIN19- Derivaten erfolgt die Einführung der DNA in die Agrobakterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al. (Mol. Gen. Genet, (1978), 163, 181-187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res. (1979), 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch aufgetrennt.

4. Pflanzentransformation

A) Tabak: 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens wurden abzentrifugiert, der Überstand verworfen, und die Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (ca. 1 cm²), denen die Mittelrippe entfernt wurde, in dieser Bakteriensuspension gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen, die MS-Medium (nach Murashige und Skoog, Physiologia Plantarum (1962), 15, 473-497) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto-Agar enthalten, dicht ausgelegt. Nach 2-tägiger Inkubation bei 25ºC im Dunkeln wurden sie auf MS-Medium übertragen, welches 100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l Claforan, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphthylessigsäure (NAA) und 0,8% Bacto-Agar enthielt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 250 mg/l Claforan überführt.
B) Kartoffel: 10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30-50 ul einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-übernachtkultur enthielt. Nach 3-5minütigem leichtem Schütteln wurden die Petrischalen bei 25ºC im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25ºC und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert. Die weitere Kultivierung erfolgte wie von Rocha-Sosa et al. in EMBO Journal 8, 29 (1989) beschrieben.

5. Analyse genomischer DNA aus transgenen Pflanzen

Die Isolierung genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers und Bendich (Plant Mol. Biol. (1985), 5, 69-76).
Für die DNA-Analyse wurden 10-20 ug DNA nach geeigneter Restriktionsspaltung mit Hilfe von "Southern Blots" auf Integration der zu untersuchenden DNA-Sequenzen analysiert.

6. Analyse der Gesamt-RNA aus transgenen Pflanzen

Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgte nach Logemann et al. (Analytical Biochem. (1987), 163, 16-20).
Für die Analyse wurden je 50 ug Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern Blots" auf die Anwesenheit der gesuchten Transkripte untersucht.

7. Proteinextraktion

Zur Extraktion von Gesamtprotein aus Pflanzengewebe wurden Gewebestücke in Proteinextraktionspuffer (25 mM Natriumphosphat pH 7,0, 2 mM Natriumbisulfit, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)), unter Zusatz von 0,1% (w/v) unlöslichem Polyvinylpyrrolidon (PVP) homogenisiert.
Nach Filtrieren durch Zellstoff wurden Zelltrümmer bei 10.000 Umdrehungen pro Minute 20 Minuten abzentrifugiert und die Proteinkonzentration des Überstandes nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem. (1976)/72, 248-254) bestimmt.

8. Nachweis der anorganischen Pyrophosphatase-Aktivität

(modifiziert nach Baykov et al., Analytical Biochemistry 171, 271-276 (1988)).
Das Gesamtprotein wurde aus Pflanzen, wie unter Punkt 7 beschrieben, extrahiert und mit nativem SB-Puffer (125 mM Tris/HCl pH 6,8, 10% 2-Mercaptoethanol, 20% Glycol, 0,004% Bromphenolblau) versetzt und auf 10%-ige SDS- Polyacrylamid-Gele gegeben. Die Ansätze wurden vor Auftrennung in den SDS-Polyacrylamidgelen nicht durch Erhitzen denaturiert. Nach elektrophoretischer Trennung wurden die Gele kurz in Wasser gespült und 1 Stunde bei 37ºC in Pyrophosphat-Puffer (0,05 M Tris-HCl pH 9,0; 0,03 mM anorganisches Pyrophosphat (Na&sub4;P&sub2;O&sub7;), 5 mM MgCl&sub2;) inkubiert. Zu dieser Lösung wurde anschließend 17 Vol.-% Färbepuffer (140 mg Ammoniummolybdat, 11,5 mg Malachitgrün in 10 ml 2,5 M H&sub2;SO&sub4;) zugegeben. Die Bildung eines türkisfarbenen Präzipitates zeigte die Pyrophosphataseaktivität an.

9. Bestimmung von Saccharose, Glucose, Fructose und Stärke

A) Extraktion

In flüssigem Stickstoff gefrorene Blattscheibchen (Durchmesser 10 mm) wurden in 0,5 ml Puffer (80% (v/v) Ethanol; 10 mM HEPES pH 7,5) 30 Minuten bei 80ºC im Wasserbad extrahiert. Der Überstand mit den löslichen Komponenten wurde abgeschüttet und das Volumen bestimmt. Der Überstand wurde zur Bestimmung der löslichen Zucker eingesetzt.
Das verbliebene unlösliche Material wurde mit Wasser gespült und fein gemörsert. Anschließend wurde der Extrakt 1 Stunde bei 95ºC in 0,2 M Kaliumhydroxyd- Lösung gekocht, mit 70 ul 1 N Essigsäure neutralisiert und anschließend zentrifugiert. Aliquots der so erhaltenen Stärkelösung wurden zur Stärkebestimmung eingesetzt.

B) Quantitative Bestimmung löslicher Glucose, Fructose und Saccharose

Die quantitative Bestimmung löslicher Glucose, Fructose und Saccharose erfolgte in folgendem Testansatz:
100,0 mM Imidazol-HCl, pH 6,9
1,5 mM MgCl&sub2;
0,5 mM NADP&spplus;
1,3 mM ATP
10-50,0 ul Probe
1,0 U Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Hefe
Dieser Ansatz wurde 5 Minuten inkubiert. Der Nachweis von Zucker wurde anschließend durch sukzessive Zugabe von
1,0 U Hexokinase aus Hefe (für die Bestimmung von Glucose)
1,0 U Phosphorglucose-Isomerase aus Hefe (für die Bestimmung von Fructose)
20,0 U Invertase aus Hefe (für die Bestimmung von Sacharose)
photometrisch bestimmt.

C) Stärkebestimmung

Die nach der ethanolischen Extraktion unter a) erhaltene Stärkelösung wurde bei 55ºC mit hydrolytischen Enzymen versetzt und 12 Stunden in folgendem Ansatz inkubiert:
50,0 mM Na-Acetat, pH 4,8
1,4 U Amyloglucosidase aus Aspergillus niger
2,0 U α-Amylase aus Schweinepankreas
Nach der Inkubation wurden die unlöslichen Bestandteile durch 4-minütige Zentrifugation bei 16.000g entfernt. Im Überstand wurde anschließend die entstandene Glucose, wie unter b) beschrieben, enzymatisch bestimmt.

Beispiel 1

Herstellung von Plasmid p35S-Ω-ppase und Einführung des Plasmids in das pflanzliche Genom

Eine DNA-Sequenz aus E. coli K12, welche für die anorganische Pyrophosphatase kodiert, wurde mit einem eine konstitutive Expression bewirkenden Promotor der 35S RNA des Cauliflower- Mosaik-Virus (CaMV), einem als Translationsverstärker dienenden DNA-Segment aus dem Tabak-Mosaik-Virus und einem pflanzlichen Terminationssignal versehen. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3'-Ende der Poly-A Seite des Octopin-Synthase Gens. Dabei wurde die Umgebung des Translationsinitiationscodons ATG der Sequenz für die anorganische Pyrophosphatase einer gerichteten Mutagenese unterzogen, um eine optimale Expression in eukaryontischen Zellen zu erreichen. Das Plasmid p35S-Ω-ppase besteht aus den vier Fragmenten A, B, C und D, die in die Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden sind (Fig. 1).
Das Fragment A ((529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21, 285-294). Es wurde als EcoRI-KpnI Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucleic Acids Research 14, 5857-5868) isoliert und zwischen die EcoRI-KpnI Schnittstellen des Polylinkers des Plasmids pUC 18 kloniert.
Das Fragment B enthält ein Segment, das aus 61 Nukleotiden der Sequenz
TTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTA
besteht, die homolog zu einem Teil des als Translationsverstärker dienenden DNA-Segmentes aus dem Tabak-Mosaik-Virus-Stamm U sind (Gallie et al., Nucleic Acids Res. 15, 3257-3273). Dieses Segment, das durch DNA-Synthese hergestellt worden ist, wurde am 5'-Ende mit einem Asp718-Linker der Sequenz
GGTTACC
sowie am 3'-Ende mit einem NcoI-Linker mit der Sequenz
CCATGG
versehen.
Das Fragment B wurde zwischen die KpnI und SmaI Schnittstelle des Polylinkers von pUC 18 kloniert.
Das Fragment C umfasst die proteinkodierende Region der anorganischen Pyrophosphatase (ppa) aus E. coli mit den Nukleotiden, Position +39 bis +565 der Sequenz nach Lahti et al. (J. Bacteriology 170, 5901-5907)
Das Fragment C wurde zwischen die NcoI Stelle des Fragments B und die SalI Stelle des Polylinkers von pUC 18 kloniert.
Fragment D (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846), Nukleotide 11749-11939, welches als PvuII-HindIII Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303, 200-213) isoliert wurde und nach Addition von SphI Linke m an die PvuII Schnittstelle zwischen die SphI-HindIII Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden war.
Die Größe des Plasmids p35S-Ω-ppase beträgt 4,0 kb.
Das Plasmid p35S-Ω-ppase wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des Agrobakteriensystems in Tabak- und Kartoffelpflanzen eingeführt. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert.
Die Analyse der transformierten Pflanzen mittels "Southern- Blot"-Analyse zeigte das Vorhandensein des intakten chimären Pyrophosphatasegens in den transgenen Pflanzen.
Zum Nachweis der vom Pyrophosphatase-Gen kodierten RNA in transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen wurden 30 ug Gesamt-RNA aus den Blättern der transformierten und regenerierten Kartoffel- und Tabakpflanzen sowie aus nicht transformierten Kartoffel- und Tabakpflanzen isoliert. Diese RNA wurde mittels Northern-Blot- Analyse untersucht. Die Analyse der regenerierten Pflanzen (Kartoffel: Positionen 1, 2, 8, 11, 12, 15 und 18; und Tabak: Positionen 21-26) zeigte in den Geweben RNA, die spezifisch mit der kodierenden Sequenz der anorganischen Pyrophosphatase hybridisiert und die in nicht transformierten Pflanzen (Kartoffelpflanze, Position A, Tabakpflanze, Position B) abwesend ist (Fig. 2).
Der Nachweis der neuen Pyrophosphataseaktivität in Proteinextrakten aus Blättern der mit dem p35S-Ω-ppase Plasmid transformierten transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen wurde in partiell denaturierten Gelen, wie unter Punkt 8 beschrieben, durchgeführt.
Die Proteinextrakte transformierter Pflanzen, die eine spezifisch mit der kodierenden Sequenz der anorganischen Pyrophosphatase hybridisierende RNA enthalten, wiesen eine anorganische Pyrophosphataseaktivität auf (Kartoffelpflanzen: Positionen 1-7 und Tabakpflanzen: Positionen 8 und 9), die in nicht-transformierten Pflanzen, Positionen A-C, fehlten (s. Fig. 3).
Es wurden somit transgene Tabak- und Kartoffelpflanzen hergestellt, die eine neue anorganische Pyrophosphataseaktivität enthalten, die von dem in diese Pflanzen eingeführten E. coli Gen stammt (s. Fig. 3).
Die regenerierten Tabak- und Kartoffelpflanzen wiesen eine Reihe von Unterschieden in bezug auf phänotypische als auch biochemische Parameter auf.

a) Transgene Tabakpflanzen

Transgene Tabakpflanzen, die eine hohe Expression des Pyrophosphatase-Gens aufwiesen, zeigten eine deutliche Reduktion in der Pflanzengröße, während Tabakpflanzen mit einer mittleren Expression des Pyrophosphatasegens nur eine geringe Reduktion der Größe aufwiesen. Die Stauchung ist dabei nicht auf eine Verringerung der Blattzahl zurückzuführen, sondern auf eine Verringerung des Internodienabstandes.
Die jungen Blätter der Pyrophosphatase-exprimierenden Tabakpflanzen wiesen keine deutlichen phänotypischen Unterschiede im Vergleich zu nicht-transformierten Kontrollpflanzen auf. Die älteren Blätter der Pyrophosphatase-exprimierenden Blätter hingegen zeigten eine deutliche Verdickung des Blattes. Bei Pflanzen, die das Pyrophosphatasegen sehr hoch exprimieren, war eine Ausbleichung der älteren Blätter zu sehen. Neben diesen phänotypischen Unterschieden wiesen die das Pyrophosphatasegen exprimierenden Tabakpflanzen eine deutliche Veränderung der Zusammensetzung der Kohlenhydrate in Blättern verschiedenen Alters auf (s. Fig. 4). So waren beispielsweise die Mengen an löslichen Zuckern, insbesondere Glucose, Fructose und Saccharose, in allen Blättern gegenüber Blättern nicht-transformierter Pflanzen deutlich erhöht, wobei in den älteren Blättern eine Erhöhung um einen Faktor bis zu 20-50 festgestellt wurde. Gleichzeitig fand zumindest in den älteren Blättern eine Steigerung der Menge an gebildeter Stärke statt, die jedoch nicht so groß war, wie die Steigerung des Anteils an löslichen Zuckern, so dass insgesamt einerseits eine deutliche Erhöhung des Gesamtgehaltes an Stärke und löslichen Zuckern als Folge der Expression der Pyrophosphatase festgestellt wurde und andererseits eine deutliche Verschiebung der Partitionierung der Photoassimilate zwischen Stärke und löslichen Zuckern in Richtung löslicher Zucker auftrat.

b) Transgene Kartoffelpflanzen

Transgene Kartoffelpflanzen, die das Pyrophosphatasegen exprimieren, zeigten als erste wesentliche phänotypische Veränderung eine deutlich gestauchte Größe. Diese Stauchung geht mit einer verstärkten Verzweigung der Pflanzen aufgrund der verstärkten Ausbildung von Achselsprossen einher. Es ist offensichtlich, dass dieser gedrungene Wuchs viele Vorteile bezüglich Standfestigkeit und Windanfälligkeit hat.
Die das Pyrophosphatasegen exprimierenden Kartoffelpflanzen wiesen weiterhin drastische Veränderungen in bezug auf die Zusammensetzung der Kohlenhydrate im Blatt auf (s. Fig. 5). So haben diese Kartoffelpflanzen ein erhöhtes Saccharose/Stärke-Verhältnis. Die Erhöhung dieses Verhältnisses kann bis Faktor 20 gehen. Im Unterschied zu den Tabakpflanzen wiesen die transgenen Kartoffelpflanzen keine drastische Erhöhung der Hexosen (Glucose und Fructose) auf.
Durch die Expression des eine anorganische Pyrophosphatase kodierenden Gens in transgenen Kartoffelpflanzen ist es somit gelungen, eine Veränderung der Saccharose/Stärke-Verhältnisse zu erreichen und damit die Kapazität des "source"-Blattes zu verändern.
Das Pyrophosphatasegen kann aus vielen anderen Quellen geklont und für ähnliche Experimente verwendet werden. Zusätzlich kann die Primärsequenz der Pyrophosphatase modifiziert werden, um eine höhere Expression zu erreichen und/oder um die ppase in beispielsweise andere subzelluläre Organellen (Chloroplasten, Mitochondrien, Vakuolen, Extrazellulärraum) zu richten bzw. schleusen, oder es können andere Promotoren verwendet werden, um die Expression spezifisch nur in z. B. photosynthetisch aktiven Zellen, in Samen, Knollen, Pfahlwurzeln, Früchten, Wurzeln, Stengel, Blüten etc. oder unter spezifischen Umgebungsbedingungen wie Trockenheit, Hitze, Kälte, stark salzhaltigen Böden sicherzustellen.

Beispiel 2

Herstellung von Plasmid L700:ppa und Einführung des Plasmids in das pflanzliche Genom

Eine DNA-Sequenz aus E. coli K12, die für die anorganische Pyrophosphatase kodiert, wurde mit einem eine spezifische Expression in photosynthetisch aktiven Zellen bewirkenden Promotor des ST-LS1 Gens (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445-2451 (1989)) und einem pflanzlichen Terminationssignal versehen. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3-Ende der Poly-A Seite des Octopin-Synthase Gens. Das Plasmid L700:ppa besteht aus den drei Fragmenten A, B und C, die in die Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden sind (Fig. 6).
Das Fragment A (1585 bp) beinhaltet den Promotor des ST-LS1 Gens (op.cit.). Das Fragment umfasst die Nukleotide +1 bis +1585 des ST-LS1 Gens (Eckes et al., Mol. Gen. Genetics 205, 14-22). Es wurde als EcoRI-MboII Fragment isoliert und zwischen die EcoRI- SmaI-Schnittstellen des Polylinkers des Plasmids pUC 18 kloniert, nachdem die MboII Stelle mit T4-DNA Polymerase geglättet (flushed) worden war.
Das Fragment B umfasst die proteinkodierende Region der anorganischen Pyrophosphatase (ppa) aus E. coli, enthaltend die Nukleotide, Positionen +39 bis +565, der Sequenz nach Lahti et al. (J. Bacteriology 170, 5901-5907). Es wurde als NcoI-SalI Fragment aus dem Plasmid p35S-Ω-ppase isoliert (s. Fig. 1). Das Fragment B wurde zwischen die BamHI- und die SalI-Stelle des Polylinkers aus pUC 18 kloniert, nachdem die NcoI- und die Bam- HI-Stelle durch Auffüllreaktionen stumpfendig gemacht worden waren.
Das Fragment C (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846), Nukleotide 11749-11939, welches als PvuII-HindIII Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303, 209-213) isoliert worden ist und nach Addition von Sph Linke m an die PvuII Schnittstelle zwischen die SphI- HindIII-Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden war.
Die Größe des Plasmids L700:ppa beträgt 5,0 kb.
Das Plasmid L700:ppa wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des Agrobakteriensystems in Tabak- und Kartoffelpflanzen eingeführt. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert.
Die Analyse der transformierten Pflanzen mittels "Southern- Blot", "RNA-Blot" und Zymogramm-Analyse zeigte das Vorhandensein sowie die Expression des Pyrophosphatasegens in den transgenen Pflanzen nur im Blattgewebe bzw. den photosynthetisch aktiven Zellen.
Die spezifische Expression der aus E. coli stammenden Pyrophosphatase in photosynthetisch aktiven Zellen (Blatt) führt zu einer erhöhten Versorgung der "sink"-Organe (Wurzeln, Knollen) mit Saccharose und steigert somit den Ertrag.

Claims

1. Plasmid, enthaltend eine für eine anorganische Pyrophosphatase codierende DNA- Sequenz, die an die Regulationsregionen von einem oder mehreren anderen Genen gebunden ist, die die Expression der genannten DNA-Sequenz in Pflanzenzellen oder Pflanzen bewirken können.

2. Plasmid gemäß Anspruch 1, wobei die genannte für eine anorganische Pyrophosphatase codierende DNA-Sequenz von E. coli abgeleitet ist.

3. Plasmid gemäß Anspruch 1, wobei die genannten Regulationsregionen Promotorregionen und transkriptorische Terminationssignale umfassen.

4. Plasmid gemäß Anspruch 3, wobei die genannte Promotorregion aus einer Gruppe ausgewählt wird, die sich zusammensetzt aus:

einem Promotor eines Pflanzengens,

einem Promotor eines Virusgens,

einem Promotor, der eine konstitutive Expression bewirkt,

einem Promotor, der eine Expression in photosynthetisch aktiven Zellen bewirkt,

einem Promotor, der eine Expression in Zellen von Sink-Geweben bewirkt,

einem Promotor, der eine Expression in Wurzelzellen bewirkt,

dem Promotor der 35S RNA des Blumenkohl-Mosaikvirus,

dem ST-Ls-1-Promotor und

Promotoren des Klasse I Patatin-Gens.

5. Plasmid gemäß Anspruch 3, wobei das genannte transkriptorische Terminationssignal vom Octopinsynthase-Gen gewonnen wird.

6. Plasmid p35S-Ω-ppase (DSM 6141).

7. Plasmid L700:ppa (DSM 6733).

8. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit einem modifizierten Zuckerstoffwechsel, das die folgenden Schritte umfasst:

Transformation von Pflanzenzellen mit einem Plasmid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und

b) Verwendung der genannten transformierten Pflanzenzellen zur Regeneration transgener Pflanzen.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die genannten Pflanzenzellen von einer Kartoffelpflanze gewonnen werden.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die genannten Pflanzenzellen von einer Tabakpflanze gewonnen werden.

11. Transgene Pflanzen, gewonnen aus Pflanzenzellen, die eine für eine anorganische Pyrophosphatase codierende DNA-Sequenz enthalten, die an die Regulationsregionen von einem oder mehreren anderen Genen gebunden ist, die die Expression der genannten DNA-Sequenz in Pflanzenzellen oder Pflanzen bewirken können.

12. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 11, wobei die genannte für eine anorganische Pyrophosphatase codierende DNA-Sequenz von E. coli abgeleitet ist.

13. Transgene Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 11 bis 12, wobei die genannten Regulationsregionen Promotorregionen und transkriptorische Terminationssignale umfassen.

14. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 13, wobei die genannte Promotorregion aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus:

einem Promotor eines Pflanzengens,

einem Promotor eines Virusgens,

einem Promotor, der eine konstitutive Expression bewirkt,

einem Promotor, der eine Expression in photosynthetisch aktiven Zellen bewirkt,

einem Promotor, der eine Expression in Zellen von Sink-Geweben bewirkt,

einem Promotor, der eine Expression in Wurzelzellen bewirkt,

dem Promotor der 35S RNA des Blumenkohl-Mosaikvirus,

dem ST-Ls-1Promotor und Promotoren des Klasse I Patatin-Gens.

15. Transgene Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie Kartoffelpflanzen sind.

16. Transgene Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie Tabakpflanzen sind.

17. Verwendung eines Plasmids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 für die Transformation von Pflanzenzellen.