ES2236005T3 - Modulacion de acido abscisico. - Google Patents
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Abstract
Un método para modular una respuesta al ácido abscísico (ABA) durante el desarrollo de la semilla, desarrollo del endospermo o maduración de la semilla en una planta, comprendiendo dicho método: introducir una construcción de ADN que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión en dicha planta por transformación, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida.
Description
Modulación de ácido abscísico.
La presente invención se refiere a métodos para
la modificación genética de plantas, en particular para modular la
respuesta de las plantas al ácido abscísico.
El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona que
tiene un papel regulador esencial en varios procesos fisiológicos.
La fitohormona está implicada en el desarrollo embrionario, el
letargo de la semilla, la transpiración y la adaptación al estrés
medioambiental. El ABA regula muchos aspectos agronómicamente
importantes del desarrollo de la planta incluyendo la síntesis de
proteínas y lípidos de almacenamiento en la semilla así como la
regulación del cierre de los estomas. El análisis de los promotores
que responden a ABA reveló una diversidad de elementos reguladores
de actuación cis potenciales.
Se conocen mutaciones en la biosíntesis de ABA en
varias especies de plantas. Véase, por ejemplo, Leung y Giraudat
(1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
49:199-222, y las referencias allí citadas.
En Arabidopsis, se han identificado varios loci de
Arabidopsis insensibles a ácidos genéticamente
diferenciados. Estos mutantes se seleccionaron basándose en la
capacidad de las semillas para germinar en presencia de
concentraciones inhibidoras de ABA. También se ha demostrado que
las mutaciones afectan a varios aspectos adicionales del desarrollo
de las semillas, incluyendo la acumulación de proteínas y lípidos
de almacenamiento, degradación de la clorofila y la tolerancia a la
desecación.
Hasta la fecha, se han caracterizado en plantas
numerosos mutantes y genes. Se han clonado cinco loci
mutacionalmente identificados que responden a ABA. Estos
representan tres clases de proteínas. Las clases incluyen dos
reguladores de la transcripción ortólogos del maíz (Viviparous
1-Vp1) y 3 insensible a ABA de Arabidopsis
(ABI3), dos miembros muy homólogos de la familia de la proteína
fosfatasa 2C, y una farnesil transferasa de Arabidopsis.
Véase, por ejemplo, McCarty et al. (1991) Cell
66:895-905; Giraudat et al. (1992)
Plant Cell 4:1251-1261; Leung et al.
(1994) Science 264:1448-1452 ; Leung et
al. (1997) Plant Cell 9:759-771; y
Cuither et al. (1996) Science
273:1239-1241.
Durante la fase de maduración del desarrollo de
la semilla, el embrión permanece quiescente en tejidos destinados a
permanecer viables y la semilla seca adquiere tolerancia a la
desecación. En maíz y otras gramíneas, esto incluye las células de
la capa de aleurona del endospermo de la semilla. Los mutantes
vivíparos del maíz tienen bloqueado el programa de maduración. De
esta manera, el embrión mutante entra de forma precoz en el
desarrollo de la plántula mientras está unido a la planta madre.
Los nueve loci vivíparos caracterizados afectan a las primeras
etapas de la biosíntesis de carotenoides y ácido abscísico. Los
embriones vp1 muestran una sensibilidad reducida a ABA en cultivo.
Se ha sugerido que el Vp1 inicial puede codificar un factor
implicado en la percepción de ABA.
A nivel molecular, la maduración embrionaria se
asocia con una amplia serie de activación de genes. Muchos de los
genes expresados está regulados por la hormona ABA. Sin embargo, en
general se desconocen los mecanismos moleculares de la acción de
ABA.
El control del crecimiento mediado por ABA es una
respuesta fundamental de las plantas a condiciones medioambientales
adversas. Como se sabe poco sobre el mecanismo molecular del
control del crecimiento mediado por ABA, se necesitan métodos para
modular la respuesta de las plata a ABA, particularmente para
incrementar el rendimiento.
Se proporcionan composiciones y métodos para
aumentar el rendimiento en plantas, particularmente en semillas de
plantas. Los métodos implican la modulación de la percepción del
ácido abscísico (ABA) y la transducción de señales en semillas en
desarrollo. Los métodos son útiles para proteger a las plantas
contra los efectos dañinos/perjudiciales del estrés y de las
condiciones medioambientales adversas. Las composiciones comprenden
construcciones genéticas de las que se sabe que afectan a la
sensibilidad a ABA de una planta o una célula vegetal. Son de
particular interés las secuencias asociadas a ABA. Estas secuencias
incluyen mutantes, fragmentos y variantes de los mismos, así como
secuencias de nucleótidos antisentido, para genes y mutantes
implicados en la percepción y traducción de señales de ABA. Las
secuencias de ADN pueden proporcionarse en construcciones para
especificidad temporal, de desarrollo y de tejidos.
Las composiciones son útiles en métodos para
aumentar el rendimiento en plantas en condiciones de estrés,
particularmente estrés abiótico. De esta forma, se anulan los
efectos perjudiciales del ABA sobre el crecimiento de la espiga y
del grano.
Adicionalmente se proporcionan plantas
transformadas, células vegetales, tejidos y semillas.
De acuerdo con la invención se proporciona un
método para modular una respuesta al ácido abscísico (ABA) durante
el desarrollo de la semilla, el desarrollo del endospermo o la
maduración de la semilla en una planta, comprendiendo dicho método:
introducir una construcción de ADN que comprende una secuencia
implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida
de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión dentro de
dicha planta por transformación, donde dicho promotor temprano de
grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia
implicada en la percepción y transducción de señales de ABA.
La invención también proporciona:
- un método para prevenir los efectos
perjudiciales del estrés sobre una semilla vegetal en desarrollo,
una semilla vegetal en maduración o un endospermo en desarrollo,
comprendiendo dicho método: introducir una construcción de ADN que
comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de
grano/embrión en una planta por transformación, donde dicho
promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a
dicha secuencia unida;
- una planta que tiene una construcción de ADN
introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada
en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma
operativa a un promotor temprano de grano/embrión, donde dicho
promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a
dicha secuencia unida;
- una célula vegetal que tiene una construcción
de ADN introducida de forma estable que comprende una secuencia
implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida
de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión, donde
dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto
a dicha secuencia unida;
- un método para prevenir los efectos
perjudiciales del estrés sobre una semilla vegetal en desarrollo,
una semilla vegetal en maduración o un endospermo en desarrollo,
comprendiendo dicho método:
- introducir una construcción de ADN que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor tardío de grano/embrión en una planta, donde la planta tiene una pérdida de función por mutación de dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA, donde dicho promotor tardío de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida;
- una planta que tiene una construcción de ADN
introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada
en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma
operativa a un promotor tardío de grano/embrión, donde dicho
promotor tardío de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha
secuencia unida;
- una célula vegetal que tiene una construcción
de ADN introducida de forma estable que comprende una secuencia
implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida
de forma operativa a un promotor tardío de grano/embrión, donde
dicho promotor tardío de grano/embrión es heterólogo con respecto a
dicha secuencia unida;
- la semilla transformada de una planta de la
invención; y
- la progenie transformada de una planta de la
invención.
Se proporcionan métodos para modular la respuesta
temprana de una planta al ácido abscísico (ABA), especialmente para
aislar el rendimiento de cultivo anulando los efectos perjudiciales
del ABA sobre el desarrollo de la semilla. En especial, la
invención proporciona composiciones y métodos para evitar la
señalización o la función de ABA. Las composiciones y métodos son
útiles para evitar la función de ABA en un tejido y son una manera
preferida en relación con el desarrollo para aislar el crecimiento
de tejido reproductor femenino de las condiciones de estrés y
medioambientalmente adversas.
Para los fines de la invención "respuesta
temprana en plantas" se entiende el desarrollo de tejido
reproductor, desarrollo de la semilla, desarrollo del endospermo, y
maduración de la semilla. El ABA está implicado en muchos otros
procesos fisiológicos y de desarrollo a lo largo del ciclo vital de
las plantas, incluyendo el letargo de la semilla, la adaptación a
estreses medioambientales abióticos, tales como el frío, sequía,
salinidad, etc.; acumulación de reservas nutritivas, adquisición de
tolerancia a la desecación, cierre de los estomas y similares. En
las fases tempranas, la fitohormona ABA regula la maduración de la
semilla y el mantenimiento del letargo del embrión. Después, en la
etapa de inicio de la ontogénesis, ABA media varias respuestas
adaptativas en relación con aspectos ambientales tales como la
desecación, frío, estrés salino y otros estreses, y actúa como un
regulador del crecimiento negativo. Generalmente, ABA impone un
control del crecimiento bimodal regulando el potencial de la célula
a crecer, posiblemente por control de la turgencia, e induciendo la
parada del crecimiento mitótico en las plantas en concordancia con
su función como regulador negativo del crecimiento.
La invención implica el control o modulación de
la respuesta temprana de la planta a señal de ABA. Por
"modulación" se entiende la regulación positiva o regulación
negativa de la respuesta de la planta a ABA. Para los fines de la
invención, generalmente la modulación es regulación negativa por la
interrupción de la síntesis de ABA o la interrupción de la
percepción y transducción de señales de ABA. Se reconoce que no es
práctica la interrupción total de la función de ABA en las plantas,
ya que ABA lleva a cabo muchas funciones útiles para el desarrollo
de las plantas. Para los fines de la invención, generalmente es
preferible impedir los efectos de ABA en el lugar final del efecto,
es decir, las espigas y los granos en el caso de cultivo de
cereales. De esta forma, la interrupción de la percepción de ABA o
de la transducción de su señal proporciona una estrategia eficaz
para aislar el crecimiento del tejido reproductor femenino del
cereal de las condiciones de estrés.
Las condiciones de estrés medioambiental que
siguen a la fertilización inhiben los acontecimientos tempranos en
el establecimiento de la capacidad de perforación y puede disminuir
el rendimiento. En los cereales, por ejemplo, el endospermo es la
principal fuente de reservas almacenadas dentro de la semilla
madura. La capacidad de almacenamiento se establece durante una
etapa temprana del desarrollo de la semilla. Si se reconoce la
implicación de ABA en respuestas tempranas de las plantas al
estrés, la presente invención está dirigida a anular los efectos
perjudiciales del ABA sobre el desarrollo de la semilla y a aumentar
la naturaleza y cantidad de semillas y productos de semilla,
especialmente cereales y granos. Véase Mambelli y Setter (1998)
Physiologia Plantarum 104:266-72 y Tuberosa
et al. (1998) Theor. Appli. Genet
744-55.
Como se ha indicado, la invención comprende
introducir secuencias que modulan la percepción y transducción de
señales de ABA dentro de una planta diana. Por "secuencias que
modulan la percepción y transducción de señales de ABA" y
"secuencias implicadas en la percepción y transducción de señales
de ABA" se entienden mutantes y genes que interrumpen la
síntesis de ABA o su percepción y transducción de señales. Estos
mutantes, genes y secuencias que interrumpen la síntesis de ABA o
su percepción o transducción de señales también se denominan aquí
"secuencias asociadas a ABA". Dichas secuencias incluyen, pero
no de forma limitante, mutantes insensibles o hipersensibles a ABA
o secuencias antisentido correspondientes a los genes mutantes o de
tipo silvestre. Los mutantes ABA son conocidos en la técnica e
incluyen abi1-5,
era1-3 (Cutler et al. (1996)
Science 273:1239-41), gca1/8 (Benning
et al. (1996) Proc. Workshop Abscisic Acid Signal
Transduction in Arabidopsis, Madrid, p. 34), axr2
(Wilson et al. (1990) Mol. Gen. Genet.
222:377-83), jar1 (Staswick et
al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:6837-40), jin4 (Berger et al.
(1996) Plant Physiol. 111:525-31),
bri1 (Clouse et al. (1996) Plant Physiol.
111:671-78), sax(Arabidopsis
thaliana); vp1 (McCarty et al. (1991) Cell
66:895-905 y Robichaud et al. (1986)
J. Plant Physiol. 126:235-42), y rea1
(Sturaro et al. (1996) J. Exp. Bot.
47:755-62) (Zea mays); cool
(Raskin et al. (1988) Planta
173:73-78) (Hordeum vulgare); aba1
(Bitoun et al. (1990) Mol. Gen. Genet.
220:234-39 y Leydecker et al. (1995)
Plant Physiol. 107:1427-31) (Nicotiana
plumbaginifolia); y similares. En la práctica de la invención
pueden usarse estos y otros mutantes asociados a ABA.
Por "correspondiente" a un gen o secuencia
se entiende que la secuencia es capaz de hibridar con el gen o la
secuencia en la extensión necesaria para interrumpir la
transcripción. Se reconoce que dependiendo de la secuencia asociada
a ABA utilizada en la invención, puede preferirse la secuencia
codificante o la secuencia antisentido. Sin embargo, la secuencia
codificante también puede usarse para co-suprimir
la expresión del gen diana. Por ejemplo, una estrategia incluye la
expresión de genes mutantes, tales como abi1 o abi2,
con un promotor temprano de grano/embrión para interrumpir de forma
dominante la acción de ABA en tejidos durante etapas tempranas.
Dicha estrategia no alterará la función posterior de ABA requerida
en la maduración de la semilla. Como alternativa, los alelos de
tipo silvestre de genes tales como Vp1 pueden regularse de forma
negativa por co-supresión o estrategias antisentido
para evitar la acción de ABA. En este último ejemplo, puede usarse
un promotor temprano de grano/embrión para dirigir la expresión de
una secuencia codificante para Vp1 (para
co-suprimir) o dirigir la expresión de una secuencia
antisentido para Vp1. Un tercer ejemplo incluye la transformación
de una planta con un promotor del desarrollo del grano de periodo
tardío que dirige a la secuencia de Vp1 de tipo silvestre. Después,
esta planta transformada puede cruzarse con una planta mutante
vp1. En este ejemplo, la incapacidad del mutante vp1
para ser inducido por ABA permite aislar los granos tempranos de
los efectos perjudiciales. Al mismo tiempo, la construcción de ADN
proporciona granos con capacidad de madurar normalmente. De esta
manera, como se describe más adelante de forma más detallada, se
dispone de varios genes diana candidatos para acoplarse con
promotores con patrones de expresión limitados para proporcionar
una mayor estabilidad de rendimiento frente a estrés abiótico.
El gen viviparous-1 (Vp1) del
maíz se requiere para la expresión del programa de maduración en el
desarrollo de la semilla. Vp1 es un nuevo factor de transcripción
posiblemente implicado en la potenciación de una respuesta hormonal
específica de la semilla. Las secuencias de ácido nucleico y de
aminoácidos de Vp1 se presentan en las SEC ID Nº: 1 y 2. Los
mutantes vivíparos del maíz tienen bloqueado el programa de
maduración. Como resultado, el embrión mutante se transforma
precozmente en plántula mientras está unido a la planta madre. Se
han identificado varios mutantes vivíparos. Otras características de
un mutante vp1 que ha perdido su función incluyen, por
ejemplo, un fenotipo insensible a ABA (es decir, una sensibilidad
reducida a la inhibición de la germinación por ABA exógeno en
cultivo) y/o un descenso en la activación del promotor Em.
Está bien dentro de la experiencia en la técnica identificar
mutaciones de Vp1 con pérdida de función que son útiles en los
métodos de la presente invención. Por ejemplo, Hill et al.
((1996) Journal Biological Chemistry 7:3366) han
identificado una función para la región ácida
NH_{2}-terminal y el dominio BR1 altamente
conservado de VP1 como esenciales para la función de VP1. Se
conocen otros mutantes vp1. Véase, por ejemplo, Neill et
al. (1986) Planta 169:87-96; McCarthy
et al. (1991) Cell 66:895-905;
Ribichaud et al. (1980) Dev. Genet.
1:325-330; Robichaud y Sussex (1987) Plant
Physiol. 130:181-188; Robichaud et
al. (1986) J. Plant. Physiol. 126:235-42
; McCarthy et al. (1990) Physiol. Plant
81:267-72; y Eyster et al. (1931)
Genetics 16:457-590; todos ellos
incorporados aquí como referencia.
También se dispone de mutantes insensibles a ABA
de Arabidopsis, ABI. Tales mutantes tienen defectos
pleiotrópicos en el desarrollo de semillas, incluyendo menor
sensibilidad a la inhibición por el ABA de la germinación en una
expresión alterada de genes específicos de semillas. Véase
Finkelstein et al. (1998) The Plant Cell
10:1043-1045; Leung et al. (1994)
Science 264:1448-1452; Leung (1997) Plant
Cell 9:759-711; Giraudat et al. (1992)
Plant Cell 4:1251-1261; Myer et al.
(1994) Science 264:1452-1455; Koornneef
et al. (1989) Plant Physiol.
90:463-469; Nambara et al. (1992)
Plant J. 2:435-441; Finkelstein y Somerville
(1990) Plant Physiol. 94:1172-1179; Leung y
Giraudat (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
49:199-222; Robinson y Hill (1999) Plant,
Cell and Environment 22:117-123; y Rodríguez
et al. (1998) FEBS Letters
421:185-190, y las referencias citadas en estos
documentos, incorporándose todos ellos como referencia. Además, en
las SEC ID Nº: 3-10 se indican las secuencias de
ácido nucleico y de aminoácidos de ABI1, ABI2, ABI3 y ABI4 de tipo
silvestre. Otros mutantes asociados con ABA incluyen bri1 de
Arabidopsis thaliana, cuya secuencia puede encontrarse en el
Nº de acceso del Genbank AF017056 y Li et al. (1997) Cell
90:929-939, incorporándose ambos como referencia en
este documento.
Un mutante abi de interés incluye, por
ejemplo, abi1. abi1 es una mutación dominante en la
parte estructural del gen ABI1. La mutación se ha caracterizado y
comprende una transición de bases nucleotídicas de guanina a
adenina y cambia la secuencia de ADN de GGC a GAC, haciendo de esta
manera que el resto de glicina de tipo silvestre en la posición de
aminoácidos 180 de la SEC ID Nº: 3 se reemplace por ácido aspártico
(Meyer et al. (1994) Science
264:1452-1455). abi2 es otra mutación
dominante de interés en los métodos de la invención. abi2 se
caracteriza por una transición de GGC a GAC que conduce al
reemplazo del resto de Gly en la posición de aminoácidos 168 de la
SEC ID Nº: 6 por Asp (Rodríguez et al. (1998) FEBS Letters
421:18-190). Está bien dentro de la experiencia
en la técnica identificar otras mutaciones (tanto dominantes como
recesivas) en otras secuencias asociadas a ABA que sean útiles en
los métodos de la presente invención.
Tales mutantes indicados anteriormente se
denominan "mutantes asociados a ABA". Por "mutantes
asociados a ABA" se entienden genes y secuencias que rompen la
señalización y/o percepción de ABA en una planta. Utilizando las
secuencias anteriores, pueden aislarse secuencias relacionas de
otras plantas, incluyendo cereales. En algunos casos, puede ser
beneficioso usar la secuencia asociada a ABA que corresponde a una
secuencia de la planta diana de interés. Por ejemplo, para uso en
maíz, puede preferirse el homólogo de maíz de la secuencia asociada
con ABA, o una secuencia correspondiente al homólogo de maíz.
La invención utiliza las secuencias asociadas con
ABA para controlar la respuesta de la planta a ABA. Generalmente,
será beneficioso bloquear la señalización o percepción de ABA para
prevenir una pérdida de rendimiento. Utilizando las secuencias
asociadas con ABA, secuencias codificantes y secuencias
antisentido, puede controlarse la expresión y percepción de ABA en
una planta. Como se describe con más detalle mas adelante, tales
secuencias pueden introducirse en las plantas de interés por
métodos recombinantes.
Las secuencias de nucleótidos de la invención
pueden usarse para aislar secuencias correspondientes de otros
organismos, particularmente otras plantas y más particularmente
cereales. De esta manera, pueden usarse métodos tales como PCR,
hibridación y similares para identificar tales secuencias basándose
en su homología de secuencia con las secuencias asociadas con ABA
conocidas en la técnica. Pueden aislarse secuencias basándose en su
identidad de secuencia con la secuencia asociada a ABA entera o
fragmentos de la misma.
En una estrategia de PCR, pueden diseñarse
cebadores oligonucleotídicos para uso en reacciones de PCR para
amplificar secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o
ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. En la técnica
se conocen generalmente métodos para diseñar cebadores de PCR y de
clonación por PCR y se describen en Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Véase también Innis
et al., eds (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds.
(1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis y
Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New
York). Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero sin limitación,
métodos que usan cebadores por parejas, cebadores anidados,
cebadores monoespecíficos, cebadores degenerados, cebadores con
especificidad génica, cebadores con especificidad de vector,
cebadores parcialmente desacoplados y similares.
En las técnicas de hibridación, todo parte de una
secuencia de nucleótidos conocida se usa como sonda que hibrida
selectivamente con otras secuencias de nucleótidos correspondientes
presentes en una población de fragmentos de ADN genómico o
fragmentos de ANDc clonados (es decir bibliotecas genómicas o de
ADNc) procedentes de una planta elegida. Las sondas de hibridación
pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc,
fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden marcarse con
un grupo detectable tal como ^{32}P o cualquier otro marcador
detectable. De esta manera, por ejemplo, pueden obtenerse sondas
para hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basándose en
las secuencias asociadas con ABA de la invención. En la técnica se
conocen generalmente métodos para la preparación de sondas para
hibridación y para la construcción de ADNc y bibliotecas genómicas
y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Plainview, New York).
Por ejemplo, puede usarse una secuencia asociada
con ABA entera, o una o mas porciones de la misma, como sonda capaz
de hibridar específicamente con secuencias y ARN mensajeros
correspondientes. Para conseguir una hibridación específica en una
diversidad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son
únicas entre las secuencias de interés y que, preferiblemente,
tienen una longitud de al menos aproximadamente 10 nucleótidos, aún
mas preferiblemente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos.
Tales sondas pueden usarse para amplificar secuencias
correspondientes a partir de una planta elegida por PCR. Esta
técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales
a partir de una planta deseada o como un ensayo de diagnóstico para
determinar la presencia de secuencias codificantes en una planta.
Las técnicas de hibridación incluyen selección de hibridación de
bibliotecas de ADN cultivadas (placas o colonias; véase, por
ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Plainview, New York).
La hibridación de tales secuencias puede
realizarse en condiciones rigurosas. Por "condiciones
rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" se
entienden condiciones en las cuales una sonda hibridará con su
secuencia diana en un grado detectablemente mayor que otras
secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces mayor con respecto al
nivel de fondo). Las condiciones rigurosas son dependientes de la
secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias.
Controlando la rigurosidad de la hibridación y/o las condiciones de
lavado, pueden identificarse secuencias diana que son
complementarias al 100% con la sonda (sondeo homólogo). Como
alternativa, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para
permitir algún desacoplamiento en las secuencias de forma que se
detecten grados menores de similitud (sondeo heterólogo).
Generalmente, una sonda tiene una longitud menor de aproximadamente
1000 nucleótidos, preferiblemente menor de 500 nucleótidos.
Típicamente, las condiciones rigurosas serán
aquellas en las que la concentración de sal sea menor que una
concentración de ion Na de aproximadamente 1,5 M, típicamente una
concentración de ion de Na de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras
sales) a un pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura es de al menos
aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50
nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas
(por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). La duración de la
hibridación generalmente es menor de aproximadamente 24 horas,
normalmente de aproximadamente 4 a 12. También pueden conseguirse
condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores
tales como formamida. Las condiciones de baja rigurosidad
ilustrativas incluyen hibridación con una solución tampón de
formamida al 30-35%, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato
sódico) al 1% a 37ºC y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SCC = NaCl 3,0
M/citrato trisódico 0,3 M) a una temperatura de 50 a 55ºC. Las
condiciones de rigurosidad moderada ilustrativas incluyen
hibridación en formamida al 40-45%, NaCl 1,0 M, SDS
al 1% a 37ºC y un lavado en 0,5X a 1X SSC a
55-60ºC. Las condiciones de alta rigurosidad
ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS
al 1% a 37ºC y un lavado en 0,1X SSC a una temperatura de 60 a
65ºC.
La especificidad es típicamente la función de los
lavados después de la hibridación, siendo los factores críticos la
resistencia iónica y la temperatura de la solución final de lavado.
Para híbridos de ADN-ADN, la T_{m} puede
aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984)
Anal. Biochem. 138:267-284: T_{m} = 81,5ºC
+ 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; donde M es la
molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de
nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el
porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la
longitud del híbrido en pares de bases. La T_{m} es la
temperatura (con una resistencia iónica definida y un pH) a la que
un 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda
ajustada perfectamente. La T_{m} se reduce en aproximadamente 1ºC
para cada 1% de desacoplamiento; de esta manera, la T_{m}, y la
hibridación y/o las condiciones de lavado pueden ajustarse para
hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se
buscan secuencias con una identidad = 90%, la T_{m} puede
reducirse 10ºC. Generalmente, se seleccionan condiciones rigurosas
de manera que sean aproximadamente 5ºC menores que el punto de
fusión térmica (T_{m}) para la secuencia específica y su
complementaria a una intensidad iónica y un valor de pH definidos.
Sin embargo, las condiciones muy rigurosas pueden utilizar una
hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4ºC menos que el punto de fusión
térmica (T_{m}); las condiciones moderadamente rigurosas pueden
utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10ºC menos que
el punto de fusión térmica (T_{m}); las condiciones de baja
rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13,
14, 15 o 20ºC menos que el punto de fusión térmica (T_{m}).
Usando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y
la T_{m} deseada, los especialistas habituales entenderán que se
describen intrínsecamente las variaciones en la rigurosidad de la
hibridación y/o soluciones de lavado. Si el grado deseado de
desacoplamiento produce una T_{m} de menos de 45ºC (solución
acuosa) o 32ºC (solución de formamida), se prefiere aumentar la
concentración de SSC de forma que pueda usarse una temperatura
superior. En Tijssen (1993) Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization
with Nucleic Acid Probes, Parte I Capítulo 2 (Elsevier, New
York); y Ausubel et al., eds (1995) Current Protocols in
Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and
Wiley-Interscience, New York) puede encontrarse una
guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos. Véase
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
New York).
De esta manera, la presente invención incluye las
"secuencias asociadas a ABA correspondientes" aisladas que
modulan la respuesta de las plantas a ABA y que hibridan en
condiciones rigurosas con las secuencias asociadas con ABA descritas
en este documento, o con fragmentos de las mismas. Tales secuencias
tendrán una homología de al menos aproximadamente un 40% a un 50%,
una homología de aproximadamente un 60%, 65% o 70%, e incluso una
homología de al menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor con las secuencias
descritas. Es decir, la identidad de secuencia de las secuencias
puede variar, compartiendo una identidad de secuencia de al menos
aproximadamente un 40% a un 50%, de aproximadamente un 60%, 65% o
70%, e incluso al menos de aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más.
Las secuencias asociadas con ABA de la invención
pueden utilizarse con promotores específicos de tejidos o del
desarrollo para alterar la función de ABA en un tejido o de una
manera específica para el desarrollo. Los promotores de interés
particular incluyen promotores preferidos para semillas,
particularmente promotores tempranos de grano/embrión y promotores
tardíos de grano/embrión.
El desarrollo del grano después de la
polinización se divide en aproximadamente 3 fases primarias. La
fase de retraso del crecimiento del grano se produce de
aproximadamente 0 a 10-12 días después de la
polinización. Durante esta fase, el grano no crece
significativamente en masa, sino que más bien se están realizando
acontecimientos bastante importantes que determinarán la vitalidad
del grano (es decir, el número de células). La fase lineal de
relleno del grano se produce de aproximadamente
10-12 a aproximadamente 40 DAP (días después de la
polinización). Durante esta fase de desarrollo del grano, el grano
alcanza casi toda su masa final y se producen diversos productos de
almacenamiento (es decir, almidón, proteína, aceite). Finalmente,
se produce la fase de maduración desde aproximadamente 40 DAP hasta
la recolección. Durante esta fase del desarrollo del grano, el
grano se vuelve quiescente y comienza a secarse en la preparación
durante un largo periodo de letargo antes de la germinación. Como se
define en este documento, los "promotores tempranos de
grano/embrión" son promotores que están durante la primera fase
del desarrollo (es decir, de aproximadamente 0 a aproximadamente 12
DAP). Los "promotores tardíos de grano/embrión", como se
define en este documento, están presentes de aproximadamente 12 DAP
hasta la maduración. La elección del promotor dependerá de la
secuencia asociada con ABA utilizada.
Los promotores tempranos de grano/embrión
incluyen, por ejemplo, cim1, un promotor específico de grano entero
y de polen que es activo 5 DAP. Véase, por ejemplo, el documento WO
00/11177, que se incorpora en este documento como referencia. Otros
promotores tempranos de grano/embrión incluyen los promotores
preferidos de semilla end1, que es activo 7-10 DAP,
y end2, que es activo 9-14 DAP en la semilla entera
y activo 10 DAP en el endospermo y el pericarpio. Véase, por
ejemplo, el documento WO 00/12733, incorporado en este documento
como referencia. Otros promotores tempranos de grano/embrión que
encuentran uso en los métodos de la presente invención incluyen el
promotor preferido de semilla lpt2 (SEC ID Nº: 13) que es activo de
6 a 24 DAP (Patente de Estados Unidos Nº 5.525.716, incorporada en
este documento como referencia).
Tales promotores tempranos de grano/embrión
pueden usarse con genes o mutantes en la ruta de
percepción/trans-
ducción de señales para ABA. De esta manera, ciertos genes mutantes tales como abi1 o abi2 unidos operativamente a un promotor temprano de grano/embrión alterarían de manera dominante la acción de ABA en tejidos antes de la última función de ABA requerida en la maduración de las semillas. Como alternativa, un promotor temprano de grano/embrión puede unirse operativamente a una secuencia de nucleótidos de tipo silvestre (cosupresión) o antisentido de una secuencia asociada con ABA. El promotor temprano de grano/embrión se utilizaría para alterar la acción de ABA en tejidos antes de la maduración de la semilla.
ducción de señales para ABA. De esta manera, ciertos genes mutantes tales como abi1 o abi2 unidos operativamente a un promotor temprano de grano/embrión alterarían de manera dominante la acción de ABA en tejidos antes de la última función de ABA requerida en la maduración de las semillas. Como alternativa, un promotor temprano de grano/embrión puede unirse operativamente a una secuencia de nucleótidos de tipo silvestre (cosupresión) o antisentido de una secuencia asociada con ABA. El promotor temprano de grano/embrión se utilizaría para alterar la acción de ABA en tejidos antes de la maduración de la semilla.
Los promotores tardíos de grano/embrión incluyen,
por ejemplo, promotores de genes de oleosina. Véase, por ejemplo,
Plant et al. (1994) Plant Mol. Biol.
25:193-205; Keddie et al. (1994) Plant
Mol. Biol. 24:327-40; Keddie et
al. (1992) Plant Mol. Biol. 19:443-53; y
Hong et al. (1997) 34:549-55;
incorporados en este documento como referencia. Véanse también los
Nº de acceso del Genbank U71381 (SEC ID Nº: 11), AF134411 (SEC ID
Nº:12), y la Patente de Estados Unidos Nº 5.977.436, que contienen
secuencias promotoras de oleosina de Glycine max, Brassica
juncea y Arabidopsis thaliana, respectivamente. Todas
estas referencias se incorporan en este documento como referencia.
Otros promotores tardíos de grano/embrión incluyen smilps, un
promotor específico de embrión que es activo 13-14
DAP y cz19B1, un promotor específico de grano entero que es activo
13-40 DAP. Véase, por ejemplo, el documento WO
00/11177, que se incorpora en este documento como referencia. El
promotor preferido de semilla a13 es activo 24-40
días después de la floración y también puede usarse en los métodos
de la invención. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/40710, que
se incorpora en este documento como referencia.
Pueden usarse promotores tardíos de grano, tales
como los de los genes de oleosina, para dirigir la expresión de un
alelo Vp1 de tipo silvestre. Tales plantas después pueden cruzarse
con una planta que tiene un mutante vp1. En este ejemplo, la
incapacidad del alelo mutante vp1 de complementarse por ABA
aislaría los granos tempranos de efectos perjudiciales. El producto
del gen Vp1 aparece en una fase muy temprana en el desarrollo del
grano. En presencia de ABA, VP1 se vuelve eficaz. El gen modificado
por ingeniería genética suministrado por el parental transgénico
proporcionaría a los granos la capacidad de madurar normalmente.
Como se usa en este documento, una "secuencia asociada a ABA
endógeno" se define como cualquier secuencia asociada a ABA no
introducida en la planta por un suceso de transformación.
Tales genes asociados a ABA pueden utilizarse
para controlar los efectos del estrés sobre la planta. Por lo
tanto, la acumulación de reservas nutritivas en la adquisición de
la tolerancia a la desecación está asociada con la expresión de
series específicas de ARNm. El ABA exógeno puede inducir precozmente
transcritos que codifican proteínas de almacenamiento o proteínas
abundantes en la última fase de la embriogénesis (LEA) que se
considera que participan en la tolerancia a la desecación en
embriones cultivados. De esta forma, la expresión tardía de genes
ABA puede acoplarse con proteínas del almacenamiento de semillas
transgénicas para aumentar las reservas nutritivas en las
semillas.
Por "introducción" de secuencias que modulan
la percepción de ABA y la transducción de señales en una planta
diana se entiende un método de transformación genética. Por
"transformación estable" se entiende que la construcción de
nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la
planta y puede heredarse por su progenie.
Los alelos de tipo silvestre de genes tales como
Vp1 pueden regularse negativamente con promotores tempranos por
cosupresión o estrategias antisentido. Se reconoce que con estas
secuencias de nucleótidos, pueden construirse construcciones
antisentido complementarias a al menos una porción del ARN
mensajero (ARNm) para las secuencias asociadas con ABA. Se
construyen nucleótidos antisentido para hibridar con el ARNm
correspondiente. Pueden realizarse modificaciones de las secuencias
antisentido siempre que las secuencias hibriden e interfieran con la
expresión del ARNm correspondiente. De esta manera, pueden usarse
construcciones antisentido que tengan un 70%, preferiblemente un
80% y mas preferiblemente un 85% de similitud de secuencia con las
secuencias antisentido correspondientes. Además, pueden usarse
porciones de los nucleótidos antisentido para interrumpir la
expresión del gen diana. En general, pueden usarse secuencias de al
menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos o más.
En la técnica se conocen métodos para suprimir la
expresión génica en plantas usando secuencias de nucleótidos en la
orientación con sentido. Los métodos generalmente implican
transformar plantas con una construcción de ADN que comprende un
promotor que dirige la expresión en una planta unido operativamente
a al menos una porción de una secuencia de nucleótidos que
corresponde al transcrito del gen endógeno (es decir, una secuencia
asociada a ABA). Típicamente, tal secuencia de nucleótidos tiene
una identidad de secuencia substancial con la secuencia del
transcrito del gen endógeno, preferiblemente una identidad de
secuencia mayor de aproximadamente un 65%, más preferiblemente una
identidad de secuencia mayor de aproximadamente un 85%, y aún más
preferiblemente una identidad de secuencia mayor de aproximadamente
un 95%. Véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.283.184 y
5.034.323; incorporadas en este documento como referencia.
Se reconoce que en la invención pueden usarse
fragmentos y/o variantes de los genes asociados con ABA. De esta
manera, la presente invención incluye fragmentos y variantes de las
secuencias de nucleótidos asociadas con ABA y proteínas codificadas
por las mismas. Por "fragmento" se entiende una porción de la
secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de
aminoácidos y, por lo tanto, la proteína codificada por la misma.
Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar
fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la
proteína activa y, por lo tanto, actúan para modular las respuestas
a ABA. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de
nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación generalmente
no codifican proteínas o fragmentos de proteínas que retienen la
actividad biológica. De esta manera, los fragmentos de una secuencia
de nucleótidos pueden variar desde al menos aproximadamente 20
nucleótidos, desde aproximadamente 50 nucleótidos, desde
aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la secuencia de nucleótidos
de longitud completa de la invención.
Por "variantes" se entienden secuencias
substancialmente similares. En el caso de secuencias de nucleótidos
naturales, pueden identificarse variantes tales como estas con el
uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como,
por ejemplo, con técnicas de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) e hibridación como se indica mas adelante. Las secuencias de
nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos
obtenidas sintéticamente, tales como las generadas, por ejemplo,
por el uso de mutagénesis de localización dirigida. Generalmente,
las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de la
invención tendrán una identidad de secuencia de al menos
aproximadamente un 40%, 50%, 60%, 65% o 70%, generalmente de al
menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, preferiblemente de al menos
aproximadamente un 90%, 92%, 94%, 95%, 96% o 97%, y mas
preferiblemente de al menos aproximadamente un 98%, un 99% o más de
identidad de secuencia con esa secuencia de nucleótidos particular
como se determina por programas de alineación de secuencias
descritos en otras partes de este documento usando parámetros por
defecto.
En la técnica son bien conocidos métodos para
alinear secuencias con fines comparativos. De esta manera, la
determinación del porcentaje de identidad entre 2 secuencias
cualesquiera puede realizarse usando un algoritmo matemático. Son
ejemplos no limitantes de tales algoritmos matemáticos el algoritmo
de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el
algoritmo de homología local de Smith et al., (1981) Adv.
Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación de homología de
Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol.
48:443-453; el método de búsqueda de
similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y
Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264,
modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:5873-5877.
Para determinar la identidad de secuencia pueden
utilizarse aplicaciones informáticas de estos algoritmos
matemáticos para comparar secuencias. Tales aplicaciones incluyen,
pero sin limitación: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en
Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN
(Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de
software de Wisconsin Genetics, versión 8 (disponible en Genetics
Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA).
Pueden realizarse alineaciones usando estos programas utilizando
los parámetros por defecto. El programa CLUSTAL se describe bien
por Higgins et al., (1988) Gene
73:237-244 (1988), Higgins et al. (1989)
CABIOS 5:151-153; Corpet et al.
(1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang
et al. (1992) CABIOS 8:155-65; y
Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol.
24:307-331. El programa ALIGN se basa en el
algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Con el programa
ALIGN puede usarse una tabla de peso de restos PAM120, una
penalización de longitud de huecos de 12, y una penalización de
huecos de 4, cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los
programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.
215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990)
supra. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos BLAST con
el programa BLASTN, puntuación =100, longitud de palabra =12, para
obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Pueden
realizarse búsquedas de proteína BLAST con el programa BLASTX,
puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de
aminoácidos homólogas a una proteína o polipéptido de la invención.
Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, puede
utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul
et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como
alternativa, puede usarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0)
para realizar una búsqueda repetida que detecte relaciones
distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997)
supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST y
PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto
de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias
de nucleótidos y BLASTX para proteínas). Véase
http://www.ncbi.hlm.nih.gov. La alineación también puede
realizarse manualmente por inspección.
A menos que se indique otra cosa, los valores de
identidad/similitud de secuencias proporcionados en este documento
se refieren al valor obtenido usando la versión 10 de GAP usando
los siguientes parámetros: % de identidad usando un peso de hueco
de 50 y un peso de longitud de 3; % de similitud usando un peso de
hueco de 12 y un peso de longitud de 4, o cualquier programa
equivalente. Por "programa equivalente" se entiende cualquier
programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias
cualesquiera en cuestión, genera una alineación que tiene
emparejamientos de restos de nucleótidos o aminoácidos idénticos y
una alta identidad de secuencias en porcentaje en comparación con
la alineación correspondiente generada por el programa
preferido.
GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsh (1970)
J. Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar la
alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de
acoplamientos y minimiza el número de huecos. GAP considera todas
las alineaciones posibles y posiciones de huecos y crea la
alineación con el mayor número de bases emparejadas y los menores
huecos. Esto permite proporcionar una penalización de creación de
huecos y una penalización de extensión de huecos en unidades de
bases emparejadas. GAP debe proporcionar un valor del número de
emparejamientos con penalización por huecos para cada hueco que
inserta. Si se elige una penalización de extensión de huecos mayor
de cero, GAP además debe proporcionar un valor, para cada hueco
insertado, de la longitud del hueco por la penalización de la
extensión de huecos. Los valores de penalización de creación de
huecos por defecto y los valores de penalización de extensión de
huecos en la versión 10 del paquete de software de Wisconsin
Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente.
Para las secuencias de nucleótidos, la penalización de creación de
huecos por defecto es 50, mientras que la penalización de extensión
de huecos por defecto es 3. Las penalizaciones de creación de
huecos y de extensión de huecos pueden expresarse como un número
entero seleccionado entre el grupo de enteros compuesto por 0 a
200. De esta manera, por ejemplo, las penalizaciones de creación de
huecos y de extensión de huecos pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o
mayor.
mayor.
GAP representa un miembro de la familia de las
mejores alineaciones. Puede haber muchos miembros de esta familia,
pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP presenta cuatro
cálculos de valor para las alineaciones: calidad, relación,
identidad y similitud. La calidad es la medida maximizada para
alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida por el
número de bases en el segmento mas corto. El porcentaje de
identidad es el porcentaje de los símbolos que coinciden realmente.
El porcentaje de similitud es el porcentaje de los símbolos que son
similares. Los símbolos que se cruzan entre huecos se ignoran. Se
puntúa una similitud cuando el valor de la matriz de puntuación para
un par de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de similitud.
La matriz de puntuación usada en la versión 10 del paquete de
software de Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (Véase Henikoff y
Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
Por proteína "variante" se entiende una
proteína derivada de la proteína nativa por deleción (denominada
truncación) o adición de uno o más aminoácidos al extremo N y/o C
terminal de la proteína nativa; deleción o adición de uno o más
aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; o
substitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la
proteína nativa. Tales variantes pueden deberse, por ejemplo, a
polimorfismo genético o manipulación humana.
Las proteínas de la invención pueden alterarse de
diversas formas incluyendo substituciones, deleciones, truncaciones
e inserciones de aminoácidos. En la técnica se conocen generalmente
métodos para tales manipulaciones. En la técnica son bien conocidos
métodos de mutagénesis y alteraciones de las secuencias de
nucleótidos. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al.
(1987) Methods in Enzymol.
154:367-382; Patente de Estados Unidos Nº
4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular
Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las
referencias citadas en estos documentos. En el modelo de Dayhoff
et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure
(Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado en este
documento como referencia pueden encontrarse pautas para
substituciones de aminoácidos apropiadas que no afecten a la
actividad biológica de la proteína de interés. Pueden preferirse
substituciones conservativas, tales como el intercambio de un
aminoácido por otro que tenga propiedades similares.
De esta manera, los genes y las secuencias de
nucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias naturales
como formas mutantes. De manera similar, las proteínas de la
invención incluyen tanto proteínas naturales como variaciones y
formas modificadas de las mismas. Tales variantes continuarán con la
actividad deseada. Evidentemente, las mutaciones que se realizarán
en el ADN que codifica la variante no deben sacar a la secuencia de
la fase de lectura y preferiblemente no crearán regiones
complementarias que puedan producir una estructura de ARNm
secundaria. Véase la publicación de la solicitud de Patente EP Nº
75.444.
No es de esperar que las deleciones, inserciones
y substituciones de las secuencias de proteínas incluidas en esta
invención produzcan cambios radicales en las características de la
proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto
de la substitución, deleción o inserción antes de hacerla, un
especialista en la técnica apreciará que el efecto se evaluará por
ensayos de selección rutinarios.
Las secuencias de nucleótidos y las proteínas
variantes también incluyen secuencias y proteínas derivadas de un
procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como barajado de
ADN. Con tal procedimiento, pueden manipularse una o más secuencias
codificantes asociadas a ABA diferentes para crear una nueva
proteína asociada a ABA que posea las propiedades deseadas. De esta
manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a
partir de una población de polinucleótidos de secuencias
relacionadas que comprenden regiones de secuencia que tienen una
identidad de secuencia substancial y pueden recombinarse de forma
homóloga in vitro o in vivo. En la técnica se conocen
estrategias para tal barajado de ADN. Véase, por ejemplo, Stemmer
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature
370:389-391; Crameri et al. (1997)
Nature Biotech. 15:436-438; Moore
et al. (1997) J. Mol. Biol.
272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et
al. (1998) Nature 391:288-291; y
las Patentes de Estados Unidos Nº 5.605.793 y 5.837.458.
Las secuencias asociadas con ABA de la invención
se proporcionan en cassettes de expresión para la expresión en las
plantas de interés. El cassette incluirá secuencias reguladoras 5'
y 3' unidas operativamente a una secuencia asociada con ABA de la
invención. Por "unida operativamente" se entiende una unión
funcional entre un promotor y una segunda secuencia, donde la
secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la
secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. En
general, unida operativamente significa que las secuencias de ácido
nucleico que se unen son contiguas y, cuando es necesario unir dos
regiones codificantes de proteínas, contiguas y en la misma fase de
lectura. El cassette también puede contener al menos un gen
adicional para cotransformar a un organismo. Como alternativa, el
gen o genes adicionales pueden proporcionarse en múltiples
cassettes de expresión.
Tal cassette de expresión se proporciona con una
pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la
secuencia de interés bajo la regulación de la transcripción de las
regiones reguladoras. El cassette de expresión también puede
contener genes marcadores selectivos.
El cassette de expresión incluirá en la dirección
5'-3' de transcripción, una región de inicio de la
transcripción y la traducción, una secuencia de ADN de la invención
y una región de terminación de la transcripción y la traducción
funcional en plantas. La región de inicio de la transcripción, el
promotor, puede ser nativo o análogo o extraño o heterólogo para el
hospedador vegetal. Además, el promotor puede ser la secuencia
natural o, como alternativa, una secuencia sintética. Por
"extraño" se entiende que la región de inicio de la
transcripción no se encuentra en la planta nativa en la que se
introduce dicha región de inicio de la transcripción. Como se usa
en este documento, un gen quimérico comprende una secuencia
codificante unida operativamente a una región de inicio de la
transcripción que es heteróloga a la secuencia codificante. Aunque
puede ser preferible expresar las secuencias usando promotores
heterólogos, pueden usarse las secuencias del promotor nativo. De
esta manera, se altera el fenotipo de la planta o la célula
vegetal.
La región de terminación puede ser nativa con la
región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la
secuencia de ADN unida operativamente de interés, o puede proceder
de cualquier otra fuente. En el plásmido Ti de A.
tumefaciens, están disponibles regiones de terminación
convenientes, tales como las regiones de terminación de la octopina
sintasa y nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al.
(1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144;
Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon
et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149;
Mogen et al. (1990) Plant Cell
2:1261-1272; Munroe et al. (1990)
Gene 91:151-158; Ballas et al.
(1989) Nucleic Acids Res.
17:7891-7903; y Joshi et al. (1987)
Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.
Cuando sea apropiado, el gen o los genes pueden
optimizarse para aumentar la expresión en la planta transformada.
Es decir, los genes pueden sintetizarse usando codones preferidos
en plantas para mejorar la expresión. En la técnica se dispone de
métodos para sintetizar genes preferidos en plantas. Véanse, por
ejemplo, las Patente de Estados Unidos Nº 5.380.831 y 5.436.391,
incorporadas en este documento como referencia.
Se conocen otras modificaciones de secuencia para
mejorar la expresión génica en un hospedador celular. Éstas
incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de
poliadenilación falsas, señales de sitios de ayuste
exón-intrón, repeticiones de tipo transposón y
otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales
para la expresión de genes. El contenido de G-C de
la secuencia puede ajustarse a niveles medios para un hospedador
celular dado, como se calcula haciendo referencia a genes conocidos
expresados en la célula hospedadora. Cuando es posible, la
secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias
de horquilla previstas.
Los cassettes de expresión pueden contener
adicionalmente secuencias líder 5' en la construcción del cassette
de expresión. Tales secuencias líder pueden actuar para mejorar la
traducción. En la técnica se conocen líderes de traducción e
incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, líder de EMCV
(región no codificante 5' de encefalomiocarditis)
(Elroy-Stein et al. (1989) PNAS USA
86:6126-6130); líderes de potivirus, por
ejemplo, el líder de TEV (virus del jaspeado del tabaco) (Allison
et al. (1986); líder de MDMV (virus del mosaico enanizante
del tabaco); Virology 154:9-20), y proteína
de unión a la cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP),
(Macejak et al. (1991) Nature
353:90-94); líder no traducido del ARNm de la
proteína de cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (ARN 4 de
AMV) (Jobling et al. (1987) Nature
325:622-625); líder del virus del mosaico del
tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology
of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pág.
237-256); y líder del virus del moteado clorótico
del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology
81:382-385). Véase también,
Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol.
84:965-968. También pueden utilizarse otros
métodos que se sabe que aumentan la traducción, por ejemplo,
intrones y similares.
En la preparación del cassette de expresión, los
diversos fragmentos de ADN pueden manipularse para proporcionar las
secuencias de ADN en la orientación apropiada y, cuando sea
apropiado, en la fase de lectura apropiada. Para este fin, pueden
emplearse adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN
o pueden utilizarse otras manipulaciones para proporcionar sitios de
restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación
de sitios de restricción o similares. Para este fin, pueden
utilizarse mutagénesis in vitro, reparación de cebadores,
restricción, templado, y resubstituciones, por ejemplo transiciones
y transversiones.
Los protocolos de transformación, así como los
protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas,
pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es
decir, monocotiledóneas o dicotiledóneas, a las que está destinada
la transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias
de nucleótidos en células vegetales y la posterior inserción en el
genoma de una planta incluyen microinyección (Crossway et al.
(1986) Biotechniques 4:320-344),
electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83:5602-5606, transformación
mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Patente
de Estados Unidos Nº 5.563.055; Patente de Estados Unidos Nº
5.981.840), transferencia directa de genes (Paszkowski et
al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y
aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, Sandford
et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.945.050; Tomes et
al. (1995) "Direct ADN Transfer into Intact Plant Cells via
Microprojectile Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and
Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips
(Springer-Verlag, Berlín); y MacCabe et al.
(1988) Biotechnology 6:923-926). Véase
también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet.
22:421-477; Sanford et al. (1987)
Particulate Science and Technology
5:27-37 (cebolla); Christou et al.
(1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja);
McCabe et al. (1988) Bio/Technology
6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991)
In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja);
Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet.
96:319-324 (soja); Datta et al.
(1990) Biotechnology 8:763-740
(arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988)
Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes,
Patente de Estados Unidos Nº 5.240.855; Buising et al.,
Patente de Estados Unidos Nº 5.322.783 y 5.324.646; Tomes et
al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via
Microprojectile Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and Organ
Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg
(Springer-Verlag, Berlín) (maíz); Klein et
al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444
(maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology
8:833-839 (maíz);
Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984)
Nature (London) 311:763-764; Bowen
et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.736.369 (cereales);
Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad, Sci. USA
84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et
al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule
Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pág.
197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990)
Plant Cell Reports 9:415-418 y
Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet.
84:560-566 (transformación mediada por
filamentos); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell
4:1495-1505 (electroporación); Li et
al. (1993) Plant Cell Reports
12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals
of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda
et al. (1996) Nature Biotechnology
14:745-750 (maíz a través de Agrobacterium
tumefaciens); incorporándose todos ellos en este documento como
referencia.
Las células que se han transformado pueden
desarrollarse hasta plantas de acuerdo con formas convencionales.
Véase, por ejemplo, Mc Cormick et al. (1986) Plant Cell
Reports 5:81-84. Estas plantas después
pueden dejarse crecer, polinizarse con la misma cepa trasformada o
con cepas diferentes, e identificarse el híbrido resultante que
tenga la expresión constitutiva de las características fenotípicas
deseadas identificadas. Pueden dejarse crecer dos o más
generaciones para asegurar que se mantiene de forma estable y se
hereda la expresión constitutiva de la característica fenotípica
deseada y después pueden recogerse las semillas para asegurar que
se ha conseguido la expresión constitutiva de las características
fenotípicas deseadas.
La presente invención puede usarse para la
transformación de cualquier especie vegetal incluyendo, pero sin
limitación, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de
plantas de interés incluyen, pero sin limitación, maíz (Zea
mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B.
juncea), particularmente las especies de Brassica útiles
como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago
sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale
cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo
(por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo común
(Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria
italica), mijo dedo (Eleusina coracana), girasol
(Helianthus annuus), cartamo (Carthamus tinctorius),
trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco
(Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum),
cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium
barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea
batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea
spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas
comosus), cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma
cacao), té (Camelia sinensis), banana (Musa
spp.), aguacate (Persea americana), higos (Picus
casica), guava (Psidium guajava), mango (Mnagifera
indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica
papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia
(Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus),
remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar
(Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas, plantas
ornamentales y coníferas.
Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon
esculentum), lechugas (Lactuca sativa), habas verdes
(Phaseolus vulgaris), fríjoles (Paseolus limensis),
guisantes (Lathyrus spp.) y miembros del género
Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupo
(C. cantalupensis) y melón (C. melo). Las plantas
ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hidrangea
(Macrophylla hydrangea), hibiscus (Hibiscus
rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes
(Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias
(Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus),
poinsettia (Euphorbia pulcherrima) y crisantemos. Las
coníferas que pueden emplearse en la práctica de la presente
invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como el pino taeda
(Pinus taeda), pino ayucahuite (Pinus elliotti), pino
ponderosa (Pinus ponderosa), pino contorta (Pinus
contorta), y pino Monterey (pino radiata); abeto de
Douglas (Pseudotsuga menziessi); tsuga del Canadá (Tsuga
canadensis); picea blanca (Picea glauca); secoya
(Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto
plateado (Abies amabilis) y abeto de navidad (Abies
balsamea); y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja
plicata) y cedro amarrillo de Alaska (Chamaecyparis
nootkatensis). Preferiblemente, las plantas de la presente
invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa,
girasol, Brassica, soja, algodón, cartamo, cacahuete, sorgo,
trigo, mijo, tabaco, etc.), más preferiblemente maíz y plantas de
soja, y aún más preferiblemente plantas de maíz.
Las plantas de interés particular incluyen
plantas de grano que proporcionan semillas de interés, plantas de
semillas para la producción de aceite y plantas leguminosas. Las
semillas de interés incluyen semillas de cereales tales como maíz,
trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas con semillas
para la obtención de aceite incluyen algodón, soja, cartamo,
girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las
plantas leguminosas incluyen judías y guisantes. Las judías
incluyen guar, algarrobilla, fenogreco, soja, fríjol, fríjol carita,
fríjol mungo, haba de lima, haba fava, lentejas, garbanzos, etc.
Los siguientes ejemplos se ofrecen de forma
ilustrativa y no limitante.
Embriones inmaduros de maíz de plantas donantes
de invernadero se bombardean con un plásmido que contiene la
secuencia ABI3 unida de forma operativa a un promotor temprano del
grano/embrión más un plásmido que contiene el gen marcador
selectivo PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene
70:25-37) que confiere resistencia al herbicida
Bialaphos.
La transformación se realiza como sigue. Todas
las fórmulas de los medios se proporcionan a continuación.
Se esteriliza la superficie de las espigas con
lejía Chlorox al 30% más detergente Micro al 0,5% durante 20
minutos, y se lavan dos veces con agua estéril. Los embriones
inmaduros se cortan y se sitúan con el eje del embrión hacia abajo
(el escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, en medio 560Y
durante 4 horas y después se alinean en los 2,5 cm de la zona diana
preparados para el bombardeo.
Se obtiene un vector plasmídico que comprende la
secuencia ABI3 unida de forma operativa a un promotor temprano de
grano/embrión. Este ADN plasmídico más el ADN plasmídico que
contiene un marcador selectivo PAT se precipitan en gránulos de
tungsteno de 1,1 \mum (diámetro medio) usando un procedimiento de
precipitación con CaCl_{2} como sigue:
100 \mul de partículas de tungsteno preparadas
en agua
10 \mul (1\mug) de ADN en tampón
Tris-EDTA (1 \mug total)
100 \mul de CaCl_{2} 2,5 M
10 \mul de espermidina 0,1 M.
Cada reactivo se añade de forma secuencial a la
suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene en el
agitador vorticial multitubo. La mezcla final se sonica brevemente
y se deja incubar durante 10 minutos en agitación vorticial
constante. Tras el periodo de precipitación, los tubos se
centrifugan brevemente, se retira el líquido, se lavan con 500 ml de
etanol al 100% y se centrifugan durante 30 segundos. Se retira el
líquido otra vez y se añaden 105 \mul de etanol al 100% al
sedimento final de partículas de tungsteno. Para el bombardeo con
pistola de partículas, las partículas de tungsteno/ADN se sonican
brevemente y se disponen 10 \mul en el centro de cada
macrosoporte y se deja que se sequen durante aproximadamente 2
minutos antes del bombardeo.
Las placas de muestra se bombardean al nivel nº 4
en una pistola de partículas nº HE34-1 y nº
HE34-2. Todas las muestras reciben un único disparo
a 650 PSI, cogiendo un total de diez alícuotas de cada tubo
partículas preparadas/ADN.
Tras el bombardero, los embriones se mantienen en
medio 560Y durante 2 días, después se transfieren a medio de
selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialaphos, y se
subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas
de selección, los callos clónicos resistentes a la selección se
transfieren a medio 288J para iniciar la regeneración de las
plantas. Tras la maduración somática del embrión
(2-4 semanas), se transfieren los embriones
somáticos bien desarrollados a medio para la germinación y se
transfieren a la cámara de cultivo iluminada. Aproximadamente
7-10 días después, las plántulas en desarrollo se
transfieren a medio 272V sin hormona en tubos durante
7-10 días hasta que las plántulas están bien
establecidas. Después, las plantas se transfieren a insertos en
bandejas (equivalentes a macetas de 2,5 pulgadas (6,35 cm) que
contienen substrato de siembra, y se dejan crecer durante 1 semana
en una cámara de cultivo, posteriormente se dejan crecer durante
1-2 semanas más en el invernadero, y después se
transfieren a macetas clásicas 600 (6,06 litros) y se cultivan
hasta la madurez. Las plantas se controlan y se evalúan.
El medio de bombardeo (560Y) contiene 4,0 g/l de
sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mezcla
de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5
mg/l de tiamina HCl, 120,0 g/l de sacarosa, 1,0 mg/l de
2,4-D y 2,88 g/l de L-prolina
(enrasado con H_{2}O desionizada después del ajuste a pH 5,8 con
KOH); 2,0 g/l de Gelrite (añadido tras enrasar con H_{2}O
desionizada); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (añadido tras
esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de
selección (560R) contiene 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA
C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson
(1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30,0
g/l de sacarosa, y 2,0 mg/l de 2,4-D (enrasado con
H_{2}O desionizada después del ajuste a pH 5,8 con KOH); 3,0 g/l
de Gelrite (añadido tras enrasar con H_{2}O desionizada); y 0,85
mg/l de nitrato de plata y 3,0 mg/l de bialaphos (ambos añadidos
tras esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente).
El medio de regeneración de las plantas (288J)
contiene 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 0,5
ml/l de solución madre de vitaminas MS (0,100 g de ácido
nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl y
0,40 g/l de glicina enrasado con H_{2}0 desionizada depurada)
(Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l
de mioinositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarosa y 1,0 ml/l
de ácido abscísico 0,1 mM (enrasado con H_{2}O desionizada
depurada después de ajustar a pH 5,6); 3,0 g/l de Gelrite (añadido
tras enrasar con H_{2}O desionizada); y 1,0 mg/l de ácido
indolacético y 3,0 mg/l de bialaphos (añadido tras esterilizar el
medio y enfriar a 60ºC). El medio sin hormonas (272V) contiene 4,3
g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de
solución madre de vitaminas MS (0,100 g/l de ácido nicotínico, 0,02
g/l de tiamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl, y 0,40 g/l de
glicina enrasado con H_{2}0 desionizada depurada), 0,1 g/l de
mioinositol y 40,0 g/l de sacarosa (enrasado con H_{2}O
desionizada depurada después de ajustar a pH 5,6) y 6 g/l de
bacto-agar (añadido tras completar el volumen con
H_{2}O desionizada depurada), esterilizado y enfriado a 60ºC.
Para la transformación del maíz mediada por
Agrobacterium con una secuencia ABI3 unida de forma
operativa a un promotor temprano de grano/embrión, se emplea
preferiblemente el método de Zhao (Patente de Estados Unidos Nº
5.981.840 y publicación de patente PCT WO98/32326; cuyo contenido
se incorpora aquí como referencia). En resumen, se aíslan embriones
inmaduros de maíz y los embriones se ponen en contacto con una
suspensión de Agrobacterium, siendo capaz la bacteria de
transferir la secuencia ABI3 unida de forma operativa a un promotor
temprano de grano/embrión a al menos una célula de al menos uno de
los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta
etapa, los embriones inmaduros preferiblemente se sumergen en una
suspensión de Agrobacterium para el inicio de la
inoculación. Los embriones se cocultivan durante un periodo de
tiempo con Agrobacterium (etapa 2: la etapa de
co-cultivo). Preferiblemente, los embriones
inmaduros se cultivan en medio sólido tras la etapa de la
infección. Después de este periodo de co-cultivo, se
contempla una etapa opcional de "reposo". En esta etapa de
reposo, los embriones se incuban en presencia de al menos un
antibiótico que se sabe que inhibe el crecimiento de
Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para
plantas transformadas (etapa 3: etapa de reposo). Preferiblemente,
los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido con
antibióticos, pero sin un agente selectivo, para eliminar
Agrobacterium y para proporcionar una fase de reposo para
las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados se
cultivan en medio que contiene un agente selectivo y se recuperan
los callos transformados en crecimiento (etapa 4: la etapa de
selección). Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan en
medio sólido con un agente selectivo, lo que tiene como resultado
el crecimiento selectivo de las células transformadas. Entonces, el
callo regenera las plantas (etapa 5: la etapa de regeneración) y,
preferiblemente, los callos que crecen en medio selectivo se
cultivan en medio sólido para regenerar las plantas.
Se bombardean embriones de soja con un plásmido
que contiene la secuencia de nucleótidos ABI3 unida de forma
operativa a un promotor temprano de embrión/grano como sigue. Para
inducir embriones somáticos, se cultivan cotiledones de
3-5 mm de longitud diseccionados a partir de
semillas inmaduras con la superficie esterilizada del cultivar de
soja A2872, en luz u oscuridad, a 26ºC en un medio de agar
apropiado durante un periodo de seis a diez semanas. Después se
escinden los embriones somáticos que producen embriones secundarios
y se ponen en un medio líquido apropiado. Después de repetir la
selección para grupos de embriones somáticos que se multiplican
como embriones en fase globular tempranos, las suspensiones se
mantienen como se describe a continuación.
Los cultivos en suspensión embriogénicos de soja
pueden mantenerse en 35 ml de medio líquido en un agitador
rotatorio a 150 rpm, a 26ºC con luz fluorescente con un programa de
16:8 horas de día/noche. Los cultivos se subcultivan cada dos
semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de medio
líquido.
Los cultivos en suspensión embriogénicos de soja
después pueden transformarse por el método de bombardeo con una
pistola de partículas (Klein et al. (1987) Nature
(Londres) 327:70-73, Patente de Estados
Unidos Nº 4.945.050). En estas transformaciones puede usarse un
instrumento PDS1000/HE de Du Pont Biolistic (actualización de
helio).
Un gen marcador selectivo que puede usarse para
facilitar la transformación de la soja es un transgén compuesto por
el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et
al. (1985) Nature 313:810-812), el gen de
la higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E.
coli; Gritz et al. (1983) Gene
25:179-1988) y la región 3' del gen de la
nopalina sintasa del ADN-T del plásmido Ti de
Agrobacterium tumefaciens. El cassette de expresión que
comprende la secuencia de nucleótidos ABI3 unida de forma operativa
a un promotor temprano de grano/embrión puede aislarse como un
fragmento de restricción. Este fragmento después puede insertarse en
un único sitio de restricción del vector que lleva el gen
marcador.
A 50 \mul de una suspensión de partículas de
oro de 1 \mum a 60 mg/ml se le añaden (en orden): 5 \mul de ADN
(1 \mug/\mul), 20 \mul de espermidina (0,1 M) y 50 \mul de
CaCl_{2} (2,5 M). Después, la preparación de partículas se agita
durante tres minutos, se centrifuga en una microcentrífuga durante
10 segundos y se elimina el sobrenadante. Las partículas recubiertas
con ADN después se lavan una vez con 400 \mul de etanol al 70% y
se resuspenden en 40 \mul de etanol anhidro. La suspensión de
ADN/partículas puede sonicarse tres veces durante un segundo cada
vez. Después, en cada disco de macrosoporte se cargan cinco
microlitros de las partículas de oro cubiertas con ADN.
Aproximadamente 300-400 mg de un
cultivo en suspensión de dos semanas se ponen en una placa petri
vacía de 60x15 mm y se retira el líquido residual del tejido con
una pipeta. Para cada experimento de transformación, normalmente se
bombardean aproximadamente 5-10 placas de tejido. La
presión de rotura de membrana se fija a 1100 psi (7582,14 kPa), y
la cámara se somete a un vacío de 28 pulgadas de mercurio (1,63
atm). El tejido se pone a aproximadamente 3,5 pulgadas (8,9 cm) de
la pantalla de retención y se bombardea tres veces. Tras el
bombardeo, el tejido puede dividirse a la mitad y ponerse de nuevo
en el líquido y cultivarse como se ha descrito anteriormente.
De cinco a siete días después del bombardeo,
puede cambiarse el medio líquido por medio fresco, y once a doce
días después del bombardeo por medio fresco que contiene
higromicina a 50 mg/ml. Estos medios selectivos pueden cambiarse
semanalmente. De siete a ocho semanas después del bombardeo puede
observarse tejido verde transformado que se desarrolla a partir de
grupos embriogénicos no transformados y necróticos. El tejido verde
aislado se retira y se inocula en matraces individuales para
generar nuevos cultivos embriogénicos en suspensión transformados,
propagados clonalmente. Cada nueva línea puede tratarse como un
suceso de transformación independiente. Después, estas suspensiones
pueden subclonarse y mantenerse como grupos de embriones inmaduros
o regenerarse en plantas completas por maduración y germinación de
embriones somáticos individuales.
Se transforman tejidos de meristemo de girasol
con un casete de expresión que contiene la secuencia ABI3 unida de
forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión como se
indica a continuación (véase también la Patente Europea número EP 0
486233, incorporada aquí como referencia, y
Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant
Science 103:199-207). Se descascaran semillas
maduras de girasol (Helianthus annuus L.) usando una
desgranadora de trigo sencilla. Se esteriliza la superficie de las
semillas durante 30 minutos con una solución de lejía Clorox al 20%
con la adición de dos gotas de Tween 20 por cada 50 ml de solución.
Las semillas se lavan dos veces con agua destilada estéril.
Se preparan explantes de eje embrionario de
escisión por medio de una modificación de procedimientos descritos
por Schrammeijer et al. (Schrammeijer et al. (1990)
Plant Cell Rep. 9: 55-60). Las semillas se
embeben en agua destilada durante 60 minutos siguiendo el
procedimiento de esterilización de la superficie. Después se
arrancan los cotiledones de cada semilla, produciendo una fractura
limpia en el plano del eje embrionario. Tras la escisión del ápice
de la raíz, los explantes se dividen en dos longitudinalmente entre
las hojas primordiales. Las dos mitades se sitúan, con la
superficie de corte hacia arriba, en medio GBA que consta de
elementos minerales de Murashige y Skoog (Murashige et al.
(1962) Physiol. Plant., 15:473-497),
adiciones de vitaminas de Shepard (Shepard (1980) en Emergent
Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of
Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), 40 mg/l de sulfato de
adenina, 30 g/l de sacarosa, 0,5 mg/l de 6-bencil
aminopurina (BAP), 0,25 mg/l de ácido
indol-3-acético (IAA), 0,1 mg/l de
ácido giberélico (GA_{3}), pH 5,6, y 8 g/l de Phytagar.
Los explantes se someten a bombardeo con
microproyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium
(Bidney et al. (1992) Plant Mol. Biol.
18:301-313). Para este tratamiento se ponen de
treinta a cuarenta explantes en un círculo en el centro de una
placa de 60 x 20 mm. Aproximadamente 4,7 mg de microproyectiles de
tungsteno de 1,8 mm se resuspenden en 25 ml de tampón TE estéril
(Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y se usan alícuotas de 1,5 ml
por bombardeo. Cada placa se bombardea dos veces a través de una
pantalla de nytex de 150 mm colocada aproximadamente a 2 cm de las
muestras en un equipo de aceleración de partículas PDS 1000®.
En todos los experimentos de transformación se
usan Agrobacterium tumefaciens de la cepa EHA105 desarmadas.
En la cepa EHA105 de Agrobacterium se introduce un vector
plasmídico binario compuesto por el cassette de expresión que
contiene el gen ABI3 unido de forma operativa a un promotor
temprano de grano/embrión por
congelación-descongelación como describen Holsters
et al. (1978) Mol. Gen. Genet.
163:181-187. Este plásmido además contiene un
gen marcador selectivo por kanamicina (es decir nptII). Las
bacterias para los experimentos de transformación de plantas se
cultivan durante toda la noche (28ºC y en continua agitación a 100
rpm) en medio líquido YEP (10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l
de bactopeptona y 5 g/l de NaCl, pH 7,0) con los antibióticos
apropiados requeridos para el mantenimiento de la cepa bacteriana y
del plásmido binario. La suspensión se usa cuando alcanza una
DO_{600} de aproximadamente 0,4 a 0,8. Las células de
Agrobacterium se sedimentan y resuspenden a una DO_{600} de
0,5 en un medio de inoculación que contiene MES 12,5 mM, pH 5,7, 1
g/l de NH_{4}Cl y 0,3 g/l de MgSO_{4}.
Los explantes recién bombardeados se ponen en una
suspensión de Agrobacterium, se mezclan y se dejan sin en
reposo durante 30 minutos. Los explantes después se transfieren a
medio GBA y se co-cultivan, con la superficie
cortada hacia abajo, a 26ºC y días de 18 horas. Tras tres días de
co-cultivo, los explantes se transfieren a 374B
(medio GBA que carece de reguladores de crecimiento y con un
reducido nivel del sacarosa del 1%) complementado con 250 mg/l de
cefotaxima y 50 mg/l de sulfato de kanamicina. Los explantes se
cultivan durante dos a cinco semanas en medio de selección y
después se transfieren a medio 374B nuevo carente de kanamicina
durante una a dos semanas de desarrollo continuado. Los explantes
que diferencian áreas de crecimiento resistentes a antibiótico que
no han producido brotes adecuados para la escisión se transfieren a
medio GBA que contiene 250 mg/l de cefotaxima para un segundo
tratamiento de 3 días con fitohormonas. En muestras de hojas de
brotes verdes resistentes a kanamicina se ensaya por ELISA la
presencia de NPTII y por medio de un ensayo de modulación de
respuesta a ABA en la planta se determina la presencia de expresión
del transgén.
Los brotes NPTII positivos se injertan en el
rizoma de plántulas de girasol cultivadas in vitro Pioneer®
híbrido 6440. Se germinan semillas con la superficie esterilizada
en medio 48-0 (mitad de la concentración de sales de
Murashige y Skoog, sacarosa al 0,5%, Gelrite al 0,3%, pH 5,6) y se
dejan crecer en las condiciones descritas para el cultivo de
explantes. Se retira la porción superior de la plántula, se hace
una sección vertical de 1 cm en el hipocotilo y se inserta el brote
transformado en el corte. El área completa se envuelve con parafilm
para asegurar el brote. Las plantas injertadas pueden transferirse
al suelo tras una semana de cultivo in vitro. Los injertos
en el suelo se mantienen en condiciones de humedad alta seguidas de
una aclimatación lenta al ambiente de invernadero. Los sectores
transformados de las plantas T_{0} (generación parental)
maduradas en el invernadero se identifican, por ejemplo, por ELISA
para NPTII de extractos de hojas mientras que las semillas
transgénicas recogidas de plantas T_{0} positivas para NPTII se
identifican ensayando una modulación de la respuesta de la planta a
ABA.
Se generan plantas transgénicas de maíz por los
métodos del ejemplo 1 usando una construcción de ADN que contiene
una secuencia Vp1 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 1) unida
operativamente al promotor de oleosina. El plásmido además contiene
el marcador selectivo PAT (Wohlleben et al. (1998) Gene
70:25-37). Como se describe en el Ejemplo 1, se
aíslan plantas que contienen la construcción de ADN oleosina:Vp1
incorporada de forma estable.
Se aíslan plantas de maíz que tienen una mutación
con pérdida de función en vp1 como se describe en Eyster
et al. (1931) Genetics 16:574-590,
incorporada en este documento como referencia. Estas plantas se
caracterizan porque tienen una sensibilidad reducida a ABA. Se
cruzan plantas transgénicas de maíz que tienen la construcción de
ADN oleosina:Vp1 incorporada de forma estable con la planta de maíz
que tiene la mutación de pérdida de función vp1. La progenie
resultante se retrocruza para producir una planta que tiene el
siguiente genotipo: vp1/vp1; oleosina:Vp1/oleosina:Vp1. Esta
planta se aislará de los efectos perjudiciales de ABA en el embrión
temprano y se le suministrará VP1 en el desarrollo tardío de
grano/embrión, permitiendo que los granos maduren normalmente.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de
los especialistas en la técnica a los que corresponde esta
invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se
incorporan en este documento como referencia como si se indicara
específica e individualmente que cada publicación o solicitud de
patente individual se incorpora como referencia.
Aunque la invención mencionada anteriormente se
ha describo con algún detalle por medio de ilustraciones y ejemplos
con el propósito de mejorar la comprensión, será obvio que pueden
ponerse en práctica determinados cambios y modificaciones dentro
del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
<110> Helentjaris, Tim
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Modulación de Acido Abscísico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 35718/205302
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/166.080
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-11-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2456
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0) ... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de vp1 (Nº de Acceso del Genbank
M60214)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73) ... (2148)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 691
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1981
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0) ... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de ABI1 (Nº de Acceso del
Genbank X77116)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (432) ... (1736)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 434
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0) ... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de ABI2 (Nº de Acceso del
Genbank Y08965)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51) ... (1322)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 423
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2868
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0) ... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de ABI3 (Nº de Acceso del
Genbank X68141)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (406) ... (2568)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 720
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0) ... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de ABI4 (Nº de Acceso del
Genbank AF040959)
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (151) ... (1137)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 328
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 286
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0) ... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor de oleosina (Nº de Acceso
del Genbank U71381)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 940
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica juncea
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0) ... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor de oleosina (Nº de Acceso
del Genbank AF134411)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0) ... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor de lpt2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>13
Claims (43)
1. Un método para modular una respuesta al ácido
abscísico (ABA) durante el desarrollo de la semilla, desarrollo del
endospermo o maduración de la semilla en una planta, comprendiendo
dicho método:
introducir una construcción de ADN que comprende
una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales
de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de
grano/embrión en dicha planta por transformación, donde dicho
promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a
dicha secuencia unida.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha modulación comprende una respuesta reducida a ABA.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA es:
a) una secuencia de nucleótidos como se establece
en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7 ó 9;
b) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido como se establece en SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 ó 10;
c) una secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad de secuencia de al menos un 70% con las SEC ID Nº: 1, 3,
5, 7 ó 9, donde la expresión de dicha secuencia disminuye la
respuesta a ABA;
d) una secuencia de nucleótidos que hibrida en
condiciones rigurosas con la complementaria de la SEC ID Nº: 1, 3,
5, 7 ó 9, donde la expresión de dicha secuencia de nucleótidos
disminuye la respuesta a ABA y dichas condiciones rigurosas
comprenden la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a
37ºC, y un lavado en 0,1x SSC a una temperatura de 60ºC a 65ºC;
e) una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia antisentido de la secuencia de nucleótidos de a), b),
c), o d); o,
f) una molécula de ácido nucleico que comprende
al menos 20 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7 ó 9,
donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico reduce la
respuesta a ABA.
4. Un método para prevenir los efectos
perjudiciales del estrés sobre una semilla de planta en desarrollo,
una semilla de planta en maduración o un endospermo en desarrollo,
comprendiendo dicho método:
introducir una construcción de ADN que comprende
una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales
de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de
grano/embrión en una planta por transformación, donde dicho
promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a
dicha secuencia unida.
5. El método de la reivindicación 4, donde la
expresión de dicha secuencia implicada en la percepción y
transducción de señales de ABA modula una respuesta a ABA.
6. El método de la reivindicación 5, donde dicha
modulación es una reducción en la respuesta a ABA.
7. El método de la reivindicación 6, donde dicha
secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de
ABA es como se define en la reivindicación 3.
8. El método de la reivindicación 2 ó 6, donde
dicha secuencia unida comprende una secuencia antisentido de una
secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de
ABA.
9. El método de la reivindicación 2 ó 6, donde
dicha secuencia unida es una secuencia mutante implicada en la
percepción y transducción de señales de ABA y comprende una
secuencia seleccionada del grupo compuesto por abi1 y
abi2.
10. El método de la reivindicación 1 ó 4, en el
que dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA corresponde a una secuencia de la planta.
11. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde dicha planta es una monocotiledónea
o una dicotiledónea.
12. El método de la reivindicación 11, donde
dicha monocotiledónea es un cereal.
13. El método de la reivindicación 12, donde
dicho cereal es maíz.
14. El método de la reivindicación 2 ó 6, que
comprende además reproducir la planta en la que se ha introducido
dicha construcción de ADN por transformación.
15. Una planta que tiene una construcción de ADN
introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada
en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma
operativa a un promotor temprano de grano/embrión, donde dicho
promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a
dicha secuencia unida.
16. La planta de la reivindicación 15, donde la
expresión de dicha secuencia implicada en la percepción y
transducción de señales de ABA modula una respuesta a ABA.
17. La planta de la reivindicación 16, donde
dicha modulación reduce una respuesta a ABA.
18. La planta de la reivindicación 16, donde
dicha secuencia está implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA y es una secuencia codificante.
19. La planta de la reivindicación 15, donde
dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA es como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 3 u 8 a 10.
20. La planta de la reivindicación 15, donde
dicha construcción de ADN está integrada de forma estable en el
genoma de la planta.
21. Una célula vegetal que tiene introducida de
forma estable una construcción de ADN que comprende una secuencia
implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida
de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión, donde
dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto
a dicha secuencia unida.
22. La célula vegetal de la reivindicación 21,
donde la expresión de dicha secuencia implicada en la percepción y
transducción de señales de ABA modula una respuesta a ABA.
23. La célula vegetal de la reivindicación 22,
donde dicha modulación reduce una respuesta a ABA.
24. La célula vegetal de la reivindicación 21,
donde dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA es una secuencia codificante.
25. La célula vegetal de la reivindicación 21,
donde dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA es como se define en una cualquier de las
reivindicaciones 3 u 8 a 10.
26. Un método para prevenir los efectos
perjudiciales del estrés sobre una semilla de la planta en
desarrollo, una semilla de la planta en maduración o un endospermo
en desarrollo, comprendiendo dicho método:
introducir una construcción de ADN que comprende
una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales
de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de
grano/embrión en una planta por transformación, donde la planta
tiene una mutación con pérdida de función para dicha secuencia
implicada en la percepción y transducción de señales de ABA, donde
dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto
a dicha secuencia unida.
27. El método de la reivindicación 26, que además
comprende reproducir la planta en la que se ha introducido dicha
construcción de ADN por transformación con una segunda planta que
tiene una mutación con pérdida de función para dicha secuencia
implicada en la percepción y transducción de señales de ABA y aislar
la progenie.
28. El método de la reivindicación 26, donde
dicha modulación comprende una reducción de la respuesta a ABA.
29. El método de la reivindicación 26, donde
dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA es:
a) una secuencia de nucleótidos indicada en la
SEC. ID. Nº: 1 ó 7;
b) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 u 8;
c) una secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad de al menos un 70% con la SEC ID Nº: 1 ó 7; y, donde
dicha secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia
de al menos un 70% con la SEC ID Nº: 1 codifica un polipéptido que
tiene actividad VP1 y dicha secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad de secuencia de al menos un 70% con la SEC ID Nº: 7
codifica un polipéptido que tiene actividad ABI3;
d) una secuencia de nucleótidos que hibrida en
condiciones rigurosas con la complementaria de la SEC ID Nº: 1 ó 7,
donde dicha secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones
rigurosas con la complementaria de la SEC ID Nº: 1 codifica un
polipéptido que tiene actividad VP1, y dicha secuencia de
nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la
complementaria de la SEC ID Nº: 7 codifica un polipéptido que tiene
actividad ABI3, y dichas condiciones rigurosas comprenden la
hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un
lavado en 0,1xSSC a una temperatura de 60ºC a 65ºC; o,
e) una molécula de ácido nucleico que comprende
al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 1 ó 7, donde
dicha molécula de ácido nucleico que tiene al menos 20 nucleótidos
consecutivos de la SEC ID Nº: 1 codifica un polipéptido que tiene
actividad VP1, y dicha molécula de ácido nucleico que tiene al menos
20 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº:7 codifica un
polipéptido que tiene actividad ABI3.
30. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 26 a 29, donde dicho promotor tardío de
grano/embrión es un promotor de oleosina.
31. Una planta que tiene una construcción de ADN
introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada
en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma
operativa a un promotor tardío de grano/embrión, donde dicho
promotor tardío de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha
secuencia unida.
32. La planta de la reivindicación 31, que además
comprende una mutación con pérdida de función en una secuencia
endógena implicada en la percepción y transducción de señales de
ABA.
33. La planta de la reivindicación 32, donde
dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA es como se define en la reivindicación 29.
34. La planta de una cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 33, donde dicho promotor tardío de
grano/embrión es un promotor de oleosina.
35. Una célula vegetal que tiene una construcción
de ADN introducida de forma estable que comprende una secuencia
implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida
de forma operativa a un promotor tardío de grano/embrión, donde
dicho promotor tardío de grano/embrión es heterólogo con respecto a
dicha secuencia unida.
36. La célula vegetal de la reivindicación 35,
que además comprende una mutación con pérdida de función en una
secuencia endógena implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA.
37. La célula vegetal de la reivindicación 35,
donde dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de
señales de ABA es como se define en la reivindicación 29.
38. La planta de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 20 ó 31 a 34, donde dicha planta es una
monocotiledónea o una dicotiledónea.
39. La planta de la reivindicación 38, donde
dicha monocotiledónea es el maíz.
40. La semilla transformada de la planta de una
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, 31 a 34, 38 ó 39.
41. La progenie transformada de la planta de una
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, 31 a 34, 38 ó 39.
42.- La célula vegetal transformada de una
cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25 ó 35 a 37, donde dicha
célula vegetal es de una monocotiledónea o una dicotiledónea.
43. La célula vegetal transformada de la
reivindicación 42, donde dicha monocotiledónea es maíz.
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