DE69434312T2

DE69434312T2 - Regulierung von pflanzenwachstum

Info

Publication number: DE69434312T2
Application number: DE69434312T
Authority: DE
Inventors: Theodor Lange; E. Jan GRAEBE; Peter Stoke Bishop HEDDEN; Andrew Pensford PHILLIPS
Original assignee: Rothamsted Research Ltd
Current assignee: Rothamsted Research Ltd
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-24
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2014-05-25
Also published as: EP0703983B1; ATE291626T1; EP0703983B9; PT703983E; CA2163454C; EP0703983A1; AU6929794A; JPH08510381A; US6198021B1; US6455675B1; ES2237752T3; GB9311147D0; WO1994028141A1; CA2163454A1; US5939539A; DE69434312D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Regulierung von Pflanzenwachstum und insbesondere auf die molekulare Klonierung und Expression eines Gibberellin 20-Oxidase-Gens und seine Verwendung, z.B. in transgenen Pflanzen.
Chemische Verbindungen zur Kontrolle des Pflanzenwachstums sind seit vielen Jahren in der kommerziellen Verwendung. Viele dieser Verbindungen wirken, indem sie verschiedene Schritte in der Biosynthese von Gibberellinen (GAs) inhibieren. GAs bilden eine große Gruppe von natürlichen Diterpenoidprodukten, von denen einige Glieder als Hormone in Pflanzen wirken, wobei sie viele Entwicklungszüge einschließlich z.B. Sprossenstreckung kontrollieren. Unter den Verbindungsgruppen, die die GA-Biosynthese in höheren Pflanzen inhibieren, sind quaternäre Ammonium- und Phosphoniumverbindungen, Verbindungen mit einem Stickstoff enthaltenden Heterocyclus und Acylcyclohexandione. Allerdings beinhaltet die Verwendung solcher Chemikalien verschiedene Probleme. Es ist z.B. schwierig, die Chemikalien in geeigneten Mengen auf Pflanzen aufzubringen oder Pflanzenorgane auszuwählen, ohne die Chemikalien auf andere Pflanzen oder lebende Tiere auszubreiten. Es besteht die Gefahr der Persistenz, die es schwierig machen kann, dass andere Nutzpflanzen, nach behandelten Nutzpflanzen wachsen. Ein Problem, dem sich die vorliegende Erfindung zuwendet, besteht demnach darin, die Verwendung von solchen Chemikalien zu vermeiden. Dieses Problem kann mit dieser Anmeldung gelöst werden, indem Mittel zur Pflanzenwachstumskontrolle auf dem Level des Pflanzengens bereitgestellt werden.
Die späteren Schritte des GA-Biosynthesewegs werden durch lösliche, von 2-Oxoglutarat abhängige Dioxygenasen katalysiert, von denen einige als regulatorische Enzyme bei der Biosynthese der physiologisch wichtigen C₁₉-Verbindung, GA₁, vorgeschlagen wurden. Beispielsweise wird die Aktivität der GA-20-Oxidase bei bestimmten für die Photoperiode empfindliche Pflanzen durch lange Tage verstärkt und wird als Folge der GR₁-Wirkung in verschiedenen Spezies herab reguliert.
Erfindungsgemäß wird eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die für ein Polypeptid codiert, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist. Diese Offenbarung ist das erste Beispiel für die molekulare Klonierung einer GA:2-Oxoglutaratdioxygenase. Das Enzym GA-20-Oxidase ist auch als 20-Hydroxylase oder C-20-Oxidase bekannt, da es Oxidationsreaktionen am C-20-Kohlenstoffatom der GA-Struktur katalysiert. Es ist eine Dioxygenase, da gleichzeitig Oxoglutarat oxidiert wird.
Wie in den Beispielen gezeigt wird, codiert die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung für GA-20-Oxidase, die fähig ist, auf eines oder mehrere der folgenden Substrate zu wirken: GA₁₂, GA₅₃, GA₁₅ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₄₄ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₂₄, GA₁₉ und GA₂₃ unter anderen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid codiert, welches GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, wobei das Polypeptid, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, fähig ist, auf eines oder mehrere der folgenden Substrate zu wirken: GA₁₂, GA₅₃, GA₁₅ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₄₄ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₂₄, GA₁₉ und GA₂₃.
Die DNA-Sequenz der Erfindung kann für eine GA-20-Oxidase im Prinzip aus beliebigen Pflanzen codieren, vorzugsweise aber aus monocotylen oder dicotylen Pflanzen und bevorzugter aus dicotylen Pflanzen. Eine besonders geeignete Quelle sind Pflanzen der Familie Cucurbitaceae, z.B. C. maxima, deren unreife Samen eine vorteilhafte Quelle sind. Eine weitere geeignete Quelle sind Pflanzen der Familie Cruciferae, z.B. Arabidopsis thaliana, deren Sprossenmaterial bzw. Schößlingmaterial eine zweckdienliche Quelle ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist daher eine DNA-Sequenz, die für eine GA-20-Oxidase aus Pflanzen, vorzugsweise aus monocotylen bzw. dicotylen Pflanzen, bevorzugter aus dicotylen Pflanzen und am bevorzugtesten aus Pflanzen der Familie Cucurbitaceae bzw. Cruciferae, z.B. C. maxima und Arabidopsis thaliana, oder ein Protein, das zu dieser wesentliche Homologie hat, codiert.
Substantielle Sequenzhomologie, so wie dieser Ausdruck in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezeichnet eine enge strukturelle Beziehung zwischen Sequenzen von Nukleotiden oder Aminosäuren. Beispielsweise können substantiell bzw. wesentlich homologe DNA-Sequenzen 60% homolog, vorzugsweise 80% und am bevorzugtesten 90% oder 95% homolog sein oder auch mehr, und substantiell bzw. im wesentlichen homologe Aminosäuresequenzen können vorzugsweise 35%, bevorzugter 50%, am bevorzugtesten mehr als 50%, homolog sein. Homologie beinhaltet auch eine Beziehung, in der eine oder mehrere Untersequenzen von Nukleotiden oder Aminosäuren fehlen oder Untersequenzen mit zusätzlichen Nukleotiden oder Aminosäuren dazwischen verteilt sind.
Der Ausdruck "Homologie", wie er hier verwendet wird, umfasst nicht nur eine strukturelle Homologie, sondern auch eine funktionelle Homologie.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf eine DNA-Sequenz, die für eine GA-20-Oxidase von Cucurbita maxima oder Arabidopsis thaliana oder ein Protein, das wenigstens 35%, vorzugsweise wenigstens 50%, und am vorteilhaftesten wenigstens mehr als 50% Homologie mit dieser hat, codiert.
Spezifischer ausgedrückt, die Erfindung bezieht sich auf eine DNA, die eine Sequenz hat, die dem offenen Leseraster der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz entspricht, oder die eine über die Degeneriertheit des genetischen Codes äquivalente Sequenz hat, einschließlich Derivate, die fähig sind, mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz zu hybridisieren und die noch für ein Polypeptid codieren, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist daher eine DNA, wie sie in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellt ist oder die Sequenzhomologie zu der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 gezeigten Sequenz hat.
Die DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine rekombinante DNA, die eine DNA-Sequenz umfasst, welche für ein rekombinantes Polypeptid codiert, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die rekombinante DNA in der Form eines cDNA-Klons.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein chimäres Genkonstrukt bereitzustellen, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid codiert, welches GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, in funktioneller Verknüpfung mit Pflanzenexpressionssignalen, die Promotor- und Terminationssequenzen umfassen, die fähig sind, zu bewirken, dass das Gen ein Polypeptid, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, innerhalb einer Pflanze exprimiert, wobei die Promotorsequenzen vorzugsweise solche eines induzierbaren Promoitors oder eines Gewebe-bevorzugten oder Gewebe-spezifischen Promotors sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein chimäres Genkonstrukt, umfassend wenigstens einen Teil einer reversen GA-20-Oxidasenukleotidsequenz in funktioneller Verknüpfung mit Pflanzenexpressionssignalen, die Promotor- und Terminationssequenzen umfassen, die fähig sind, zu bewirken, dass die reverse Sequenz Antisense-mRNA in einer Pflanze exprimiert.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht auch in der Bereitstellung von transformierten Wirtszellen, umfassend rekombinante DNA, die für ein Polypeptid codiert, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, in funktioneller Verknüpfung mit Expressionssignalen, die Promotor- und Terminationssequenzen beinhalten, die eine Expression der DNA in der Wirtszelle erlauben.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine transgene Pflanze, einschließlich Samen und Nachkommenschaft oder Ableger davon, umfassend vorzugsweise in stabiler Weise in ihr Genom ein chimäres Genkonstruktion, wie es oben beschrieben wurde, integriert umfasst. Bevorzugt ist eine monocotyle bzw. dicotyle Pflanze, z.B. Tabak, Tomate, Baumwolle, Sonnenblume, Mais, Weizen und Dactylis glomerata.
Besonders bevorzugt ist eine transgene Pflanze, die eine monocotyle Pflanze ist, vorzugsweise eine Maispflanze oder eine Weizenpflanze.
Die Erfindung umfasst auch ein rekombinantes Polypeptid aus Pflanzen, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, wobei das Polypeptid vorzugsweise fähig ist, auf eines oder mehre der folgenden Substrate zu wirken: GA₁₂, GA₅₃, GA₁₅ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₄₄ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₂₄, GA₁₉ und GA₂₃.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist daher ein rekombinantes Polypeptid, das eine GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist und das aus Pflanzen, vorzugsweise monocotylen oder dicotylen Pflanzen, bevorzugter aus dicotylen Pflanzen und am vorteilhaftesten aus Pflanzen der Familie Cucurbitaceae bzw. Cruciferae, z.B. C. maxima und Arabidopsis thaliana, ist, oder ein Protein mit substantieller Homologie dazu.
Spezifischer, die Erfindung bezieht sich auf ein rekombinantes Polypeptid, das eine Sequenz, wie sie in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 gezeigt ist, oder eine Sequenz, die im wesentlichen dazu homolog ist, hat.
Die Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer DNA-Sequenz, die für eine GA-20-Oxidase codiert, umfassend Herstellen einer cDNA-Bibliothek aus einem geeigneten Quellenorganismus und Screening dieser Bibliothek mittels eines der herkömmlicherweise angewendeten Screening-Systeme.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, welches eine der vorstehend genannten DNA-Sequenzen umfasst.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von DNA-Sequenzen, die eine DNA-Region umfassen, welche für ein Polypeptid codiert, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, wobei das Verfahren umfasst: Herstellen einer cDNA- oder einer genomischen Bibliothek aus einem geeigneten Quellenorganismus und Screening dieser Bibliothek mit Hilfe einer Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten DNA als Hybridisierungssonde.
An erster Stelle betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid codiert, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist.
Beispiele einer DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung sind die offenen Leseraster der Sequenzen, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 gezeigt sind, oder eine über die Degeneriertheit des genetischen Code äquivalente Sequenz. Demnach kann eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung eine sein, die für die Aminosäuresequenz codiert, welche in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 gezeigt ist. Es wird einzusehen sein, dass die Erfindung Derivate und Mutanten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenzen umfasst, vorausgesetzt dass solche Derivate im wesentlichen ähnliche Peptide, die im wesentlichen dieselbe Funktion wie die Peptide, die durch das hierin beschriebene GA-20-Oxidasegen codiert werden, codieren. Die genannten Derivate der DNA-Sequenz gemäß der Erfindung können natürlich auftretende Varianten oder Mutanten sein oder speziell können sie künstlich erzeugte Varianten oder Mutanten sein, die durch bekannte Mutationsverfahren spezifisch oder unspezifisch produziert werden können.
Mutation ist so zu verstehen, dass sie sowohl die Deletion wie auch die Insertion von einer oder mehreren Basen und die Substitution von einer oder mehreren Basen oder eine Kombination dieser Maßnahmen bezeichnet. Dies ist speziell der Fall, wenn die Basensubstitution von einer stummen Mutation begleitet ist, die zu keiner Aminosäuresubstitution führt und somit die chemische Struktur des Expressionsproduktes nicht verändert.
Das Strukturgen gemäß der Erfindung, das für GA-20-Oxidase codiert, kann eine nicht unterbrochene codierende Sequenz bilden oder kann ein oder mehrere Introns umfassen, die durch geeignete Spleißverbindungen funktionell in Pflanzen gebunden sind, welche aus einer synthetischen oder natürlichen Quelle erhalten werden können. Das Strukturgen gemäß der Erfindung, das für GA-20-Oxidase codiert, kann außerdem ausschließlich aus natürlich vorkommenden oder aus synthetischen Quellen erhalten werden. Es kann z.B. aus einer genomischen oder einer cDNA-Bibliothek erhalten werden oder kann ganz durch synthetische Mittel konstruiert werden.
Eine andere Möglichkeit ist die Konstruktion einer Hybrid-DNA-Sequenz, die cDNA und auch genomische DNA und/oder synthetische DNA umfasst. In diesem Fall kann die cDNA aus demselben Gen wie die genomische DNA stammen oder die cDNA und die genomische DNA können aus unterschiedlichen Genquellen stammen. In jedem Fall können allerdings die genomische DNA und/oder die cDNA jeweils einzeln aus dem selben Gen oder aus verschiedenen Genen produziert werden.
Wenn das Strukturgen Teile von mehr als einem Gen enthält, können diese Gene aus ein und demselben Organismus, aus mehreren Organismen, die zu verschiedenen Stämmen oder Varietäten derselben Spezies oder unterschiedlicher Spezies derselben Gattung gehören, oder von Organismen, die zu mehr als einer Gattung derselben oder einer anderen taxonomischen Einheit gehören, stammen.
In jedem Fall wird die DNA-Sequenz als im Rahmen der Erfindung liegend angesehen, wenn das codierte Protein GA-20-Oxidase-Aktivität hat.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten DNA bereit, die für GA-20-Oxidase codiert. Das Verfahren kann Herstellen einer cDNA-Bibliothek aus einer geeigneten Quelle und Screening dieser Bibliothek mit Hilfe eines Antikörpers gegen GA-20-Oxidase oder einen Teil ihrer Aminosäuresequenz oder Screening der Bibliothek durch Testen auf katalytische Aktivitätscharakteristika der GA-20-Oxidase oder durch ein anderes geeignetes Verfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, umfassen. Standardtechniken der DNA-Rekombinationstechnik können als Teil des Verfahrens verwendet werden, z.B. Hybridisierung unter Verwendung von cDNA-Sonden, Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von degenerierten Primern und Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus.
Das Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten DNA, die GA-20-Oxidase codiert, kann Herstellen einer genomischen oder einer cDNA-Genbibliothek, die durch übliche Routineverfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, produziert werden kann, umfassen. Die grundlegenden Verfahren der Herstellung genomischer oder cDNA-Genbibliotheken sind detailliert z.B. bei Maniatis et al. (1982) beschrieben, während Informationen bezüglich des Transfers und der Anwendung solcher Verfahren auf Pflanzensysteme z.B. in der Mohnen (1985)-Literaturstelle gefunden werden [Mohnen et al., EMBO J., 4: 1631–1635 (1985)].
Genomische DNA und cDNA können auf verschiedenen Wegen erhalten werden. Genomische DNA beispielsweise kann unter Verwendung bekannter Verfahren aus geeigneten Zellen extrahiert werden und gereinigt werden.
In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Ausgangsmaterial, das für die Herstellung von cDNA verwendet wird, im allgemeinen mRNA, die aus ausgewählten Zellen oder Geweben, speziell aber aus Zellen oder Geweben unreifer Samen von Cucurbitaceae-Pflanzen, wie z.B. C. maxima, die bekanntermaßen eine reiche Quelle für GA-Biosyntheseenzyme sind, isoliert werden kann. Eine weitere geeignete Quelle für GA-Biosyntheseenzym ist das Sprossengewebe bzw. Schößlinggewebe von Arabidopsis thaliana-Pflanzen. Die isolierte mRNA kann dann in einer reversen Transkription als Matrix für die Produktion einer entsprechenden cDNA verwendet werden.
Die Verfahren zur Isolierung von Poly(A⁺)-RNA und zur Herstellung von cDNA sind dem Fachmann bekannt und werden in den Beispielen unten detailliert beschrieben.
Die extrahierten und gereinigten DNA-Präparationen werden dann für die anschließende Klonierung in Fragmente gespalten. Die zu klonierende genomische DNA oder cDNA kann zu einer Größe, die für eine Insertion in einen Klonierungsvektor geeignet ist, entweder durch mechanische Scherung oder vorzugsweise durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen fragmentiert werden. Geeignete Klonierungsvektoren, die bereits routinemäßig für die Herstellung von genomischen und/oder cDNA-Gen-Bibliotheken eingesetzt werden, umfassen z.B. Phagenvektoren, z.B. die λ-Charon-Phagen, oder bakterielle Vektoren, z.B. das E. coli-Plasmid pBR322. Weitere geeignete Klonierungsvektoren sind dem Fachmann bekannt und können aus kommerziellen Quellen erhalten werden, z.B. die, die im "Fast Track"-mRNA-Isolierungskit enthalten sind, welcher von INVITROGEN erhalten wird, oder die im λgt11-Cloning Kit of Amersham enthalten sind.
Aus den auf diese Weise produzierten Gen-Bibliotheken können dann geeignete Klone, die das gewünschte Gen oder Teile davon umfassen, in einem Screening-Programm, beispielsweise mit Hilfe geeigneter Oligonukleotidsonden (Sondenmolekül), identifiziert und dann isoliert werden. Zur Identifizierung geeigneter Klone sind verschiedene Verfahren, wie z.B. differenzielle Kolonienhybridisierung oder Plaque-Hybridisierung verfügbar. Es kann auch eine Identifizierung der spezifischen Translationsprodukte auf der Basis immunologischer Detektionsverfahren eingesetzt werden.
Als Sondenmolekül kann z.B. ein DNA-Fragment, das bereits aus demselben Gen oder aus einem strukturell verwandten Gen isoliert wurde und das zur Hybridisierung mit dem entsprechenden Sequenzabschnitt innerhalb des gewünschten Gens, das zu identifizieren ist, fähig ist, eingesetzt werden.
Unter der Voraussetzung, dass die Aminosäuresequenz des zu isolierenden Gens oder wenigstens Teile dieser Sequenz bekannt sind, kann eine entsprechende DNA-Sequenz auf der Basis dieser Sequenzinformation gezeichnet werden. Auf der Basis dieser Information ist es somit möglich, Oligonukleotidmoleküle zu entwickeln, die als Sondenmoleküle für die Identifizierung und Isolierung geeigneter Klone verwendet werden, und zwar indem die Sondenmoleküle mit genomischer DNA oder cDNA in einem der oben beschriebenen Verfahren hybridisiert werden.
Um eine Detektion des gewünschten Gens zu erleichtern, kann das oben beschriebene DNA-Sondenmolekül mit einer geeigneten leicht detektierbaren Gruppe markiert werden. Im Rahmen der Erfindung wird unter einer detektierbaren Gruppe ein beliebiges Material verstanden, das eine besondere, leicht identifizierbare physikalische oder chemische Eigenschaft hat.
Solche Materialien werden bereits umfangreich speziell auf dem Gebiet der Immunoassays verwendet und die Mehrzahl von ihnen kann auch in der vorliegenden Anmeldung verwendet werden. In diesem Zusammenhang können speziell enzymatisch aktive Gruppen, z.B. Enzyme, Enzymsubstrate, Co-Enzyme und Enzyminhibitoren und auch fluoreszierende und lumineszierende Mittel, Chromophore und Radioisotope genannt werden, z.B. ³H, ³⁵S, ³²P, ¹²⁵I und ¹⁴C. Die leichte Detektierbarkeit dieser Markierungen basiert einerseits auf ihren inhärenten physikalischen Eigenschaften (z.B. fluoreszierende Markierungen, Chromophore, Radioisotope) und andererseits auf ihren Reaktions- und Bindungseigenschaften (z.B. Enzyme, Substrate, Co-Enzyme, Inhibitoren).
Als Sondenmolekül ist auch eine einzelsträngige cDNA geeignet, die von einer Poly(A)⁺-RNA abgeleitet ist, welche wiederum aus einem Gewebe oder einer Zelle isoliert wurde, von dem/der bekannt ist, dass sie hohe Spiegel an Ga-Biosyntheseenzymen enthält.
Die erfindungsgemäße cDNA-Sequenz kann z.B. verwendet werden, um genomische oder weitere cDNA-Sequenzen zu isolieren, welche für GA-20-Oxidase codieren. Wenn eine partielle cDNA erhalten wurde, kann die partielle cDNA als Sonde verwendet werden, um die cDNA-Bibliothek durchzumustern, um einen Volllängen-cDNA-Klon zu isolieren. Hybridisierungsklone werden gereinigt, Restriktions-kartiert und sequenziert. Ein Volllängen-Klon wird nahezu Message-Größe haben und auch ein vollständiges offenes Leseraster haben. Um einen genomischen Klon zu isolieren, wird die Volllängen-cDNA als Sonde zur Durchmusterung einer genomischen Bibliothek eingesetzt. Durch Restriktionskartierung und Hybridisierung an die cDNA wird die codierende Region des genomischen Klons identifiziert. Der Bereich stromaufwärts vom codierenden Bereich des Klons ist der Promotorbereich.
Allgemeine Verfahren, die die Hybridisierung betreffen, sind z.B. bei T. Maniatis et al. (1982) und in B. T. Haymes et al. (1985) beschrieben [B. T. Haymes et al., Nucleic Acid Hybridisation: a Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1985)].
Klone innerhalb der oben beschriebenen Genbibliotheken, die zur Hybridisierung mit einem Sondenmolekül fähig sind und die mit Hilfe eines der oben genannten Detektionsverfahren identifiziert werden können, können weiter analysiert werden, um die Größe und die Natur der codierenden Sequenz zu bestimmen.
Ein alternatives Verfahren zur Klonierung von Genen basiert auf der Konstruktion einer Genbibliothek, die aus Expressionsvektoren besteht. Bei diesem Verfahren wird analog zu den bereits oben beschriebenen Verfahren genomische DNA, aber vorzugsweise cDNA, zunächst aus einer Zelle oder einem Gewebe, das zur Expression des gewünschten Genprodukts – im vorliegenden Fall GA-20-Oxidase – fähig ist, isoliert und dann in einen geeigneten Expressionsvektor gespleißt. Die so produzierten Genbibliotheken können dann unter Verwendung geeigneter Mittel, vorzugsweise unter Verwendung von Antikörpern durchgemustert werden, und es können solche Klone selektiert werden, die das gewünschte Gen oder wenigstens einen Teil dieses Gens als Insert umfassen.
Alternativ kann die gesamte DNA aus der DNA-Bibliothek, vorzugsweise aus der cDNA-Bibliothek, hergestellt werden und als Matrize für eine PCR-Reaktion mit Primern, die Teile der Aminosäuresequenz mit geringer Degeneriertheit darstellen, verwendet werden. Vorzugsweise werden die verwendeten Primer PCR-Produkte erzeugen, die einen signifikanten Teil der Nukleotidsequenz darstellen. Die PCR-Produkte können weiter sondiert werden, um zu bestimmen, ob sie einem Teil des GA-20-Oxidasegens entsprechen, wobei eine synthetische Oligonukleotidsonde verwendet wird, die einer Aminosäurefragmentsequenz entspricht, welche in der inneren oder mittleren Region des GA-20-Oxidaseproteins liegt.
Die cDNA-Klone und die PCR-Produkte, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, oder Fragmente davon können als Hybridisierungssonde in einem Verfahren zur Identifizierung weiterer DNA-Sequenzen aus einem homologen oder heterologen Quellenorganismus, die für ein Proteinprodukt codieren, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, z.B. aus einer monocotylen Pflanze, verwendet werden. Eine geeignete Quelle wäre sich entwickelndes Gewebe aus Mais- oder Weizenpflanzen.
Sie können auch als RFLP-Marker verwendet werden, um z.B. die Lage des GA-20-Oxidasegens oder eines eng verknüpften Zugs im Pflanzengenom zu bestimmen, oder für eine Marker-unterstützte Züchtung [EP-A-0 306 139; WO 89/07647] verwendet werden.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren ist es somit möglich, ein Gen zu isolieren, das für eine GA-20-Oxidase codiert.
Zur weiteren Charakterisierung werden die DNA-Sequenzen, die wie oben beschrieben gereinigt und isoliert worden waren, einer Sequenzanalyse unterworfen. Die vorher isolierte DNA wird zunächst mit Hilfe geeigneter Restriktionsenzyme in Fragmente gespalten und dann in geeignete Klonierungsvektoren, z.B. die M13-Vektoren mp 18 und mp 19 kloniert. Die Sequenzierung wird in 5'- zu 3'-Richtung durchgeführt, und zwar mit dem Didesoxynukleotidkettenterminierungsverfahren nach Sanger [Sanger et al., 1977] oder nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert [Maxam und Giltert, 1980] oder durch ein im Handel verfügbares Nukleotidsequenzierungsgerät [erhältlich von Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, und Dupont, Wilmington, Delaware]. Um Fehler bei der Sequenzierung zu vermeiden, ist es vorteilhaft, die zwei DNA-Stränge parallel zu sequenzieren. Die Analyse der Nukleotidsequenz und der entsprechenden Aminosäuresequenz wird unter Verwendung geeigneter, im Handel verfügbarer Computersoftware vorteilhafterweise durch Computer unterstützt (z.B. GCG-Software der University of Wisconsin].
Der Bereich stromaufwärts vom codierenden Bereich des Klons ist die Promotorregion. Die GA-20-Oxidase-Promotorregion kann durch Deletionsanalyse genauer kartiert werden. 5'-Deletionen eines GA-20-Oxidasepromotors werden hergestellt, indem durch PCR Restriktionsstellen eingeführt werden, wobei Oligonukleotidprimer mit Restriktionsstellen an den 5'-Enden und Promotorsequenzen an den 3'-Enden eingeführt werden. Die PCR-Produkte werden verdaut, gereinigt und in einen geeigneten Klonierungsvektor wie z.B. in pBI101 (Clontech) kloniert. Die Deletionsmutanten enthalten die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz an die translationale Startstelle des GUS-Gens fusioniert. Interne Deletionen und 3'-Deletionen des GA-20-Oxidase-Promotors werden durch PCR in ähnlicher Weise durchgeführt. Die PCR-Fragmente werden an einen GUS-Vektor, der den CAMV 35S-Minimalpromotor [–46 bis +1; Benfey et al., 1990] enthält, fusioniert. Transgene Pflanzen werden mit dem fluorometrischen und histochemischen GUS-Assay untersucht.
Die GA-20-Oxidase-Promotorregion kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeigneterweise für die Herstellung von Rekombinanten oder chimären DNA-Konstrukte verwendet werden, die ein GA-20-Oxidase-Strukturgen umfassen, das bezüglich der Promotorsequenz homologen oder heterologen Ursprungs sein kann.
Die vorliegende Erfindung umfasst somit außerdem rekombinante DNA-Sequenzen, die in 5'- zu 3'-Richtung eine Promotorregion, erhältlich aus einer genomischen GA-20-Oxidase-DNA-Sequenz, umfassen, wobei diese funktionell an eine für GA-20-Oxidase-codierende DNA-Sequenz gebunden ist, die bezüglich der Promotorsequenz homolog oder heterolog sein kann. Die rekombinanten DNA-Sequenzen führen zu einer Expression der assoziierten homologen oder heterologen GA-20-Oxidase in transformiertem Pflanzenmaterial.
Im Prinzip kann die DNA auch durch chemische Synthese hergestellt werden.
Nach einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Polypeptid bereit, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist. Dieses Polypeptid oder Enzym ist löslich und von 2-Oxoglutarat abhängig. Es ist fähig, z.B. auf eines oder mehrerer der folgenden Substrate zu wirken: GA₁₂, GA₅₃, GA₁₅ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₄₄ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₂₄, GA₁₉ und GA₂₃. Die GA-20-Oxidase kann aus Pflanzen, vorzugsweise aus monocotylen bzw. dicotylen Pflanzen, und bevorzugter aus dicotylen Pflanzen stammen. Eine besonders geeignete Quelle sind Pflanzen der Familie Cucurbitaceae, z.B. C. maxima, deren unreife Samen eine zweckdienliche Quelle sind. Eine weitere geeignete Quelle sind Pflanzen der Familie Cruciferae, z.B. Arabidopsis thaliana, deren Sprossenmaterial bzw. Schösslingsmaterial eine zweckdienliche Quelle ist.
Die rekombinante GA-20-Oxidase ist insbesondere von C. maxima oder Arabidopsis thaliana abgeleitet oder ist ein Protein, das wesentliche Homologie dazu hat (wie oben definiert).
Eine Ausführungsform dieses letzteren Aspektes der Erfindung ist eine GA-20-Oxidase, die die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 gezeigte Aminosäuresequenz hat. Die Erfindung umfasst auch ein Protein, das substantielle Homologie (wie oben definiert) mit dieser Aminosäuresequenz hat und GA-20-Oxidase-Aktivität hat. Modifizierte Proteine, die sich von dieser Aminosäuresequenz durch Mutation, d.h. Addition, Substitution oder Deletion einer oder mehrerer der Aminosäurereste, ableiten und GA-20-Oxidase-Aktivität haben, liegen ebenfalls im Rahmen der Erfindung.
Sobald die DNA, die für ein Polypeptidprodukt, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, identifiziert und isoliert wurde, kann ein gereinigtes Protein aus transgener Expression der DNA erhalten werden, d.h. einer rekombinante DNA, die eine DNA-Sequenz umfasst, welche für ein Protein codiert, das GA-20-Oxidase-Aktivität hat, in einem geeigneten bakteriellen, Hefe-, Pflanzen- oder anderen geeigneten Zellexpressionssystem angeordnet ist.
Geeignete Wirte umfassen Bakterien, wie z.B. E. coli und Hefen, einschließlich dem Stamm Saccharomyces cerevisiae. Andere geeignete Expressionssystemwirte umfassen Insektenzellen, die in Kultur gewachsen sind. Diese Insektenzellen können mit einem Baculovirus infiziert werden, welcher ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß der Erfindung enthält.
Alternativ kann das Baculovirus verwendet werden, um die Zellen eines lebenden Insekts zu infizieren, und die Insektenzellen können als Expressionssystemwirt verwendet werden. Der Expressionssystemwirt wird dann einen Expressionsüberstand produzieren gelassen. Dies erlaubt eine einfache Bildung großer Mengen an gereinigter rekombinanter GA-20-Oxidase durch Isolierung des Enzyms aus dem Expressionsüberstand.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein chimäres Genkonstruktur, umfassend zusätzlich zu der DNA-Sequenz gemäß der Erfindung, die für GA-20-Oxidase codiert, Expressionssignale, die sowohl Promotor- wie auch Terminatorsequenzen und andere regulatorische Sequenzen der 3'- und 5'-nicht-translatierten Regionen umfassen und die funktionell an die codierende DNA-Sequenz gebunden sind, so dass sie die Expression des entsprechenden Genproduktes in dem jeweiligen Wirtsorganismus sicherstellen.
Geeignete Kontrollsequenzen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, sind die, die nicht-translatierte regulatorische 5'- und 3'-Sequenzen umfassen, die in Pflanzen funktionell sind. Diese Sequenzen können unabhängig aus einer beliebigen Quelle stammen, z.B. aus Virus-, Pflanzen- oder Bakteriengenen. Diese Promotoren oder regulatorischen Sequenzen können konstitutiver Natur sein oder können in ihren Expressionsmustern reguliert sein. Eine solche Regulation kann temporal oder räumlich sein und durch die Entwicklung regulierte Promotoren und induzierbare Promotoren umfassen. Proteine können gegebenenfalls in der Vakuole oder extrazellulär unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, exprimiert werden ( EP 0 462 065 ).
Im allgemeinen kann ein beliebiger Promotor und ein beliebiger Terminator, der fähig ist, eine Induktion der Expression einer codierenden DNA-Sequenz (Strukturgen) zu bewirken, als Bestandteil der chimären Gensequenz gemäß der Erfindung verwendet werden. Die Expressionssignale können eine kontinuierliche und stabile Expression des Gens begünstigen. Besonders geeignet sind Expressionssignale, die aus Genen von Pflanzen oder Pflanzenviren stammen. Beispiele für geeignete Promotoren und Terminatoren sind die der Blumenkohlmosaikvirusgene (CaMV) oder homologe DNA-Sequenzen, die noch die charakteristischen Eigenschaften der genannten Expressionssignale haben. Geeignet sind auch bakterielle Expressionssignale, speziell die Expressionssignale der Nopalin-Synthasegene (nos) oder der Opin-Synthasegene (ocs) aus den Ti-Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens. Hier können z.B. auch Ubiquitin-Promotoren, Actin-Promotoren, Histon-Promotoren und Tubulin-Promotoren genannt werden. Andere geeignete Promotoren sind ein Amylase-Promotor (a-Amylase-Promotor) und ein ABA (Abscisinsäure)induzierbarer Promotor.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine Promotorregion verwendet werden, die aus einer genomischen GA-20-Oxidase-DNA-Sequenz, wie sie vorstehend beschrieben wurde, erhältlich ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird den 35S- und 19S-Expressionssignalen des CaMV-Genoms oder ihren Homologen, die aus dem Genom unter Verwendung molekular-biologischer Verfahren, wie sie z.B. in Maniatis et al. (1982) beschrieben sind, isoliert werden können und an die codierende DNA-Sequenz gebunden werden können, Präferenz gegeben.
Weiter bevorzugt sind Expressionssignale, die Gewebe-bevorzugte oder Gewebe-spezifische Promotoren umfassen. Der Ausdruck Gewebe-bevorzugter Promotor wird verwendet, um anzuzeigen, dass ein gegebenes Expressionssignal einen höheren Level der Transkription einer assoziierten exprimierbaren DNA oder der Expression des Produktes der DNA, wie es durch einen herkömmlichen RNA- oder Proteinassay bestimmt wird, hervorrufen wird oder dass eine gegebene DNA-Sequenz einen etwas anderen Effekt zeigen wird; d.h., dass die Transkription der assoziierten DNA-Sequenzen oder die Expression eines Genproduktes in einem bestimmten Gewebe höher als in anderen Geweben einer Pflanze ist. Beispielsweise kann der Gewebe-bevorzugte Promotor eine höhere Expression eines assoziierten Genproduktes in Blättern, Stengeln, Wurzeln und/oder Pollen als im Samen steuern. Ein Beispiel eines Gewebe-bevorzugten Promotors, der geeigneterweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist ein aus einem Mais-TrpA-Gen isolierter Mark-bevorzugter Promotor.
Der Ausdruck Gewebe-spezifischer Promotor wird verwendet, um anzugeben, dass eine gegebene regulatorische DNA-Sequenz die Transkription einer assoziierten exprimierbaren DNA-Sequenz ganz in einem oder mehreren Geweben einer Pflanze oder in einem Gewebe-Typ fördern wird, während im wesentlichen keine Transkription dieser assoziierten codierenden DNA-Sequenz in allen anderen Geweben oder Gewebe-Typen der Pflanze auftreten wird. Auf dem Fachgebiet sind zahlreiche Promotoren bekannt, deren Expression in Gewebe-spezifischer Art variiert. Ein solches Beispiel ist Mais-Phosphoenolpyruvatcarboxylase [PEPC], die Grüngewebe-spezifisch ist [R. L. Hudspeth und J. W. Grula, 1989]. Andere Grüngewebe-spezifische Promotoren umfassen Chlorophyll a/b-Bindungsprotein-Promotoren und RubisCo-kleine Untereinheit-Promotoren. Außerdem sind hier z.B. Pollen-spezifische Promotoren zu nennen, z.B. die, die aus einem Calcium-abhängigen Phosphatkinase[CDPK]-Pflanzengen erhältlich sind.
Es kann auch ein durch Entwicklung regulierter Promotor verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung kann selbstverständlich irgendein Promotor, der in der gewünschten Wirtspflanze funktionell ist, verwendet werden, um die Expression eines assoziierten Gens zu steuern.
Im allgemeinen kann das GA-20-Oxidase-Strukturgen mit der Promotorregion entweder in Sense- oder Antisense-Orientierung verknüpft sein.
Es ist oft vorteilhaft, eine Leader-Sequenz zwischen der Promotorsequenz und der angrenzenden codierenden DNA-Sequenz einzubauen, wobei die Länge der Leader-Sequenz so gewählt wird, dass der Abstand zwischen dem Promotor und der DNA-Sequenz gemäß der Erfindung der optimale Abstand zur Expression des assoziierten Strukturgens ist. Geeignete Leader-Sequenzen umfassen Leader-Sequenzen verschiedener Längen, die aus dem 35S CaMV-Gen isoliert sind (Pierce et al., 1987). Die bevorzugten Leader-Sequenzen sind die, die aus dem 35S CaMV-Gen isoliert sind und eine Länge von etwa 50 bis etwa 130 Nukleotide haben. Die Identifizierung anderer Leader-Sequenzen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe Della-Cioppa et al., 1987; Schekman, 1985.
Weitere regulatorische DNA-Sequenzen, die für die Konstruktion von chimären Genen verwendet werden können, umfassen z.B. Sequenzen, die zur Regulierung der Transkription einer assoziierten DNA-Sequenz in Pflanzengeweben im Sinne einer Induktion oder Repression fähig sind.
Es gibt z.B. bestimmte Pflanzengene, von denen bekannt ist, dass sie durch verschiedene interne und externe Faktoren induziert werden, z.B. durch Pflanzenhormone, Wärmeschock, Chemikalien, Pathogene, Sauerstoffmangel, Licht, Stress usw.
Eine andere Klasse von Genen, die in Pflanzen geeignet sind, umfasst die Licht-regulierten Gene, speziell das Kern-codierte Gen der kleinen Untereinheit von Ribulose-l,5-biphosphatcarboxylase (RUBISCO). Morelli et al. (1985) haben gezeigt, dass die 5'-flankierende Sequenz eines RUBISCO-Gens aus der Erbse fähig ist, Licht-Induzierbarkeit auf ein Reportergen zu transferieren, vorausgesetzt, dass letztgenannte ist in chimärer Form an die Sequenz gebunden. Es war auch möglich, diese Betrachtung auf andere Licht-induzierte Gene, z.B. das Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein auszudehnen.
Eine weitere Gruppe regulierbarer DNA-Sequenzen umfasst chemisch regulierbare Sequenzen, die z.B. im PR (mit Pathogenese in Verbindung stehenden) Protein-Gene von Tabak vorliegen und mit Hilfe chemischer Regulatoren, wie z.B. denen, die in EP-A-0 332 104 beschrieben sind, induzierbar sind.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird ein Promotor des Arabidopsis PR1a-Gens verwendet.
Die oben beispielhaft genannten regulierbaren DNA-Sequenzen können sowohl natürlichen wie auch synthetischen Ursprungs sein oder sie können ein Gemisch aus natürlichen und synthetischen DNA-Sequenzen umfassen.
Die rekombinanten DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können außerdem eine Signalsequenz umfassen, die funktionell an die codierende DNA-Sequenz gebunden sind. Die Signalsequenz ist für einen spezialisierten Transport des assoziierten Peptids innerhalb der Pflanzenzelle verantwortlich.
Die Signalsequenz der vorliegenden Erfindung kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die fähig ist, den Transport eines assoziierten Polypeptids in ein zelluläres Kompartiment oder mehrere der zellulären Kompartimente zu lenken. Die Signalsequenz ist vorzugsweise eine Sequenz, die in ein Signalpeptid translatiert wird, welches nachdem der Transit des Peptids vervollständigt ist, vom Peptid abgetrennt wird. Signalsequenzen sind zur Lenkung des Polypeptidproduktes der codierenden DNA-Sequenz an einen gewünschten Ort innerhalb der Zelle, z.B. zu den Mitochondrien oder zum endoplasmatischen Reticulum, einsetzbar oder zur Lenkung des extrazellulären Transports außerhalb der Zelle einsetzbar.
Zu nennen sind hier z.B. N-terminale Signalpeptide, die beim intrazellulären Transport involviert sind und die am N-terminalen Ende von Proteinen, die über das Endomembransystem transportiert werden, gefunden werden. Diese Signalsequenzen stellen sicher, dass die Proteine zunächst in das endoplasmatische Reticulum gehen, wo das Signalpeptid proteolytisch vom Vorläuferprotein abgespalten wird, sobald es seine Funktion erfüllt hat. Durch seine spezifische Funktion wurde dieser Typ einer Signalpeptidsequenz während der Evolution in allen lebenden Zellen zu einem hohen Grad konserviert, ungeachtet ob diese Bakterien, Hefen, Fungi, Tiere oder Pflanzen sind.
Am C-terminalen Ende von vakuolären Proteinen können andererseits Sequenzen gefunden werden, die bei der Steuerung der Expression des assoziierten codierenden Teils der Pflanzenvakuole involviert sind. Beispiele für diese sogenannten "vacuolar Targeting"-Sequenzen sind z.B. in EP-A-0 462 065 angeführt.
Darüber hinaus kann das DNA-Molekül weiter Sequenzabschnitte umfassen, die für Peptidfragmente codieren, welches als Ganzes zur Verbesserung der Kompetenz für einen Zugang in die Vakuole beitragen, z.B. das Propeptidfragment, das von K. Matsuoka und K. Nakamura in der N-terminalen Extension von Sporamin entdeckt wurde [K. Matsuoka und K. Nakamura (1991)].
Weitere Signalsequenzen, die für die vorliegende Erfindung einsetzbar sind, sind z.B. die Signalsequenz aus dem mit Pathogenese in Verbindung stehenden Tabakgen (PR-1), das bei Cornellisen et al., 1986 beschrieben wird; die Hefe-Mitochondrienpräsequenz; Schmitz et al., 1989; die Signalsequenz aus dem Pflanzenmitochondrien-Rieske-Eisen-Schwefel-Protein, Huang et al., 1991; Mitochondrien- und Chloroplasten-Targetingpeptide, von Heijne et al., 1989.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher auch chimäre gentische Konstruktionen, die in funktioneller Verknüpfung mit einem Strukturgen, das für GA-20-Oxidase codiert, weitere regulatorische Sektionen einer DNA-Sequenz umfassen, die z.B. eine spezifisch kontrollierte Induktion oder Repression der Genexpression erlaubt.
Als Modifikation des obigen Aspekts stellt die Erfindung auch ein chimäres Genkonstrukt bereit, das wenigstens einen Teil einer reversen GA-20-Oxidase-Nukleotidsequenz, die an ihrem 5' einen Promotor hat, der fähig ist, zu bewirken, dass die reverse Sequenz Antisense-mRNA innerhalb einer Pflanze exprimiert, und gegebenenfalls weitere regulatorische DNA-Sequenzen, wie z.B. die oben genannten, umfaßt.
Die verschiedenen Sektionen der chimären DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung können durch per se bekannte Verfahren miteinander verknüpft werden, um so eine vollständige codierende DNA-Sequenz zu bilden. Geeignete Verfahren umfassen z.B. die in vivo-Rekombination von DNA-Sequenzen, die homologe Sektionen haben, und die in vitro-Verknüpfung von Restriktionsfragmenten.
In den obigen in vivo- und/oder in vitro-Prozessen zum Zusammenbau der verschiedenen Sektionen der funktionellen Einheit können Klonierungsvektoren, wie z.B. Plasmid- oder Virus(Bakteriophagen)-Vektoren, die Replikations- und Kontrollsequenzen haben, welche aus Spezies stammen, die mit spezifischen Wirtszellen kompatibel sind, involviert sein.
Der Klonierungsvektor trägt im allgemeinen einen Replikationsursprung, speziell einen Replikationsursprung, der fähig ist, in E. coli, in Agrobacterium oder in beiden zu funktionieren, und außerdem spezifische Gene, die zu phänotypischen Selektionsmerkmalen in der transformierten Wirtszelle, speziell zur Resistenz gegenüber Antibiotika oder gegenüber spezifischen Herbiziden, führen. Die transformierten Vektoren können auf der Basis dieser phänotypischen Marker nach der Transformation in einer Wirtszelle selektiert werden.
Die Klonierungsvektoren und die mit diesen Vektoren transformierte Wirtszelle werden im allgemeinen verwendet, um die Kopienzahl der Konstrukte zu erhöhen, die darin kloniert sind. Mit einer erhöhten Kopienzahl ist es möglich, den Vektor zu isolieren, der die chimäre Genkonstruktion trägt, und ihn z.B. zur Insertion der chimären Gensequenz in eine Pflanzenstelle zu präparieren.
Im Rahmen der Erfindung sind sogenannte Shuttle-Vektoren besonders geeignet, welche in stabiler Weise nicht nur in einem, sondern in wenigstens zwei unterschiedlichen Wirtsorganismen, wie z.B. in E. coli und in Agrobacterium tumefaciens, in Gegenwart eines geeigneten Selektionsmarkers replizieren können.
Selektierbare phänotypische Marker, die im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen z.B. Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin, Hygromycin, Kanamycin, Methotrexat, G418 und Neomycin, wobei diese Liste, die nur als Beispiel aufgeführt ist, den Gegenstand der Erfindung nicht beschränken soll.
Geeignete Wirtszellen im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Prokaryonten, einschließlich Bakterienwirte, z.B. A. tumefaciens, E. coli, S. typhimurium und Serratia marcescens und auch Cyanobakterien. Eukaryotische Wirte, wie z.B. Hefe, Mycelium-bildende Pilze und Pflanzenzellen, können im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
Das Spleißen der erfindungsgemäßen chimären Genstruktion in einen geeigneten Klonierungsvektor wird unter Verwendung von Standardmethoden durchgeführt, z.B. solche, die beispielsweise bei Maniatis et al. (1982) und Sambrook et al. (1989) beschrieben sind.
In einem weiteren Verfahrensschritt wird das klonierte Strukturgen, das für GA-20-Oxidase codiert, in eine der üblicherweise verwendeten Pflanzentransformationskassetten eingeführt werden und unter Verwendung von Standardtechniken in eine Pflanze transformiert werden und gegebenenfalls in das Pflanzengenom integriert werden.
Die Detektion einer transformierten Pflanzenzelle kann unter Verwendung geeigneter Selektionssysteme erfolgen.
Äußerst zweckdienliche Selektionssysteme, die vorzugsweise in transienten Expressionssystemen eingesetzt werden, sind die, die auf einem Punkt-bewertbaren Marker basieren, z.B. regulatorische oder strukturelle Gene, die eine Anthocyanin-Biosynthese kontrollieren, GUS (β-Glucuronidase), Luciferase, Opine-Synthetasen, Thaumatin, β-Galactosidase, einzigartige synthetische Epitope, die zur einfachen Detektion durch ELISA konzipiert sind, Phycobiliproteine und verschiedene fluorogene Substanzen.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird von dem Markersystem auf "GUS"-Basis Gebrauch gemacht, welches eine DNA-Sequenz involviert, die für ein β-Glucuronidaseenzym codiert und funktionell mit einem oder mehreren der oben aufgelisteten Expressionssignale verknüpft ist. Bei Expression des GUS-Gens in der Pflanzenzelle kann das β-Glucuronidaseenzym mit seinem spezifischen Substrat reagieren, was zum Auftreten von blauen Punkten führt, die im Pflanzengewebe einfach detektiert werden können.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden codierende Sequenzen für die regulatorischen Anthocyanin-Gene verwendet, die auf dem Fachgebiet als C1 und B-Peru [Goff et al., 1990] bekannt sind. Solche codierenden Sequenzen, die funktionell mit einem oder mehreren der oben aufgelisteten konstitutiven Promotoren verknüpft sind, können eingesetzt werden, um Transformanten auf der Basis der roten Pigmentierung von Zellen, die mit solchen Genen transformiert sind, zu isolieren. Das Markersystem auf "Anthocyanin"-Basis involviert dagegen eine rote Farbreaktion.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine transformierte Wirtszelle bereit, umfassend rekombinante DNA, die für ein Polypeptid codiert, welches GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, in funktioneller Verknüpfung mit Expressionssignalen, die Promotor- und Terminationssequenzen einschließen, die eine Expression der DNA in der Wirtszelle erlauben. Wenn die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist, können transgene Pflanzen erhalten werden. Auf diese Weise liefert die vorliegende Erfindung erstmals eine transgene Pflanze mit einem veränderten GA-Biosyntheseweg, insbesondere eine Pflanze, die ein rekombinantes GA:2-Oxoglutarat-Dioxygenase-Gen enthält und fähig ist, dieses zu exprimieren. Auf diese Weise wird eine transgene Pflanze bereitgestellt, die eine rekombinante DNA, welche für ein Polypeptid codiert, das GA-20-Oxidase-Aktivität hat, in funktioneller Verknüpfung mit Pflanzenexpressionssignalen, einschließlich Promotor- und Terminationssequenzen, die eine Expression der DNA in der Pflanze erlauben, umfasst.
Eine Modifikation des obigen Aspekts der Erfindung ist die Transformation einer Pflanze mit einem Konstrukt, das eine reverse GA-20-Oxidase-Nukleotidsequenz (die gesamte codierende Sequenz oder einen Teil davon) enthält, zur Transkription von Antisense-mRNA und die anschließende reduzierte Expression des GA-20-Oxidase-Gens. Beispiele für Antisense-Technologie sind in EP-A-0 240 208 (Calgene) und EP-A-0 458 367 (Calgene) bereitgestellt. Die reverse Nukleotidsequenz kann mit einem Promotor in Verbindung stehen, der für bestimmte Pflanzengewebe und/oder einen externen Stimulus (z.B. Licht, Kälte, Wärme, Chemikalien usw.) spezifisch ist. Ein weiteres mögliches Mittel zur Reduktion der Expression ist z.B. die Verwendung der Ribozymtechnologie, wie sie in EP-A-0 321 201 oder in WO 89/05852 beschrieben ist. Eine Kombination aus Antisense- und Ribozym-Technologie kann auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Regulierung der GA-20-Oxidase-Aktivität eingesetzt werden.
Ferner kann eine Überexpression des GA-20-Oxidase-Gens in Pflanzen zu verringerten Leveln an biologisch aktiven Gibberellinen in Pflanzen führen.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Nachkommenschaft oder Ableger, einschließlich Samen, von transgenen Pflanzen, wie sie oben definiert wurden. Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Herstellung von solchen transgenen Pflanzen.
Die rekombinante DNA gemäß der Erfindung, die die für GA-20-Oxidase codierende DNA-Sequenz umfasst, kann auf eine Vielzahl von Wegen, die dem Fachmann bekannt sind, in die Pflanzenzelle eingeführt werden. Verfahren zum Transformieren von Pflanzenzellen umfassen z.B. Mikroinjektion [Crossway et al. (1986); Neuhaus (1987)], Elektroporation [Riggs et al. (1986)], Agrobacterium-vermittelte Transformation [Hinchee et al. (1988)], direkten Gentransfer [Paszkowski et al., (1984)] und ballistische Partikelbeschleunigung unter Verwendung von z.B. Vorrichtungen, die von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin und Dupont, inc., Wilmington, Delaware erhältlich sind [siehe z.B. Sanford et al., US-Patent 4,945,050 und McCabe et al., (1988). Siehe auch Weissinger et al. (1988); Sanford et al. (1987) (Zwiebel); Christou et al. (1988) (Sojabohne); McCabe et al. (1988) (Sojabohne); Datta et al. (1990) (Reis); Klein et al. (1988) (Mais); Klein et al. (1988) (Mais); Klein et al. (1989) (Mais); Fromm et al. (1990); Gordon-Kamm et al. (1990) (Mais)].
Ein mögliches Verfahren zur Einführung von genetischem Material in Pflanzenzellen umfasst z.B. in Kontaktbringen von Pflanzenzellen mit Viren oder Agrobacterium, die/das die einzuführende DNA umfasst. Dies kann erreicht werden, indem empfindliche Pflanzenzellen infiziert werden oder indem aus Pflanzenzellen stammende Protoplasten cokultiviert werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) als Vektor für die Insertion der für GA-20-Oxidase-codierenden DNA-Sequenz gemäß der Erfindung in eine Pflanze verwendet werden.
Ein anderes Verfahren zum Insertieren einer für GA-20-Oxidase-codierenden DNA-Sequenz in eine Zelle nutzt die Infektion der Pflanzenzelle mit Agrobacterium tumefaciens und/oder Agrobacterium rhizogenes, das vorher mit der Genkonstruktion transformiert worden ist. Die transgenen Pflanzenzellen werden dann unter geeigneten Kulturbedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, kultiviert, so dass sie Schösslinge bzw. Sprossen und Wurzeln bilden und schließlich ganze Pflanzen gebildet werden.
Ein weiteres mögliches Verfahren zum Transformieren von Pflanzenmaterial umfasst eine Mischinfektion unter Verwendung sowohl Agrobacterium rhizogenes als auch transformiertem Agrobacterium tumefaciens, wie es von Petit et al. (1986) für die Transformation von Karotten beschrieben wurde.
Die für GA-20-Oxidase-codierende DNA-Sequenz gemäß der Erfindung kann daher mit Hilfe z.B. des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens oder des Ri-Plasmids von Agrobacterium rhizogenes in geeignete Pflanzenzellen transferiert werden. Das Ti-Plasmid oder Ri-Plasmid wird im Verlauf der Infektion durch Agrobacterium zur Pflanze transferiert und in geeigneter Weise in das Pflanzengenom integriert.
Ein beliebiger T-DNA-enthaltender Vektor, der in Pflanzenzellen transferiert werden kann und eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt, ist für eine Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet, z.B. ein Shuttle-Vektor, der die GA-20-Oxidase-codierende DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, die zwischen die linke Randsequenz (LB) und die rechte Randsequenz (RB) kloniert ist, umfasst und der zur stabilen Replikation sowohl in E. coli als auch in A. tumefaciens geeignet ist. Bevorzugt ist ein sogenanntes binäres Vektorsystem.
Unter Verwendung neu entwickelter Transformationstechniken wurde es im Prinzip auch möglich, Pflanzenspecies in vitro zu transformieren, die keine natürlichen Wirtspflanzen für Agrobacterium sind. Monocotylenpflanzen beispielsweise, speziell die Getreidespezies und verschiedene Gräser, sind keine natürlichen Wirte für Agrobacterium.
Es wurde zunehmend klar, dass Monocotylen auch unter Verwendung von Agrobacterium transformiert werden können, so dass auch Getreide- und Grasspezies unter Verwendung neuer experimenteller Formulierungen, die nun in zunehmenden Maße zur Verfügung stehen, einer Transformation zugänglich sind [N. H. Grimsley et al. (1987)].
Eines der bevorzugten Verfahren zur Einführung von DNA mit Hilfe von Agrobacterium in eine Pflanzenzelle ist die sogenannte Blattscheibentransformation unter Verwendung von Agrobacterium [Horsch et al. (1985)]. Sterile Blattscheiben aus einer geeigneten Zielpflanze werden mit Agrobacterium-Zellen, die eine der für GA-20-Oxidase-codierenden DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung umfassen, inkubiert und dann in oder auf ein geeignetes Nährmedium übertragen. Besonders geeignet und daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind LS-Medien, die durch Zusatz von Agar verfestigt wurden und die mit einem oder mehreren der Pflanzenwachstumsregulatoren, die üblicherweise verwendet werden, angereichert wurden; diese sind speziell die, die aus der Gruppe von Auxinen, bestehend aus a-Naphthylessigsäure, Picloram, 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Indol-3-buttersäure, Indol-3-milchsäure, Indol-3-bernsteinsäure, Indol-3-essigsäure und p-Chlorphenoxyessigsäure, und aus der Gruppe der Cytokinine, bestehend aus Kinetin, 6-Benzyladenin, 2-Isopentenyladenin und Zeatin, ausgewählt sind. Die bevorzugte Konzentration an Auxinen und Cytokinen liegt im Bereich von 0,1 mg/l bis 10 mg/l.
Nach einer Inkubation für mehrere Tage, vorzugsweise aber nach einer Inkubation für 2 bis 3 Tage bei einer Temperatur für 20°C bis 40°C, vorzugsweise von 23°C bis 35°C und vor allem bei 25°C, und bei diffusem Licht werden die Blattscheiben zum Zwecke einer Schösslingsinduktion auf ein geeignetes Medium transferiert. Für die Selektion der Transformanten ist ein LS-Medium, das kein Auxin, stattdessen aber Cytokinin enthält, und dem eine selektive Substanz in Abhängigkeit vom verwendeten Markergen zugesetzt wurde, besonders bevorzugt. Die Kulturen werden im Licht gehalten und in geeigneten Intervallen, vorzugsweise aber in Intervallen von einer Woche, auf frisches Medium transferiert. Sich entwickelnde grüne Schösslinge werden ausgeschnitten und in einem Medium, dass die Schösslinge zur Bildung von Wurzeln induziert, weiter kultiviert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein LS-Medium besonders bevorzugt, das kein Auxin oder Cytokinin enthält, sondern dem eine selektive Substanz zur Selektion der Transformanten zugesetzt wurde.
Zusätzlich zur Agrobacterium-vermittelten Transformation im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es möglich, direkte Transformationsmethoden für die Insertion der Genkonstruktionen gemäß der Erfindung in Pflanzenmaterial zu verwenden.
Mögliche Methoden bzw. Verfahren für den direkten Transfer von genetischem Material in eine Pflanzenzelle umfassen z.B. die Behandlung von Protoplasten unter Anwendung von Verfahren, die die Plasmamembran modifizieren, z.B. Polyethylenglykolbehandlung, Hitzeschockbehandlung oder Elektroporation oder eine Kombination dieser Verfahren [Shillito et al. (1985)].
Bei der Elektroporationstechnik werden Pflanzenprotoplasten zusammen mit Plasmiden, die die für GA-20-Oxidase-codierende DNA-Sequenz umfassen, elektrischen Pulsen mit Hochfeldspannung unterworfen. Dies führt zu einer reversiblen Erhöhung der Permeabilität von Biomembranen und erlaubt die Insertion der Plasmide. Elektroporierte Pflanzenprotoplasten erneuern ihre Zellwand, teilen sich und bilden Callusgewebe. Eine Selektion der transformierten Pflanzenzellen kann mit Hilfe der oben beschriebenen phänotypischen Marker stattfinden.
Ein weiteres Verfahren für die direkte Einführung von genetischem Material in Pflanzenzellen, das lediglich auf chemischen Verfahrensschritten beruht und das es möglich macht, dass die Transformation sehr effizient und schnell durchgeführt wird, wird bei L. Negrutiu et al. (1987) beschrieben.
Für die Transformation von Pflanzenmaterial ist auch ein direkter Gentransfer unter Verwendung einer Co-Transformation geeignet (R. J. Schocher et al., 1986).
Eine Co-Transformation ist ein Verfahren, das auf der gleichzeitigen Aufnahme und Integration verschiedener DNA-Moleküle (nicht-selektierbare und selektierebare Gene) in das Pflanzengenom basiert und das daher die Detektion von Zellen ermöglicht, die mit nicht-selektierbaren Genen transformiert wurden.
Weitere Mittel zum Insertieren genetischen Materials, das in einem Vektor enthalten ist, direkt in eine Pflanzenzelle umfassen die Verwendung rein physikalischer Verfahren, z.B. durch Mikroinjektion unter Verwendung fein ausgezogener Mikropipetten [Neuhaus et al. (1987)] oder durch Beschuss der Zellen mit Mikroprojektilen, die mit der transformierenden DNA beschichtet sind ["Microprojectile Beschuss"; Y-C Wang et al. (1988)] oder durch eine DNA-enthaltende Lösung in Richtung der Zellen, die zu transformieren sind, durch Druckeinwirkung, wodurch diese mit der Lösung als Resultat der Druckeinwirkung fein zu Nebel atomisiert wird [EP-A-0 434 616].
Mikroprojektil-Beschuss wurde zu einer wirksamen Transformationstechnik für Zellen, einschließlich Pflanzenzellen, entwickelt. In Sanford et al. (1987) wurde berichtet, dass ein Mikroprojektil-Beschuss effektiv war, um Nukleinsäure in das Cytoplasma von Pflanzenzellen von Allium cepa (Zwiebel) abzugeben. Christou et al. (1988) beschreiben die stabile Transformation von Sojabohnencallus mit einem Kanamycinresistenzgen über Mikroprojektil-Beschuss. Christou et al. beschrieben eine Penetration bei etwa 0,1% bis 5% Zellen. Christou berichtete außerdem über wahrnehmbare Level an NPTII-Enzym-Aktivität und Resistenz in den transformierten Calli von bis zu 400 mg/l Kanamycin. McCabe et al. (1988) beschreiben die stabile Transformation von Glycine max (Sojabohne) unter Anwendung des Mikroprojektil-Beschusss. McCabe et al. beschreiben außerdem die Gewinnung einer transformierten R₁-Pflanze aus einer chimären R₀-Pflanze.
Die Transformation von Maispflanzen, einschließlich Elitemaispflanzen, durch Mikroprojektil-Beschuss, kann nach dem allgemeinen Protokoll durchgeführt werden, das beispielsweise in EP-A-0 0478 502 beschrieben wird, deren Offenbarung hier durch Referenz aufgenommen wird.
Es wird kein Anspruch erhoben, dass die oben als Beispiel angegebene Liste möglicher Transformationsverfahren vollständig ist, und es ist nicht beabsichtigt, den Gegenstand der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher auch transgenes Pflanzenmaterial, das aus der Gruppe, bestehend aus Protoplasten, Zellen, Calli, Geweben, Organen, Samen, Embryos, Ovulum, Zygoten usw. und speziell ganzen und vorzugsweise phänotypisch normalen Pflanzen, ausgewählt ist, das vorher mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren transformiert worden war und das die rekombinante DNA gemäß der Erfindung in exprimierbarer Form umfasst, und Verfahren zur Hestellung des transgenen Pflanzenmaterials.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind monocotyle Pflanzen, einschließlich Samen und der Nachkommenschaft oder Ableger davon, speziell aber grasartige Monocotylen, wie z.B. Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale und Setaria, bevorzugt. Besonders bevorzugt sind transgener Mais, Weizen und Gerstepflanzen und Samen davon.
Ein Screening von Pflanzenzellen, -gewebe und Pflanzen auf das Vorliegen spezifischer DNA-Sequenzen kann durch Southern-Analyse (Southern, 1975) durchgeführt werden. Details dieses Verfahrens werden bei Maniatis et al. (1982) gegeben. Dieses Screening kann auch durch Verwendung von Polymerasekettenreaktions-Verfahren (PCR) durchgeführt werden. PCR-Verfahren sind detailliert bei Mullis et al. (1987) und A. Ehrlich (1989) beschrieben.
Eine Transformation der Pflanzenzellen beinhaltet ein Abtrennen transformierter Zellen von denen, die nicht transformiert wurden. Ein zweckdienliches Verfahren für eine derartige Trennung oder Selektion besteht darin, in das Material, das in die transformierte Zelle insertiert werden soll, ein Gen für ein Selektionsmarker einzubauen. Als Resultat werden nur jene Zellen, die erfolgreich transformiert wurden, das Markergen enthalten. Das Translationsprodukt des Markergens wird dann ein phänotypisches Merkmal verleihen, das eine Selektion möglich macht. Üblicherweise ist das phänotypische Merkmal die Fähigkeit, in Gegenwart eines bestimmten chemischen Agens, z.B. eines Antibiotikums, wie Kanamycin, G418, Paromomycin usw., das in einem Selektionmedium vorhanden ist, zu überleben.
Einige Beispiele für Gene, die Antibiotika-Resistenz verleihen, umfassen z.B. solche, die für Neomycin-Phosphotransferase-Kanamycinresistenz [Velten et al. (1984)]; Hygromycinphosphotransferase (Hygromycinresistenz, [van den Elzen et al. (1985)] codieren, das Kanamycinresistenz(NPTII)-Gen, das von Tn5 Bevan et al. (1983) stammt; [McBride et al. (1990)], das PAT-Gen, das von Thompson et al. (1987) beschrieben wurde, und Chloramphenicolacetyltransferase.
Ein Beispiel für ein Gen, das in erster Linie als durchmusterbarer Marker in Gewebekultur zur Identifizierung von Pflanzenzellen, die genetisch veränderte Vektoren enthalten, einsetzbar ist, ist ein Gen, das für ein Enzym codiert, das ein chromogenes Produkt produziert. Ein Beispiel ist das Gen, das für die Produktion von β-Glucuronidase (GUS) codiert. Dieses Enzym wird in großem Umfang eingesetzt und seine Herstellung und Verwendung ist in Jefferson (1987) beschrieben.
Sobald die transformierten Pflanzenzellen auf dem Selektionsmedium kultiviert wurden, werden überlebende Zellen für eine weitere Untersuchung und Manipulation selektiert. Selektionsverfahren und -materialien sind dem Fachmann wohlbekannt, der überlebende Zellen mit einem hohen Grad der Vorhersagbarkeit auswählen kann, so dass die ausgewählten Zellen mit der exogenen DNA erfolgreich transformiert waren.
Nach Transformation der Pflanzenzelle oder der Pflanze unter Verwendung beispielsweise des Agrobacterium-Ti-Plasmids können solche Pflanzenzellen oder Pflanzen, die durch das Ti-Plasmid transformiert sind, so dass das Enzym exprimiert wird, durch einen geeigneten phänotypischen Marker selektiviert werden. Diese phänotypischen Marker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Antibiotika-Resistenz. Andere phänotypische Marker sind auf dem Fachgebiet bekannt und können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Positive Klone werden nach Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, regeneriert. Anschließend werden transformierte Pflanzen auf das Vorliegen der gewünschten Eigenschaften und/oder dem Ausmaß, zu dem die gewünschten Eigenschaften exprimiert sind, beurteilt. Eine erste Beurteilung kann z.B. den Level der bakteriellen/fungalen Resistenz der transformierten Pflanzen, stabile Vererbbarkeit der gewünschten Eigenschaften, Feldversuche und dergleichen umfassen.
Das Verfahren zur Herstellung von transformiertem Pflanzenmaterial, einschließlich ganzer Pflanzen, umfasst somit im wesentlichen:

– Zuerst Isolieren einer DNA-Sequenz, die für ein Protein codiert, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist, aus einer geeigneten Quelle oder Synthetisieren mit Hilfe bekannter Verfahren;
– funktionelles Verknüpfen der DNA-Sequenz in einer 5'- zu 3'-Richtung an Pflanzenexpressionssequenzen, wie sie vorher definiert wurden;
– Transformieren des Konstrukts von Schritt (b) in Pflanzenmaterial mit Hilfe bekannter Verfahren und Exprimieren desselben darin;
– Screening des Pflanzenmaterials, das gemäß Schritt (c) behandelt wurde, auf Vorliegen einer DNA-Sequenz, die für ein Protein codiert, das GA-20-Oxidase-Aktivität aufweist; und gegebenenfalls
– Regenerieren des gemäß Schritt (c) transformierten Pflanzenmaterials zu einer ganzen und vorzugsweise phänotypisch normalen Pflanze.

Die vorliegende Erfindung umfasst somit auch transgene Pflanzen und die sexuelle und/oder asexuelle Nachkommenschaft davon, die mit einer rekombinanten DNA-Sequenz gemäß der Erfindung transformiert worden sind.
Der Ausdruck "asexuelle oder sexuelle Nachkommenschaft transgener Pflanzen" beinhaltet durch Definition gemäß der Erfindung alle Mutanten und Varianten, die mittels bekannter Verfahren erhältlich sind, z.B. durch Zellfusion und Mutantenselektion, und die noch die charakteristischen Eigenschaften der ursprünglichen transformierten Pflanze aufweisen, zusammen mit allen Kreuzungs- und Fusionsprodukten des transformierten Pflanzenmaterials.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung betrifft das Proliferationsmaterial von transgenen Pflanzen. Das Proliferationsmaterial von transgenen Pflanzen ist für die Erfindung als ein beliebiges Pflanzenmaterial definiert, das in vivo oder in vitro sexuell vermehrt werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Protoplasten, Zellen, Calli, Gewebe, Organe, Samen, Embryos, Eizellen, Zygoten zusammen mit beliebigem anderen Vermehrungsmaterial, das aus transgenen Pflanzen erhalten wird, bevorzugt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung eines Antikörpers, der gegen wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz der GA-20-Oxidase gerichtet ist. Ein derartiger Antikörper ist beim Screening einer cDNA- Bibliothek in geeigneten Vektoren, die aus Pflanzengewebe-RNA abgeleitet sind, einsetzbar.
Das GA-20-Oxidasegen gemäß der Erfindung ist bei der Wachstumsmodifikation und bei Entwicklungsprozessen in transgenen Pflanzen nützlich. Beispielsweise kann eine verringerte Expression mit Antisense-RNA zu einer niedrigen GA-Produktion und daher zu einem verminderten Längenwachstum führen. Die 20-Oxidase ist ein regulatorisches Enzym und die GA-Produktion kann für ihre Aktivität besonders empfindlich sein. Sie wird bekanntermaßen durch die Tag-Länge bei Lang-Tag-Rosenpflanzen, z.B. Spinat, reguliert, bei denen eine verstärkte 20-Oxidase-Aktivität an langen Tagen für eine Schosserbildung verantwortlich ist. Ein Modifizieren der Expression dieses Gens kann daher von besonderem Nutzen sein. Andere GA-regulierte Prozesse, die potentielle Ziele für eine Manipulation darstellen, sind Samenkeime, Blumeninitiierung und -entwicklung, Fruchtansatz und -wachstum und Geschlechtstyp bei einigen diözischen Spezies.
So werden nach einem Aspekt der Verwendung dieser Erfindung reverse 20-Oxidase-Nukleotidsequenzen und Gewebe- und/oder Stimulus (d.h. Licht, Wärme, Kälte, Chemikalie usw.)-spezifische Promotoren zur Transformation von Pflanzen verwendet, um so Antisense-mRNA zu transkribieren, was zu einer verringerten Expression des 20-Oxidasegens führt. Dieses Verfahren produziert Pflanzen mit reduzierten endogenen GA-Leveln und folglich verändertem Wuchshabitus und/oder anderen Entwicklungsprozessen.
Dieses Verfahren kann verwendet werden, um vegetatives Wachstum zu verringern, wie:
Strohverstärkung in kleinkörnigen Cerealien und Reis;
zur Prävention des Niederliegens;
Verhinderung des Niederliegens bei Ölsamenraps und Verbesserung seiner Blätterdachstruktur;
Verbesserung der Sämlingsqualität zur Transplantation;
Reduzierung des Wachstums von Rasen- und Anlagengräsern;
Verringerung des Schösslingswachstums bei Obstplantagen- und -anlagengräsern;
Reduzierung des Schösslingswachstums bei Obstplantagen- und -anlagenbäumen;
Herstellen von Zierpflanzen mit kompakterem Wachstumshabitus;
Verbesserung der Toleranz gegen Kälte, Trockenheit und Pilzinfektion; und
Erhöhung der Ausbeute durch Diversion von Assimilaten aus vegetativen bzw. reproduktiven Organen.
Das Verfahren ist auch einsetzbar, um eine Schosserbildung und ein Blühen bei Rosettenpflanzen, wie z.B. Rüben, Salat, Spinat und Kohl zu verhindern. Es ist einsetzbar, um ein Austreiben zu verhindern, wie bei Kartoffelknollen. Es ist auch einsetzbar, um eine frühzeitige Samenkeimung zu verhindern.
Die Erfindung ist auch bei der Transformation von Pflanzen mit Konstrukten, die die 20-Oxidase-Sequenz und Gewebe- und/oder Stimulus-spezifische Promotoren enthalten, für eine verstärkte Expression des GA-20-Oxidasegens verwendbar. Dieses Verfahren wird die Level biologisch aktiver GAs erhöhen und so die Pflanzenentwicklung in Fällen modifizieren, in denen 20-Oxidation ein Geschwindigkeit limitierender Schritt ist. Das Verfahren kann auch zur Verbesserung des Fruchtstandes und des Wachstums in folgenden Fällen verwendet werden: Erhöhung der Beerengröße bei kernlosen Trauben (auch bei der Erhöhung der Rachislänge und zur Produktion weniger kompakter Cluster); bei der Erhöhung des Fruchtansatz bei Zitrusfrüchten, insbesondere bei Clementinen; Verzögerung der Reifung bei Zitrusfrüchten; Verbesserung des Fruchtansatzes bei Birnen und Verringerung der Samenzahl; und zur Modifizierung der Form der Apfelfrucht und zur Verbesserung der Hauttextur.
Das Verfahren kann potentiell verwendet werden, um eine Stammverlängerung und eine Blattausdehnung zu erhöhen, z.B. um die Stengellänge und die Zuckerausbeute bei Zuckerrohr zu erhöhen; um die Ausbeute und die Frühzeitigkeit bei Sellerie und Rhabarber zu erhöhen; um die Ausbeute bei Kohl, Salat, Spinat usw. zu erhöhen und um die Futterausbeute bei Weideland zu erhöhen. Das Verfahren kann eingesetzt werden, um die Samenkeimung zu stimulieren, z.B. beim Fortschreiten des Mälzens, und um die Malzausbeute bei Getreiden (z.B. Gerste, Weizen, Hafer) zu erhöhen. Das Verfahren kann verwendet werden, um ein gleichmäßiges Schossen zu erzeugen und das Blühen zu stimulieren, beispielsweise bei der Samenproduktion von Salat und anderen Rosettenspezies, oder bei der Ernteverfrühung von Artischocken. Das Verfahren kann eingesetzt werden, um eine Blütenbildung bei Koniferen zu induzieren. Es kann auch verwendet werden, um die Ruhe von Knollen zu überwinden und einen Schösslingsauswuchs wie bei Kartoffeln, Guldenbaum usw. zu beschleunigen. Außerdem kann das Verfahren eingesetzt werden, um männliche Blüten bei Gynözeum-Spezies, wie z.B. Gurken, zu induzieren.
Im Folgenden wird nun auf das beigefügte Sequenzprotokoll und die Figuren Bezug genommen, worin:
SEQ ID NO: 1 die Nukleotidsequenz von GA-20-Oxidase-cDNA-Klon pB11, der aus Curcubita maxima-Samen erhalten worden war, zeigt;
SEQ ID NO: 2 die Aminosäuresequenz des GA-20-Oxidaseproteins, das cDNA-Klon pB11 entspricht, zeigt;
SEQ ID NO: 3 die Nukleotidsequenz von GA-20-Oxidase-cDNA-Klon pAt2301 zeigt, der aus Arabidopsis thaliana erhalten worden war;
SEQ ID NO: 4 die Aminosäuresequenz des GA-20-Oxidaseproteins zeigt, das cDNA-Klon pAT2301 entspricht;
SEQ ID NO: 5 die Nukleotidsequenz des GA-20-Oxidase-cDNA-Klons pAt2353 zeigt, die aus Arabidopsis thaliana erhalten wurde;
SEQ ID NO: 6 die Aminosäuresequenz des GA-20-Oxidaseproteins zeigt, die cDNA-Klon pAt2353 entspricht;
SEQ ID NO: 7 die Aminosäuresequenz eines synthetischen Peptids zeigt, das auf der Basis der Aminosäuresequenz eines Peptids produziert wurde, die aus einem Trypsinverdau von gereinigter GA₁₂20-Oxidase aus C. maxima-Endosperm resultiert;
SEQ ID NO: 8 und 9 zeigen die Aminosäuresequenz von zwei Peptiden, die Oligodesoxynukleotidprimern entsprechen, die auf der Basis von Aminosäureregionen entwickelt wurden, welche zwischen der Cucurbita maxima-Cotyledonen-Gibberellin-20-Oxidase und anderen Pflanzendioxygenasen, einschließlich den mit Tomaten E8-Reifung in Verbindung stehendem Protein, Tomaten-Ethylenbildungs-Enzym, Hyoscamin-6-hydroxylase aus Hyoscyamus niger, Gerste-Flavanon-3-Hydroxylase, und dem A2-Gen aus Mais konserviert worden waren;
SEQ ID NO: 10 und 11 zeigen die Sequenz von zwei Oligodesoxynukleotidprimern, die auf der Basis von Aminosäureregionen entwickelt wurden, welche zwischen der Cucurbita maxima-Cotyledonen-Gibberellin-20-Oxidase und anderen Pflanzen-Dioxygenasen, einschließlich dem Tomaten-E8-Reifungsprotein, Tomaten-Ethylenbildungsenzym, Hyoscamin-6-hydroxylase aus Hyoscyamus niger, Gerste-Flavanon-3-Hydroxylase, und dem A2-Gen aus Mais konserviert werden. Die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Primer enthielten Restriktionsendonukleasespaltstellen für HindIII bzw. EcoRI an ihren 5'-Termini;
SEQ ID NO: 12 und 13 zeigen die Nukleotid- und die entsprechende Aminosäuresequenz eines Inserts von cDNA-Klon pAt2204, dessen vorausgesagte Aminosäuresequenz zu 67 identisch mit der von Kürbis-Gibberellin-20-Oxidase ist;
SEQ ID NO: 14 bis 17 zeigen die Nukleotidsequenzen von vier Oligonukleotiden, die in Verbindung mit dem universellen M13-Sequenzierungsprimer in PCR-Regionen verwendet werden.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert. In den Beispielen werden die Isolierung und die Nukleotidsequenz eines cDNA-Klons für GA₁₂-20-Oxidase, selektiert mit einem spezifischen Antikörper aus einer λgt11-Bibliothek, abgeleitet aus unreifen Cucurbita maxima (Kürbis)-Cotylen, beschrieben. Die Identität des klonierten Gens wird durch Expression eines funktionellen rekombinanten Proteins, welches die Dreistufenoxidation von GA₁₂ in GA₂₅ und von GA₅₃ in GA₁₇ katalysiert wie auch die Bildung von C₁₉-GAs in niedriger Ausbeute katalysiert, in Escherichia coli bestätigt. Außerdem kann 20-Oxidase-Aktivität in einzelnen Bakteriophagenplaques detektiert werden.
Der Beweis einer 20-Oxidase-Aktivität in einzelnen Bakteriophagenplaques legt nahe, dass – in Abwesenheit eines geeigneten Antikörpers – ein funktionelles Screening der λgt11-Bibliothek auf der Basis der Messung der katalytischen Enzymaktivität erfolgreich sein würde. Es wird möglich sein, die Enzymaktivität durch Unterteilungen der Bibliothek zu verfolgen und dann einzelne lysogene Kolonien oder Plaques zu selektieren. Tatsächlich kann ein geringer Level an 20-Oxidase-Aktivität in Lysogenen, hergestellt unter Verwendung von 3,6 × 10⁷ pfu aus der amplifizierten Bibliothek, detektiert werden.
Die Beispiele beschreiben außerdem die Herstellung von chimären DNA-Konstrukten, die die GA-20-Oxidase-cNDA in Sense- und Antisense-Orientierung umfassen, welche geeignet sind, um in Pflanzen transformiert und exprimiert zu werden. Die Beispiele beschreiben auch die Transformation von Pflanzen mit den chimären Konstrukten, wobei die Pflanzen aus der Gruppe bestehend aus Tabak, Karotten, Sonnenblumen, Tomaten, Baumwolle, Zea-Mais, Dactylis globerata und Weizen ausgewählt sind.
Außerdem werden in den Beispielen die Isolierung von drei weiteren cDNA-Klonen [pAT2301; pAT2353; pYAP169] für GA₁₂-20-Oxidase aus einer λgt11-Bibliothek beschrieben, welche aus Schösslingsgewebe der Arabidopsis thaliana ga1-Mutante stammt. Die Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen der cDNA-Klone pAT2301 und pAT2353 sind in SEQ ID NO. 1 bis 6 gezeigt.
Die Beispiele beschreiben weiter die Herstellung von chimären DNA-Konstrukten, die die GA-20-Oxidase-cNDAs [AT2301; AT2353; YAP169] in Sense- und Antisense-Orientierung umfassen, welche geeignet sind, um in Arabidopsis thaliana-Pflanzen transformiert und exprimiert zu werden; beschrieben wird auch die Transformation von Arabidopsis thaliana mit den genannten chimären Konstrukten.
REFERENZBEISPIEL
Allgemeine DNA-Rekombinationstechniken
Da viele der DNA-Rekombinationstechniken bzw. rekombinanten DNA-Techniken, die in dieser Erfindung verwendet werden, für den Fachmann Routine sind, ist es besser, nur eine kurze Beschreibung dieser allgemein verwendeten Techniken zu geben als sie jedes Mal zu beschreiben, wenn sie vorkommen. Außer wenn ein spezifischer Hinweis auf das Gegenteil erfolgt, sind alle diese Verfahren in der Maniatis et al. (1982)-Referenz beschrieben.
A. Spaltung mit Restriktionsendonukleasen
Eine Reaktionscharge enthält typischerweise etwa 50 bis 500 mg/ml DNA in der vom Hersteller, New England Biolabs, Beverly, MA, empfohlenen Pufferlösung. 2 bis 5 Einheiten Endonukleasen werden für jedes mg DNA zugesetzt, und die Reaktionscharge wird für 1 bis 3 Stunden bei der Temperatur, die vom Hersteller empfohlen wurde, inkubiert. Die Reaktion wird durch 10-minütiges Erwärmen bei 65°C oder durch Extraktion mit Phenol beendet, worauf sich eine Präzipitation der DNA mit Ethanol anschließt. Diese Technik ist auch auf Seiten 104 bis 106 der Maniatis et al. (1982)-Referenz beschrieben.
B. Behandlung von DNA mit Polymerase, um glatte Enden zu produzieren
50 bis 500 mg/ml DNA-Fragmente werden in dem vom Hersteller, New England Biolabs, empfohlenen Puffer einer Reaktionscharge zugesetzt. Die Reaktionscharge enthält alle vier Desoxynukleotidtriphosphate in Konzentrationen von 0,2 mM. Die Reaktion findet über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 15°C statt und wird dann durch 10-minütiges Erwärmen bei 65°C beendet. Für Fragmente, die durch Spaltung mit Restriktionsendonukleasen, welche 5'-vorstehende Enden produzieren, z.B. EcoRI und BamHI, erhalten werden, wird das große Fragment oder Klenow-Fragment von DNA-Polymerase verwendet. Für Fragmente, die durch Endonukleasen, die 3'-vorstehende Enden produzieren, z.B. PstI und SacI, erhalten werden, wird die T4-DNA-Polymerase verwendet. Die Verwendung dieser zwei Enzyme ist auf den Seiten 113 bis 121 der Maniatis et al. (1982)-Referenz beschrieben.
C. Agarosegelelektrophorese und Reinigung von DNA-Fragmenten aus Gelen
Die Agarosegelelektrophorese wird in einer horizontalen Apparatur, wie sie auf den Seiten 150 bis 163 der Maniatis et al.-Referenz beschrieben ist, durchgeführt. Der verwendete Puffer ist der Tris-Boratpuffer, der dort beschrieben ist. Die DNA-Fragmente werden unter Verwendung von 0,5 mg/ml Ethidiumbromid gefärbt, welches entweder im Tankgelpuffer während der Elektrophorese vorliegt oder nach der Elektrophorese zugesetzt wird. Die DNA wird durch Beleuchtung mit langwelligem ultravioletten Licht sichtbar gemacht. Wenn die Fragmente aus dem Gel abgetrennt werden sollen, wird eine Agarose verwendet, die bei niedriger Temperatur geliert und die von Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, erhältlich ist. Nach der Elektrophorese wird das gewünschte Fragment ausgeschnitten, in ein Kunststoffteströhrchen gegeben, bei 65°C für 15 Minuten erwärmt, dreimal mit Phenol extrahiert und zweimal mit Ethanol präzipitiert. Dieses Verfahren unterscheidet sich etwas von dem, das von Maniatis et al. (1982) auf Seite 170 beschrieben ist.
Als Alternative kann die DNA mit Hilfe des Geneclean-Kit (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA) aus der Agarose isoliert werden.
D. Anfügung von synthetischen Linker-Fragmenten an DNA-Enden
Wenn es gewünscht wird, eine neue Endonuklease-Spaltstelle an das Ende eines DNA-Moleküls anzufügen, wird das Molekül gegebenenfalls zuerst mit DNA-Polymerase behandelt, um geglättete Enden zu produzieren, wie dies im obigen Abschnitt beschrieben ist. Etwa 0,1 bis 1,0 mg dieses Fragments wird zu etwa 10 ng phosphorylierter Linker-DNA, erhalten von New England Biolabs, in einem Volumen von 20 bis 30 ml mit 2 ml T4-DNA-Ligase von New England Biolabs und 1 mM ATP in den vom Hersteller empfohlenen Puffer gegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 15°C wird die Reaktion durch 10-minütiges Erwärmen bei 65°C beendet.
Der Reaktionsansatz wird in einem für die Restriktionsendonuklease, die die synthetische Linkersequenz spaltet, geeigneten Puffer auf etwa 100 ml verdünnt. Es werden etwa 50 bis 200 Einheiten dieser Endonuklase zugesetzt. Das Gemisch wird für 2 bis 6 Stunden bei der geeigneten Temperatur inkubiert, dann wird das Fragment einer Agarosegelelektrophorese unterworfen und wie oben beschrieben gereinigt. Das resultierende Fragment wird dann Enden mit Termini haben, die durch Spaltung mit der Restriktionsendonuklease produziert wurden. Sie sind üblicherweise kohäsiv, so dass das resultierende Fragment in einfacher Weise an andere Fragmente, die dieselben kohäsiven Enden haben, gebunden werden kann.
E. Entfernung von 5'-terminalen Phosphaten von DNA-Fragmenten
Während der Plasmidklonierungsstufen verringert eine Behandlung des Plasmids mit Phosphatase die Rezirkularisierung des Vektors (diskutiert auf Seite 13 der Literaturstelle von Maniatis et al.). Nach Spaltung der DNA mit der richtigen Restriktionsendonuklease wird eine Einheit an Kälberdarm-alkalischer Phosphatase, erhalten von Boehringer-Mannheim, Mannheim, zugesetzt. Die DNA wird bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und dann zweimal mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert.
F. Verknüpfung von DNA-Fragmenten
Wenn Fragmente, die komplementäre kohäsive Enden haben, miteinander zu verknüpfen sind, werden etwa 100 ng jedes Fragments in einem Reaktionsgemisch mit 20 bis 40 ml, das etwa 0,2 Einheit T4-DNA-Ligase von New England Biolabs in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer enthält, inkubiert. Eine Inkubation wird für etwa 1 bis 20 Stunden bei 15°C durchgeführt. Wenn DNA-Fragmente, die stumpfe bzw. glatte Enden haben, miteinander verknüpft werden, werden sie wie oben inkubiert, mit der Ausnahme, dass die Menge an T4-DNA-Ligase auf 2 bis 4 Einheiten erhöht wird.
G. Transformation von DNA in E. coli
Der E. coli-Stamm HB101 wird für die meisten der Experimente eingesetzt. DNA wird unter Verwendung des Calciumchlorid-Verfahrens in E. coli eingeführt, wie es von Maniatis et al. (1982), Seiten 250 und 251, beschrieben ist.
H. Screening von E. coli auf Plasmide
Nach Transformation werden die resultierenden Kolonien von E. coli mit Hilfe eines schnellen Plasmidisolierungsverfahrens auf das Vorliegen des gewünschten Plasmids untersucht. Zwei übliche Verfahren sind auf den Seiten 366 bis 369 der Maniatis et al. (1982)-Referenz beschrieben.
I. Isolierung von Plasmid-DNA in grobem Maßstab
Verfahren zur Isolierung von Plasmiden aus E. coli in großem Maßstab sind auf den Seiten 88 bis 94 der Maniatis et al. (1982)-Referenz beschrieben.
J. Klonierung in M13-Phage-Vektoren
Es ist einzusehen, dass in der folgenden Beschreibung die doppelsträngige replikative Form der Phage M13-Derivate für Routineverfahren wie z.B. Spaltung mit Restriktionsendonuklease, Verknüpfung usw., eingesetzt wird.
Wenn es keinen spezifischen Hinweis für das Gegenteil gibt, können Enzyme von Boehringer, Biolabs (BRL) erhalten werden. Sie werden, wenn nichts Anderes angegeben ist, entsprechend den Instruktionen des Herstellers verwendet.
K. Southern Blot-Analyse
Die extrahierte DNA wird zunächst mit Restriktionsenzymen behandelt, dann in einem 0,8% bis 1% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, auf eine Nitrocellulosemembran [Southern E. M. (1975)] transferiert und mit der zu detektierenden DNA, die vorher einer Nick-Translation unterworfen worden war (DNA-spezifische Aktivitäten von 5 × 10⁸ bis 10 × 10⁸ c.p.m/mg), hybridisiert. Die Filter wurden dreimal für je 1 Stunde mit einer wässrigen Lösung von 0,03 M Natriumcitrat und 0,3 M Natriumchlorid bei 65°C gewaschen. Die hybridisierte DNA wird durch Schwärzen eines Röntgenfilms über einen Zeitraum von 24 bis 48 Stunden sichtbar gemacht.
BEISPIEL 1
Metabolismus von [¹⁴C]GAs durch C. maxima-Poly(A)⁺-RNA- in vitro-Translationsprodukte
Endosperm und sich entwickelnde Cotyledone von Kürbis (C. maxima) sind reiche Quellen für GA-Biosyntheseenzyme. Poly(A)⁺-RNA wurde aus unreifen Cotyledonen (1 g) oder Endosperm (10 g) von C. maxima-Samen mit 50%igem Reifungsindex unter Verwendung des "Fast Track"-mRNA-Isolierungs-Kits (Invitrogen) isoliert. Die Ausbeute an Poly(A)⁺-RNA aus Cotylen (17,4 mg/g Frischgewicht) war viel höher als aus Endosperm (0,75 mg/g Frischgewicht).
Die in vitro-Translation von mRNA aus Cotylen (1 mg) oder Endosperm (0,5 mg) wurde mit Kaninchen-Retikulozytenlysate (Boehringer) durchgeführt, wobei Standardbedingungen verwendet wurden, außer dass Leucin und Methionin in einer Konzentration von 12,5 mM vorlagen. Als Kontrollen wurde das Retikulozytenlysat mit Tabakmosaikvirus-RNA (1 mg) inkubiert und Cotylen-mRNA (1 mg) wurde ohne Lysat inkubiert. Nach Inkubation für 2 h bei 30°C wurden die Gemische (50 ml) mit Dioxygenase-Co-Faktoren (4 mM 2-Oxoglutarat, 0,5 mM FeSO₄, 3 mM Ascorbat und Catalase (1 mg/ml)) supplementiert und [¹⁴C]GA-Substrat (15.000 dpm; spezifische Radioaktivität 180 Ci/mol) wurde in 5 ml zugesetzt und für weitere 3 h inkubiert. Die Produkte wurden extrahiert und durch Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), angeschlossen an einen Radioaktivitätsmonitor, getrennt.
Es wurde gezeigt, dass die Produkte nach Translation von Poly(A)⁺-RNA aus beiden Geweben in Kaninchen-Reticulozytenlysaten [¹⁴C]GA₁₂ in [¹⁴C]GA₁₅ nach Inkubation mit den geeigneten Co-Faktoren und Analyse durch HPLC umwandeln. Die 20-Oxidase-Aktivität war in den Translationsprodukten, die von der Cotylen-mRNA stammten, höher. Es wurde keine Aktivität nach Inkubation des Retikulozytenlysats mit Tabakmosaikvirus-RNA oder Cotylen-mRNA ohne das Translationssystem detektiert.
BEISPIEL 2
Metabolismus von [¹⁴C]GAs durch rekombinante Bakteriophagen-Plaques
Eine amplifizierte cDNA-Bibliothek in λgt11, die von Cotylen-Poly(A)⁺-RNA stammte, wurde mit einem Antikörper gegen ein synthetisches Peptid (ValPheGlyGlySerAspGluSerLys), das auf der Basis der Aminosäuresequenz eines Peptids, das aus Trypsinverdau von gereinigter GA₁₂-20-Oxidase aus C. maxima-Endosperm [siehe SEQ ID NO: 7] resultierte, produziert worden war, einem Immunscreening unterworfen.
Eine Oligo(dT)-geprimte cDNA-Bibliothek wurde in λgt11 (Amersham) unter Verwendung von Cotylen-mRNA konstruiert. Die Gesamtbibliothek (70.000 Klone) wurde amplifiziert, wodurch 3,6 × 10⁸ Plaque-bildende Einheiten (pfu)/ml erhalten wurden, von denen 69% rekombinant waren. Ein Immunscreening der amplifizierten Bibliothek wurde mit 3.600 pfu auf einer 90 mm-Platte und einer Sondierung mit dem 20-Oxidase-Peptidantikörper (1 mg/ml) und einem zweiten Antikörper, nämlich mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG, durchgeführt.
Es wurden sieben positive Plaques erhalten und diese wie auch ein negativer Plaque als Kontrolle wurden mit 50 pfu/Platte replattiert und erneut einem Screening unterzogen. Neun positive Plaques aus einer Platte wurden auf GA₁₂-20-Oxidase-Aktivität analysiert, indem Agarstopfen (ca. 5 ml) in Eppendorf-Röhrchen, die [¹⁴C]-GA₁₂ und Co-Faktoren, wie in Beispiel 1 angegeben, in 25 ml SM-Puffer enthielten, inkubiert wurden. Die Inkubationen erfolgten für 6 h, wobei die Co-Faktoren alle 2 h ergänzt wurden. Produkte wurden nach Zentrifugation (15.000 g für 2 min) gewonnen und durch Reverse-Phase-HPLC, online verbunden mit einem Radioaktivitätsmonitor, getrennt.
Alle Plaques waren aktiv, was zu einer 60% Umwandlung des Substrats zu [¹⁴C]GA₁₅ führt. In ähnlicher Weise exprimierten auch zwei positive Plaques, die aus jeder der restlichen Platten ausgewählt worden waren, funktionelles Protein; bei größeren (ca. 25 ml) Agarstopfen wurde das Substrat vollständig umgewandelt, und zwar hauptsächlich zu GA₂₄/GA₂₅. Keine positiven Plaques wurden erhalten, nach ein negativer Plaque replattiert worden war und mit dem Antikörper erneut einem Screening unterworfen worden war; zwei Plaques, die willkürlich aus dieser Platte ausgewählt worden waren, besaßen keine GA₁₂-20-Oxidase-Aktivität.
Positive Plaques wandelten nach Reinigung [¹⁴C]GA₁₂ in radioaktiv markiertes GA₁₅, GA₂₄ und GA₂₅ um, wenn Agarstopfen mit dem Substrat und Co-Faktoren inkubiert wurden. Negative Plaques enthielten keine Enzym-Aktivität. Die Größe der Inserts in die positiven Bakteriophagen wurden unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit λgt11-Primern mit etwa 1,4 Kilobasenpaare (kbp) festgestellt.
BEISPIEL 3
Metabolismus von [¹⁴C]GAs durch rekombinante 20-Oxidase
Wir untersuchten die katalytischen Eigenschaften des rekombinanten Proteins unter Verwendung eines Lysogens aus einem einzelnen Bakteriophagen.
Rekombinante GA-20-Oxidase wurde aus einem λgt11-Lysogen in Y1089 im wesentlichen wie in J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) beschrieben hergestellt, allerdings wurde ein Lysogenextraktionspuffer verwendet, der 200 mM Tris-HCl, pH 7,0, und 8 mM Dithiothreitol enthielt. Die Aktivität des Proteins wurde untersucht, indem Zelllysate mit GA-Vorläufern inkubiert wurden. Die Kapazität des Proteins, [¹⁴C]GA₁₂ zu oxidieren, war vom Zusatz von 2-Oxoglutarsäure absolut abhängig und wurde um 73 bzw. 90% verringert, wenn Fe²⁺ oder Ascorbinsäure weggelassen wurden.
Die Substratspezifität des Proteins wurde ebenfalls bestimmt (Tabelle 1). Verschiedene Aliquote der Zelllysate wurden mit 100.000 dpm [¹⁴C]GA₁₂ (A) oder [¹⁴C]GA₅₃ (B) und Co-Faktoren, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurden, in einem Gesamtvolumen von 250 ml für 4 h bei 30°C inkubiert, wobei frische Co-Faktoren nach 2 h zugesetzt wurden. Bei C wurden die Substrate (200.000 dpm) mit 250 ml des Lysats mit Co-Faktoren für 6 h inkubiert, die Co-Faktoren wurden alle 2 h ergänzt. Produkte wurden extrahiert und durch HPLC-Radiozählung analysiert und ihre Identität durch die Kombination Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) bestätigt. Die spezifischen Radioaktivitäten der Produkte und Substrate waren dieselben. Die Resultate sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 A. Inkubationen mit [¹⁴C]GA₁₂
B. Inkubationen mit [¹⁴C]GA₅₃
C. Inkubationen mit 20-Oxo-[¹⁴C]GAs

* Durch HPLC nicht aufgetrennt.
** Durch GC-MS wurde gezeigt, dass nur [¹⁴C]GA₂₅ enthalten war.
*** Identität von [¹⁴C]GA wurde durch GC-MS nicht bestätigt.

Wenn das Protein bei steigenden Konzentrationen mit [¹⁴C]GA₁₂ inkubiert wurde (Tabelle 1A) trat eine sequenzielle Oxidation der C-20-Methylgruppe zum Alkohol, Aldehyd und zur Carbonsäure auf, wobei als Produkte radioaktiv markiertes GA₁₅, GR₂₄ bzw. GA₂₅ erhalten wurde. Die entsprechenden 13-Hydroxy-GA-Produkte (GA₄₄, GA₁₉ und GA₁₇) wurden ebenfalls erhalten, allerdings mit geringerer Effizienz, wenn das Lysat mit [¹⁴C]GA₅₃ inkubiert wurde (Tabelle 1B). Ein Vergleich der Aldehydsubstrate GA₂₄ (nicht-hydroxyliert), GR₁₉ (monohydroxyliert) und GA₂₃ (dihydroxyliert) zeigte, dass die Oxidationseffizienz zu den entsprechenden Tricarbonsäuren mit steigender Polarität des Substrats abnahm (Tabelle C1). Außerdem wurden die entsprechenden C₁₉-GA-Produkte (GA₉, GA₂₀ und GA₁), die durch Verlust von C-20 als CO₂ gebildet wurden, in niedriger Ausbeute erhalten. Die Resultate zeigen, dass ein einziges Enzym jeden der Schritte, der Oxidation am C-20 involviert, während der GA-Biosynthese katalysieren kann, und zwar möglicherweise auch einschließlich des Verlustes von C-20, obgleich eine Bestätigung dafür weitere Studien mit dem entsprechenden Enzym aus einem Pflanzengewebe, in welchem C₁₉-GA-Produktion einen Hauptstoffwechselweg bildet, erfordert.
BEISPIEL 4
Nucleotidsequenz des GA-20-Oxidase-cDNA-Klons und abgeleitete Aminosäuresequenz
Die Restriktionsanalyse von PCR-amplifizierten Bakteriophagen-Inserts zeigte das Vorliegen einer internen EcoRI-Stelle, allerdings keine internen BamHI-Stellen. Bakteriophagen-DNA wurde nach Infektion des E. coli-Stamms Y1090 (Amersham; 400 ml-Kultur) hergestellt und unter Verwendung eines λ-Phage-Purification-Kits (Qiagen) gereinigt. Nach Freisetzung des Inserts mit BamHI wurde es durch Insertion in die BamHI-Stelle von pUC18 und Transformation von E. coli-Stamm XL1blue subkloniert. Plasmide wurden aus den Transformanten isoliert (Qiagen Plasmid Midi Kit) und einer wurde nach dem Didesoxynukleotid-Kettenterminierungs-Verfahren an beiden Stellen sequenziert.
Der selektierte Klon wurde als pB11 (E. coli) bei The Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Centre, 1815 North University Street, Peoria, Il. 61604 hinterlegt. Die Eingangsnummer ist NRRL B-21096, und das Hinterlegungsdatum der 21. Mai 1993.
Die Nukleotidsequenz des selektierten Klons enthält ein offenes Leseraster von 1.158 Nukleotiden, die ein Protein Mr 43.321 codieren, was eng mit dem Wert übereinstimmt, der für das native Enzym bestimmt worden war.
Die Sequenz enthält Regionen, die zu den der früher klonierten Pflanzendesoxygenasen, einschließlich Flavanon-3-hydroxylase, Hyoscyamin-6-hydroxylase, E8, ein mit Reifung in Verbindung stehendes Gen mit unbekannter Funktion, und 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure-oxidase, ein Enzym, das bei der Produktion des Pflanzenhormons Ethylen involviert ist, homolog sind. Die konservierten Sequenzen umfassen drei Histidin-enthaltende Motive, von denen zwei als Fe-Bindungsstellen am aktiven Zentrum des Enzyms vorgeschlagen wurden. Aminosäuren, die in anderen Pflanzendioxygenasen konserviert werden, sind fett gedruckt.
Die Sequenz des Peptids, gegen den der Antikörper zur Durchmusterung der Expressionsbibliothek gerichtet war, befindet sich nahe dem N-Terminus und ist unterstrichen. Sie hat einen Unterschied (P für V), die, wie wir anschließend feststellten, von einer Verunreinigung im tryptischen Peptid herrührte, welches sequenziert worden war. Demnach hatten alle Klone, die unter Verwendung dieses Antikörpers selektiert worden waren, nahezu die volle Länge und sollten, wie wir bewiesen, funktionelle Proteine codieren.
Heterologe Expression der Kürbis-GA-20-Oxidase in E. coli
Wenn das cDNA-Insert aus pB11, das für GA-20-Oxidase aus Kürbis codiert, in E. coli exprimiert wird, katalysiert das produzierte Protein die anschließende Oxidation der C-20-Methylgruppe. Nur 1% der Produkte sind biologisch aktive C₁₉-Gibberelline, die durch Verlust von C-20 als CO₂ gebildet wurden; 99% der Produkte haben eine Carbonsäuregruppe am C-20 und sind nicht biologisch aktiv, noch können sie in aktive Gibberelline umgewandelt werden. Die Produktion dieses Enzyms in Pflanzen sollte daher die C₂₀-Gibberellin-Zwischenprodukte der GA-Biosynthese (hauptsächlich GA₁₂ und GA₅₃) zu den Carbonsäureformen lenken, wodurch die Level an aktiven GAs reduziert werden.
BEISPIEL 5: Konstruktion eines chimären 35S-GA-20-Gens (die GA-20-cDNA kloniert in pCGN1761)
GA-20-Oxidase wird in Sense und Antisense hinter dem konstitutiven 35S-Promotor exprimiert. Die cDNA, die für das GA-20-Oxidasegen codiert, wird auf den Vektor pCGN1761 transferiert, der den doppelten 35S CaMV-Promotor und den transkriptionalen tml-Terminator an einem von pUC-abgeleiteten Plasmid trägt. Die Konstruktion pCGN1761 ist in Beispiel 23 auf den Seiten 39 bis 41 der EP-A 0 392 225 offenbart, die hier durch Referenz aufgenommen wird. Das 1,4 BamHI-Fragment, das das GA-20-Oxidasegen enthält, wird aus dem Plasmid auf pUC-Basis, das in Beispiel 4 beschrieben ist, ausgeschnitten und an den "annealed" Moleküladapter der Sequenz 5'-AATTCGRACCCCTTCG-3'/5'-GATCCGAAGGGGTTCG-3' (New England Biolabs #1105 und #1106) ligiert, wodurch die BamHI-Enden in EcoRI-Enden umgewandelt werden. Das Ligationsprodukt wird gereinigt und in die EcoRI-Stelle von pCGNl761 kloniert, wobei Standardtechniken eingesetzt werden. Kolonien, die die cDNA in Sense- und Antisense-Orientierung bezüglich des doppelten 35S-Promotors tragen, werden isoliert und pCGN1761-35S-GA20ox-A bzw. pCGN1761-35S-GA20ox-B genannt.
BEISPIEL 6A: Transfer der 35S-GA20-Fusion aus pCGN1761-35S-GAox-A und pCGN1761-35S-GAox-B zu dem binären Vektor pCIB2001
Die 35S-GA20-Expressionskassette wird aus den Konstruktionen pCGN1761-35S-GAox-A und pCGN1761-35S-GAox-8, die oben beschrieben wurden, ausgeschnitten, indem zuerst mit HindIII geschnitten wird, das linearisierte Plasmid durch Inkubation mit T4-DNA-Polymerase geglättet wird und dann mit HpaI unter Freisetzung des 35S-GA20-tml-Inserts geschnitten wird. Dieses wird in die StuI-Stelle von pCIB2001 kloniert, wodurch binäre Vektoren erzeugt werden, die das GA20ox-Gen in Sense- und Antisense-Orientierung hinter dem doppelten 35S-Promotor exprimieren.
BEISPIEL 6B: Transfer der 35S-GA20-Fusion aus pCGN1761-35S-GAox-A und pCGN1761-35S-GAox-B zu dem direkten Gentransfervektor pCIB3064.
Die 35S-GA20-Expressionskassette wird aus den Konstruktionen pCGN1761-35S-GAox-A und pCGN1761-35S-GAox-B, die in Beispiel 5 beschrieben sind, ausgeschnitten, indem zuerst mit HindIII geschnitten wird, das linearisierte Plasmid durch Inkubation mit T4-DNA-Polymerase geglättet wird und dann mit HpaI unter Freisetzung des 35S-GA20-tml-Inserts geschnitten wird. Dieses Fragment wird in die HindIII-Stelle (durch Inkubation mit T4-DNA-Polymerase geglättet) von pCIB3064 [Koziel et al. (1993)] kloniert, wodurch Vektoren für einen direkten Transfer gebildet werden, die eine PAT-Genselektion verwenden, die das GA20ox-Gen in Sense- und Antisense-Orientierung hinter dem doppelten 35S-Promotor exprimieren.
BEISPIEL 7: Konstruktion eines chimären PR1-GA20-Gens (die GA20-cDNA kloniert in pCIB1004)
Die cDNA, die für das GA20-Oxidasegen codiert, wird zu dem Vektor pCIB1004 transferiert, um sie unter die Kontrolle des chemisch induzierbaren PR1a-Genpromotors zu stellen. pCIB1004 wird mit Ncol gespalten und der 3'-Überhang wird durch Inkubation mit T4-DNA-Polymerase geglättet. Die Konstruktion von pCIB1004 ist in Beispiel 21B auf Seite 36 der EP-A 0 332 104 offenbart, die durch Referenz hier aufgenommen ist. Anschließend werden nicht-phosphorylierte BamHI-Linker (New England Biolabs #1003) an die Enden ligiert und eine Spaltung mit BamHI setzt ein Insert frei, das verworfen wird. Das 1,4 A kb GA20-enthaltende Gen wird aus der Konstruktion von Beispiel 4 durch Spaltung mit BamHI ausgeschnitten und an die BamHI-Stelle des von pCIB1004 stammenden Fragments ligiert, wodurch das GA20-Gen an den PR1a-Promotor in beiden Orientierungen fusiert wurde. Die resultierenden Plasmide wurden pCIB1004-PR1-GA20ox-A (Sense-Orientierung) und pCIB1004-PR1-GA20ox-B (Antisense-Orientierung) genannt.
BEISPIEL 8A: Transfer der PR1-GA20-Fusion aus pCGN1004-PR1-GAox-A und pCGN1004-PR1-GAox-B zu dem binären Vektor pCIB2001
Die PR-GA20-Expressionskassette wird aus dem von pCIB1004 abgeleiteten Konstrukt durch partiellen Verdau mit KpnI, Isolierung eines Fragments mit einer Größe von 5,6 kb und Ligation dieses Fragments in die KpnI-Stelle von pCIB2001 transferiert. Dies erzeugt binäre Vektoren, die das GA20ox-Gen zur Expression hinter dem chemisch regulierten PR1a-Promotor in Sense- und Antisense-Orientierung tragen.
BEISPIEL 8B: Transfer der PR1-GA20-Fusion aus pCGN1004-PR1-GAox-A und pCGN1004-PR1-GAox-B zu dem direkten Gentransfer-Vektor pCIB3064
Die PR-GA20-Expressionskassette wird aus dem von pCIB1004-abgeleiteten Konstrukt (Beispiel 7) durch partiellen Verdau mit KpnI, Gewinnung eines Fragments mit einer Größe von 5,6 kb, Inkubation mit T4-DNA-Polymerase, um die Enden glatt zu machen, und Ligation dieses Fragments in die HindIII-Stelle (durch Inkubation mit T4-DNA-Polymerase glatt gemacht) von pCIB3064 transferiert, wobei Vektoren für einen direkten Gentransfer erzeugt werden, die eine PAT-Genselektion verwenden und das Ga20ox-Gen in Sense- und Antisense-Orientierung hinter dem chemisch regulierten PR1a-Promotor exprimieren.
BEISPIEL 9: Konstruktion eines chimären Pth-GA20-Gens
Ein Mark-spezifischer Promotor aus Mais wird verwendet, um das GA20-Gen in Sense- und Antisense-Orientierung in Gewebe-spezifischer Weise zu exprimieren. pCGN1761 wird mit XhoI und SalI gespalten und mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um die Enden glatt zu machen. Das größere der zwei resultierenden Fragmente wird Gel-gereinigt. Ein BamHI-Fragment, das einen Mark-spezifischen Promotor trägt, wird aus dem Plasmid pCIB4433 (WO 93/07278) ausgeschnitten und an das 1,4 kb-Fragment ligiert, das das GA-20-Oxidasegen trägt. Das Plasmid pCIB4433 wurde bei The Agricultural Research Culture Collection (NRRL) (1818 N. University St., IL 61604) nach den Vorgaben des Budapester Vertrags unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18999 am 21. September 1992 hinterlegt. Nach der Ligation wird das Gemisch mit T4-DNA-Polymerase behandelt und die resultierenden glatten Fragmente werden in das von pCGN1761-abgeleitete Fragment ligiert. Durch Restriktionskartierung und Sequenzanalyse der E. coli-Klone, die erhalten wurden, ist es möglich, Klone zu identifizieren, die mit dem Pth-Promotor, der eine Expressions des Sense-GA20-Gens stromabwärts des tml-Transkriptionsterminators steuert, orientiert sind, und Klone zu identifizieren, die mit dem Pth-Promotor, der die Expression des GA20-Gens in Antisense-Orientierung stromabwärts des tml-Terminators steuert, orientiert sind. Diese Klone werden pCGN1761-Pth-GA20ox-A bzw. pCGN1761-Pth-Ga20ox-B bezeichnet.
BEISPIEL 10A: Transfer der pepC-GA20-Fusion aus pCGN1761-PepC-GA0x-A und pCGN1761-PepC-GAox-B zu dem binären Vektor pCIB2001
Die Pth-GA20ox-Kassette wird aus pCGN1761-Pth-GA20ox-A und pCGN1761-Pth-GAox-B unter Verwendung von BglII und HpaI ausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen in pCIB2001 kloniert. Dies erzeugt binäre Vektoren mit GA20ox, kloniert in Sense- und Antisense-Orientierung unter der Regulation des Mark-spezifischen Pth-Promotors.
BEISPIEL 10B: Transfer der PepC-GA20-Fusion aus pCGN1761-PepC-GAox-A und pCGN1761-PepC-GAox-B zu dem direkten Gentransfervektor pCIB3064.
Die Pth-GA20ox-Kassette wird aus pCGN1761-Pth-GA20ox-A und pCGN1761-Pth-GAox-B ausgeschnitten, indem zuerst mit BglII geschnitten wird, das linearisierte Plasmid durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase geglättet wird und dann mit HpaI geschnitten wird, um das Pth-GA20ox-Insert freizusetzen.
Dieses wird in die HindIII-Stelle (durch Inkubation mit T4-DNA-Polymerase geglättet) von pCIB3064 kloniert, was Vektoren zum direkten Gentransfer erzeugt, eine PAT-Genselektion ausnützt, das GA20ox-Gen in Sense- und Antisense-Orientierung unter der Regulierung des Mark-spezifischen Pth-Promotors exprimiert.
BEISPIEL 11: Konstruktion des binären Vektors pCIB2001
TJS75 Kan wird zuerst durch Verdau von pTJS75 [Schmidhauser et al., J. Bacteriol. 164: 446–455, 1985] mit NarI unter Ausschneiden des Tetracyclingens, gefolgt von Insertion eines AccI-Fragments aus pUC4K [Messing et al., Gene 19: 259–268, 1982], das ein NptI-Gen trägt, gebildet. pCIB 200 wird dann hergestellt, indem XhoI-Linker an das EcoRV-Fragment von pCIB7 (enthält den linken und rechten T-DNA-Rand, ein Pflanzen-selektierbares chimäres nos/nptII-Gen und den pUC-Polylinker [Rothstein et al., Gene 53: 153–161, 1987]), ligiert wird und das durch XhoI verdaute Fragment in salI-verdautes TJS75 Kan kloniert wird. pCIB2001 wird hergestellt, indem ein neuer Polylinker in die mehrfache Klonierungsstelle von pCIB200 kloniert wird, wobei mehrere einmal vorkommende Restriktionsenzymstellen erhalten werden.
PFLANZENTRANSFORMATION
Die erfindungsgemäße rekombinante DNA, welche die für GA20-Oxidase codierende DNA-Sequenz umfasst, kann in die Pflanzenzelle eingefügt werden, indem eines der gut entwickelten Agrobacterium-Transformationssysteme verwendet wird, oder indem eine direkte Genabgabe erfolgt, welche z.B. Mikroinjektion [Corssway et al. (1986) Neuhaus (1987)], Elektroporation [Riggs et al. (1986)], direkten Gentransfer [Paszkowski et al. (1984)] oder eine ballistische Partikelbeschleunigung unter Verwendung von z.B. Vorrichtungen, die von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin und Dupont, Inc., Wilmington, Delaware, umfassen.
Die Detektion von transformierten Pflanzenzellen kann unter Verwendung geeigneter Selektionssysteme, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erreicht werden. Ein geeignetes Selektionsmarkergen kann im Pflanzenexpressionsvektor vorhanden sein, der bei der Pflanzentransformation verwendet wird, oder kann alternativ an einem der herkömmlicherweise angewendeten Selektionsplasmide, z.B. das, das von Rothstein et al. (1987) beschrieben wurde, das ein selektierbares Hygromycinresistenzgen enthält, bereitgestellt sein. Das genannte Plasmid kann zusammen mit der rekombinanten DNA gemäß der Erfindung, die die für GA20-Oxidase codierende DNA-Sequenz umfasst, unter Verwendung einer Co-Transformation in die Pflanzenzelle eingeführt werden.
BEISPIEL 12: A. tumefaciens-vermittelte Transformation von N. tabacum
Explantate mit grob 5 bis 10 mm werden aus jungen 3 bis 5 cm langen Blättern, und zwar dritte bis sechste, aus dem Apex von N. tabacum cv "Xanthi nc", die unter keimfreien Bedingungen [Facciotti und Pilet, 1979] in festem MS-Medium [Murashige und Skoog, 1962], das 0,7% Phytagar (Gibco-BRL), 1 mg/l IAA, 0,15 mg/l Kinetin enthält, gewachsen waren, geschnitten. Diese Explantate werden auf festem MS-Medium, das 0,6% Phytagar, 40 mg/l Adeninsulfat, 2 mg/l IAA und 2 mg/l Kinetin enthält, plattiert; auf die Oberfläche wird ein #1 Whatman-Filter gelegt, und das Ganze wird für 24 h im Dunklen bei 24°C inkubiert. Agrobacterium-Stämme, die die oben beschriebenen binären Vektoren enthalten, werden über Nacht in LBMG bei 30°C an einer Schüttelvorrichtung mit 180 U/min wachsen gelassen. Explantate werden in eine Bakteriensuspension mit 3,3 × 10⁸ Zellen/ml für etwa 5 min eingetaucht, auf sterile Papiertücher geblottet und auf denselben Platten replattiert. Nach 48 Stunden werden Explantate auf Selektionsmedium gelegt, welches dasselbe Plattenmedium wie oben plus 350 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Kanamycin enthält. Co-kultiviertes Kontrollgewebe wird auf dasselbe Medium, allerdings ohne Kanamycin, gelegt. Die Explantate werden alle 2 Wochen auf frisches Medium übertragen. Schösslinge werden 4 bis 8 Wochen nach Co-Kultivierung geerntet, auf 50 ml-Kulturröhrchen mit 25 ml festem MS-Medium, das 0,6% Phytogar, 1 mg/l IBA, 350 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Kanamycin enthält, gelegt. Das ganze Gewebe wird bei 24°C bis 28°C, 12 Stunden Licht, 12 Stunden Dunkelheit, Lichtintensität 6.700 bis 8.400 lx wachsen gelassen. Die Schösslinge bilden in 1 bis 2 Wochen Wurzeln und werden dann in Pflanzmischung in 4''-Töpfe umgetopft und in das "transgene Pflanzen-Phytotron" gestellt.
BEISPIEL 13: Blattscheibentransformation von Tabak
Agrobacterium-Stämme, die die oben beschriebenen binären Vektoren enthalten, werden 18 bis 24 h in Glutamatsalzmedium, eingestellt auf pH 5,6 und supplementiert mit 0,15% Mannit, 50 mg/ml Kanamycin, 50 mg/ml Spectinomycin und 1 mg/ml Streptomycin, wachsen gelassen, bevor sie zu einem OD₆₀₀-Wert von 0,2 in dem selben Medium ohne die Antibiotika verdünnt werden. Die Bakterien werden dann für 3 bis 5 h vor Verdünnung auf einen OD₆₀₀-Wert von 0,2 bis 0,4 zur Inokulierung von Scheiben von 5 bis 7 mm, welche aus Blättern von N. tabacum cv xanthi ausgestanzt worden waren, wobei N. tabacum cv xanthi aseptisch in GA7-Behältern nach einer Modifikation der Verfahren von Horsch et al. (1985) wachsen gelassen worden war, wachsen gelassen.
Die Blattscheiben werden auf 0,7% Agar, der Murashige und Skoogs Haupt- und Nebensalze (MS), 1 mg/l Benzyladenin und 1 mg/ml NAA enthält, für 2 Tage gehalten, bevor eine Übertragung auf dasselbe Medium, das 50 mg/ml Kanamycin, 100 mg/ml Carbenicillin und 100 mg/ml Mefoxin enthält, erfolgt. Schösslinge, die sich auf den Scheiben bilden, werden herausgeschnitten und vermehrt, bis sechs Pflänzchen erhalten werden, und zwar durch Subkultivieren der Schösslingsspitzen auf MS-Medium, das 50 mg/ml Kanamycin enthält, in GA7-Behältern.
Die Schösslinge bilden auf Medium, das keine Hormone und 50 mg/ml Kanamycin enthält, Wurzeln, werden auf Erde übertragen und vor Übertragung in das Gewächshaus zur Induktionsbehandlung mit chemischen Regulatoren in einem Phytotron abgehärtet. Zur Blütezeit werden Blüten zur Selbstbestäubung induziert. Nach Reifung werden Samen geerntet.
Beispiel 14: Produktion von transgenem Tabakcallus und von transgenen Tabakpflanzen
Agrobacterium-Stämme, die die oben beschriebenen binären Vektoren enthalten, werden verwendet, um eine Callusbildung aus Blattscheiben zu transformieren. Callusbildung wird auf Kanamycin-enthaltendem MSBN-Selektionsmedium auf einem Calluswachstumsmedium, das MS-Haupt-, Nebensalze und Fe-EDTA (Gibco #500-1117; 4,3 g/l), MS-Vitamine, 100 mg/l Myoinositol, 20 g/l Saccharose, 2 mg/l NAAA und 0,3 mg/l Kinetin umfasst, aufrechterhalten.
Der Callus kann verwendet werden, um transgene Pflanzen zu regenieren, indem Callusstücke auf MSBN-Medium übertragen werden und beschriebenen Verfahren gefolgt wird.
Beispiel 15: Transformation von Karotten
Agrobacterium-Stämme, die die oben beschriebenen binären Vektoren enthalten, werden wie es in Beispiel 13 beschrieben ist, wachsen gelassen. Die Bakterien, die auf einen OD₆₀₀-Wert von 0,2 bis 0,4 verdünnt sind, werden dann zur Inokulierung von Scheiben verwendet, welche aus Oberflächen-sterilisierten Karotten geschnitten waren.
Um die Karotten an der Oberfläche zu sterilisieren, werden sie geschält und dann 20 min in eine 10%ige Chlorox-Lösung eingeweicht. Die Karotten werden mit sterilem Wasser abgespült, in 5 mm-Stücke als Scheiben geschnitten und mit der Basalseite nach oben auf Wasseragar gelegt. Danach werden 20 bis 50 ml Bakterien auf die Oberfläche der Scheiben aufgebracht. Nach 7 Tagen werden die Scheiben auf 0,7% Agar, der MS-Salze, 3% Saccharose, 0,1 mg/l 2,4-D, 50 mg/ml Kanamycin, 100 mg/ml Carbenicillin und 100 mg/ml Mefoxin enthält, transferiert. Die Callusbildung um den Cambiumring wird ausgeschnitten und auf 0,7% MS-Agar, ergänzt mit 3% Saccharose, 0,1 mg/l 2,4-D, 50 mg/ml Kanamycin, 100 mg/ml Carbenicillin und 100 mg/ml Mefoxin, gelegt. Nachdem der Callus gewachsen ist, wird er in kleine Stücke geschnitten und willkürlich auf vier Platten mit demselben Medium verteilt.
BEISPIEL 16: Transformation von Sonnenblumen
Agrobacterium-Stämme, die die oben beschriebenen binären Vektoren enthalten, werden wie beschrieben wachsen gelassen. Die Bakterien, verdünnt auf einen OD₆₀₀-Wert von 0,2 bis 0,4, werden dann zur Beimpfung von Sonnenblumenpflanzenstengeln verwendet, die wie folgt präpariert waren:
Sonnenblumensamen werden 10 min in 10% Captan, danach 10 min in 10% Chlorox eingeweicht und mit sterilem Wasser gespült. Die Samenhüllen werden entfernt und die Samen werden auf 0,7% Wasseragar im Dunklen 3 Tage lang gekeimt, wonach sie in einen "Labline"-Inkubator, der auf 23°C mit 12 Stunden Tag und 12 Stunden Nacht eingestellt war, gestellt wurden. Die Setzlinge werden für 1 Woche wachsen gelassen, bevor sie entwipfelt wurden und eine Inokulierung der Bakterien auf der Stengelschnittoberfläche erfolgte.
Nach einer Woche wurden die inokulierten Stengel geschnitten und auf 0,7% Agar, enthaltend MS-Salze, 3% Saccharose, 2 mg/ml NAA, 1 mg/ml BAP, 100 mg/ml Carbenicillin, 100 mg/ml Mefoxin und 50 mg/ml Kanamycin, gelegt. Der Callus wird alle zwei Wochen auf frische Medien übertragen, bis eine ausreichende Menge für vier Platten erhalten wird. Die Hälfte des Callus, der aus virulenten Agrobacterium-Stämmen wächst, wird auf Medium ohne Hormone, das 50 mg/ml Kanamycin enthält, übertragen.
BEISPIEL 17: Transformation von Tomaten
Agrobacterium-Stämmen, die die oben beschriebenen binären Vektoren enthalten, werden wie in Beispiel 13 beschrieben wachsen gelassen. Die Bakterien, die auf einen OD₆₀₀-Wert von 0,2 bis 0,4 verdünnt sind, werden dann zur Inokulierung von Stengel von Tomatensetzlingen verwendet, die wie folgt präpariert wurden:
Tomatensamen werden 20 min in 10% Chlorox eingeweicht und mit sterilem Wasser gespült. Die Samen werden auf 0,7% Wasseragar im Dunklen 3 Tage lang gekeimt, wonach sie in einen Laborinkubator gestellt werden, der auf 23°C mit 12 Stunden Tag und 12 Stunden Nacht eingestellt ist. Die Setzlinge werden für 1 Woche vor Entwipfelung und Inokulierung mit den Bakterien auf der Stengelschnittoberfläche wachsen gelassen.
Nach einer Woche werden die inokulierten Stengel geschnitten und auf 0,7% Agar gelegt, der MS-Salze, 3% Saccharose, 2 mg/ml NAA, 1 mg/ml BAP, 100 mg/ml Carbenicillin, 100 mg/ml Mefoxin und 50 mg/ml Kanamycin enthält. Der Callus wird alle 2 Wochen auf frisches Medium übertragen, bis eine ausreichende Menge für vier Platten erhalten wird.
BEISPIEL 18: Transformation von Baumwolle
Agrobacterium-Stämme, die die oben beschriebenen binären Vektoren enthalten, werden wie es beschrieben wurde, wachsen gelassen. Die Bakterien, die auf einen OD₆₀₀-Wert von 0,2 bis 0,4 verdünnt sind, werden dann zur Inokulierung von Baumwollcotylen verwendet, welche wie folgt präpariert sind:
Die Baumwollsamen werden 20 min in 10% Chlorox eingeweicht und mit sterilem Wasser gespült. Die Samen werden auf 0,7% Wasseragar im Dunklen keimen gelassen. Die Keimpflanzen werden für 1 Woche wachsen gelassen, bevor eine Inokulierung der Bakterien auf die Cotylenoberfläche erfolgt. Die inokulierten Cotylene werden Callus bilden gelassen, bevor sie geschnitten werden und auf 0,7% Agar, der MS-Salze, 3% Saccharose, 100 mg/ml Carbenicillin und 100 mg/ml Mefoxin enthält, gelegt werden. Der Callus wird alle 3 Wochen auf frisches Medium transferiert, bis eine für 4 Platten ausreichende Menge erhalten wird. Die Hälfte des Callus, der aus den virulenten Agrobacterium-Stämmen gewachsen ist, wird auf ein Medium ohne Hormone, das 50 mg/ml Kanamycin enthält, transferiert.
BEISPIEL 19: Herstellung eines speziellen Callus-Typs von Zea mays, Elite Inzucht Linie Funk 2717
ZeaA-Maispflanzen der Inzucht Linie Funk 2717 werden im Gewächshaus zum Blühen wachsen gelassen und selbst-bestäubt. Unreife Ähren, die Embroys mit etwa 2 bis 2,5 mm in der Länge enthalten, werden von den Pflanzen entfernt und für 20 min in 10% Chlorox-Lösung sterilisiert. Embryos werden aseptisch aus den Kernen entfernt und mit der Embryo-Achse nach unten auf OMS-Medium plattiert, welches 0,1 mg/l 2,4-D, 6% Saccharose und 25 mM L-Prolin enthält und mit 0,24% Gelrite^® verfestigt ist (Initiationsmedium). Nach einer 2-wöchigen Kultur im Dunklen bei 27°C wird der Callus, der sich am Scutellum entwickelt, vom Embryo entfernt und auf B5-Medium (Gamborg et al., 1968), das 0,5 mg/l 2,4-D enthält und mit 0,24% Gelrite^® verfestigt ist, plattiert. Der Callus wird alle zwei Wochen auf frischem Medium subkultiviert. Nach insgesamt 8 Wochen nach Legen der Embryos auf das Initiationsmedium wird der spezielle Callus-Typ durch seine charakteristische Morphologie identifiziert. Dieser Callus wird auf demselben Medium weiter subkultiviert. Nach einem weiteren 2-monatigen Zeitraum wird der Callus auf N6-Medium, das 2 mg/l 2,4-D enthält und mit Gelrite^® verfestigt ist, transferiert und in Reihe subkultiviert.
BEISPIEL 20: Herstellung einer Suspensionskultur von Zea mays, Elite Inzucht Funk 2717
Der oben beschriebene Callus wird für insgesamt wenigstens sechs Monate subkultiviert. Der zur Subkultur gewählte Callus-Typ ist vergleichsweise nicht-schleimig, granulär und sehr brüchig, so dass er sich in kleine einzelne Zellaggregate aufteilt, wenn er in flüssiges Medium gelegt wird. Kulturen, die Aggregate mit großen ausgedehnten Zellen enthalten, werden nicht beibehalten. Etwa 500 mg-Aliquots des speziellen Callus von Zea mays-Elite Inzucht Funk 2717 werden in 30 ml N6-Medium, das 2 mg/l 2,4-D enthält, in 125 ml-Delong-Kolben gelegt. Nach einwöchiger Kultur bei 26°C im Dunklen auf einem kreisförmigen Schüttler ("gyratory shaker") (130 U/min, 2,5 cm Drehung) wird das Medium durch frisches Medium ersetzt. Die Suspensionen werden nach einer weiteren Woche erneut subkultiviert. Zu dieser Zeit werden die Kulturen untersucht und die, die keine große Anzahl expandierter Zellen zeigen, werden zurückbehalten. Suspensionskulturen, die Aggregate mit großen expandierten Zellen enthalten, werden verworfen. Das bevorzugte Gewebe besteht aus dichten zytoplasmisch teilenden Zellaggregaten, die eine charakteristisch glattere Oberfläche haben als der übliche Typ der Zellaggregate. Die Kulturen, die zurück gehalten werden, haben wenigstens 50% Zellen, die durch diese kleinen Aggregate repräsentiert werden. Dies ist die gewünschte Morphologie. Diese Suspensionen haben auch eine schnelle Wachstumsrate mit einer Verdoppelungszeit von weniger als 1 Woche. Die Suspensionskulturen werden wöchentlich subkultiviert, indem 0,5 ml PCV in 25 ml frisches Medium transferiert werden. Nach 4 bis 6 Wochen einer Subkultur auf diese Weise vermehren sich die Kulturen bei wöchentlicher Subkultur 2- bis 3-fach. Kulturen, in denen mehr als 75% der Zellen die gewünschte Morphologie haben, werden zur weiteren Subkultur zurückgehalten. Die Linien werden aufrechterhalten, indem immer der Flash, dessen Inhalte die beste Morphologie aufweisen, zur Subkultur gewählt wird. Eine periodische Filtration alle 2 Wochen durch Stainless Steel-Siebe mit einer Porengröße von 630 mm wird in einigen Fällen angewendet, um die Dispersion der Kulturen zu verstärkten, ist allerdings nicht notwendig.
BEISPIEL 21: Herstellung von Protoplasten aus Suspensionskulturen von Zea mays
1 bis 1,5 ml PCV der Suspensionskulturzellen von oben werden in 10 bis 15 ml eines filtriersterilisierten Gemisches, bestehend aus 4% Cellulase RS mit 1% Rhozyme in KMC (8,65 g/l KCl, 16,47 g/l MgCl₂·6H₂O und 12,5 g/l CaCl₂·2H₂O, pH 5,6)-Salz-Lösung inkubiert. Ein Verdau wird bei 30°C an einem sich langsam hin und her bewegenden Tisch über einen Zeitraum von 3 bis 4 Stunden durchgeführt. Die Herstellung wird unter einem Umkehrmikroskop bezüglich Protoplastenfreisetzung überwacht. Die Protoplasten, die freigesetzt werden, werden wie folgt gesammelt:
Die Präparation wird durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 100 mm, anschließend durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 50 mm filtriert. Die Protoplasten werden durch die Siebe mit einem Volumen KMC-Salz-Lösung, das dem ursprünglichen Volumen der Enzymlösung entspricht, gewaschen. 10 ml der Protoplastenpräparation werden in jedes von mehreren Kunststoff-Einwegzentrifugenröhrchen gegeben und 1,5 bis 2 ml 0,6 M Saccharose-Lösung (mit 0,1% MES und KOH auf pH 5,6 gepuffert) darunter geschichtet. Das Röhrchen wird bei 60 bis 100 × g für 10 min zentrifugiert und die Protoplastenbanden an der Grenzfläche werden mit einer Pipette gesammelt und in frisches Röhrchen gebracht. Die Protoplastenpräparation wird 10 ml frischer KMC-Salz-Lösung resuspendiert und für 5 min bei 60 bis 100 × g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und verworfen und die Protoplasten werden in dem verbleibenden Tropf vorsichtig resuspendiert und dann werden nach und nach 10 ml einer KMC-Lösung der Stärke 13/14 zugegeben. Nach erneutem Zentrifugieren für 5 min wird der Überstand erneut entfernt und die Protoplasten werden in einer KMC-Lösung der Stärke 6/7 re-suspendiert. Ein Aliquot wird zur Zählung entnommen, und die Protoplasten werden durch Zentrifugation erneut sedimentiert. Die Protoplasten werden mit 10⁷ pro ml in KM-8p-Medium oder in 0,5 M Mannit, enthaltend 6 mM MgCl₂, oder in anderem geeigneten Medium zur Verwendung bei der Transformation, wie es in den folgenden Beispielen beschrieben wird, re-suspendiert. Diese Protoplasten-Suspension wird zur Transformation eingesetzt und wird wie unten beschrieben kultiviert.
Beispiel 22: Transformation von Zea mays-Protoplasten durch Elektroporation

A. Alle Schritte außer dem Hitzeschock werden bei Raumtemperatur (22 bis 28°C) durchgeführt. Die Protoplasten werden im letzten Schritt der oben beschriebenen in 0,5 M Mannit, das 0,1% MES und 6 mM MgCl₂ enthält, resuspendiert. Der Widerstand dieser Suspension wird in der Kammer in Dialog-Elektroporators gemessen und auf 1 bis 1,2 kL unter Verwendung einer 300 mM MgCl₂-Lösung eingestellt. Die Protoplasten werden hitzegeschockt, indem das Röhrchen, das die Probe enthält, für 5 min in ein Wasserbad mit 45°C getaucht wird, worauf sich ein Kühlen bei Raumtemperatur auf Eis einschließt, und 4 mg linearisiertes Plasmid und 20 mg Kälberthymusträger-DNA zu Aliquots von 0,25 ml dieser Suspension gegeben werden. 0,125 ml einer 24% PEG-Lösung (MG 8000) in 0,5 M Mannit, die 30 mM MgCl₂ enthält, werden den Protoplasten zugesetzt. Das Gemisch wird gut aber leicht gemischt und 10 min inkubiert. Die Probe wird in die Kammer des Elektroporators transferiert und die Proben werden mit 10 Sekunden-Intervallen dreimal mit Anfangsspannungen von 1500, 1800, 2300 oder 2800 Vcm^–1 und einer exponentiellen Verzögerungszeit von 10 ms gepulst. Die Protoplasten werden wie folgt kultiviert. Die Proben werden in 6 cm-Petrischalen bei Raumtemperatur plattiert. Nach weiteren 5 bis 15 min werden 3 ml KM-8p-Medium, das 1,2% SeaPlaque-Agarose und 1 mg/l 2,4-D enthält zugesetzt. Die Agarose und die Protoplasten werden gut vermischt und das Medium wird gelieren gelassen.
B. Dies wird mit einer oder mehreren der folgenden Modifikationen wiederholt: Der Widerstand der Protoplastenpräparation wird auf 0,5 bis 0,7 kL eingestellt.

Das verwendete PEG ist PEG mit einem MG von 4000.
Es wird kein PEG zugesetzt oder es wird ein halbes Volumen 12% PEG zugesetzt.
Die Impulse werden in Intervallen von 3 Sekunden angewendet.
Die Protoplasten werden nach der Elektroporation in Schalen plattiert, die auf eine Platte gestellt werden, welche auf eine Temperatur von 16°C gekühlt wird.
Die Protoplasten werden nach dem Elektroporationsschritt in Röhrchen gegeben, mit 10 ml KMC-Lösung der Stärke 6/7 oder mit W5-Lösung (umfasst 380 mg/l KCl, 18,375 g/l CaCl₂·2H₂O, 9 g/l NaCl; 9 Ag/l Glucose, pH 6,0) gewaschen, danach durch Zentrifugation bei 60 × g für 10 min gesammelt, in 0,3 ml KM-Medium re-suspendiert und wie in A. plattiert.
Die Kälberthymusträger-DNA wird nicht zugesetzt.
Beispiel 23: Transformation von Zea mays-Protoplasten durch Behandlung mit PEG

A. Die Protoplasten werden im letzten Schritt der oben beschriebenen in einer 0,5 M Mannitlösung, die 12 bis 30 mM MgCl₂ enthält, re-suspendiert. Es wird ein Hitzeschock mit 45°C für 5 min durchgeführt, wie es beschrieben wurde. Die Protoplasten werden in Aliquots zur Transformation in Zentrifugenröhrchen verteilt, 0,3 ml suspendierte Protoplasten pro Röhrchen. Während der nächsten 10 min wird Folgendes zugesetzt: DNA und PEG-Lösung (MG 6000, 40%, enthaltend 0,1 M Ca(NO₃)₂ und 0,4 M Mannit; pH 8 bis 9 mit KOH), wobei eine Endkonzentration von 20% PEG erreicht wird. Die Aliquots werden für 30 min unter gelegentlichem leichten Schütteln inkubiert und dann werden die Protoplasten in Petrischalen gegeben (0,3 ml ursprüngliche Protoplastensuspension pro 6 cm Durchmesser-Schale) und kultiviert, wie beschrieben.
B. Dies wird wiederholt und die Protoplasten werden nach 30-minütiger Inkubation in der PEG-Lösung von oben durch Zusatz von 0,3 ml W5-Lösung fünfmal in 2- bis 3-Minuten-Intervallen gewaschen. Die Protoplastensuspension wird zentrifugiert und der Überstand wird entfernt und die Protoplasten werden kultiviert, wie beschrieben.
C. Das Obige wird mit der Modifikation wiederholt, dass die Endkonzentration an PEG zwischen 13 und 25% liegt.

Beispiel 24: Callusregeneration aus Protoplasten
Die Platten, die die Protoplasten in Agarose enthalten, werden bei 26°C ins Dunkle gestellt. Nach 14 Tagen entstehend aus den Protoplasten Kolonien. Die Agarose, die die Kolonien enthält, wird auf die Oberfläche einer Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm, die 30 ml N6-Medium, das 2 mg/l 2,4-D, verfestigt mit 0,24% Gelrite, enthält, enthält, transferiert. Dieses Medium wird als 2N6 bezeichnet. Der Callus wird im Dunklen bei 26°C weiter kultiviert und Callusstücke werden alle 2 Wochen in frischem festem 2N6-Medium subkultiviert.
Beispiel 25: Selektion von transformiertem Callus von Zea mays
Das obige Beispiel wird mit der Modifikation wiederholt, dass ein geeignetes Selektionsagens zu dem 2N6-Medium gegeben wird, um auf transformierte Zellen zu selektieren.
Beispiel 26: Regeneration von Maispflanzen

A. Callus wird auf 2N6-Medium zur Erhaltung gelegt und auf ON6 (umfassend N6-Medium, dem 2,4-D fehlt) und N61-Medium (umfassend N6-Medium, das 0,25 mg/l 2,4-D und 10 mg/l Kinetin enthält) gelegt, um eine Regeneration zu initiieren. Callus, der auf ON6- und N61-Medium gewachsen ist, wird im Licht wachsen gelassen (16 Stunden/Tag Licht mit 840 bis 8400 lx aus weißen Fluoreszenzlampen). Callus, der an N61-Medium gewachsen ist, wird nach 2 Wochen auf ON6-Medium transferiert, da eine längere Zeit an N61-Medium schädlich ist. Der Callus wird alle 2 Wochen subkultiviert, selbst wenn der Callus wieder auf dieselbe Mediumsformulierung zu übertragen ist. Pflänzchen treten in etwa 4 bis 8 Wochen auf. Sobald die Pflänzchen wenigstens 2 cm groß sind, werden sie auf ON6-Medium in GA7-Behältern übertragen. In 2 bis 4 Wochen bilden sich Wurzeln und wenn die Wurzeln gut ausgebildet aussehen, so dass sie Wachstum unterstützen können, werden die Pflänzchen in Erde in Torftöpfe umgepflanzt, wobei sie für die ersten 4 bis 7 Tage unter Schatten bleiben. Es ist oft hilflich, einen klaren Kunststoffbecher für 2 bis 3 Tage über die Transplantate zu stülpen, um ihr Härten zu unterstützen. Sobald die Pflanzen etabliert sind, werden sie wie normale Maispflanzen behandelt und im Gewächshaus zur Reife wachsen gelassen. Um Nachkommen zu erhalten, werden die Pflanzen selbstbestäubt oder mit Wildtyp gekreuzt.
B. Das obige Beispiel wird mit der Modifikation wiederholt, dass ein geeignetes Selektionsmittel zu dem Medium gegeben wird, welches verwendet wird, um den Callus aufrecht zu erhalten.

Beispiel 27: Produktion von transgenen Maispflanzen Gewebe
Unreife Maisembryos mit einer Länge von etwa 1,5 bis 2,5 mm werden aus einer Ähre vom Genotyp 6N615 14 bis 15 Tage nach der Bestäubung herausgeschnitten. Die Mutterpflanze wird im Gewächshaus wachsen gelassen. Vor dem Ausscheiden wird die Ähre mit 20% Chlorox für 20 min oberflächensterilisiert und dreimal mit sterilem Wasser gespült. Einzelne Embryos werden mit der Scutellumseite in einen Bereich von 2 cm², 36 Embryos pro Platte, auf das Callusinitiationsmedium, plattiert; 2DG4 + 5 Chloramben-Medium (N6-Hauptsalze, B5-Nebensalze, MS-Eisen, 2% Saccharose, mit 5 mg/l Chloramben, 20 mg/l Glucose und 10 ml G4-Zusätze, Tabelle 1) werden nach dem Autoklavieren zugesetzt.
Tabelle 1 – G4-Zusätze
Ingrediens pro Liter Medium

Caseinhydrolysat 0,5 g
Prolin 1,38 g
Nikotinsäure 0,2 mg
Pyridoxin-HCl 0,2 mg
Thiamin-HCl 0,5 mg
Cholin-HCl 0,1 mg
Riboflavin 0,05 mg
Biotin 0,1 mg
Folsäure 0,05 mg
Ca-pantothenat 0,1 mg
p-Aminobenzoesäure 0,05 mg
B12 0,136 g

Beschuss
Gewebe wird unter Verwendung der PDS-1000He Biolistics-Vorrichtung beschossen. Das Gewebe wird 8 cm unter dem Stopp-Schirmbrett auf das Brett gelegt. Das Gewebe wird einmal mit der DNA/Goldmikroträger-Lösung 101 beschossen, auf dem Makroträger getrocknet. Der verwendete Stopp-Schirm ist von Hand unter Verwendung eines 10 × 10-Edelstahl-Maschengewebeschirms gestanzt. Es werden Bruchscheiben mit einem Wert von 1550 psi verwendet. Nach Beschuss werden die Embryonen im Dunklen bei 25°C kultiviert.
Präparation von DNA zur Abgabe
Der Mikroträger wird im wesentlichen nach den Anweisungen, die mit der Biolistic-Vorrichtung geliefert wurden, präpariert.
Callusbildung
Embryos werden auf Callusinitiierungsmedium mit 3 mg/l PPT 1 Tag nach Beschuss transferiert. Embryos werden bezüglich der Callusinitiierung 2 und 3 Wochen nach Beschuss einer Punktbewertung unterzogen. Reaktionen werden auf das Calluserhaltungsmedium, 2DG4 + 0,5 2,4-D-Medium, ergänzt mit einem geeigneten Selektionsmittel, das vom verwendeten Selektionsmarkergen abhing, transferiert. Calluserhaltungsmedium ist N6-Hauptsalze, B5-Nebensalze, MS-Eisen, 2% Saccharose mit Zugaben von 0,5 mg/l 2,4-D, 20 mg/l Glucose und 10 ml G4 nach dem Autoklavieren. Embryogener Callus wird alle 2 Wochen auf frisches Erhaltungsmedium, das ein geeignetes Selektionsmittel enthält, subkultiviert. Der gesamte Callus wird im Dunklen bei 25°C inkubiert.
Die Typ I-Callusbildungsantwort ist 18%. Jeder Embryo, der Callus produzierte, wird als einzelnes Ereignis kultiviert, das zu einer einzelnen Linie wurde.
Regeneration
Nach 12-wöchiger Selektion wird das Gewebe aus dem Calluserhaltungsmedium mit einem geeigneten Selektionsmittel entfernt und auf Regenerationsmedium gegeben und bei 25°C unter Anwendung einer Fotoperiode mit 16 Stunden Licht (50 E. m-2, s-1)/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Regenerationsmedium ist 0,25 MS3S5BA (0,25 mg/l 2,4-D, 5 mg/l BAP, MS-Salze, 3% Saccharose) über 2 Wochen, gefolgt von Subkultur auf MS3S-Medium zur Pflanzenregeneration. Nach 4 bis 10 Wochen werden Pflanzen entfernt und in GA7 gegeben.
Beispiel 28: Herstellung von embryogenen Suspensionen aus Gewebe von Dactylis glomerata L. (Knaulgras)

A. Embryogener Callus wird aus Basalsektionen der jüngsten Blätter von im Gewächshaus gewachsenen Knaulgraspflanzen (Dactylis glomerata L.) initiiert, wie es von Hanning und Conger (1982) beschrieben wurde. Die Blätter werden durch Eintauchen in einer 1:10-Verdünnung von Chlorox-Lösung (5,25% Natriumhypochlorit; The Clorox Company, Oakland, Ca.) für etwa 10 min oberflächenbehandelt und dann in kleine Segmente mit einer Länge von 1 bis 5 mm oder einem solchen Durchmesser geschnitten. Diese Segmente werden auf sterilem SH-30-Medium, das 0,8% Agarose als Geliermittel enthält, plattiert. Callus und/oder embryogene Strukturen erscheinen innerhalb von 2 bis 6 Wochen nach Plattierung bei Kultur bei etwa 25°C. Embryogener Callus wird aufrechterhalten, indem alle 2 bis 4 Wochen auf frisches SH-30-Medium eine Subkultur angelegt wird und indem im Dunklen bei 25°C kultiviert wird.
B. Embryogene Suspensionskulturen werden initiiert, indem etwa 0,5 g Frischgewicht an embryogenem Callus in 50 ml flüssiges Medium gegeben werden, das von Gray und Conger (1985) beschrieben wurde und das 45 mM Dicamba und 4 g/l Caseinhydrolysat enthält. Die Suspensionskulturen werden bei 27°C unter einer Fotoperiode mit 16 h Licht (3300 lx), 8 Stunden Dunkelheit an einem Gyratory-Schüttler mit etwa 130 U/min in 125 ml-Delong-Flaschen, die mit einer Metallkappe und Parafilm dicht abgeschlossen sind, wachsen gelassen. Nach etwa 4 Wochen werden die großen Klumpen sich für etwa 30 Sekunden absetzen gelassen und 10 ml-Aliquots des überstehenden Mediums, das kleine Zellcluster enthält, werden entfernt und in 50 ml frisches Medium transferiert. Dieser Prozess wird alle 3 bis 4 Wochen wiederholt, wobei die erfolgreichsten Kulturen als die mit kleinerer Klumpengröße und besserer Qualität auf der Basis des Vorliegens kleiner zytoplasmischer Zellen beurteilt wurden. Nach 5 bis 8 Übertragungen sind die Suspensionen im wesentlichen frei von nicht-embryogenen Zellen und die Mehrheit der Cluster als embryogenen Zellen sind ziemlich klein (150 bis 2000 mm).

Beispiel 29: Isolierung und Reinigung von Dactylis glomerata L.-Protoplasten
Protoplasten werden aus den obigen embryogenen Suspensionskulturen durch aseptisches Filtrieren der Zellen an einer Nalgene-0,2 mm-Filtereinheit und danach Zugeben von 0,5 g Frischgewichtzellen zu jeweils 12,5 ml Protoplastenenzymgemisch in eine Petrieschale hergestellt. Das Enzymgemisch besteht aus 2% Cellulase RS, 7 mM CaCl₂ × H₂O, 0,7 mM NaH₂NPO₄ × H₂O, 3 mM MES (pH 5,6), Glucose (550 mOs/kg H₂O auf pH 5,6), und der Filter ist sterilisiert. Das Gemisch wird an einem Planetenschüttler mit etwa 50 U/min in Dimm (< 420 lx)-Licht für etwa 4 bis 5 Stunden verwirbelt. Der Verdau wird dann durch ein Edelstahl-Sieb (Maschenweite 100 mm) gesiebt und in 12 Zentrifugen-Röhrchen verteilt, die mit etwa 60 bis 100 × g für etwa 5 min zentrifugiert werden. Das Protoplasten enthaltende Sediment wird dann dreimal mit Protoplastenkulturmedium KM-8p gewaschen, das mit Glucose auf 550 mOs/kg H₂O eingestellt ist. Zu diesem Zeitpunkt kann ein Flotationsschritt zur weiteren Reinigung der Protoplasten enthalten sein. In diesem Fall werden die gewaschenen Protoplasten über 10 ml KM-8p-Kulturmedium, das mit Saccharose mit 700 mOs/kg H₂O eingestellt ist, geschichtet. Nach Zentrifugation mit 60 bis 100 × g für etwa 10 min werden die Protoplastenbanden an der Grenzfläche unter Verwendung einer feinen Pipette gesammelt. Schließlich werden die Protoplasten in 1 bis 2 ml KM-8p-Kulturmedium re-suspendiert und durch ein Edelstahl-Sieb (Maschenweite 20 mm) gesiebt. Die freigesetzten Protoplasten werden gesammelt und gewaschen und in KM-8p-Medium zur Kultur oder in osmotisch eingestelltem Medium, das zur Transformation geeignet ist, entsprechend den folgenden Beispielen re-suspendiert.
Beispiel 30: Dactylis glomerata L.-Protoplastenkultur und Calluswachstum

A. Die gereinigten Protoplasten werden mit einer Dichte von etwa 5 × 10⁵ Protoplasten pro ml in KM-8p-Kulturmedium plattiert, welches 1,3% SeaPlaque-Agarose (FMC Corp., Marine Colloids Division, Rockland, Maine, USA) und 30 bis 40% konditioniertes Medium (erhalten von 3 bis 4 Wochen alten Dactylis glomerata L.-embryogenen Suspensionskulturen durch Filtrieren des Mediums durch ein steriles Nalgene-Filter mit 0,2 mm, Einstellen des Mediums auf 550 mOs/kg H₂O durch Zugabe von Glucose und Filtriersterilisieren) enthält. Die Platten werden dann ins Dunkle bei einer konstanten Temperatur von 28°C gelegt. Nach 10 bis 14 Tagen wird die Agarose in Keile geschnitten und in "Perlenkultur" gelegt, wie es von Shillito et al. (1983) beschrieben ist, wobei 20 ml SH-45-Suspensionskulturmedium mit 3% Saccharose pro 3 ml ursprünglicher Agarose-Einbettkultur verwendet werden. Die Pflanzen werden auf einen Plattenschüttler gestellt und bei etwa 50 U/min in Licht bei 670 lx bewegt. Wenn die Kolonien aus der Agarose herauswachsen und Zellen in das flüssige Medium freisetzen, werden neue Suspensionskulturen gebildet. Die resultierenden in Suspension kultivierten Zellen werden auf Agar-verfestigtem SH-30-Medium plattiert und ins Dunkle bei 25°C gestellt, bis Callus gebildet wird.
B. Protoplasten werden wie oben beschrieben kultiviert, außer dass das Kulturmedium kein konditioniertes Medium enthält.

Beispiel 31: Transformation von Dactylis glomerata L.-Protoplasten durch Elektroporation

A. Unmittelbar nach Reinigung der Protoplasten wird eine Elektroporation nach Shillito et al. (1985) unter Verwendung von linearisiertem Plasmid durchgeführt. Die Protoplasten werden nach dem letzten Waschgang in einer Dichte von etwa 7 × 10⁶ Protoplasten pro ml im Elektroporationspuffer (0,4 M Mannit, 6 mM MgCl₂) re-suspendiert. Die Protoplasten werden in 0,7 ml-Aliquots in 10 ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen gebracht. Plasmid-DNA und Ultraschall-behandelte Kälberthymus-DNA (Sigma) werden zu Endkonzentrationen von 10 mg/ml bzw. 50 mg/ml zu den Röhrchen gegeben. Dann werden 0,38 ml PEG-Lösung [24% PEG 6000 in 0,4 M Mannit, 30 mM MgCl₂, 0,1% MES (ph 5,6)] zugesetzt und die Lösung wird leicht gemischt. Die Protoplastensuspension wird in die Kammer eines Dialog-Elektroporators transferiert und 10 Impulse mit 3250 Vcm^–1 Anfangspannung und einer exponentiellen Abklingkonstante von 10 ms werden in 30 s-Intervallen angewendet. Die Probe wird aus der Kammer entfernt und in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm gelegt. 10 ml KM-8p-Medium, das 1,2% SeaPlaque-Agarose enthält, wird zugesetzt, die Protoplasten werden gleichmäßig durch das Medium verteilt und die Agarose wird gelieren gelassen.
B. Das Obige wird wiederholt, außer dass die verwendete Anfangsspannung 3500 Vcm^–1, 4000 Vcm^–1, 5000 Vcm^–1, 3000 Vcm^–1 oder 2500 Vcm^–1 ist.

Beispiel 32: Transformation von Dactylis glomerata L.-Protoplasten durch Behandlung mit PEG

A. Ein PEG-vermittelter direkter Gentransfer wird nach I. Negrutiu et al., (1987) durchgeführt. Die verwendete DNA ist ein beschriebenes linearisiertes Plasmid. Die Protoplasten werden nach dem letzten Waschgang in 0,5 M Mannit, das 15 mM MgCl₂ enthält, in einer Dichte von etwa 2 × 10⁶ pro ml suspendiert. Die Protoplastensuspension wird als 1 ml-Aliquot in 10 ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen verteilt. Die DNA wird wie oben beschrieben zugesetzt und dann werden 0,5 ml der PEG-Lösung zugesetzt (40% PEG 4000 in 0,4 M Mannit, 0,1 M Ca(NO₃)₂, pH 7,0). Die Lösungen werden vorsichtig vermischt und für 30 min bei Raumtemperatur (etwa 24°C) unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. 1,4 ml der Waschlösung wird dann zugegeben und die Inhalte des Röhrchens werden leicht vermischt. Die Waschlösung besteht aus 87 mM Mannit, 115 mM CaCl₂, 27 mM MgCl₂, 39 mM KCl, 7 mM Tris-HCl und 1,7 g/l Myo-inositol, pH 9,0. Vier weitere 1,4 ml-Aliquots Waschlösung werden in 4 min-Intervallen zugesetzt, wobei nach jedem Zusatz gemischt wird. Danach wird das Röhrchen bei etwa 60 × g für etwa 10 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die sedimentierten Protoplasten werden in 1 ml KM-8p-Kulturmedium aufgenommen und eine 10 cm-Petrieschale gegeben. 10 ml KM-8p-Medium, das 1,2% SeaPlaque-Agarose enthält, wird zugesetzt. Die Protoplasten werden gleichmäßig durch das Medium verteilt und die Agarose wird gelieren gelassen.
B. Dies wird mit einer oder mehreren der folgenden Modifikationen wiederholt:
(1) Der pH der Waschlösung wird auf 5,6 oder 7,0 eingestellt.
(2) Das verwendete PEG ist PEG mit MG 6000, PEG mit MG 2000 oder PEG mit MG 8000.
(3) Das Waschmedium besteht aus 154 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl, 5 mM Glucose, pH auf 6,0 mit KOH, 0,2 M CaCl₂, 0,1% MES, pH 6,0 mit KOH, oder aus 0,2 M CaCl₂, 7 mM Tris/HCl, pH 9,0 mit KOH.

Beispiel 33: Transformation von Dactylis glomerata L.-Protoplasten durch Elektroporation oder PEG-Behandlung
Eine Transformation wird wie oben beschrieben durchgeführt, außer dass die Protoplasten für etwa 5 min bei 45°C vor Verteilung der Aliquots in Röhrchen zur Transformation oder nach Verteilung der Aliquots und vor Zusatz des PEG behandelt werden.
Beispiel 34: Selektion von transformierten Kolonien

A. Die Kulturplatten (Petrischalen), die die Protoplasten enthalten, werden für 10 Tage im Dunklen bei etwa 25°C inkubiert und dann in 5 gleiche Scheiben zur "Perlenkultur" (Shillito et al., 1983) geschnitten. Vier der Scheiben werden in je 20 ml SH-45-Kulturmedium gelegt, das 4 g/l Kaseinhydrolysat und ein geeignetes Selektionsmittel, das vom Selektionsmarkergen, das bei der Pflanzentransformation verwendet wird, abhängt, gegeben. Die fünfte Scheibe wird in 20 ml desselben Medium, allerdings ohne Selektionsmittel, als nicht-selektierte Kontrolle gegeben. Nach 4 bis 5 Wochen werden die vermeintlichen transformierten, von Protoplasten abgeleiteten Zellkolonien, die in Gegenwart des Selektionsmarkers wachsen, aus der Agagrose ausgeschnitten und in eine 19 mm-Petrischale mit 2 ml SH-45-Medium, das ein geeignetes Selektionsmittel enthält, gegeben; es wird bei etwa 50 U/min an einem Planetenschüttler bewegt. Nach weiteren 4 bis 5 Wochen werden alle Kolonien, die zur Herstellung neuer Suspensionen wachsen, in 125 ml-Erlenmeyer-Kolben transferiert und in ähnlicher Weise wie die Eltern-Suspensionskultur, außer dass ein geeignetes Selektionsmittel in dem Medium enthalten ist, wachsen gelassen. Die neuen Suspensionen werden alle 1 bis 3 Wochen subkultiviert, wobei SH-45-Medium verwendet wird, das 4 g/l Caseinhydrolysat und ein geeignetes Selektionsmittel enthält. Zellen aus diesen Suspensionen werden auch auf verfestigtes SH-30-Medium, das ein geeignetes Selektionsmittel enthält, plattiert und bei etwa 25°C im Dunklen inkubiert. Calli, die aus den plattierten Zellen gewachsen sind, werden alle zwei Wochen auf frisches Medium subkultiviert. Von den Zellen, die in Gegenwart des Selektionsmarkers wachsen, wird angenommen, dass sie Transformanten sind.
B. Eine Sektion wird wie beschrieben durchgeführt, außer dass die von den Protoplasten abgeleiteten Zellkolonien, die in Gegenwart des Selektionsmarkers enthaltenden Mediums wachsen, auf Agarplatten mit SH-30-Medium, das den Selektionsmarker enthält, gegeben werden und im Dunklen bei etwa 25°C inkubiert werden.

Beispiel 35: Regeneration von transformierten Dactylis glomerata L.-Pflanzen

A. Dactylis glomerata L.-Callus (erhalten wie beschrieben), der von Protoplasten abgeleitet ist, wird auf verfestigtem SH-30-Medium wachsen gelassen und alle 2 Wochen subkultiviert. Embryos, die sich bilden, werden entfernt und auf Keimungsmedium (SH-O) plattiert und in das Licht gebracht (3800 bis 4600 lx). Eine Keimung dieser Embryos erfolgt in 1 bis 4 Wochen und die resultierenden Pflänzchen werden auf SH-O-Medium im Licht gegeben, um Wurzelsysteme zu bilden. Sie werden im 6- bis 12-Blattstadium ins Gewächshaus gebracht und allmählich gehärtet.
B. Callus (erhalten wie beschrieben), der von Protoplasten abgeleitet ist, wird auf SH-O-Medium, das mit 0,24% Gelrite verfestigt wurde, im Licht (3800 bis 4600 lx) wachsen gelassen und alle 2 Wochen subkultiviert. Die resultierenden Pflänzchen werden in 1:1-Gemisch aus SH-O- und OMS-Medium, verfestigt mit einer Kombination aus 0,12% Gelrite und 0,4% Agar, gegeben, um im Licht Wurzelsysteme zu bilden. Sie werden im 6- bis 12-Blatt-Stadium ins Gewächshaus gebracht und allmählich gehärtet.
C. Kleine Pflänzchen werden erhalten, wie es in den Beispielen 35A und 35B beschrieben ist, und werden auf OMS- Medium, das mit 0,8% Agar verfestigt ist, ins Licht gestellt, um Wurzelsysteme auszubilden. Im 6- bis 12-Blatt-Stadium werden sie in das Gewächshaus gebracht und allmählich gehärtet.
D. Kleine Pflänzchen werden erhalten, wie es in Beispiel 35A oben beschrieben ist, und auf ein 1:1-Gemisch aus SH-O- und OMS-Medium, verfestigt mit einer Kombination aus 0,12% Gelrite und 0,4% Agar, im Licht gegeben, um Wurzelsysteme auszubilden. Sie werden im 6- bis 12-Blatt-Stadium in das Gewächshaus gebracht und allmählich gehärtet.

Beispiel 36: Produktion von transgenen Weizenpflanzen
Aufrechterhaltung der Zellkultur
Calluskulturen werden auf 1MS-Medium gehalten, wie es z.B. von "T. Murashige und F. Skoog, 1962, Physiol. Plant 15, 473–497" beschrieben ist (MS-Salze, Vitamine, Eisen, 3% Saccharose, 0,7% Agar, 1 mg/Liter 2,4-D) gehalten. Die geeigneten Calluskulturen umfassen unter anderem Typ II-Callus (ein brüchiger und embryogener Callustyp), erhalten aus "shoot-competent"-Zellkulturen, wie es in "W. Wang und H. Nguyen, 1990, Plant Cell Reports 8, 639–642") beschrieben ist, und zwar nach wiederholter Subkultur und visuelle Selektion. Sie werden alle 2 Wochen subkultiviert und im Dunklen bei 26°C gehalten. Suspensionskulturen werden in 1MS-Flüssigkeitsmedium gehalten und zweimal wöchentlich subkultiviert. Sie werden im Dunklen bei 26°C gehalten und mit 125 U/min geschüttelt.
Zellpräparierung zum Beschuss
Die Zellen erhalten vor einem Beschuss eine Plasmolyse-Behandlung. Das gepackte Zellvolumen wird gemessen und Zellen werden in flüssigem 1MS-Medium, das mit Osmoticum versetzt ist, verdünnt: 0,4 M Sorbit für Suspensionszellen und 0,6 M Sorbit für Calluszellen. Die Zellen werden so verdünnt, dass das endgültige Zellpackungsvolumen pro Ziel 1/20 ml für eine feine Suspension und 1/10 ml für Callus ist. Verdünnte Zellen werden in einen 250 ml-Kolben gegeben, der einen Rührstab enthält, dann werden sie für mindestens 30 min bis zu wenigen Stunden gerührt. Um die Zellen zu plattieren, werden 2 ml aus der Flasche genommen und in den oberen Teil einer Vakuumflasche pipettiert, auf welche ein Whatman-2,5 cm-GFA-Filter gelegt worden war. Es wird Vakuum angelegt, bis die Zellen auf dem Filter trocken sind; die Filter werden auf 60 × 15 mm-Petriplatten gelegt, die 5 ml festes Nach-Beschuss-Plasmolysemedium enthalten: 1 MS, enthaltend 0,2 M Sorbit, für Suspensionszellen oder 0,4 M Sorbit für Calluszellen. Auf jede Schale werden 2 Filter gelegt.
Partikelpräparation
Goldpartikel (1,0 μm; von Bio-Rad) werden gewaschen, indem sie als Aliquot in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben werden, ungefähr 1 ml 100% Ethanol zugegeben wird, verwirbelt wird, zentrifugiert wird, der Überstand entfernt wird und das Ganze zweimal mit sterilem Wasser wiederholt wird. Nach dem letzten Waschgang wird möglichst viel Wasser entfernt und Polylysin-Lösung (0,02% Polylysin + 15 mM Ammoniumacetat) zugesetzt, um die Partikel vollständig einzutauchen. Die Partikel werden durchgewirbelt, zentrifugiert und der Überstand wird entfernt. Die Partikel werden über Nacht in einer Laminarströmungsabdeckung oder für 30 min unter leichtem Stickstoffstrom trocknen gelassen.
Für eine "Voll"-Partikel-Präparation werden 10 mg Partikel abgewogen und in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Rührstab enthält, gegeben. Es werden 100 ml (1 mg/ml) DNA (entsprechend Stufe I) zugegeben, verwirbelt, es werden 10 ml 100 mM Na₂HPO₄ zugegeben, mit einem Vortex-Gerät behandelt, dann werden 10 ml 100 mM CaCl₂ zugegeben, mit einem Vortex behandelt, es werden 380 ml 100% Ethanol zugegeben, mit einem Vortex behandelt. Die Suspension wird gründlich auf einer Rührplatte gerührt, während 3 ml auf jeden Kunststoff-Flyer (Projektil) pipettiert wurden. Die Partikel wurden für wenigstens 15 min vor Beschuss auf Flyern trocknen gelassen.
Beschuss von Zellkulturen
Der Beschuss von Zellkulturen wird unter Verwendung der in EP-A ... beschriebenen Vorrichtung durchgeführt. Die Petriplatte, die die Zellfilter enthält, wird auf der Plattform oberhalb der Bühne umgedreht, dann über der Partikelflugöffnung zentriert. Der klare Deckel wird über die Plattform gelegt. Ein Mikroprojektil wird auf den Verschlussstift gelegt und der Verschluss wird geschlossen. Der Knopf "Arm" wird gedrückt, um das Reservoir mit der geeigneten Menge an Heliumgas (üblicherweise 1800 bis 1900 psi) zu füllen. Das Vakuum an der Kammer wird auf 27 mm gezogen. Das Vakuum wird abgestellt, und die Knöpfe "Arm" und "Feuer" werden gedrückt. Der "Arm"-Knopf wird in die "Aus"-Position bewegt. Jeder Filter wird üblicherweise zweimal beschossen.
Kultur und Sektion nach Beschuss
Nach Beschuss werden die Zellen über Nacht im Dunklen gehalten. Am nächsten Tag werden die Filter aus dem Plasmolysemedium entfernt und auf 1MS-Medium gelegt. 7 bis 10 Tage nach Beschuss erfolgt eine Selektion für Suspensionszellen und nach 14 Tagen für Kalluszellen.
Die Zellen werden von den Filtern abgekratzt und auf der Oberfläche von Platten ausgebreitet, die 1MS plus ein geeignetes Selektionsmittel enthalten, das vom Selektionsmarkergen abhängt, welches bei der Pflanzentransformation verwendet wird. Die Platten werden im Dunklen für mehrere Wochen inkubiert. Resistente Kolonnen, die nach wenigen Wochen gewachsen sind, werden auf IMS + Selektionsmittel transferiert. Kolonien, die sich für etwa 3 bis 4 Wochen weiter vermehren, werden dann auf "0,5MS"-Erhaltungsmedium transferiert: MS-Salze, Vitamine, Eisen, 3% Saccharose, 0,7% Agar, 0,5 mg/l 2,4-D. Gewebe wird auf diesem Medium 2-wöchentlich subkultiviert, bis embryogene Strukturen oder Gewebe zur Regeneration geeignet erscheint.
Regeneration
Gewebe wird auf MS-Medium, welches entweder 3 mg/l BAP oder 1 mg/l NAA + 5 mg/l GA enthält, transferiert und die Platten werden zum Licht bewegt. Nach 2 bis 4 Wochen wird Gewebe auf MS-Medium ohne Hormone übertragen. Keimlinge bzw. Schösslinge, die auftreten, werden in Magentaboxen gelegt, die entweder MS-Medium ohne Hormone oder MS-Medium mit 0,5 mg/l NAA enthalten. Wenn ausreichend Wurzel- und Schössling-Wachstum aufgetreten ist, werden Pflänzchen im Boden umgepflanzt und in ein Phytotron gestellt.
Beispiel 37: GA-20-Oxidase-DNA aus Arabidopsis thaliana
(a) Isolierung genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana
Samen von Arabidopsis thaliana Landsberg erecta werden durch Behandlung mit 5%iger Natriumhypochlorit-Lösung in 0,01% Tween-20 (Sigma) oberflächensterilisiert, zweimal mit Wasser gewaschen und in 0,15% Agar suspendiert. Die Samen werden auf 0,8% Agar, der Murashige- und Skoog-Medium, supplementiert mit B5-Vitaminen (Sigma) und 5% Saccharose, enthält, in sterilen Magenta-Behältern (Sigma) gesät. Pflanzen werden für 4 Wochen bei 20°C wachsen gelassen und Schösslingmaterial wird in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –70°C gelagert. Genomische DNA wird im wesentlichen wie von Murray und Thompson (MG Murray und WF Thompson (1980)) beschrieben, isoliert. Das gefrorene Gewebe, 10 g, wird in einem eisgekühlten Mörser mit einer geringen Menge an Säuregewaschenem Sand zu einer Aufschlämmung vermahlen. Das Homogenat wird in ein Polypropylenzentrifugenröhrchen überführt, und es wird ein gleiches Volumen an 2% G/V CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid, Sigma), 1,4 M NaCl, 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0, 20 mM EDTA zugesetzt. Nach leichtem Vermischen wird das Röhrchen für 20 min bei gelegentlichem Vermischen bei 67°C inkubiert. Das Röhrchen wird aus dem Wasserbad entfernt und 0,5 Volumen Chloroform wird zugesetzt, es wird leicht gemischt und bei Raumtemperatur (20°C) für 20 min bei gelegentlichem Umdrehen belassen. Das Röhrchen wird für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 2000 g zentrifugiert, die obere Phase wird in ein neues Röhrchen entfernt und die untere Phase wird verworfen. Zu der oberen Phase werden 0,1 Volumen 10% (G/V) CTAB, 0,7 M NaCl gegeben, und die obige Chloroform-Extraktion wird wiederholt. Die obere Phase wird wiederum in ein neues Röhrchen dekantiert und 2 Volumina 10% (G/V) CTAB, 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA werden zugesetzt. Das Ganze wird leicht gemischt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann für 5 min bei 5000 g zentrifugiert. Das Pellet wird in 50% (G/G CsCl in TE-Puffer mit Ethidiumbromid mit 0,5 mg/ml gelöst. Die Lösung wird in ein Quick-Seal-Röhrchen (Beckman) transferiert und in einem Vertikalrotor (Beckman VTi90) für 16 Stunden mit 80.000 U/min bei 20°C zentrifugiert. Die DNA wird unter natürlichem Licht sichtbar gemacht und mit Hilfe einer Spritze und Nadel entfernt. Ethidiumbromid wird durch viermalige Extraktion mit 5 Volumina Butan-1-ol, das vorher gegen NaCl-gesättigtes Wasser äquilibriert worden war, entfernt. Die Lösung wird durch Zusatz von 3 Volumina TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) verdünnt und DNA wird mit 2 Volumina EtOH präzipitiert. Die DNA wird durch Zentrifugation bei 10.000 g für 10 min bei 0°C pelletisiert, mit 70% EtOH gewaschen, im Vakuum getrocknet und in TE-Puffer aufgelöst. Die DNA-Konzentration wird durch ihre Extinktion bei 260 nm bestimmt.
(b) Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
Samen von Arabidopsis thaliana ga1 werden durch Inkubation über Nacht in einer 10 mM-Lösung von GA₃, Schütteln bei Raumtemperatur zur Keimung induziert. Die Samen werden zweimal mit Wasser gewaschen, in 0,15% Agar in Wasser suspendiert und direkt auf Saatkompost gesät. Pflanzen werden 5 Wochen lang wachsen gelassen und Schlösslingsgewebe wird direkt in flüssigen Stickstoff gesammelt und bei –70°C gelagert. Poly A⁺ RNA wird isoliert, wie es von Bartels und Thompson (1983) beschrieben ist. Doppelsträngige cDNA wird aus 5 mg mRNA unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers mit dem cDNA-Synthesis Plus Kit (Amersham) produziert und EcoRI-Adapter werden unter Verwendung des λgt11-Cloning Kit (Amersham) addiert. Die cDNA wird in EcoRI-geschnittene, dephosphorylierte λZapII-Arme (Stratagene) ligiert und unter Verwendung von Gigapack Gold (Stratagene) verpackt. Eine Primärbibliothek aus 320.000 Rekombinanten wird produziert und die Hälfte davon wird durch Passage durch E. coli XL1-Blue (Stratagene), wie vom Hersteller beschrieben, amplifiziert.
(c) Plattierung der cDNA-Bibliothek zum Screening
Ein 50 ml-Aliquot von 2xYT (1,6% Bactotrypton, 1% Hefeextrakt, 0,5% NaCl), enthaltend 0,2% Maltose und 10 mM MgSO₄, wird mit einer einzelnen Kolonie von E. coli XL1-Blue beimpft. Dieses wird über Nacht bei 30°C wachsen gelassen, in ein steriles Zentrifugenröhrchen transferiert und bei Raumtemperatur für 5 min mit 2000 × g zentrifugiert. Die Zellen werden in 10 mM MgSO₄ re-suspendiert. In sterilen 15 ml-Röhrchen werden 500 ml E. coli-Zellen mit 50.000 rekombinanten Bakteriophagen aus der amplifizierten Bibliothek vermischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend für 15 min bei 37°C inkubiert. Geschmolzene Agarose im oberen Teil (0,75% in 2xYT/0,2% Maltose/10 mM MgSO₄), 6,5 ml, wird bei 48°C zugegeben und die Röhrcheninhalte werden schnell auf eine vorerwärmte Platte mit 10 cm × 10 cm aus 1,5% Agar in 2xYT/0,2% Maltose/10 mM MgSO₄ gegossen. Die Platten werden umgekehrt bei 37°C für 6 Stunden inkubiert und dann über Nacht bei 4°C gelagert. Zweifache Nitrocellulosefilter werden markiert und für jeweils 1 Stunde auf die Agarplatten gelegt. Die Filter werden luftgetrocknet und für 5 min mit je 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH (Denaturierung); 3 M NaCl, 1 M Tris-Cl pH 6,5 (Neutralisation); 0,6 M NaCl, 60 mM Trinatriumcitrat (Fixierung) behandelt. Die Filter werden erneut auf Filterpapier luftgetrocknet und im Vakuum zwischen Schichten von Filterpapier bei 80°C für 2 h im Vakuum wärmebehandelt.
(d) Herstellung einer markierten Sonde
Das Insert aus Klon pAt2204, das aus einem PCR-Fragment aus der genomischen Arabidopsis-DNA besteht, wird durch Primerextension mit P³² markiert. Plasmid-DNA, 2 mg in 20 mg TE-Puffer, wird durch Zusatz von 5 ml 1 M NaOH denaturiert, bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert und durch Spinn-Entsalzung durch eine 0,5 ml-Säule aus Sepharose CL-6B in TE neutralisiert, für 2,5 min bei 2000 U/min zentrifugiert. Zu 10 ml dieser denaturierten DNA werden 2 ml Universal-Sequenzierprimer (New England Biolabs) und 2 ml 100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM MgCl₂ gegeben. Das Ganze wird für 15 min bei 37°C inkubiert und 4 ml ³²P-dCTP (10 mCi/ml; 3.000 Ci/mmol; Amersham), 1 ml dGAT-Mix (0,2 mM von jeweils dGTP, dATP, DTTP), 1 ml Klenow-DNA-Polymerase (1 μ/ml; Gibco-BRL) werden zugesetzt. Nach 15 min bei Raumtemperatur (20°C) wird 1 ml 2 mM dCTP zugegeben; nach weiteren 5 min bei Raumtemperatur werden 2,2 ml 10 × HindIII-Puffer (Gibco-BRL) und 10 Einheiten HindIII zugesetzt und das Röhrchen wird für 45 min bei 37°C inkubiert. Um die Reaktion zu beenden, werden 8 ml Formamid-Farbstoff-Lademischung (Pharmacia) zugegeben und die DNA wird durch 2-minütiges Erhitzen auf 95°C denaturiert. Die Produkte werden auf eine 1,5 cm-Vertiefung auf einem 1 mm dicken, 20 cm × 20 cm-Polyacrylamidgel (6% (G/V) Polyacrylamid (Acrylamid:Methylenbisacrylamid = 39:1), 1 × TBE (90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA), 8 M Harnstoff) aufgetragen. Das Gel wird bei Gleichstrom für 1 h bei 25 W laufen gelassen und eine Glasplatte wird entfernt und das Gel wird mit "Cling"-Film bedeckt. Die Position der markierten Bande wird durch Autoradiographie mit Kodak X-OMAT LS für 5 min identifiziert. Die markierte Bande wird aus dem Gel herausgeschnitten und in einem Dialyseschlauch, 1 cm weit, mit 0,4 ml TE-Puffer gegeben. Dieser wird an jedem Ende mit einem Dialyseclip verschlossen und in einen horizontalen Elektrophoresetank, der mit TBE-Puffer gefüllt ist, gegeben.
Die markierte DNA wird bei 100v für 30 min eluiert und aus dem Dialysebeutel im TE-Puffer wiedergewonnen.
(e) Hybridisierung
Nitrocellulosefilter-Aufhebungen, die wie oben hergestellt worden waren, wurden in Wasser angefeuchtet und für 2 Stunden bei 42°C in Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 50 mM NaPi pH 6,3, 0,75 m NaCl, 75 mM Trinatriumcitrat, 0,1% (G/V) Rinderserumalbumin, 0,1% (G/V) Ficoll 400, 0,1% (G/V) Polyvinylpyrrolidon, 0,1% (G/V Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mg/ml beschallte Kälberthymus-DNA) vorhybridisiert. Die Sonde wird für 2 Minuten gekocht, mit 25 ml Hybridisierungspuffer vermischt und mit den vorhybridisierten Filtern in einem Polythenbeutel versiegelt. Eine Hybridisierung wird bei 42°C über Nacht durchgeführt und nicht-gebundene Sonde wird durch Waschen in 0,3 M NaCl, 30 mM Trinatriumcitrat, 0,1% (G/V) SDS bei Raumtemperatur für 15 min und in 15 mM NaCl, 1,5 mM Trinatriumcitrat, 0,1% SDS bei 60°C für 10 min entfernt. Positiv-hybridisierende Plaques werden durch Autoradiographie gegenüber Kodak X-OMAT AR-Film mit intensivierenden Filtern über Nacht bei –70°C identifiziert.
Positive Plaques werden in reiner Form durch Plattieren der primären Positive und Sondieren von Hochhebungen mit dem markierten Insert von pAt2204, wie es oben beschrieben wurde, isoliert. Reine rekombinante λZapII-Klone werden in pBluescript (Stratagene), wie vom Hersteller beschrieben, gerettet.
(f) DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenz der Inserts der primären klonierten PCR-Fragmente wird mit dem T4-Polymerase-Sequenzier-Kit (Pharmacia) erhalten. Das Insert des Volllängenklons pAt2301 wird durch die Konstruktion eines verschachtelten Satzes an Transposoninsertionsklonen unter Verwendung des TN1000 Nested Set Kit (Gold Biotechnologyx, St. Louis, Mo) sequenziert, gefolgt von der Sequenzierung einzelner Klone mit dem T4-Polymerase-Sequenzier-Kit (Pharmacia).
Beispiel 38: Isolierung und Charakterisierung von DNA-Klon pAt2301 und pAt2353, die für eine Gibberellin-20-Oxidase aus Arabidopsis thaliana codieren.
(a) PCR-Amplifikation und Klonierung von internen Fragmenten von mit 20-Oxidase in Verbindung stehenden Genen aus der genomischen Arabidopsis-DNA.
Degenerierte Oligodesoxynukleotid-Primer werden auf der Basis von Aminosäureregionen, die zwischen der Cotylen-Gibberellin-20-Oxidase und anderen Pflanzen, Dioxigenasen konserviert werden, einschließlich dem mit der Reifung in Verbindung stehenden Tomaten-E8-Protein, dem Ethylen-bildenden Enzym der Tomate, Hyoscamin-6-hydroxylase aus Hyoscyamus niger, Gersteflavanon-3-hydroxylase und dem A2-Gen aus Mais, entwickelt. Der Upstream-Primer und der Downstream-Primer enthielten Restriktionsendonukleasespaltstellen für HindIII bzw. EcoRI an ihren 5'-Termini.
Upstream-Primer
Downstream-Primer
PCR-Reaktionen enthielten 50 ng genomische DNA aus Arabidopsis thaliana-Stamm Landsberg erecta (Redei, GP (1962)), je 2,5 μg degenerierten Primer, je 25 μM dNTP und 1 Einheit AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus) in einem Gesamtvolumen an 25 μl AmpliTaq-Puffer, der 1,5 mM MgCl₂ enthielt, und waren mit 25 μl Mineralöl überschichtet. Die Reaktionen werden bei 94°C für 5 min inkubiert, worauf sich 40 Zyklen mit 94°C 1 min, 35°C 2 min, 72°C 3 min anschließen.
Der 72°C-Schritt wird in jedem Zyklus 5 l verlängert. Die Reaktionen werden dann für 10 min bei 72°C inkubiert.
Die Produkte der PCR-Amplifikation werden durch ein 1,5% Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer (90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA) getrennt. Eine schwache Bande mit etwa 190 bp wird identifiziert und aus dem Gel in 100 μl TE-Puffer (10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA) eluiert; davon wird 1 μl als Substrat in einer PCR-Reaktion unter den oben beschriebenen Bedingungen verwendet. Die Produkte werden erneut durch Agarosegelelektrophorese getrennt und die amplifizierte Bande mit 190 bp wird aus der Agarose gereinigt. Diese wird mit EcoRI und HindIII verdaut und ein Zehntel der Produkte werden an 100 ng pUC19 (Pharmacia), vorher mit EcoRI und HindIII verdaut und dephosphoryliert, ligiert. Die Produkte der Ligationsreaktion werden in E. coli-Stamm XL1-Blue (Stratagene) durch Transformation eingeführt und aus 2xYT-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthalten, wachsen gelassen. Plasmid-DNA wird aus einzelnen Kolonien isoliert und durch das Didesoxynukleotid-Kettenterminerungsverfahren sequenziert.
Einer dieser Klone, pAt2204, enthielt ein Insert, dessen vorausgesagte Aminosäuresequenz zu 67% mit der von Kürbis-Gibberellin-20-Oxidase identisch ist.
(b) Isolierung eines Volllängen-cDNA-Klons, der PCR-Klon pAt2204 entspricht
Das Insert von pAt2204 wird mit ³²P-dCTP markiert und verwendet, um Nitrocellulosefilter-Aufhebungen einer Volllängen-cDNA-Bibliothek, konstruiert in λZapII (Stratagene) aus Poly-A⁴-RNA, die aus Schösslingmaterial der Gibberellin-defizienten ga1-Mutante von Arabidopsis thaliana isoliert worden war (M. Koornneef und J. H. van der Veen (1980)) zu sondieren. Die Hybridisierung wird in 50% Formamid, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,3, 0,75 M NaCl, 75 mM Natiumcitrat, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll 400, 0,1% Polyvinylpyrrolidon 360, 0,1% Natriumdodecylsulfat und 100 μg Lachshohden-DNA bei 42°C über Nacht durchgeführt. Filter werden mit 15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat bei 42°C für 10 min gewaschen. Hybridisierungsplaques werden durch Autoradiographie identifiziert und durch sukzessive Hybridisierungszyklen gereinigt. Positive Klone werden in pBluescript-Klone durch Plasmidrettung umgewandelt und durch EcoRI-Verdau und DNA-Sequenzierung charakterisiert. Klon pAt2353 und Klon pAt2301, die ein 1,3 kbp-Insert enthalten, werden für heterologe Expressionsstudien gewählt.
(c) Expression von cDNA-Klon pAt2301 in E. coli
Das 1,3 kbp-Insertg von pAt2301 wird mit EcoRI ausgeschnitten, durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und an den Expressionsvektor pTrcHisA (Invitrogen), der vorher mit EcoRI geschnitten worden war und dephosphoryliert war, ligiert. Ligationsprodukte werden in E. coli-Stamm TOP10 (Invitrogen) durch Transformation eingeführt und durch Wachstum auf 2xYT-Agar mit Ampicillin bei 100 μg/ml selektiert. Plasmid-DNA wird aus einer Anzahl der resultierenden Klone isoliert und die Orientierung des cDNA-Inserts wird durch HindIII-Verdau bestimmt. Klon pAt2328, der ein cDNA-Insert in Sense-Orientierung enthielt, wird verwendet, um 2xYT, enthaltend Carbenicillin mit 100 μg/ml, zu inokulieren. Nach 2-stündigem Wachstum unter Schütteln bei 37°C wird IPTG (Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid) zu 1 mM gegeben und die Kulturen werden für weitere 5 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und in 4 ml 100 mM Tris-Cl, pH 7,5, 4 mM DTT suspendiert und auf Eis für insgesamt 90 s mit Ultraschall behandelt. Die Proben werden dann in flüssigem Stickstoff gefroren, von Hand aufgetaut und unlösliches Material durch Zentrifugation bei 15.000 × g für 5 min entfernt. Das resultierende Überstandsmaterial wird bei –80°C gelagert und anschließend für ein Enzymassay verwendet.
Der Überstand (90 μl) wird mit [¹⁴]GA₁₂ (10.000 dpm) und Dioxygenase-Co-Faktoren, wie in Beispiel 1 angegeben, in einem Gesamtvolumen von 100 μl bei 30°C für 5 h inkubiert. Eine Produkttrennung durch HPLC zeigte eine Produktion von [¹⁴]GA₁₅, dessen Identität durch die Kombination Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) bestätigt wird.
Beispiel 39: Isolierung von cDNA-Klon YAP169, der für eine Gibberellin-20-Oxidase aus Arabidopsis thaliana codiert.
Ein TBLASTN-Programmwird mit DBEST (Datenbank exprimierter Sequenz-tags), diebei der NIH unterhalten wird (BLAST@NCBI.NLM.NIH.GOV) laufen gelassen, wobei die volle Aminosäuresequenz des Arabidopsis-cDNA-Klons At2301 verwendet wurde, um nach verwandten Sequenzen zu suchen. Das Suchprogramm translatiert die DNA-Sequenzen in der Datenbank in Aminosäuresequenzen in beiden Orientierungen und allen drei Leserastern. Die DBEST-Datenbank enthält partielle Sequenzen für cDNAs, die statistisch als Teil des systematischen Arabidopsis-cDNA-Sequenzierungsprogramms erhalten wurden. Das Verfahren zur Herstellung von Arabidopsis-Sequenzen wurde von Höfte et al. (1993) veröffentlicht.
Beim Durchlauf des TBLASTIN-Programms kann ein weiterer Klon (YAP169) identifiziert werden, der aufgrund seiner Sequenzhomologie zu Klon pAt2301 wahrscheinlich für eine Dioxygenase codiert. Eine Expression der cDNA in E. coli, wie vorstehend beschrieben, bestätigt, dass das exprimierte Protein 20-Oxidase-Aktivität hat. Klon YAP169 war freundlicherweise von M. Delseny der Universität von Perpignan, Frankreich, zur Verfügung gestellt worden.
Beispiel 40: Transformation von ARabidopsis thaliana
(a) Konstruktion eines PR1-tml-Vektors
Die Konstruktion eines Vektors, in dem der doppelte CaMV-35S-Promotor in pCGN1761 durch den chemisch-induzierbaren Promotor aus dem Arabidopsis PR1a-Gen ersetzt ist. Das Oligonucleotid 5'-GAGAATTCTAAGTTGATAATGGTTATTG-3' wird in Verbindung mit dem M13-Universalsequenzierungsprimer in einer PCR-Reaktion eingesetzt, wobei Plasmid pATRP1-P als Substrat verwendet wird. Das Produkt dieser Reaktion, ein 4,2 kbp-Fragment, das den PR1-Promotor enthält, wird mit EcoRI und HindIII verdaut. Plasmid pCGN1761 wird mit EcoRI und HindIII verdaut, um den doppelten 35S-Promotor zu entfernen; das resultierende 5 kbp-Vektor-Fragment wird mit dem PR1-Promotorfragment ligiert. Die Ligationsprodukte werden durch Transformation in E. coli eingeführt und eine Kolonie, die den PR1-Promotor enthält, wird identififziert. Dieses Plasmid wird pPR1-tml genannt.
(b) Konstruktion von chimären 35S-20-Oxidase (Arabidopsis)-Genen (die drei Arabidopsis-20-Oxidase-cDNAs, jeweils kloniert in pCGN1761)
Die drei GA-20-Oxidase-cDNAs (At2301, At2353 und YAP169) werden jeweils in Sense- und Antisense-Orientierung hinter dem konstitutiven CaMV 35S-Promotor durch PCR-Amplifikation jedes offenen Leserasters und Transfer in den Vektor pCGN1761 exprimiert. Es wird ein Oligonukleotid synthetisiert, das dem Translationsinitiationscodon und den darauffolgenden 12–13 Basen des codierenden Strangs jeder cDNA entspricht und eine EcoRI-Stelle an den 5'-Enden eingearbeitet hat: für pAT2301 ist das Oligonukleotid 5'-GAGAATTCAAAATGGCCGTAAGTTTCG-3'; für pAt2353 ist das Oligonukleotid 5'-GAGAATTCAGAAATGGCGATACTATGC-3'; für YAP169 ist das Oligonukleotid 5'-GAGAATTCAAAAATGGCAACGGAATGC-3'. Jedes dieser Oligonukleotide wird in Verbindung mit dem M13-Universalsequenzierungsprimer in PCR-Reaktionen eingesetzt, wobei das geeignete Plasmidsubstrat (pAt2301, pAT2353 bzw. YAP169) verwendet wird. Die PCR-Produkte aus jeder Reaktion werden mit EcoRI verdaut und in die EcoRI-Stelle von pCGN1761 kloniert, wobei Standardtechniken angewendet werden. Kolonien, die jedes der drei cDNA-Inserts in Sense- und Antisense-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors tragen, werden isoliert und werden pCGN1761-35S-At2301-Sense, pCGN1761-35S-At2301-Antisense, pCGN1761-35S-At2353-Sense, pCGN1761-35S-At2353-Antisense, pCGN1761-35S-YAP169-Sense bzw. pCGN1761-35S-YAP169-Antisense genannt.
(c) Konstruktion von chimären PR1-20-Oxidase (Arabidopsis)-Genen (die drei Arabidopsis-20-Oxidase-cDNAs, jeweils in lpPR1-tml kloniert
Die mit EcoRI-verdauten PCR-Produkte, die von den oben beschriebenen pAt2301, pAt2353 und YAP169 abgeleitet sind, werden in die EcoRI-Stelle von pPR1-tml kloniert, wobei jede Arabidopsis-GA-20-Oxidase-cDNA in Sense- und Antisense-Orientierung bezüglich dem chemisch-induzierbaren PR1-Promotor erhalten wird. Die Konstrukte werden pPR1-At2301-Sense, pPR1-At2301-Antisense, pPR1-At2353-Sense, pPR1-At2353-Antisense, pPR1-YAP169-Sense und pPR1-YAP169-Antisense genannt.
(d) Transfer der 35S-20-Oxidase (Arabidopsis)-Fusionen aus pCGN1761-35S-At2301-Sense, pCGN1761-35S-At2301-Antisense, pCGN1761-35S-At2353-Sense, pCGN1761-35S-At2353-Antisense, pCGN1761-35S-YAP169-Sense und pCGN1761-35S-YAP169-Antisense zu dem binären Vektor pCIB200
Die 35S-20-Oxidase-Expressionskassetten werden aus den Konstrukten pCGN1761-35S-At2301-Sense, pCGN1761-35S-At2301-Antisense, pCGN1761-35S-At2353-Sense, pCGN17b1-35S-At2353-Antisense, pCGN1761-35S-YAP169-Sense und pCGN1761-35S-YAP169-Antisense durch Verdau oder partiellen Verdau mit XbaI ausgeschnitten. Jede dieser Kassette wird in die XbaI-Stelle pCIB200 [siehe Beispiel 11] kloniert, wobei binäre Vektoren erzeugt werden, die fähig sind, die cDNA-Inserts von pAt2301, pAt2353 und YAP169 in Sense- und Antisense-Orientierung hinter dem doppelten 35S-Promotor zu exprimieren.
(e) Transfer der PR1-20-Oxidase (Arabidopsis)-Fusionen aus pPR1-At2301-Sense, pPR1-At2301-Antisense, pPR1-At2353-Sense, pPR1-At2353-Antisense, pPR1-YAP169-Sense und pPR1-YAP169-Antisense zu dem binären Vektor pCIB200
Die PR1-20-Oxidase-Expressionskassetten werden aus den Konstrukten pPR1-At2301-Sense, pPR1-At2301-Antisense, pPR1- At2353-Sense, pPR1-At2353-Antisense, pPR1-YAP169-Sense und pPR1-YAP169-Antisense durch Verdau oder pariellen Verdau mit XbaI ausgeschnitten. Jede dieser Kassetten wird in die XbaI-Stelle von pCIB200 kloniert, wodurch binäre Vektoren gebildet werden, die fähig sind, die cDNA-Inserts von pAt2301, pAt2353 und YAP169 in Sense- und Antisense-Orientierung hinter dem chemisch-induzierbaren PR1-Promotor zu exprimieren.
(f) Transformation von Arabidopsis thaliana
Die obigen Konstrukte werden durch eine Agrobacterium tumifaciens-vermittelte Transformation, wie sie in Beispiel 12 und 13 beschrieben ist, in Arabidopsis thaliana eingeführt.
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EP-A 0 332 104
EP-A 0 434 616
EP-A 0 462 065
EP-A 0 478 502
WO 89/07647
US 4,945,050

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Molekül, das für ein Polypeptid codiert, das zu mehr als 50% zu SEQ ID NO: 2 homolog ist und GA20-Oxidase-aktivität aufweist.
DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid, das GA20-Oxidaseaktivität aufweist, fähig ist, auf eines oder mehrere der folgenden Substrate zu wirken: GA₁₂, GA₅₃, GA₁₅ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₄₄ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₂₄, GA₁₉ und GA₂₃.
DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das in Form eines cDNA-Klons ist.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das für eine GA20-Oxidase aus Pflanzen, vorzugsweise aus monokotylen oder dikotylen Pflanzen, bevorzugter aus dikotylen Pflanzen und am bevorzugtesten aus Pflanzen der Familie Cucurbitaceae bzw. Cruciferase codiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 4; das für GA20-Oxidase von Cucurbita maxima codiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 4, das für GA20-Oxidase aus Arabidopsis thaliana codiert.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend eine Sequenz, die dem offenen Leseraster der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz entspricht, oder eine über die Degeneriertheit des genetischen Codes äquivalente Sequenz, einschließlich Derivate, die fähig sind, mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz zu hybridisieren und die noch für ein Polypeptid codieren, das GA20-Oxidaseaktivität aufweist.
DNA-Molekül, das mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 eine mindestens 60%ige Sequenzhomologie hat.
DNA-Molekül, das mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 eine mindestens 60%ige Sequenzhomologie hat.
DNA-Molekül, das mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 eine mindestens 60%ige Sequenzhomologie hat.
Verfahren zur Herstellung einer DNA nach Anspruch 1, die für ein Polypeptid codiert, welches eine GA20-Oxidaseaktivität aufweist, umfassend Herstellen einer cDNA-Bibliothek aus einem geeigneten Quellenorganismus und Screening dieser Bibliothek mit einem der herkömmlicherweise angewendeten Screening-Systeme.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Screening mit Hilfe eines Antikörpers gegen GA20-Oxidase oder einen Teil ihrer Aminosäuresequenz oder indem auf das Charakteristikum der katalytischen Aktivität der GA20-Oxidase getestet wird, erreicht wird.
Polypeptid, das rekombinant produziert wurde, indem in einem geeigneten Wirtsorganismus eine DNA-Sequenz, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 10 beansprucht wird und die eine Aminosäuresequenz mit einer mehr als 50%igen Homologie zu SEQ ID NO: 2 hat und GA20-Oxidaseaktivität aufweist, exprimiert wird.
Polypeptid nach Anspruch 13, das fähig ist, auf eines oder mehrere der folgenden Substrate zu wirken: GA₁₂, GA₅₃, GA₁₅ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₄₄ (offenes oder geschlossenes Lacton), GA₂₄, GA₁₉ und GA₂₃.
GA20-Oxidase nach Anspruch 13 oder 14, die aus Pflanzen, vorzugsweise aus monokotylen oder dikotylen Pflanzen, bevorzugter aus dikotylen Pflanzen und am bevorzugtesten aus Pflanzen der Familie Cucurbitaceae bzw. Cruciferae stammt.
GA20-Oxidase nach Anspruch 15, die aus Cucurbita maxima stammt.
GA20-Oxidase nach Anspruch 15, die aus Arabidopsis thaliana stammt.
GA20-Oxidase nach einem der Ansprüche 13 bis 17, die die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz hat.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 13, das Exprimieren einer DNA-Sequenz, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 10 beansprucht wird, in einem geeigneten Wirtsorganismus umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, indem diese Expression in einer transformierten Wirtszelle stattfindet.
Transformierte Wirtszelle, die eine DNA nach Anspruch 1 in funktioneller Verknüpfung mit Expressionssignalen, die Promotor- und Terminationssequenzen umfassen, die die Expression der DNA in der Wirtszelle ermöglichen, umfasst.
Chimäres Genkonstrukt, umfassend eine DNA nach Anspruch 1 in funktioneller Verknüpfung mit Pflanzenexpressionssignalen, die Promotor- und Terminationssequenzen umfassen, die fähig sind, zu bewirken, dass das Gen ein Polypeptid, das GA20-Oxidaseaktivität aufweist, innerhalb einer Pflanze exprimiert.
Chimäres Genkonstrukt, umfassend eine DNA nach Anspruch 1 oder einen Teil davon in reverser Orientierung und funktioneller Verknüpfung mit Pflanzenexpressionssignalen, die Promotor- und Terminationssequenzen umfassen, welche fähig sind, zu bewirken, dass die reverse Sequenz Antisense-mRNA in einer Pflanze exprimiert.
Chimäres Genkonstrukt nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Promotor ein induzierbarer Promotor ist.
Chimäres Genkonstrukt nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Promotor ein Gewebe-bevorzugter oder Gewebe-spezifischer Promotor ist.
Chimäres Genkonstrukt nach Anspruch 25, wobei der Gewebe-bevorzugte oder der Gewebe-spezifische Promotor ein Mark-spezifischer Promotor ist.
Chimäres Genkonstrukt nach Anspruch 22 oder 23, das zusätzlich zu den Promotor- und Terminierungssequenzen außerdem regulatorische Sequenzen der 5'- und 3'-unlatierten Region umfasst.
Chimäres Genkonstrukt nach Anspruch 27, wobei die zusätzliche regulatorische Sequenz eine Sequenz ist, die fähig ist, die Transkription einer assoziierten DNA-Sequenz in Pflanzengewebe im Induktions- oder Repressionssinn zu regulieren.
Chimäres Genkonstrukt nach Anspruch 28, wobei die regulatorische Sequenz durch eine Chemikalie induzierbar ist.
Chimäres Genkonstrukt nach Anspruch 29, wobei die regulatorische Sequenz aus einem PR (mit Pathogenese in Verbindung stehendem) Proteingen erhältlich ist.
Vektor, der ein chimäres Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 22 bis 30 umfasst.
Wirtszelle, die mit einem chimären Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 22 bis 30 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 32, die bakteriellen oder pflanzlichen Ursprungs ist.
Transgene Pflanzenzelle oder Pflanze, einschließlich ihres Samens, die in stabiler Weise in ihr Genom eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 integriert umfasst.
Transgene Pflanze einschließlich ihres Samens, umfassend eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 in funktioneller Verknüpfung mit Pflanzenexpressionssignalen, die Promotor- und Terminierungssequenzen enthalten, welche eine Expression der DNA in der Pflanze ermöglichen.
Transgene Pflanze, einschließlich ihres Samens, umfassend eine DNA nach Anspruch 1 oder einen Teil davon in reverser Orientierung und in funktioneller Verknüpfung mit Pflanzenexpressionssignalen, die Promotor- und Terminationssequenzen umfassen, die eine Transkription der Sequenz oder der Partialsequenz unter Bildung von Antisense-mRNA ermöglichen.
Transgene Zelle oder Pflanze, einschließlich ihres Samens, die mit einem chimären Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 22 bis 30 transformiert ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 34 bis 37, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tabak, Karotte, Sonnenblume, Tomate, Baumwolle, Zea mays, Dactylis glomerata und Weizen.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 34 bis 37, die eine monokotyle Pflanze ist, vorzugsweise eine grasartige Monokotyle ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 39, die eine grasartige Monokotyle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale und Setaria, ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 40, die eine Maispflanze ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 40, die eine Weizenpflanze ist.
Nachkommen oder Ableger, einschließlich Samen, einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 34 bis 42.
Verfahren zur Identifizierung von DNA-Sequenzen, die eine DNA-Region umfassen, welche für ein Polypeptid codiert, das GA20-Oxidaseaktivität aufweist, wobei das Verfahren umfasst: Herstellen einer cDNA- oder einer genomischen Bibliothek aus einem geeigneten Quellenorganismus und Screening dieser Bibliothek mit Hilfe einer Hybridisierung unter Verwendung einer rekombinanten DNA nach einem der Ansprüche 7 bis 10 als Hybridisierungssonde.
DNA-Sequenz, die eine DNA-Region umfasst, die für ein Polypeptid codiert, das GA20-Oxidaseaktivät hat, die durch ein Verfahren nach Anspruch 44 erhältlich ist.