DE69836267T2

DE69836267T2 - Nukleinsäuren aus der artischocke (cynara scolymus), welche für ein enzym mit fruktosylpolymerase-aktivität kodieren

Info

Publication number: DE69836267T2
Application number: DE69836267T
Authority: DE
Inventors: G. Arnd HEYER; Elke Hellwege; Dominique Gritscher
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 1997-03-04
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2018-03-03
Also published as: CN1163612C; HUP0003600A2; WO1998039460A1; JP2001513642A; US7153674B2; BR9808154A; HU225800B1; ES2275302T3; JP4101304B2; EP0977876B1; ZA981762B; BRPI9808154B1; CZ314099A3; PL197151B1; DE69836267D1; PL335657A1; CN1249783A; CZ299374B6; EP0977876A1; US6515203B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Nucleinsäuremoleküle, welche Saccharose-abhängige Saccharose-Fructosyltransferasen (SST) codieren. Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf Vektoren und Wirte, welche solche Nucleinsäuremoleküle enthalten, sowie auf Pflanzenzellen und Pflanzen, welche mit den beschriebenen Nucleinsäuremoleküle transformiert sind. Darüber hinaus werden Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen beschrieben, welche kurzkettige Fructosylpolymere auf Grund der Einführung von DNA-Molekülen synthetisieren, welche eine SST aus Artischocke codieren. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Herstellung von SST von kurzkettigen Fructosylpolymeren in verschiedenen Wirtsorganismen sowie auf die SST, mit deren Hilfe kurzkettige Fructosylpolymere unter Verwendung verschiedener Verfahren hergestellt werden können, zum Beispiel enzymatische oder andere biotechnologische Verfahren.
Wasserlösliche, lineare Polymere haben viele verschiedene Anwendungen, zum Beispiel zur Steigerung der Viskosität von wässrigen Systemen, als Detergenzien, als Suspensionsmittel oder zur Beschleunigung des Sedimentationsprozesses und zur Komplexierung, aber auch zur Bindung von Wasser. Polymere auf der Grundlage von Sacchariden, zum Beispiel Fructosylpolysaccharide, sind besonders interessante Rohmaterialien, da sie biologisch abbaubar sind.
Abgesehen von ihrer Anwendung als regenerierbare Rohmaterialien zur industriellen Produktion und Verarbeitung sind Fructosylpolymere auch als Lebensmittelzusatzstoffe interessant, zum Beispiel als künstliche Süßstoffe. Polymere, welche einen niedrigen Polymerisationsgrad haben, sind zu diesem Zweck besonders passend.
Bis jetzt wurden nur Verfahren zur Herstellung von langkettigen Fructan-Polysacchariden in Pflanzen durch Expression von Enzymen von bakteriellem Ursprung sowie ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen beschrieben, welche Fructosyltransferasen aus Helianthus tuberosus exprimieren. Verfahren zur Herstellung von Enzymen zur Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren sind nicht bekannt. In der Beschreibung von PCT/USA89/02729 wird die Möglichkeit, Kohlenhydrat-Polymere, insbesondere Dextrane oder Polyfructose, in transgenen Pflanzen, insbesondere in den Früchten von transgenen Pflanzen, herzustellen, beschrieben. Zur Herstellung von solchen modifizierten Pflanzen werden die Anwendung von Levan-Saccharasen aus Mikroorganismen, insbesondere aus Aerobacter levanicum, Streptococcus salivarius und Bacillus subtilis, oder von Dextran-Saccharasen aus Leuconostoc mesenteroides vorgeschlagen. Weder von den aktiven Enzymen, noch von Levan oder Dextran, noch von transgenen Pflanzen wird die Herstellung beschrieben. Die Beschreibung von PCT/EP93/02110 legt einen Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen offen, welche das Isc-Gen von Levan-Saccharase aus dem gramnegativen Bakterium Erwinia amylovora exprimieren. In der Beschreibung von PCT/NL93/00279 wird die Transformation von Pflanzen beschrieben, welche chimäre Gene haben, welche das sacB-Gen aus Bacillus subtilis oder das ftf-Gen aus Streptococcus mutans enthalten. In dem Fall des sacB-Gens wird eine Modifikation in der 5'-untranslatierten Region des Gens empfohlen, um das Expressionsniveau bei transgenen Pflanzen zu steigern. Die Beschreibung von PCT/NL96/00012 offenbart DNA-Sequenzen, welche die Enzyme codieren, welche Kohlenhydrat-Polymere synthetisieren, und die Herstellung transgener Pflanzen mit der Hilfe dieser DNA-Sequenzen. Die offenbarten Sequenzen stammen aus Helianthus tuberosus. Nach PCTL/NL96/00012 sind die offenbarten Sequenzen nicht nur passend, um das Fructanprofil von zum Beispiel der Petunie oder der Kartoffel, sondern auch von Helianthus tuberosus selbst zu modifizieren. Daher beschreibt die Beschreibung von PCT/NL96/00012 unter anderem transgene Kartoffelpflanzen, welche eine SST aus Helianthus tuberosus exprimieren. Obwohl die enzymatische Aktivität der exprimierten SST in den transgenen Pflanzen nachgewiesen werden konnte, konnte nur ein geringes Niveau der Umwandlung des Substrats Saccharose zu kurzkettigen Fructosylpolymeren erreicht werden. Dies kann auf verschiedene Faktoren bezogen werden, wie geringe Affinität des Enzyms zu seinem Substrat oder eine mögliche Inhibition des Enzyms durch das hergestellte Produkt.
Daher ist die Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung, Nucleinsäuremoleküle bereitzustellen, welche eine Saccharose-abhängige Saccharose-Fructosyltransferase (SST) codieren, mit deren Hilfe es möglich ist, durch Gentechnik modifizierte Organismen herzustellen, welche in der Lage sind, kurzkettige Fructosylpolymere zu bilden.
Die Aufgabenstellung wird durch Bereitstellung der in den Patentansprüchen beschriebenen Ausführungsformen gelöst.
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Nucleinsäuremoleküle, welche die Proteine codieren, welche die biologische Aktivität einer SST haben und aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:

(a) Nucleinsäuremolekülen, welche ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:4 umfasst;
(b) Nucleinsäuremolekülen, umfassend die Nucleotidsequenz, dargestellt in SEQ ID NO:1 oder eine entsprechende Ribonucleotidsequenz;
(c) Nucleinsäuremolekülen, umfassend die Nucleotidsequenz, dargestellt in SEQ ID NO:3 oder eine entsprechende Ribonucleotidsequenz;
(d) Nucleinsäuremolekülen, welche mit den in (a) oder (b) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren und welche eine SST codieren, deren Aminosäure zu mindestens 90% identisch mit der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ist; und
(e) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz von der in (a), (b) oder (c) genannten Sequenz auf Grund der Degeneration des genetischen Codes abweicht.

In dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird ein Enzym, welches die Fructosyl-Polymeraseaktivität hat, als ein Protein verstanden, welches in der Lage ist, die Verknüpfung von β-2,1-glycosidischen oder β-2,6-glycosidischen Bindungen zwischen Fructoseeinheiten zu katalysieren. Hiermit kann ein zu übertragender Fructosylrest aus Saccharose oder einem Fructanpolymer stammen.
Ein kurzkettiges Fructosylpolymer wird als ein Molekül verstanden, welches mindestens zwei aber nicht mehr als 100 Fructosylreste enthält, die entweder β-2,1-glycosidisch oder β-2,6-glycosidisch verbunden sind. Das Fructosylrolymer kann einen Glucoserest an seinem Ende tragen, das über die C-1-OH-Gruppe der Glucose und der C-2 OH-Gruppe eines Fructosyls verbunden ist. In diesem Fall ist ein Saccharosemolekül in dem Fructosylpolymer enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nucleinsäuresequenzen der Erfindung aus Artischocke abgeleitet.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass während der Expression der Nucleinsäuremoleküle der Erfindung große Mengen von Fructosylpolymeren hergestellt wurden.
Im Gegensatz zu den in der Beschreibung PCT/NL96/00012 beschriebenen Kartoffeln wird eine große Menge von Oligonfructan erhalten, welche sogar größer ist als der Zellgehalt des Substrats Saccharose, wenn die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung verwendet werden.
Die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung können sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle sein. Passende DNA-Moleküle sind zum Beispiel genomische oder cDNA-Moleküle. Die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung können aus natürlichen Quellen isoliert werden, vorzugsweise aus Artischocke, oder können nach bekannten Verfahren synthetisisiert werden.
Mit Hilfe von konventionellen molekularbiologischen Verfahren ist es möglich (s. z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), unterschiedliche Mutationen in die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung einzuführen. Als Ergebnis werden Proteine mit möglicherweise modifizierten biologischen Eigenschaften synthetisiert. Eine Möglichkeit ist die Herstellung von Deletionsmutanten, bei denen Nucleinsäuremoleküle durch durchgängige Deletionen von dem 5'- oder 3'-Ende der codierenden DNA-Sequenz hergestellt werden und die zur Synthese von Proteinen führen, welche demgemäß verkürzt sind. Durch solche Deletionen an dem 5'-Ende der Nucleinsäuresequenz ist es zum Beispiel möglich, Aminosäuresequenzen zu identifizieren, welche verantwortlich sind für die Translokation des Enzyms in die Plastide (Übergangspeptide). Dies erlaubt die spezifische Herstellung von Enzymen, welche auf Grund der Beseitigung der entsprechenden Sequenzen nicht länger in der Vakuole, sondern im Cytosol lokalisiert sind oder welche auf Grund der Hinzufügung von anderen Signalsequenzen in anderen Kompartimenten lokalisiert sind.
Eine andere Möglichkeit ist die Einführung einer Punktmutation an Positionen, wo eine Modifikation der Aminosäuresequenz z.B. die Enzymaktivität oder die Enzymregulation beeinflusst. Durch dieses Verfahren können Mutanten hergestellt werden, welche zum Beispiel einen modifizierten K_m-Wert besitzen oder welche nicht länger den Regulationsmechanismen unterliegen, welche normalerweise in der Zelle im Hinblick auf allosterische Regulation oder kovalente Modifikation existieren.
Darüber hinaus können Mutanten hergestellt werden, welche eine modifizierte Substrat- oder Produktspezifität zeigen. Auch können Mutanten hergestellt werden, welche ein modifiziertes Aktivitäts-Temperatur-Profil zeigen.
Zur Manipulation in prokaryontischen Zellen können mit Hilfe von Gentechnik die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingeführt werden, welche eine Mutagenese oder eine Modifikation einer Sequenz durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von konventionellen Verfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basen ausgetauscht werden und natürliche oder synthetische Sequenzen können hinzugefügt werden. Um die DNA-Fragmente miteinander zu verbinden, können Adapter oder Linker den Fragmenten hinzugefügt werden. Darüber hinaus können Manipulationen durchgeführt werden, welche passende Spaltstellen bereitstellen oder welche überflüssige DNA oder Spaltstellen beseitigen. Wenn Insertionen, Deletionen oder Substitutionen möglich sind, können in vitro-Mutagenese, Primer-Reparatur, Restriktion oder Ligation durchgeführt werden. Als Analyseverfahren werden gewöhnlich Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse und andere biochemische oder molekularbiologische Verfahren verwendet.
Der Begriff „Hybridisierung" im Zusammenhang dieser Erfindung hat die Bedeutung von Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Nucleinsäuremoleküle, welche mit den Molekülen der Erfindung hybridisieren, können z.B. aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken isoliert werden, welche aus Artischocke hergestellt wurden.
Um solche Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren und zu isolieren, können die Moleküle der Erfindung oder Teile dieser Moleküle oder die umgekehrten Komplemente dieser Moleküle verwendet werden, zum Beispiel mit Hilfe von Hybridisierung nach konventionellen Verfahren (s. z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Als Hybridisierungssonde können Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, welche zum Beispiel genau oder grundlegend die in Seq ID NO: 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder Teile von diesen Sequenzen haben. Die als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmente können synthetische Fragmente sein, welche mit Hilfe von konventionellen Syntheseverfahren hergestellt wurden und deren Sequenz grundlegend der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls der Erfindung entspricht.
Die Moleküle, welche mit den Nucleinsäuremolekülen der Erfindung hybridisieren, umfassen auch Fragmente, Derivate und allele Varianten der voranstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, welche ein Protein der Erfindung codieren. „Fragmente" werden als Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, welche lang genug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu codieren. Der Begriff „Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der voranstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle um eine oder mehrere Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad von Homologie mit diesen Sequenzen haben. Homologie bedeutet hier eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise von mehr als 80% und besonders bevorzugt von mehr als 90%. Diese durch die Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine haben eine Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz von mindestens 80%, vorzugsweise von 85% und besonders bevorzugt von mehr als 90%, 95%, 97% und 99%. Die Abweichungen zu den voranstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination hergestellt worden sein.
Die Nucleinsäuremoleküle, welche homolog zu den voranstehend beschriebenen Molekülen sind und welche Derivate dieser Moleküle repräsentieren, sind gewöhnlich Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen repräsentieren, welche die gleiche biologische Funktion haben. Sie können natürlich vorkommende Variationen sein, zum Beispiel Sequenzen aus anderen Organismen, oder Mutationen, welche entweder natürlich vorkommen oder durch spezifische Mutagenese eingeführt wurden. Darüber hinaus können die Variationen synthetisch hergestellte Sequenzen sein. Die allelen Varianten können entweder natürlich vorkommende Varianten oder synthetisch hergestellte Varianten oder durch rekombinante DNA-Prozesse hergestellte Varianten sein.
Die durch die verschiedenen Varianten der Nucleinsäuremoleküle der Erfindung codierten Proteine zeigen bestimmte gemeinsame Merkmale, wie Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktionsfähigkeit oder Konformation oder physikalische Eigenschaften wie die elektrophoretische Beweglichkeit, das chromatographische Verhalten, die Sedimentationskoeffizienten, die Löslichkeit, die spektroskopischen Eigenschaften, die Stabilität; das pH-Optimum, das Temperaturoptimum.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Nucleinsäuremoleküle, welche spezifisch mit Transkripten der Nucleinsäuremoleküle hybridisieren. Diese Nucleinsäuremoleküle sind vorzugsweise Oligonucleotide, welche eine Länge von mindestens 10, insbesondere von mindestens 15 und besonders bevorzugt von mindestens 50 Nucleotide haben. Die Nucleinsäuremoleküle und die Oligonucleotide der Erfindung können zum Beispiel als Primer für eine PCR-Reaktion verwendet werden. Sie können auch Komponenten von Antisense-Konstrukten oder von DNA-Molekülen sein, welche passende Ribozyme codieren.
Die Erfindung bezieht sich darüber hinaus auf Vektoren, welche Nucleinsäuremoleküle der Erfindung enthalten. Vorzugsweise sind sie Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere Vektoren, welche gewöhnlich auf dem Gebiet der Gentechnik verwendet werden.
Vorzugsweise ist die Nucleinsäuresequenz der Erfindung funktionell mit regulatorischen Elementen in dem Vektor der Erfindung verbunden, welcher die Transkription und Synthese einer RNA in prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zellen gewährleistet, welche translatiert werden können.
Die Expressionsvektoren der Erfindung erlauben die Herstellung von Enzymen, welche kurzkettige Fructosylpolymere in verschiedenen Wirtsorganismen synthetisieren.
Die codierten Enzyme können auch außerhalb der Wirtsorganismen zur Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren verwendet werden. Dadurch können enzymatische und andere biotechnologische Verfahren zur Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren verwendet werden. Zum Beispiel ist es auch denkbar, Fructosylpolymere mit Hilfe von immobilisierten Enzymen herzustellen.
Gemäß der Erfindung werden regulatorische Elemente des Patatin-B33-Promotors bevorzugt. Andere bevorzugte Promotor sind der 35S-CaMV-Promotor und der Promotor des Alkoholdehydrogenase-Gens von Saccharomyces cerevisiae.
Die Vektoren der Erfindung können weiterhin funktionelle Einheiten besitzen, welche die Stabilisierung des Vektors im Wirtsorganismus bewirkt, wie ein bakterieller Replikationsursprung oder die 2-μ-DNA zum Zweck der Stabilisierung in Saccharomyces cerevisiae. Darüber hinaus können „linker Rand-" und „rechter Rand-"Sequenzen von agrobakterieller T-DNA enthalten sein, wodurch ein stabiler Einbau in das Genom von Pflanzen möglich gemacht wird.
Darüber hinaus können die Vektoren der Erfindung funktionelle Terminatoren enthalten, wie den Terminator des Octopin-Synthasegens von Agrobakterien.
In einer anderen Ausführungsform ist das Nucleinsäuremolekül der Erfindung mit dem Vektor der Erfindung durch ein Nucleinsäuremolekül verbunden, welches eine funktionelle Signalsequenz codiert, um das Enzym zu verschiedenen Zellkompartimenten zu transportieren. Diese Modifikation kann zum Beispiel die Hinzufügung einer N-terminalen Signalsequenz zur Sekretion in den Zellmembran-Zwischenraum von höheren Pflanzen sein, aber auch eine andere Modifikation, welche zur Fusion einer Signalsequenz mit der codierten Fructosyltransferase führt, kann der Gegenstand der Erfindung sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf das Plasmid pB33-cySST, dessen Konstruktion in den Beispielen beschrieben ist (1).
Die Expression der Nucleinsäuremoleküle der Erfindung in prokaryontischen Zellen, zum Beispiel in Escherichia coli, ist interessant, weil auf diesem Weg eine nähere Charakterisierung der Enzymaktivitäten der Enzyme, welche diese Moleküle codieren, möglich ist.
In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Wirtszellen, welche vorübergehend oder beständig die Nucleinsäuremoleküle oder die Vektoren der Erfindung enthalten. Eine Wirtszelle wird als ein Organismus verstanden, der in der Lage ist, in vitro rekombinante DNA aufzunehmen und, gegebenenfalls die Proteine zu synthetisieren, welche durch die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung codiert werden.
Vorzugsweise sind diese Zellen prokaryontische oder eukaryontische Zellen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Pflanzenzellen, welche die Vektorsysteme der Erfindung oder Derivate oder Teile davon enthalten. Vorzugsweise sind sie in der Lage, Enzyme für die Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren zu synthetisieren auf Grund der Tatsache, dass sie die Vektorsysteme der Erfindung, Derivate oder Teile davon eingenommen haben. Die Zellen der Erfindung werden vorzugsweise durch die Tatsache charakterisiert, dass das eingeführte Nucleinsäuremolekül der Erfindung entweder heterolog ist in Bezug auf die transformierte Zelle, d.h. das es nicht natürlich in diesen Zellen vorkommt, oder an einem Platz im Genom lokalisiert ist, der unterschiedlich ist von dem der entsprechenden natürlich vorkommenden Sequenz.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf Proteine, welche durch Nucleinsäuremoleküle der Erfindung codiert werden, sowie auf Verfahren zu ihrer Herstellung, wobei eine Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen gezüchtet wird, welche die Synthese des Proteins erlauben, und das Protein anschließend aus den gezüchteten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird. Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf die SSTs, welche mit den Pflanzen der Erfindung hergestellt werden können.
Durch Bereitstellung von Nucleinsäuremolekülen der Erfindung ist es nun möglich, kurzkettige Fructosylpolymere in beliebigen Organismen mit Hilfe von Gentechnik herzustellen, während es bis jetzt nicht möglich gewesen war, Pflanzen durch konventionelle Verfahren zu modifizieren, zum Beispiel durch Züchtungsverfahren, so dass sie in der Lage sind, Fructosylpolymere zu synthetisieren. Durch Steigerung der Aktivität der Proteine der Erfindung, zum Beispiel durch Überexpression von passenden Nucleinsäuremolekülen oder durch Bereitstellung von Mutanten, welche nicht länger den zellspezifischen Regulationsmechanismen unterliegen und/oder welche hinsichtlich ihrer Aktivität geänderte Temperaturabhängigkeiten haben, ist es möglich, die Ausbeute an modifizierten Pflanzen durch Gentechnik zu steigern.
Daher ist die Expression von Nucleinsäuremolekülen der Erfindung in Pflanzenzellen, um die Aktivität der entsprechenden SST zu steigern oder die Einführung in die Zellen, welche normalerweise dieses Enzym nicht exprimieren, nun möglich. Darüber hinaus ist es möglich, die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung nach den Verfahren zu modifizieren, welche einem Fachmann bekannt sind, um SSTs der Erfindung zu erhalten, welche nicht länger den zellspezifischen Regulationsmechanismen unterliegen oder welche modifizierte Temperaturabhängigkeiten oder Substrat- oder Produktspezifitäten haben.
Wenn die Nucleinsäuremoleküle in Pflanzen exprimiert werden, kann das synthetisierte Protein in einem beliebigen Kompartiment der Pflanzenzelle lokalisiert sein. Um die Lokalisation in einem spezifischen Kompartiment zu erreichen, muss die Sequenz, welche die Lokalisation in der Vakuole gewährleistet, deletiert werden und, falls notwendig, muss die verbleibende codierende Region mit DNA-Sequenzen verbunden werden, welche die Lokalisation in dem spezifischen Kompartiment gewährleisten. Solche Sequenzen sind bekannt (s. z.B. Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf transgene Pflanzenzellen, welche mit einem oder mehreren Nucleotidmolekül(en) der Erfindung transformiert wurden, sowie auf transgene Pflanzenzellen, welche von solchen transformierten Zellen stammen. Solche Zellen enthalten ein oder mehrere Nucleinsäuremolekül(e) der Erfindung, welche(s) vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Elementen verbunden ist/sind, welche die Transkription in Pflanzenzellen, insbesondere mit einem Promotor, gewährleisten. Solche Pflanzen können von natürlich vorkommenden Pflanzenzellen durch die Tatsache unterschieden werden, dass sie mindestens ein Nucleinsäuremolekül gemäß der Erfindung enthalten, welches nicht natürlich in diesen Zellen vorkommt, oder durch die Tatsache, dass solch ein Molekül in das Genom der Zelle eingebaut wird, wo es nicht natürlich vorkommt, d.h. in einer anderen genomischen Region.
Die transgenen Pflanzenzellen können zu gesamten Pflanzen regeneriert werden unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Pflanzen, welche durch Regeneration der transgenen Pflanzenzellen der Erfindung erhältlich sind. Darüber hinaus bezieht sich der Gegenstand der Erfindung auf Pflanzen, welche die vorstehend beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Die transgenen Pflanzen können grundsätzlich Pflanzen von einer beliebigen Pflanzenart sein, d.h. sowohl einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen. Vorzugsweise sind sie Anbaupflanzen, insbesondere Pflanzen, welche Stärke synthetisieren und/oder speichern, wie Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrüben, Zuckerrohr oder Kartoffel. Besonders bevorzugt sind Saccharose speichernde Pflanzen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der Pflanzen der Erfindung, zum Beispiel auf Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Setzlinge, Sämlinge usw.
Die transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen der Erfindung synthetisieren kurzkettige Fructosylpolymere auf Grund der Expression oder zusätzlichen Expression von mindestens einem Nucleinsäuremolekül der Erfindung.
Der Gegenstand der Erfindung bezieht sich daher auch auf kurzkettige Fructosylpolymere, welche aus transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen der Erfindung sowie aus Vermehrungsmaterial und Ernteprodukten erhältlich sind.
Die transgenen Pflanzenzellen der Erfindung können nach dem Fachmann bekannten Verfahren zu gesamten Pflanzen regeneriert werden. Daher bezieht sich der Gegenstand der Erfindung auch auf Pflanzen, welche die transgenen Pflanzenzellen der Erfindung enthalten. Diese Pflanzen sind vorzugsweise Anbaupflanzen, insbesondere Pflanzen, welche Saccharose und/oder Stärke synthetisieren und/oder speichern. Besonders bevorzugt ist die Kartoffel. Die Erfindung bezieht sich auch auf Vermehrungsmaterial der Pflanzen der Erfindung, insbesondere auf Knollen.
Um die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung in Sense- oder Antisense-Ausrichtung in Pflanzenzellen zu exprimieren, werden sie mit regulatorischen DNA-Elementen verbunden, welche die Transkription in Pflanzenzellen gewährleisten. Diese sind besonders Promotoren. Grundsätzlich ist ein in Pflanzenzellen aktiver Promotor passend für die Expression.
Der Promotor kann so ausgewählt werden, dass die Expression konstitutiv oder nur in einem bestimmten Gewebe, bei einem bestimmten Stadium der Pflanzenentwicklung oder bei einem Zeitpunkt, der durch äußerliche Reize bestimmt wird, abläuft. Im Hinblick auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Passende Promotoren sind zum Beispiel der Promotor der 35S-RNA des Blumenkohl-Mosaikvirus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, besonders bevorzugt der Patatin-Gen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) für eine Knollen-spezifische Expression in der Kartoffel oder ein Promotor, welcher nur die Expression in photosynthetisch aktivem Gewebe gewährleistet, zum Beispiel der ST-LS1-Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al. EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) oder für eine Endosperm-spezifische Expression die HMG-Promotoren aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolin-Promotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais.
Darüber hinaus kann es eine Terminationssequenz geben, welche der korrekten Termination der Transkription sowie einer Hinzufügung eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript dient, für den angenommen wird, dass er eine Funktion zur Stabilisierung des Transkripts hat. Solche Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und können beliebig ausgetauscht werden.
Um die Einführung von fremden Genen in höhere Pflanzen durchzuführen, ist eine große Anzahl von Clonierungsvektoren erhältlich, welche ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Auswahl der transformierten Bakterienzellen enthalten. Beispiele solcher Vektoren sind pBR322, die pUC-Serie, die M13mp-Serie, pACYC184 usw. Die gewünschten Sequenz kann in den Vektor bei einer passenden Spaltstelle eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid ist passend für die Transformation von E.coli-Zellen. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem passenden Medium kultiviert, dann geerntet und lysiert. Das Plasmid wird regeneriert. Gewöhnlich werden Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und andere biochemische oder molekularbiologische Verfahren als Analyseverfahren zur Charakterisierung der regenerierten Plasmid-DNA verwendet. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten werden und die regenerierten DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verbunden werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in die gleichen oder in andere Plasmide kloniert werden.
Zur Einführung von DNA in die Wirtszelle einer Pflanze sind eine große Anzahl von Verfahren erhältlich. Diese Verfahren umfassen die Transformation von Pflanzenzellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Mittel zur Transformation, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, der Elektroporation von DNA, die Einführung von DNA mit Hilfe der biolistischen Verfahren sowie weiteren Möglichkeiten.
Für die Injektion und die Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen gibt es keine spezifischen Anforderungen für die verwendeten Plasmide. Einfache Plasmide wie pUC-Derivate können verwendet werden. Wenn die gesamten Pflanzen aus solchen transformierten Zellen regeneriert werden müssen, sollte es einen auswählbaren Marker geben.
Abhängig von dem Verfahren zur Einführung der gewünschten Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen notwendig sein. Wenn zum Beispiel das Ti- oder Ri-Plasmid zur Transformation der Pflanzenzelle verwendet wird, müssen mindestens der rechte Rand, oft jedoch der rechte und linke Rand der T-DNA des Ti- und des Ri-Plasmids als flankierende Region mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Wenn Agrobakterien für die Transformation verwendet werden, muss die einzuführende DNA in spezifische Plasmide cloniert werden, entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien auf Grund von Sequenzen, welche homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination eingebaut werden. Das Ti- oder Ri-Plasmid enthält darüber hinaus die für die Übertragung der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können in Agrobakterien nicht replizieren. Mit Hilfe eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor in Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welcher durch die rechte und linke T-DNA-Randregion umrahmt ist. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das Agrobakterium, welches als Wirtszelle dient, sollte ein Plasmid enthalten, welches eine vir-Region trägt. Die vir-Region ist für die Übertragung der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Es kann zusätzliche T-DNA geben. Das so transformierte Agrobakterium wird für die Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen wurde weitgehend untersucht und beschrieben in EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Kapitel V, Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287.
Für die Übertragung der DNA in Pflanzenzellen können Pflanzen-Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobakterium rhizogenes cokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Stücke vom Blatt, Stammabschnitte, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder durch Suspension kultivierte Pflanzenzellen) können gesamte Pflanzen in einem passenden Medium regeneriert werden, welches Antibiotika oder Biozide für die Auswahl der transformierten Zellen enthalten kann. Die auf diesem Weg erhaltenen Pflanzen können auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten zur Einführung fremder DNA unter Verwendung biolistischer Verfahren oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In : Biotechnology, A Multi-Volume comprehensive Treatise (Hrsg. H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler), Band 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).
Alternative Systeme zur Transformation von einkeimblättrigen Pflanzen sind die Transformation mit Hilfe der biolistischen Herangehensweise, die elektrisch oder chemisch induzierte Einführung von DNA in Protoplasten, die Elektroporation von teilweise permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blüten, die Mikroinjektion von DNA in Mikrosporen und Proembryonen, die Einführung von DNA in keimende Pollen und die Einführung von DNA in Embryonen durch Aufquellen (als Übersicht: Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269-273).
Während die Transformation von zweikeimblättrigen Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektor-Systeme mit der Hilfe von Agrobakterium tumefaciens gut etabliert ist, zeigen jüngere Forschungsarbeiten, dass auch einkeimblättrige Pflanzen für die Transformation mit Hilfe von Vektoren auf der Grundlage von Agrobakterium zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1983), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould et al., Plant Physiol. 95 (1991), 426-434; Mooney et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991), 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).
Drei der voranstehend erwähnten Transformationssysteme konnten für verschiedenes Getreide etabliert werden: die Elektroporation von Geweben, die Transformation von Protoplasten und die DNA-Übertragung durch Teilchenbeschuss in regenerativem Gewebe und Zellen (als Übersicht: Jähne et al., Euphytica 85 (1995), 35-44).
Die Transformation von Weizen wurde häufig in der Literatur beschrieben (als Übersicht: Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).
Die Erfindung bezieht sich auch auf Pflanzen, welche mindestens eine, vorzugsweise eine Anzahl von Zellen enthalten, welche die Vektorsysteme der Erfindung oder Derivate oder Teile davon enthalten und welche in der Lage sind, Enzyme zur Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren auf Grund der Einführung der Vektorsysteme, Derivate oder Teile der Vektorsysteme der Erfindung zu synthetisieren. Die Erfindung stellt auch Pflanzen von vielen Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen bereit, welche in der Lage sind, Enzyme zur Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren auf Grund der eingeführten Vektorsysteme oder Derivate oder Teile davon zu synthetisieren. Da die bekannten Pflanzen nicht in der Lage sind, nur kurzkettige Fructosylpolymere herzustellen, ist es leicht zu prüfen, ob das Verfahren erfolgreich durchgeführt wurde, zum Beispiel durch chromatographische Analyse der Fructose enthaltenden Zucker. Sie sind vorteilhaft im Vergleich zu den wenigen Pflanzen, welche Fructosylpolymere enthalten, da es eine definierte molekulare Größe gibt, d.h. die Größe des kurzkettigen Fructosy-Polymers. Darüber hinaus ist eine Lokalisierung in den verschiedenen Zellkompartimenten und verschiedenen Organen sowie eine Steigerung des Expressionanteils und daher der Ausbeute möglich.
In einer anderen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Herstellung von kurzkettigen Fructosylpolymeren, umfassend:

(a) Inkontaktbringen von Saccharose oder einem äquivalenten Substrat mit einer SST der Erfindung unter Bedingungen, welche die Umwandlung zu kurzkettigen Fructosylpolymeren erlauben; und
(b) Erhalten der auf diesem Weg hergestellten Fructosylpolymere.

Die Beschaffenheit der hergestellten Fructosylpolymere hängt von der enzymatischen Spezifität der Fructosyltransferase ab. Wenn eine SST der Erfindung verwendet wird, werden vorzugsweise Kestose, aber auch Nystose und Fructosylnystose hergestellt.
Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf die Fructosylpolymere, welche aus einer Pflanzenzelle oder Pflanze der Erfindung oder aus dem Vermehrungsmaterial oder den Ernteprodukten von Pflanzen oder Pflanzenzellen der Erfindung hergestellt werden oder nach dem voranstehend beschriebenem Verfahren der Erfindung erhalten werden. Diese Fructosylpolymere können vorzugsweise zur Herstellung von Nahrungsmitteln wie Backwaren oder Teigwaren verwendet werden. Vorzugsweise können diese Fructosylpolymere zur Steigerung der Viskosität in wässrigen Systemen verwendet werden, als Detergenzien, als Suspensionsmittel oder zur Beschleunigung des Sedimentationsprozesses und Komplexierung, aber auch zur Bindung von Wasser.

1 zeigt den Aufbau des Plasmids pB33-cySST.

Vektor:	pBin33 (Derivat von pBin19; Bevan, 1984,
	Nucl Acid Res 12: 8711)
Promotor:	B33-Promotor (Rocha-Sosa et al., 1989,
	EMBO J 8: 23-29)
Donor:	Solanum tuberosum
Codierende Region:	SST-Gen aus Cynars scolymus
Ausrichtung:	Sense
Terminator:	Polyadenylierungssignal des Octopin-,
	Synthase-Gens vom Plasmid pTiACH5 von
	A. tumefaciens (Gielen et al., 1984, EMBO J
	3: 835-846)
Donator:	Agrobacterium tumefaciens
Resistenz:	Kanamycin

2 zeigt die Analyse der löslichen Zucker in den Knollen von transgenen Pflanzen, welche unter Verwendung des Vektorsystems pB33-cySTT hergestellt wurden. Die kurzkettigen Fructosylpolymere (insbesondere 1-Kestose), welche auf Grund der genetischen Modifikation hergestellt wurden, wurden markiert.
3 zeigt die Analyse der löslichen Zucker in transgenen Pflanzen, welche jeweils unter Verwendung des Vektorsystems pB33-cySST und p35S-cySST hergestellt wurden, verglichen mit Wildtyp-Pflanzen.
Beispiel 1: Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung einer cDNA, welche eine Saccharose-abhängige Saccharose-Fructosyltransferase aus Artischocke (Cynare scolymus) codiert
Gesamt-RNA wurde aus den Blütentellern der Artischocke isoliert (Sambrook et al., s. oben). Poly(A)⁺-mRNA wurde unter Verwendung des mRNA-Isolierungssystems PolyATtract (Promega Corporation, Madison, WI, USA) isoliert. Komplementäre DNA (cDNA) wurde aus 5 μg dieser RNA mit Hilfe des ZAp-cDNA-Synthesekits von Stratagene nach den Anleitungen des Herstellers hergestellt. 2 × 10⁶ eigenständige rekombinante Phagen wurden erhalten. Die Bibliothek der amplifizierten cDNA wurde durch konventionelle Verfahren mit einem DNA-Fragment gescreent, welches mit ³²P markiert war und welches dem 3'-Endstück der 6-SFT-cDNA entsprach (Sprenger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 11652), welches eine Länge von 392 bp hatte. Dieses Fragment wurde aus der vollständigen RNA durch RT-PCR (RT-PCR-Kit, Stratagene, Heidelberg, Deutschland) als Matrix von Licht-induzierten (72 Stunden) Primärblättern aus der Gerste erhalten. Positive Clone wurden weiter untersucht.
Beispiel 2: Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pCy21
Die Plasmid-DNA wurde aus dem Clon pCy21 isoliert. Die Sequenz der cDNA-Insertion wurde durch konventionelle Verfahren mit Hilfe des Didesoxynucleotid-Verfahrens (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt.
Die Insertion des Clons pCy21 ist eine DNA von 2055 bp. Die Nucleotidsequenz ist in Seq ID NO: 1 dargestellt. Die entsprechende Aminosäuresequenz ist in Seq ID NO: 2 dargestellt.
Eine Sequenzanalyse und ein Vergleich mit bereits publizierten Sequenzen zeigte, dass die in Seq ID NO: 1 dargestellte Sequenz neu ist und eine codierende Region umfasst, welche Homologien mit SSTs von anderen Organismen zeigt.
Beispiel 3: Herstellung des Plasmids pB33-cySST und Einführung des Plasmids in das Genom der Kartoffel
Das Plasmid pB33-cySST enthält drei Fragmente A, B und C in dem binären Vektor pBin19 (Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711, modifiziert nach Becker, 1990, Nucl Acids Res 18: 203) (vgl. 1). Das Fragment A enthält den B33-Promotor des Patatin-Gens b33 der Kartoffel. Es enthält ein Dral-Fragment (Position .-1512 bis Position +14) des Patatin-Gens B33 (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J 8:23-29), welches zwischen der EcoRI- und der SacI-Spaltstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg insertiert ist. Das Fragment B enthält die codierende Region der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz. Das Fragment B wurde als NotI-Fragment mit glatten Enden aus dem Vektor pBluescript SK erhalten, in dem es in die EcoRI-Spaltstelle über eine EcoRI/Not I-Linker-Sequenz insertiert ist. Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal von Gen 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTi ACH 5 (Gielen et al (1984); EMBO J. 3, 835-846), Nucleotide 11749-11939, welches als Pvu II-Hind III-Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al (1983) Nature 303, 209-213) isoliert wurde und zwischen der SphI und der Hind III-Spaltstelle des Polylinkers von pBin19-Hyg nach der Hinzufügung von SphI-Linkern an die Pvu II-Spaltstelle cloniert wurde. Das Plasmid pB33-cySST hat eine Größe von ca. 14 kb. Das Plasmid wurde in Agrobakterien eingeführt (Höfgen und Willmitzer, Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877).
Das Plasmid pB33-cySST wurde in Kartoffelpflanzen über die durch Agrobacterium induzierte Genübertragung nach den voranstehend beschriebenen konventionellen Verfahren eingeführt. Intakte Pflanzen wurden aus transformierten Zellen regeneriert. Aus regenerierten Pflanzen wurden Enzymextrakte erhalten und auf die Anwesenheit von Fructosylpolymeren untersucht. Die Analyse wurde ausgeführt, wie beschrieben in Röber (Planta 199, 528-536). Die Analyse der Knollen einer Anzahl von transformierten Pflanzen, welche mit diesem Vektor transformiert wurden, zeigten deutlich die Anwesenheit von kurzkettigen Fructosylpolymeren, insbesondere 1-Kestose, welche der Expression des SST-Gens der Erfindung zugeschrieben werden kann (vgl. 2).
Beispiel 4: Analyse von löslichem Zucker in Wildtyp-Pflanzen und in SST enthaltenden transgenen Pflanzen
Transgene Pflanzen, welche die Vektoren pB33-cySST und 35S-cySST enthalten (welche die codierende Region von SEQ ID NO: 1 unter der Kontrolle des 35S-Promotors haben) wurden erzeugt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Extrakte wurde aus transgenen Pflanzen und Wildtyp-Pflanzen erhalten und auf die Anwesenheit von Fructosylpolymeren untersucht; s. Beispiel 3. Die in 3 gezeigte HPAEC-Analyse zeigte die Herstellung von Oligofructanen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1, nachstehend, zusammengefasst. Tabelle 1 Lösliche Zucker (Saccharose und Oligofructane) in Wildtyp- und transgenen Pflanzen.

Werte in g Kohlenhydrat pro kg Frischgewicht

Wie aus 3 und Tabelle 1, oben, erwiesen ist, übersteigt der Gehalt an Fructosylpolymeren, insbesondere an 1-Kestose, den Gehalt an Saccharose. Demnach zeigen die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente die Brauchbarkeit der Nucleinsäuremoleküle der Erfindung zur Herstellung von Fructosylpolymeren in transgenen Pflanzen.
SEQUENZLISTUNG

Claims

Nucleinsäuremolekül, welches eine Saccharose-abhängige Saccharose-Fructosyltransferase (SST) codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nucleinsäuremolekülen, welche ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 umfasst; (b) Nucleinsäuremolekülen, umfassend die Nucleotidsequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder eine entsprechende Ribonucleotidsequenz; (c) Nucleinsäuremolekülen, umfassend die Nucleotidsequenz dargestellt in SEQ ID NO: 3 oder eine entsprechende Ribonucleotidsequenz; und (d) Nucleinsäuremolekülen, enthaltend ein Fragment der in (a) bis (c) genannten Nucleinsäuremoleküle, welche ein Protein codieren, das in der Lage ist, die Verknüpfung von β-2,1-glycosidischen oder β-2,6-glycosidischen Bindungen zwischen Fructoseeinheiten zu katalysieren.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches ein DNA-Molekül ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 2, welches ein cDNA-Molekül ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches ein RNA-Molekül ist.
Vektor, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Vektor nach Anspruch 5, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell mit regulatorischen Elementen verbunden ist, welche die Transkription und die Synthese einer translatierbaren RNA in prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zellen erlauben.
Vektor nach Anspruch 6, wobei die regulatorischen Elemente vom Patatin-B33-Promotor abgeleitet sind.
Wirtszelle, umfassend das heterologe Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einen Vektor nach Anspruch 6 oder 7.
Verfahren zur Herstellung der SST, welche durch das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 codiert wird, wobei die Wirtszelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen kultiviert wird, welche die Synthese der SST erlauben, und wobei die SST aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.
SST, welche durch das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, oder gemäß dem Verfahren nach Anspruch 9 erhältlich ist.
Transgene Pflanze, umfassend das heterologe Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einen Vektor nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Nucleinsäuremolekül, welches die SST aus Cynara scolymus codiert, durch regulatorische Elemente kontrolliert wird, welche die Transkription einer translatierbaren mRNA in Pflanzenzellen erlauben.
Pflanze, enthaltend die Pflanzenzellen nach Anspruch 11.
Pflanze nach Anspruch 12, welche Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr oder Kartoffel ist.
Pflanze nach Anspruch 13, welche eine Kartoffelpflanze ist.
Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach einem der Ansprüche 12 bis 14, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 11.
Ernteprodukte einer Pflanze nach einem der Ansprüche 12 bis 14, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 11, wobei die Ernteprodukte ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Früchten, Samen, Knollen, Wurzelstöcken, Setzlingen und Sämlingen.
Verfahren zur Herstellung von 1-Kestose, Nystose, und/oder Fructosylnystose, umfassend: (a) Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 8 oder einer Pflanzenzelle nach Anspruch 11 unter Bedingungen, welche die Herstellung der SST, welche durch das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 codiert wird, und die Umwandlung, falls erforderlich, von außen hinzugefügter Saccharose zu 1-Kestose, Nystose, und/oder Fructosylnystose erlauben; und (b) Erhalten von auf diesem Wege hergestellter 1-Kestose, Nystose, und/oder Fructosylnystose aus den kultivierten Zellen oder aus dem Medium.
Verfahren zur Herstellung von 1-Kestose, Nystose, und/oder Fructosylnystose, umfassend: (a) Inkontaktbringen von Saccharose mit der SST nach Anspruch 10 unter Bedingungen, welche die Umwandlung von 1-Kestose, Nystose, und/oder Fructosylnystose erlauben; und (b) Erhalten der so hergestellten 1-Kestose, Nystose, und/oder Fructosylnystose.
Verfahren zur Herstellung von 1-Kestose, Nystose, und/oder Fructosylnystose, umfassend: (a) Kultivieren einer Pflanze nach einem der Ansprüche 12 bis 14; und (b) Erhalten von 1-Kestose, Nystose, und/oder Fructosylnystose aus diesen Pflanzen oder ihrem Vermehrungsmaterial nach Anspruch 15 oder den Ernteprodukten nach Anspruch 16.