DE60017781T2

DE60017781T2 - Modulation der antwort einer pflanze auf abscisin säure

Info

Publication number: DE60017781T2
Application number: DE60017781T
Authority: DE
Inventors: Tim Helentjaris
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1999-11-17
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2020-11-18
Also published as: ATE287964T1; DE60017781D1; US20040148654A1; HUP0204207A2; HU225785B1; HUP0204207A3; CA2391879A1; EP1230377B1; AU779111B2; WO2001036596A2; WO2001036596A3; PT1230377E; MXPA02004932A; US8115052B2; ES2236005T3; AU1777501A; EP1230377A2; CA2391879C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zur genetischen Modifikation von Pflanzen, insbesondere zur Modulation der Pflanzenreaktion auf Abscisinsäure, aufgezeichnet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Abscisinsäure (ABA, "Abscisic acid") ist ein Phytohormon, das eine essentielle regulatorische Rolle bei einer Vielfalt physiologischer Prozesse spielt. Das Phytohormon ist an der Embryonalentwicklung, Samenruhe, Transpiration und Anpassung an Umgebungsstressarten beteiligt. ABA reguliert viele agronomisch wichtige Aspekte der Pflanzenentwicklung, einschließlich Synthese von Samenspeicherproteinen und -lipiden sowie das Regulieren des Schließens der Stomata. Die Analyse von auf ABA reagierenden Promotoren hat eine Vielfalt potentieller cis-agierender ("cis-acting") regulatorischer Elemente enthüllt.
Mutationen bei der ABA-Biosynthese sind in einer Vielzahl von Pflanzenarten bekannt. Siehe beispielsweise Leung und Giraudat (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:199–222, und die darin zitierten Referenzen. In Arabidopsis ist eine Anzahl genetisch verschiedener Säure-insensitiver Arabidopsis-Loci identifiziert worden. Diese Mutanten wurden, basierend auf der Fähigkeit der Samen, in Anwesenheit inhibitorischer Konzentrationen von ABA zu keimen, selektiert. Von den Mutationen wurde gezeigt, dass sie verschiedene zusätzliche Aspekte der Samenentwicklung, einschließlich Akkumulation von Speicherproteinen und -lipiden, Chlorophyllabbau und Desikkationstoleranz beeinflussen.
Bis heute sind zahlreiche Mutanten und Gene in Pflanzen charakterisiert worden. Fünf durch Mutation identifizierte ABA-Reaktionsloci sind kloniert worden. Diese stellen drei Proteinklassen dar. Die Klassen schließen zwei orthologe transkriptionelle Regulatoren (Viviparl-Vpl, "Viviparous1") von Mais und ABA-insensitiv 3 ("ABA-insensitive 3") von Arabidopsis (ABI3), zwei hochhomologe Mitglieder der Proteinphosphatase 2C-Familie und eine Farnesyltransferase aus Arabidopsis ein. Siehe beispielsweise McCarty et al. (1991) Cell 66:895–905; Giraudat et al. (1992) Plant Cell 4:1251–1261; Leung et al. (1994) Science 264:1448–1452; Leung et al. (1997) Plant Cell 9:759–771; und Cuither et al. (1996) Science 273:1239–1241.
Während der Reifungsphase der Samenentwicklung wird der Embryo in Geweben quieszent, die dafür bestimmt sind, lebensfähig zu bleiben, und der trockene Samen erwirbt Toleranz gegen Desikkation. In Mais und anderen Gräsern schließt dies Zellen in der Aleuronschicht des Samenendosperm ein. Die viviparen Mutanten aus Mais sind in ihrem Reifungsprogramm blockiert. Folglich rückt der Mutant der Embryo frühreif in die Keimlingsentwicklung vor, während er an der Mutterpflanze anheftet. Die neun charakterisierten Viviparloci beeinflussen frühe Stufen bei der Biosynthese von Carotinoiden und Abscisinsäure. vp1-Embryos weisen in Kultur reduzierte Sensitivität gegen ABA auf. Es ist vorgeschlagen worden, dass das Anfangs-vp1 möglicherweise für einen Faktor codiert, der an der ABA-Perzeption beteiligt ist.
Auf molekularem Level ist embryonale Reifung mit einem weiten Umfang an Genaktivierung assoziiert. Viele der exprimierten Gene sind durch das Hormon ABA reguliert. Allerdings sind die molekularen Mechanismen von ABA-Wirkung größtenteils unbekannt.
ABA-vermittelte Wachstumskontrolle ist eine fundamentale Reaktion von Pflanzen auf nachteilige Umgebungsbedingungen. Weil wenig über den molekularen Mechanismus ABA-vermittelter Wachstumskontrolle bekannt ist, sind Verfahren erforderlich, um die Reaktion von Pflanzen auf ABA zu modulieren, insbesondere um die Ausbeute zu steigern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Erhöhen des Ertrags bei Pflanzen, insbesondere Samenpflanzen, bereitgestellt. Die Verfahren beinhalten Modulieren von Abscisinsäure (ABA)-Perzeption und Signaltransduktion in sich entwickelnden Samen. Die Verfahren sind zum Schützen von Pflanzen gegen die schädlichen/nachteiligen Wirkungen von Stress und widrigen Umgebungsbedingungen verwendbar. Die Zusammensetzungen umfassen genetische Konstrukte, von denen bekannt ist, dass sie die ABA-Sensitivität in einer Pflanze oder Pflanzenzelle beeinflussen. Von besonderem Interesse sind ABA-assoziierte Sequenzen. Derartige Sequenzen schließen Mutanten, Fragmente und Varianten davon sowie Antisens-Nucleotidsequenzen für Gene und Mutanten, die bei der Perzeption und Signaltransduktion von ABA beteiligt sind, ein. Die DNA-Sequenzen können als Konstrukte für temporale, Entwicklungs- und Gewebespezifität bereitgestellt sein.
Die Zusammensetzungen sind bei Verfahren zum Erhöhen des Ertrags bei Pflanzen unter Stress, insbesondere abiotischem Stress, verwendbar. Auf diese Weise werden die nachteiligen Wirkungen von ABA auf Ähren- und Kernwachstum ablatiert.
Transformierte Pflanzen, Pflanzenzellen, Gewebe und Samen werden zusätzlich bereitgestellt.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Modulation einer Reaktion auf Abscisinsäure (ABA) während der Samentwicklung, Endospermentwicklung oder Samenreifung in einer Pflanze bereitgestellt, wobei das genannte Verfahren umfasst: Einbringen eines DNA-Konstrukts, umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, in die Pflanze durch Transformation, wobei genannter Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der Sequenz, die bei der Perzeption und Signaltransduktion von ABA beteiligt ist, ist.
Die Erfindung stellt außerdem bereit:
– ein Verfahren zum Verhindern nachteiliger Auswirkungen von Stress auf einen sich entwickelnden Pflanzensamen, einen reifenden Pflanzensamen oder ein sich entwickelndes Endosperm, wobei genanntes Verfahren umfasst: Einbringen eines DNA-Konstrukts, umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, in eine Pflanze durch Transformation, wobei der frühe Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der verknüpften Sequenz ist;
– eine Pflanze mit einem stabil eingebrachten DNA-Konstrukt, umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, wobei genannter früher Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist;
eine Pflanzenzelle mit einem stabil eingebrachten DNA-Konstrukt, umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, wobei genannter früher Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist;
– ein Verfahren zum Verhindern nachteiliger Auswirkungen von Stress auf einen sich entwickelnden Pflanzensamen, einen reifenden Pflanzensamen oder ein sich entwickelndes Endosperm, genanntes Verfahren umfassend: Einbringen eines DNA-Konstrukts, umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem späten Kern/Embryo-Promotor, in eine Pflanze, wobei die Pflanze eine Funktionsverlustmutation für die genannte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, aufweist, wobei genannter später Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist;
– eine Pflanze mit einem stabil eingebrachten DNA-Konstrukt, umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem späten Kern/Embryo-Promotor, wobei genannter später Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist;
– eine Pflanzenzelle mit einem stabil eingebrachten DNA-Konstrukt, umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem späten Kern/Embryo-Promotor, wobei der genannte späte Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist;
– den transformierten Samen einer erfindungsgemäßen Pflanze; und
– die transformierten Abkömmlinge einer erfindungsgemäßen Pflanze.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Verfahren zum Modulieren einer frühen Pflanzenreaktion auf Abscisinsäure (ABA) werden bereitgestellt, insbesondere, um den Nutzpflanzenertrag durch Ablatieren der nachteiligen Auswirkungen von ABA auf die Samenentwicklung zu isolieren. Insbesondere stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Unterbrechen von ABA-Signalisieren oder -Funktion bereit. Die Zusammensetzungen und Verfahren sind zum Unterbrechen von ABA-Funktion in einem Gewebe und auf entwicklungsbevorzugte Weise verwendbar, um weibliches Reproduktionsgewebewachstum von Stress- und widrigen Umgebungsbedingungen zu isolieren.
Für Zwecke der Erfindung ist mit "frühe Pflanzenreaktion" die Entwicklung eines reproduktiven Gewebes, Samenentwicklung, Endospermentwicklung und Samenreifung gemeint. ABA ist an vielen anderen physiologischen Prozessen und Entwicklungsprozessen durch den Lebenszyklus von Pflanzen, einschließlich Samenruhe, Adaptation an abiotische Umgebungsstressarten, wie z.B. Kälte, Dürre, Salzigkeit, etc., Akkumulation von Nährstoffreserven, Erwerb von Desikkationstoleranz, Stomataschließung und dergleichen, beteiligt. In den frühen Phasen reguliert das Phytohormon ABA Samenreifung und die Aufrechterhaltung von Embryoruhe. Später und beim Beginn der Ontogenese vermittelt ABA verschiedene Adaptionsreaktionen auf Umgebungsreize, wie z.B. Desikkation, Kälte, Salzstress oder andere Stressarten, und wirkt als ein negativer Wachstumsregulator. Allgemeiner zwingt ABA eine bimodale Wachstumskontrolle durch Regulieren des Potentials der Zelle, sich möglicherweise durch Turgorkontrolle zu vergrößern und entsprechend ihrer Rolle als negativer Wachstumsregulator durch Induzieren von mitotischem Wachstumsarrest.
Die Erfindung bezieht die Kontrolle oder Modulation der frühen Reaktion der Pflanze auf das Signalisieren von ABA ein. Durch "Modulation" ist die Hochregulation oder Herabregulation der Pflanzenreaktion auf ABA gemeint. Für Zwecke der Erfindung ist Modulation im Allgemeinen Herabregulation durch die Unterbrechung von ABA-Synthese oder die Unterbrechung der Perzeption und Signaltransduktion von ABA. Es wird erkannt, dass die gesamte Unterbrechung der ABA-Funktion in Pflanzen nicht praktikabel ist, weil ABA viele nützliche Rollen bei der Pflanzenentwicklung spielt. Für Zwecke der Erfindung ist es im Allgemeinen bevorzugt, die Wirkungen von ABA an der Stelle der eventuellen Wirkung, d.h. Ähren und Kerne von Getreidenutzpflanzen, zu unterbrechen. Auf diese Weise stellt das Unterbrechen von ABA-Perzeption oder dessen Signaltransduktion eine wirksame Strategie beim Isolieren weiblichen reproduktiven Getreidegewebswachstums von Stress bereit.
Umgebungsstressarten, die auf die Befruchtung folgen, inhibieren frühe Ereignisse beim Aufbau einer Assimilatspeicherkapazität und können die Ausbeute verringern. In Getreiden beispielsweise ist das Endosperm die Hauptquelle gespeicherter Reserven innerhalb des reifen Samens. Die Speicherkapazität wird während eines frühen Stadiums der Samenentwicklung etabliert. Erkennend die Beteiligung von ABA an frühen Pflanzenreaktionen auf Stress, ist die vorliegende Erfindung abgefasst, um die nachteiligen Auswirkungen von ABA auf den sich entwickelnden Samen zu ablatieren und die Art und Menge von Samen und Samenprodukten, insbesondere Getreiden und Körnern, zu verbessern. Siehe Mambelli und Setter (1998) Physiologia Plantarum 104:266–72 und Tuberosa et al. (1998) Theor. Appl. Genet 744–55.
Wie angezeigt, umfasst die Erfindung das Einbringen von Sequenzen, die ABA-Perzeption und -Signaltransduktion modulieren, in eine Zielpflanze. Mit "Sequenzen, die ABA-Perzeption und -Signaltransduktion modulieren" und "Sequenzen, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA" sind Mutanten und Gene gemeint, die ABA-Synthese oder deren Perzeption und Signaltransduktion unterbrechen. Diese Mutanten, Gene und Sequenzen, welche ABA-Synthese oder deren Perzeption oder Signaltransduktion unterbrechen, werden hierin außerdem "ABA-assoziierte Sequenzen" genannt. Solche Sequenzen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, ABA-insensitive und -hypersensitive Mutanten oder Antisens- Sequenzen, die zu den mutierten oder Wildtyp-Genen korrespondieren. ABA-Mutanten sind im Fachgebiet bekannt und schließen abi1–5, era1–3 (Cutler et al. (1996) Science 273:1239–41), gca 1/8 (Benning et al. (1996) Proc. Workshop Abscisic Acid Signal Tranduction in Arabidopsis, Madrid, S. 34), axr2 (Wilson et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 222:377–83), jar1 (Staswick et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6837–40), jin4 (Berger et al. (1996) Plant Physiol. 111:525–31), bri1 (Clouse et al. (1996) Plant Physiol. 111:671–78), sax (Arabidopsis thaliana); vp1 (McCarty et al. (1991) Cell 66:895–905 und Robichaud et al. (1986) J. Plant Physiol. 126:235–42) und real (Sturaro et al. (1996) J. Exp. Bot. 47:755–62 (Zea mays); cool (Raskin et al. (1988) Planta 173:73–78) (Hordeum vulgare); aba1 (Bitoun et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220:234–39 und Leydecker et al. (1995) Plant Physiol. 107:1427–31) (Nicotiana plumbaginifolia); und dergleichen, ein. Diese und andere ABA-assoziierte Mutanten können in der Praxis der Erfindung verwendet werden.
Mit "korrespondierend" zu einem Gen oder einer Sequenz ist gemeint, dass die Sequenz fähig ist, an das Gen oder die Sequenz in dem Ausmaß zu hybridisieren, das notwendig ist, um die Transkription zu unterbrechen. Es wird erkannt, dass abhängig von der ABA-assoziierten Sequenz, die in der Erfindung verwendet wird, die codierende Sequenz oder die Antisens-Sequenz bevorzugt sein kann. Die codierende Sequenz kann jedoch außerdem verwendet werden, um Expression des Zielgens zu co-supprimieren. Beispielsweise schließt eine Strategie Expression von mutierten Genen, wie z.B. abi1 oder abi2, mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, um ABA-Wirkung in Geweben zu frühen Stadien dominant zu unterbrechen, ein. Eine solche Herangehensweise würde die späte erforderliche ABA-Funktion bei der Samenreifung nicht unterbrechen. Alternativ können Wildtyp-Allele von Genen, wie z.B. Vp1, durch Co-Suppression oder Antisens-Strategien herabreguliert werden, um ABA-Wirkung zu unterbrechen. Bei diesem letzteren Beispiel kann ein früher Kern/Embryo-Promotor verwendet werden, um Expression einer codierenden Sequenz für Vp1 (um zu co-supprimieren) zu steuern oder Expression einer Antisens-Sequenz für Vp1 zu steuern. Ein drittes Beispiel schließt die Transformation einer Pflanze mit einem Promotor für Kernentwicklung in einer späten Periode ein, der eine Wildtyp-Vp1-Sequenz antreibt bzw. steuert. Diese transformierte Pflanze kann dann zu einer vp1-Mutantenpflanze gekreuzt werden. In diesem Beispiel funktioniert das Unvermögen der vp1-Mutante, durch ABA-induziert zu werden, um frühe Kerne von schädlichen Wirkungen zu isolieren. Zur selben Zeit liefert das DNA-Konstrukt Kerne mit der Fähigkeit, normal zu reifen. Folglich sind, wie umfangreicher unten beschrieben, verschiedene Kandidaten-Genziele verfügbar, um an Promotoren mit limitierten Expressionsmustern gekoppelt zu werden, um erhöhte Ausbeutestabilität im Angesicht von abiotischem Stress bereitzustellen.
Das Vivipar-1 (Vp1)-Gen von Mais ist zur Expression des Reifungsprogramms bei der Samenentwicklung erforderlich. VP1 ist ein neuer Transkriptionsfaktor, der möglicherweise an der Potenzierung einer Samen-spezifischen Hormonantwort beteiligt ist. Die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenz von Vp1 befindet sich in SEQ ID NOS: 1 und 2. Die Vivipar-Mutanten von Mais sind im Reifungsprogramm blockiert. Als Folge schreitet der mutierte Embryo frühreif in die Keimlingsentwicklung fort, während er an die Mutterpflanze angeheftet ist. Mehrere Vivipar-Mutanten sind identifiziert worden. Weitere Charakteristika einer vp1-Funktionsverlustmutante schließen beispielsweise einen ABA-insensitiven Phänotyp (d.h., eine reduzierte Sensitivität auf Keimungsinhibierung durch exogene ABA in Kultur) und/oder eine Verringerung der Em-Promotoraktivierung ein. Es liegt gut innerhalb fachmännischen Tuns, Funktionsverlustmutationen in Vp1 zu identifizieren, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind. Beispielsweise haben Hill et al. ((1996) Journal Biological Chemistry 7:3366) eine Rolle der sauren NH²-terminalen Region und der hochkonservierten BR1-Domäne von VP1 für die VP1-Funktion essentiell zu sein, identifiziert. Andere vp1-Mutanten sind bekannt. Siehe beispielsweise Neill et al. (1986) Planta 169:87–96; McCarthy et al. (1991) Cell 66:895–905; Robichaud et al. (1980) Dev. Genet. 1:325–330; Robichaud und Sussex (1987) Plant Physiol. 130:181–188; Robichaud et al. (1986) J. Plant Physiol. 126:235–42; McCarthy et al. (1990) Physiol. Plant 81:267–72; und Eyster et al. (1931) Genetics 16:457–590; von denen alle hierin durch Referenz inkorporiert sind.
ABA-insensitive, ABI, Arabidopsis-Mutanten sind außerdem verfügbar. Solche Mutanten haben pleiotropische Defekte bei der Samenentwicklung, einschließlich verringerter Sensitivität auf ABA-Inhibierung der Keimung in veränderter Samen-spezifischer Genexpression. Siehe Finkelstein et al. (1998) The Plant Cell 10:1043–1045; Leung et al. (1994) Science 264:1448–1452; Leung (1997) Plant Cell 9:759–771; Giraudat et al. (1992) Plant Cell 4:1251-1261; Myer et al. (1994) Science 264:1452–1455; Koornneef et al. (1989) Plant Physiol. 90:463–469; Nambara et al. (1992) Plant J. 2:435–441; Finkelstein und Somerville (1990) Plant Physiol. 94:1172–1179; Leung und Giraudat (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:199–222; Robinson und Hill (1999) Plant, Cell and Environment 22:117–123; und Rodriguez et al. (1998) FEBS Letters 421:185–190, und die hierin zitierten Referenzen, von denen alle hierin durch Referenz inkorporiert sind. Außerdem sind die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen von Wildtyp-ABI1, -ABI2, -ABI3 und -ABI4 in SEQ ID NOS: 3–10 dargelegt. Andere ABA-assoziierte Mutanten schließen bri1 von Arabidopsis thaliana, dessen Sequenz in Genbank-Eingangs-Nr. AF017056 gefunden werden kann, und Li et al. (1997) Cell 90:929–938, ein, von denen beide hierin durch Referenz inkorporiert sind.
Eine interessierende abi-Mutante schließt beispielsweise abi1 ein. abi1 ist eine dominante Mutation im strukturellen Teil des ABI1-Gens. Die Mutation ist charakterisiert worden und umfasst einen Nucleotid-Basenübergang von Guanin zu Adenin und verändert die DNA-Sequenz GGC zu GAC, was folglich verursacht, dass der Wildtyp-Glycinrest an Aminosäure-Position 180 von SEQ ID NO: 3 mit Aspartat (Asparaginsäure) ersetzt wird (Meyer et al. (1994) Science 264:1452–1455). abi2 ist eine weitere interessierende dominante Mutation in den erfindungsgemäßen Verfahren. abi2 ist durch einen GGC-zu-GAC-Übergang charakterisiert, der zum Ersetzen des Gly-Restes an Aminosäure-Position 168 von SEQ ID NO: 6 durch Asp führt (Rodriquez et al. (1998) FEBS Letters 421: 18–190). Es liegt innerhalb fachmännischen Wissens, andere Mutationen (sowohl dominant als auch rezessiv) in anderen ABA-assoziierten Sequenzen zu identifizieren, die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sein werden.
Derartige Mutanten, die oben aufgelistet sind, werden als "ABA-assoziierte Mutanten" bezeichnet. Mit "ABA-assoziierte Mutanten" sind Gene und Sequenzen gemeint, die ABA-Signalgebung und/oder -Perzeption in einer Pflanze unterbrechen. Unter Verwendung obiger Sequenzen können verwandte Sequenzen von anderen Pflanzen, einschließlich Getreidearten, isoliert werden. In manchen Fällen kann es förderlich sein, die ABA-assoziierte Sequenz zu verwenden, die einer Sequenz aus der interessierenden Zielpflanze entspricht. Beispielsweise kann, für die Verwendung in Mais, das Maishomologon der ABA-assoziierten Sequenz oder eine Sequenz, die dem Maishomologon entspricht, bevorzugt sein.
Die Erfindung verwendet die ABA-assoziierten Sequenzen, um die Pflanzenreaktion auf ABA zu kontrollieren. Im Allgemeinen wird es förderlich sein, ABA-Signalgebung oder -Perzeption zu blockieren, um einen Ausbeuteverlust zu verhindern. Durch Verwenden der ABA-assoziierten Sequenzen, codierenden Sequenzen und Antisens-Sequenzen kann die Expression und Perzeption von ABA in einer Pflanze kontrolliert werden. Wie unten in größerem Detail beschrieben, können derartige Sequenzen in interessierende Pflanzen durch rekombinante Verfahren eingebracht werden.
Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen können verwendet werden, um entsprechende Sequenzen von anderen Organismen, insbesondere anderen Pflanzen, insbesondere Getreidearten, zu isolieren. Auf diese Weise können Verfahren, wie z.B. PCR, Hybridisierung und dergleichen, verwendet werden, um derartige Sequenzen, basierend auf ihrer Sequenzhomologie, zu den ABA-assoziierten, im Fachgebiet bekannten Sequenzen zu identifizieren. Sequenzen können, basierend auf ihrer Sequenzidentität, zu der gesamten ABA-assoziierten Sequenz oder zu Fragmenten davon isoliert werden.
In einer PCR-Vorgehensweise können Oligonucleotid-Primer für die Verwendung in PCR-Reaktionen entworfen werden, um entsprechende DNA-Sequenzen von cDNA oder genomischer DNA, extrahiert aus irgendeiner interessierenden Pflanze, zu amplifizieren. Verfahren zum Entwerfen von PCR-Primern und PCR-Klonierungen sind allgemein im Fachgebiet bekannt und in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Habor Laboratory Press, Plainview, New York) offenbart. Siehe außerdem Innis et al., Hrsg. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis und Gelfand, Hrsg. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); und Innis und Gelfand, Hrsg. (1999) PCR Methods Manual(Academic Press, New York). Bekannte Verfahren von PCR schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Verfahren unter Verwendung gepaarter Primer, verschachtelter Primer, einzelspezifischer Primer, degenerierter Primer, Gen spezifischer Primer, Vektor-spezifischer Primer, Primer mit teilweise fehlender Übereinstimmung und dergleichen.
Bei Hybridisierungstechniken wird alles oder ein Teil von einer bekannten Nucleotidsequenz als eine Sonde verwendet, die selektiv an andere entsprechende Nucleotidsequenzen hybridisiert, die in einer Population klonierter genomischer DNA-Fragmente oder cDNA-Fragmente (d.h., genomische oder cDNA-Bibliotheken) von einer ausgewählten Pflanze anwesend sind. Die Hybridisierungssonden können genomische DNA-Fragmente, cDNA-Fragmente, RNA-Fragmente oder andere Oligonucleotide sein und können mit einer detektierbaren Gruppe, wie z.B. ³²P oder irgendeinem anderen detektierbaren Marker markiert sein. Folglich können Sonden für die Hybridisierung beispielsweise durch Markieren synthetischer Oligonucleotide, die auf den erfindungsgemäßen ABA-assoziierten Sequenzen basieren, hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Sonden für die Hybridisierung und zur Konstruktion von cDNA und genomischen Bibliotheken sind allgemein im Fachgebiet bekannt und in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) offenbart.
Beispielsweise kann eine gesamte ABA-assoziierte Sequenz oder ein oder mehrere Teile davon als eine Sonde verwendet werden, die fähig ist, spezifisch an entsprechende Sequenzen und Messenger-RNAs zu hybridisieren. Um spezifische Hybridisierung unter einer Vielfalt von Bedingungen zu erreichen, schließen derartige Sonden Sequenzen ein, die unter den interessierenden Sequenzen einzigartig sind und vorzugsweise wenigstens etwa 10 Nucleotide lang sind und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 20 Nucleotide lang sind. Solche Sonden können verwendet werden, um entsprechende Sequenzen von einer ausgewählten Pflanze durch PCR zu amplifizieren. Diese Technik kann außerdem verwendet werden, um zusätzliche codierenden Sequenzen von einer gewünschten Pflanze zu isolieren oder als ein diagnostischer Assay verwendet werden, um die Anwesenheit codierender Sequenzen in einer Pflanze zu bestimmen. Hybridisierungsverfahren schließen Hybridisierungsscreening plattierter DNA-Bibliotheken (entweder Plaques oder Kolonien; siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) ein.
Die Hybridisierung derartiger Sequenzen kann unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Mit "stringenten Bedingungen" oder "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind Bedingungen gemeint, unter denen eine Sonde an ihre Zielsequenz in einem nachweislich größeren Ausmaß hybridisieren wird als an andere Sequenzen (z.B. wenigstens 2fach gegenüber dem Hintergrund). Stringente Bedingungen sind Sequenz-abhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Durch Kontrollieren der Hybridisierungsstringens und/oder der Waschbedingungen können Zielsequenzen, die 100% komplementär zu der Sonde sind, identifiziert werden (homologes Sondieren, "homologous probing"). Alternativ können Stringensbedingungen eingestellt werden, um etwas fehlende Übereinstimmung bei Sequenzen zu erlauben, so dass niedrigere Ähnlichkeitsgrade detektiert werden (heterologes Sondieren, "heterologous probing"). Im Allgemeinen ist eine Sonde weniger als etwa 1000 Nucleotide lang, vorzugsweise weniger als 500 Nucleotide lang.
Typischerweise werden Stringensbedingungen jene sein, bei denen die Salzkonzentration weniger ist als etwa 1,5 M Natriumionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionen-Konzentration (oder andere Salze), bei pH 7,0 bis 8,3, und die Temperatur ist wenigstens etwa 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange Sonden (z.B. größer als 50 Nucleotide). Die Dauer der Hybridisierung ist im Allgemeinen weniger als etwa 24 Stunden, für gewöhnlich etwa 4 bis 12. Stringente Bedingungen können außerdem durch die Zugabe von destabilisierenden Mitteln, wie z.B. Formamid, erreicht werden. Beispielhafte Niedrigstringens-Bedingungen schließen Hybridisierung mit einer Pufferlösung von 30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und ein Waschen in 1X bis 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C ein. Beispielhafte Bedingungen moderater Stringens schließen Hybridisierung in 40 bis 45% Formamid, 1,0 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und ein Waschen in 0,5X bis 1X SSC bei 55 bis 60°C ein. Beispielhafte Hochstringens-Bedingungen schließen Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und ein Waschen in 0,1X SSC bei 60 bis 65°C ein.
Spezifität ist typischerweise die Funktion der Posthybridisierungs-Waschschritte, wobei die kritischen Faktoren die Ionenstärke und Temperatur der finalen Waschlösung sind. Für DNA-DNA-Hybride kann die T_m aus der Gleichung von Meinkoth und Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267–284: T_m = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61 (% Form) – 500/L genähert werden; wo M die Molarität monovalenter Kationen ist, %GC der Prozentsatz von Guanosin- und Cytosin-Nucleotiden in der DNA ist, % Form der Prozentsatz von Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. Die T_m ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH), bei der 50% einer komplementären Zielsequenz an eine perfekt gepaarte Sonde hybridisieren. T_m ist um etwa 1°C für jedes 1% fehlender Übereinstimmung reduziert; folglich können T_m-Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen eingestellt werden, um an Sequenzen der gewünschten Identität zu hybridisieren. Beispielsweise kann, wenn Sequenzen mit ≥90% Identität gesucht sind, die T_m dann um 10°C verringert sein. Im Allgemeinen werden Stringensbedingungen ausgewählt, um etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt T_m für die spezifische Sequenz und deren Komplement bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH zu sein. Jedoch können stark stringente Bedingungen eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 1, 2, 3 oder 4°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) verwenden; moderat stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 6, 7, 8, 9 oder 10°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) verwenden; Niedrigstringens-Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) verwenden. Verwendend die Gleichung, Hybridisierung und Waschzusammensetzungen und die gewünsch te T_m, wird der Durchschnitt-Fachmann erkennen, dass Variationen bei der Hybridisierungsstringens und/oder den Waschlösungen inhärent beschrieben sind. Wenn der erwünschte Grad an fehlender Übereinstimmung in einer T_m von weniger als 45°C (wässrige Lösung) oder 32°C (Formamidlösung) resultiert, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration zu erhöhen, so dass eine höhere Temperatur verwendet werden kann. Einen umfangreichen Leitfaden zur Hybridisierung von Nucleinsäuren findet man in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 (Elsevier, New York); und Ausubel et al., Hrsg. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
Folglich sind isolierte "entsprechende bzw. korrespondierende ABA-assoziierte Sequenzen", die die Pflanzenreaktion auf ABA modulieren, und welche unter stringenten Bedingungen an die hierin offenbarten ABA-assoziierten Sequenzen oder an Fragmente davon hybridisieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst. Derartige Sequenzen werden wenigstens etwa 40% bis 50% homolog, etwa 60%, 65% oder 70% homolog, und sogar wenigstens etwa 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder homologer mit den offenbarten Sequenzen sein. D.h., die Sequenzidentität der Sequenzen kann variieren, wobei wenigstens etwa 40% bis 50%, etwa 60%, 65% oder 70%, und sogar wenigstens etwa 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität geteilt werden.
Die ABA-assoziierten erfindungsgemäßen Sequenzen können mit Gewebe- oder entwicklungsspezifischen Promotoren verwendet werden, um ABA-Funktion auf eine gewebe- oder eine entwicklungsspezifische Weise zu unterbrechen. Promotoren von speziellem Interesse schließen Samen-bevorzugte Promotoren, insbesondere frühe Kern/Embryo-Promotoren und späte Kern/Embryo-Promotoren ein.
Kernentwicklung nach Bestäubung wird in etwa drei primäre Phasen eingeteilt. Die lag-Phase des Kernwachstums findet von etwa 0 bis 10–12 Tagen nach Bestäubung statt. Während dieser Phase wächst der Kern nicht signifikant an Masse, sondern vielmehr werden wichtige Ereignisse durchgeführt, die die Kernvitalität (d.h., Anzahl von Zellen) bestimmen werden. Das lineare Kernfüllungsstadium findet von etwa 10–12 bis etwa 40 DAP (="days after pollination", Tage nach Bestäubung) statt. Während dieser Stufe der Kernentwicklung erlangt der Kern fast seine gesamte Endmasse, und es werden verschiedene Speicherprodukte (d.h., Stärke, Protein, Öl) produziert. Schließlich geschieht die Reifungsphase von etwa 40 DAP bis zur Ernte. Während dieser Phase der Kernentwicklung wird der Kern quieszent und beginnt auszutrocknen, in Vorbereitung auf eine lange Periode von Ruhe vor der Keimung. Wie hierin definiert, sind "frühe Kern/Embryo-Promotoren" Promotoren, die während der ersten Phase der Entwicklung an sind (d.h., von etwa 0 bis etwa 12 DAP). "Späte Kern/Embryo-Promotoren", wie hierin definiert, sind von etwa 12 DAP bis zur Reifung an. Die Wahl des Promotors wird von der verwendeten ABA-assoziierten Sequenz abhängen.
Frühe Kern/Embryo-Promotoren schließen beispielsweise cim1, einen Pollen- und Gesamtkern-spezifischen Promotor ein, der 5 DAP aktiv ist. Siehe beispielsweise WO 00/11177, welche hierin durch Referenz inkorporiert ist. Andere frühe Kern/Embryo-Promotoren schließen die Samen-bevorzugten Promotoren end1, welcher 7–10 DAP aktiv ist, und end2, welcher 9–14 DAP im gesamten Kern aktiv ist und 10 DAP im Endosperm und Pericarp aktiv ist, ein. Siehe beispielsweise WO 00/12733, hierin durch Referenz inkorporiert. Zusätzliche frühe Kern/Embryo-Promotoren finden in den Verfahren der vorliegenden Erfindung Anwendung, einschließlich der Samen-bevorzugte Promotor lpt2 (SEQ ID NO: 13), der 6 bis 24 DAP aktiv ist (US-Patent Nr. 5 525 716, hierin durch Referenz inkorporiert).
Solche frühen Kern/Embryo-Promotoren können mit Genen oder Mutanten im Perzeptions-/Signaltransduktions-Weg für ABA verwendet werden. Auf diese Weise würden mutierte Gene, wie z.B. abi1 oder abi2, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, ABA-Wirkung in Geweben, vor der später erforderlichen ABA-Funktion bei der Samenreifung, unterbrechen. Alternativ kann ein früher Kern/Embryo-Promotor funktionell mit einer Wildtyp-(Co-Supprimierung)- oder Antisens-Nucleotidsequenz einer ABA-assoziierten Sequenz verknüpft sein. Der frühe Kern/Embryo-Promotor würde verwendet werden, um ABA-Wirkung in Geweben vor der Samenreifung zu unterbrechen.
Späte Kern/Embryo-Promotoren schließen beispielsweise Promotoren von Oleosingenen ein. Siehe beispielsweise Plant et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25:193–205; Keddie et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:327–40; Keddie et al. (1992) Plant Mol. Biol. 19:443–53; und Hong et al. (1997) 34:549–55; hierin durch Referenz inkorporiert. Siehe außerdem Genbank-Eingangs-Nrn. U71381 (SEQ ID NO: 11), AF134411 (SEQ ID NO: 12) und US-Patent Nr. 5 977 436, welche Oleosin-Promotorsequenzen von Glycine max, Brassica juncea bzw. Arabidopsis thaliana enthalten. All diese Referenzen sind hierin durch Referenz inkorporiert. Zusätzliche späte Kern/Embryo-Promotoren schließen smi1ps, einen Embryo-spezifischen Promotor, der 13–14 DAP aktiv ist, und cz19B1, ein Gesamtkern-spezifischer Promotor, der 13–40 DAP aktiv ist, ein. Siehe beispielsweise WO 00/11177, welche hierin durch Referenz inkorporiert ist. Der Samenbevorzugte Promotor a13 ist 24–40 Tage nach dem Blühen aktiv und kann außerdem bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Siehe beispielsweise WO 00/40710, welche hierin durch Referenz inkorporiert ist.
Späte Kern/Promotoren, wie jene von Oleosingenen, können verwendet werden, um Expression eines Wildtyp-Vp1-Allels anzutreiben. Solche Pflanzen können dann zu einer Pflanze gekreuzt werden, die eine vp1-Mutante aufweist. In diesem Beispiel würde das Unvermögen des mutierten vp1-Allels, durch ABA komplementiert zu werden, frühe Kerne von schädlichen Wirkungen isolieren. Das Vp1-Genprodukt ist sehr früh bei der Kernentwicklung an. In Anwesenheit von ABA wird Vp1 wirksam. Das von der transgenen Mutterpflanze zur Verfügung gestellte konstruierte Gen würde die Kerne mit der Fähigkeit versehen, normal zu reifen. Wie hierin verwendet, ist eine "endogene ABA-assoziierte Sequenz" definiert als irgendeine ABA-assoziierte Sequenz, die nicht über ein Transformationsereignis in die Pflanze eingebracht ist.
Derartige ABA-assoziierte Gene können verwendet werden, um die Wirkungen von Stress auf die Pflanze zu kontrollieren. Die Akkumulation von Nährstoffreserven ist beim Erwerb von Desikkationstoleranz mit der Expression spezifischer Sätze von mRNAs assoziiert. Transkripte, die entweder Speicherproteine oder späte Embryogenese-abundante (LEA, "lateembryogenesis-abundant") Proteine codieren, von denen man glaubt, dass sie bei der Desikkationstoleranz beteiligt sind, können frühreif durch exogenes ABA in kultivierten Embryos induziert werden. Folglich kann eine späte Expression von ABA-Genen mit transgenen Samenspeicherproteinen gekoppelt sein, um die Nährstoffreserven in Samen zu erhöhen.
Durch "Einbringen" von Sequenzen, die ABA-Perzeption und -Signaltransduktion modulieren, in eine Zielpflanze, ist ein genetisches Transformationsverfahren gemeint. Mit "stabile Transformation" ist gemeint, dass das in eine Pflanze eingebrachte Nucleotidkonstrukt in das Genom der Pflanze integriert und fähig ist, an deren Nachkommenschaft vererbt zu werden.
Wildtyp-Allele von Genen, wie z.B. Vp1, können mit frühen Promotoren über entweder Co-Supprimierung oder Antisens-Strategien herabreguliert werden. Man erkennt, dass mit diesen Nucleotidsequenzen Antisens-Konstruktionen konstruiert werden können, die zu wenigstens einem Anteil der Messenger-RNA (mRNA) für die ABA-assoziierten Sequenzen komplementär sind. Antisens-Nucleotide werden konstruiert, um mit der entsprechenden mRNA zu hybridisieren. Modifikationen der Antisens-Sequenzen können angefertigt werden, solange die Sequenzen anhybridisieren und mit der Expression der entsprechenden mRNA interferieren. Auf diese Weise können Antisens-Konstruktionen mit 70%, bevorzugt 80%, stärker bevorzugt 85% Sequenzähnlichkeit zu den entsprechenden Antisens-Sequenzen verwendet werden. Ferner können Anteile der Antisens-Nucleotide verwendet werden, um die Expression des Zielgens zu unterbrechen. Im Allgemeinen können Sequenzen von wenigstens 50 Nucleotiden, 100 Nucleotiden, 200 Nucleotiden oder größer, verwendet werden.
Verfahren zum Supprimieren von Genexpression in Pflanzen unter Verwendung von Nucleotidsequenzen in der Sinn-Orientierung sind im Fachgebiet bekannt. Die Verfahren beinhalten im Allgemeinen Transformieren von Pflanzen mit einem DNA-Konstrukt, umfassend einen Promotor, der Expression in einer Pflanze antreibt, funktionell verknüpft mit wenigstens einem Teil einer Nucleotidsequenz, die dem Transkript des endogenen Gens (d.h., eine ABA-assoziierte Sequenz) entspricht. Typischerweise weist eine solche Nucleotidsequenz substantielle Sequenzidentität mit der Sequenz des Transkripts des endogenen Gens auf, bevorzugt größer als etwa 65% Sequenzidentität, stärker bevorzugt größer als etwa 85% Sequenzidentität, am stärksten bevorzugt größer als etwa 95% Sequenzidentität. Siehe US-Patent-Nrn. 5 283 184 und 5 034 323; hierin durch Referenz inkorporiert.
Man erkennt, dass Fragmente und/oder Varianten der ABA-assoziierten Gene in der Erfindung verwendet werden können. Fragmente und Varianten der ABA-assoziierten Nucleotidsequenzen und davon codierte Proteine sind folglich von der vorliegenden Erfindung umfasst. Mit "Fragment" ist ein Anteil von der Nucleotidsequenz oder ein Anteil von der Aminosäuresequenz, und folglich von dadurch codiertem Protein, gemeint. Fragmente einer Nucleotidsequenz können für Proteinfragmente codieren, die die biologische Aktivität des nativen Proteins beibehalten und folglich wirken, indem sie Reaktionen auf ABA modulieren. Alternativ codieren Fragmente einer Nucleotidsequenz, die als Hybridisierungssonden verwendbar sind, im Allgemeinen keine Fragmentproteine, die biologische Aktivität beibehalten. Folglich können Fragmente einer Nucleotidsequenz von wenigstens etwa 20 Nucleotiden, etwa 50 Nucleotiden, etwa 100 Nucleotiden und bis zur erfindungsgemäßen Volllängen-Nucleotidsequenz reichen.
Mit "Varianten" sind im Wesentlichen ähnliche Sequenzen gemeint. Für Nucleotidsequenzen können natürlich vorkommende Varianten, wie diese mit Verwendung von gut bekannten molekularbiologischen Techniken, wie beispielsweise mit Polymerasekettenreaktion (PCR) und Hybridisierungstechniken, wie unten skizziert, identifiziert werden, genannt werden. Variante Nucleotidsequenzen schließen außerdem synthetisch abgeleitete Nucleotidsequenzen ein, wie jene, die beispielsweise durch Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese erzeugt sind. Im Allgemeinen werden Varianten einer speziellen erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz wenigstens etwa 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, im Allgemeinen wenigstens etwa 75%, 80%, 85%, bevorzugt wenigstens etwa 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, und stärker bevorzugt wenigstens etwa 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu dieser speziellen Nucleotidsequenz aufweisen, wie bestimmt durch Sequenzanordnungsprogramme, die hierin anderswo beschrieben sind, unter Verwendung von Standardparametern.
Verfahren zur Sequenzanordnung für einen Vergleich sind im Fachgebiet gut bekannt. Folglich kann die Bestimmung der Prozent Identität zwischen beliebigen zwei Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erreicht werden. Nicht-abschließende Beispiele derartiger mathematischer Algorithmen sind der Algorithmus von Myers und Miller (1988) CABIOS 4:11–17; der lokale Homologie-Algorithmus von Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; der Homologie-Anordnungsalgorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443–453; das Suche-nach-Ähnlichkeit-Verfahren von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444–2448; der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modifiziert wie in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873–5877.
Computerausführungen dieser mathematischen Algorithmen können für Sequenzvergleiche verwendet werden, um Sequenzidentität zu bestimmen. Solche Ausführungen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf CLUSTAL im PC/Gene-Programm (erhältlich von Intelligenetics, Mountain View, California); das ALIGN-Programm (Version 2.0) und GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software-Paket, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Vergleichende Anordnungen ("alignements") unter Verwendung dieser Programme können unter Verwendung der Standardparameter durchgeführ werden. Das CLUSTAL-Programm ist von Higgins et al. (1988) Gene 73:237–244 (1988); Higgins et al. CABIOS 5:151–153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881–90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155–65; und Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307–331, gut beschrieben. Das ALIGN-Programm basiert auf dem Algorithmus von Myers und Miller (1988) a.a.O. Eine PAM120-Gewichtreste-Tabelle, eine Lückenlängenstrafe von 12 und eine Lückenstrafe von 4 können mit dem ALIGN-Programm verwendet werden, wenn Aminosäuresequenzen verglichen werden. Die BLAST-Programme von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403, basieren auf dem Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) a.a.O. BLAST-Nucleotidsuchen können mit dem BLASTN-Programm, Punktzahl = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden, um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die homolog zu einer Nucleotidsequenz sind, die für ein erfindungsgemäßes Protein codiert. BLAST-Proteinsuchen können mit dem BLASTX-Programm, Punktzahl = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die homolog zu einem Protein oder Polypeptid der Erfindung sind. Um vergleichende Anordnungen mit Lücken für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped-BLAST (in BLAST 2.0), wie in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 beschrieben, verwendet werden. Alternativ kann PSI-BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, um eine wiederholte Suche durchzuführen, die entfernte Beziehungen zwischen Molekülen detektiert. Siehe Altschul et al. (1997) a.a.O. Beim Verwenden von BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, können die Standardparameter des jeweiligen Programms (z.B. BLASTN für Nucleotidsequenzen, BLASTX für Proteine) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.hlm.nih.gov. Das Anordnen kann außerdem manuell durch Inspektion durchgeführt werden.
Wenn nicht anderweitig vermerkt, beziehen sich hierin bereitgestellte Sequenzidentitäts/Ähnlichkeitswerte auf den Wert, erhalten unter Verwendung von GAP, Version 10, unter Verwendung der folgenden Parameter: % Identität unter Verwendung eines GAP-Gewichts von 50 und eines Längengewichts von 3; % Ähnlichkeit unter Verwendung eines GAP Gewichts von 12 und eines Längengewichts von 4, oder ein äquivalentes Programm. Mit "äquivalentes Programm" ist irgendein Sequenzvergleichsprogramm gemeint, das für beliebige zwei in Frage kommende Sequenzen eine Anordnung erzeugt, die identische Nucleotid- oder Aminosäurerest-Übereinstimmungen und Prozent Sequenzidentität zeigt, wenn verglichen mit der entsprechenden Anordnung, erzeugt von einem bevorzugten Programm.
GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443–453, um die Anordnung zweier kompletter Sequenzen zu finden, die die Anzahl von Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl von Lücken minimiert. GAP erwägt alle möglichen Anordnungen und Lückenpositionen und erzeugt die Anordnung der größten Zahl von übereinstimmenden Basen und der geringsten Lücken. Es erlaubt die Bereitstellung einer Lückenerzeugungsstrafe und einer Lückenerweiterungsstrafe in Einheiten übereinstimmender Basen. GAP muss einen Profit von Lückenerzeugungs-Strafeanzahl von Übereinstimmungen für jede Lücke, die sie einfügt, machen. Wenn eine Lückenerweiterungsstrafe größer als null gewählt wird, muss GAP zusätzlich einen Profit für jede eingefügte Lücke von der Länge der Lücke mal der Lückenerweiterungsstrafe machen. Voreinstellungs-Lückenerzeugungsstrafwerte und Lückenerweiterungsstrafwerte sind in Version 10 des Wisconsin Genetics Software-Pakets für Proteinsequenzen 8 bzw. 2. Für Nucleotidsequenzen ist die Voreinstellungslückenerzeugungsstrafe 50, während die Voreinstellungs-Lückenerweiterungsstrafe 3 ist. Die Lückenerzeugungs- und Lückenerweiterungsstrafen können ausgedrückt werden als eine ganze Zahl, ausgewählt aus der Gruppe von ganzen Zahlen, bestehend aus von 0 bis 200. Folglich können die Lückenerzeugungs- und Lückenerweiterungsstrafen 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder größer sein.
GAP präsentiert ein Mitglied der Familie der besten Anordnungen. Es kann viele Mitglieder dieser Familie geben, aber kein anderes Mitglied weist eine bessere Qualität auf. GAP zeigt vier Leistungsfiguren für Anordnungen an: Qualität, Verhältnis, Identität und Ähnlichkeit. Die Qualität ist das metrische Maximierte, um die Sequenzen anzuordnen. Verhältnis ist die Qualität, geteilt durch die Anzahl von Basen in dem kürzeren Segment. Prozent Identität sind die Prozent der Symbole, die tatsächlich übereinstimmen. Prozent Ähnlichkeit sind die Prozent der Symbole, die ähnlich sind. Symbole, die gegenüber von Lücken sind, werden ignoriert. Eine Ähnlichkeit wird gepunktet, wenn der Auswerte-Matrixwert für ein Paar von Symbolen größer als oder gleich 0,50, der Ähnlichkeitsgrenzwert, ist. Die in Version 10 des Wisconsin Genetics Software-Pakets verwendete Auswerte-Matrix ist BLOSUM62 (siehe Henikoff und Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
Mit "variantes" Protein ist ein Protein, das von dem nativen Protein durch Deletion (sogenannte Trunkierung, "truncation") oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an das N-terminale und/oder C-terminale Ende des nativen Proteins; Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in dem nativen Protein; oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in dem nativen Protein, abgeleitet ist, gemeint. Solche Varianten können sich beispielsweise aus genetischem Polymorphismus oder menschlicher Manipulation ergeben.
Die erfindungsgemäßen Proteine können auf verschiedenen Wegen verändert werden, einschließlich Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen, -Trunkierungen und -Insertionen. Verfahren für derartige Manipulationen sind allgemein im Fachgebiet bekannt. Verfahren zur Mutagenese und Nucleotidsequenz-Veränderungen sind im Fachgebiet gut bekannt. Siehe beispielsweise Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488–492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367–382; US-Patent Nr. 4 873 192; Walker und Gaastra, Hrsg. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York), und die hierin zitierten Referenzen. Anleitung bezüglich geeigneter Aminosäure-Substitutionen, die die biologische Aktivität des interessierenden Proteins nicht beeinflussen, können im Modell von Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), hierin durch Referenz inkorporiert, gefunden werden. Konservative Substitutionen, wie z.B. das Austauschen einer Aminosäure mit einer anderen mit ähnlichen Eigenschaft, kann bevorzugt sein.
Folglich schließen die erfindungsgemäßen Gene und Nucleotidsequenzen sowohl die natürlich vorkommenden Sequenzen als auch mutante Formen davon ein. Gleichermaßen umfassen die erfindungsgemäßen Proteine sowohl natürlich vorkommende Proteine als auch Variationen und modifizierte Formen davon. Solche Varianten werden weiterhin die gewünschte Aktivität besitzen. Offensichtlich dürfen die Mutationen, die man in der die Variante codierenden DNA durchführen wird, die Sequenz nicht außerhalb des Leserahmens platzieren, und bevorzugt werden sie keine komplementären Regionen erzeugen, die sekundäre mRNA-Struktur produzieren könnten. Siehe EP-Patent-Anmeldungsveröffentlichungs-Nr. 75 444.
Man erwartet nicht, dass die Deletionen, Insertionen und Substitutionen der hierin umfassten Proteinsequenzen radikale Änderungen bei den Charakteristika des Proteins hervorrufen. Jedoch wird ein Fachmann erkennen, wenn es schwierig ist, den genauen Effekt der Substitution, Deletion oder Insertion vor der Durchführung vorherzusagen, dass der Effekt durch Routinedurchmusterungsassays ausgewertet werden wird.
Variante Nucleotidsequenzen und Proteine umfassen außerdem Sequenzen und Proteine, die aus einem mutagenen oder rekombinogenen Verfahren, wie z.B. "DNA-Mischen" ("DNA-shuffling"), stammen. Mit einem derartigen Verfahren können ein oder mehrere verschiedene ABA-assoziierte, codierende Sequenzen manipuliert werden, um ein neues ABA-assoziiertes Protein zu erzeugen, das die gewünschten Eigenschaften besitzt. Auf diese Weise werden Bibliotheken rekombinanter Polynucleotide erzeugt, aus einer Population von Polynucleotiden mit verwandter Sequenz, umfassend Sequenzregionen, die substantielle Sequenzidentität aufweisen und in vitro oder in vivo homolog rekombiniert werden können. Strategien für derartiges "DNA-Shuffling" sind im Fachgebiet bekannt. Siehe beispielsweise Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389–391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436–438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336–347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504–4509; Carmeri et al. (1998) Nature 391:288–291; und US-Patent Nrn. 5 605 793 und 5 837 458.
Die erfindungsgemäßen ABA-assoziierten Sequenzen werden in Expressionskassetten zur Expression in der interessierenden Pflanze bereitgestellt. Die Kassette wird regulatorische 5'- und 3'-Sequenzen, funktionell verknüpft mit einer ABA-assoziierten Sequenz der Erfindung, einschließen. Mit "funktionell verknüpft" ist eine funktionelle Verknüpfung zwischen einem Promotor und einer zweiten Sequenz gemeint, wobei die Promotorsequenz die Transkription der DNA-Sequenz, die der zweiten Sequenz entspricht, initiiert und vermittelt. Im Allgemeinen bedeutet funktionell verknüpft, dass die verknüpften Nucleinsäuresequenzen zusammenhängend sind und, wo notwendig, um zwei Protein-codierende Regionen zu verbinden, zusammenhängend und im selben Leserahmen sind. Die Kassette kann zusätzlich wenigstens ein zusätzliches Gen enthalten, um in den Organismus co-transformiert zu werden. Alternativ kann das zusätzliche Gen/können die zusätzlichen Gene auf mehreren Expressionskassetten bereitgestellt sein.
So eine Expressionskassette wird mit einer Vielfalt von Restriktionsstellen zur Insertion der interessierenden Sequenz, die unter der transkriptionellen Regulation der regulatorischen Regionen sein soll, bereitgestellt. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Marker-Gene enthalten.
Die Expressionskassette wird in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine transkriptionelle und translationale Startregion, eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz und eine transkriptionelle und translationale Terminationsregion, funktionell in Pflanzen, einschließen. Die transkriptionelle Startregion, der Promotor, kann für den Pflanzenwirt nativ oder analog oder fremd oder heterolog sein. Zusätzlich kann der Promotor die natürliche Sequenz oder alternativ eine synthetische Sequenz sein. Mit "fremd" ist gemeint, dass die transkriptionelle Startregion nicht in der nativen Pflanze gefunden wird, in welche die transkriptionelle Startregion eingebracht wird. Wie hierin verwendet, umfasst ein chimäres Gen eine codierende Sequenz, funktionell verknüpft mit einer Transkriptions-Startregion, die heterolog zu der codierenden Sequenz ist. Während es bevorzugt sein kann, die Sequenzen unter Verwendung heterologer Promotoren zu exprimieren, können die nativen Promotorsequenzen verwendet werden. Folglich wird der Phänotyp der Pflanze oder Pflanzenzelle verändert.
Die Terminationsregion kann nativ mit der transkriptionellen Startregion sein, kann nativ mit der funktionell verknüpften, interessierenden DNA-Sequenz sein oder kann von einer anderen Quelle abgeleitet sein. Günstige Terminationsregionen sind von dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens erhältlich, wie z.B. die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminationsregionen. Siehe außerdem Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141–144; Proudfoot (1991) Cell 64:671–674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141–149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261–1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151–158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891–7903; und Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627–9639.
Wo angebracht, kann das Gen/können die Gene für erhöhte Expression in der transformierten Pflanze optimiert werden. D.h., die Gene können unter Verwendung von Pflanzenbevorzugten Kodonen für verbesserte Expression synthetisiert werden. Im Fachgebiet sind Verfahren verfügbar, um Pflanzen-bevorzugte Gene zu synthetisieren. Siehe beispielsweise US-Patent Nrn. 5 380 831 und 5 436 391, und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477–498, hierin durch Referenz inkorporiert.
Zusätzliche Sequenzmodifikationen, um die Genexpression in einem zellulären Wirt zu steigern, sind bekannt. Diese schließen Eliminierung von Sequenzen, codierend störende Poly adenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellensignale, Transposon-ähnliche Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen, die schädlich für die Genexpression sein können, ein. Der G-C-Gehalt der Sequenz kann an Level angepasst werden, die für einen gegebenen zellulären Wirt Durchschnitt sind, wie berechnet durch Bezug auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden. Wenn möglich, wird die Sequenz modifiziert, um vorhergesagte sekundäre Haarnadel-mRNA-Strukturen zu vermeiden.
Die Expressionskassette kann zusätzlich 5'-Leadersequenzen in dem Expressionskassetten-Konstrukt enthalten. Solche Leadersequenzen können wirken, um die Translation zu steigern. Translations-Leader sind im Fachgebiet bekannt und schließen ein: Picornavirus-Leader, beispielsweise EMCV-Leader (Encephalomyocarditis 5'-nicht-codierende Region) (Elroy-Stein et al. (1989) PNAS USA 86:6126–6130); Potyvirus-Leader, beispielsweise TEV-Leader (Tabakätzvirus) (Allison et al. (1986); MDMV-Leader (Maisverzwergungs-Mosaikvirus, "Maize Dwarf Mosaic Virus"); Virology 154:9–20), und menschliches, die schwere Kette von Immunoglobulin bindendes, Protein (BiP, "immunoglobulin heavy-chain binding protein"), (Macejak et al. (1991) Nature 353:90–94); untranslatierten Leader von der Hüllprotein-mRNA von Luzernen-Mosaikvirus (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622–625); Tabak-Mosaikvirus-Leader (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, Hrsg. Cech (Liss, New York), S. 237–256); und chlorotisches Mais-Scheckungsvirus-Leader (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382–385). Siehe außerdem Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965–968. Andere Verfahren, die bekannt sind, die Translation zu steigern, können außerdem verwendet werden, beispielsweise Introns und dergleichen.
Beim Herstellen der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente manipuliert werden, um für die DNA-Sequenzen in der geeigneten Orientierung und, da angebracht, im geeigneten Leserahmen, zu sorgen. Diesbezüglich können Adapter oder Linker eingesetzt werden, um die DNA-Fragmente zu verbinden, oder andere Manipulationen können beteiligt sein, um für günstige Restriktionsstellen, Entfernen überflüssiger DNA, Entfernen von Restriktionsstellen oder dergleichen, zu sorgen. Für diesen Zweck können in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, Anlagern ("annealing"), Resubstitutionen, z.B. Transitionen und Transversionen, einbezogen werden.
Transformationsprotokolle sowie Protokolle zum Einbringen von Nucleotidsequenzen in Pflanzen können, abhängig von dem Typ der Pflanze oder Pflanzenzelle, d.h., Monocotyle oder Dicotyle, auf die bei der Transformation abgezielt wird, variieren. Geeignete Verfahren zum Einbringen von Nucleotidsequenzen in Pflanzenzellen und nachfolgende Insertion in das Pflanzengenom schließen ein: Mikroinjektion (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320–334), Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602–5606, Agrobacteriumvermittelte Tansformation (Townsend et al., US-Patent Nr. 5 563 055; US-Patent Nr. 5 981 840), direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717–2722), und ballistische Teilchenbeschleunigung (siehe beispielsweise Sanford et al., US-Patent Nr. 4 945 050; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und Phillips (Springer-Verlag, Berlin); und McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923–926). Siehe außerdem Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421–477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27–37 (Zwiebel); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671–674 (Sojabohne); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923–926 (Sojabohne); Finer und McMullan (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175–182 (Sojabohne); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319–324 (Sojabohne); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736–740 (Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305–4309 (Mais); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559–563 (Mais); Tomes, US-Patent Nr. 5 240 855; Buising et al., US-Patent Nrn. 5 322 783 und 5 324 646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods; Hrsg. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440–444 (Mais); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833–839 (Mais); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763–764; Bowen et al., US-Patent Nr. 5 736 369 (Getreide); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345–5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Hrsg. Chapman et al. (Longman, New York), S. 197–209 (Pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415–418 und Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560–566 (Whisker-vermittelte Transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495–1505 (Elektroporation); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250–255 und Christou und Ford (1995) Annals of Botany 75:407–413 (Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745–750 (Mais über Agrobacterium tumefaciens); von denen alle hierin durch Referenz inkorporiert sind.
Die Zellen, die transformiert worden sind, können gemäß konventioneller Wege in Pflanzen kultiviert werden. Siehe beispielsweise McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81–84. Diese Pflanzen können dann kultiviert werden und entweder mit demselben transformierten Stamm oder verschiedenen Stämmen bestäubt werden, und das resultierende Hybrid, das die konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Charakteristikums aufweist, kann identifiziert werden. Zwei oder mehrere Generationen können kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Charakteristikums stabil aufrecht erhalten wird und vererbt wird, und dann können Samen geerntet werden, um zu versichern, dass konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Charakteristikums erreicht worden ist.
Die vorliegende Erfindung kann zur Transformation einer beliebigen Pflanzenart, einschließlich, aber nicht limitiert auf, Monocotylen und Dicotylen, verwendet werden. Beispiele interessierender Pflanzen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf: Mais (Zea mays), Brassica sp. (z.B. B. napus, B. rapa, B. juncea), insbesondere jene Brassica-Arten, die als Quellen von Samenöl verwendbar sind, Luzerne (Medicago sativa), Reis (Oryza sativa), Roggen (Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Hirse (z.B. Perlenhirse (Pennisetum glaucum), Rispenhirse (Panicum miliaceum), Borstenhirse (Setaria italica), Fingerhirse (Eleusine coracana)), Sonnenblume (Helianthus annuus), Safflor (Carthamus tinctorius), Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Manihot (Manihot esculenta), Kaffee (Coffea spp.), Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Zitrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensi), Banane (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guajave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya), Cashewbaum (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Zuckerrohr (Saccharum spp.), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen und Konifären.
Gemüse schließen Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z.B. Lactuca sativa), grüne Bohnen (Phaseolus vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Lathyrus spp.) und Mitglieder der Gattung Cucumis, wie z.B. Gurke (C. sativus), Melone (C. cantalupensis) und Zuckermelone (C. melo), ein. Zierpflanzen schließen Azalee (Rhododendron spp.), Hortensie (Macrophylla hydrangea), Hibiskus (Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa spp.), Narzissen (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), Nelke (Dianthus caryophyllus), Christstern (Euphorbia pulcherrima) und Chrysantheme ein. Konifären, die beim Praktizieren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, schließen beispielsweise Kiefern, wie z.B. Weihrauchkiefer (Pinus taeda), karibische Kiefer (Pinus elliotii), Gelbkiefer (Pinus ponderosa), Drehkiefer (Pinus contorta) und Monterey-Kiefer (Pinus radiata); Douglasie (Pseudotsuga menziesii); westamerikanische Hemlock-Tanne (Tsuga canadensis); Sitka-Fichte (Picea glauca); Redwood (Sequoia sempervirens); echte Tanne, wie z.B. Weißtanne (Abies amabilis) und Balsamtanne (Abies balsamea); und Zedern, wie z.B. rote Zeder (Thuja plicata) und Alaska-Nootkaten-Zypresse (Chamaecyparis nootkatensis), ein. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Pflanzen Nutzpflanzen (beispielsweise Mais, Luzerne, Sonnenblume, Brassica, Sojabohne, Baumwolle, Saflor, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Hirse, Tabak, etc.). Stärker bevorzugt sind Mais- und Sojabohnenpflanzen, und noch stärker bevorzugt Maispflanzen.
Pflanzen von besonderem Interesse schließen Kornpflanzen, die für interessierende Samen sorgen, Ölsamenpflanzen und Leguminosen-artige Pflanzen ein. Interessierende Samen schließen Kornsamen, wie z.B. Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sorghum, Roggen, etc., ein. Ölsamenpflanzen schließen Baumwolle, Sojabohne, Saflor, Sonnenblume, Brassica, Mais, Luzerne, Palme, Kokosnuss, etc., ein. Leguminosen-artige Pflanzen schließen Bohnen und Erbsen ein. Bohnen schließen Guarpflanzen, Karube, Boxhornklee, Sojabohne, Gartenbohne, Kuhbohne, Mungbohne, Limabohne, Ackerbohne, Linsen, Kichererbse, etc., ein.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung angeführt.
EXPERIMENTELLES
Transformation und Regeneration von transgenen Pflanzen
Beispiel 1: Transformation und Regeneration von transgenen Maispflanzen
Unreife Maisembryos von Gewächshaus-Donorpflanzen werden mit einem Plasmid beschossen, das die ABI3-Sequenz, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor plus ein Plasmid, enthaltend das selektierbare Marker-Gen PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25–37), das Resistenz gegen das Herbizid Bialaphos verleiht, enthält. Die Transformation wird wie folgt durchgeführt. Alle Medienrezepte sind unten angegeben.
Präparation von Zielgewebe
Die Ähren werden in 30% Chlorox-Bleichmittel plus 0,5% Mikrodetergens 20 Minuten lang oberflächensterilisiert und zweimal mit sterilem Wasser gewaschen. Die unreifen Embryos werden ausgeschnitten und mit der Embryonalachse nach unten (Scutellum-Seite nach oben) zu 25 Embryos pro Platte 4 Stunden lang auf 560 Y-Medium platziert und dann innerhalb der 2,5 cm-Zielzone in Vorbereitung auf den Beschuss ausgerichtet.
Präparation von DNA
Ein Plasmidvektor, umfassend die ABI3-Sequenz, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, wird hergestellt. Diese Plasmid-DNA plus Plasmid-DNA, die einen selektierbaren PAT-Marker enthält, werden auf 1,1 μm (durchschnittlicher Durchmesser) Wolframkügelchen unter Verwendung eines CaCl₂-Präzipitationsverfahrens gefällt, das wie folgt lautet:

100 μl präparierte Wolframpartikel in Wasser
10 μl (1 μg) DNA in TrisEDTA-Puffer (1 μg insgesamt)
100 μl 2,5 M CaCl₂
10 μl 0,1 M Spermidin

Jedes Reagens wird der Reihe nach zu der Wolframpartikel-Suspension gegeben, während diese auf dem Multiröhrchen-Vortexer gehalten wird. Das endgültige Gemisch wird kurz Ultraschall-behandelt und unter konstantem Vortexen 10 Minuten lang inkubieren gelassen. Nach dem Präzipitationszeitraum werden die Röhrchen kurz zentrifugiert, die Flüssigkeit entfernt, es wird mit 500 ml 100% Ethanol gewaschen und 30 Sekunden lang zentrifugiert. Wiederum wird die Flüssigkeit entfernt, und 105 μl 100% Ethanol werden zu dem endgültigen Wolframpartikel-Pellet zugegeben. Für Beschuss mit der Partikelkanone werden die Wolfram/DNA-Partikel kurz Ultraschall-behandelt, und 10 μl werden auf das Zentrum jedes Makrocarriers getüpfelt und vor dem Beschuss etwa 2 Minuten lang trocknen gelassen.
Teilchen-Kanonen-Behandlung
Die Probenplatten werden bei Level #4 in der Partikelkanone #HE34-1 oder #HE34-2 beschossen. Alle Proben empfangen einen einzelnen Schuss bei 650 PSI, wobei insgesamt 10 Aliquots aus jedem Röhrchen vorbereiteter Partikel/DNA entnommen werden.
Nachfolgende Behandlung
Auf den Beschuss folgend, werden die Embryos 2 Tage lang auf 560Y-Medium gehalten, dann auf 560R-Selektionsmedium übertragen, das 3 mg/Liter Bialaphos enthält, und werden alle 2 Wochen subkultiviert. Nach etwa 10 Wochen Selektion werden selektionsresistente Kallusklone auf 288J-Medium transferiert, um Pflanzenregeneration zu initiieren. Auf somatische Embryoreifung (2–4 Wochen) folgend, werden gut entwickelte somatische Embryos auf Keimungsmedium transferiert und in den beleuchteten Kulturenraum überführt. Ungefähr 7–10 Tage später werden sich entwickelnde Pflänzchen für 7–10 Tage in 272V-hormonfreies Medium in Röhrchen transferiert, bis die Pflänzchen gut entwickelt sind. Pflanzen werden dann in Einsätze in Flachpaletten (entsprechend zu einem 2,5''-Topf) transferiert, die Topferde enthalten, und werden eine Woche lang in einer Wachstumskammer kultiviert, anschließend zusätzliche 1–2 Wochen im Gewächshaus kultiviert, dann in klassische 600-Töpfe (1,6 Gallonen) transferiert und zur Reife kultiviert. Pflanzen werden beobachtet und bewertet.
Beschuss und Kulturmedien
Beschussmedium (560Y) umfasst 4,0 g/l N6-Basalsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson's Vitamin-Mix (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin HCl, 120,0 g/l Saccharose, 1,0 mg/l 2,4-D und 2,88 g/l L-Prolin (mit D-I H₂O auf Volumen gebracht, folgend auf Einstellen auf pH 5,8 mit KOH); 2,0 g/l Gelrite (zugegeben nach Auf-Volumen-bringen mit D-I H₂O); und 8,5 mg/l Silbernitrat (zugegeben nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf Raumtemperatur). Selektionsmedium (560R) umfasst 4,0 g/l N6-Basalsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson's Vitamin-Mix (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin HCl, 30,0 g/l Saccharose und 2,0 mg/l 2,4-D (auf Volumen gebracht mit D-I H₂O, folgend auf Einstellen auf pH 5,8 mit KOH); 3,0 g Gelrite (zugegeben nach Auf-Volumen-bringen mit D-I H₂O); und 0,85 mg/l Silbernitrat und 3,0 mg/l Bialaphos (beides zugegeben nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf Raumtemperatur).
Pflanzenregenerationsmedium (288 J) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117–074), 5,0 ml/l MS Vitamin-Stammlösung (0,100 g Nikotinsäure, 0,02 g/l Thiamin HCl, 0,10 g/l Pyridoxin HCl und 0,40 g/l Glycin, auf Volumen gebracht mit "polished" D-I H₂O) (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473); 100 mg/l Myoinositol, 0,5 mg/l Zeatin, 60 g/l Saccharose und 1,0 ml/l 0,1 mM Abscisinsäure (auf Volumen gebracht mit "polished" D-I H₂O nach Einstellen auf pH 5,6); 3,0 g/l Gelrite (zugegeben nach Auf-Volumen-bringen mit D-I H₂O); und 1,0 mg/l Indolessigsäure und 3,0 mg/l Bialaphos (zugegeben nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf 60°C). Hormon-freies Medium (272V), umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117–074), 5,0 ml/l MS Vitamin-Stammlösung (0,100 g/l Nikotinsäure, 0,02 g/l Thiamin HCl, 0,10 g/l Pyridoxin HCl und 0,40 g/l Glycin, auf Volumen gebracht mit "polished" D-I H₂O), 0,1 g/l Myoinositol und 40,0 g/l Saccharose (auf-Volumen-gebracht mit "polished" D-I H₂O nach Einstellen des pH auf 5,6); und 6 g/l Bacto-Agar (zugegeben nach Auf-Volumen-bringen mit "polished" D-I H₂O), sterilisiert und auf 60°C gekühlt.
Beispiel 2: Agrobacterium-vermittelte Transformation
Für Agrobacterium-vermittelte Transformation von Mais mit einer ABI3-Sequenz, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, wird vorzugsweise das Verfahren von Zhao angewendet (US-Patent Nr. 5 981 840 und PCT-Patentveröffentlichung WO98/32326; deren Inhalte hierdurch durch Referenz inkorporiert sind). Kurz beschrieben, werden unreife Embryos aus Mais isoliert und die Embryos mit einer Suspension von Agrobacterium in Kontakt gebracht, wobei die Bakterien in der Lage sind, die ABI3-Sequenz, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, zu wenigstens einer Zelle von wenigstens einem der unreifen Embryos zu transferieren (Schritt 1: der Infektionsschritt). Bei diesem Schritt werden die unreifen Embryos vorzugsweise in eine Agrobacterium-Suspension für die Initiierung der Inokulation eingetaucht. Die Embryos werden eine Zeitlang mit dem Agrobacterium co-kultiviert (Schritt 2: der Co-Kultivierungsschritt). Vorzugsweise werden die unreifen Embryos auf den Infektionsschritt folgend auf festem Medium kultiviert. Auf diesen Co-Kultivierungszeitraum folgend, wird ein wahlweiser "Ruhe"-Schritt in Erwägung gezogen. Bei diesem Ruheschritt werden die Embryos in Gegenwart von wenigstens einem Antibiotikum, von dem bekannt ist, dass es das Wachstum von Agrobacterium inhibiert, ohne die Zugabe eines selektiven Mittels für Pflanzentransformanten inkubiert (Schritt 3: Ruheschritt). Vorzugsweise werden die unreifen Embryos auf festem Medium mit Antibiotikum, aber ohne ein selektierendes Mittel, zur Eliminierung von Agrobacterium und für eine Ruhephase für die infizierten Zellen kultiviert. Als Nächstes werden inokulierte Embryos auf Medium kultiviert, das ein selektives Mittel enthält, und wachsender transformierter Kallus wird gewonnen (Schritt 4: der Selektionsschritt). Vorzugsweise werden die unreifen Embryos auf festem Medium mit einem selektiven Mittel, resultierend in dem selektiven Wachstum transformierter Zellen, kultiviert. Der Kallus wird dann in Pflanzen regeneriert (Schritt 5: der Regenerationsschritt), und vorzugsweise werden auf selektivem Medium gewachsene Kalli auf festem Medium kultiviert, um die Pflanzen zu regenerieren.
Beispiel 3: Sojabohnenembryo-Transformation
Sojabohnenembryos werden wie folgt mit einem Plasmid beschossen, das die ABI3-Nucleotidsequenz, funktionell verknüpft mit einem frühen Embryo/Kern-Promotor, enthält. Um somatische Embryos zu induzieren, werden 3–5 mm lange Cotyledonen, präpariert von oberflächensterilisierten, unreifen Samen der Sojabohnensorte A2872, im Licht oder im Dunkeln bei 26°C auf einem geeigneten Agarmedium sechs bis zehn Wochen lang kultiviert. Somatische Embryos, die sekundäre Embryos produzieren, werden dann ausgeschnitten und in ein geeignetes flüssiges Medium platziert. Nach wiederholter Selektion auf Cluster somatischer Embryos, die sich als frühe, kugelförmig gestaffelte Embryos multiplizierten, werden die Suspensionen, wie unten beschrieben, aufrechterhalten.
Embryogene Sojabohnen-Suspensionskulturen können in 35 ml Flüssigmedium auf einem Rotationsschüttler, 150 UpM, bei 26°C mit fluoreszierenden Lichtern bei einem 16:8 Stunden Tag/Nacht-Plan beibehalten werden. Kulturen werden alle zwei Wochen durch Inokulieren von ungefähr 35 mg Gewebe in 35 ml Flüssigmedium subkultiviert.
Embryogene Sojabohnen-Suspensionskulturen können dann durch das Verfahren des Partikelkanonenbeschusses transformiert werden (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73, US-Patent Nr. 4 945 050). Ein biolistisches Du Pont PDS 1000/HE-Instrument (Heliumnachrüstung) kann für diese Transformationen verwendet werden.
Ein selektierbares Marker-Gen, das verwendet werden kann um Sojabohnen-Transformation zu ermöglichen, ist ein Transgen, zusammengesetzt aus dem 35S-Promotor von Blumenkohl-Mosaikvirus (Odell et al. (1985) Nature 313:810–812), dem Hygromycin-Phosphotransferase-Gen von Plasmid pJR225 (aus E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179-188), und der 3'-Region des Nopalinsynthase-Gens aus der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens. Die Expressionskassette, die die ABI3-Nucleotidsequenz, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, umfasst, kann als ein Restriktionsfragment isoliert werden. Dieses Fragment kann dann in eine einzigartige Restriktionsstelle des Vektors insertiert werden, der das Marker-Gen trägt.
50 μl einer 60 mg/ml Suspension von 1 μm Goldpartikeln wird versetzt mit (in Reihenfolge): 5 μl DNA (1 μg/μl), 20 μl Spermidin (0,1 M) und 50 μl CaCl₂ (2,5 M). Die Partikelzubereitung wird dann 3 Minuten lang geschüttelt, in einer "Mikrofuge" 10 Sekunden lang zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Die DNA-beschichteten Partikel werden dann einmal in 400 μl 70% Ethanol gewaschen und in 40 μl wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA/Partikel-Suspension kann dreimal für jeweils eine Sekunde lang Ultraschall-behandelt werden. Fünf Mikroliter der DNA-beschichteten Goldpartikel werden dann auf jede Makrocarrierscheibe geladen.
Ungefähr 300–400 mg einer zwei Wochen alten Suspensionskultur wird in eine leere 60 × 15 mm-Petrischale platziert, und die restliche Flüssigkeit wird mit einer Pipette von dem Gewebe entfernt. Für jedes Transformationsexperiment werden normalerweise 5–10 Gewebeplatten beschossen. Der Membranbruchdruck wird auf 1100 psi eingestellt und die Kammer auf ein Vakuum von 28 Inch Quecksilber evakuiert. Das Gewebe wird ungefähr 3,5 Inch entfernt vom Rückhalteschirm ("retaining screen") platziert und dreimal beschossen. Auf den Beschuss folgend, kann das Gewebe zweigeteilt werden und zurück in Flüssigkeit gelegt werden und, wie oben beschrieben, kultiviert werden.
Fünf bis sieben Tage nach Beschuss kann das Flüssigmedium durch frisches Medium ersetzt werden, und elf bis zwölf Tage nach Beschuss mit frischem Medium, enthaltend 50 mg/ml Hygromycin. Dieses selektive Medium kann wöchentlich erneuert werden. Sieben bis acht Wochen nach Beschuss kann grünes, transformiertes Gewebe beobachtet werden, das von untransformierten, nekrotischen, embryogenen Clustern wächst. Isoliertes grünes Gewebe wird entfernt und in individuelle Kolben inokuliert, um neue, klonal propagierte, transformierte embryogene Suspensionskulturen zu erzeugen. Jede neue Linie kann als ein unabhängiges Transformationsereignis behandelt werden. Diese Suspensionen können dann subkultiviert werden und als Cluster unreifer Embryos aufrecht erhalten werden, oder in Gesamtpflanzen durch Reifung und Keimung individueller somatischer Embryos regeneriert werden.
Beispiel 4: Sonnenblumen-Meristem-Gewebe-Transformation
Sonnenblumen-Meristem-Gewebe werden mit einer Expressionskassette, die die ABI3-Sequenz, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, enthält, wie folgt transformiert (siehe außerdem europäische Patent-Nr. EP 0 486233 , hierin durch Referenz inkorporiert, und Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant Science 103:199–207). Reifer Sonnenblumensamen (Helianthus annuus L.) wird unter Verwendung eines Einzelweizenkopf-Dreschsatzes ("single wheat-head thresher") enthülst. Samen werden 30 Minuten lang in einer 20%igen Chlorox-Bleichmittellösung oberflächensterilisiert, wobei zwei Tropfen Tween 20 pro 50 ml Lösung zugegeben werden. Die Samen werden zweimal mit sterilem, destilliertem Wasser gespült.
Gespaltene Embryonalachsen-Explantate werden durch eine Modifikation von Verfahren, beschrieben durch Schrammeijer et al. (Schrammeijer et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60) hergestellt. Samen werden, folgend auf die Oberflächensterilisierungsprozedur, 60 Minuten lang in destilliertem Wasser eingeweicht. Die Cotyledonen jedes Samens werden dann abgebrochen, wobei eine saubere Fraktur an der Ebene der Embryonalachse erzeugt wird. Folgend auf die Entfernung der Wurzelspitze, werden die Explantate zwischen den Primordialblättern longitudinal halbiert. Die beiden Hälften werden mit der geschnittenen Oberfläche nach oben auf GBA-Medium platziert, das aus Murashige und Skoog-Mineralelementen (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant. 15:473–497), Shepard's Vitaminzugaben (Shepard (1980) in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota)), 40 mg/l Adeninsulfat, 30 g/l Saccharose, 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurin (BAP), 0,25 mg/l Indol-3-essigsäure (IAA), 0,1 mg/l Gibberellinsäure (GA₃), pH 5,6 und 8 g/l Phytagar besteht.
Die Explantate werden vor Agrobacterium-Behandlung einem Mikroprojektilbeschuss unterzogen (Bidney et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:301–313). Dreißig bis vierzig Explantate werden in einem Kreis im Zentrum einer 60 X 20 mm-Platte für diese Behandlung platziert. Ungefähr 4,7 mg 1,8 mm-Wolfram-Mikroprojektilen werden in 25 ml sterilem TE-Puffer (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, und 1,5 ml-Aliquots werden pro Beschuss verwendet. Jede Platte wird zweimal durch ein bzw. einen 150 mM "Nytex"-Sieb bzw. -Schirm beschossen, die 2 cm über den Proben in einem PDS 1000^® Teilchenbeschleunigungsgerät platziert ist.
Der entschärfte Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 wird bei allen Transformationsexperimenten verwendet. Ein binärer Plasmidvektor, der die Expressionskassette umfasst, die das ABI3-Gen enthält, das funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor ist, wird in Agrobacterium-Stamm EHA105 über Gefrier-Tauen ("freeze-thawing"), wie von Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181–187 beschrieben, eingebracht. Dieses Plasmid umfasst ferner ein selektierbares Kanamycin-Marker-Gen (d.h., nptII.) Bakterien für die Pflanzentransformationsexperimente wachsen über Nacht (28°C und 100 UpM kontinuierliche Bewegung) in flüssigem YEP-Medium (10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bactopepton und 5 g/l NaCl, pH 7,0) mit den geeigneten Antibiotika, die für den Bakterienstamm und Beibehaltung von binärem Plasmid kultiviert werden. Die Suspension wird verwendet, wenn sie eine OD₆₀₀ von etwa 0,4 bis 0,8 erreicht. Die Agrobacterium-Zellen werden dann pelletiert und bei einer End-OD₆₀₀ von 0,5 in einem Inokulationsmedium resuspendiert, das aus 12,5 mM MES pH 5,7, 1 g/l NH₄Cl und 0,3 g/l MgSO₄ besteht.
Frisch beschossene Explantate werden in eine Agrobacterium-Suspension platziert, gemischt und 30 Minuten lang ungestört stehen gelassen. Die Explantate werden dann mit der geschnittenen Oberfläche nach unten auf GBA-Medium transferiert und bei 26°C und 18-Stunden-Tagen kultiviert. Nach dreitägiger Co-Kultivierung werden die Explantate auf 374B (GBA-Medium, dem Wachstumsregulatoren fehlen und mit einem reduzierten Saccharose-Level von 1%) transferiert, das mit 250 mg/l Cefotaxim und 50 mg/l Kanamycinsulfat ergänzt ist. Die Explantate werden zwei bis fünf Wochen lang auf Selektion kultiviert und dann auf frisches 374B-Medium, dem Kanamycin fehlt, für ein bis zwei Wochen fortgesetzter Entwicklung transferiert. Explantate mit differenzierenden, Antibiotika-resistenten Wachstumsgebieten, die keine Sprosse produziert haben, die zur Exzision geeignet sind, werden auf GBA-Medium, enthaltend 250 mg/l Cefotaxim für eine zweite 3-tägige Phytohormon-Behandlung, transferiert. Blattproben von grünen, Kanamycin-resistenten Sprossen werden auf Anwesenheit von NPTII hin durch ELISA und auf die Anwesenheit von Transgenexpression durch einen Assay auf eine Modulation bei der Pflanzenreaktion auf ABA untersucht.
NPTII-positive Sprossen werden auf in vitro kultivierte Pioneer^® Hybrid 6440-Sonnenblumensetzling-Veredelungsunterlage gepfropft. Oberflächensterilisierte Samen werden in 48-0-Medium (halbkonzentrierte Murashige und Skoog-Salze, 0,5% Saccharose, 0,3% Gelrite, pH 5,6) gekeimt und unter Bedingungen, beschrieben für Explantatkultur, kultiviert. Der obere Anteil des Setzlings wird entfernt, ein 1 cm vertikaler Schnitt wird in der Keimachse gemacht und der transformierte Spross in den Schnitt eingefügt. Die gesamte Gegend wird mit Parafilm eingewickelt, um den Spross zu sichern. Gepfropfte Pflanzen können, auf eine Woche in vitro-Kultur folgend, auf Erde transferiert werden. Pfröpflinge in Erde werden unter hohen Feuchtigkeitsbedingungen aufrechterhalten, gefolgt von einer langsamen Akklimatisierung an die Gewächshausumgebung. Transformierte Sektoren von T₀-Pflanzen (Eltern-Generation), die im Gewächshaus reifen, werden beispielsweise durch NPTII-ELISA von Blätterextrakten iden tifiziert, während transgene Samen, geerntet von NPTII-positiven T₀-Pflanzen, durch Analysieren auf eine Modulation bei der Pflanzenreaktion auf ABA identifiziert werden.
Beispiel 5
Transgene Maispflanzen werden durch die Verfahren aus Beispiel 1 unter Verwendung einer DNA-Konstruktion, umfassend eine Wildtyp-Vp1-Sequenz (SEQ ID NO: 1), funktionell verknüpft mit dem Oleosin-Promotor, erzeugt. Das Plasmid enthält ferner den selektierbaren Marker PAT (Wohlleben et al. (1998) Gene 70:25–37). Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden Pflanzen isoliert, die das Oleosin:Vp1-DNA-Konstrukt stabil inkorporiert aufweisen.
Maispflanzen, die eine Funktionsverlustmutation in vp1 aufweisen, werden wie in Eyster et al. (1931) Genetics 16:574–590, hierin durch Referenz inkorporiert, beschrieben, isoliert. Derartige Pflanzen werden als Pflanzen charakterisiert, die eine reduzierte Sensitivität gegen ABA aufweisen. Transgene Maispflanzen, die das Oleosin:Vp1-DNA-Konstrukt stabil inkorporiert aufweisen, werden zu der Maispflanze gekreuzt, die die vp1-Funktionsverlustmutation aufweist. Die resultierenden Nachkommen werden rückgekreuzt, um eine Pflanze zu produzieren, die den folgenden Genotyp aufweist: vp1/vp1; Oleosin:Vp1/Oleosin:Vp1. Diese Pflanze wird von den schädlichen Wirkungen von ABA im frühen Embryo isoliert sein und wird mit Vp1 bei der späten Kern/Embryo-Entwicklung versorgt sein, was den Kernen erlaubt, normal zu reifen.
Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in der Beschreibung genannt sind, sind Indikativ bezüglich des Levels desjenigen Fachmanns, den diese Erfindung betrifft. Alle Publikationen und Patentanmeldungen sind hierin in demselben Ausmaß durch Referenz inkorporiert, als wenn jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung spezifisch und individuell angezeigt wäre, durch Referenz inkorporiert zu sein.
Obwohl die vorstehende Erfindung in manchem Detail als Veranschaulichung und Beispiel zum Zwecke von Klarheit und Verständnis beschrieben worden ist, wird offensichtlich sein, dass gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Bereichs der beigefügten Ansprüche praktiziert werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Modulation der Reaktion auf Abscisinsäure (ABA) während der Samenentwicklung, Endospermentwicklung oder Samenreifung in einer Pflanze, genanntes Verfahren umfassend: das Einbringen eines DNA-Konstrukts umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, in die Pflanze durch Transformation, wobei genannter früher Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei genannte Modulation eine abnehmende Reaktion auf ABA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei genannte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, ist: a) eine Nucleotidsequenz dargelegt in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9; b) eine Nucleotidsequenz codierend ein Polypeptid dargelegt in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10; c) eine Nucleotidsequenz mit wenigstens 70% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9, wobei die Expression genannter Sequenz die Reaktion auf ABA verringert; d) eine Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9 hybridisiert, wobei die Expression genannter Nucleotidsequenz die Reaktion auf ABA verringert und genannte stringente Bedingungen Hybridisierung in 50% Formamid, 1M NaCl, 1% SDS bei 37°C und ein Waschen in 0,1 × SSC bei 60°C bis 65°C umfassen; e) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Antisense-Sequenz der Nucleotidsequenz aus a, b, c oder d; oder f) ein Nucleinsäuremolekül umfassend wenigstens 20 zusammenhängende Nucleotide aus SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 oder 9, wobei die Expression des genannten Nucleinsäuremoleküls die Reaktion auf ABA verringert.
Verfahren zur Verhinderung nachteiliger Auswirkungen von Stress auf einen sich entwickelnden Pflanzensamen, einen reifenden Pflanzensamen oder ein sich entwickelndes Endosperm, genanntes Verfahren umfassend: das Einbringen eines DNA-Konstrukts umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, in eine Pflanze durch Transformation, wobei genannter früher Kern/Embryo-Promotor heterolog zu genannter verknüpfter Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Expression genannter Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, eine Reaktion auf ABA moduliert.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei genannte Modulation eine verringerte Reaktion auf ABA ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei genannte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, wie in Anspruch 3 definiert, ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 6, wobei genannte verknüpfte Sequenz eine Antisense-Sequenz von einer Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 6, wobei genannte verknüpfte Sequenz eine mutierte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, ist, und eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus abi1 und abi2, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, wobei genannte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, einer Sequenz aus der Pflanze entspricht.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei genannte Pflanze eine Monokotyle oder eine Dikotyle ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei genannte Monokotyle ein Getreide ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei genanntes Getreide Mais ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 6, welches weiterhin das Züchten einer Pflanze, in welche genanntes DNA-Konstrukt durch Transformation eingebracht worden ist, umfasst.
Pflanze mit einem stabil eingebrachten DNA-Konstrukt, umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, wobei genannter früher Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist.
Pflanze nach Anspruch 15, wobei die Expression genannter Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, eine Reaktion auf ABA moduliert.
Pflanze nach Anspruch 16, wobei genannte Modulation eine Reaktion auf ABA verringert.
Pflanze nach Anspruch 16, wobei genannte Sequenz an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA beteiligt ist und eine codierende Sequenz ist.
Pflanze nach Anspruch 15, wobei genannte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, wie in irgendeinem der Ansprüche 3 oder 8 bis 10 definiert, ist.
Pflanze nach Anspruch 15, wobei genanntes DNA-Konstrukt stabil in das Genom der Pflanze integriert ist.
Pflanzenzelle mit einem stabil eingebrachten DNA-Konstrukt, umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem frühen Kern/Embryo-Promotor, wobei genannter früher Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 21, wobei die Expression der genannten Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, eine Reaktion auf ABA moduliert.
Pflanzenzelle nach Anspruch 22, wobei genannte Modulation eine Reaktion auf ABA verringert.
Pflanzenzelle nach Anspruch 21, wobei genannte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, eine codierende Sequenz ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 21, worin genannte Sequenz beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, wie in irgendeinem der Ansprüche 3 oder 8 bis 10 definiert, ist.
Verfahren zur Verhinderung nachteiliger Auswirkungen von Stress auf einen sich entwickelnden Pflanzensamen, einen reifenden Pflanzensamen oder ein sich entwickelndes Endosperm, genanntes Verfahren umfassend: das Einbringen eines DNA-Konstrukts umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem späten Kern/Embryo-Promotor, in eine Pflanze durch Transformation, wobei die Pflanze eine Funktionsverlustmutation für die genannte Sequenz beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA aufweist, wobei genannter später Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 26, welches weiterhin das Züchten der Pflanze, in welche das genannte DNA-Konstrukt durch Transformation eingebracht worden ist, mit einer zweiten Pflanze, die eine Funktionsverlustmutation für die genannte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, aufweist, und die Isolation der Abkömmlinge umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei genannte Modulation eine abnehmende Reaktion auf ABA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei genannte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, ist. a) eine Nucleotidsequenz dargelegt in SEQ ID NO: 1 oder 7; b) eine Nucleotidsequenz codierend ein Polypeptid dargelegt in SEQ ID NO: 2 oder 8; c) eine Nucleotidsequenz mit wenigstens 70% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1 oder 7; und wobei die genannte Nucleotidsequenz mit wenigstens 70% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1 ein Polypeptid mit VP1-Aktivität codiert und genannte Nucleotidsequenz mit wenigstens 70% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 7 ein Polypeptid mit ABI3-Aktivität codiert; d) eine Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement von SEQ ID NO: 1 oder 7 hybridisiert, wobei genannte Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, ein Polypeptid mit VP1-Aktivität codiert und genannte Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement von SEQ ID NO: 7 hybridisiert, ein Polypeptid mit ABI3-Aktivität codiert, und genannte stringente Bedingungen Hybridisierung in 50% Formamid, 1M NaCl, 1% SDS bei 37°C und ein Waschen in 0,1 × SSC bei 60°C bis 65°C umfassen; oder e) ein Nucleinsäuremolekül umfassend wenigstens 20 zusammenhängende Nucleotide aus SEQ ID NO: 1 oder 7, wobei genanntes Nucleinsäuremolekül mit wenigstens 20 zusammenhängenden Nucleotiden aus SEQ ID NO: 1 ein Polypeptid mit VP1-Aktivität codiert und genanntes Nucleinsäuremolekül mit wenigstens 20 zusammenhängenden Nucleotiden aus SEQ ID NO: 7 ein Polypeptid mit ABI3-Aktivität codiert.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 26 bis 29, wobei genannter später Kern/Embryo-Promotor ein Oleosin-Promotor ist.
Pflanze mit einem stabil eingebrachten DNA-Konstrukt, umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem späten Kern/Embryo-Promotor, wobei genannter späterer Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist.
Pflanze nach Anspruch 31, weiterhin umfassend eine Funktionsverlustmutation in einer endogenen Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA.
Pflanze nach Anspruch 32, wobei genannte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, wie in Anspruch 29 definiert, ist.
Pflanze nach irgendeinem der Ansprüche 31 bis 33, wobei genannter später Kern/Embryo-Promotor ein Oleosin-Promotor ist.
Pflanzenzelle mit einem stabil eingebrachten DNA-Konstrukt umfassend eine Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, funktionell verknüpft mit einem späten Kern/Embryo-Promotor, wobei genannter später Kern/Embryo-Promotor heterolog zu der genannten verknüpften Sequenz ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 35, weiterhin umfassend eine Funktionsverlustmutation in einer endogenen Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA.
Pflanzenzelle nach Anspruch 35, wobei genannte Sequenz, beteiligt an der Perzeption und Signaltransduktion von ABA, wie in Anspruch 29 definiert, ist.
Pflanze nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 20 oder 31 bis 34, wobei genannte Pflanze eine Monokotyle oder eine Dikotyle ist.
Pflanze nach Anspruch 38, wobei genannte Monokotyle Mais ist.
Transformierter Samen der Pflanze nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 20, 31 bis 34, 38 oder 39.
Transformierte Abkömmlinge der Pflanze nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 20, 31 bis 34, 38 oder 39.
Transformierte Pflanzenzelle nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 25 oder 35 bis 37, wobei genannte Pflanzenzelle von einer Monokotyle oder einer Dikotyle ist.
Transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 42, wobei genannte Monokotyle Mais ist.