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DE60128002T2 - Rezeptor-nukleinsäure und rezeptor-polypeptide - Google Patents

Rezeptor-nukleinsäure und rezeptor-polypeptide Download PDF

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DE60128002T2
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DE60128002T
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Christine M. Reading AMBROSE
Jeffrey S. Stoneham THOMPSON
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Biogen MA Inc
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Biogen Idec Inc
Biogen Idec MA Inc
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Description

  • ERFINDUNGSGEBIET
  • Die vorliegende Erfindung bietet ein neues Rezeptorprotein. Die Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf Nukleinsäuren und Polypeptide. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Nukleinsäuren, die für Polypeptide kodieren, die mit einem Rezeptor für BAFF, einem zur Tumornekrosefaktor („TNF")-Familie gehörenden B-Zellen aktivierenden Faktor, der mit der Expression von B-Zellen und Immunglobulinen assoziiert ist, verwandt sind. Dieser Rezeptor kann für die Behandlung von Krebsen, Lymphomen, Autoimmunkrankheiten oder ererbten genetischen Störungen, die mit B-Zellen zu tun haben, eingesetzt werden.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Rezeptor in der TNF-Familie. Ein neuer Rezeptor wurde als der BAFF-Rezeptor („BAFF-R") identifiziert.
  • Die TNF-Familie besteht aus Paaren von Liganden und deren spezifischen Rezeptoren, die als TNF-Familien-Liganden und TNF-Familien-Rezeptoren bezeichnet werden (Bazzoni und Beutler (1996) N. Engl. J. Med. 334(26):1717-1725). Die Familie ist an der Regulation des Immunsystems und möglicherweise anderer nicht-immunologischer Systeme beteiligt. Die Regulation findet oft auf einer „Hauptschalter"-Ebene statt, so dass die TNF-Familien-Signalübertragung eine große Zahl nachgeordneter Ereignisse auslösen kann, die am besten durch TNF repräsentiert werden kann. TNF kann die allgemeine schützende Entzündungsantwort eines Organismus auf ein fremdes Eindringen auslösen, die eine geänderte Präsentation von Adhäsionsmolekülen, die am Zellverkehr beteiligt sind, Chemokin-Produktion zur Steuerung bestimmter Zellen in bestimmte Kompartimente, und das Priming von verschiedenen Effektorzellen umfasst. Somit besitzt die Regulation dieser Wege klinisches Potential.
  • Die Induktion verschiedener zellulärer Antworten, die durch solche TNF-Familien-Zytokine vermittelt werden, wird nach der allgemeinen Meinung durch die spezifische Bindung an spezielle Zellrezeptoren ausgelöst. Zumindest zwei verschiedene TNF-Rezeptoren von ungefähr 55kD (TNFR1) und 75kD (TNFR2) wurden identifiziert (Hohman et al. (1989) J. Biol.Chem. 264:14927-13934; und Brockhaus et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3127-3131). Umfangreiche Polymorphismen wurden mit beiden TNF-Rezeptorgenen assoziiert. Die beiden TNFRs teilen die typische Struktur von Zelloberflächenrezeptoren, einschließlich extrazellulärer, Transmembran- und intrazellulärer Domänen. Der extrazelluläre Teil von Typ 1- und Typ 2-TNFRs enthält ein repetitives Aminosäuresequenzmuster von vier cysteinreichen Domänen (CDRs). Ein ähnliches repetitives Muster von CDRs existiert in einigen anderen Zelloberflächenproteinen, einschließlich des p75-Nervenwachstumsfaktor-Rezeptors, des B-Zell-Antigens CD40, nebst anderen.
  • Die Rezeptoren sind mächtige Werkzeuge zur Aufklärung biologischer Wege, da sie leicht in Immunglobulin-Fusionsproteine verwandelt werden können. Diese dimeren löslichen Rezeptor-Formen sind gute Inhibitoren von Vorgängen, die entweder durch sekretierte oder oberflächengebundene Liganden vermittelt werden. Durch die Bindung an diese Liganden hindern sie den Liganden an der Wechselwirkung mit zellassoziierten Rezeptoren, die signalisieren können. Diese Rezeptor-Fc-Fusionsproteine sind nicht nur im experimentellen Sinne nützlich, sondern wurden auch im Falle von TNF-R-Fc erfolgreich klinisch eingesetzt, um chronisch-entzündliche Darmerkrankungen, rheumatoide Arthritis und das akute klinische Syndrom, das die OKT3- Verabreichung begleitet, zu behandeln (Eason et al. (1996) Transplantation 61(2):224-228; Feldmann et al. (1996) Int. Arch. Allergy Immunol. 111(4):362-365; und van Dullemen et al. (1995) Gastroenterol. 109(1):129-135). Man kann sich vorstellen, dass die Manipulation der zahlreichen Ereignisse, die durch das Signalisieren durch die TNF-Familie von Rezeptoren vermittelt wird, eine breite Anwendung in der Behandlung von immunbasierten Krankheiten und auch des großen Bereichs menschlicher Krankheiten, die pathologische Komplikationen aufgrund der Beteiligung des Immunsystems aufweisen, finden wird. Eine lösliche Form eines kürzlich beschriebenen Rezeptors, Osteoprotegerin, kann den Verlust von Knochenmasse blockieren; daher sind die Ereignisse, die durch TNF-Familien-Rezeptoren-Signaltransduktion kontrolliert werden, nicht notwendigerweise auf die Immunsystem-Regulierung beschränkt (Simonet et al. (1997) Cell 89(2):309-319). Antikörper gegen den Rezeptor können blockierendie Ligandenbindung blockieren und daher auch klinische Anwendung finden. Solche Antikörper sind oft sehr langlebig und können gegenüber löslichen Rezeptor-Fc-Fusionsproteinen, die kürzere Blut-Halbwertszeiten aufweisen, Vorteile besitzen.
  • Während die Inhibition des rezeptorvermittelten Weges die am meisten ausgeschöpfte therapeutische Anwendung dieser Rezeptoren darstellt, war es ursprünglich die Aktivierung der TNF-Rezeptoren, die klinisch vielversprechend schien (Aggarwal und Natarajan (1996) Eur. Cytokine Netw. 7(2):93-124). Die Aktivierung der TNF-Rezeptoren kann den Zelltod in der Zielzelle auslösen; daher war und ist die Anwendung bei Tumoren attraktiv (Eggermont et al. (1996) Ann. Surg. 224(6):756-765). Der Rezeptor kann entweder durch Verabreichung des Liganden, d.h. über den natürlichen Weg, aktiviert werden, oder einige Antikörper, die den Rezeptor quervernetzen können, sind auch potente Agonisten. Antikörper hätten Vorteile in der Onkologie, da sie über lange Zeiträume im Blut verharren können, während die Liganden im allgemeinen kurze Lebenszeiten im Blut besitzen. Da viele dieser Rezeptoren selektiver in Tumoren exprimiert werden können, oder sie nur in Tumoren den Zelltod oder die Zelldifferenzierung signalisieren können, könnten agonistische Antikörper gute Waffen für die Behandlung von Krebs sein. Desgleichen werden viele positive immunologische Ereignisse über die TNF-Familien-Rezeptoren vermittelt, z.B. entzündliche Reaktionen und Antikörperproduktion des Wirts etc., und daher könnten agonistische Antikörper positive Effekte bei anderen, nicht-onkologischen Anwendungen haben.
  • Paradoxerweise kann die Inhibition eines Weges klinischen Nutzen bei der Behandlung von Tumoren haben. Zum Beispiel wird der Fas-Ligand von einigen Tumoren exprimiert, und diese Expression kann zum Tod Fas-positiver Lymphozyten führen und es damit dem Tumor erleichtern, dem Immunsystem zu entkommen. In diesem Falle könnte die Inhibition des Fas-Systems dann dem Immunsystem erlauben, auf den Tumor auf andere Weise zu reagieren, nun da ein Zugang möglich ist (Green und Ware (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(12):5986-90).
  • Der TNF-Familien-Ligand BAFF, auch als TALL-1, THANK, BLyS und zTNF4 bekannt (Schneider et al. (1999) J. Exp. Med. 189(11):1747-1756; Shu et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 65(5):680-683; Mukhopadhyay et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(23):15978-15981; Moore et al. (1999) Science 285(5425):260-263; Gross et al. (2000) Nature 404(6781):995-999), erhöht das Überleben von B-Zellen in vitro (Gatten et al. (2000) J. Exp. Med. 192(10):1453-1466) und hat sich als ein Schlüsselregulator peripherer B-Zell-Populationen in vivo erwiesen. BAFF überexprimierende Mäuse zeigen reife B-Zell-Hyperplasie und Symptome von systemischem Lupus erythematodes (SLE) (Mackay et al. (1999) J. Exp. Med. 190(11):1697-1710; WO 00/43032 ). Einige SLE-Patienten haben auch signifikant erhöhte BAFF-Spiegel im Serum (Zhang et al. (2001) J. Immunol. 166(1):6-10). Es wurde daher vorgeschlagen, dass abnorm hohe Spiegel dieses Liganden zur Pathogenese von Autoimmunkrankheiten durch Erhöhung des Überlebens von autoreaktiven B-Zellen beitragen könnten (Gatten et al. (2000) J. Exp. Med. 192(10):1453-1466).
  • BAFF, ein Typ-II-Membranprotein, wird von Zellen myeloider Herkunft produziert (Schneider et al. (1999) J. Exp. Med. 189(11):1747-1756; Moore et al. (1999) Science 285(5425):260-263) und wird entweder auf der Zelloberfläche oder in löslicher Form exprimiert (Schneider et al. (1999) J. Exp. Med. 189(11):1747-1756). Zwei TNF-Rezeptor-Familienmitglieder, BCMA und TACI, interagieren, wie schon früher gezeigt, mit BAFF (Gross et al. (2000) Nature 404:995-999; Thompson et al. (2000) J. Exp. Med. 192(1):129-135; Xia et al. (2000) J. Exp. Med. 192:137-143; Marsters et al. (2000) Curr. Biol. 10(13):785-788; Shu et al. (2000) J. Leukoc. Biol. 65(5):680-683; Wu et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:35478-35485; Yu et al. (2000) Nature Imm. 1(3):252-256).
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung von „BAFF-R", einem BAFF-Rezeptorprotein, Polynukleotidsequenzen und der BAFF-R-Polypeptide, die von diesen Nukleinsäuresequenzen kodiert werden.
  • In einem Aspekt bietet die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, die ein BAFF-R-Polypeptid kodiert, oder ein Fragment oder Derivat davon. Die Nukleinsäure kann z.B. eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die ein Polypeptid kodiert, das wenigstens 50% identisch, oder wenigstens 90% identisch mit einem Polypeptid ist, das die Aminosäuresequenz der 2D (SEQ ID NO:5) umfasst.
  • Die Erfindung bietet auch ein im wesentlichen reines Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz umfasst, die unter stringenten Bedingungen an eine Hybridisierungssonde hybridisiert, wobei die Nukleinsäuresequenz der Sonde aus der kodierenden Sequenz von 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) oder dem Komplement jener kodierenden Sequenz besteht.
  • In einigen Ausführungsformen kodiert die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid, das die Sequenz von 2D (SEQ ID NO:5) mit mindestens einer konservativen Aminosäuresubstitution besitzt.
  • In einigen Ausführungsformen kodiert die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid, das an BAFF bindet.
  • Die Nukleinsäure kann z.B. eine Nukleinsäure umfassen, die die in 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) dargestellte Nukleotidsequenz umfasst.
  • Die Nukleinsäure kann z.B. ein genomisches DNA-Fragment sein, oder sie kann ein cDNA-Molekül sein. Auch von der Erfindung umfasst ist ein Vektor, der eine oder mehrere hierin beschriebene Nukleinsäuren enthält, und eine Zelle, die die hierin beschriebenen Vektoren oder Nukleinsäuren enthält.
  • In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein im wesentlichen reines Nukleinsäuremolekül, das für ein Fusionsprotein kodiert, das mindestens zwei Segmente umfasst, wobei eines der Segmente ein Polypeptid oder ein Fragment davon umfasst, wie es in den Aminosäuresequenzen beschrieben ist, die in den obigen Ausführungsformen der Erfindung dargelegt sind. Die Erfindung bietet auch ein Fusionsprotein, das mindestens zwei oder drei Segmente umfasst, wobei das erste Segment ein heterologes Signal-Polypeptid umfasst, das zweite ein Polypeptid oder ein Fragment davon umfasst, wie es in den BAFF-R-Aminosäuresequenzen beschrieben ist, die in den obigen Ausführungsformen der Erfindung dargelegt sind, und das dritte Segment ein Immunglobulin-Polypeptid umfasst. Alternativ umfasst das erste Segment ein Immunglobulin-Polypeptid-Fragment, das eine Signalsequenz enthält, und das zweite Segment umfasst das BAFF-R-Polypeptid-Fragment.
  • In weiteren Aspekten bietet die Erfindung ein im wesentlichen reines Binde-Agens, das spezifisch an das Polypeptid nach den oben genannten Ausführungsformen der Erfindung bindet.
  • Die vorliegende Erfindung ist auch auf Wirtszellen gerichtet, die mit einem einem rekombinanten Expressionsvektor, der eines der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle enthält, transformiert sind.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine BAFF-R-Nukleinsäure und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünner umfasst.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein in wesentlichen gereinigtes BAFF-R-Polypeptid, z.B. eines der von einer BAFF-R-Nukleinsäure kodierten Polypeptide.
  • Die Erfindung umfasst auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein BAFF-R-Polypeptid und einen einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünner umfasst.
  • In noch einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung einen Antikörper, der spezifisch an ein BAFF-R-Polypeptid bindet. Der Antikörper kann z.B. ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein. Die Erfindung umfasst auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen BAFF-R-Antikörper und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünner umfasst. Die vorliegende Erfindung ist auch auf isolierte Antikörper gerichtet, die an ein Epitop auf einem Polypeptid binden, das von einem der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle kodiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung ist weiterhin gerichtet auf Kits, die Antikörper, die an ein Polypeptid binden, das von einem der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle kodiert wird, und einen Negativkontroll-Antikörper umfassen.
  • Die Erfindung bietet weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eine BAFF-R-Polypeptids. Das Verfahren umfasst das Zurverfügungstellen einer Zelle, die eine BAFF-R-Nukleinsäure enthält, z.B. einen Vektor, der eine BAFF-R-Nukleinsäure umfasst, und das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die geeignet sind, das von der Nukleinsäure kodierte BAFF-R-Polypeptid zu exprimieren. Das exprimierte BAFF-R-Polypeptid wird dann aus der Zelle gewonnen. Vorzugsweise produziert die Zelle wenig oder kein endogenes BAFF-R-Polypeptid. Die Zelle kann z.B. eine prokaryotische oder eine eukaryotische Zelle sein.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Auslösen einer Immunantwort in einem Säugetier gegen ein von einem der oben offenbarten Nukleinsäuremoleküle kodiertes Polypeptid durch Verabreichen einer Menge an Polypeptid an das Säugetier, die ausreicht, die Immunantwort auszulösen.
  • Die vorliegende Erfindung ist auch auf Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung gerichtet, die an ein BAFF-R-Polypeptid bindet, durch Kontaktieren des BAFF-R-Polypeptids mit einer Verbindung und Bestimmen, ob die Verbindung an das BAFF-R-Polypeptid bindet.
  • Die vorliegende Erfindung ist auch auf Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung gerichtet, die an eine BAFF-R-Nukleinsäure bindet, durch Kontaktieren der BAFF-R-Nukleinsäure mit einer Verbindung und Bestimmen, ob die Verbindung an die Nukleinsäure bindet.
  • Die Erfindung bietet ferner Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Aktivität eines BAFF-R-Polypeptids moduliert, durch Kontaktieren des BAFF-R-Polypeptids mit einer Verbindung und Bestimmen, ob BAFF-R-Polypeptid-Aktivität moduliert wird.
  • Die vorliegende Anmeldung ist auch auf Verbindungen gerichtet, die die BAFF-R-Polypeptid-Aktivität modulieren, identifiziert durch Kontaktieren des BAFF-R-Polypeptids mit der Verbindung und Bestimmen, ob die Verbindung die BAFF-R-Polypeptid-Aktivität moduliert, an das BAFF-R-Polypeptid bindet, oder an ein ein BAFF-R-Polypeptid kodierendes Nukleinsäuremolekül bindet.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Diagnose eines B-Zell-vermittelten Zustandes, z.B. einer autoimmunen Störung oder von Krebs, in einem Subjekt beschrieben. Das Verfahren umfasst das Zurverfügungstellen einer Proteinprobe aus dem Subjekt und das Messen der Menge an BAFF-R-Polypeptid in der Subjektprobe. Die Menge an BAFF-R in der Subjektprobe wird dann mit der Menge an BAFF-R-Polypeptid in einer Kontroll-Proteinprobe verglichen. Eine Veränderung in der Menge an BAFF-R-Polypeptid in der Subjektproteinprobe relativ zu der Menge an BAFF-R-Polypeptid in der Kontrollproteinprobe deutet daraufhin, dass das Subjekt in einem B-Zell-vermittelten Zustand ist. Eine Kontrollprobe wird vorzugsweise einem vergleichbaren Individuum entnommen, d.h. einem Individuum ähnlichen Alters, Geschlechts oder anderer allgemeiner Vorbedingung, das jedoch vermutlich nicht in einem B-Zell- vermittelten Zustand ist. Alternativ kann die Kontrollprobe dem Subjekt zu einer Zeit entnommen werden, zu der das Subjekt vermutlich nicht die Störung besitzt. In einigen Ausführungsformen wird das BAFF-R-Polypeptid mit Hilfe eines BAFF-R-Antikörpers detektiert.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Diagnose eines B-Zell-vermittelten Zustandes, z.B. einer autoimmunen Störung, in einem Subjekt beschrieben. Das Verfahren umfasst das Zurverfügungstellen einer Nukleinsäureprobe, z.B. RNA oder DNA oder beider, aus dem Subjekt und das Messen der Menge an BAFF-R-Nukleinsäure in der Nukleinsäureprobe des Subjekts. Die Menge an BAFF-R-Nukleinsäureprobe in der Subjektnukleinsäure wird dann mit der Menge an BAFF-R-Nukleinsäure in einer Kontrollprobe verglichen. Eine Veränderung in der Menge an BAFF-R-Nukleinsäure in der Probe relativ zu der Menge an BAFF-R in der Kontrollprobe deutet daraufhin, dass das Subjekt in einem Autoimmunzustand ist.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Diagnose eines tumorigenen oder Autoimmunzustandes in einem Subjekt beschrieben. Das Verfahren umfasst das Zurverfügungstellen einer Nukleinsäureprobe des Subjektes und das Identifizieren mindestens eines Teiles der Nukleinsäuresequenz einer BAFF-R-Nukleinsäure in der Nukleinsäureprobe des Subjektes. Die BAFF-R-Nukleotidsequenz der Subjektprobe wird dann mit der BAFF-R-Nukleotidsequenz einer Kontrollprobe verglichen. Eine Veränderung in der BAFF-R-Nukleotidsequenz in der Probe relativ zu der BAFF-R-Nukleotidsequenz in jener Kontrollprobe deutet daraufhin, dass das Subjekt in einem solchen Zustand ist.
  • In noch einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung die Verwendung einer BAFF-R-Nukleinsäure, eines BAFF-R-Polypeptids oder eines anti-BAFF-R-Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments/Reagenz' zur Behandlung, Vorbeugung, Verzögerung oder Diagnose eines B-Zell-vermittelten Zustandes.
  • Die Zustände, die mit Hilfe der BAFF-R-Nukleinsäuremoleküle, -Polypeptide oder -Antikörper diagnostiziert, behandelt oder verzögert werden, können ein Krebs oder eine immunregulatorische Störung sein. Krankheiten umfassen jene, die ihrem Wesen nach autoimmun sind, wie systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, Mysthenia gravis, autoimmune hämolytische Anämie, idiopathische thrombozytopenische Purpurs, Antiphospholipid-Syndrom, Chagas-Krankheit, Basedowsche Krankheit, Wegener- Granulomatose, Polyarteriitis nodosa oder schnellfortschreitende Glomerulonephritis. Das therapeutische Agens findet auch Anwendung in Plasmazellstörungen wie multiplem Myelom, Waldenström-Makroglobulinämie, Schwerkettenkrankheit, primärer oder immunozytenassoziierter Amyloidose oder Monoklonaler Gammopathie unklarer Signifikanz (MGUS). Onkologie-Targets umfassen B-Zell-Karzinome, Leukämien und Lymphome.
  • Zusammensetzungen und Behandlungsverfahren mit Hilfe der Nukleinsäuren, Polypeptide und Antikörper nach der vorliegenden Erfindung können bei jeglichem Zustand, der mit unerwünschter Zellproliferation assoziiert ist, Anwendung finden. Insbesondere kann vorliegende Erfindung verwendet werden, um Tumorzellen zu behandeln, die BAFF und/oder BAFF-R exprimieren.
  • Zusammensetzungen, die beschrieben werden und BAFF-R-Agonisten (wie Antikörper, die an BAFF-R binden und BAFF vorgaukeln) umfassen, können auch verwendet werden, um Immundefizienzen zu behandeln, die z.B. durch niedrige Mengen an B-Zellen charakterisiert sind. Solche Störungen können z.B. durch Strahlung und/oder Chemotherapie verursacht werden.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erniedrigung der Aggregation eines rekombinant exprimierten Proteins zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst den Vergleich von Homologen eines Proteins oder Fusionsproteins davon zur Bestimmung konservierter Domänen und nicht-identischer Aminosäuren innerhalb konservierter Regionen. Im allgemeinen ist mindestens eine nicht-polare Aminosäure gegen eine ungeladene Aminosäure oder ein Prolin, Alanin oder Serin ausgetauscht.
  • Wenn nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin benutzt werden, dieselbe Bedeutung, wie sie allgemein von Fachleuten auf dem Gebiet dieser Erfindung verstanden werden. Obwohl Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu jenen sind, die hierin beschrieben werden, bei der Ausführung oder Prüfung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind geeignete Verfahren und Materialien unten beschrieben.
  • Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch folgende detaillierte Beschreibung und die Ansprüche deutlich.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A zeigt die DNA-Sequenz der BJAB-cDNA (SEQ ID NO:1), in pJST576 kloniert.
  • 1B zeigt die gesamte DNA-Sequenz der cDNA des IMAGE-Klons 2000271 (EST AI 250289 ) (SEQ ID NO:2).
  • 2A zeigt die Nukleotidsequenz von JST576 mit einem entfernten Intron, wie vom GENESCAN-Programm vorhergesagt (SEQ ID NO:3).
  • 2B zeigt ein 1%-Agarose-Gel von PCR-Produkten, die für BAFF-R mit Hilfe Erststrang-cDNA, die aus BJAB- oder IM-9-RNA oder auf JST576-cDNA erzeugt wurde, erhalten wurden. Spur 1. Lambda-DNA-HindIII-Verdau. Spur 2. BJAB-Oligo-dT-geprimete BAF-225/BAF-191. Spur 3. BJAB-Oligo-dT-geprimete BAF-226/BAF-191. Spur 4. BJAB-zufallsgeprimete BAF-225/BAF-191. Spur 5. BJAB-zufallsgeprimete BAF-226/BAF-191. Spur 6. IM-9-Oligo-dT-geprimete BAF-225/BAF-191. Spur 7. IM-9-Oligo-dT-geprimte BAF-226/BAF-191. Spur 8. IM-9-zufallsgeprimete BAF-225/BAF-191. Spur 9. IM-9-zufallsgeprimete BAF-226/BAF-191. Spur 10. JST576-cDNA BAF-225/BAF-191. Spur 11. JST576-cDNA BAF-226/BAF-191. Spur 12. Kein Template BAF-225/BAF-191. Spur 13. Kein Template BAF-226/BAF-191.
  • 2C zeigt die reife JST576 (BAFF-R-)Sequenz (SEQ ID NO:4) (auch GenBank-Zugriffsnummer AF 373846 ), bestimmt durch Sequenzieren von Bulk-PCR-Produkt, das das vorhergesagte Intron der BJAB-Erststrang-cDNA flankiert.
  • 2D zeigt die Aminosäuresequenz von BAFF-R (JST576) (SEQ ID NO:5). Der fettgedruckte A (Ala)-Rest zeigt die Sequenz, die sich aus der Verwendung der alternativen Spleiß-Akzeptor-Stelle ergibt. Die vorhergesagte Transmembrandomäne ist in einem Kasten und das vermutliche Stop-Transfer-Signal ist unterstrichen.
  • 3 zeigt die gespleißte Version von JST576 (SEQ ID NO:6), die die 5'-UTR-Sequenz enthält, die durch RT-PCR aus humaner Milz-Erststrang-cDNA erhalten wird, und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:7). Diese Sequenz enthält ein stromaufwärts gelegenes Stopcodon im Leserahmen mit dem ATG.
  • 4A zeigt die Sequenz der murinen BAFF-R-cDNA (SEQ ID NO:8) (auch GenBank-Zugriffsnummer AF 373847 ).
  • 4B zeigt die Aminosäuresequenz des murinen BAFF-R (SEQ ID NO:9). Die Cys-Reste sind fett und unterstrichen, und die vorhergesagte Transmembranregion in einem Kasten.
  • 4C zeigt die Homologie zwischen der humanen (SEQ ID NO:10) und murinen (SEQ ID NO:9) BAFF-R-Proteinsequenz.
  • 5 zeigt die Bindung von humanem BAFF an JST576-transfizierte Zellen. 293EBNA-Zellen wurden mit pJST576 oder CA336 (huTACI) und einem GFP-Reporter-Konstrukt kotransfiziert. Die Zellen wurden auf BAFF-Bindung mit 1 μg/ml biotinyliertem myc-huBAFF, gefolgt von SAV-PE, untersucht.
  • 6 zeigt die Bindung von humanem und murinem BAFF an JST576-transfizierte Zellen. 293EBNA-Zellen wurden mit pJST576 und einem GFP-Reporter-Konstrukt kotransfiziert. Die Zellen wurden 24 Stunden später auf BAFF-Bindung mit 5 μg/ml flag-huBAFF oder flag-muBAFF, gefolgt von anti-flag monoklonalem Antikörper M2 und Esel-anti-Maus-PE, untersucht.
  • 7 zeigt, dass APRIL nicht an JST576-transfizierte Zellen bindet. 293EPBA-Zellen wurden mit pJST576 oder CA336 (huTACI) und einem GFP-Reporter-Konstrukt kotransfiziert. Die Zellen wurden auf APRIL-Bindung mit 1 μg/ml myc-muAPRIL, gefolgt von anti-muAPRIL-Ratten-IgG2b, biotinyliertem anti-Ratten-FcG2b und SAV-PE, untersucht.
  • 8 zeigt, dass BAFF ein Protein aus JST576-transfizierten Zellen fällt. 293EBNA-Zellen wurden mit entweder BAFF-R (pJST576), nur Vektor (CH269) oder huTACI (CA336) transfiziert und mit 35S-Cystein und -Methionin gepulst. Extrakte wurden mit flag-huBAFF immunpräzipitiert und auf ein reduzierendes SDS-PAGE-Gel aufgetragen. Molekulargewichts-Marker sind links angezeigt.
  • 9 zeigt die Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO:11) und deren abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:12) eines Gens, das ein humanes BAFF-R-Fc kodiert: Nukleinsäurereste 1-63 kodieren die murine IgG-kappa-Signalsequenz; Nukleinsäurereste 64-66 wurden verwendet, um eine Restriktionsenzym-Schnittstelle einzuführen, Nukleinsäurereste 67-276 kodieren einen Teil der extrazellulären Domäne von BAFF-R, Nukleinsäurereste 277-279 wurden verwendet, um eine Restriktionsenzym-Schnittstelle einzuführen, und Nukleinsäurereste 280-960 kodieren die Fc-Region von humanem IgG1.
  • 10 zeigt die Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse mit Hilfe des EcoNI-Fragments von JST56 als Sonde. Alle Expositionen waren für 4 Tage. 10A: Clontech „human Immune II blot"; 10B: Clontech „human 12 lane multi-tissue blot"; 10A: Clontech „human multi-tissue II blot".
  • 11 zeigt das Ergebnis der Northern-Blot-Analyse von 20 μg Gesamt-RNA, die aus verschiedenen Zelllinien isoliert wurde. Der Blot wurde 4 Tage einer Sonde aus dem EcoNI-Restriktionsfragment von JST576 exponiert. Die Fähigkeit der Zelllinien, BAFF zu binden, wie durch FACS-Analyse bestimmt, ist unter der Spur angegeben.
  • 12 zeigt die Ergebnisse von Immunpräzipitationsergebnissen mit Hilfe BAFF-R:Fc. Humanes BAFF wird mit BAFF-R:Fc oder BCMA:Fc immunpräzipitiert, aber nicht Fn14-Fc. Kontroll-BAFF-Protein ist in Spur 1 gezeigt.
  • 13 zeigt, dass humanes BAFF-R:Fc die Bindung von humanem BAFF an BJAB-Zellen blockiert. Die Ergebnisse der FACS-Analyse sind in 13A gezeigt. Kurve E stellt die Bindung biotinylierten BAFFs an BJAB-Zellen in Abwesenheit von BAFF-R:Fc dar. Kurven B-D stellen die Fähigkeit von BAFF dar, an BJAB-Zellen in Gegenwart von 5 μg/ml, 1 μg/ml bzw. 0.2 μg/ml zu binden. Kurve A ist die Nur-zweiter-Schritt-Kurve. 13B zeigt die Fähigkeit verschiedener Konzentrationen von BAFF-R:Fc (Quadrate), verglichen mit TACI:Fc (Dreiecke) oder einem nichtspezifischen Fusionsprotein, LT_R:fc (Kreise), die Bindung von BAFF an die rezeptorexprimierenden BJAB-Zellen zu blockieren.
  • 14 zeigt die Fähigkeit von BAFF-R:Fc, die BAFF-induzierte Kostimulation von Milz-B-Zellen zu blockieren. Ein Diagramm des [3H]-Thymidin-Einbaus (cpm) gegen steigende Mengen hBAFF (ng/ml) ist gezeigt.
  • 15 zeigt, dass BAFF-R:Fc-Behandlung zu einem Verlust an peripheren B-Zellen in normalen Mäusen führt.
  • 16 zeigt, dass die Behandlung von Mäusen mit humanem oder murinem BAFF-R:Fc die Anzahl der Milz-B220+-B-Zellen vermindert.
  • 17 zeigt, dass die Verbreichung von BAFF-R:Fc an Mäuse den prozentsatz an Lymphknoten-B220+-B-Zellen vermindert.
  • 18 zeigt, dass die Verabreichung von BAFF-R:Fc an Mäuse die B220+-B-Zellen des peripheren Bluts vermindert.
  • 19A zeigt FACS-Daten von Überständen vierer Klone, die Antikörper herstellen, die BAFF-R binden. Auch gezeigt ist ein Kontrollüberstand, der keine Antikörper enthält, die BAFF-R binden.
  • 19B zeigt ein Histogramm, das zwei Klone zeigt, die die BAFF-Bindung an BAFF-R blockieren. (a) zwigt die Kein-BAFF-Kontrolle; (b) zeigt die Blockierfähigkeit des Antikörpers aus Klon 2; (c) zeigt die Blockierfähigkeit des Antikörpers aus Klon 9; und (d) zeigt die Kurve eines Kontrollantikörpers, der BAFF-R nicht bindet.
  • 20 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen der extrazellulären Domänen von humanen BAFF-R:Fc (hBAFF-R) und murinen BAFF-R:Fc (mBAFF-R) und den Prozentsatz der Aggregation, die bei der Expression der Fc-Fusionsproteine, die die angegebenen Sequenzen enthalten, beobachtet wird. Numerierte JST-Klone stellen die Aminosäuresequenzen dar, die Mutationen (unterstrichen gezeigt) in den Elternsequenzen zeigen, und die resultierende Aggregation von exprimiertem Protein. Gezeigt sind die partiellen Sequenzen für humanen (Aminosäuren 2-71 von SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:13) und murinen (Aminosäuren 2-66 von SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:14) BAFF-R; und die entsprechenden Teile für die folgenden Klone: JST659 (SEQ ID NO:15), JST660 (SEQ ID NO:16), JST661 (SEQ ID NO:17), JST662 (SEQ ID NO:18), JST663 (SEQ ID NO:19), JST673 (SEQ ID NO:20), JST674 (SEQ ID NO:21), JST675 (SEQ ID NO:22), JST672 (SEQ ID NO:23), JST676 (SEQ ID NO:24), JST671 (SEQ ID NO:25), JST677 (SEQ ID NO:26), JST678 (SEQ ID NO:27), JST 664 (SEQ ID NO:28), JST668 (SEQ ID NO:29), JST665 (SEQ ID NO:30), JST666 (SEQ ID NO:31) und JST667 (SEQ ID NO:32).
  • 21 zeigt einen Autoradiograph von Proteinen, die mit Hilfe Lysaten immunpräzipitiert wurden, die aus BAFF-R-i.c.d. (intrazelluläre Domäne von BAFF-R)-transfizierten (Spur 1), oder kontrollvektortransfizierten Zellen (Spur 2) erzeugt wurden. Ungefähr 6 × 106 293E-Zellen wurden mit einem BAFF-R-i.c.d.-kodierenden Konstrukt oder einem Scheinplasmid transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit 35S 24 Stunden metabolisch markiert, mit Lysepuffer lysiert, voraufgearbeitet und mit einem anti-myc-mAk, 9E10, immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden durch 10-20% SDS-PAGE under reduzierenden Bedingungen aufgetrennt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Referenzarbeiten, -Patente, -Patentanmeldungen und wissenschaftliche Literatur, einschließlich Zugriffsnummer auf GenBank-Datenbanksequenzen, auf die hierin Bezug genommen wird, bilden das Wissen der Fachleute und sind hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einbezogen, im selben Ausmaß, als wenn jedes einzelne speziell und individuell durch Bezugnahme einbezogen wäre. Jeder Konflikt zwischen einer hierin genannten Referenz und den speziellen Lehren dieser Beschreibung soll zugunsten der letzteren aufgelöst werden. Desgleichen soll jeder Konflikt zwischen einer von Fachleuten verstandenen Definition eines Wortes oder einer Phrase und einer Definition eines Wortes oder einer Phrase, wie sie spezifisch in dieser Beschreibung gelehrt wird, zugunsten der letzteren aufgelöst werden.
  • Standard-Referenzwerke, die das allgemeine Prinzip der rekombinanten DNA-Technologie darstellen und dem Fachmann bekannt sind, umfassen: Ausubel et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York (1998); Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2D ED., Cold Spring Harbor Laborstory Press, Plainview, New York (1989); Kaufuran et al., Eds., HANDBOOK OF MOLECULAR AND CELLULAR METHODS IN BIOLOGY AND MEDICINE, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press, Oxford (1991).
  • Vorliegende Erfindung offenbart BAFF-R Nukleinsäuren, isolierte Nukleinsäuren, die BAFF-R-Polypeptide oder einen Teil davon kodieren, BAFF-R-Polypeptide, Vektoren, die diese Nukleinsäuren enthalten, Wirtszellen, die mit den BAFF-R-Nukleinsäuren transformiert sind, anti-BAFF-R-Antikörper und pharmazeutische Zusammensetzungen. Ebenso offenbart sind Verfahren zur Herstellung von BAFF-R-Polypeptiden sowie Verfahren zum/r Screening, Diagnose und Behandlung von Zuständen mit Hilfe dieser Verbindungen, und Verfahren zum Screening von Verbindungen, die die BAFF-R-Polypeptid-Aktivität modulieren.
  • Die BAFF-R-Nukleinsäuren und Polypeptide sowie BAFF-R-Antikörper, sowie hierin diskutierte pharmazeutische Zusammensetzungen eignen sich unter anderem für die Behandlung von Krebs und/oder immunregulatorischen Zuständen. Diese Störungen umfassen z.B. B-Zell-vermittelte Krankheiten, die nach ihrer Natur autoimmun sind, wie systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, Mysthenia gravis, autoimmune hämolytische Anämie, idiopathische thrombozytopenische Purpurs, Antiphospholipid-Syndrom, Chagas-Krankheit, Basedowsche Krankheit, Wegener-Granulomatose, Polyarteriitis nodosa oder schnellfortschreitende Glomerulonephritis. Das therapeutische Agens findet auch Anwendung in Plasmazellstörungen wie multiplem Myelom, Waldenström-Makroglobulinämie, Schwerkettenkrankheit, primärer oder immunozytensassoziierter Amyloidose oder Monoklonaler Gammopathie unklarer Signifikanz (MGUS). Onkologie-Targets umfassen B-Zell-Karzinome, Leukämien und Lymphome.
  • BAFF-R-Nukleinsäuren
  • Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf isolierte Nukleinsäuremoleküle, die BAFF-R-Proteine oder biologisch aktive Teile davon kodieren. Auch umfasst sind Nukleinsäurefragmente, die sich als Hybridisierungssonden zur Identifizierung von BAFF-R-kodierenden Nukleinsäuren eignen (z.B. BAFF-R-mRNA) und Fragmente zur Verwendung als Polymerasekettenreaktion (PCR)-Primer zur Amplifizierung oder Mutation von BAFF-R-Nukleinsäuremolekülen. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA), RNA-Molekülle (z.B. mRNA), mit Hilfe von Nukleotidanaloga erzeugte Analoga der DNA oder RNA, und Derivate, Fragmente oder Homologe davon umfassen. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber bevorzugt doppelsträngige DNA.
  • „Sonden" bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen variabler Länge, vorzugsweise zwischen mindestens etwa 10 Nukleotiden (nt) oder bis zu z.B. 6000 nt, je nach Verwendung. Sonden werden bei der Detektion von identischen, ähnlichen oder komplementären Nukleinsäuresequenzen verwendet. Sonden größerer Länge werde üblicherweise aus einer natürlichen oder rekombinanten Quelle erhalten, sind hochspezifisch und viel langsamer zu hybridisieren als Oligomere. Sonden können einzel- oder doppelsträngig sein und so gestaltet, dass sie in der PCR, membran-basierten Hybridisierungstechnologien oder ELISA-artigen Technologien Spezifität besitzen.
  • Ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist eines, das von anderen Nukleinsäuremolekülen, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäuren vorhanden sind, getrennt ist. Beispiele für isolierte Nukleinsäuremoleküle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf rekombinante in einem Vektor enthaltene DNA-Moleküle, in einer heterologen Wirtszelle gehaltene rekombinante DNA-Moleküle, teilweise oder im wesentlichen gereinigte Nukleinsäuremoleküle, und synthetische DNA- oder RNA-Moleküle. Vorzugsweise ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen, die in der Natur die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, von dem die Nukleinsäure stammt, flankieren (d.h., Sequenzen, die sich am 5'- oder 3'-Ende der Nukleinsäure befinden). Zum Beispiel kann in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte BAFF-R-Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 50 kb, 25 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb von Nukleotidsequenzen enthalten, die in der Natur die Nukleinsäure in der genomischen DNA der Zelle flankieren, von der die Nukleinsäure stammt. Überdies kann ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül (wie ein cDNA-Molekül) im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es mit rekombinanten Techniken hergestellt wird, oder von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird.
  • Ein Nukleinsäuremolekül nach der vorliegenden Erfindung, z.B. ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6), oder ein Komplement einer dieser Nukleotidsequenzen, kann mit Hilfe von Standardtechniken der Molekularbiologie und der hierin angebotenen Sequenzinformation isoliert werden. Mit Hilfe aller oder eines Teils der Nukleinsäuresequenzen nach 1A, B, 2A, C und 3 als Hybridisierungssonde können BAFF-R-Nukleinsäuresequenzen mit Hilfe von Standard-Hybridisierungs- und -klonierungstechniken isoliert werden (z.B. wie in Sambrook et al., Eds., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2ND ED., Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; und Ausubel, et al., Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993 beschrieben).
  • Eine Nukleinsäure nach der Erfindung kann mit Hilfe von cDNA, mRNA oder, alternativ, genomischer DNA als Template und geeigneten Oligonukleotid-Primern nach Standard-PCR-Amplifizierungs-Techniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Ferner können Oligonukleotide, die mit BAFF-R-Nukleotidsequenzen korrespondieren, mit Standard-Synthesetechniken hergestellt werden, z.B. mit Hilfe eines automatischen DNA-Synthesizers.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Oligonukleotid" auf eine Abfolge verbundener Nukleotidreste, und das Oligonukleotid besitzt eine ausreichende Zahl an Nukleotidbasen, um in einer PCR-Reaktion verwendet zu werden. Eine kurze Oligonukleotidsequenz kann auf einer genomischen oder cDNA-Sequenz basieren oder danach gestaltet sein, und wird verwendet, um eine identische, ähnliche oder komplementäre DNA oder RNA zu amplifizieren, oder deren Anwesenheit in einer bestimmten Zelle oder einem bestimmten Gewebe zu bestätigen oder aufzuzeigen. Oligonukleotide umfassen Teile einer Nukleinsäuresequenz, die wenigstens etwa 10 nt und bis zu 50 nt besitzt, vorzugsweise etwa 15 nt bis 30 nt. Sie können chemisch synthetisiert und als Sonden verwendet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül nach der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das ein Komplement der Nuklotidsequenz ist, die in 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) gezeigt ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül nach der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das ein Komplement der Nuklotidsequenz ist, die in 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) gezeigt ist, oder einen Teil dieser Nukleotidsequenz. Ein Nukleinsäuremolekül, das komplementär zu der Nukletidsequenz ist, die in 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) gezeigt ist, ist eines, das ausreichend komplementär zu der Nukleotidsequenz, die in 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) gezeigt ist, dass es Wasserstoffbrücken mit wenigen oder ohne Fehlpaarungen zu der Nukleotidsequenz, die in 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) gezeigt ist, bilden, und damit eine stabile Doppelhelix bilden kann.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „komplementär" auf Watson-Crick- oder Hoogsteen-Basenpaarung zwischen Nukleotideinheiten eines Nukleinsäuremoleküls, und der Begriff „Bindung" bedeutet die physikalische oder chemische Wechselwirkung zwischen zwei Polypeptiden oder Verbindungen oder assoziierten Polypeptiden oder Verbindungen oder Kombinationen davon. Bindung bedeutet ionische, nichtionische, Van-der-Waals-, hydrophobe Wechselwirkungen etc. Eine physische Wechselwirkung kann entweder direkt oder indirekt sein. Indirekte Wechselwirkungen können durch die oder aufgrund der Effekte eines anderen Polypeptids oder einer anderen Verbindung entstehen. Direkte Bindung bezieht sich auf Wechselwirkungen, die nicht durch den, oder aufgrund des Effekts eines anderen Polypeptids oder einer anderen Verbindung entstehen, sondern stattdessen ohne andere wesentliche chemische Intermediate.
  • Überdies kann das Nukleinsäuremolekül nach der Erfindung nur einen Teil der Nukleinsäuresequenz nach 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) umfassen, z.B. ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, das für einen biologisch aktiven Teil von BAFF-R kodiert. Hierin zur Verfügung gestellte Fragmente sind als Sequenzen von mindestens 6 (aufeinanderfolgenden) Nukleinsäuren oder mindestens 4 (aufeinanderfolgenden) Aminosäuren definiert, eine Länge, die ausreicht, um spezifische Hybridisierung im Falle von Nukleinsäuren bzw. spezifische Erkennung eines Epitops im Falle von Aminosäuren zu erlauben, und sind meistens etwas kürzer als eine Volllängen-Sequenz. Fragmente können von jedem kontinuierlichen Teil einer Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenz nach Wahl stammen. Derivate sind Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die aus nativen Verbindungen entweder direkt oder durch Modifikation oder partielle Substitution gebildet sind. Analoga sind Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die eine Struktur besitzen, die ähnlich, aber nicht identisch mit der nativen Verbindung ist, sondern sich davon im Hinblick auf gewisse Komponenten oder Seitenketten unterscheidet. Analoga können synthetisch oder anderen evolutionären Ursprungs sein und verglichen mit dem Wildtyp eine ähnliche oder gegensätzliche metabolische Aktivität haben.
  • Derivate und Analoga können die volle Länge oder eine andere als die volle Länge haben, wenn das Derivat oder Analogon eine modifizierte Nukleinsäure oder Aminosäure enthält, wie weiter unten beschrieben. Derivate oder Analoga der Nukleinsäuren oder Proteine nach der Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Moleküle, die Regionen umfassen, die im wesentlichen homolog zu den den Nukleinsäuren oder Proteinen nach der Erfindung sind, in verschiedenen Ausführungsformen zu mindestens 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98% oder sogar 99% Identität (mit einer bevorzugten Identität von 80-99%) mit einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz von identischer Länge, oder wenn mit einer alignten Sequenz verglichen, wobei das Alignment mit Hilfe eines dem Fachmann bekannten Computer-Homologieprogramms durchgeführt wurde, oder dessen kodierende Nukleinsäure unter stringenten, moderat stringenten oder wenig stringenten Bedingungen an das Komplement einer Sequenz hybridisieren kann, die die vorgenannten Proteine kodiert. Siehe z.B. Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons,
    New York, NY, 1993, und unten. Ein Beispiel für ein Programm ist das Gap-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI) mit den Standardeinstellungen, das den Algorithmus von Smith und Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489) benutzt, hierin durch Bezugnahme in vollem Umfang einbezogen.
  • Eine „homologe Nukleinsäuresequenz" oder „homologe Aminosäuresequenz" oder Variationen davon beziehen sich auf Sequenzen, die durch Homologie auf Nukleotidebene oder Aminosäureebene wie oben beschrieben charakterisiert sind. Homologe Nukleotidsequenzen kodieren für jene Sequenzen, die für Isoformen des BAFF-R-Polypeptids kodieren. Isoformen können in verschiedenen Geweben desselben Organismus als Ergebnis z.B. alternativen Spleißens von RNA exprimiert werden. Alternativ können Isoformen von verschiedenen Genen kodiert werden. In der vorliegenden Erfindung umfassen homologe Nukleotidsequenzen Nukleotidsequenzen, die für BAFF-R-Polypeptide aus anderen Spezies als Menschen kodieren, umfassend, aber nicht beschränkt auf Säugetiere, und können daher z.B. Maus, Ratte, Kaninchen, Hund, Katze, Kuh, Pferd und andere Organismen umfassen. Homologe Nukleotidsequenzen umfassen auch, sind aber nicht beschränkt auf natürlich vorkommende allelische Variationen und Mutationen der hierin beschriebenen Nukleotidsequenzen. Eine homologe Nukleotidsequenz umfasst jedoch nicht die Nukleotidsequenz, die humanes BAFF-R-Protein kodiert. Homologe Nukleinsäuresequenzen umfassen jene Nukleinsäuresequenzen, die für konservative Aminosäuresubstitutionen (siehe unten) in 2D (SEQ ID NO:5) sowie ein Polypeptid mit BAFF-R-Aktivität kodieren. Eine homologe Aminosäuresequenz kodiert nicht die Aminosäuresequenz eines menschlichem BAFF-R-Polypeptids.
  • Die Nukleotidsequenz, die nach der Klonierung des menschlichen BAFF-R-Gens bestimmt wurde, erlaubt die Herstellung von Sonden und Primern, die zur Verwendung bei der Identifizierung und/oder Klonierung von BAFF-R-Homologen in anderen Zelltypen, z.B. aus anderen Geweben, sowie BAFF-R-Homologen aus anderen Säugetieren entworfen wurden. Die Sonde bzw. der Primer umfasst typischerweise ein im wesentlichen gereinigtes Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst typischerweise eine Region einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an mindestens 12, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 oder 400 aufeinanderfolgende Nukleotide einer Sequenz des kodierenden Stranges nach 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) oder einer Nukleotidsequenz des nichtkodierendes Stranges nach 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6), oder einer natürlich vorkommenden Mutante nach 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6).
  • Sonden, die auf der humanen BAFF-R-Nukleotidsequenz basieren, können zur Detektion von Transkripten oder genomischen Sequenzen verwendet werden, die für dasselbe oder homologe Proteine kodieren. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst die Sonde ferner eine daran angebrachte Markiergruppe, z.B. kann die Markiergruppe ein Radioisotop, eine fluoreszente Verbindung, ein Enzym, oder ein Enzym-Kofaktor sein. Solche Sonden können als Teil eines diagnostischen Testkits zur Identifizierung von Zellen oder Gewebe, die ein BAFF-R-Protein falsch exprimieren, verwendet werden, z.B. durch Messung des Niveaus BAFF-R-kodierender Nukleinsäure in einer Probe von Zellen aus einem Subjekt, z.B. Detektieren von BAFF-R-mRNA-Niveaus oder Bestimmen, ob ein genomisches BAFF-R-Gen mutiert oder deletiert wurde.
  • „Ein Polypeptid mit einem biologisch aktiven Teil von BAFF-R" bezieht sich auf Polypeptide, die eine ähnliche, aber nicht notwendigerweise identische Aktivität wie eine Polypeptid nach der vorliegenden Erfindung aufweisen, umfassend natürliche Formen, wie in einem bestimmten biologischen Assay gemessen, mit oder ohne Dosisabhängigkeit. Ein Nukleinsäurefragment, das für einen „biologisch aktiven Teil von BAFF-R" kodiert, kann durch Isolieren eines Teils von 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6), der für ein Polypeptid kodiert, das eine BAFF-R-biologische Aktivität hat (biologische Aktivitäten der BAFF-R-Proteine sind weiter unten beschrieben), Exprimieren des kodierten Teils des BAFF-R-Proteins (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Bestimmen der Aktivität des kodierten Teils von BAFF-R hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein Nukleinsäurefragment, das für einen biologisch aktiven Teil von BAFF-R kodiert, optional eine BAFF-Bindedomäne umfassen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Nukleinsäurefragment, das für einen biologisch aktiven Teil von BAFF-R kodiert, eine oder mehrere Regionen.
  • BAFF-R-Varianten
  • Die Erfindung umfasst ferner Nukleinsäuremoleküle, die sich von den Nukleinsäuresequenzen, die in 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) gezeigt sind, wegen der Degenerierung des genetischen Codes unterscheiden. Diese Nukleinsäuren kodieren somit für dasselbe BAFF-R-Protein wie das, das durch die Nukleotidsequenz nach 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) kodiert wird. In einer weiteren Ausführungsform hat ein isoliertes Nukleinsäuremolekül nach der Erfindung eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz wie in 2D (SEQ ID NO:5) gezeigt kodiert.
  • Zusätzlich zu der humanen BAFF-R-Nukleotidsequenz wie in 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) gezeigt, wird von den Fachleuten anerkannt werden, dass DNA-Sequenz-Polymorphismen, die zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen von BAFF-R führen, in einer Population (z.B. der menschlichen Population) existieren können. Solch genetischer Polymorphismus im BAFF-R-Gen kann unter Individuen in einer Population aufgrund natürlicher allelischer Variation existieren. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Gen" und „rekombinantes Gen" auf Nukleinsäuremoleküle, die einen offenen Leserahmen umfassen, der für ein BAFF-R-Protein kodiert, vorzugsweise ein Säuger-BAFF-R-Protein. Solch natürliche allelische Variationen können typischerweise zu einer 1-5%igen Varianz in der Nukleotisequenz des BAFF-R-Gens führen. Absolut alle solchen Nukleotidvariationen und die daraus resultierenden Aminosäurepolymorphismen in BAFF-R, die das Resultat natürlicher allelischer Variation sind und nicht die funktionelle Aktivität von BAFF-R verändern, sollen zum Umfang dieser Erfindung gehören.
  • Überdies sollen Nukleinsäuremoleküle, die für BAFF-R-Moleküle aus anderen Spezies kodieren und daher eine Nukleotidsequenz besitzen, die von den humanen Sequenzen nach 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) abweicht, zum Umfang dieser Erfindung gehören. Nukleinsäuremoleküle, die natürlichen allelischen Varianten und Homologen der BAFF-R-cDNAs nach der Erfindung entsprechen, können basierend auf ihrer Homologie zu den hierin offenbarten menschlichen BAFF-R-Nukleinsäuren mit Hilfe der humanen cDNAs oder eines Teils davon als Hybridisierungssonde nach Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. Zum Beispiel kann eine lösliche humane BAFF-R-cDNA basierend auf ihrer Homologie zu menschlichem membrangebundenem BAFF-R isoliert werden. Desgleichen kann eine membrangebundene humane BAFF-R-cDNA basierend auf ihrer Homologie zu löslichem humanem BAFF-R isoliert werden.
  • Entsprechend ist in einer weiteren Ausführungsform ein isoliertes Nukleinsäuremolekül nach der Erfindung mindestens 6 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an das Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz nach 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) umfasst. In einer weiteren Ausführungsform ist die Nukleinsäure mindestens 10, 25, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotide lang. In einer weiteren Ausführungsform hybridisiert ein isoliertes Nukleinsäuremolekül nach der Erfindung an die kodierende Region. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Bedingungen für Hybridisierung und Waschen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60% homolog zueinander sind, typischerweise aneinander hybridisiert bleiben.
  • Homologe (d.h. Nukleinsäuren, die für BAFF-R-Proteine kodieren, die von anderen Spezies als Mensch stammen) oder andere verwandte Sequenzen (z.B. Paraloge) können durch Niedrig-, Moderat- oder Hochstringenz-Hybridisierung mit der ganzen oder einem Teil der jeweiligen menschlichen Sequenz als Sonde mit Hilfe von Verfahren für Nukleinsäurehybridisierung und -klonierung, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich die Wendung „stringente Hybridisierungsbedingungen" auf Bedingungen, unter denen eine Sonde, ein Primer oder Oligonukleotide an ihre Zielsequenz hybridisieren, aber nicht an andere Sequenzen. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und unter verschiedenen Umständen verschieden. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen als kürzere Sequenzen. Im allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C niedriger als der Wärmeschmelzpunkt (Tm) für die jeweilige Sequenz bei einer/m definierten Innenstärke und pH sind. Der Tm ist die Temperatur (unter definierter/m Innenstärke, pH and Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der Sonden, die komplementär zu der Zielsequenz sind, im Gleichgewicht an die Zielsequenz hybridisieren. Da die Zielsequenzen im allgemeinen im Überschuß vorliegen, sind im Gleichgewicht bei Tm 50% der Sonden besetzt. Typischerweise sind stringente Bedingungen jene, bei denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,0 M Natriumionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionen (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 und die Temperatur mindestens etwa 30°C für kurze Sonden, Primer oder Oligonukleotide (z.B. 10 nt bis 50 nt) und mindestens etwa 60°C für längere Sonden, Primer oder Oligonukleotide beträgt. Stringente Bedingungen können auch durch die Zugabe von destabilisierenden Stoffen wie Formamid erreicht werden.
  • Stringente Bedingungen sind den Fachleuten bekannt und können in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 nachgelesen werden. Vorzugsweise sind die Bedingungen so, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% homolog zueinander sind, typischerweise aneinander hybridisiert bleiben. Ein nicht beschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in einem Hochsalzpuffer, umfassend 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA und 500 mg/ml denaturierte Lachsssperma-DNA bei 65°C. Dieser Hybridisierung folgt eine oder mehrere Waschungen in 0,2X SSC, 0,01% BSA bei 50°C. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül nach der Erfindung, das unter stringenten Bedingungen an die Sequenz nach SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 bindet, entspricht einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hierin verwendet, bezieht sich „natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül auf ein RNA- oder DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz besitzt, die in der Natur vorkommt (z.B. ein natürliches Protein kodiert).
  • In einer zweiten Ausführungsform wird eine Nukleinsäuresequenz zur Verfügung gestellt, die unter Bedingungen moderater Stringenz an das Nukleinsäuremolekül umfassend die Nukleotidsequenz nach 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) oder Fragmente, Analoga oder Derivate davon hybridisierbar ist. Ein nicht beschränkendes Beispiel für Hybridisierungsbedingungen moderater Stringenz ist Hybridisierung in 6X SSC, 5X Denhardts Lösung, 0,5% SDS und 100 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 55°C, gefolgt von einer oder mehreren Waschungen in 1X SSC, 0,1% SDS bei 37°C. Weitere Bedingungen moderater Stringenz, die verwendet werden können, sind im Fach wohlbekannt. Siehe z.B. Ausubel et al., Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1993; und Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY, 1990.
  • In einer dritten Ausführungsform wird eine Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, die unter Bedingungen niedriger Stringenz an das Nukleinsäuremolekül umfassend die Nukleotidsequenz nach 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) oder Fragmente, Analoga oder Derivate davon hybridisierbar ist. Ein nicht beschränkendes Beispiel für Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz ist Hybridisierung in 35% Formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, 10% (w/v) Dextransulfat bei 40°C, gefolgt von einer oder mehreren Waschungen in 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,1% SDS bei 50°C. Weitere Bedingungen niedriger Stringenz, die verwendet werden können, sind im Fach wohlbekannt (wie z.B. für Kreuzhybridisierungen zwischen Spezies verwendet). Siehe z.B. Ausubel et al., Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1993; und Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY, 1990; Shilo and Weinberg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792.
  • Konservative Mutationen
  • Zusätzlich zu natürlich vorkommenden allelischen Varianten der BAFF-R-Sequenz, die in der Population vorkommen können, wird der Fachmann weiterhin anerkennen, dass durch Mutation Änderungen in die Nukleotidsequenz nach 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) eingeführt werden können, was zu Änderungen in der Aminosäuresequenz des kodierten BAFF-R-Proteins führt, ohne die Funktionalität des BAFF-R-Proteins zu verändern. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen bei „nicht-essentiellen" Aminosäureresten (ihren, in den Sequenzen nach 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) bewirkt werden. Eine „nicht-essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der in der Wildtyp-Sequenz geändert werden kann, ohne die biologische Aktivität zu ändern, während eine „essentieller" Aminosäurerest für die biologische Aktivität erforderlich ist. Zum Beispiel sind Aminosäurereste, die unter den BAFF-R-Proteinen nach der vorliegenden Erfindung konserviert sind, nach der Vorhersage der Veränderung besonders unzugänglich.
  • Des weiteren sind Aminosäurereste, die unter den Familienmitgliedern der BAFF-R-Proteine nach der vorliegenden Erfindung konserviert sind, nach der Vorhersage der Veränderung ebenfalls besonders unzugänglich. Zum Beispiel können BAFF-R-Proteine nach der vorliegenden Erfindung mindestens eine Domäne enthalten, die eine typischerweise konservierte Region in TNF-Familienmitgliedern ist. Somit sind diese konservierten Domänen der Mutation wahrscheinlich nicht zugänglich. Andere Aminosäurereste jedoch (z.B. die, die unter den Mitgliedern der BAFF-R-Proteine nicht konserviert oder nur schwach konserviert sind) können für die Aktivität nicht essentiell sein, und sind daher wahrscheinlich der Veränderung zugänglich.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Nukleinsäuremoleküle, die BAFF-R-Proteine kodieren, die Änderungen in Aminosäureresten enthalten, die für die Aktivität nicht essentiell sind. Solche BAFF-R-Proteine unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von 2D (SEQ ID NO:5), behalten jedoch ihre biologische Aktivität. In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 45% homolog zu einer Aminosäuresequenz nach 2D (SEQ ID NO:5) ist. Vorzugsweise ist das von dem Nukleinsäuremolekül kodierte Protein mindestens etwa 60% homolog zu 2D (SEQ ID NO:5), mehr vorzugsweise mindestens etwa 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, und am meisten vorzugsweise mindestens 99% homolog zu 2D (SEQ ID NO:5).
  • Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein BAFF-R-Protein kodiert, das homolog zu dem Protein nach 2D ist, kann durch Einführen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in die Nukleotidsequenz nach 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und
  • 3 (SEQ ID NO:6), so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden.
  • Mutationen können in 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) z.B. durch Standardtechniken wie ortsspezifische Mutagenese und PCR-Mutagenese. Vorzugsweise erfolgen konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren (nach der Vorhersage) nicht-essentiellen Aminosäurerest(en). Eine „konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, bei der der Aminoäsurerest durch einen Aminosäurerest ersetzt wird, der eine ähnliche Seitenkette besitzt. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten wurden im Fachgebiet definiert. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nichtpolare Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigte Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatische Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Daher wird ein nach der Vorhersage nichtessentieller Aminosäurerest in BAFF-R durch einen anderen Aminosäurerest aus derselben Seitenkettenfamilie ersetzt. Alternativ können in einer weiteren Ausführungsform Mutationen zufällig entlang der ganzen oder eines Teils der BAFF-R kodierenden Sequenz, wie durch Sättigungs-Mutagenese, eingeführt werden, und die entstehenden Mutanten können auf BAFF-R-biologische Aktivität untersucht werden, um Mutanten zu identifizieren, die Aktivität behalten. Nach einer Mutagenese einer der 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und
    3 (SEQ ID NO:6) kann das kodierte Protein durch irgendeine im Fach bekannte rekombinante Technologie exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann bestimmt werden.
  • In einer Ausführungsform kann ein mutiertes BAFF-R-Protein auf (1) die Fähigkeit, Protein:Protein-Wechselwirkungen mit anderen BAFF-R-Proteinen, anderen Zelloberflächenproteinen oder biologisch aktiven Teilen davon einzugehen, (2) Komplexbildung zwischen einem mutierten BAFF-R-Protein und einem BAFF-R-Liganden; (3) die Fähigkeit eines mutierten BAFF-R-Proteins, ein intrazelluläres Zielprotein oder einen biologisch aktiven Teil davon zu binden (z.B. Avidin-Proteine); (4) die Fähigkeit BAFF zu binden; oder (5) die Fähigkeit, einen BAFF-R-Antikörper spezifisch zu binden untersucht werden.
  • Die Erfindung bietet spezifische Mutanten, die für ein BAFF-R:Fc-Polypeptid kodieren, das so gestaltet ist, dass es die Aggregation von exprimiertem Protein vermindert, während die BAFF-Bindeaktivität erhalten wird. Solche Mutanten umfassen z.B. Klone, die für die Aminosäuresequenzen von JST661 (SEQ ID NO:17), JST662 (SEQ ID NO:18), JST663 (SEQ ID NO:19), JST673 (SEQ ID NO:20), JST674 (SEQ ID NO:21), JST675 (SEQ ID NO:22), JST672 (SEQ ID NO:23), JST676 (SEQ ID NO:24), JST671 (SEQ ID NO:25), JST677 (SEQ ID NO:26) und JST678 (SEQ ID NO:27) kodieren. Weitere Ausführungsformen umfassen Mutanten, die für ein BAFF-R- oder BAFF-R-Fc-Polypeptid kodieren, das ähnliche Aggregationscharakteristika wie natives menschliches BAFF-R oder BAFF-R:Fc-Polypeptid hat, aber auch BAFF bindet, umfassend z.B. Sequenzen, die die Aminsoäuresequenzen von JST659 (SEQ ID NO:15), JST660 (SEQ ID NO:16), JST664 (SEQ ID NO:28), JST668 (SEQ ID NO:29), JST665 (SEQ ID NO:30), JST666 (SEQ ID NO:31) und
    JST667 (SEQ ID NO:32) umfassen. Weitere Ausführungsformen umfassen Mutanten, die für ein BAFF-R- oder BAFF-R:Fc-Polypeptid kodieren, wobei zwischen humanem und murinem BAFF-R konservierte Aminosäuren gegen andere konservierte Aminosäuren ausgetauscht sind und wobei die Bindeaktivität des BAFF-R- oder BAFF-R:Fc-Polypeptids zu BAFF erhalten bleibt. In weiteren Ausführungsformen kodieren die Mutanten für ein BAFF-R- oder BAFF-R:Fc-Polypeptid, das Aminosäuren besitzt, die nicht zwischen humanem und murinem BAFF-R konserviert sind, die gegen andere Aminosäuren ausgetauscht wurden. Vorzugsweise wird mindestens eine nichtpolare Aminosäure gegen einen Prolinrest oder eine ungeladene polare Aminosäure ausgetauscht.
  • Antisense
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf isolierte Antisense-Nukleinsäuremoleküle, die an das Nukleinsäuremolekül umfassend die Nukleotidsequenz nach 2A, C, 3 oder Fragment, Analoga oder Derivate davon hybridisiert werden können oder dazu komplementär sind. Eine „Antisense"-Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer „sense"-Nukleinsäure ist, die für ein Protein kodiert, z.B. komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu eine mRNA-Sequenz. In speziellen Aspekten werden Antisense-Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung gestellt, die eine Sequenz umfassen, die komplementär zu mindestens etwa 10, 25, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotiden oder einem gesamten BAFF-R kodierenden Strang ist oder nur zu einem Teil davon. Nukleinsäuremoleküle, die für Fragmente, Homologe, Derivate und Analoga eines BAFF-R-Proteins nach 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4), 3 (SEQ ID NO:6), oder Antisense-Nukleinsäuren, die komplementär zu einer BAFF-R-Nukleinsäuresequenz nach 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4), 3 (SEQ ID NO:6) sind, werden zusätzlich zur Verfügung gestellt.
  • In einer Ausführungsform ist ein Antisense-Nukleinsäuremolekül der Gegenstrang zu einer „kodierenden Region" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, die für BAFF-R kodiert. Der Begriff „kodierende Region" bezieht sich auf die Region der Nukleotidsequenz, die Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden (z.B. entspricht die proteinkodierende Region von humanem BAFF-R den Nukleotiden 13 bis 568 von 2A (SEQ ID NO:3) oder Nukleotiden 13 bis 565 von 2C (SEQ ID NO:4) oder Nukleotiden 298 bis 849 von 3 (SEQ ID NO:6)). In einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül der Gegenstrang zu einer „nichtkodierenden Region" des kodierenden Stranges einer BAFF-R-kodierenden Nukleotidsequenz. Der Begriff „nichtkodierende Region" bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren und nicht in Aminosäuren translatiert werden (d.h. auch als 5'- und 3'-nichttranslatierte Regionen bezeichnet).
  • Anhand der hierin offenbarten Sequenzen der kodierenden Stränge, die BAFF-R kodieren, können Antisense-Nukleinsäuren nach der Erfindung nach den Regeln der Watson und Crick- oder Hoogsteen-Basenpaarung entworfen werden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zu der gesamten kodierenden Region der BAFF-R-mRNA komplementär sein, ist aber mehr bevorzugterweise ein Oligonukleotid, das der Gegenstrang zu nur einem Teil der kodierenden oder nichtkodierenden Region der BAFF-R-mRNA ist. Zum Beispiel kann das Antisense-Oligonukleotid komplementär zu der die Translationsstartstelle der BAFF-R-mRNA umgebenden Region sein. Ein Antisense-Oligonukleotid kann zum Beispiel etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Eine Antisense-Nukleinsäure nach der Erfindung kann mit Hilfe chemischer Synthese- oder enzymatischer Ligationsreaktionen unter Vernwendung im Fach bekannter Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäure (z.B. ein Antisense-Oligonukleotid) mit Hilfe von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder verschiedenartig modifizierten Nukleotiden chemisch synthetisiert werden, die so gestaltet sind, dass die biologische Stabilität der Moleküle gesteigert wird oder die physische Stabilität der Doppelhelix zwischen der Antisense- und der Sense-Nukleinsäure erhöht wird; z.B. können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden.
  • Beispiele für modifizierte Nukleotide, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, umfassen: 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Joduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Alternativ kann die Antisense-Nukleinsäure mit Hilfe eines Expressionsvektors, in den eine Nukleinsäure in Antisense-Orientierung subkloniert wurde, biologisch hergestellt werden (d.h. RNA, die von der inserierten Nukleinsäure abgelesen wird, wird eine Antisense-Orientierung zu einer interessierenden Zielnukleinsäure haben; in folgendem Unterkapitel näher beschrieben).
  • Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle nach der Erfindung werden typischerweise an ein Subjekt verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA, die ein BAFF-R-Protein kodieren, hybridisieren oder daran binden, um damit die Expression des Proteins zu inhibieren, z.B. durch Inhibierung der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch konventionelle Nukleotid-Komplementarität zur Bildung einer stabilen Doppelhelix geschehen, oder, z.B. im Falle eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, das an DNA-Doppelhelices bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Ein Beispiel einer Verabreichungsroute für Antisense-Nukleinsäuremoleküle nach der Erfindung umfasst die direkte Injektion an einer Gewebestelle. Alternativ können Antisense-Nukleinsäuremoleküle so modifiziert werden, dass sie auf spezielle Zellen abzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Zum Beispiel können für systemische Verabreichung Antisense-Moleküle so modifiziert werden, dass sie spezifisch an auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimierte Rezeptoren oder Antigene binden, z.B. durch Anheftung der Antisense-Nukleinsäuremoleküle an Peptide oder Antikörper, die an Zelloberflächen-Rezeptoren oder -Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle können auch mit Hilfe der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen geschickt werden. Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen an Antisense-Molekülen zu erreichen, sind Vektorkonstrukte bevorzugt, in denen das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter die Kontrolle eines starken pol-II- oder pol-III-Promotors gestellt ist.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremoleküle nach der Erfindung ein a-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein a-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, worin, im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander laufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15:6625-6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-O-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15:6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog umfassen (Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215:327-330).
  • Ribozyme und PNA-Teile
  • In einer weiteren Ausführungsform ist eine Antisense-Nukleinsäure nach der Erfindung ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure wie mRNA spalten können, zu der sie eine komplementäre Region haben. Daher können Ribozyme (z.B. Hammerhead-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) verwendet werden, um BAFF-R-mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, um damit die Translation von BAFF-R-mRNA zu inhibieren. Ein Ribozym, das Spezifität für eine BAFF-R kodierende Nukleinsäure besitzt, kann basierend auf der Nukleotidsequenz einer hierin offenbarten BAFF-R-DNA entworfen werden (d.h. SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6). Zum Beispiel kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS-RNA konstruiert werden, in dem die Nukleotidsequenz des aktiven Zentrums komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer BAFF-R kodierenden mRNA gespalten werden soll. Siehe z.B. Cech et al. U.S. Pat. Nr. 4,987,071 ; und Cech et al. U.S. Pat. Nr. 5,116,742 . Alternativ kann BAFF-R-mRNA verwendet werden, um eine katalytische RNA mit spezifischer Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen. Siehe z.B. Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418.
  • Alternativ kann die BAFF-R-Genexpression durch Abzielen auf Nukleotidsequenzen, die komplementär zu der regulatorischen Region des BAFF-R sind (z.B. der/die BAFF-R-Promotor und/oder -Enhancer), um tripelhelikale Strukturen zu bilden, die die Transkription des BAFF-R-Gens in Zielzellen verhindern, inhibiert werden. Siehe im allgemeinen Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36; und Maher (1992) Bioassays 14:807-15.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die Nukleinsäuren von BAFF-R am Basen- oder Zuckerbestandteil oder am Phosphatrückgrat modifiziert werden, um z.B. die Stabilität, Hybridisierung oder Löslichkeit des Moleküls zu verbessern. Zum Beispiel kann das Desoxyribosephosphatrückgrat der Nukleinsäuren modifiziert werden, um Peptidnukleinsäuren zu erzeugen (siehe Hyrup et al. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23). Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Peptidnukleinsäuren" oder „PNAs" auf Nukleinsäuremimetika, z.B. DNA-Mimetika, in denen das Desoxyribosephosphat-Rückgrat durch ein Pseudopeptid-Rückgrat ersetzt ist und nur die vier natürlichen Nukleobasen erhalten sind. Das neutrale Rückgrat von PNAs erlaubt, wie gezeigt wurde, spezifische Hybridisierung an DNA oder RNA unter Bedingungen niedriger Innenstärke. Die Synthese von PNA-Oligomeren kann mit Standard-Festphasen-Peptidsyntheseprotokollen wie in Hyrup et al. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675 ausgeführt werden.
  • PNAs von BAFF-R können in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel können PNAs als Antisense- oder Antigen-Agentien zur sequenzspezifischen Modulation der Genexpression durch z.B. das Induzieren der Transkription oder Translationsarrest oder Inhibition der Replikation verwendet werden. PNAs von BAFF-R können auch z.B. bei der Analyse von Einzelbasenpaar-Mutationen in einem Gen durch z.B. PNA-spezifisches PCR-Clamping; als künstliche Restriktionsenzyme, wenn in Kombination mit anderen Enzymen verwendet, z.B. S1-Nukleasen (Hyrup B. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23); oder als Sonden oder Primer für DNA-Sequenz und Hybridisierung (Hyrup et al. (1996), Bioorg Med. Chem. 4:5-23; Perry-O'Keefe (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675) verwendet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform können PNAs von BAFF-R, z.B. um ihre Stabilität oder zelluläre Aufnahme zu verbessern, durch Anheften lipophiler oder anderer Hilfsgruppen an PNA, durch die Bildung von PNA-DNA-Chimären, oder durch die Verwendung von Liposomen oder anderen im Fach bekannten Verabreichungstechniken modifiziert werden. Zum Beispiel können PNA-DNA-Chimären von BAFF-R erzeugt werden, die die vorteilhaften Eigenschaften von PNA und DNA kombinieren. Solche Chimären erlauben DNA-Erkennungsenzymen, z.B. RNAse H und DNA-Polymerasen, mit dem DNA-Teil zu interagieren, während der PNA-Teil eine hohe Bindeaffinität und -spezifität bietet. PNA-DNA-Chimären können mit Hilfe von Linker geeigneter Längen, ausgewählt nach Basenstapelung, Anzahl der Bindungen zwischen den Nukleobasen und Orientierung, verbunden werden (Hyrup (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23). Die Synthese von PNA-DNA-Chimären kann wie in Hyrup (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23 und Finn et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24:3357-63 beschrieben durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Kette mit Hilfe von Standard-Phosphoramidit-Kuppelungschemie auf einem festen Träger synthetisiert werden, und modifizierte Nukleosidanaloga, z.B. 5*-(4-Methoxytrityl)amino-5'-deoxy-thymidin-phosphoramidit, können zwischen der PNA und dem 5'-Ende der DNA verwendet werden (Mag et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:5973-88). PNA-Monomere werden dann schrittweise gekuppelt, um ein chimäres Molekül mit einem 5'-PNA-Segment und einem 3'-DNA-Segment herzustellen (Finn et al. (1996) a.a.O.). Alternativ können chimäre Moleküle mit einem 5'-DNA-Segment und einem 3'-PNA-Segment synthetisiert werden. Siehe Petersen et al. (1975) Bioorg. Med. Chem. Lett. 5:1119-11124.
  • In weiteren Ausführungsformen kann das Oligonukleotid weitere angehängte Gruppen wie Peptide umfassen (z.B. zur Zielsteuerung von Wirtszellrezeptoren in vivo) oder Stoffe, die den Transport durch die Zellmembran (siehe z.B. Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT-Publikationsnr. WO 88/09810 ) oder die Blut-Hirn-Schranke (siehe z.B. PCT-Publikationsnr. WO 89/10134 ) erleichtern. Ferner können Oligonukleotide mit durch Hybridisierung getriggerten Spaltungsstoffen (siehe z.B. Krol et al., (1988) BioTechniques 6:958-976) oder interkalierenden Stoffen (siehe z.B. Zon, (1988) Pharm. Res. 5:539-549) modifiziert werden. Zu diesem Zwecke kann das Oligonukleotid an ein anderes Molekül konjugiert werden, z.B. ein Peptid, ein durch Hybridisierung ausgelöstes Quervernetzungsmittel, einen Transportstoff, ein durch Hybridierung getriggertes Spaltungsmittel usw.
  • BAFF-R-Polypeptide
  • Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf isolierte BAFF-R-Proteine und biologisch aktive Teile davon, oder Derivate, Fragmente, Analoga oder Homologe davon. Auch zur Verfügung gestellt werden Polypeptidfragmente, die sich zur Verwendung als Immunogene zur Erzeugung von anti-BAFF-R-Antikörpern eignen. In einer Ausführungsform können native BAFF-R-Proteine aus Zellen oder Gewebequelle durch ein geeignetes Reinigungsschema mit Hilfe von Standard-Proteinreinigungsverfahren isoliert werden. in einer weiteren Ausführungsform werden BAFF-R-Proteine durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Alternativ zu rekombinanter Expression kann ein BAFF-R-Protein oder -Polypeptid mit Hilfe von Standard-Peptidsynthesetechniken chemisch synthetisiert werden.
  • Ein „isoliertes" oder „gereinigtes" Protein oder ein biologisch aktiver Teil davon ist im wesentlichen frei von zellulärem Material oder anderen kontaminierenden Proteinen aus der Zelle oder Gewebequelle, aus der das BAFF-R-Protein stammt, oder im wesentlich frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Die Wendung „im wesentlichen frei von zellulärem Material" umfasst Präparationen von BAFF-R-Protein, in denen das Protein von zellulären Komponenten der Zellen, aus denen es isoliert oder in denen es rekombinant hergestellt wurde. In einer Ausführungsform umfasst die Wendung „im wesentlichen frei von zellulärem Material" Präparationen von BAFF-R-Protein, die weniger als etwa 30% (nach Trockengewicht) von Nicht-BAFF-R-Protein (hierin auch als „kontaminierendes Protein" bezeichnet) besitzt, mehr vorzugsweise weniger als etwa 20% von Nicht-BAFF-R-Protein, noch mehr vorzugsweise weniger als etwa 10% von Nicht-BAFF-R-Protein, und am meisten vorzugsweise weniger als etwa 5% von Nicht-BAFF-R-Protein. Wenn das BAFF-R-Protein oder der biologisch aktive Teil davon rekombinant hergestellt wird, ist es auch vorzugsweise im wesentlichen frei von Kulturmedium, d.h. das Kulturmedium umfasst weniger als etwa 20%, mehr vorzugsweise weniger als etwa 10%, und am meisten vorzugsweise weniger als etwa 5% des Volumens der Proteinpräparation.
  • Die Wendung „im wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" umfasst Präparationen von BAFF-R-Protein, worin das Protein von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, die an der Synthese des Proteins mitwirken, getrennt ist. In einer Ausführungsform umfasst die Ausdrucksweise „im wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" Präparationen von BAFF-R-Protein, die weniger als etwa 30% (nach Trockengewicht) an chemischen Vorläufern oder nicht-BAFF-R-Chemikalien besitzt, mehr vorzugsweise weniger als etwa 20% an chemischen Vorläufern oder nicht-BAFF-R-Chemikalien, noch mehr vorzugsweise weniger als etwa 10% an chemischen Vorläufern oder nicht-BAFF-R-Chemikalien, und am meisten vorzugsweise weniger als etwa 5% an chemischen Vorläufern oder nicht-BAFF-R-Chemikalien.
  • Biologisch aktive Teile eines BAFF-R-Proteins umfassen Peptide, die Aminosäuresequenzen umfassen, die ausreichend homolog zu der Aminosäuresequenz des BAFF-R-Proteins oder davon abgeleitet sind, z.B. die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:5 gezeigt ist, die weniger Aminosäuren umfassen als die Volllängen-BAFF-R-Proteine, und mindestens eine Aktivität eines BAFF-R-Proteins entfalten. Typischerweise umfassen biologisch aktive Teile eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität des BAFF-R-Proteins. Ein biologisch aktiver Teil eines BAFF-R-Proteins kann ein Polypeptid sein, das z.B. 10, 25, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang ist.
  • Ein biologisch aktiver Teil eines BAFF-R-Proteins nach der vorliegenden Erfindung kann mindestens eine der oben identifizierten Domänen enthalten, die unter BAFF-R-Proteinen konserviert sind. Ein alternativer biologisch aktiver Teil eines BAFF-R-Proteins kann mindestens zwei der oben identifizierten Domänen enthalten. Ein weiterer biologisch aktiver Teil eines BAFF-R-Proteins kann mindestens drei der oben identifizierten Domänen enthalten. Noch ein weiterer biologisch aktiver Teil eines BAFF-R-Proteins nach der vorliegenden Erfindung kann mindestens vier der oben identifizierten Domänen enthalten.
  • Überdies können weitere biologisch aktive Teile, in denen andere Regionen des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt und auf eine oder mehrere funktionelle Aktivitäten eines nativen BAFF-R-Proteins untersucht werden.
  • In einer Ausführungsform hat das BAFF-R-Protein eine Aminosäuresequenz wie in 2D (SEQ ID NO:5) gezeigt. In weiteren Ausführungsformen ist das BAFF-R-Protein im wesentlichen homolog zu 2D (SEQ ID NO:5) und behält die funktionelle Aktivität des Proteins nach 2D (SEQ ID NO:5), unterscheidet sich aber in der Aminosäuresequenz aufgrund natürlicher allelischer Variation oder Mutagenese, wie im Detail unten beschrieben. Entsprechend ist in einer weiteren Ausführungsform das BAFF-R-Protein ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 45% homolog zu der Aminosäuresequenz von 2D (SEQ ID NO:5) ist und die funktionelle Aktivität der BAFF-R-Proteins nach 2D (SEQ ID NO:5) behält.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Erfindung spezifische Mutanten von BAFF-R:Fc-Polypeptiden, die so gestaltet sind, dass sie die Aggregation von exprimiertem Protein vermindern, während die BAFF-Bindeaktivität erhalten bleibt. Solche Mutanten umfassen z.B. Klone, die die Aminosäuresequenzen von JST661 (SEQ ID NO:17), JST662 (SEQ ID NO:18), JST663 (SEQ ID NO:19), JST673 (SEQ ID NO:20),
    JST674 (SEQ ID NO:21), JST675 (SEQ ID NO:22), JST672 (SEQ ID NO:23), JST676 (SEQ ID NO:24), JST671 (SEQ ID NO:25), JST677 (SEQ ID NO:26) und JST678 (SEQ ID NO:27) kodieren. Weitere Ausführungsformen umfassen Mutanten, die ein BAFF-R- oder BAFF-R:Fc-Polypeptid kodieren, das ähnliche Aggregationscharakteristika wie natives humanes BAFF-R- oder BAFF-R:Fc-Polypeptid hat, aber auch BAFF bindet, umfassend z.B. Sequenzen, die die Aminsoäuresequenzen von JST659 (SEQ ID NO:15), JST660 (SEQ ID NO:16), JST664 (SEQ ID NO:28), JST668 (SEQ ID NO:29), JST665 (SEQ ID NO:30), JST666 (SEQ ID NO:31) und
    JST667 (SEQ ID NO:32) umfassen. Weitere Ausführungsformen umfassen Mutanten, die für ein BAFF-R- oder BAFF-R:Fc-Polypeptid kodieren, worin zwischen humanem und murinem BAFF-R konservierte Aminosäuren gegen andere konservierte Aminosäuren ausgetauscht sind und wobei die Bindeaktivität des BAFF-R- oder BAFF-R-Fc:Polypeptids zu BAFF erhalten bleibt. In weiteren Ausführungsformen kodieren die Mutanten für ein BAFF-R- oder BAFF-R:Fc-Polypeptid, das Aminosäuren besitzt, die nicht zwischen humanem und murinem BAFF-R konserviert sind, die gegen andere Aminosäuren ausgetauscht wurden. Vorzugsweise werden nichtpolare Aminosäuren zu Prolin oder einer ungeladenen polaren Aminosäure mutiert.
  • Bestimmung der Homologie zwischen zwei oder mehr Sequenzen
  • Um den Prozentsatz der Homologie zwischen zwei Aminosäure- oder zwei Nukleotidsequenzen zu bestimmen, wird ein Alignment dieser Sequenzen für optimale Vergleichszwecke erstellt (z.B. können Leerstellen in die Sequenz einer ersten Aminosäure- oder Nukleotidsequenz für ein optimales Alignment mit einer zweiten Aminosäure- oder Nuklerinsäuresequenz eingeführt werden). Danach werden die Aminosäurereste bzw. Nukleotide an entsprechenden Aminosäure- oder Nukleotid-Positionen verglichen. Wenn eine Position der ersten Sequenz von demselben Aminosäurerest bzw. demselben Nukleotid besetzt ist wie die entsprechende Position in der zweiten Sequenz, dann werden die Moleküle an dieser Position als homolog erachtet (d.h. Aminosäure- bzw. Nukleinsäure"homologie" ist, wie hierin verwendet, äquivalent zu Aminosäure- bzw. Nukleinsäureidentität).
  • Die Homologie von Nukleinsäuresequenzen kann als Grad der Identität zwischen zwei Sequenzen bestimmt werden. Die Homologie kann unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Computerprogrammen bestimmt werden, wie der GAP Software, die im GCG-Programmpaket angeboten wird (siehe Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453). Unter Verwendung der GCG-GAP-Software mit folgenden Einstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen: „GAP creation penalty" von 5.0 und „GAP extension penalty" von 0.3, weist die kodierende Region der obengenannten analogen Nukleinsäuresequenzen einen Grad der Identität von bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% mit dem CDS (kodierenden) Teil der DNA-Sequenz auf, die in 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4), 3 (SEQ ID NO:6) gezeigt ist.
  • Der Begriff „Sequenzidentität" bezieht sich auf den Grad, in welchem zwei Polynukleotid- bzw. Polypeptidsequenzen in der jeweiligen zu vergleichenden Region auf Rest-für-Rest-Basis identisch sind. Der Begriff „Prozentsatz der Sequenzidentität" wird durch den Vergleich von zwei Sequenzen mit optimalem Alignment in dieser Vergleichsregion berechnet, wobei die Anzahl von Positionen, an welchen die gleiche Nukleinsäurebase (z.B. A, T, C, G, U oder I im Fall von Nukleinsäuren) in beiden Sequenzen vorkommt, bestimmt wird, was die Anzahl von übereinstimmenden Positionen ergibt, die Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtanzahl der Positionen in der Vergleichsregion (d.h. der Fenstergröße) geteilt wird, und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, was den Prozentsatz der Sequenzidentität ergibt. Der Begriff „wesentliche Identität", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Charakteristikum einer Polynukleotidsequenz, wobei das Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die eine Sequenzidentität von mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85% Identität, und oft 90 bis 95% Sequenzidentität, üblicherweise mindestens 99% Sequenzidentität, verglichen mit einer Vergleichssequenz in der zu vergleichenden Region, besitzt.
  • Chimären und Fusionsproteine
  • Die Erfindung bietet auch BAFF-R-chimäre bzw. Fusionsproteine. BAFF-R-"Chimärproteine" bzw. „Fusionsproteine", wie hierin verwendet, umfassen ein BAFF-R-Polypeptid, das operativ mit einem nicht-BAFF-R-Polypeptid verbunden ist. „BAFF-R-Polypeptid" bedeutet ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die der des BAFF-R entspricht, während ein „Nicht-BAFF-R-Peptid" ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bedeutet, die einem Protein entspricht, das im wesentlichen nicht homolog zum BAFF-R-Protein ist, d.h. ein Protein, das sich vom BAFF-R-Protein unterscheidet und das von demselben oder von einem anderen Organismus abgeleitet ist. Innerhalb des BAFF-R-Fusionsproteins kann das BAFF-R-Polypeptid dem gesamten BAFF-R-Protein oder einem Teil davon entsprechen. In einer Ausführungsform umfasst ein BAFF-R-Fusionsprotein mindestens einen biologisch aktiven Teil eines BAFF-R-Proteins. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein BAFF-R-Fusionsprotein mindestens zwei biologisch aktive Teile eines BAFF-R-Proteins. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst ein BAFF-R-Fusionsprotein mindestens drei biologisch aktive Teile eines BAFF-R-Proteins. Der Begriff „operativ verbunden" soll in Bezug auf das Fusionsprotein darauf hinweisen, dass das BAFF-R-Polypeptid und das Nicht-BAFF-R-Polypeptid miteinander inframe fusioniert sind. Das Nicht-BAFF-R-Polypeptid kann mit dem N-Terminus oder C-Terminus des BAFF-R-Polypeptids fusioniert sein. Das Nicht-BAFF-R-Polypeptid kann z.B. das Fc-Fragment eines Antikörpers sein. Dieses kann entweder mit dem N-Terminus oder mit dem C-Terminus des BAFF-R-Polypeptids operativ verbunden sein. Fusionsproteine mit einem Fc-Target wurden in Lo et al. (1998) Protein Engineering 11:495-500, und U.S.-Patentschriften 5,541,087 und 5,726,044 beschrieben, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin einbezogen ist.
  • Zum Beispiel umfasst in einer Ausführungsform ein BAFF-R-Fusionsprotein eine BAFF-R-Domäne, die operativ mit der extrazellulären Domäne eines zweiten Proteins verbunden ist. Solche Fusionsproteine können weiter in „Screening-Assays" für die Verbindungen, die BAFF-R-Aktivität modulieren (solche Assays sind detailliert unten beschrieben), verwendet werden.
  • In noch einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein GST-BAFF-R-Fusionsprotein, in welchem die BAFF-R-Sequenzen mit dem C-Terminus der GST (d.h. Glutathion-S-Transferase)-Sequenzen fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinantem BAFF-R erleichtern.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein BAFF-R-Protein, das eine heterologe Signalsequenz am N-Terminus hat. Zum Beispiel muss, weil BAFF-R keine eigene Signalsequenz enthält, eine heterologe Signalsequenz am 5'-Ende der BAFF-R kodierenden Sequenz fusioniert werden, damit eine effiziente Sekretion des BAFF-R-Fusionsproteins erreicht wird. Expression und/oder Sekretion von BAFF-R kann durch die Verwendung verschiedener heterologer Signalsequenzen erhöht werden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein BAFF-R-Immunglobulin-Fusionsprotein, in welchem die BAFF-R-Sequenzen, die eine oder mehrere Domänen umfassen, mit Sequenzen fusioniert sind, die von einem Mitglied der Proteinfamilie der Immunglobuline stammen. Das erfindungsgemäße BAFF-R-Immunglobulin-Fusionsprotein kann in pharmazeutische Zusammensetzungen inkorporiert und Subjekten verabreicht werden, um eine Interaktion zwischen einem BAFF-R-Ligand und einem BAFF-R-Protein auf der Zelloberfläche zu inhibieren und auf diese Weise BAFF-R-vermittelte Signaltransduktion in vivo zu unterbinden. Die BAFF-R-Immunglobulin-Fusionsproteine können verwendet werden, um die Bioverfügbarkeit eines zugehörigen BAFF-R-Liganden zu beeinflussen. Inhibierung der Interaktion zwischen BAFF-R-Ligand und BAFF-R könnte therapeutisch nützlich sein, sowohl für die Behandlung von Proliferations- und Differenzierungserkrankungen als auch für die Modulation (z.B. Förderung oder Inhibierung) des Überlebens der Zellen. Außerdem können die erfindungsgemäßen BAFF-R-Immunglobulin-Fusionsproteine als Immunogene zur Herstellung von Anti-BAFF-R-Antikörpern in einem Subjekt, um BAFF-R-Liganden aufzureinigen und in Screening-Assays verwendet werden, um Moleküle zu identifizieren, die die Interaktion von BAFF-R mit einem BAFF-R-Ligand inhibieren.
  • Ein erfindungsgemäßes BAFF-R-Chimären- oder -Fusionsprotein kann mit Hilfe von üblichen rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden. Beispielsweise werden DNA-Fragmente, die für verschiedene Proteinsequenzen kodieren, mit Hilfe konventioneller Techniken, wie z.B. unter Anwendung von blunt- und stagger-Enden für Ligation, Verdau mit Restriktionsenzymen zur Bereitstellung von geeigneten Enden, Auffüllen von kohäsiven Enden, soweit erforderlich, Behandlung mit alkaliner Phosphatase, um das unerwünschte Zusammenfügen zu vermeiden und enzymatischer Ligation miteinander im Leserahmen ligiert. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen mit Hilfe konventioneller Techniken einschließlich automatisierten DNA-Synthesizern synthetisiert werden. Alternativ kann PCR-Amplifizierung von Genfragmenten mit Hilfe von Verankerungsprimern durchgeführt werden, die zu komplementären Überhängen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten führen, die anschließend annealt und reamplifiziert werden können, um eine chimäre Gensequenz herzustellen (siehe z.B. Ausubel et al. Eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Außerdem sind viele Expressionsvektoren kommerziell erhältlich, die bereits ein Fusionsteil (z.B. ein GST-Polypeptid) kodieren. Eine BAFF-R-kodierende Nukleinsäure kann in einen solchen Expressionsvektor in der Weise kloniert werden, dass der Fusionsteil im Leserahmen mit dem BAFF-R-Protein verbunden ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die BAFF-R Fusion von der Nukleinsäure- (SEQ ID NO:11) und Aminosäure (SEQ ID NO:12)-Sequenz gemäß 9 zur Verfügung gestellt.
  • BAFF-R-Agonisten und Antagonisten
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Varianten der BAFF-R-Proteine, die entweder als BAFF-R-Agonisten (Mimetika) oder als BAFF-R-Antagonisten funktionieren. Varianten des BAFF-R-Proteins können durch Mutagenese, z.B. diskrete Punktmutation oder Trunkation des BAFF-R-Proteins, hergestellt werden. Ein Agonist des BAFF-R-Proteins kann im wesentlichen dieselben oder einen Teil der biologischen Aktivitäten eines natürlich vorkommenden Form des BAFF-R-Proteins beibehalten. Ein Antagonist des BAFF-R-Proteins kann eine oder mehrere Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des BAFF-R-Proteins inhibieren, z.B. durch kompetitive Bindung an ein vor- oder nachgeordnetes Mitglied einer zellulären Signalkaskade, die ein BAFF-R-Protein umfasst. Auf diese Weise können spezifische biologische Effekte durch die Behandlung mit einer Variante mit limitierter Funktion ausgelöst werden. In einer Ausführungsform hat die Behandlung eines Subjekts mit einer Variante, die einen Teil der biologischen Aktivitäten einer natürlich vorkommenden Form des Proteins hat, im Vergleich zur Behandlung mit der natürlich vorkommenden Form der BAFF-R-Proteine weniger Nebenwirkungen in einem Subjekt.
  • Varianten des BAFF-R-Proteins, die entweder als BAFF-R-Agonisten (Mimetika) oder als BAFF-R-Antagonisten funktionieren, können durch Screening kombinatorischer Mutantenbibliotheken, z.B. Trunkationsmutanten, des BAFF-R-Proteins auf ihre agonistische bzw. antagonistische Aktivität identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine vielfältige Bibliothek von BAFF-R-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf der Nukleinsäureebene erzeugt und durch eine vielfältige Genbibliothek kodiert. Eine vielililtige Bibliothek von BAFF-R-Varianten kann durch z.B. enzymatische Ligation einer Mischung von synthetischen Oligonukleotiden in die Gensequenzen auf eine Weise, dass ein degenerierter Satz potentieller BAFF-R-Sequenzen als individuelle Polypeptide exprimiert werden kann, oder alternativ als ein Satz größerer Fusionsproteine (z.B. für Phage-Display), der einen Satz von BAFF-R-Sequenzen enthält, hergestellt werden. Es gibt eine Anzahl von Verfahren, welche zur Herstellung von Bibliotheken potentieller BAFF-R-Varianten aus degenerierten Oligonukleotidsequenzen benutzt werden können. Chemische Synthese degenerierter Gensequenzen kann in einem automatischen DNA-Synthesizer durchgeführt werden und das synthetische Gen dann in einen entsprechenden Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Satzes von Genen ermöglicht die Bereitstellung aller Sequenzen, die den erwünschten Satz von potentiellen BAFF-R-Sequenzen kodieren, in einer Mischung. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind fachbekannt (siehe z.B. Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1977) Science 198:1056-1063; Ike et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11:477-488).
  • Polypeptid-Bibliotheken
  • Außerdem können Bibliotheken von Fragmenten der BAFF-R-Protein kodierenden Sequenzen verwendet werden, um eine vielfältige Population von BAFF-R-Fragmenten für Screening und anschließende Selektion von BAFF-R-Proteinvarianten zu erzeugen. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek kodierender Sequenzfragmente durch Behandlung doppelsträngiger PCR-Fragmente einer BAFF-R-kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen hergestellt werden, unter denen nur ca. einmal pro Molekül ein Bruch vorkommt, Denaturierung der Doppelstrang-DNA, Renaturierung der DNA, um eine doppelsträngige DNA zu bilden, die Sense/Antisense-Paare verschiedener Spaltprodukte beinhalten kann, Entfernen einsträngiger Überhänge von wiederhergestellten Duplexen durch die Behandlung mit S1 Nuklease und Ligieren der resultierenden Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor. Mit Hilfe dieses Verfahrens kann eine Expressionsbibliothek hergeleitet werden, die N-terminale und innere Fragmente des BAFF-R-Proteins unterschiedlicher Größe kodiert.
  • Mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten aus kombinatorischen Bibliotheken, die durch Punktmutationen oder Trunkationen hergestellt sind, und zum Screening von cDNA-Bibliotheken auf Genprodukte mit ausgewählten Eigenschaften sind fachbekannt. Solche Techniken können zum schnellen Screening von Genbibliotheken, die durch die kombinatorische Mutagenese von BAFF-R-Proteinen hergestellt wurden, adaptiert werden. Die am meisten verwendeten Techniken, die für eine Hochdurchsatzanalyse geeignet sind, zum Screening großer Genbibliotheken beinhalten typischerweise das Klonieren der Genbibliothek in replizierbare Expressionsvektoren, Transformation entsprechender Zellen mit der resultierenden Vektorenbibliothek und Expression der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter welchen die Detektion einer erwünschten Aktivität die Isolation des Vektors erleichtert, der das Gen kodiert, dessen Produkt detektiert war. Rekursive Gesamtmutagenese (REM), eine neue Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann in Kombination mit Screening-Assays zur Identifizierung von BAFF-R-Varianten verwendet werden (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6:327-331).
  • Anti-BAFF-R Antikörper
  • Ein isoliertes BAFF-R-Protein oder ein Teil oder Fragment davon können als ein Immunogen zum Herstellen von Antikörpern, die BAFF-R binden, unter Anwendung von Standardtechniken zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Das Volllängen-BAFF-R-Protein kann verwendet werden, oder alternativ stellt die Erfindung antigene Peptidfragmente von BAFF-R zur Verwendung als Immunogene bereit. Das antigene BAFF-R-Peptid umfasst mindestens 8 Aminosäurereste der Aminosäuresequenz, die in 2D (SEQ ID NO:5) gezeigt ist und umfasst ein Epitop von BAFF-R, so dass ein gegen das Peptid erzeugter Antikörper einen spezifischen Immunkomplex mit BAFF-R bildet. Vorzugsweise umfasst das antigene Peptid mindestens 10 Aminosäurereste, mehr vorzugsweise mindestens 15 Aminosäurereste, noch mehr vorzugsweise mindestens 20 Aminosäurereste; und am meisten bevorzugt sind mindestens 30 Aminosäurereste. Bevorzugte Epitope, die vom antigenen Peptid umfasst sind, sind Regionen von BAFF-R, die auf der Oberfläche des Proteins lokalisiert sind, z.B. hydrophile Regionen.
  • Wie hierin offenbart, können die BAFF-R-Proteinsequenz nach 2D (SEQ ID NO:5) oder ihre Derivate, Fragmente, Analoga oder Homologe als Immunogene für die Erzeugung von Antikörpern, die immunspezifisch diese Proteinkomponenten binden, verwendet werden. Der Begriff „Antikörper", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile der Immunglobulinmoleküle, d.h. Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle beinhalten, die spezifisch ein Antigen bindet (damit immunreagiert), wie BAFF-R. Solche Antikörper umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, polyklonale, monoklonale, chimäre, einzelkettige, Fab- und F(ab')2-Fragmente und eine Fab-Expressionsbibliothek. In einer besonderen Ausführungsform sind Antikörper gegen humane BAFF-R-Proteine offenbart. Verschiedene fachbekannte Verfahren können für die Herstellung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen eine BAFF-R-Proteinsequenz nach 2D (SEQ ID NO:5) oder ihre Derivate, Fragmente, Analoga oder Homologe verwendet werden. Manche dieser Proteine werden unten besprochen.
  • Für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern können verschiedene passende Wirtstiere (z.B. Kaninchen, Ziege, Maus oder andere Säuger) durch Injektion mit dem nativen Protein oder einer synthetischen Variante davon oder einem Derivat der genannten immunisiert werden. Eine geeignete immunogene Präparation kann z.B. rekombinant exprimiertes BAFF-R-Protein oder ein chemisch synthetisiertes BAFF-R-Polypeptid enthalten. Die Präparation kann weiterhin ein Adjuvans enthalten. Verschiedene Adjuvanzien, die verwendet werden, um die immunologische Antwort zu verstärken, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Freunds (komplett und nichtkomplett), Mineralgele (z.B. Aluminium-Hydroxide), oberflächenaktive Stoffe (z.B.
  • Lysolezithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Dinitrophenol usw.), humane Adjuvanzien wie Bacille Calmette-Guerin (BCG) und Corynebacterium parvum oder ähnliche immunstimulatorische Mittel. Falls erwünscht, können die Antikörpermoleküle, die gegen BAFF-R gerichtet sind, aus dem Säugetier (z.B. aus dem Blut) isoliert und mit Hilfe bekannter Techniken, wie Protein A-Chromatographie, weiter aufgereinigt werden, um die IgG-Fraktion zu gewinnen.
  • Der Begriff „monoklonaler Antikörper" oder „monoklonale Antikörperzusammensetzung", wie hierin verwendet, betreffen eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Art von Antigenenbindungsstelle, die zum Immunreagieren mit einem speziellen Epitop von BAFF-R fähig sind, enthalten. Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung zeigt demnach üblicherweise eine einzige Bindungsaktivität für ein bestimmtes BAFF-R-Protein, mit dem sie immunreagiert. Für die Präparation von monoklonalen Antikörpern, die gegen ein spezifisches BAFF-R-Protein oder dessen Derivate, Fragmente, Analoga oder Homologe gerichtet sind, kann eine beliebige Technik, die eine Antikörpermolekülproduktion mit Hilfe kontinuierlicher Zelllinienkultur erlaubt, verwendet werden. Solche Techniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Hybridoma-Technik (siehe Kohler & Milstein, (1975) Nature 256:495-497); die Trioma-Technik; die humane B-Zell-Hybridoma-Technik (siehe Kozbor et al. (1983) Immunl. Today 4:72) und die EBV-Hybridoma-Technik für die Produktion humaner monoklonaler Antikörper (siehe Cole, et al. in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., 1985, pp. 77-96). Humane monoklonale Antikörper können in der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden und können unter Verwendung humaner Hybridome (siehe Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) oder durch die Transformation humaner B-Zellen mit Epstein-Barr-Virus in vitro (siehe siehe Cole, et al. in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., 1985, pp. 77-96) hergestellt werden.
  • Gemäß der Erfindung können Techniken für die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern, die spezifisch für ein BAFF-R-Protein sind, adaptiert werden (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 4,946,778 ). Außerdem können Verfahren für den Aufbau von Fab-Expressionsbibliotheken adaptiert werden (siehe z.B. Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281), um eine schnelle und effektive Identifizierung von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für ein BAFF-R-Protein oder seine Derivate, Fragmente, Analoga oder Homologe zu erlauben. Nicht-humane Antikörper können mit Hilfe fachbekannter Techniken „humanisiert" werden (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,225,539 ). Antikörperfragmente, die die Idiotypen zu einem BAFF-R-Protein enthalten, können mit Hilfe fachbekannter Techniken hergestellt werden, die umfassen, aber nicht beschränkt sind auf: (i) ein F(ab')2-Fragment, hergestellt durch den Pepsin-Verdau eines Antikörpermoleküls; (ii) ein Fab-Fragment, hergestellt durch Reduktion von Disulfidbrücken eines F(ab')2-Fragments; (iii) ein Fab-Fragment, hergestellt durch die Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel und (iv) Fv-Fragmente.
  • Außerdem sind rekombinante anti-BAFF-R-Antikörper wie chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, die sowohl humane, als auch nicht-humane Anteile umfassen, die unter Verwendung standardisierter rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden können, im Bereich der Erfindung. Solche chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper können durch fachbekannte rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden, z.B. unter Verwendung von Verfahren, beschrieben in der internationalen PCT-Anmeidung Nr. PCT/US86/02269 ; der Europäischen Patentanmeldung Nr. 184,187 ; der Europäischen Patentanmeldung Nr. 171,496 ; der Europäischen Patentanmeldung Nr. 173,494 ; der internationalen PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/01533 ; U.S.-Patent Nr. 4,816,567 ; der Europäischen Patentanmeldung Nr. 125,023 ; Retter et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; U.S.-Patent Nr. 5,225,539 ; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; und Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.
  • In einer Ausführungsform umfassen Verfahren für das Screening von Antikörpern, die die gewünschte Spezifität besitzen, sind aber nicht beschränkt auf den enzymgebundenen Immunosorbens-Assay (ELISA) und andere immunologisch vermittelte fachbekannte Techniken. In einer speziellen Ausführungsform ist die Selektion von Antikörpern, die spezifisch für eine bestimmte Domäne eines BAFF-R-Proteins sind, erleichtert durch die Erzeugung von Hybridomen, die an ein eine solche Domäne enthaltendes BAFF-R-Fragment binden. Antikörper, die für eine oder mehrere Domänen innerhalb eines BAFF-R-Proteins spezifisch sind, z.B. Domänen, die die oben identifizierten konservierten Regionen von Proteinen der BAFF-R- Familie oder ihre Derivate, Fragmente, Analoga oder Homologe überspannen, sind ebenso hierin bereitgestellt.
  • Anti-BAFF-R-Antikörper können in fachbekannten Verfahren zur Lokalisierung und/oder Quantifizierung eines BAFF-R-Proteins verwendet werden (z.B. zur Verwendung für Messungen des BAFF-R-Protein-Niveaus in geeigneten physiologischen Proben, zur Verwendung in diagnostischen Verfahren, zur Verwendung im Proteinimaging und ähnlichem). In einer gegebenen Ausführungsform werden Antikörper für BAFF-R-Proteine oder ihre Derivate, Fragmente, Analoga oder Homologe, die die antikörpereigene Bindedomäne enthalten, als pharmakologisch aktive Verbindungen verwendet (nachstehend „Therapeutika").
  • Ein Anti-BAFF-R-Antikörper (z.B. monoklonaler Antikörper) kann zur Isolierung von BAFF-R mit Hilfe gängiger Techniken wie Affinitätschromatographie oder Immunpräzipitation verwendet werden. Ein Anti-BAFF-R-Antikörper kann die Aufreinigung von natürlichem BAFF-R aus Zellen und von rekombinant hergestelltem BAFF-R, das in Wirtszellen exprimiert wird, erleichtern. Außerdem kann ein Anti-BAFF-R-Antikörper zur Detektion von BAFF-R-Protein verwendet werden (z.B. in einem zellulären Lysat oder Zellüberstand), um die Menge und das Expressionsmuster des BAFF-R-Proteins zu evaluieren. Anti-BAFF-R-Antikörper kann diagnostisch verwendet werden, um das Proteinniveau im Gewebe als Teil einer klinischen Testmethode diagnostisch zu kontrollieren, um z.B. die Wirksamkeit eines bestimmten Behandlungsplans zu bestimmen. Die Detektion kann durch Kopplung (d.h. physikalische Verbindung) des Antikörpers mit einer detektierbaren Substanz erleichtert werden. Beispiele detektierbarer Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszente Stoffe, lumineszente Stoffe, biolumineszente Stoffe und radioaktive Stoffe. Beispiele für passende Enzyme umfassen Meerrettichperoxidase, alkaline Phosphatase, B-Galaktosidase oder Acetylcholinesterase; Beispiele für geeignete prosthetische Gruppenkomplexe umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele für passende fluoreszente Stoffe umfassen Umbelliferon, Fluoreszein, Fluoreszein-Isothiocyanat, Rhodamin, Dichlorotriazinylamin-Fluoreszein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für einen lumineszenten Stoff umfasst Luminol; Beispiele für biolumineszente Stoffe umfassen Luziferase, Luziferin und Aequorin, und Beispiele für passende radioaktive Stoffe umfassen 125I, 131I 35S und 3H.
  • BAFF-R rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die BAFF-R oder ihre Derivate, Fragmente, Analoga oder Homologe kodiert. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Vektor" auf Nukleinsäuremoleküle, die zum Transport anderer Nukleinsäuren, mit denen sie verbunden wurden, fähig sind. Ein Typ von Vektoren ist ein „Plasmid", was sich auf eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in welche zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein anderer Typ von Vektoren ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden kann. Manche Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle geeignet, in welche sie eingeführt werden (z.B. bakterielle Vektoren, die einen bakteriellen Replikationsursprung aufweisen, und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z.B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden nach der Einführung in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert, und werden dadurch mit dem Wirtsgenom repliziert. Außerdem sind manche Vektoren zur Steuerung der Expression von Genen in der Lage, mit denen sie operativ verbunden sind. Solche Vektoren werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen sind die Expressionsvektoren, die in rekombinanten DNA-Techniken verwendbar sind, oft in der Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können „Plasmid" und „Vektor" synonym verwendet werden, da das Plasmid die am meisten verwendeten Form eines Vektors ist. Allerdings soll die Erfindung auch andere Formen von Expressionsvektoren umfassen, wie virale Vektoren (z.B. replikationsdefiziente Retroviren, Adenviren und adenoassoziierte Viren), welche äquivalente Funktionen erfüllen.
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in der Form, die zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenz(en) umfassen, die auf Basis der Wirtszellen, die für die Expression verwendet werden sollen, ausgewählt ist/sind, und die mit den zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen operativ verbunden ist/sind. Für einen rekombinanten Expressionsvektor soll „operativ verbunden" bedeuten, dass die interessierende Nukleotidsequenz mit der/n regulatorischen Sequenz(en) in einer Weise verbunden ist, die die Expression der Nukleinsäure erlaubt (z.B. in einem in-vitro-Transkription/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird). Der Begriff „regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente umfassen (z.B. Polyadenylierungssignale). Solche regulatorischen Sequenzen sind z.B. in Goeddel „Gene Expression Technology" METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990 beschrieben. Regulatorische Sequenzen umfassen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Typen von Wirtszellen steuern, und solche, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern (z.B. gewebespezifische regulatorische Sequenzen). Ein Fachmann wird wissen, dass das Design des Expressionsvektors von Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Expressionsniveau des Proteins usw. abhängen kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in die Wirtszelle eingeführt werden, um Proteine oder Peptide herzustellen, umfassend Fusionsproteine oder Peptide, die durch hierin beschriebene Nukleinsäuren kodiert sind (z.B. BAFF-R-Proteine, mutante Formen von BAFF-R, Fusionsproteine usw.).
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von BAFF-R in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen konzipiert werden. Z.B. kann BAFF-R in bakteriellen Zellen wie Escherichia coli, Insektenzellen (unter Verwendung von bakuloviralen Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert werden. Passende Wirtszellen sind weiter diskutiert in Goeddel, „Gene Expression Technology" METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, z.B. unter Verwendung einer T7-Promotorregulationssequenz und T7-Polymerase.
  • Die Expression von Proteinen in Prokaryonten wird am häufigsten in E. coli durchgeführt mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von Fusions- wie Nichtfusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren fügen eine Anzahl von Aminosäuren zu einem Protein, das darin kodiert ist, hinzu, üblicherweise zu dem Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise dreierlei Zwecken: (1) zur Verstärkung der Expression von rekombinantem Protein; (2) zur Verstärkung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins; und (3) zur Unterstützung während der Aufreinigung des rekombinanten Proteins durch ihre Wirkung als Ligand in der Affinitätsaufreinigung. Oft wird in Fusionsexpressionsvektoren eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindungsstelle des Fusionsteils und des rekombinanten Proteins eingefügt, um die Trennung des rekombinanten Proteins vom Fusionsteil im Anschluss an die Aufreinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre zugehörigen Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Typische Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharma Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.), die entsprechend Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-E-Bindungsprotein oder Protein A mit dem rekombinanten Zielprotein fusionieren.
  • Beispiele von passenden induzierbaren E. coli-Nichtfusions-Expressionsvektoren umfassen pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier et al., „Gene Expression Technology" METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990, pp. 60-89).
  • Eine Strategie zur Maximierung der Expression rekombinanter Proteine in E. coli ist die Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium mit einer verminderten Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins, siehe Gottesman, „Gene Expression Technology" METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990, pp. 119-128. Eine andere Strategie ist die Änderung der Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu inserierenden Nukleinsäure derart, dass die individuellen Kodons für jede Aminosäure solchen der in E. coli vorzugsweise verwendeten entsprechen (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Solche Änderungen von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können mit Hilfe standardmäßiger DNA-Synthesethechniken durchgeführt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der BAFF-R-Expressionsvektor ein Hefeexpressionsvektor. Beispiele für Vektoren für Expression in Hefe (z.B. Saccharomyces cerivisae) umfassen pYepSec1 (Baldari et al., (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), und für P. pastoris umfassen sie die pPIC-Familie von Vektoren (Invitrogen Corp, Sand Diego, Calif.).
  • Alternativ kann BAFF-R in Insektenzellen unter Verwendung von bakuloviralen Expressionsvektoren exprimiert werden. Bakulovirusvektoren, die zur Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (z.B. SF9-Zellen) zur Verfügung stehen, umfassen die pAc-Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) und die pVL-Serie (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39).
  • In einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Säugetierzellen unter Verwendung eines Säugetierexpressionsvektors exprimiert. Beispiele für Säugetierexpressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840-842) und pMT2PC (Kaufmau et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Wenn in Säugetierzellen verwendet, werden die Kontrollfunktionen der Expressionsvektoren oft unterstützt von viralen regulatorischen Elementen. Zum Beispiel sind häufig verwendete Promotoren abgeleitet von Polyoma, Adenvirus 2, Cytomegalovirus und Affenvirus 40. Für andere passende Expressionssysteme für sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen siehe z.B. Kapitel 16 und 17 von Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2ND ED., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der rekombinante Säugetierexpressionsvektor imstande, die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp zu steuern (z.B. werden gewebespezifische Regulationselemente verwendet zur Nukleinsäureexpression). Gewebespezifische Regulationselemente sind fachbekannt. Nichtbeschränkende Beispiele passender gewebespezifischer Promotoren umfassen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), lymphspezifische Promotoren (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) und Immunglobuline (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748), neuronspezifische Promotoren (z.B. der Neurofilamentpromotor, Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren (z.B. Milchserumpromotor, U.S. Pat. Nr. 4,873,316 und Europäische Anmeldungsveröffentlichung Nr. 264, 166 ). Entwicklungsregulierte Promotoren sind ebenso inbegriffen, z.B. die murinen hox-Promotoren (Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379) und der α-Fetoproteinpromotor (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).
  • Die Erfindung bietet weiterhin einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül, das in den Expressionsvektor in einer Antisenseorientierung kloniert ist. Das heißt, das DNA-Molekül ist derart mit einer regulatorischen Sequenz operativ verbunden, dass die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das antisense zu BAFF-R-mRNA sind, ermöglicht ist. Es können regulatorische Sequenzen gewählt werden, die mit einer in Antisense-Orientierung klonierten Nukleinsäure operativ verbunden sind, und die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, beispielsweise virale Promotoren und/oder Verstärker, oder es können regulatorische Sequenzen gewählt werden, die die konstitutive gewebespezifische oder zellspezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in der Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder eines abgeschwächten Viruses sein, in welchem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer hocheffizienten regulatorischen Region hergestellt werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp, in welchen der Vektor eingeführt ist, bestimmt werden kann. Zur Diskussion der Regulation der Genexpression unter Verwendung von Antisensegenen siehe Weintraub et al. (1986) „Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis", Reviews-Trends in Genetics, 1(1).
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in welche ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingeführt wurde. Die Begriffe „Wirtszelle" und „rekombinante Wirtszelle" sind hierin synonym verwendet. Es ist klar, dass solche Begriffe sich nicht nur auf die jeweiligen Subjekt-Zellen beziehen, sondern auch auf die Nachkommen oder potentielle Nachkommen dieser Zellen. Weil gewisse Modifikationen in nachfolgenden Generationen auftreten können, ausgelöst entweder durch Mutationen oder durch Umwelteinflüsse, können solche Nachkommen in der Tat nicht mit den Elternzellen identisch sein, aber immer noch in den Umfang des Begriffs, wie hierin verwendet, fallen.
  • Eine Wirtszelle kann jede prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Zum Beispiel kann BAFF-R-Protein in bakteriellen Zellen wie E. coli, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie Eizellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen exprimiert werden. Andere passende Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
  • Vektor-DNA kann in prokaryotische oder erkaryotische Zellen mit Hilfe konventioneller Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Wie hierin verwendet, sollen die Begriffe „Transformation" und „Transfektion" sich auf eine Vielzahl von allgemeinanerkannten Techniken zur Einführung fremder Nukleinsäuren (z.B. DNA) in eine Wirtszelle beziehen, einschließlich Kalziumphosphat- oder Kalziumchlorid-Kopräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Passende Verfahren zur Transformation und Transfektion von Wirtszellen können in Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2ND ED., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 und anderen Laborhandbüchern gefunden werden.
  • Es ist für stabile Transfektion von Säugetierzellen bekannt, dass in Abhängigkeit von dem verwendeten Expressionsvektor und der Transfektionstechnik nur eine kleine Fraktion von Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird ein Gen, das einen Selektionsmarker kodiert (z.B. Resistenz gegen Antibiotika), allgemein in die Wirtszellen zusammen mit dem interessierenden Gen eingeführt. Verschiedene Selektionsmarker umfassen solche, die Resistenz gegenüber Wirkstoffen verleihen, wie G418, Hygromycin und Methotrexat. Eine Nukleinsäure, die einen Selektionsmarker kodiert, kann in eine Wirtszelle mit demselben Vektor wie dem eingeführt werden, der für BAFF-R kodiert, oder kann mit einem separaten Vektor eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert sind, können mit Hilfe von Wirkstoffselektion identifiziert werden (z.B. werden Zellen, die das Selektionsmarker-Gen eingebaut haben, überleben, wogegen die anderen Zellen absterben).
  • Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen in Kultur, können zur Herstellung (d.h. Expression) von BAFF-R-Protein verwendet werden. Dementsprechend bietet die Erfindung weiterhin Verfahren zur Herstellung von BAFF-R-Protein unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Kultivierung der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in welche ein rekombinanter Expressionsvektor, der BAFF-R kodiert, eingeführt wurde) in einem geeigneten Medium, so dass BAFF-R-Protein hergestellt wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin die Isolierung von BAFF-R aus dem Medium oder der Wirtszelle.
  • Transgene Tiere
  • Die erfindungsgemäßen Wirtszelle können auch zur Herstellung von nichthumanen transgenen Organismen verwendet werden. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform eine erfindungsgemäße Wirtszelle eine fertilisierte Oozyte oder eine embryonale Stammzelle, in welche BAFF-R-kodierende Sequenzen eingeführt wurden. Solche Wirtszellen können dann zur Erzeugung von nicht-humanen transgenen Tieren verwendet werden, in welchen exogene BAFF-R-Sequenzen in ihr Genom eingeführt wurden oder homolog rekombinanten Tieren, in welchen endogene BAFF-R-Sequenzen geändert wurden. Solche Tiere sind nützlich zur Untersuchung der Funktion und/oder Aktivität von BAFF-R und zur Identifizierung und/oder Evaluierung von Modulatoren der BAFF-R-Aktivität. Wie hierin verwendet, ist ein „transgenes Tier" ein nicht-humanes Tier, bevorzugt ein Säugetier, mehr bevorzugt ein Nagetier wie eine Ratte oder eine Maus, in welchen eine oder mehrere Zellen des Tieres ein Transgen umfassen. Andere Beispiele für transgene Tieren umfassen nicht-humane Primaten, Schafe, Hunde, Kühe, Ziegen, Hühner, Amphibien usw. Ein Transgen ist exogene DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus welcher ein transgenes Tier sich entwickelt und welche im Genom eines erwachsenen Tieres bleibt, auf diese Weise die Expression eines kodierten Genprodukts in einem oder mehreren Zelltyp(en) oder Gewebe(n) des transgenen Tieres steuernd. Wie hierin verwendet, ist ein „homolog rekombinantes Tier" ein nicht-humanes Tier, bevorzugt ein Säugetier, mehr bevorzugt eine Maus, in welchem/r durch homologe Rekombination zwischen dem endogenen Gen und einem in eine Zelle des Tieres, z.B. eine embryonale Zelle des Tieres, eingeführten exogenen DNA-Molekül ein endogenes BAFF-R-Gen vor Beginn seiner Entwicklung geändert wurde. Ein erfindungsgemäßes transgenes Tier kann durch Einführen BAFF-R-kodierender Nukleinsäure in die männlichen Pronuklei einer fertilisierten Oozyte erzeugt werden, z.B. durch Mikroinjektion, retrovirale Infektion und indem der Oozyte erlaubt wird, sich zu einem pseudoträchtigen Ammentier zu entwickeln. Die humane BAFF-R DNA-Sequenz von 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4), 3 (SEQ ID NO:6) kann als ein Transgen in das Genom eines nicht-humanen Tieres eingeführt werden. Alternativ kann ein nicht-humanes Homolog des humanen BAFF-R-Gens, wie ein Maus-BAFF-R-Gen (4A) (SEQ ID NO:8) basierend auf Hybridisierung an humane BAFF-R-cDNA (weiter oben beschrieben) isoliert und als ein Transgen verwendet werden. Intronische Sequenzen und Polyadenylierungssignale können auch in das Transgen eingeschlossen werden, um die Expressionseffizienz des Transgens zu erhöhen. (Eine) gewebespezifische Regulationssequenz(en) kann/können mit dem BAFF-R-Transgen operativ verbunden werden, um die Expression von BAFF-R-Protein in bestimmten Zellen zu steuern. Verfahren zur Herstellung transgener Tiere mit Hilfe Embryomanipulation und Mikroinjektion, besonders von Tieren wie Mäusen, sind auf dem Gebiet konventionell geworden und beschrieben z.B. in U.S. Patent No. 4,736,866 ; 4,870,009 und 4,873,191 und Hogan in MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986. Ähnliche Verfahren werden für Herstellung von anderen transgenen Tieren verwendet. Ein transgenes Founder-Tier kann aufgrund der Präsenz des BAFF-R-Transgens in seinem Genom und/oder der Expression von BAFF-R-mRNA in Geweben oder Zellen des Tieres identifiziert werden. Ein transgenes Founder-Tier kann dann zur Züchtung von weiteren transgentragenden Tieren verwendet werden. Außerdem können transgene Tiere, die ein BAFF-R-kodierendes Transgen tragen, weiter mit anderen transgenen Tieren gekreuzt werden, die andere Transgene tragen.
  • Um ein homolog rekombinantes Tier zu erzeugen, wird ein Vektor hergestellt, der mindestens einen Teil eines BAFF-R-Gens enthält, in welchem eine Deletion, Addition oder Substitution eingefügt wurde, um dadurch das BAFF-R-Gen zu verändern, z.B. funktionell zu zerstören. Das BAFF-R-Gen kann ein humanes Gen sein (z.B. 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4), 3 (SEQ ID NO:6)), aber mehr bevorzugt ist es ein nicht-humanes Homolog eines humanes BAFF-R-Gens. Zum Beispiel kann ein Maushomolog (4A) eines humanen BAFF-R-Gens von 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4), 3 (SEQ ID NO:6) zur Konstruktion eines homologen Rekombinationsvektors verwendet werden, der zur Änderung eines endogenen BAFF-R-Gens im Mausgenom geeignet ist. In einer Ausführungsform der Vektor ist derart aufgebaut, dass nach der homologen Rekombination das endogene BAFF-R-Gen funktionell zerstört ist (d.h. kein funktionales Protein mehr kodiert; auch bezeichnet als „knockout"-Vektor).
  • Alternativ kann der Vektor derart aufgebaut werden, dass nach der homologen Rekombination das endogene BAFF-R-Gen mutiert oder auf andere Weise geändert ist, aber immer noch funktionales Protein kodiert (z.B. kann die stromaufwärts gelegene Regulationsregion geändert sein, um die Expression des endogenen BAFF-R-Proteins zu ändern). In dem homologen Rekombinationsvektor wird der geänderte Teil des BAFF-R-Gens an seinen 5'- und 3'-Enden durch zusätzliche Nukleinsäure desBAFF-R-Gens flankiert, um homologe Rekombination zwischen dem exogenen BAFF-R-Gen, das vom Vektor getragen wird, und einem endogenen BAFF-R-Gen in einer embryonalen Stammzelle zu ermöglichen. Die zusätzliche flankierende BAFF-R-Nukleinsäure ist von genügender Länge für erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen. Typischerweise sind etliche Kilobasen flankierender DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) in den Vektor eingeschlossen, siehe z.B. Thomas et al. (1987) Cell 51:503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren. Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie eingebracht (z.B. durch Elektroporation), und Zellen, in welchen das eingeführte BAFF-R-Gen homolog mit dem endogenen BAFF-R-Gen rekombiniert hat, werden selektiert (siehe z.B. Li et al. (1992) Cell 69:915).
  • Die selektierten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tieres (z.B. einer Maus) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden, siehe z.B. Bradley, in TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, Ed. IRL, Oxford, 1987, pp. 113-152. Ein chimärer Embryo kann dann in ein passendes pseudoträchtiges Ammentier implantiert werden und der Embryo ausgetragen werden. Nachkommen, die in ihren Keimzellen die homolog rekombinierte DNA enthalten, können zur Züchtung von Tieren verwendet werden, in welchen alle Zellen des Tieres die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen durch die Keimbahntransmission des Transgens aufweisen. Verfahren zur Konstruktion homologer Rekombinationsvektoren und homolog rekombinanter Tiere sind weiter beschrieben in Bradley (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2:823-829; PCT internationale Veröffentlichung No.: WO 90/11354 ; WO 91/01140 ; WO 92/0968 und WO 93/04169 .
  • In einer anderen Ausführungsform können transgene nicht-humane Tiere hergestellt werden, die selektierte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des Transgens erlauben. Ein Beispiel für ein solches Systems ist das cre/loxP-Rekombinasensystem des Bakteriophagen P1. Zur Beschreibung des cre/losP-Rekombinasensystems siehe z.B. Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236. Ein anderes Beispiel für ein Rekombinasesystem ist das FLP-Rekombinasesystem von S. cerevisiae (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355). Wenn ein cre/loxP Rekombinasesystem zur Regulation der Expression des Transgens verwendet wird, werden Tiere benötigt, die Transgene enthalten, die sowohl Cre-Rekombinase als auch ein selektiertes Protein kodieren. Solche Tiere können durch die Konstruktion von „doppel"transgenen Tieren bereitgestellt werden, z.B. durch Verpaarung zweier transgener Tiere, von denen eins ein für ein ausgewähltes Protein kodierendes Transgen und das andere ein für eine Rekombinase kodierendes Transgen enthält.
  • Klone der hier beschriebenen nicht-humanen transgenen Tiere können auch gemäß den Verfahren hergestellt werden, die in Wilmut et al. (1997) Nature 385:810-813 beschrieben sind. Kurz gesagt kann eine Zelle, z.B. eine somatische Zelle aus dem transgenen Tier, isoliert und zum Ausstieg aus dem Wachstumszyklus und zum Eintreten in G0-Phase induziert werden. Die ruhenden Zellen können dann, z.B. durch die Verwendung von elektrischen Pulsen, mit einer entkernten Oozyte aus einem Tier derselben Spezies fusioniert werden, aus welchem die ruhende Zelle isoliert war. Die rekonstruierte Oozyte wird dann derart kultiviert, dass sie sich zur Morula oder Blastozyste entwickelt, und dann in ein weibliches pseudoträchtiges Ammentier transferiert. Die Nachkommen, die von diesem weiblichen Ammentier geboren werden, werden ein Klon des Tieres sein, aus welchem die Zelle, z.B. die somatische Zelle, isoliert wurde.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die erfindungsgemäßen BAFF-R Nukleinsäuremoleküle, BAFF-R-Proteine und anti-BAFF-R-Antikörper (hier auch bezeichnet als „aktive Verbindungen") und ihre Derivate, Fragmente, Analoga und Homologe können in pharmazeutische Zusammensetzungen aufgenommen werden, die zur Verabreichung geeignet sind. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise das/den Nukleinsäuremolekül, Protein oder Antikörper und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Wie hierin verwendet soll „pharmazeutisch akzeptabler Träger" alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Wirkstoffe und ähnliches umfassen, die mit pharmazeutischer Verabreichung kompatibel sind. Passende Träger sind in der neuesten Auflage von Remington's Pharmaceutical Sciences beschrieben, einem Standardlehrbuch in diesem Fachgebiet, welches hierin durch Bezugnahme einbezogen ist. Bevorzugte Beispiele von solchen Trägern oder Verdünnungsmitteln umfassen, sind aber nicht begrenzt auf Wasser, Salzlösungen, Ringer-Lösungen, Dextroselösung und 5% humanes Serumalbumin. Liposomen und nichtwässrige Vehikel, wie Fettöle, können auch verwendet werden. Die Verwendung von solchen Medien und Stoffen für pharmazeutisch aktive Substanzen ist fachbekannt. Ausgenommen Fälle, in denen ein konventionelles Medien nicht mit dem Wirkstoff kompatibel ist, wird deren Anwendung in den Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Zusätzliche aktive Stoffe können auch in die Zusammensetzungen aufgenommen werden.
  • Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist so formuliert, dass sie kompatibel mit dem vorgesehenem Verabreichungsweg ist. Beispiele für Verabreichungswege umfassen parenterale, z.B. intravenöse, intradermale, subkutane, orale (z.B. Inhalation), transdermale (topische), transmukosale und rektale Verabreichung. Lösungen oder Suspensionen, die für parenterale, intradermale oder subkutane Verabreichung verwendet werden, können folgende Komponenten umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel wie Wasser für Injektion, Salzlösung, Fettöle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatoren wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); Puffer wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zur Einstellung von Tonizität wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH kann mit Säuren oder Basen wie Salzsäure oder Natriumhydroxid eingestellt werden. Die parenterale Zubereitung kann in aus Glas oder Kunststoff gefertigten Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfachdosisampullen verpackt werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für Injektionsgebrauch geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen (soweit wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die spontane Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Für intravenöse Verabreichung umfassen geeignete Träger physiologische Salzlösungen, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N.J.) oder Phosphat-gepufferte Salzlösungen (PBS). In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril und sollte insoweit flüssig sein, dass die Aufnahme in die Spritze möglich ist. Sie muss unter den Produktions- und Aufbewahrungsbedingungen stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen konserviert werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (z.B. Glycerol, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und ähnliches) enthält und geeignete Mischungen davon. Die angemessene Fluidität kann zum Beispiel durch Verwendung einer Beschichtung wie Lecithin, durch Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle von Dispersion und durch Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen aufrechterhalten werden. Eine Verhinderung der Mikroorganismenwirkung kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel erreicht werden, z.B. Parabene, Chlorobutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und ähnliche. In vielen Fällen wird es zu bevorzugen sein, isotonische Mittel, z.B. Zucker, Polyalkohole wie Mannitol, Sorbitol, Natriumchlorid in die Zusammensetzung einzubeziehen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch das Hinzufügen eines Mittels in die Zusammensetzung bewirkt werden, das die Absorption verzögert, z.B. Aluminium-Monostearat und Gelatine.
  • Sterile injizierbare Lösungen können durch das Kombinieren des Wirkstoffs (z.B. eines BAFF-R-Proteins oder Anti-BAFF-R-Antikörpers) in der nötigen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination von oben aufgelisteten Ingredienzien hergestellt werden, je nach Bedarf, gefolgt von Filter-Sterilisation. Generell werden Dispersionen durch die Aufnahme der Wirkstoffe in ein steriles Vehikel hergestellt, das ein Grunddispersionsmedium und die nötigen anderen Inhaltsstoffe aus den oben aufgelisteten enthält. Im Fall von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind Herstellungsverfahren Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, welches ein Pulver des Wirkstoffs und jedes weiteren gewünschten Inhaltsstoffs aus einer vorher sterilfiltrierten Lösung ergibt.
  • Orale Zusammensetzungen umfassen generell ein inertes Verdünnungsmittel oder einen genießbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln gefasst oder als Tabletten gepresst werden. Zum Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann der Wirkstoff mit Hilfsstoffen kombiniert werden und in der Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können auch unter Verwendung eines flüssigen Trägers hergestellt werden zur Verwendung als eine Mundspülung, wobei der Stoff in dem Flüssigträger oral verabreicht, gegurgelt und ausgespuckt oder geschluckt wird. Pharmazeutisch kombatible Bindemittel und/oder Adjuvantien können als Teil der Zusammensetzung eingearbeitet werden. Tabletten, Dragees, Kapseln, Pastillen und ähnliches können einige von folgenden Ingredienzien oder Stoffen ähnlicher Art enthalten: ein Bindemittel wie mikrokristalline Zellulose, Tragantgummi oder Gelatine; einen Hilfsstoff wie Stärke oder Laktose, ein Sprengmittel wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Schmiermittel wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel wie kolloidales Siliziumdioxid; ein Süssmittel wie Saccharose oder Saccharin; oder einen Aromastoff wie Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangenaroma.
  • Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Stoffe in der Form eines Aerosolsprays aus einem Druckbehälter oder Spender, der einen geeignetes Treibgas enthält, z.B. ein Gas wie Kohlenstoffdioxid, oder einem Zerstäuber geliefert.
  • Systemische Verabreichung kann auch auf transmukosalem oder transdermalen Weg erfolgen. Für transmukosale oder transdermale Verabreichung werden für die zu überwindende Barriere geeignete Durchdringungsmittel in der Formulierung verwendet. Solche Durchdringunsmittel sind generell fachbekannt und umfassen zum Beispiel für transmukosale Verabreichung Detergentien, Gallensäuren und Fusidinsäurederivate. Transmukosale Verabreichung kann unter Verwendung von Nasensprays oder Suppositorien durchgeführt werden. Für transdermale Verabreichung sind die Wirkstoffe formuliert in Salben, Gele oder Cremes, wie allgemein fachbekannt ist.
  • Die Stoffe können auch in der Form von Suppositorien (z.B. mit konventionellen Grundlagen für Suppositorien, wie Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder Retentionsklistieren zur rektalen Zuführung hergestellt werden.
  • In einer Ausführungsform sind die Wirkstoffe mit Trägern hergestellt, die die Stoffe vor schneller Eliminierung aus dem Körper schützen sollen, wie Formulierungen zur kontrollierten Freigabe, umfassend Implantate und mikrokapsulierte Abgabesysteme. Es können bioabbaubare, biokompatible Polymere verwendet werden wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sollten für den Fachmann offenkundig sein. Die Materialien können auch kommerziell von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. bezogen werden. Liposomale Suspensionen (umfassend Liposomen, die durch monoklonale Antikörper gegen virale Antigene auf infizierte Zellen gelenkt werden) können auch als pharmazeutisch akzeptable Träger verwendet werden. Diese können gemäß fachbekannten Verfahren hergestellt werden, z.B. wie in U.S.-Patent No. 4,522,811 beschrieben ist.
  • Es ist von besonderem Vorteil, wenn orale oder parenterale Zusammensetzungen zur Erleichterung der Verabreichung und Gleichmäßigkeit der Dosierung in Dosierungseinheiten formuliert sind. Dosierungseinheitsform, wie hierin verwendet, bezieht sich auf physikalisch eigenständige Einheiten, die als Einzeldosierungen für das zu behandelnde Subjekt geeignet sind; jede Einheit enthält eine vorbestimmte Menge von Wirkstoff, die ausgerechnet ist, um den erwünschten therapeutischen Effekt in Verbindung mit dem nötigen pharmazeutischen Träger zu erzeugen. Die Vorgaben für die erfindungsgemäßen Dosierungseinheitsformen sind bestimmt durch und direkt abhängig von einzelnen Charakteristika der Wirkstoffen und dem speziellen zu erreichenden therapeutischen Effekt.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in Vektoren inseriert und als Gentherapievektoren verwendet werden. Gentherapievektoren können an ein Subjekt auf einer Vielzahl von Wegen abgegeben werden, z.B. wie in U.S.-Patent No. 5,703,055 beschrieben ist. Die Abgabe kann auf diese Weise auch z.B. intravenöse Injektion, lokale Verabreichung (siehe U.S.-Patent No. 5,328,470 ) oder stereotaktische Injektion (siehe z.B. Chef et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3054-3057) umfassen. Die pharmazeutische Präparation des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einem geeigneten Verdünnungsmittel umfassen, oder kann eine Matrix zur langsamen Abgabe umfassen, in das das Gentransportvehikel eingebettet ist. Alternativ kann, wenn der komplette Gentransportvektor intakt von rekombinanten Zellen hergestellt werden kann, z.B. retrovirale Vektoren, die pharmazeutische Präparation eine oder mehrere Zellen umfassen, die das Gentransportsystem herstellen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einen Behälter, Packung oder Spender zusammen mit Gebrauchsanweisungen zur Verabreichung enthalten sein.
  • Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
  • Die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinhomologe und Antikörper können in einem oder mehreren der folgenden Verfahren verwendet werden: (a) Screening-Assays; (b) Detektionsassays (z.B. chromosomale Kartierung, Gewebetypisierung, forensische Biologie); (c) prädiktive Medizin (z.B. diagnostische Assays, prognostische Assays, Monitoring von klinischen Versuchen und Pharmakogenomik); und (d) Behandlungsverfahren (z.B. therapeutische und prophylaktische). Wie hierin beschrieben hat ein erfindungsgemäßes BAFF-R-Protein in einer Ausführungsform die Fähigkeit, BAFF zu binden.
  • Die isolierten Nukleinsäuremoleküle nach der Erfindung können zur Expression von BAFF-R-Protein verwendet werden (z.B. mit Hilfe eines rekombinanten Expressionsvektors in einer Wirtszelle in Gentherapie-Anwendungen), zur Detektion von BAFF-R-mRNA (z.B. in einer biologischen Probe) oder einer genetische Läsion in einem BAFF-R-Gen, und zur Modulation von BAFF- und/oder BAFF-R-Aktivität wie weiter unten beschrieben. Ferner können die BAFF-R-Proteine zum Screening auf Wirkstoffe oder Verbindungen verwendet werden, die die BAFF-R-Aktivität oder -Expression modulieren sowie zur Behandlung von Störungen, die durch ungenügende oder exzessive Produktion von BAFF- und/oder BAFF-R-Protein, oder durch Produktion von BAFF-R-Proteinformen charakterisiert sind, die verglichen mit BAFF-R-Wildtypprotein eine verminderte oder anomale Aktivität aufweisen. Ferner können die erfindungsgemäße Anti-BAFF-R-Antikörper zur Detektion und Isolierung von BAFF-R-Proteinen und zur Modulierung der BAFF- und/oder BAFF-R-Aktivität verwendet werden.
  • Diese Erfindung bezieht sich weiterhin auf neue Mittel, die durch die obenbeschriebenen Screening-Assays identifiziert wurden, und ihre Anwendungen für Behandlungen wie hierin beschrieben.
  • Screening-Assays
  • Die Erfindung bietet ein Verfahren (hierin auch als "Screening-Assay" bezeichnet) zur Identifizierung von Modulatoren, d.h. Kandidaten oder Testverbindungen oder Mitteln (z.B. Peptiden, Peptidomimetika, Kleinmolekülen oder anderen Wirkstoffen), die an BAFF-R-Proteine binden oder ein stimulatorischen oder inhibitorischen Effekt auf z.B. BAFF-R-Expression oder BAFF-R-Aktivität haben.
  • In einer Ausführungsform bietet die Erfindung Assays für Screening von Kandidaten oder Testverbindungen, welche an BAFF-R-Protein oder Polypeptid oder biologisch aktives Teil davon binden oder seine Aktivität modulieren. Die erfindungsgemäßen Testverbindungen können unter Verwendung von einigen der zahlreichen fachbekannten Methoden in Verfahren mit kombinatorischen Bibliotheken erhalten werden, umfassend: biologische Bibliotheken; räumlich ansprechbare parallele Festphasen- oder Lösungsphasenbibliotheken; Verfahren mit synthetischen Bibliotheken, die Dekonvolution benötigen; das „one-bead one-compound"-Bibliothek-Verfahren und Verfahren mit synthetischen Bibliotheken, die Selektion durch Affinitätschromatographie verwenden. Die Methode mit biologischen Bibliotheken ist beschränkt auf Peptidbibliotheken, während die anderen vier Methoden auf Peptid-, Nicht-Peptid-Oligomer- oder Kleinmolekül-Bibliotheken von Verbindungen anwendbar sind (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145-167).
  • Beispiele für Verfahren zur Synthese molekularer Bibliotheken können in der Fachliteratur gefunden werden, zum Beispiel in: DeWitt et al. (1993) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6013; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678-2685; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew.
  • Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; und Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233-1251.
  • Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung vorliegen (z.B. Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), oder auf Kügelchen (Lam (1991) Nature 354:82-84), auf Chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), Bakterien (Ladner U.S.-Patent No. 5,223,409 ), Sporen (Ladner U.S.-Patent 5,223,409 ), Plasmiden (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) oder auf Phagen (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner U.S.-Patent 5,223,409 ).
  • In einer Ausführungsform ist ein Assay ein zellbasierter Assay, in welchem eine Zelle, die eine membrangebundene Form von BAFF-R-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon auf der Zelloberfläche exprimiert, mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird und die Fähigkeit der Testverbindung, an ein BAFF-R-Protein zu binden, bestimmt wird. Die Zelle kann z.B. von Säugetierursprung oder eine Hefezelle sein. Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, an BAFF-R-Protein zu binden, kann z.B. durch Kopplung der Testverbindung mit einem Radioisotop oder einer enzymatischen Markierung erreicht werden, so dass die Bindung der Testverbindung an BAFF-R-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon durch Detektion der markierten Verbindung in einem Komplex bestimmt werden kann. Zum Beispiel können Testverbindungen mit 125I, 35S, 14C oder 3H direkt oder indirekt markiert werden und die Radioisotope durch direktes Zählen von Radioemission oder durch Zählen von Szintillation detektiert werden. Alternativ können Testverbindungen durch z.B. Meerrettichperoxidase, alkaline Phosphatase oder Luziferase enzymatisch markiert werden, und die enzymatische Markierung durch die Bestimmung von Konversion eines geeigneten Substrats zum Produkt detektiert werden. In einer Ausführungsform umfasst der Assay die Kontaktierung einer eine membrangebundene Form von BAFF-R-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon exprimierenden Zelle auf der Zelloberfläche mit einer bekannten Verbindung, die ein BAFF-R-Protein bindet, um eine Assaymischung zu bilden, die Kontaktierung der Assaymischung mit einer Testverbindung und die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, mit einem BAFF-R-Protein zu interagieren, wobei die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, mit einem BAFF-R-Protein zu interagieren, die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung umfasst, bevorzugt an BAFF-R-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon zu binden, verglichen mit der bekannten Verbindung.
  • In einer anderen Ausführungsform ist ein Assay ein zellbasierter Assay, umfassend die Kontaktierung einer eine membrangebundene Form von BAFF-R-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon exprimierenden Zelle auf der Zelloberfläche mit einer Testverbindung und die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität des BAFF-R-Proteins oder eines biologisch aktiven Teils davon zu modulieren (z.B. stimulieren oder inhibieren). Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität von BAFF-R-Protein oder eine biologisch aktiven Teils davon zu modulieren, kann z.B. durch Bestimmung der Fähigkeit des BAFF-R-Proteins, ein BAFF-R-Zielmolekül zu binden oder damit zu interagieren, erreicht werden. Wie hierin verwendet ist ein „Zielmolekül" ein Molekül, an das/mit dem ein BAFF-R-Protein bindet oder in der Natur interagiert, z.B. ein Molekül auf der Oberfläche einer Zelle, die ein BAFF-R-Protein exprimiert, ein Molekül auf der Oberfläche einer zweiten Zelle, ein Molekül im extrazellulären Milieu, ein mit der inneren Oberfläche einer Zellmembran assoziiertes Molekül oder ein zytoplasmatisches Molekül. Ein BAFF-R-Zielmolekül kann ein nicht-BAFF-R-Molekül oder ein BAFF-R-Protein oder -Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung sein. In einer Ausführungsform ist ein BAFF-R-Zielmolekül eine Komponente eines Signaltransduktionsweges, der die Übertragung eines extrazellulären Signals (z.B. ein Signal, das durch Bindung einer Verbindung an ein membrangebundenes BAFF-R-Molekül generiert wird) über die Zellmembran und in die Zelle ermöglicht. Das Ziel kann z.B. ein zweites intrazelluläres Protein sein, das katalytische Aktivität aufweist, oder ein Protein, das die Assoziierung von nachgeordneten Signalmolekülen mit BAFF-R ermöglicht.
  • Die Bestimmung der Fähigkeit des BAFF-R-Proteins, an ein BAFF-R-Zielmolekül zu binden oder mit einem BAFF-R-Zielmolekül zu interagieren kann mit Hilfe eines oder mehrerer obenbeschriebener Verfahren zur Bestimmung direkter Bindung durchgeführt werden. In einer Ausführungsform kann Bestimmung der Fähigkeit des BAFF-R-Proteins, an ein/mit einem BAFF-R-Zielmolekül zu binden oder zu interagieren durch die Bestimmung der Aktivität des Zielmoleküls erreicht werden. Zum Beispiel kann die Aktivität des Zielmoleküls durch die Detektion der Induktion eines zellulären sekundären Botenstoffs des Ziels (z.B. intrazelluläres Ca2+, Diacylglycerol, IP3 usw.), die Detektion katalytischer/enzymatischer Aktivität des Ziels mit einem geeigneten Substrat, die Detektion der Induktion eines Reportergens (umfassend ein operativ an eine für einen nachweisbaren Marker, z.B. Luziferase, kodierende Nukleinsäure gebundenes BAFF-R-responsives regulatorisches Element) oder die Detektion einer zellulären Antwort, z.B. Zellüberleben, zelluläre Differenzierung oder Zellproliferation bestimmt werden.
  • In noch einer anderen Ausführungsform ist ein Assay gemäß der vorliegenden Erfindung ein zellfreier Assay, umfassend die Kontaktierung eines BAFF-R-Proteins oder eines biologischen aktiven Teils davon mit einer Testverbindung und die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, an das BAFF-R-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon zu binden. Bindung der Testverbindung an das BAFF-R-Protein kann entweder direkt oder indirekt bestimmt werden, wie oben beschrieben. In einer Ausführungsform umfasst der Assay die Kontaktierung des BAFF-R-Proteins oder biologisch aktiven Teils davon mit einer bekannten Verbindung, die BAFF-R bindet, um eine Assaymischung zu bilden, die Kontaktierung der Assaymischung mit einer Testverbindung und die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, mit einem BAFF-R-Protein zu interagieren, wobei die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, mit einem BAFF-R-Protein zu interagieren, die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, bevorzugt an BAFF-R oder einen biologisch aktiven Teil davon vorzugsweise zu binden umfasst, verglichen mit der bekannten Verbindung.
  • In einer anderen Ausführungsform ist ein Assay ein zellfreier Assay umfassend die Kontaktierung von BAFF-R-Protein oder eines biologisch aktiven Teils davon mit einer Testverbindung und die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität des BAFF-R-Proteins oder eines biologisch aktiven Teil davon zu modulieren (z.B. stimulieren oder inhibieren). Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität von BAFF-R zu modulieren, kann z.B. durch Bestimmung der Fähigkeit des BAFF-R-Proteins ein BAFF-R-Zielmolekül zu binden mit Hilfe eines der oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmmung von direkter Bindung erreicht werden. In einer alternativen Ausführungsform kann die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität von BAFF-R zu modulieren, durch die Bestimmung der Fähigkeit des BAFF-R-Proteins, weiterhin ein BAFF-R-Zielmolekül zu modulieren, erreicht werden. Zum Beispiel kann die katalytische/enzymatische Aktivität des Zielmoleküls auf einen entsprechenden Substrat wie vorher beschrieben bestimmt werden.
  • In noch einer anderen Ausführungsform umfasst der zellfreie Assay die Kontaktierung des BAFF-R-Proteins oder eines biologisch aktiven Teils davon mit einer bekannten Verbindung, die BAFF-R bindet, um eine Assaymischung zu bilden, die Kontaktierung der Assaymischung mit einer Testverbindung und die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, mit einem BAFF-R-Protein zu interagieren, wobei die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, mit einem BAFF-R-Protein zu interagieren, die Bestimmung der Fähigkeit des BAFF-R-Proteins umfasst, bevorzugt ein BAFF-R-Zielmolekül zu binden oder dessen Aktivität zu modulieren.
  • Die zellfreien Assays gemäß der vorliegenden Erfindung sind der Verwendung sowohl der flüssigen als auch der membrangebundenen Form von BAFF-R zugänglich. Im Falle von zellfreien Assays, umfassend die membrangebundene Form von BAFF-R, kann es erwünscht sein, ein Solubilisierungsmittel zu verwenden, so dass die membrangebundene Form von BAFF-R in Lösung bleibt. Beispiele für solche Solubilisierungsmittel umfassen nichtionische Detengentien wie n-Octylglucosid, n-Dodecylglucosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-Methylglucamid, Decanoyl-N-Methylglucamid, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, Isotridecypoly(ethylenglycolether)n, 3-(3-Cholamidopropyl)dimethylamminiol-1-propansulfonat (CHAPS), 3-(3-Cholamidopropyl)dimethylamminiol-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO) oder N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat.
  • In mehr als einer Ausführungsform der obigen Assayverfahren gemäß vorliegender Erfindung kann es erwünscht sein, entweder BAFF-R oder sein Zielmolekül zu immobilisieren, um die Trennung komplexierter von nichtkomplexierten Formen eines oder beider Proteine zu ermöglichen, sowie eine Automatisierung des Assays zu erreichen. Bindung einer Testverbindung an BAFF-R oder Interaktion von BAFF-R mit einem Zielmolekül in An- oder Abwesenheit einer Kandidatenverbindung kann in einem beliebigen Behälter durchgeführt werden, der zum Enthalten der Reagentien geeignet ist. Beispiele für solche Behälter umfassen Mikrotiterplatten, Reagenzgläser und Mikrozentrifugenröhrchen. In einer Ausführungsform kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die es einem oder beiden Proteinen erlaubt, an eine Matrix gebunden zu sein. Zum Beispiel können GST-BAFF-R-Fusionsproteine oder GST-Zielfusionsproteine auf Glutathion-Sepharose-Kügelchen (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierten Mikrotiterplatten absorbiert werden, die dann mit der Testverbindung oder der Testverbindung und entweder dem nichtabsorbierten Zielprotein oder dem BAFF-R-Protein kombiniert werden, und die Mischung wird unter Bedingungen inkubiert, die Komplexbildung begünstigen (z.B. unter physiologischen Bedingungen für Salz und pH). Nach der Inkubation werden die Kügelchen oder Mikrotiterplatten-wells gewaschen, um jegliche nichtgebundenen Komponenten zu entfernen, die Matrix wird im Falle von Kügelchen immobilisiert, Komplex entweder direkt oder indirekt bestimmt, z.B. wie oben beschrieben. Alternativ können die Komplexe von der Matrix dissoziiert sein und das Niveau der BAFF-R-Bindung oder -Aktivität unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt werden.
  • Andere Techniken zur Immobilisierung von Proteinen auf Matrices können ebenso in den Screening-Assays gemäß der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können entweder BAFF-R oder sein Zielmolekül immobilisiert werden unter Verwendung von Konjugation von Biotin und Streptavidin. Biotinyliertes BAFF-R oder Zielmoleküle können aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) unter Verwendung von fachbekannten Techniken hergestellt werden (z.B. Biotinylierungskit, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.) und in den Wells von streptavidinbeschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Alternativ können Antikörper, die mit BAFF-R oder Zielmolekülen reagieren, aber mit der Bindung des BAFF-R-Proteins an sein Zielmolekül nicht interferieren, in den Wells der Platte fixiert werden und nichtgebundene Ziele oder BAFF-R in den Wells duch Antikörperkonjugation gefangen werden. Verfahren zur Detektion solcher Komplexe umfassen zusätzlich zu solchen, die für die GST-immobilisierten Komplexe oben beschrieben sind, Immundetektion von Komplexen mittels Antikörpern, die mit dem BAFF-R oder Zielmolekül reagieren, sowie enzymgebundene Assays, die auf Detektion von mit dem BAFF-R oder Zielmolekül assoziierter enzymatischer Aktivität beruhen.
  • In einer anderen Ausführungsform werden Modulatoren von BAFF-R-Expression in einem Verfahren identifiziert, in dem eine Zelle mit einer Kandidatenverbindung kontaktiert und die Expression von BAFF-R-mRNA oder -Protein in der Zelle bestimmt wird. Das Expressionsniveau von BAFF-R-mRNA oder -Protein in Gegenwart der Kandidatenverbindung wird mit dem Expressionsniveau von BAFF-R-mRNA oder -Protein in Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen. Die Kandidatenverbindung kann dann als ein Modulator der BAFF-R-Expression auf Basis dieses Vergleichs identifiziert werden. Wenn zum Beispiel die Expression von BAFF-R-mRNA oder -Protein in Gegenwart der Kandidatenverbindung größer (statistisch signifikant größer) ist als in ihrer Abwesenheit, ist die Kandidatenverbindung als ein Stimulator von BAFF-R-mRNA- oder -Protein-Expression identifiziert.
  • Wenn alternativ die Expression von BAFF-R-mRNA oder -Protein in der Gegenwart der Kandidatenverbindung geringer (statistisch signifikant geringer) ist als in ihrer Abwesenheit, ist die Kandidatenverbindung als ein Inhibitor von BAFF-R-mRNA oder -Protein-Expression identifiziert. Das Niveau von BAFF-R-mRNA- oder -Protein-Expression in den Zellen kann mithilfe von Verfahren bestimmt werden, die hierin für die Detektion von BAFF-R-mRNA oder -Protein beschrieben sind.
  • In noch einem anderen Aspekt der Erfindung können die BAFF-R-Proteine als „Köderproteine" in einem Two-Hybrid-Assay oder Three-Tybrid-Assay (siehe z.B. U.S.-Patent No. 5,283,317 ; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696 und Brent WO 94/10300 ) verwendet werden, um andere Proteine zu identifizieren, die binden BAFF-R („BAFF-R-Bindungsproteine" oder „BAFF-R-bp") oder damit interagieren und die BAFF-R-Aktivität modulieren. Solche BAFF-R-Bindungsproteine sind auch wahrscheinlich an der Signalverbreitung durch die BAFF-R-Proteine beteiligt, wie zum Beispiel vor- oder nachgelagerten Elementen des BAFF-R-Signalweges.
  • Das Two-Hybrid-System beruht auf dem modularen Wesen der meisten Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen bestehen. Kurz gesagt, der Assay verwendet zwei verschiedene DNA-Konstrukte. In einem Konstrukt ist das für BAFF-R kodierende Gen fusioniert mit einem Gen, das die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors kodiert (z.B. GAL-4). In dem anderen Konstrukt ist eine DNA-Sequenz aus einer Bibliothek von DNA-Sequenzen, die ein nichtidentifiziertes Protein („Beute" oder „Probe") kodiert, mit einem Gen fusioniert, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert. Wenn das „Köder"- und das „Beute"-Protein in der Lage sind, in vivo zu interagieren, einen BAFF-R-abhängigen Komplex bildend, werden die DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors in unmittelbare Nähe gebracht. Diese Nähe erlaubt die Transkription eines Reportergens (z.B. LacZ), das mit einer transkriptionellen Regulationsstelle, die auf den Transkriptionsfaktor reagiert, operativ verbunden ist. Die Expression des Reportergens kann detektiert werden, und Zellkolonien, die den funktionalen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert werden und verwendet werden, um das klonierte Gen zu erhalten, das das mit BAFF-R interagierende Protein kodiert.
  • Diese Erfindung betrifft weiterhin neue Mittel, die mit Hilfe der oben beschriebenen Screening-Assays identifiziert wurden und Verwendungen davon für Behandlungen wie hierin beschrieben.
  • Detektionsassays
  • Teile oder Fragmente der hierin identifizierten DNA-Sequenzen (und die entsprechenden kompletten Gensequenzen) können auf zahlreiche Weisen als Polynukleotidreagentien verwendet werden. Zum Beispiel können diese Sequenzen verwendet werden, um: (i) deren jeweilige Gene auf einem Chromosom zu kartieren; und damit Genregionen zu lokalisieren, die mit genetischer Krankheit assoziiert sind; (ii) ein Individuum aus einer winzigen biologischen Probe zu identifizieren (Gewebetyping); und (iii) bei der forensischen Identifikation einer biologischen Probe zu helfen. Diese Anwendungen sind in den folgenden Unterkapiteln beschrieben.
  • Chromomenkartierung
  • Sobald die Sequenz (oder ein Teil der Sequenz) eines Gens isoliert wurde, kann diese Sequenz verwendet werden, um die Lokalisierung des Gens auf einem Chromosom zu kartieren. Dieser Prozess wird Chromosomenkartierung genannt. Entsprechend können Teile oder Fragmente der hierin beschriebenen BAFF-R-Sequenzen verwendet werden, um den Ort der BAFF-R-Gene auf einem Chromosom zu kartieren. Die Kartierung der BAFF-R-Sequenzen auf Chromosomen ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelierung dieser Sequenzen mit Genen, die mit Krankheit assoziiert sind.
  • Kurz gesagt, BAFF-R-Gene können auf Chromosomen durch die Herstellung von PCR-Primern (vorzugsweise von 15-25 bp Länge) aus den BAFF-R-Sequenzen kartiert werden. Eine Computeranalyse der BAFF-R-Sequenzen kann verwendet werden, um schnell Primer zu wählen, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA überspannen und damit den Amplifizierungsprozess komplizieren. Diese Primer können dann für das PCR-Screening von somatischen Zellhybriden verwendet werden, die individuelle Chromosomen einer bestimmten Spezies enthalten. Nur diese Hybriden, die das speziesspezifische Gen enthalten, das den BAFF-R-Sequenzen entspricht, werden ein amplifiziertes Fragment liefern.
  • Die PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden ist eine schnelle Prozedur zur Zuweisung einer bestimmten Sequenz zu einem bestimmten Chromosom. Drei oder mehr Sequenzen können pro Tag mit Hilfe eines einzigen Thermocyclers zugewiesen werden. Die BAFF-R-Sequenzen zum Entwurf von Oligonukleotidprimern verwendend, kann eine Sublokalisierung mit Sätzen von Fragmenten bestimmter Chromosomen erreicht werden.
  • Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) einer DNA-Sequenz an eine Metaphasenchromosomen-Spreizung kann ferner verwendet werden, um eine präzise chromosomale Ortsbestimmung in einem Schritt zu liefern. Chromosomen-Spreizungen können mit Hilfe von Zellen erzeugt werden, deren Teilung in der Metaphase durch eine Chemikalie wie Colcemid, die die mitotische Spindel zerreißt, blockiert wurde. Die Chromosomen können kurz mit Trypsin behandelt und dann mit Giemsa gefärbt werden. Ein Muster von hellen und dunklen Banden entwickelt sich auf jedem Chromosom, so dass die Chromosomen individuell identifiziert werden können. Die FISH-Technik kann mit einer bis zu 500 oder 600 Basen kurzen DNA-Sequenz verwendet werden. Klone größer als 1000 Basen haben jedoch eine höhere Wahrscheinlichkeit, an eine einzelne chromosomale Stelle mit ausreichender Signalintensität für einfache Detektion zu binden. Vorzugsweise 1000 Basen, und mehr vorzugsweise 2000 Basen werden ausreichen, um gute Ergebnisse in einem vernünftigen Zeitraum zu erhalten. Für einen Review dieser Technik siehe Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, N.Y., 1988.
  • Reagentien für die Chromosomen-Kartierung können individuell verwendet werden, um ein einzelnes Chromosom oder eine einzelne Stelle auf diesem Chromosom zu markieren, oder Sätze von Reagentien können verwendet werden, um eine Mehrzahl von Stellen und/oder eine Mehrzahl von Chromosomen zu markieren. Reagentien, die nichtkodierenden Regionen der Gene entsprechen, sind für Kartierungszwecke sogar bevorzugt. Kodierende Sequenzen sind wahrscheinlich innerhalb von Genfamilien konserviert, was daher die Möglichkeit einer Kreuzhybridisierung während der Chromosomenkartierung erhöht.
  • Sobald eine Sequenz einer präzisen chromosomalen Lokalisierung zugewiesen wurde, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit Genkartendaten korreliert werden. Solche Daten können z.B. in McKusick, MENDELIAN INHERITANCE IN MAN, online verfügbar durch die Johns Hopkins University Welch Medical Library, gefunden werden. Die Beziehung zwischen Genen und Krankheit, auf dieselbe chromosomale Region kartiert, kann dann durch Verknüpfungsanalyse identifiziert werden (gemeinsame Vererbung physikalisch benachbarter Gene), beschrieben in z.B. Egeland et al. (1987) Nature, 325:783-787.
  • Darüber hinaus können Unterschiede in den DNA-Sequenzen zwischen von einer mit einem BAFF-R-Gen assoziierten Krankheit betroffenen oder nicht betroffenen Individuen bestimmt werden. Wenn eine Mutation in einigen oder allen der betroffenen Individuen beobachtet wird, aber nicht in einem der nicht betroffenen Individuen, dann ist die Mutation wahrscheinlich der Verursacher der jeweiligen Krankheit. Der Vergleich von betroffenen und nicht betroffenen Individuen umfasst im allgemeinen, zuerst nach strukturellen Veränderungen in den Chromosomen zu suchen, wie Deletionen oder Translokationen, die in Chromosomen-Spreizungen sichtbar oder mit Hilfe von PCR basierend auf dieser DNA-Sequenz detektierbar sind. Letztlich kann eine komplette Sequenzierung von Genen mehrerer Individuen ausgeführt werden, um die Anwesenheit einer Mutation zu bestätigen und Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden.
  • Gewebetyping
  • Die BAFF-R-Sequenzen nach der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um Individuen aus winzigen biologischen Proben zu identifizieren. In dieser Technik wird die genomische DNA eines Individuums mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut und auf einem Southern Blot einer Sonde ausgesetzt, um einzelne Banden zur Identifizierung zu erhalten. Die Sequenzen nach der vorliegenden Erfindung sind als zusätzliche DNA-Marker für RFLP („Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen", beschrieben in U.S.-Patent Nr. 5,272,057 ) nützlich.
  • Ferner können die Sequenzen nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine alternative Technik zu liefern, die die eigentliche Base-für-Base-DNA-Sequenz von ausgewählten Teilen des Genoms eines Individuums bestimmt. Daher können die hierin beschriebenen BAFF-R-Sequenzen verwendet werden, um zwei PCR-Primer an den 5'- und 3'-Enden der Sequenzen herzustellen. Diese Primer können dann verwendet werden, um die DNA eines Individuums zu amplifizieren und danach zu sequenzieren.
  • Sätze von entsprechenden DNA-Sequenzen von Individuen, hergestellt auf diese Weise, können eindeutige individuelle Identifizierungen liefern, da jedes Individuum aufgrund von allelischen Unterschieden einen einzigartigen Satz von solchen DNA-Sequenzen haben wird. Die Sequenzen nach der vorliegenden Erfindung können zur Erlangung solcher Identifizierungssequenzen von Individuen und Gewebe verwendet werden. Die BAFF-R-Sequenzen nach der Erfindung stellen Teile des menschlichen Genoms auf einzigartige Weise dar. Allelische Variation kommt zu einem gewissen Grad in den kodierenden Regionen dieser Sequenzen vor, und zu einem höheren Grad in den nichtkodierenden Regionen. Es wird geschätzt, dass allelische Variation zwischen individuellen Menschen mit einer Frequenz von etwa einmal alle 500 Basen vorkommt. Die meisten allelischen Variationen bestehen aufgrund von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), die Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLPs) umfassen.
  • Jede der hierin beschriebenen Sequenzen kann zu einem gewissen Grad als Standard verwendet werden, gegen den DNA eines Individuums für Identifizierungszwecke verglichen werden kann. Da größere Zahlen von Polymorphismen in den nichtkodierende Regionen vorkommen, sind weniger Sequenzen nötig, um Individuen zu unterscheiden. Die nichtkodierenden Sequenzen von 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2B (SEQ ID NO:4), 3 (SEQ ID NO:6) können komfortabel eine positive individuelle Identifizierung mit einem Satz von vielleicht 10 bis 1000 Primern ermöglichen, von denen jeder eine nichtkodierende amplifizierte Sequenz von 100 Basen liefert. Wenn nach der Vorhersage kodierende Sequenzen wie jene in 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2B (SEQ ID NO:4), 3 (SEQ ID NO:6) verwendet werden, wäre eine geeignetere Anzahl von Primern für positive individuelle Identifizierung 500-2000.
  • Prädiktive Medizin
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Feld der prädiktiven Medizin, in der diagnostische Assays, prognostische Assays, Pharmakogenomik und das Monitoring von klinischen Studien für prognostische (prädiktive) Zwecke verwendet werden, um hiermit ein Individuum prophylaktisch zu behandeln. Entsprechend bezieht sich ein Aspekt der Erfindung auf diagnostische Assays zur Bestimmung von BAFF-R-Protein- und/oder -Nukleinsäureexpression sowie BAFF-R-Aktivität, im Kontext einer biologischen Probe (z.B. Blut, Serum, Zellen, Gewebe), um damit zu bestimmen, ob ein Individuum an einer Krankheit oder Störung leidet, oder ein Risiko trägt, eine Störung zu entwickeln, die mit anomaler BAFF-R-Expression oder -Aktivität assoziiert ist. Die Erfindung bietet auch prognostische (oder prädiktive) Assays zur Bestimmung, ob ein Individuum ein Risiko trägt, eine mit einem/r BAFF-R-Protein, -Nukleinsäure oder -Aktivität assoziierte Störung zu entwickeln. Zum Beispiel können Mutationen in einem BAFF-R-Gen in einer biologischen Probe analysiert werden. Solche Assays können für prognostische oder prädiktive Zwecke verwendet werden, um damit prophylaktisch ein Individuum schon vor dem Ausbruch einer Störung, die durch BAFF-R-Protein- oder -Nukleinsäure-Expression oder -Aktivität charakterisiert oder damit assoziiert ist.
  • In einem weiteren Aspekt werden Verfahren zur Bestimmung von BAFF-R-Protein, -Nukleinsäureexpression oder BAFF-R-Aktivität in einem Individuum beschrieben, um damit geeignete therapeutische oder prophylaktische Wirkstoffe für dieses Individuum zu wählen (hierin als „Pharmakogenomics" bezeichnet). Pharmakogenomics erlaubt die Selektion von Agenzien (z.B. Wirkstoffen) für therapeutische oder prophylaktische Behandlung eines Individuums basierend auf dem Gentyp des Individuums (z.B. dem Gentyp des untersuchten Individuums, um die Fähigkeit des Individuums, auf einen bestimmten Wirkstoff zu reagieren, zu bestimmen).
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Beobachtung des Einflusses der Agenzien (z.B. Wirkstoffe, Verbindungen) auf die Expressionsaktivität von BAFF-R in klinischen Studien.
  • Diese und andere Agenzien werden in den folgenden Abschnitten genauer beschrieben.
  • Diagnostische Assays
  • Ein exemplarisches Verfahren zur Detektion der An- oder Abwesenheit von BAFF-R in einer biologischen Probe umfasst die Beschaffung einer biologischen Probe aus einem Testsubjekt und das Kontaktieren der biologischen Probe mit einer Verbindung oder einem Wirkstoff BAFF-R-Protein oder -Nukleinsäure (z.B. mRNA, genomische DNA), die BAFF-R-Protein kodiert, detektieren kann, so dass die Anwesenheit von BAFF-R in der biologischen Probe detektiert wird. Ein Agens zur Detektion von BAFF-R-mRNA oder -genomischer DNA ist eine markierte Nukleinsäuresonde, die an BAFF-R-mRNA oder -genomische DNA hybridisieren kann. Die Nukleinsäuresonde kann z.B. eine Volllängen-BAFF-R-Nukleinsäure sein, wie die Nukleinsäuren nach einer von 1A (SEQ ID NO:1), 1B (SEQ ID NO:2), 2A (SEQ ID NO:3), 2C (SEQ ID NO:4) und 3 (SEQ ID NO:6) oder eines Teils davon, wie ein Oligonukleotid von mindestens 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotiden Länge und ausreichend, um spezifisch unter stringenten Bedingungen an BAFF-R-mRNA oder -genomische DNA zu hybridisieren. Weitere geeignete Sonden zur Verwendung in den diagnostischen Assays nach der Erfindung werden hierin beschrieben.
  • Ein Agens zur Detektion von BAFF-R-Protein ist ein Antikörper, der an BAFF-R-Protein binden kann, vorzugsweise ein Antikörper mit einem detektierbaren Marker. Antikörper können polyklonal oder mehr vorzugsweise monoklonal sein. Ein intakter Antikörper, oder ein Fragment davon (z.B. Fab oder F(ab')2) kann verwendet werden. Der Begriff „markiert" soll in Bezug auf die Sonde oder den Antikörper das direkte Markieren der Sonde oder des Antikörpers durch Koppeln (z.B. physikalisches Verknüpfen) einer detektierbaren Substanz an die Sonde oder den Antikörper, sowie das indirekte Markieren der Sonde oder des Antikörpers durch Reaktivität mit einem anderen Reagenz, das direkt markiert ist, umfassen. Beispiele indirekter Markierung umfassen die Detektion eines primären Anitkörpers mit Hilfe eines fluoreszent markierten Sekundär-Antikörpers und das End-Markieren einer DNA-Sonde mit Biotin, so dass sie mit fluoreszent markiertem Streptavidin detektiert werden kann. Der Begriff „biologische Probe" soll aus einem Subjekt isolierte Gewebe, Zellen und biologische Flüssigkeiten umfassen, sowie in einem Subjekt vorhandene Gewebe, Zellen und biologische Flüssigkeiten. Das heißt, das Detektionsverfahren nach der Erfindung kann verwendet werden, um BAFF-R-mRNA, -Protein oder -genomische DNA in einer biologischen Probe in vitro sowie in vivo zu detektieren. Zum Beispiel umfassen in-vitro-Techniken zur Detektion von BAFF-R-mRNA Northern-Hybridisierungen und in situ-Hybridisierungen. In vitro-Techniken zur Detektion von BAFF-R-Protein umfassen enzymgebundene Immunosorbens-Assays (ELISAs), Western Blots, Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenz. In vitro-Techniken zur Detektion von BAFF-R-genomischer DNA umfassen Southern-Hybridisierungen. Ferner umfassen in-vivo-Techniken zur Detektion von BAFF-R-Protein das Einbringen eines markierten anti-BAFF-R-Antikörpers in ein Subjekt. Zum Beispiel kann der Antikörper mit einem radioaktiven Marker markiert werden, dessen Anwesenheit und Ort in einem Subjekt mit Standard-Imaging-Techniken detektiert werden kann.
  • In einer Ausführungsform enthält die biologische Probe Proteinmoleküle aus dem Testsubjekt. Alternativ kann die biologische Probe mRNA-Moleküle aus dem Testsubjekt oder genomische DNA-Moleküle aus dem Testsubjekt enthalten. Eine bevorzugte biologische Probe ist eine Leukozytenprobe aus peripherem Blut, isoliert mit konventionellen Mitteln aus einem Subjekt.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Verfahren ferner das Beschaffen einer biologischen Kontrollprobe aus einem Kontrollsubjekt, das Kontaktieren der Kontrollprobe mit einer Verbindung oder einem Agens, das BAFF-R-Protein, -mRNA oder -genomische DNA detektieren kann, so dass die Anwesenheit von BAFF-R-Protein, -mRNA oder -genomische DNA in der biologischen Probe detektiert wird, und das Vergleichen der Anwesenheit von BAFF-R-Protein, -mRNA oder -genomischer DNA in der Kontrollprobe mit der Anwesenheit von BAFF-R-Protein, -mRNA oder -genomischer DNA in der Testprobe.
  • Die Erfindung umfasst auch Kits zur Detektion der Anwesenheit von BAFF-R in einer biologischen Probe. Zum Beispiel kann das Kit umfassen: eine markierte Verbindung oder ein Agens, das BAFF-R-Protein oder -mRNA in einer biologischen Probe detektieren kann; Mittel zur Bestimmung der Menge an BAFF-R in der Probe; und Mittel zum Vergleichen der Menge an BAFF-R in der Probe mit einem Standard. Die Verbindung oder das Agens kann in einen geeigneten Behälter verpackt werden. Das Kit kann ferner Anweisungen zur Verwendung des Kits zur Detektion des/r BAFF-R-Proteins oder -Nukleinsäure umfassen.
  • Prognostische Assays
  • Die hierin beschriebenen diagnostischen Verfahren können ferner zur Identifizierung von Subjekten verwendet werden, die eine Krankheit oder Störung haben, die mit anomaler BAFF-R-Expression oder -Aktivität assoziiert ist, oder ein Risiko tragen, eine solche zu entwickeln. Zum Beispiel können die hierin beschriebenen Assays, wie die vorhergehenden diagnostischen Assays oder die folgenden Assays, verwendet werden, um ein Subjekt zu identifizieren, das eine Krankheit oder Störung hat, die mit anomaler BAFF-R-Protein, -Nukleinsäure-Expression oder -Aktivität in z.B. Autoimmunzuständen wie autoimmuner hämolytischer Anämie und systemischem Lupus erythematodes assoziiert ist, oder ein Risiko trägt, eine solche zu entwickeln. Alternativ können die prognostischen Assays verwendet werden, um ein Subjekt zu identifizieren, das eine Krankheit oder Störung hat oder ein Risiko trägt, eine solche zu entwickeln. Daher beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation einer Krankheit oder Störung, die mit anomaler BAFF-R-Expression oder -Aktivität assoziiert ist, wobei eine Testprobe von einem Subjekt beschafft wird und BAFF-R-Protein oder -Nukleinsäure (z.B. mRNA, genomische DNA) detektiert wird, wobei die Anwesenheit von BAFF-R-Protein oder -Nukleinsäure diagnostisch ist dafür, dass ein Subjekt eine Krankheit oder Störung hat, die mit anomaler BAFF-R-Expression oder -Aktivität assoziiert ist, oder ein Risiko trägt, eine solche zu entwickeln. Wie hierin verwendet, bezieht sich „Testprobe" auf eine biologische Probe, die von einem interessierenden Subjekt beschafft wurde. Zum Beispiel kann eine Testprobe eine biologische Flüssigkeit (z.B. Serum), Zellprobe oder Gewebe sein.
  • Ferner können die hierin beschriebenen prognostischen Assays verwendet werden, um zu bestimmen, ob einem Subjekt ein Agens verabreicht werden kann (z.B. ein Agonist, Antagonist, Peptidomimetikum, Protein, Peptid, Nukleinsäure, Kleinmolekül oder ein anderer Wirkstoffkandidat), um eine Krankheit oder Störung zu behandeln, die mit anomaler BAFF-R-Expression oder -Aktivität assoziiert ist. Zum Beispiel können solche Verfahren verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Subjekt effizient mit einem Wirkstoff auf eine Störung hin behandelt werden kann. Daher beschreibt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Bestimmung, ob ein Subjekt wirksam mit einem Agens auf eine Störung, die mit anomaler BAFF-R-Expression oder -Aktivität assoziiert ist, behandelt werden kann, wobei eine Testprobe beschafft und BAFF-R-Protein oder -Nukleinsäure detektiert wird (z.B. wobei die Anwesenheit von BAFF-R-Protein oder -Nukleinsäure diagnostisch ist dafür, dass einem Subjekt das Agens verabreicht werden kann, um eine mit anomaler BAFF-R-Expression oder -Aktivität assoziierte Störung zu behandeln).
  • Die Verfahren nach der Erfindung können auch verwendet werden, um genetische Läsionen in einem BAFF-R-Gen zu detektieren, womit bestimmt wird, ob ein Subjekt mit dem lädierten Gen ein Risiko für eine tumorigene oder autoimmune Störung trägt, oder daran leidet. In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die Verfahren das Detektieren der An- oder Abwesenheit einer genetischen Läsion in einer Zell-Probe eines Subjekts, die durch mindestens eine Veränderung, die die Integrität eines ein BAFF-R-Protein kodierenden Gens beeinflusst, oder falsche Expression des BAFF-R-Gens charakterisiert ist. Zum Beispiel können solche genetischen Läsionen durch das Bestimmen der Existenz von mindestens einem von (1) einer Deletion eines oder mehrerer Nukleotide eines BAFF-R-Gens; (2) einer Addition eines oder mehrerer Nukleotide zu einem BAFF-R-Gen; (3) einer Substitution eines oder mehrerer Nukleotide eines BAFF-R-Gens; (4) einer chromosomalen Umordnung eines BAFF-R-Gens; (5) einer Veränderung im Niveau eines mRNA-Transkripts eines BAFF-R-Gens; (6) anomaler Modifikation eines BAFF-R-Gens, wie des Methylierungsmusters der genomischen DNA; (7) der Anwesenheit eines Nicht-Wildtyp-Spleißmusters eines mRNA-Transkripts eines BAFF-R-Gens; (8) einem Nicht-Wildtyp-Niveau einer BAFF-R-Proteins; (9) allelischem Verlust eines BAFF-R-Gens; und (10) ungeeigneter posttranslationaler Modifikation eines BAFF-R-Proteins detektiert werden. Wie hierin beschrieben, ist eine Vielzahl von Assaytechniken im Fach bekannt, die zur Detektion von Läsionen in einem BAFF-R-Gen verwendet werden können. Eine bevorzugte biologische Probe ist eine Leukozytenprobe der peripheren Bluts, die mit konventionellen Mitteln aus einem Subjekt isoliert wurde. Es kann jedoch jede biologische Probe, die Zellen mit Zellkern enthält, verwendet werden, umfassend zum Beispiel Wangenschleimhautzellen.
  • In gewissen Ausführungsformen umfasst die Detektion der Läsion die Verwendung einer Sonde/eines Primers in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe z.B. U.S.-Patente Nrn. 4,683,195 und 4,683,202 ), wie Anker-PCR or RACE-PCR, oder alternativ in einer Ligationskettenreaktion (LCR) (siehe z.B. Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; und Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364), wobei letztere besonders nützlich für die Detektion von Punktmutationen im BAFF-R-Gen sein kann (siehe Abravaya etal. (1995) Nucl. Acids Res. 23:675-682). Dieses Verfahren kann die Schritte des Sammelns einer Probe von Zellen eines Patienten, das Isolieren von Nukleinsäure (z.B. genomische, mRNA oder beide) aus der Zellprobe, das Kontaktieren der Nukleinsäureprobe mit einem oder mehreren Primern, die spezifisch an ein BAFF-R-Gen unter solchen Bedingungen hybridisieren, dass Hybridisierung und Amplifizierung des BAFF-R-Gens (falls vorhanden) stattfindet, und das Detektieren der An- oder Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts, oder das Detektieren der Größe des Amplifikationsprodukts und das Vergleichen der Länge mit einer Kontrollprobe umfassen. Es wird vorhergesagt, dass PCR und/oder LCR als vorläufiger Amplifikationsschritt erwünscht sein können, in Verbindung mit einer der Techniken, die zur Detektion der hierin beschriebenen Mutationen verwendet werden.
  • Alternative Amplifikationsverfahren umfassen: „Self-sustained sequence replication" (Guatelli et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), Transkriptionales Amplifikationssystem (Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta-Replikase (Lizardi et al.
  • (1988) BioTechnology 6:1197), oder jede weitere Nukleinsäure-Amplifikationsmethode, gefolgt von der Detektion der amplifizierten Moleküle mit Hilfe von Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Diese Detektionsschemata sind besonders nützlich für die Detektion von Nukleinsäuremolekülen, wenn solche Moleküle in sehr niedriger Zahl vorhanden sind.
  • In einer alternativen Ausführungsform können Mutationen in einem BAFF-R-Gen aus einer Probenzelle durch Veränderungen in Restriktionsenzym-Spaltmustem identifiziert werden. Zum Beispiel wird Proben- und Kontroll-DNA isoliert, amplifiziert (optional), mit einem oder mehreren Restriktions-Endonukleasen verdaut, und die Fragmentlängen durch Gelelektrophorese bestimmt und verglichen. Unterschiede in den Fragmentlängengrößen zwischen Proben- und Kontroll-DNA deuten auf Mutationen in der Proben-DNA hin. Darüber hinaus kann die Verwendung von sequenzspezifischen Ribozymen (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,493,531 ) verwendet werden, um die Anwesenheit von spezifischen Mutationen durch Entstehung oder Verlust einer Ribozym-Spaltstelle zu bestimmen.
  • In weiteren Ausführungsformen können genetische Mutationen in BAFF-R durch Hybridisieren von Proben- und Kontroll-Nukleinsäuren, z.B. DNA oder RNA, an Hochdichte-Arrays, die Hunderte oder Tausende Oligonukleotidsonden enthalten, identifiziert werden (Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244-255; Kozal et al. (1996) Nature Med. 2:753-759). Zum Beispiel können genetische Mutationen in BAFF-R in zweidimensionalen Matrices identifiziert werden, die lichterzeugte DNA-Sonden enthalten, wie in Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244-255 beschrieben. Kurz gesagt, eine erste Hybridisierungsreihe von Sonden kann verwendet werden, um lange Abschnitte von DNA in einer Probe und der Kontrolle abzutasten, um Basenänderungen zwischen den Sequenzen durch Erzeugen linearer Reihen von in der Sequenz überlappenden Sonden zu identifizieren. Dieser Schritt erlaubt die Identifizierung von Punktmutationen. Dieser Schritt wird gefolgt von einer zweiten Hybridisierungsreihe, der die Charakterisierung von speziellen Mutationen durch Verwendung kleiner, spezialisierter Sondensätze, die komplementär zu allen detektierten Varianten oder Mutationen sind, erlaubt. Jede Mutationsmatrix setzt sich aus parallelen Sondensätzen zusammen, einer komplementär zum Wildtyp-Gen, und der andere komplementär zum mutierten Gen.
  • In noch einer anderen Ausführungsform kann eine Vielzahl von fachbekannten Sequenzierreaktionen verwendet werden, um das BAFF-R-Gen direkt zu sequenzieren und Mutationen durch Vergleich der Sequenz des Proben-BAFF-R mit der korrespondierenden Wildtyp (Kontroll)-Sequenz zu detektieren. Beispiele von Sequenzierreaktionen umfassen jene, die auf Techniken basieren, die von Maxim and Gilbert (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560 oder Sanger (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 entwickelt wurden. Es wird auch erwogen, dass jede einer Vielzahl von automatisierten Sequenziermethoden verwendet werden kann, wenn die diagnostischen Assays durchgeführt werden (Naeve et al. (1995) Biotechniques 19:448), umfassend das Sequenzieren durch Massenspektrometrie (siehe z.B. PCT Internationale Publikation Nr. WO 94/16101 ; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; und Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159).
  • Weitere Verfahren zur Detektion von Mutationen im BAFF-R-Gen umfassen Verfahren, in denen der Schutz vor Spaltagentien verwendet wird, um fehlgepaarte Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Heteroduplexen zu detektieren (Myers et al. (1985) Science 230:1242). Im allgemeinen beginnt die fachbekannte Technik der „Fehlpaarungsspaltung" durch das Zurverfügungstellen von Heteroduplexen, die durch Hybridisieren von (markierter) RNA oder DNA, die die Wildtyp-BAFF-R-Sequenz enthält, mit potentiell mutanter RNA oder DNA, die aus einer Gewebeprobe erhalten wurde, entstanden sind. Die doppelsträngigen Duplexe werden mit einem Agens behandelt, das einzelsträngige Bereiche der Doppelhelix spaltet, die wegen Basenpaarfehlpaarungen zwischen den Kontroll- und Probensträngen existieren werden. Zum Beispiel können RNA/DNA-Duplexe mit RNAse behandelt werden und DNA/DNA-Hybride mit S1-Nuklease behandelt werden, um die fehlgepaarten Regionen enzymatisch zu verdauen. In weiteren Ausführungsformen können sowohl DNA/DNA- als auch RNA/DNA-Duplexe mit Hydroxylamin oder Osmiumtetroxid und mit Piperidin beahndelt werden, um fehlgepaarte Regionen zu verdauen. Nach Verdau der fehlgepaarten Regionen wird das entstandene Material dann nach Größe auf denaturierenden Polyacrylamidgelen aufgetrennt, um die Mutationsstelle zu bestimmen. Siehe z.B. Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. In einer Ausführungsform kann die Kontroll-DNA oder -RNA für die Detektion markiert werden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform verwendet die Fehlpaarungs-Spaltungsrekation eines oder mehrere Proteine, die fehlgepaarte Basenpaare in doppelsträngiger DNA (sogenannte „DNA-Fehlpaarungs-Reparatur"-Enzyme) in definierten Systemen für die Detektion und Kartierung von Punktmutationen in BAFF-R-cDNAs erkennen, die aus Zellproben erhalten wurde. Zum Beispiel spaltet das mutY-Enzym von E.coli A bei G/A-Fehlpaarungen, und die Thymidin-DNA-Glycosylase aus HeLa-Zellen spaltet T bei G/T-Fehlpaarungen (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). Gemäß einer Beispielsausführungsform wird eine auf einer BAFF-R-Sequenz basierende Sonde, z.B. eine Wildtyp-BAFF-R-Sequenz mit einer cDNA oder einem anderen DNA-Produkt aus (einer) Testzelle(n) hybridisiert. Die Doppelhelix wird mit einem DNA-Fehlpaarungs-Reparaturenzym behandelt, und die Spaltprodukte, wenn vorhanden, können mit Hilfe Elektrophoreseprotokollen oder ähnlichem detektiert werden. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,449,039 .
  • In weiteren Ausführungsformen werden Veränderungen in der elektrophoretischen Mobilität verwendet, um Mutationen in BAFF-R-Genen zu identifizieren. Zum Beispiel kann Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP) verwendet werden, um Unterschiede in der elektrophoretischen Mobilität zwischen mutanten und Wildtyp-Nukleinsäuren zu detektieren (Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766, siehe auch Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144; Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79). Einzelsträngige DNA-Fragmente der Proben- und Kontroll-BAFF-R-Nukleinsäuren werden denaturiert, und es wird ihnen erlaubt zu renaturieren. Die Sekundärstruktur von einzelsträngigen Nukleinsäuren variiert je nach Sequenz, die sich ergebende Veränderung in der elektrophoretischen Mobilität ermöglicht die Detektion sogar von einzelnen Basenänderungen. Die DNA-Fragmente können markiert oder mit markierten Sonden detektiert werden. Die Sensitivität des Assays kann durch Verwendung von RNA, in der die Sekundärstruktur sensitiver für eine Sequenzveränderung ist, erhöht werden (statt DNA). In einer Ausführungsform verwendet das Subjektverfahren Heteroduplexanalyse, um doppelsträngige Heteroduplexmoleküle auf Basis von Veränderungen in der elektrophoretischen Mobilität zu trennen (Keen et al. (1991) Trends Genet. 7:5).
  • In noch einer weiteren Ausführungsform wird die Bewegung von mutierten oder Wildtyp-Fragmenten mit Hilfe denaturierender Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495) untersucht. Wenn DGGE als Analysemethode verwendet wird, wird die DNA modifiziert, um sicherzustellen, dass sie nicht komplett denaturiert, z.B. durch Zugabe einer GC-Klammer von etwa 40 bp hochschmelzender GC-reicher DNA durch PCR. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Temperaturgradient statt eines denaturierenden Gradienten verwendet, um Unterschiede in der Mobilität von Kontroll- und Proben-DNA zu identifizieren (Rosenbaum und Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:12753).
  • Beispiele anderer Techniken zur Detektion von Punktmutationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf selektive Oligonukleotidhybridisation, selektive Amplifikation, oder selektive Primerverlängerung. Zum Beispiel können Oligonukleotidprimer hergestellt werden, in denen die bekannte Mutation zentral plaziert wird und dann an Ziel-DNA unter Bedingungen hybridisiert werden, die Hybridisierung nur erlauben, wenn eine perfekte Paarung gefunden wird (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230). Solch allelspezifische Oligonukleotide werden an PCR-amplifizierte Ziel-DNA hybridisiert, oder eine Anzahl verschiedener Mutationen, wenn die Oligonukleotide an die hybridisierende Membran angebracht sind, und mit markierter Ziel-DNA hybridisiert.
  • Alternativ kann allelspezifische Amplifikationstechnologie, die von selektiver PCR-Amplifikation abhängt, im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Oligonukleotide, die als Primer für spezifische Amplifikation verwendet werden, können die interessierende Mutation im Zentrum des Moleküls (so dass die Amplifikation von differentieller Hybridisierung abhängt) (Gibbs et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:2437-2448), oder am äußersten 3'-Ende einer Primers enthalten, wo unter geeigneten Bedingungen eine Fehlpaarung Polymeraseverlängerung verhindern oder vermindern kann (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Des weiteren kann es erwünscht sein, eine neue Restriktionsstelle in der Region der Mutation einzuführen, um spaltungsbasierte Detektion zu ermöglichen (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell. Probes 6:1). Es wird vorhergesagt, dass in gewissen Ausführungsformen die Amplifikation auch mit Hilfe von Taq-Ligase für die Amplifikation durchgeführt werden kann (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189). In solchen Fällen wird die Ligation nur stattfinden, wenn es eine perfekte Paarung am 3'-Ende der 5'-Sequenz gibt, was ermöglicht, die Anwesenheit einer bekannten Mutation an einer spezifischen Stelle durch die Suche nach der An- oder Abwesenheit von Amplifikation zu detektieren.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren können z.B. durch Verwendung vorverpackter diagnostischer Kits ausgeführt werden, die mindestens ein hierin beschriebenes Sonden-Nukleinsäure- oder Antikörperreagenz umfassen, die komfortabel verwendet werden können, z.B. in klinischen Situationen, um Patienten zu diagnostizieren, die Symptome oder eine Familiengeschichte einer Krankheit oder Erkrankung aufweisen, die mit einem BAFF-R-Gen zu tun hat.
  • Ferner kann jeder/s Zelltyp oder Gewebe, in dem BAFF-R exprimiert wird, in den hierin beschriebenen prognostischen Assays verwendet werden. Es kann jedoch jede biologische Probe verwendet werden, die Zellen mit Zellkern enthält, umfassend z.B. Wangenschleimhautzellen.
  • Pharmakogenomics
  • Agenzien oder Modulatoren, die eine stimulatorische oder inhibitorische Wirkung auf die BAFF-R-Aktivität (z.B. BAFF-R-Genexpression) haben, wie durch einen hierin beschriebenen Screening-Assay identifiziert, können an Individuen verabreicht werden, um Störungen (z.B. krebsbezogene oder autoimmune Störungen) (prophylaktisch oder therapeutisch) zu behandeln. In Verbindung mit solcher Behandlung können die Pharmakogenomics (d.h. die Untersuchung der Beziehung zwischen dem Gentyp eines Individuums und der Antwort dieses Individuums auf eine(n) fremde Verbindung oder Wirkstoff) dieses Individuums berücksichtigt werden. Unterschiede im Metabolismus von Therapeutika können zu schwerer Toxizität oder therapeutischem Versagen durch die Veränderung der Beziehung zwischen Dosis und Blutkonzentration des pharmakologisch aktiven Wirkstoffs führen. Daher erlauben die Pharmakogenomics des Individuums die Wahl von wirksamen Agentien (z.B. Wirkstoffen) für prophylaktische oder therapeutische Behandlungen basierend auf einer Berücksichtigung des Gentyps des Individuums. Solche Pharmakogenomics können ferner zur Bestimmung von geeigneten Dosierungen und Therapieschemata verwendet werden. Entsprechend kann die Aktivität des BAFF-R-Proteins, die Expression von BAFF-R-Nukleinsäure oder der Mutationsgehalt von BAFF-R-Genen in einem Individuum bestimmt werden, um damit geeignete Agenzien für therapeutische oder prophylaktische Behandlung des Individuums zu wählen.
  • Pharmakogenomics beschäftigen sich mit klinisch signifikanten ererbten Variationen in der Antwort auf Wirkstoffe aufgrund veränderter Wirkstoffverteilung und anomaler Wirkung in betroffenen Personen. Siehe z.B. Eichelbaum (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23:983-985 und Linder (1997) Clin. Chem. 43:254-266. Im allgemeinen können zwei Typen pharmakogenetischer Zustände unterschieden werden. Genetische Zustände, die als einzelner Faktor übertragen werden und die Art verändern, in der die Wirkstoffe auf den Körper wirken (veränderte Wirkstoffwirkung), oder genetische Zustände, die als einzelne Faktoren übertragen werden und die Art verändern, in der der Körper auf Wirkstoffe wirkt (veränderter Wirkstoffmetabolismus). Diese pharmakogenetischen Zustände können entweder als seltene Defekte oder als Polymorphismen vorkommen. Zum Beispiel ist Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD)-Defizienz eine übliche ererbte Enzymopathie, in der die klinische Hauptkomplikation Hämolyse nach Aufnahme von oxidierenden Wirkstoffen (Antimalaria-Stoffe, Sulfonamide, Analgetika, Nitrofurane) und Verzehr von Puffbohnen ist.
  • Als veranschaulichende Ausführungsform ist die Aktivität von wirkstoffmetabolisierenden Enzymen eine Hauptdeterminante sowohl der Intensität als auch der Dauer der Wirkstoffwirkung. Die Entdeckung von genetischen Polymorphismen wirkstoffmetabolisierender Enzyme (z.B. N-Acetyltransferase 2 (NAT 2) und Cytochrom-P450-Enzyme CYP2D6 und CYP2C19) hat eine Erklärung dafür geliefert, warum einige Patienten die erwarteten Wirkstoffwirkungen nicht erreichen oder ausufernde Wirkstoffantwort und schwere Toxizität nach Einnahme der sicheren Standarddosis eines Wirkstoffs zeigen. Diese Polymorphismen drücken sich in zwei Phänotypen der Population aus, dem starken Metabolisierer (EM) und dem schwachen Metabolisierer (PM). Die Verbreitung von PM unterscheidet sich zwischen den verschiedenen Populationen. Zum Beispiel ist das Gen, das für CYP2D6 kodiert, hochpolymorph, und mehrere Mutationen wurden in PM identifiziert, die alle zur Abwesenheit funktionellen CYP2D6' führen. Schwache Metabolisierer von CYP2D6 und CYP2C19 erfahren ziemlich oft ausufernde Wirkstoffantwort und Nebeneffekte, wenn sie die Standarddosen erhalten. Wenn ein Metabolit der aktive therapeutische Stoff ist, zeigen PM keine therapeutische Antwort, wie für den analgetischen Effekt von Codein gezeigt, der durch seinen durch CYP2D6 gebildeten Metaboliten Morphin vermittelt wird. Das andere Extrem sind die sogenannten ultraschnellen Metabolisierer, die nicht auf Standarddosen antworten. Kürzlich wurde die molekulare Basis von ultraschnellem Metabolismus als auf CYP2D6-Genamplifikation basierend identifiziert.
  • Daher kann die Aktivität von BAFF-R-Protein, die Expression von BAFF-R-Nukleinsäure oder der Mutationsgehalt von BAFF-R-Genen in einem Individuum bestimmt werden, um dadurch geeignete Agentien für therapeutische oder prophylaktische Behandlung des Individuums zu wählen. Des weiteren können pharmakogenetische Studien verwendet werden, um das Genotyping von polymorphen Allelen, die wirkstoffmetabolisierende Enzyme kodieren, auf die Identifizierung des Wirkstoffresponsivitäts-Phänotyps des Individuums anzuwenden. Dieses Wissen, wenn auf die Dosierung oder Wirkstoffwahl angewendet, kann nachteilige Reaktionen oder therapeutisches Versagen verhindern, und damit die therapeutische oder prophylaktische Effizienz steigern, wenn ein Subjekt mit einem BAFF-R-Modulator behandelt wird, wie einem Modulator, der durch einen der hierin beschriebenen beispielhaft genannten Screening-Assays identifiziert wurde.
  • Überwachen klinischer Wirksamkeit
  • Das Überwachen des Einflusses von Agentien (z.B. Wirkstoffen, Verbindungen) auf die Expression oder Aktivität von BAFF-R (z.B. die Fähigkeit, anomale Zellproliferation und/oder -differenzierung zu modulieren) kann nicht nur in einfachem Wirkstoffscreening, sondern auch in klinischen Studien angewendet werden. Zum Beispiel kann die Wirksamkeit eines Agens, die/das BAFF-R-Genexpression oder -Proteinniveaus zu steigern oder die BAFF-R-Aktivität hinaufzuregulieren, die durch einen hierin beschriebenen Screening-Assay bestimmt wurde, in klinischen Studien an Subjekten, die erniedrigte BAFF-R-Genexpression oder -Proteinniveaus oder herunterregulierte BAFF-R-Aktivität zeigen, überwacht werden. Alternativ kann die Wirksamkeit eines Agens, die/das BAFF-R-Genexpression oder -Proteinniveaus zu erniedrigen oder die BAFF-R-Aktivität herunterzuregulieren, die durch einen hierin beschriebenen Screening-Assay bestimmt wurde, in klinischen Studien von Subjekten, die erhöhte BAFF-R-Genexpression oder -Proteinniveaus oder hinaufregulierte BAFF-R-Aktivität zeigen, überwacht werden. In solchen klinischen Studien können die Expression oder Aktivität von BAFF-R und, vorzugsweise, anderen Genen, die mit z.B. einer Störung in Verbindung gebracht wurden, als „Ablesung" oder Marker der Immunresponsivität einer bestimmten Zelle verwendet werden.
  • Zum Beispiel können Gene, umfassend BAFF-R, die in Zellen durch Behandlung mit einem Agens moduliert werden (z.B. Verbindung, Wirkstoff oder Kleinmolekül), das die BAFF-R-Aktivität moduliert (z.B. in einem Screening-Assay wie hierin beschrieben identifiziert), identifiziert werden. Daher können Zellen, um den Effekt von Agentien auf Zellproliferationsstörungen z.B. in einer klinischen Studie zu studieren, isoliert werden und RNA präpariert und auf die Expressionsniveaus von BAFF-R und anderen in die Störung verwickelten Genen untersucht werden. Die Genexpressionsniveaus (d.h., ein Genexpressionsmuster) können durch Northern Blot-Analyse oder RT-PCR, wie hierin beschrieben, oder alternativ durch Messung der Menge produzierten Proteins durch eines der hierin beschriebenen Verfahren, oder durch Messung der Aktivitätsniveaus von BAFF-R oder anderen Genen quantifiziert werden. Auf diese Weise kann das Genexpressionsmuster als Marker dienen, indem es die physiologische Antwort der Zellen auf das Agens anzeigt. Entsprechend kann dieser Antwortzustand vor und an verschiedenen Punkten während der Behandlung des Individuums mit dem Agens bestimmt werden.
  • In einer Ausführungsform bietet die Erfindung ein Verfahren zur Überwachung der Wirksamkeit der Behandlung eines Subjekts mit einem Agens (z.B. einem Agonisten, Antagonisten, Protein, Peptid, Peptidomimetikum, einer Nukleinsäure, einem Kleinmolekül oder anderem Wirkstoffkandidaten, der durch die hierin beschriebenen Screening-Assays identifiziert wurde), umfassend die Schritte (i) des Beschaffens einer Vor-Verabreichungsprobe aus einem Subjekt vor der Verabreichung des Agens; (ii) des Detektierens des Expressionsniveaus eines/r BAFF-R-Proteins, -mRNA, oder -genomischen DNA in der Vor-Verabreichungsprobe; (iii) des Beschaffens einer oder mehrerer Nach-Verabreichungsproben aus dem Subjekt; (iv) des Detektierens des Expressionsniveaus oder der Aktivität des/r BAFF-R-Proteins, -mRNA oder -genomischen DNA in den Nach-Verabreichungsproben; (v) des Vergleichens des Expressionsniveaus oder der Aktivität des/r BAFF-R-Proteins, -mRNA oder -genomischen DNA in der Vor-Verabreichungsprobe mit dem/r BAFF-R-Protein, -mRNA oder -genomischen DNA in der/n Nach-Verabreichungsprobe(n); und (vi) der entsprechenden Veränderung der Verabreichung des Agens an das Subjekt. Zum Beispiel kann eine erhöhte Verabreichung des Agens erwünscht sein, um die Expression oder Aktivität von BAFF-R auf höhere Niveaus als detektiert zu heben, d.h. die Wirksamkeit des Agens zu erhöhen. Alternativ kann eine erniedrigte Verabreichung des Agens erwünscht sein, um die Expression oder Aktivität von BAFF-R auf niedrigere Niveaus als detektiert zu senken, d.h. die Wirksamkeit des Agens zu erniedrigen.
  • Behandlungsverfahren
  • Sowohl prophylaktische als auch therapeutische Verfahren zur Behandlung eines Subjekts, das ein Risiko für eine Störung trägt (oder empfenglich dafür ist) oder eine Störung hat, die mit anomaler BAFF-R-Expression oder -Aktivität assoziiert ist, sind beschrieben.
  • Krankheiten oder Störungen, die durch erhöhte Niveaus oder biologische Aktivität charakterisiert sind (verglichen mit einem Subjekt, das nicht an der Krankheit oder Störung leidet), können mit Therapeutika, die die Aktivität antagonisieren (d.h. reduzieren oder inhibieren), behandelt werden. Therapeutika, die die Aktivität antagonisieren, können in therapeutischer oder prophylaktischer Weise verabreicht werden. Therapeutika, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf (i) ein BAFF-R-Polypeptid, oder Analoga, Derivate, Fragmente oder Homologe davon; (ii) Antikörper gegen ein BAFF-R-Polypeptid; (iii) Nukleinsäuren, die ein BAFF-R-Peptid kodieren; (iv) Verabreichung einer Antisense-Nukleinsäure und Nukleinsäuren, die „dysfunktional" sind (d.h. aufgrund einer heterologen Insertion in der kodierenden Sequenz von kodierenden Sequenzen zu einem BAFF-R-Peptid) werden verwendet, um die endogene Funktion eines BAFF-R-Peptids durch homologe Rekombination „auszuknocken" (siehe z.B. Capecchi (1989) Science 244:1288-1292); oder (v) Modulatoren, die die Wechselwirkung zwischen einem BAFF-R-Peptid und seinem Bindungspartner verändern (d.h. Inhibitoren, Agonisten und Antagonisten, umfassend zusätzliche Peptidomimetika nach der Erfindung oder Antikörper, die spezifisch für ein Polypeptid nach der Erfindung sind).
  • Krankheiten und Störungen, die durch erniedrigte Niveaus oder biologische Aktivität charakterisiert sind (verglichen mit einem Subjekt, das nicht an der Krankheit oder Störung leidet), können mit Therapeutika behandelt werden, die die Aktivität erhöhen (d.h. Agonisten dafür sind). Therapeutika, die die Aktivität hinaufregulieren, können in therapeutischer oder prophylaktischer Weise verabreicht werden. Therapeutika, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf ein BAFF-R-Peptid, oder Analoga, Derivate, Fragmente oder Homologe davon; oder einen Agonisten, der die Bioverfügbarkeit erhöht.
  • Erhöhte oder erniedrigte Niveaus können problemlos detektiert werden, indem man Peptid und/oder RNA quantifiziert durch das Beschaffen einer Patientengewebeprobe (z.B. aus Biopsiegewebe) und das Untersuchen derselben in vitro auf RNA- oder Peptidniveaus, die Struktur und/oder die Aktivität der exprimierten Peptide (oder mRNAs eines BAFF-R-Peptids). Verfahren, die wohlbekannt im Fach sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Immunoassays (z.B. durch Western Blot-Analyse, Immunpräzipitation gefolgt von Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Immuncytochemie etc.) und/oder Hybridisierungsassays, um die Expression von mRNAs zu detektieren (z.B. Northern Assays, Punktdiagramme, in-situ-Hybridisierung etc.).
  • In einem Aspekt wird ein Verfahren zur Prävention einer Krankheit oder eines Zustandes in einem Subjekt beschrieben, die/der mit einer anomalen BAFF-R-Expression assoziiert ist, durch Verabreichung eines Agens an das Subjekt, das die BAFF-R-Expression oder mindestens eine BAFF-R-Aktivität moduliert. Subjekte mit einem Risiko für eine Krankheit, die durch anomale BAFF-R-Expression oder -Aktivität verursacht oder mitbestimmt wird, können durch z.B. jeden diagnostischen oder prognostischen Assay wie hierin beschrieben oder eine Kombination derselben identifiziert werden. Verabreichung eines prophylaktischen Agens' kann vor der Manifestation von Symptomen, die charakteristisch für BAFF-R-Anomalie sind, geschehen, so dass eine Krankheit oder Störung verhindert wird oder alternativ in ihrer Progression verzögert wird. Abhängig vom Typ der BAFF-R-Anomalie kann z.B. ein BAFF-R-Agonist oder BAFF-R-Antagonist zur Behandlung des Subjekts verwendet werden. Das geeignete Agens kann basierend auf den hierin beschriebenen Screening-Assays bestimmt werden.
  • Ein weiterer Aspekt, der beschrieben wird, bezieht sich auf Verfahren zur Modulation der BAFF-R-Expression oder -Aktivität für therapeutische Zwecke. Das modulatorische Verfahren umfasst das Kontaktieren einer Zelle mit einem Agens, das eine oder mehrere Aktivitäten der mit der Zelle assoziierten BAFF-R-Proteinaktivität moduliert. Ein Agens, das die BAFF-R-Proteinaktivität moduliert, kann ein hierin beschriebenes Agens sein, wie eine Nukleinsäure oder ein Protein, ein natürlich-vorkommender zugehöriger Ligand eines BAFF-R-Proteins, ein Peptid, ein BAFF-R-Peptidomimetikum, oder ein Kleinmolekül. In einer Ausführungsform stimuliert das Agens eine oder mehrere BAFF-R-Proteinaktivitäten. Beispiele für solche stimulatorische Agentien umfassen aktives BAFF-R-Protein und ein Nukleinsäuremolekül, das BAFF-R kodiert und in die Zelle eingebracht wurde. In einer weiteren Ausführungsform inhibiert das Agens eine oder mehrere BAFF-R-Proteinaktivitäten. Beispiele solcher inhibitorischer Agentien umfassen Antisense-BAFF-R-Nukleinsäuremoleküle und anti-BAFF-R-Antikörper. Diese modulatorischen Verfahren können in vitro (z.B. durch Kultivieren der Zelle mit dem Agens) oder alternativ in vivo (z.B. durch Verabreichung des Agens an ein Subjekt) durchgeführt werden. Verfahren zur Behandlung eines Individuums, das von einer Krankheit oder Störung betroffen ist, die durch anomale Expression oder Aktivität eines BAFF-R-Proteins oder -Nukleinsäuremoleküls charakterisiert sind, werden beschrieben. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung eines Agens (z.B. eines Agens, das durch einen hierin beschriebenen Screening-Assay identifiziert wurde), oder einer Kombination von Agentien, die die BAFF-R-Expression oder -Aktivität moduliert (z.B. hinauf- oder herunterreguliert). In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung eines BAFF-R-Proteins oder -Nukleinsäuremoleküls als Therapie zur Kompensierung von verminderter oder anomaler BAFF-R-Expression oder -Aktivität.
  • In einer Ausführungsform werden Verfahren zur Verwendung von BAFF-R beschrieben. Umfasst von solchen Verfahren sind Verfahren zur Inhibition des B-Zell-Wachstums, des/r durch dendritische Zellen induzierten B-Zell-Wachstums und -Reifung, oder der Immunglobulin-Produktion in einem Tier mit Hilfe eines BAFF-R-Polypeptids, umfassend mindestens einen BAFF-Bindeteil von BAFF-R. Weitere Ausführungsformen umfassen Verfahren zur Stimulierung des B-Zell-Wachstums, des/r durch dendritische Zellen induzierten Wachstums und -Reifung, oder der Immunglobulin-Produktion in einem Tier mit Hilfe eines BAFF-R-Polypeptids (wie durch Transfektion von Zellen, die BAFF-R-defizient sind, mit Vektoren, um eine wirksame Expression von BAFF-R zu erlauben, oder durch Verabreichung von Antikörpern, die BAFF-R binden und BAFF vorgaukeln).
  • In einer weiteren Ausführungsform werden Verfahren zur Verwendung von BAFF-R in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, Bluthochdruck, kardiovaskulären Störungen, Nierenstörungen, B-Zell-lymphoproliferativen Störungen, immunsuppressiven Krankheiten, Organtransplantation und HIV beschrieben. Auch umfasst sind Verfahren zur Verwendung von Agentien zur Behandlung, Suppression oder Veränderung einer Immunantwort unter Einbeziehung eines Signalübertragungsweges zwischen BAFF-R und seinem Liganden, und Verfahren zur Inhibition von Entzündung durch das Verabreichen eines Antikörpers, der spezifisch ist für einen BAFF-R oder ein Epitop davon.
  • Die Verfahren werden vorzugsweise durch die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines BAFF-R-Polypeptids, eines chimären Moleküls umfassend ein BAFF-R-Polypeptid, fusioniert an eine heterologe Aminosäuresequenz, oder eines anti-BAFF-R-Antikörperhomologs, ausgeführt.
  • In einer Ausführungsform bietet die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend eine BAFF-R-Polypeptid und einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff.
  • In einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung chimäre Moleküle umfassend ein BAFF-R-Polypeptid, fusioniert an ein(e) heterologe(s) Polypeptid oder Aminosäuresequenz. Ein Beispiel für ein solches chimäres Molekül umfasst einen BAFF-R, fusioniert an eine Fc-Region eines Immunglobulins oder eine „epitope tag"-Sequenz.
  • In einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung einen Antikörper, der spezifisch an ein BAFF-R-Polypeptid bindet. Optional ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
  • In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers für einen Zustand beschrieben, der mit unerwünschter Zellproliferation assoziiert ist, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung umfassend einen BAFF-R-Antagonisten an das Säugetier, wobei der BAFF-R-Antagonist ein Polypeptid umfasst, das die Wechselwirkung zwischen BAFF-R und seinem/n zugehörigen Rezeptor(en) antagonisiert, und einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der zugehörige Rezeptor von BAFF auf der Oberfläche der Zelle BAFF-R.
  • Das Verfahren kann mit jedem BAFF-R-Antagonisten verwendet werden, der ein Polypeptid hat, das die Wechselwirkung zwischen BAFF und seinem/n zugehörigen Rezeptor(en) antagonisiert. Beispiele für BAFF-R-Antagonisten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf lösliche BAFF-R-Polypeptide, lösliche chimäre BAFF-R-Moleküle umfassend, aber nicht beschränkt auf BAFF-R-IgG-Fc und anti-BAFF-R-Antikörperhomologe.
  • Das Verfahren kann für jeden Zustand, der mit unerwünschter Zellproliferation assoziiert ist, verwendet werden. Insbesondere können die Verfahren verwendet werden, um Tumorzellen zu behandeln, die BAFF und/oder BAFF-R exprimieren.
  • Beispiele von Krebsen, deren Zellproliferation durch BAFF moduliert wird, können durch die Messung des in-vitro-Niveaus der in Tumorgewebebibliotheken exprimierten BAFF- und/oder BAFF-R-mRNA gescreent werden. Tumorgewebebibliotheken, in denen BAFF- und/oder BAFF-R-mRNA stark exprimiert wird, wären Kandidaten. Alternativ kann man auf Kandidaten screenen, indem man die öffentlichen und privaten Datenbanken (d.h. die Incyte-Datenbank) mit z.B. der Volllängen-Human-BAFF-cDNA-Sequenz durchsucht.
  • Die BAFF-R-Antagonisten, die für die Behandlung von Zuständen, die mit unerwünschter Zellproliferation assoziiert sind, insbesondere Tumortherapie, verwendet werden, inhibieren vorteilhaft das Tumorzellwachstum mehr als 10%, 20%, 30% oder 40% und am vorteilhaftesten mehr als 50%. Die BAFF-R-Antagonisten werden durch Screening erhalten. Zum Beispiel können BAFF-R-Antagonisten auf Basis der Wachstumsinhibitionsaktivität (d.h. mehr als 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%) gegen humanes Kolonkarzinom HT29 oder humanes Lungenkarzinom A549, die von einem Kolon- bzw. Lungentumor abgeleitet sind, gewählt werden.
  • Eine weitere Ausführungsform bietet Verfahren zur Inhibierung des B-Zell- und Nicht-B-Zellwachstums, des/r durch dendritische Zellen induzierten B-Zell-Wachstums und -Reifung, oder der Immunglobulin-Produktion in einem Tier mit Hilfe eines BAFF-R-Polypeptids wie den oben beschriebenen.
  • Das Verfahren zur Inhibierung des B-Zell- und Nicht-B-Zell-Wachstums, des/r durch dendritische Zellen induzierten B-Zell-Wachstums und -Reifung, oder der Immunglobulin-Produktion kann auch die Verabreichung eines anti-BAFF-R-Antikörpers (polyklonal oder monoklonal) umfassen, der an BAFF-R bindet und die Bindung von BAFF an BAFF-R inhibiert. Die Verabreichung des Antikörpers inhibiert dadurch das B-Zell- und Nicht-B-Zell-Wachstum, das/die durch dendritische Zellen induzierte B-Zell-Wachstum und -Reifung, oder die Immunglobulin-Produktion. Die Menge an Antikörper, die für die Verwendung geeignet sein kann, kann aus den hierin gezeigten in-vivo-Daten extrapoliert werden. Verschiedene Verfahren zur Extrapolation von Dosierungen aus Tierexperimenten sind im Fach bekannt, umfassend z.B. Extrapolation basierend auf dem Körpergewicht oder der -Oberfläche.
  • In einigen Ausführungsformen werden die BAFF-R:Fc-Polypeptide oder anti-BAFF-R-Antikörper in einer Menge von etwa 1 bis 20 mg/kg/Dosis verabreicht. Dosen können zweimal pro Woche, einmal pro Woche, einmal alle zwei Wochen oder einmal pro Monat, je nach Bedarf, verabreicht werden. Ein Arzt wird in der Lage sein, die geeignete Dosis zu bestimmen, indem er die Wirksamkeit gegen die Verminderung aller negativen Effekte der Therapie abwägt.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden Verfahren zur Verwendung von BAFF-R- oder anti-BAFF-R-Antikörpern in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, Bluthochdruck, kardiovaskulären Störungen, Nierenstörungen, B-Zell-lymphoproliferativen Störungen, immunsuppressiven Krankheiten, Organtransplantation, Entzündung und HIV beschrieben. Auch umfasst sind Verfahren zur Verwendung von Agentien zur Behandlung, Suppression oder Veränderung einer Immunantwort, umfassend einen Signalübertragungsweg zwischen BAFF-R und seinem Liganden.
  • Verfahren zur Inhibition der Aggregation von BAFF-R und BAFF-R:Fc Die Erfindung bietet auch ein Verfahren zur Inhibition oder Verminderung der Aggregation von exprimiertem BAFF-R-Protein, insbesondere humanem BAFF-R oder huBAFF-R:Fc, welches während der Expression zur Aggregation neigt, was eine Reinigung in hohen Ausbeuten vergeblich macht. In dem Verfahren nach der Erfindung wird die Aminosäuresequenz eines BAFF-R-Proteins, das zur Aggregation neigt, wenn es in einem rekombinanten System exprimiert wird, mit der Aminosäuresequenz eines Homologen des Proteins verglichen, das weniger Aggegrationsaktivität zeigt. Die zwei Homologen werden konservierte Domänen und nichtkonservierte Aminosäuren dazwischen und möglicherweise darin eingestreut haben. Im allgemeinen kann mindestens eine der nichtkonservierten Aminosäuren des aggregierenden Proteins gegen eine Aminosäure im Homologen substituiert werden, um die Aggregation zu vermindern. In einigen Ausführungsformen werden nichtpolare Aminosäuren substituiert. Nichtpolare Aminosäuren umfassen Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan und Cystein. In einigen Ausführungsformen substituieren nichtpolare Aminosäuren andere nichtpolare Aminosäuren. Bevorzugte nichtpolare Aminosäuren zur Inhibition oder Verminderung der Aggregation sind Prolin und Alanin. In weiteren Ausführungsformen wird eine ungeladene polare Aminosäure gegen eine nichtpolare Aminosäure substituiert. Ungeladene polare Aminosäuren umfassen Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin und Tyrosin.
  • In dem Verfahren nach der Erfindung werden Substitutionen erzeugt, die vorzugsweise dem BAFF-R-Protein erlauben, seine biologische Aktivität zu erhalten. Im allgemeinen sind nichtkonservierte Aminosäuren der Substitution zugänglich, ohne die biologische Aktivität zu sehr zu beeinträchtigen.
  • In einem speziellen Beispiel für das Verfahren nach der Erfindung kann humanes BAFF-R-Protein Aminosäuresubstitutionen haben, die an Positionen V20, P21, A22 und L27 von SEQ ID NO:5 (oder V41, P42, A43 und L48 von SEQ ID NO:12) eingeführt wurden, und verschiedene Kombinationen davon, was die Aggregation des Protein stark vermindert. Ähnliche Strategien können für andere BAFF-R-Proteine verwendet werden, die zur Aggregation tendieren, wenn die in rekombinanten Systemen exprimiert werden. Obwohl eine Bindung an eine bestimmte Wirkungstheorie nicht erwünscht ist, glauben wir, dass die Substitution von ungeladenen polaren Aminosäuren gegen nichtpolare Aminosäuren dem Protein Löslichkeit verleiht und die Aggregation von nichtpolaren Regionen zwischen den Proteinen vermindert.
  • Die vorliegende Erfindung soll nicht in ihrem Schutzbereich durch spezielle hierin beschriebene Ausführungsformen beschränkt werden. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hierin beschrieben werden, den Fachleuten durch die vorstehende Beschreibung und die begleitenden Abbildungen offenbar werden. Solche Modifikationen sollen in den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche fallen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel beschreibt die molekulare Klonierung von BAFF-R, einem neuen Rezeptor für BAFF.
  • Material und Methoden
  • Eine oligo-dT-geprimete cDNA-Bibliothek wurde aus BJAB-Zellen hergestellt, einer humanen B-Zell-Linie, die humanes BAFF bindet, und direktional in den Expressionsvektor CH269 kloniert. CH269 ist ein Derivat von pCEP4 (Invitrogen), das den CMV-Promotor enthält, um die Expression der klonierten DNA zu steuern, und auch den oriP von EBV enthält. Dies erlaubt die autonome Multicopy-Replikation dieser Plasmide in Zellen, die stabil mit EBNA-1 transformiert sind, wie 293 EBNA. Die BJAB-cDNA-Bibliothek wurde in E. coli-DH10B-Zellen transfiziert, und in ein 96-well-Format als Pools von ungeführ 2500 unabhängigen Klonen pro Well ausgesät. DNA wurde aus diesen Pools mit Hilfe des Qiagen BioRobot 9600 präpariert. Die DNA-Pools wurden mit Hilfe von Lipofectamin (Life Technologies) in 293EBNA-Zellen transfiziert, die in mit Fibronectin ausgekleidete 6-well-Schalen ausgesät wurden. 48 Stunden nach Transfektion wurde das Medium entfernt und die Zellen mit Platten-Assay-Waschpuffer (20 mM HEPES, 0,5 mg/ml bovines Serum-Albumin, 0,1% NaN3) gewaschen. Zell-Einzelschichten wurden mit 100 mg/ml biotinyliertem humanen rekombinanten löslichen myc-BAFF (myc-huBAFF) in Bindepuffer (PBS, 2% fötales Rinderserum, 0,1% NaN3) überschichtet und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Das in diesem Assay verwendete myc-huBAFF (Aminosäuren 136-285) wurde in Pichia pastoris exprimiert und durch Anionenaustauschchromatographie, gefolgt von Gelfiltration, gereinigt.
  • Die BAFF-Lösung wurde entfernt und die Zellen gewaschen und durch Inkubation mit 1,8% Formaldehyd-0,2%-Glutaraldehyd in PBS für 5 Minuten fixiert. Die Zellen wurden erneut gewaschen und dann 30 Minuten mit Streptavidin, konjugiert mit alkaliner Phosphatase (SAV-AP; Jackson ImmunoResearch), bei einer 1:3000-Verdünnung der Stocklösung in Bindepuffer inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit Fast-Red/Naphtholphosphat (Pierce) angefärbt. Zellen, die den Biotin-BAFF/SAV-AP-Komplex binden, wurden durch die Anwesenheit eines roten Niederschlags nach Inspektion unter Niedrigstrom-Mikroskopie identifiziert. Ein sekundäres Screening bedingte das Ausplattieren der DH10B-Glycerin-Stocks der BAFF-Bindepools auf einzelne Kolonien, das Animpfen zur Kultur in Pools von 100, und das Wiederholen des BAFF-Bindeassays wie oben beschrieben. Im sekundären Screening positive Pools wurden ähnlich in einzelne Klone aufgeteilt und auf BAFF-Bindung nach Transfektion in 293EBNA wie oben beschrieben untersucht. Die DNA-Sequenz der unabhängigen BAFF-Bindeklone wurde bestimmt.
  • Ergebnisse
  • Einer der BAFF-Bindeklone war pJST576. Er hat eine Insert-Größe von 1201 Basenpaaren (bp), den Poly-A-Schwanz nicht eingeschlossen. Die Sequenz des Inserts von pJST576 ist in 1A (SEQ ID NO:1) gezeigt. Eine BLAST-Analyse dieses Klons zeigte Homologie in der GenBank-Datenbank zu Chromosom 22-BAC-Klon HS250D10 (Zugriffsnummer Z99716). Dies gesamte pJST576-Sequenz findet sich in diesem BAC. Homologie wurde auch am 3'-Ende eines humanen EST gefunden ( AI 250289 ; IMAGE-Klon 2000271). Der EST wurde aus einer humanen Follikellymphom-Bibliothek erzeugt. Der EST AI 250289 wurde von Incyte gekauft und die Sequenz des Inserts bestimmt (1B) (SEQ ID NO:2). Diese Sequenz addierte 15 bp von 5'-Sequenz zur pJST576-Sequenz, die mit der genomischen Sequenz kontinuierlich ist, und 23 bp, die das nicht war. Der Rest der EST-Sequenz besitzt perfekte Homologie zu pJST576. Ein offener Leserahmen konnte in diesen Klonen nicht identifiziert werden.
  • Beispiel 2
  • In diesem Beispiel bestimmen wir, dass die JST576-cDNA ein Intron enthält, und legen dann einen offenen Leserahmen fest.
  • Methoden
  • Das GENSCAN (Burge, C. & Karlin, S.J (1997) Mol. Biol 268:78-94)-Exon-Vorhersageprogramm wurde mit der JST576-cDNA-Sequenz laufen gelassen. Die Ergebnisse dieses Programms sagten ein Intron in der cDNA vorher. Um zu bestimmen, ob die Vorhersage korrekt war, wurde eine PCR-Analyse auf der Erststrang-cDNA aus 2 Zelllinien, die JST576 exprimieren, durchgeführt. RNA wurde aus ungefähr 107 BJAB- oder IM-9-Zellen mit Hilfe des RNeasy-Lits (Qiagen) gereinigt, dem empfohlenen Protokoll des Herstellers folgend. Die RNA wurde quantifiziert, und 5 μg wurden für Erststrang-cDNA-Reaktionen mit Hilfe des Superscript-Präamplifikationskits (Life Technologies) verwendet. Beide Oligo-dT- und Zufallshexamere wurden verwendet, um das Erststrangprodukt zu erzeugen. Die Synthese des ersten Strangs wurde gemäß des empfohlenen Protokolls durchgeführt. Drei μl jeder Reaktion, 10 ng von JST576 oder keine DNA wurden dann als Template für PCR mit Hilfe von Oligonukleotiden, die das vorhergesagte Intron flankieren, verwendet. Die in dieser Reaktion verwendeten Oligonukleotide waren die 5'-Oligos BAF-225 [5'-GGCCGAGTGCTTCGACCTGCT-3'] (SEQ ID NO:33) oder BAF-226 [5'-GGTCCGCCACTGCGTGGCCTG-3'] (SEQ ID NO:34) und das 3'-Oligo BAF-191 [5'-CACCAAGACGGCCGGCCCTGA-3'] (SEQ ID NO:35). Jede Reaktion enthielt 1× Pfu-Puffer (Stratagene), 200 μM dNTPs, 10% DMSO, 150 ng jedes Oligos, und 1,25 Einheiten von Turbo-Pfu-Puffer (Stratagene). Die Reaktionen wurden für 35 Zyklen bei 94°C für 30 sek, 60°C für 1 min und 72°C für 1,5 min durchgeführt. Zehn μl jeder Reaktion wurden auf einem 1%-Agarosegel gefahren. Die verbleibenden Produkte der BJAB- und IM-9-BAF-225/191-Reaktionen wurden mit Hilfe des High-Pure-PCR-Produkt-Reinigungskits (Roche Molecular Biochemicals) gereinigt, und das Bulk-Reaktionsprodukt wurde der DNA-Sequenzierung unterworfen. Zusätzlich wurden PCR-Produkte mit Hilfe der Primer BAF-225 und BAF-191 aus cDNA ruhender B-Zellen erzeugt, subkloniert, und individuelle Klone wurden sequenziert. Hier wurden 5 μl von cDNA ruhender B-Zellen (Clontech) in einer PCR-Reaktion mit den BAF-225- und BAF-191-Primern wie oben beschrieben verwendet. Das PCR-Produkt wurde dann mit Hilfe des High-Pure-Produkt-Reinigungskits gereinigt und konzentriert. Um das PCR-Fragment zu subklonieren, wurden die Enden des Fragments phosphoryliert und mit Hilfe des Sure-Clone-Ligationskits (Amersham Pharmacia Biotech) wie empfohlen stumpf gemacht. Das resultierende Produkt wurde in die EcoRV-Stelle von pBluescriptII (Stratagene) kloniert und in E.coli transformiert. Individuelle Kolonien wurden hochgezogen, die Plasmid-DNA minigepreppt. Sechs unabhängige Isolate wurden sequenziert.
  • Ergebnisse
  • Die reife, vom GENSCAN-Programm vorhergesagte Nukleotid- und Aminosäuresequenz von JST576 ist in 2A (SEQ ID NO:3) gezeigt. PCR-Produkte von BJAB- und IM-9-Reaktionen, die das vorhergesagte Intron überspannen, sind in 2B dargestellt und bestätigen die Existenz eines Introns im JST576-cDNA-Klon. Die vorhergesagte Größe des PCR-Produkts aus der JST576-cDNA ist ungefähr 788 bp für BAF-225/BAF-191 und 767 bp für BAF-226/BAF-191. Die PCR-Produkte, die aus dem JST576-Template erhalten wurden, haben ungeführ diese Größe (Spuren 10 und 11). Die PCR-Produkte, die mit Hilfe von BAF-225/BAF-191 auf oligo-dT-geprimeter BJAB- oder IM-9-Erststrang-cDNA erhalten wurden (Spuren 2 und 6), haben dieselbe Größe und sind erheblich kürzer als das von der JST576-cDNA erhaltene Produkt. Die vorhergesagte Größe dieses Fragments ohne das vorhergesagte Intron ist 484 bp. Die Größe der PCR-Produkte stimmt mit dieser Größe überein. Dieselben Ergebnisse wurden erhalten, wenn BJAB- oder IM-9-RNA mit Zufallshexameren geprimet wurde (Spuren 4 und 8). Die Reaktionen mit BAF-226/BAF-191 funktionierten nicht auf den Erststrang-cDNA-Templates. Daher scheint es, dass das vom GENSCAN-Programm vorhergesagte Intron nicht in der JST576-cDNA existiert. Die Sequenz des gespleißten Produkts von BJAB- und IM-9-RNA wurde durch Sequenzieren des Bulk-PCR-Produkts bestätigt und wird durch die in 2C (SEQ ID NO:4) dargestellte Sequenz reflektiert. Die Sequenz ist identisch mit der in 2A (SEQ ID NO:3) dargestellten Sequenz, ausgenommen die Abwesenheit des Alanin-Codons (GCA) bei Nukleotid 149 (gezeigt in Kleinbuchstaben). Die Ergebnisse der Sequenzierung von sechs unabhängigen Klonen aus der RT-PCR-Reaktion auf cDNA ruhender B-Zellen zeigt, dass beide Spleißakzeptorstellen verwendet werden. Die bevorzugte Akzeptorstelle scheint das in einem Alaninrest resultierende Produkt zu sein (5/6-Klone). Die vom GENSCAN-Programm vorhergesagte Sequenz (SEQ ID NO:3), die zwei Alanine enthält, wurde jedoch in den 1/6-Klonen festgestellt. Daher wurde ein offener Leserahmen für menschliches JST576 etabliert und eine einzelne Aminosäure-Spleißvariante bestimmt. Der offene Leserahmen sagt ein Protein von 184 Aminosäuren vorher, gezeigt in 2D (SEQ ID NO:5). Der Alaninrest (A) in fett stellt die Spleißvariante dar. Dieses Protein wird als BAFF-R bezeichnet. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von BAFF-R umfasst eine hydrophobe Region von Resten 72-100 (Hopp-Woods-Algorithmus) und ein potentielles Transmembransegment von Resten 84-102, wie durch den TMPred-Algorithmus analysiert. Diese Region wird gefolgt von einem stark geladenen Abschnitt von Aminosäuren, die als Stop-Transfer-Signal dienen könnten. BAFF-R entbehrt einer N-terminalen Signalsequenz und ist ein Typ-III-Membranprotein, das ähnlich zu den anderen BAFF-Bindeproteinen BCMA (Laabi et al. (1992) EMBO J. 11:3897-3904) und TACI (von Bulow und Bram, (1997) Science 278:138-141) ist. Der N-Terminus ist nach der Vorhersage die extrazelluläre Domäne von BAFF-R und enthält ein 4-Cystein-Motiv bei Resten 19-35, im Unterschied zu allen anderen Mitgleidern der TNF-Rezeptorfamilie. Der C-Terminus von BAFF-R ist nach der Vorhersage die intrazelluläre Domäne.
  • Beispiel 3
  • Hier bestimmen wir die DNA-Sequenz stromaufwärts des vorgeschlagenen Startmethionins für humanes BAFF-R umfassend ein Stopcodon im Leserahmen.
  • Methoden
  • Ein Primer BAF-254 (5'GGGCGCCTACAATCTCAGCTA3') (SEQ ID NO:36) wurde nach der genomischen Sequenz entworfen, die in BAC HS250d10 stromaufwärts des vorgeschlagenen ATG vorkommt (Genbank-Zugriffsnummer Z99716), und in einer PCR-Reaktion mit dem Oligo BAF-236 (5'GGCGGACCAGCAGGTCGAAGCACTC 3') (SEQ ID NO:37) verwendet. Das Template in der Reaktion war aus humaner Milz-RNA (Clontech) mit Hilfe des PCR-Präamplifikationskits wie vom Hersteller beschrieben (Life Technologies) hergestellte Erststrang-cDNA. Die PCR-Reaktion enthielt 3 μl der Erststrangreaktion, 1 × Pfu-Puffer (Stratagene), 10% DMSO, 0,2 mM dNTPs, 150 ng jeden Primers und 1.25 Einheiten Pfu-Turbo-Polymerase (Stratagene). Das PCR-Produkt wurde mit Hilfe des High-Pure-PCR-Produkt-Reinigungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Roche Molecular Biochemicals) gereinigt. Die Enden des PCR-Produkts wurden stumpf gemacht und mit Hilfe des Sure-Clone-Ligationskits (Amersham Pharmacia Biotech) phosphoryliert, in die EcoRV-Stelle von pBSK2 (Stratagene) kloniert und in DH5-Zellen transformiert. Aus dieser Ligation erhaltene Kolonien wurde mit Hilfe des Wizard-Systems (Promega) minigepreppt und dann mit Hilfe einer ABI-Maschine sequenziert.
  • Ergebnisse
  • Die Sequenz des PCR-Produkts bestätigt, dass die mRNA Sequenzen direkt stromaufwärts des ATG, das in der genomischen Sequenz enthalten ist, enthält. Diese Sequenz ist in der Sequenz in 3 unterstrichen. Die Anwesenheit eines stromaufwärts gelegenen Stop-Codons im Leserahmen und die Abwesenheit eines anderen Methionins zeigen, dass das Methionin in der JST576-cDNA das korrekte Startmethionin ist.
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel beschriebt die Klonierung der murinen BAFF-R-cDNA.
  • Methoden
  • Ungefähr eine Million Phagenplaques aus der murinen A20-Zelllinien-cDNA-Bibliothek, gekauft von Stratagene (La Jolla, CA), wurden wie vom Hersteller beschrieben gescreent. Die humane JST576-BAFF-R-cDNA wurde mit EcoNI verdaut und auf einem 1%-Niedrigschmelzgel gefahren. Das 425-bp-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und gewogen. Dreimal das Volumen an Wasser wurde hinzugefügt und das Gelfragment wurde 5 Minuten gekocht. Das Fragment wurde mit 50 μCi 32P-dCTP (Amersham) in einer Reaktion enthaltend 50 mM Tris pH 8, 5 mM MgCl2, 10 μM β-Mercaptoethanol, 200 mM HEPES pH 6,5, 20 μM dNTPs (außer dCTP), 0,27 Einheiten von pd(N)6-Hexanukleotiden (Amersham Pharmacia Biotech) und 1 Einheit von Klenow-Enzym (USB) über Nacht bei Raumtemperatur markiert. Etwa eine Million Counts pro ml Sonde wurden mit den Filtern in Plaque-Screeningpuffer (50 mM Tris, 1% SDS, 1 M NaCl, 0,1% Natrium-Pyrophosphat, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% BSA) über Nacht bei 65 °C inkubiert. Die Filter wurden in 2X SSC and 0,1% SDS bei 50°C für 1,5 Stunden (3 × 2 Liter) gewaschen und dann an Röntgenfilm für 2 Tage exponiert. Ungefähr 36 positive Plaques wurden identifiziert. Von diesen wurden 6 plaquegereinigt. Die Phagemiden wurden mit Hilfe des invivo-Exzisionsprotokolls wie von Stratagen beschrieben freigesetzt. Die resultierenden Kolonien wurden herangezogen, und die DNA wurde dann minigepreppt (Qiagen). Die cDNA-Klone wurden sequenziert.
  • Ergebnisse
  • Die murine BAFF-R-Konsensus-Nukleotidsequenz wird als 4A (SEQ ID NO:8) präsentiert und die Aminosäuresequenz wird als 4B (SEQ ID NO:9) präsentiert. Drei der Klone enthielten eine 10-Aminosäuren-Deletion von Aminosäure 119 bis 129 in der intrazellulären Domäne von murinem BAFF-R. Das Alignment der humanen und murinen BAFF-R-Sequenzen verdeutlicht, dass die 4 Cysteinreste in der extrazellulären Domäne konserviert sind, dass die Position des Startmethionins ähnlich ist und dass die C-terminale Region der Proteine hochkonserviert ist (4C), wobei die letzten 24 Reste identisch sind. Die Sequenzen haben insgesamt etwa 56% Identität.
  • Beispiel 5
  • In diesem Beispiel wird die Fähigkeit von humanem rekombinantem löslichem BAFF, an mit pJST576 und einem GFP-Reporterplasmid kotransfizierte Zellen zu binden, beschrieben.
  • Material und Methoden
  • Das Reporterplasmid kodiert ein membranverankertes GFP-Molekül und erlaubt die Unterscheidung transfizierter Zellen von nichttransfizierten Zellen. 293EBNA-Zellen wurden mit dem Reporterplasmid und pJST576 mit Hilfe von Lipofectamin 2000 (Life Technologies) kotransfiziert. 18-20 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen von den Platten mit 5 mM EDTA in PBS abgelöst und gezählt. Die Zellen wurden zweimal mit FACS-Puffer gewaschen (PBS, enthaltend 10% fötales Rinderserum, 0,1% NaN3), und 2,5 × 105 Zellen wurden 1 Stunde auf Eis mit biotinyliertem myc-huBAFF, verdünnt in FACS-Puffer über einen Konzentrationsbereich von 8 ng/ml bis 5 μg/ml, inkubiert. Die Zellen wurde mit FACS-Puffer gewaschen und 30 Minuten mit Streptavidin, konjugiert mit Phycoerythrin (SAV-PE) (Jackson ImmunoResearch) bei einer 1:100-Verdünnung der Stocklösung inkubiert. Die Zellen wurden erneut mit FACS-Puffer gewaschen und in 1% Paraformaldehyd in FACS-Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden mit FACS auf GFP- und PE-Fluoreszenz untersucht, und die Daten wurden in einem Vier-Quadranten-Punktdiagramm aufgetragen. Die Punkte in den zwei rechten Quadranten stellen Zellen dar, die den Transfektionsrezeptor GFP exprimieren. Die Punkte in den zwei oberen Quadranten stellen Zellen dar, die biotinyliertes myc-huBAFF gebunden haben, wobei diese Bindung durch SAV-PE sichtbar gemacht wurde. Die Zellen im oberen rechten Quadranten sind transfizierte Zellen, die biotinylierten myc-huBAFF binden.
  • Ergebnisse
  • Ungefärbte Zellen und Zellen, die nur mit SAV-PE gefärbt wurden, sind zu etwa 50% GFP-positiv und sind mit dem Reporterplasmid kotransfiziert (5). Wenn mit dem GFP-Reporter und pJST576 kotransfizierte Zellen mit 1 μg/ml biotinyliertem myc-huBAFF gefärbt werden, verschieben sich fast alle Zellen im unteren rechten Quadranten nach oben, was BAFF-Bindung anzeigt. Ein ähnliches Ergebnis wird beobachtet, wenn statt pJST576 ein huTACI-exprimierendes Plasmid kotransfiziert wird. TACI bindet bekanntermaßen BAFF. Die Zellen wurden mit fünffachen Verdünnungen von biotinyliertem myc-huBAFF von 5 μg/ml bis 8 ng/ml gefärbt, und die Intensität der Verschiebung nahm in dem Maße ab, wie die Konzentration des biotinylierten myc-huBAFF abnahm.
  • Beispiel 6
  • In diesem Beispiel wird die Fähigkeit von humanem rekombinantem löslichem BAFF oder murinem rekombinantem löslichem BAFF beschrieben, an mit pJST576 und einem GFP-Reporterplasmid kotransfizierte Zellen zu binden.
  • Material und Methoden
  • Die Kotransfektionen in 293EBNA waren wie in Beispiel 5 beschrieben. 18-20 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen abgelöst, gezählt und für FACS-Analyse ähnlich wie in Beispiel 5 gefärbt, mit den folgenden Modifikationen. Die Zellen wurde 1 Stunde auf Eis mit 5 μg/ml von entweder murinem oder humanem rekombinantem löslichem flag-BAFF inkubiert, nach Waschen gefolgt von Inkubation für 30 Minuten mit 5 μg/ml des anti-flag monoklonalen Antikörpers M2 (Sigma Aldrich), und dann durch Inkubation der gewaschenen Zellen für 30 Minuten mit PEkonjugiertem Esel-anti-Maus IgG (Jackson ImmunoResearch) bei einer 1:100-Verdünnung der Stocklösung sichtbar gemacht. Die Zellen wurden wieder gewaschen, mit Paraformaldehyd fixiert, und mit FACS auf GFP- und PS-positive Zellen analysiert.
  • Ergebnisse
  • Ungefähr 50% der Zellen sind GFP-positiv und sind daher mit dem Reporter-Plasmid kotransfiziert (6). Wenn mit GFP-Reporter und pJST576 kotransfizierte Zellen mit 5 μg/ml von entweder humanem oder murinem rekombinantem löslichem flag-BAFF gefärbt werden, verschieben sich fast alle Zellen im unteren rechten Quadranten nach oben. Dies zeigt, dass sowohl murines als auch humanes BAFF an mit pJST576 transfizierte Zellen binden.
  • Beispiel 7
  • In diesem Beispiel wird die Unfähigkeit des murinen rekombinanten löslichen APRIL, an mit pJST576 und einem GFP-Reporterplasmid kotransfizierte Zellen zu binden, beschrieben.
  • Material und Methoden
  • Kotransfektionen in 293EBNA waren wie in Beispiel 5 beschrieben. 18-20 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen abgelöst, gezählt und für FACS-Analyse ähnlich wie in Beispiel 5 gefärbt, mit den folgenden Modifikationen. Die Zellen wurden 1 Stunde auf Eis mit 1 μg/ml von murinem rekombinantem löslichem myc-APRIL inkubiert, nach Waschen gefolgt von Inkubation für 30 Minuten mit 5 μg/ml des anti-Maus-APRIL monoklonalen Antikörpers, gefolgt von 30minütiger Inkubation der gewaschenen Zellen mit 5 μg/ml biotinyliertem anti-Ratten-IgG2b (Pharmingen), und schließlich durch Inkubation der gewaschenen Zellen für 30 Minuten mit SAV-PE sichtbar gemacht. Die Zellen wurden wieder gewaschen, mit Paraformaldehyd fixiert, und mit FACS auf GFP- und PS-positive Zellen analysiert.
  • Ergebnisse
  • Ungefähr 50% der Zellen sind GFP-positiv und daher mit dem Reporter-Plasmid kotransfiziert (7). Wenn mit GFP-Reporter und pJST576 kotransfizierte Zellen mit 1 μg/ml von murinem myc-APRIL gefärbt werden, verschieben sich keine der Zellen im unteren rechten Quadranten nach oben. Dies steht im Gegensatz zu Zellen, die mit einem humanes TACI statt pJST576 exprimierenden Plasmid kotransfiziert wurden. In diesen transfizierten Zellen waren fast alle positiv für Murin-myc-APRIL-Bindung. Es wurde schon früher gezeigt, dass sowohl BAFF als auch APRIL an sowohl TACI als auch BCMA binden. Daher deutet der Umstand, dass APRIL nicht an BAFF-R bindet, wie es auf pJST576-transfizierten Zellen exprimiert wird, auf eine Spezifität von BAFF-R für BAFF hin.
  • Beispiel 8
  • Dieses Beispiel beschreibt die Fähigkeit von BAFF-R, wie es von pJST576 exprimiert wird, durch rekombinantes lösliches humanes flag-BAFF kopräzipitiert zu werden.
  • Material und Methoden
  • 293EBNA-Zellen wurden durch Lipofectamin 2000 mit pJST576, einer Nur-Vektor-Kontrolle, oder einem hUTACI-exprimierenden Plasmid als Positivkontrolle für BAFF-Bindung transfiziert. Nach 20 Stunden Inkubation wurde das Transfektionsmedium abgezogen, die Zellen mit PBS gewaschen, und das Medium mit 35S-Markierungsmedium ersetzt (9 Teile DMEM ohne Methionin und Cystein zu einem Teil komplettes DMEM, supplementiert mit 10% dialysiertem fötalem Rinderserum, 4 mM Glutamin, und 100 μCi/ml35S-Methionin und -Cystein (Translabel, ICN Radiochemicals). Die Zellen wurden in diesem Medium sechs Stunden inkubiert, woraufhin das Medium entfernt wurde. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann mit 250 μl Extraktionspuffer solubilisiert (1% Brij 98, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5). Koimmunpräzipitationen wurden durch Inkubation von 75 μl der 355-markierten Zellextrakte mit 5 μg rekombinantem löslichem humanem flag-BAFF in 1 ml DMEM-10% fötalem Rinderserum-0,1% NaN3 über Nacht bei 4°C durchgeführt. Der monoklonale anti-flag-Antikörper M2, 10 μg, und Protein-A-Sepharose wurden zugegeben und die Inkubationen zwei Stunden fortgesetzt. Die Sepharosekügelchen wurde durch Zentrifugation gesammelt, mit FACS-Puffer gewaschen, und in SDS-Ladepuffer mit beta-Mercaptoethanol als Reduktionsmittel resuspendiert. Die Proben wurden 5 Minuten gekocht, kurz zentrifugiert, um die Sepharosekügelchen zu pelletieren, und ein Aliquot auf SDS-PAGE gefahren. Das Gel wurde mit Enlightning (New England Nuclear) inkubiert, getrocknet und einem Film bei –80°C ausgesetzt.
  • Ergebnisse
  • Diese Koimmunpräzipitation bindet flag-BAFF an die Protein-A-Sepharosekügelchen durch den anti-flag-Antikörper M2. Sie wird auch alle Proteine im Zellextrakt präzipitieren, die an flag-BAFF binden, und diese radiomarkierten Proteine werden durch Autoradiographie detektiert werden. Da 293EBNA-Zellen nicht an BAFF binden, zeigt die leere Vektor-Kontrolle den in dem Verfahren inhärenten Hintergrund (8). Wenn Extrakte von mit TACI transfizierten Zellen mit flag-BAFF koimmunpräzipitiert werden, wird eine Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 34 kDa beobachtet. Dies ist das ungefähre vorhergesagte Molekulargewicht von Volllängen-Human-TACI (31,2 kDa), einem Protein, von dem bekannt ist, dass es an BAFF bindet. Wenn Extrakte von mit pJST576 transfizierten Zellen mit flag-BAFF koimmunpräzipitiert werden, wird eine Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 12 kDa beobachtet. Das vorhergesagte Molekulargewicht von BAFF-R, exprimiert von pJST576, ist 18,9 kDa. Der Ungleichheit von vorhergesagtem und beobachtetem Molekulargewicht könnte eine anomale elektrophoretische Mobilität aufgrund der Ladung oder Konformation von BAFF-R zugrundeliegen. Eine andere Möglichkeit ist, dass 12 kDa ein proteolytisches Fragment von BAFF-R ist.
  • Beispiel 9
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von löslichen Formen von BAFF-R. Oligonukleotid-Primer, die zu pJST576 komplementär sind, können so entworfen werden, dass die extrazelluläre Domäne von BAFF-R in Abwesenheit von Transmembran- und intrazellulärer Domäne PCR-amplifiziert wird. Typischerweise schließt man den größten Teil der „Stiel" domäne oder der Aminosäureregion zwischen der Ligand-Bindedomäne und der Transmembrandomäne ein. Man kann die Größe der eingeschlossenen Stielregion variieren, um die Wirksamkeit des sich ergebenden löslichen Rezeptors zu optimieren. Dieses amplifizierte Fragment würde mit geeigneten Restriktionsstellen versehen, um das Klonieren an verschiedene heterologe Führungssequenzen am 5'-Ende des Fragments und an verschiedene Ig-Fusions-Chimären- Fusionsvektoren am 3'-Ende zu ermöglichen. Alternativ kann man ein Stop-Signal am 3'-Ende der BAFF-R-extrazellulären Domäne einfügen, um eine lösliche Form des Rezeptors erzeugen, oder einen anderen C-terminalen Fusionspartner verwenden, ohne auf die Verwendung eines zurückzugreifen, statt den Ig-Fusions-Chimären-Ansatz zu verwenden. Man kann auch ein N-terminales Fusionsprotein erzeugen, das aus einem Fusionspartner besteht, der eine Signalsequenz enthält, gefolgt von der N-terminalen extrazellulären Domäne von BAFF-R. Die entstehenden Vektoren können in den meisten Systemen exprimiert werden, die in der Biotechnologie verwendet werden, einschließlich Hefe, Insektenzellen, Bakterien und Säugerzellen, und Beispiele existieren für alle Expressionstypen. Verschiedene menschliche Fc-Domänen können angebracht werden, um FcR- und Komplement-Wechselwirkungen nach Wunsch zu optimieren oder zu eliminieren. Alternativ können mutierte Formen dieser Fe-Domänen verwendet werden, um FcR- oder Komplement-Wechselwirkungen oder die Anheftung von N-verknüpften Zuckern an die Fc-Domäne selektiv zu verhindern, was gewisse Vorteile hat. Ein Beispiel eines BAFF-R:Fc-Fusionsmoleküls ist in 9 gezeigt. Dieses Molekül enthält die Typ-I-Führungssequenz aus einem murinen Ig-k-Gen, verknüpft durch eine Aat2-Restriktionsstelle mit der BAFF-R-extrazellulären Domäne (Aminosäuren 2-71 wie in 2D gezeigt), die wiederum durch eine SalI-Restriktionsstelle mit der Fc-Domäne von menschlichem IgG1 verknüpft ist.
  • Beispiel 10
  • In diesem Beispiel zeigen wir das Expressionsprofil von BAFF-R in menschlichen Geweben und Zelllinien mit Hilfe der Northern-Blot-Analyse.
  • Material und Methoden
  • Verschiedene B- und Nicht-B-Zelllinien wurden unter geeigneten Bedingungen angezogen. RNA wurde aus ungefähr 107 Zellen mit Hilfe des RNeasy-Kits (Qiagen) präpariert. Die RNAs wurden quantifiziert und 20 μg jeder Probe wurden auf einem 1,2%-Formaldehyd-Gel wie von Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1989 beschrieben gefahren.
  • Das Gel wurde auf eine Nylonmembran (BMB) geblottet und dann ultraviolett (UV) quervernetzt. Mehrere humane Northern Blots (12 lane multi-tissue, Human II und Immune system II) wurden von Clontech gekauft. Die Filter wurden bei 65°C in ExpressHyb (Clontech)- Puffer 30 Minuten prähybridisiert und dann mit einem zufallsgeprimeten 32P-markierten EcoNI-Fragment vom 3'-Ende von JST576 etwa 3 Stunden hybridisiert. Die Filter wurden bei Raumtemperatur in 2X SSC/0,05% SDS 45 Minuten und dann bei 50°C in 0,1 X SSC/0,1% SDS 45 Minuten gewaschen. Der Filter wurde einem Röntgenfilm 4 Tage mit 2 Verstärkerfolien ausgesetzt. Zusätzlich wurden mehrere humane Northern Blots (12 laue multi-tissue, Human 11 und Immune system II) von Clontech gekauft, an die JST576-Sonde hybridisiert und wie oben behandelt.
  • Ergebnisse
  • Die BAFF-R-mRNA scheint vor allem in Organen des Immunsystems bei diesem Detektionsniveau exprimiert werden. Das höchste Niveau ist in Milz und Lymphknoten, aber mRNA zeichnete sich auch in PBLs, Thymus, Dünndarm und Kolon ab (10A, B und C). Die ungefähre Größe der mRNA ist 4,5 kb; es scheinen zwei mRNA-Populationen in den Proben zu existieren, wo das Gen nicht stark exprimiert wird. Zwei mRNAs könnten auch in Milz und Lymphknoten existieren. Dies könnte darauf hinweisen, dass BAFF-R alternative poly-A-Additionsstellen hat oder dass die RNA alternativem Spleißen unterliegt. Als eine Anzahl von Zellinien auf die Anwesenheit von BAFF-R-mRNA untersucht wurde, wurde dieselbe 4,5 kbmRNA detektiert. Nur B-Zell-Linien exprimieren BAFF-R-mRNA (11). Keine mRNA wird in U266, RPMI8226 und Daudi-Zelllinien oder in den untersuchten Nicht-B-Zell-Linien detektiert.
  • Beispiel 11
  • In diesem Beispiel zeigen wir, dass die JST576-Expression auf Zelllinien beschränkt ist, die BAFF binden.
  • Material und Methoden
  • Zelllinien wurden von ATCC gekauft und unter den angegebenen Bedingungen angezogen. Verschiedene B- und Nicht-B-Zell-Linien wurden unter geeigneten Bedingungen angezogen. RNA wurde aus ungeführ 107 Zellen mit Hilfe des RNeasy-Kits (Qiagen) präpariert. Die RNAs wurden quantifiziert und 20 μg jeder Probe wurden auf einem 1,2%-Formaldehyd-Gel wie von Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1989 beschrieben gefahren. Das Gel wurde auf eine Nylonmembran (BMB) geblottet und dann ultraviolett (UV) quervernetzt. Der Filter wurde mit einerm JST576-markierten Fragment hybridisiert und dann wie in Beispiel 10 beschrieben gewaschen. Die Zellen wurden auf ihre Fähigkeit BAFF zu binden mit FACS-Analyse untersucht. Ungefähr 2,5-5 × 105 Zellen wurden gesammelt und gewaschen. FLAG-getaggtes BAFF, in PBS + 5% FCS und 0,05% Natriumazid (FACS-Puffer) verdünnt, wurde mit den Zellen über den Konzentrationsbereich (8-0,125 μg/ml) 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden mit FACS-Puffer gewaschen und 30 Minuten auf Eis mit dem monoklonalen anti-FLAG-Antikörper M2 (Sigma) bei 5 μg/ml inkubiert. Die Zellen wurden wiederum mit FACS-Puffer gewaschen und dann mit einer 1:5000-Verdünnung von Ziegen-anti-Maus-IgG-PE-konjugiertem Antikörper (Jackson ImmunoResearch) 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden wie oben gewaschen und dann auf einem FACSCalibur-Flußsortierer (Becton-Dickinson) mit CellQuest-Software analysiert.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse der BAFF-Bindeexperimente sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Zelllinien, die BAFF binden, sind Ramos, Namalwa, IM-9, NC-37, Raji, BJAB und SKW6.4. Die Stärke der Bindung wird durch die Anzahl der +-Zeichen dargestellt. Die Zelllinien, die BAFF nicht binden, sind U266, RPMI 8226, Daudi, U937, Jurkat, HT29, A549, SW480 und ME260. Die Fähigkeit der Zelllinien BAFF zu binden korreliert mit der in 11 gezeigten Anwesenheit von BAFF-R-mRNA. Tabelle 1
    Zelllinie Typ BAFF-Bindung
    BJAB Burkitt-Lymphom +++
    IM-9 Lymphoblast IgG +++
    NC-37 Lymphoblast EBV+ ++
    Ramos Burkitt-Lymphom EBV– ++
    Raji Burkitt-Lymphom ++
    SKW6.4 Lymphoblast IgM ++
    Namalwa Burkitt-Lymphom +
    Daudi Burkitt-Lymphom EBV+ –
    U266 Plasmacytom –
    RPMI 8226 Plasmacytom –
    U937 Monozyt –
    Jurkat T-Zell-Leukämie –
    HT29 Kolorektales Adenkarzinom –
    A549 Lungenkarzinom –
    SW480 Kolorektales Adenokarzinom –
    ME260 Melanom –
  • Beispiehl 12
  • Dieses Beispiel beschreibt die Fähigkeit eines huBAFF-R:huIgG1-Fusionsproteins, das exprimiert und durch transient transfizierte 293EBNA-Zellen in das konditionierte Medium sekretiert wird, rekombinantes lösliches biotinyliertes myc-huBAFF zu koimmunpräzipitieren.
  • Material und Methoden
  • 293EBNA-Zellen wurden durch Lipofectamin-2000 (LifeTechnologies) mit entweder pJST618, das huBAFF-R (Aminosäuren 2-71) exprimiert, einem Plasmid, das huBCMA:huIgG1 als Positivkontrolle für BAFF-Bindung oder einem huFN14:huIgG1 exprimierenden Plasmid als Negativkontrolle für BAFF-Bindung transfiziert. Nach 24 Stunden Inkubation wurde das konditionierte Medium geerntet.
  • Eine SDS-PAGE wurde durch Mischen eines gleichen Volumen von 2X SDS-Laufpuffer, mit oder ohne Reduktionsmittel, mit dem konditionierten Medium und Kochen für 5 Minuten gefahren. Die Proben wurden dann auf einem 4-20%igen SDS-Polyacrylamidgel gefahren. Bekannte Mengen an gereinigtem hBCMA:Fc wurden in benachbarten Spuren gefahren, um die Menge an hIgG1-Fusionsprotein in dem konditionierten Medium abzuschätzen. Die Proben wurden auf Membranen (Immobillon P, Millipore) duch Western Blot in 0,01 M CAPS pH 11-10% MeOH-Puffer übertragen. Die Membranen wurden mit 5% fettfreier Trockenmilch (NFDM) in TEST blockiert, 1 Stunde einer 1:3000-Verdünnung von Ziegen-anti-Mensch-IgG-HRP (Jackson ImmunResearch) ausgesetzt, in TEST gewaschen und an Film exponiert. Die Koimmunpräzipitationen wurden durch Inkubation von 200 μl konditioniertem Medium mit 200 ng rekombinantem löslichem humanem flag-BAFF in 1 ml DMEM-10% fötalem Rinderserum-0,1% NaN3 über Nacht bei 4°C inkubiert. Protein-A-Sepharose wurde zugegeben und die Inkubationen 2 Stunden fortgesetzt. Die Sepharose-Kügelchen wurden durch Zentrifugation gesammelt, mit FACS-TBST-Puffer gewaschen und in SDS-Ladepuffer mit beta-Mercaptoethanol als Reduktionsmittel resuspendiert. Die Proben wurden 5 Minuten gekocht, kurz zentrifugiert, um die Sepharose-Kügelchen zu pelletieren, und ein Aliquot auf SDS-PAGE gefahren. FLAG-huBAFF, 50 ng, wurde als Positivkontrolle mitgefahren. Die Proben wurden auf PVDF-Membranen (Immbillon, P, Millipore) durch Western Blot in 0,01 M CAPS pH 11-10% MeOH-Puffer übertragen. Die Membranen wurden mit 5% NFDM-TBST blockiert, 1 Stunde 1 μg/ml anti-FLAG-M2-HRP ausgesetzt, in TEST gewaschen und an Film exponiert.
  • Ergebnisse
  • Koimmunpräzipitation präzipitiert die verschiedenen Rezeptor:Fc-Fusionen durch die Interaktion des Fusionspartners mit Protein-A-Sepharose. Sie wird auch alle Proteine präzipitieren, die mit den R:IgG1-Fusionen interagieren, wie das flag-BAFF. Konditioniertes Medium von hBCMA:Fc exprimierenden Zellen ist auch in der Lage, flag-BAFF zu koimmunpräzipitieren, wie erwartet, da eine Bande, die mit flag-BAFF komigriert auf dem Western Blot beobachtet wird (12). Konditioniertes Medium von Zellen, die hFN14:Fc exprimieren, koimmunpräzipitiert flag-BAFF nicht. Das konditionierte Medium von Zellen, die BAFF-R:Fc exprimieren, ist auch in der Lage, flag-BAFF zu koImmunpräzipitieren. Eine Bande, die mit flag-BAFF komigriert, wird auf dem Western Blot beobachtet und ist von ähnlicher Intensität wie die, die durch huBCMA:huIgG1 koimmunpräzipitiert wird.
  • Beispiel 13
  • Dieses Beispiel illustriert die Fähigkeit eines BAFF-R:Fc-Fusionsproteins, in diesem Falle von huBAFF-R (Aminosäuren 2-71):huIgG1, die Bindung von huBAFF an BJAB-Zellen zu blockieren.
  • Material und Methoden
  • Die in Beispiel 9 diskutierte huBAFF-R (2-71)-huIgG-Fusion wurde erzeugt und pJST618 genannt. Dieses Konstrukt wurde transient in 293EBNA-Zellen transfiziert und das konditionierte Medium geerntet. Das Fusionsprotein wurde durch Säureelution von Protein-A-Sepharose gereinigt, gefolgt von Gelfiltrationschromatographie. Biotinyliertes myc-huBAFF, 200 ng/ml, wurde mit entweder 50 μl FACS-Puffer oder mit fünffachen Serienverdünnungen, von 5 μg/ml bis 200 ng/ml reichend, von gereinigtem huBAFF-R:Fc 30 Minuten auf Eis präinkubiert. BJAB-Zellen (2,5 × 105 Zellen) wurden dann mit diesen Lösungen auf Eis eine Stunde inkubiert. Die Zellen wurden mit FACS-Puffer gewaschen und mit SAV-PE gefärbt. Die Zellen wurde mit FACS auf PE-Fluoreszenz untersucht, und die Daten als überlagerte Histogramme formatiert. Alternativ wurden 200 ng/ml biotinyliertes BAFF mit zweifachen Serienverdünnungen von entweder hBAFF-R:Fc, hTACI:Fc oder hLTBR:Fc präinkubiert. Die Zellen wurden auf Bindung von biotinyliertem BAFF wie oben angefärbt.
  • Ergebnisse
  • 13A zeigt die Überlagerung von Histogrammen, aufgetragen für huBAFF-Bindung an BJAB in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von huBAFF-R:Fc. Die schwarze mit „A" bezeichnete Linie stellt die Hintergrund-Bindung von SAV-PE dar, und die rote mit „E" bezeichnete Linie stellt mit biotinyliertem myc-huBAFF gefärbte Zellen ohne Präinkubation mit BAFF-R:Fc dar. Präinkubation von biotinyliertem myc-huBAFF mit 5 μg/ml huBAFF-R:Fc führt zu einer Verschiebung im Histogramm fast auf Hintergrundniveau (Kurve B). Präinkubation mit entweder 1 μg/ml (Kurve C) oder 200 ng/ml (Kurve D) huBAFF-R-huIgG1 führte zu einer ungefähr vierfachen Abnahme an Bindung von biotinyliertem myc-huBAFF.
  • 13B zeigt, dass sowohl BAFF-R:Fc als auch TACI:Fc fähig sind, die BAFF-Bindung an BJAB-Zellen zu blockieren. Präinkubation mit LTBR:Fc hat keine BAFF-Blockadeeffekt.
  • Beispiel 14
  • Dieses Beispiel beschriebt die Fähigkeit eines BAFF-R:IgG1-Fusionsproteins, die BAFF-induzierte B-Zell-Proliferation zu blockieren.
  • Material und Methoden
  • Für den in-vitro-Proliferationsassay wurden Mäuse-B-Zellen aus der Milz von C57B16-Mäusen (8 Wochen alt) mit Hilfe einer B-Zell-Gewinnungssäule (CellectTM Mouse B Cell Recovery Column: Cedarlane Laborstories Limited, Ontario, Canada). Gereinigte B-Zellen wurden mit FACS analysiert und > 90% waren positiv für B220-Färbung. Die B-Zellen wurden in 96-well-Platten (105 Zellen/well in 50 ml RPMI supplementiert mit 10% FBS) 72 Stunden in An- oder Abwesenheit von 2 mg/ml von Ziegen-anti-Mensch-m-Ketten-Antikörper (Sigma Chemical Co.) inkubiert; Kontroll-hIgG (10 mg/ml) huBAFF-R:Fc (10 mg/ml). Die Proben wurden dreifach und mit den angegebenen Konzentrationen von myc-hBAFF ausplattiert. Die Zellen wurden zusätzliche 18 Stunden mit [3H]Thymidin (1 μCi/well) gepulst und geerntet. Der [3H]Thymidin-Einbau wurde durch Flüssigszintillationszählung verfolgt. Humanes BAFF-R:Fc-Fusionsprotein, erzeugt wie in Beispiel 13, wurde in diesem Assay verwendet., wie in Beispiel 9 diskutiert, wurde aus dem Überstand von pJST618-transfizierten 293EBNA-Zellen erzeugt. Der Überstand wurde geerntet, auf eine Protein-A-Säule geladen, mit Säure eluiert, neutralisiert und dann der Gelfiltrationschromatographie unterworfen, um aggregatfreies huBAFF-R:Fc-Protein zu erhalten. Das in dem Assay verwendete BAFF wurde in Pichia pastoris exprimiert und durch Anionenaustausch-Chromatographie, gefolgt von Gelfiltration, gereinigt.
  • Ergebnisse
  • 14 zeigt, dass BAFF das B-Zell-Wachstum in Anwesenheit von Anti-m-Antikörpern (Quadrate) und hIgG (Dreiecke) kostimulieren kann. BAFF allein (Rauten) kann die B-Zell-Proliferation nicht induzieren. Inkubation mit 10 mg/ml huBAFF-R:Fc (Sternchen) führt zu einer kompletten Inhibition von BAFF-induzierter B-Zell-Proliferation.
  • Beispiel 15
  • Material und Methoden
  • Mäuse
  • Sechs Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurde von The Jackson Laborstory (Bar Harbor, ME) gekauft und unter Quarantänebedingungen in der Biogen-Tieranstalt gehalten.
  • Reagenzien und Behandlungsschema
  • Rezeptor-Fusionsproteine enthalten die humane IgG1-Fc-Region. Mäuse (5 pro Gruppe) erhielten 200 μg der Fusionsproteine (Mäuse-BAFF-R:Fc oder humanes BAFF-R:Fc) 2× pro Woche für 4 Wochen, ip (intraperitoneal). Kontrollmäuse erhielten polyklonales humanes IgG (PanglobulinTM) (hIgG), 200 μg 2×/Woche für 4 Wochen. Drei Tage nach der letzten Dosis wurde Blut über den orbitalen Sinus gesammelt, dann wurden die Mäuse geopfert und Milz, Lymphknoten und Knochenmark für die Analyse entnommen.
  • Flußzytometrie-Analyse
  • Zum Zeitpunkt der Opferung wurden die Milzgewichte notiert. Einzelzellsuspensionen wurden aus Milz und Blut nach der Lyse roter Blutzellen in einer hypotonen Lösung präpariert. Einzelzellsuspensionen wurden auch aus Leisten-Lymphknoten und Knochemark präpariert. Die Flußzytometrie wurde mit Hilfe von mAks gegen B220, IgM, IgD und CD21 durchgeführt. Milz-B-Zell-Subpopulationen wurden als follikulär (B220+, IgMlow, CD21low), Randzone (B220+, IgMhi, CD21hi) und neugebildet (B220+, IgMhi, CD21-) definiert. Kurz gesagt, es wurden etwa 1,5 × 106 Zellen mit 10 μg/ml Fc-Block (Pharmingen) 10 Minuten auf Eis inkubiert, um Fc-Rezeptoren zu blockieren, gefolgt von Zugabe von fluoreszenzmarkierten mAks, und auf Eis 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden 1x gewaschen und in 0,5% Paraformaldehyd resuspendiert.
  • Zellfluoreszenzdaten wurden auf einem FACSCalibur-Flußzytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) erhoben und mit Hilfe der CellQuest-Software (Becton Dickinson) analysiert.
  • Ergebnisse
  • Nach einem 4wöchigen Behandlungsverlauf mit Mäuse- oder Human-BAFF-R:Fc gab es eine deutliche Reduktion im Gewicht der Milz von Mäusen, die mit Mäuse- und Human-BAFF-R:Fc behandelt wurden (15), verglichen mit Kontroll-Human-IgG-behandelten Mäusen. Die augenscheinliche Abnahme der Zellularität der Milz resultierte, wie gefunden wurde, aus einer Abnahme der Anzahl von Milz-B-Zellen. Die durchschnittliche Zahl der Gesamt-B220+-Milz-B-Zellen in Mäuse- und Human-BAFF-R:Fc-behandelten Mäusen, 1,8 × 106 bzw. 2,6 × 106 Zellen, war signifikant reduziert im Vergleich zur Anzahl der B-Zellen in Kontroll-hIgG-behandelten Tieren, die durchschnittlich 19,8 x 106 Zellen besaßen (16). Die Untersuchung von unterschiedlichen Subpopulationen von Milz-B-Zellen, follikulär, Randzone und neugebildet, deutete an, dass die Anzahl von B-Zellen in jeder Teilmenge in den BAFF-R:Fc-behandelten Mäusen reduziert war (Tabelle 2), obwohl follikuläre und Randzonen-B-Zellen die größte Reduktion aufwiesen. Tabelle 2. BAFF-R:Fc-Behandlung führt zu einer Reduktion in Milz-B-Zell-Subpopulationen
    Milz-B-Zell-Supopulationen (108 Zellen ± SD)
    Follikulär Randzone neugebildet
    Human-IgG 14,5 ± 2,4 1,1 ± 0,3 1,5 ± 0,2
    mBAFF-R:Fc 0,7 ± 0,1 0,06 ± 0,02 0,4 ± 0,1
    hBAFF-R:Fc 1,4 ± 0,5 0,05 ± 0,02 0,5 ± 0,2
  • Die Mause erhielten μg, hIgG, mBAFF-R:Fc oder hBAFF-R:Fc an Tagen 1, 4, 8, 15, 18, 22 und 25. Die Mäuse wurden an Tag 28 geopfert, und die Milz für die Analyse der B-Zell-Teilmengen entnommen.
  • Die Untersuchung des Prozentsatzes an in Leisten-Lymphknoten (LN) enthaltenen B220+-B-Zellen zeigte, dass die mittleren B-Zell-Populationen deutlich reduziert waren in Maus- und Human-BAFF-R:Fc-behandelten Mäusen, 12,3% ± 1,4 bzw. 18,6% ± 1,3, im Vergleich mit Kontroll-hIgG-behandelten Mäusen, die durchschnittlich 30,8% ± 4,1 B-Zellen hatten (17). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn B-Zellen des peripheren Bluts untersucht wurden. 42,5% ± 2,9 der Lymphknoten aus humanen IgG-behandelten Mäusen waren B-Zellen, während nur 21,2% ± 6,1 bzw. 8,3% ± 4,5 der Lymphozyten B-Zellen aus Mäuse- bzw. Human-BAFF-R:Fc-behandelten Mäusen waren (18).
  • Obwohl neugebildete (unreife) B-Zell- und reife B-Zell-Populationen in BAFF-R:Fc-behandelten Mäusen reduziert waren, blieben die B-Zell-Vorläufer im Knochenmark unbetroffen (Daten nicht gezeigt).
  • Diskussion
  • Diese Ergebnisse legen nahe, dass die in-vivo-Blockade von BAFF mit einem löslichen BAFF-R-Rezeptor-Fusionsprotein zur Inhibition des B-Zell-Überlebens und/oder der B-Zell-Reifung führt.
  • Diese Ergebnisse legen auch eine mögliche Verwendung eines BAFF-R-Fusionsproteins als therapeutischer Wirkstoff mit klinischen Anwendungen in B-Zell-vermittelten Krankheiten nahe. Krankheiten umfassen jene, die ihrem Wesen nach autoimmun sind, wie systemischer Lupus erythematodes, Myasthenia gravis, autoimmune hämolytische Anämie, idiopathische thrombozytopenische Purpurs, Antiphospholipid-Syndrom, Chagas-Krankheit, Basedowsche Krankheit, Wegener-Granulomatose, Polyarteriitis nodosa oder schnellfortschreitende Glomerulonephritis. Der therapeutische Wirkstoff findet auch Anwendung in Plasmazellstörungen wie multiplem Myelom, Waldenström-Makroglobulinämie, Schwerkettenkrankheit, primärer oder immunozytensassoziierter Amyloidose oder Monoklonaler Gammopathie unklarer Signifikanz (MGUS). Onkologie-Targets umfassen B-Zell-Karzinome, Leukämien und Lymphome.
  • Beispiel 16:
  • In diesem Beispiel wird die Charakterisierung eines anfänglichen Satzes von murinen monoklonalen Antikörpern gegen die extrazelluläre Domäne von BAFF-R beschrieben. Alle Antikörper erkennen die extrazelluläre Domäne von BAFF-R, und eine Teilmenge dieser Antikörper hat antagonistische Eigenschaften, da sie die nachfolgende Bindung von BAFF an BAFF-R verhindern.
  • Material und Methoden:
  • RBF-Mäuse wurden mit huBAFF-R:Fc immunisiert und geboostet. Milzzellen aus der immunen Maus wurden mit Maus-Myelom-Stamm FL653 fusioniert, einem Derivat des Stamms P3-X63-Ag8.653, um Hybridome mit Standardtechnologien zu erzeugen.
  • Konditioniertes Medium von Hybridom-Klonen, die Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne von huBAFFR sekretieren, wurden mit FACS analysiert. FACS-Bindeassays wurden mit 293EBNA-Zellen durchgeführt, die mit Plasmiden kotransfiziert waren, die Volllängen-huBAFF-R oder -muBAFF-R und GFP wie in Beispiel 5 exprimieren. Koniditioniertes Hybridom-Medium wurde 1:10 in FACS-Puffer verdünnt und mit den transfizierten Zellen 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden mit FACS-Puffer gewaschen und die Bindung wurde durch Inkubation mit einer 1:100-Verdünnung von anti-Maus-IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) 30 Minuten auf Eis sichtbar gemacht. Die Zellen wurden erneut mit FACS-Puffer gewaschen und in 1% Paraformaldehyd in FACS-Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden mit FACS auf GFP- und PS-Fluoreszenz analysiert, und die Daten wurden in einem Vier-Quadranten-Punktdiagramm wie in Beispiel 5 beschrieben formatiert. BAFF-Blockade-Assays wurden durch Inkubieren von 10 μg/ml Protein-A-gereinigtem anti-BAFF-R-mAk oder Kontroll-Antikörper (MOP C21) mit BJAB-Zellen 30 Minuten auf Eis durchgeführt. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit 250 ng/ml biotinyliertem huBAFF 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden erneut gewaschen, und die BAFF-Bindung durch Inkubation mit SAV-PE sichtbar gemacht. Die Zellen wurden mit FACS auf PS-Fluoreszenz untersucht, und die Daten wurden als überlagerte Histogramme aufgetragen.
  • Ergebnisse:
  • Es wurde beobachtet, dass die Überstände von zehn Klonen huBAFF-R-transfizierte Zellen binden. Die Punktdiagramme der FACS-Daten von vier der zehn anti-BAFF-R-Überstände sind in 19A gezeigt. Die Transfektionseffizienz war ungefähr 50%, wobei fast alle transfizierten Zellen sich in den oberen rechten Quadranten nach Anfärben mit Überständen verschieben.
  • Keiner dieser zehn Überstände band an 293EBNA-Zellen, die mit muBAFFR transfiziert waren (Daten nicht gezeigt). Konditioniertes Medium von den Klonen, die positiv für Bindung an BAFF-R waren, wurde auf seine Fähigkeit getestet, die Wechselwirkung von BAFF mit dem BAFF-R, das auf der Oberfläche von BJAB-Zellen exprimiert wird, zu blockieren. BJAB-Zellen exprimieren BAFFR auf ihrer Oberfläche, und exprimieren keine detektierbaren Mengen an BCMA oder TACI (Thompson et al. (2001) Science Aug 16). Zwei der zehn Hybridome, Klone 2 und 9, produzierten mAks, die die Wechselwirkung von BAFF-R mit BAFF blockieren konnten. (Klon 2 wurde bei der ATCC am 6. September 2001 als „anti-BAFF-R-Klon #2.1" (IgG1-kappa-Isotyp) deponiert und erhielt die ATCC-Nummer ______;Klon 9 wurde wurde bei der ATCC am 6. September 2001 als „anti-BAFF-R-Klon #9.1" (IgG1-kappa-Isotyp) deponiert und erhielt die ATCC-Nummer _______). Die Überlagerungen der Histogramme in 19B zeigen, dass Präinkubation von 10 μg/ml von entweder mAk-Klon 2 (Kurve (b)) oder 9 (Kurve (c)) die BAFF-Bindekurve mehr als zehnfach nach links verschiebt, fast bis zum Signal der Kein-BAFF-Kontrolle (Kurve (a)). Das äußerst rechte Histogramm (Kurve (d)) deutet die Verschiebung an, wenn Kontroll-mAk MOP C21, anti-BAFF-R-nichtblockierende mAks oder kein Protein mit den Zellen vor der BAFF-Bindung inkubiert wurden.
  • Beispiel 17:
  • Dieses Beispiel beschreibt die Kontruktion, Sequenz und Proteincharakterisierung von Aminosäuresubstitutionen in hBAFF-R(2-71)-Fc, die zu einer erhöhten Löslichkeit des rekombinant exprimiertern Moleküls führen.
  • Material und Methoden:
  • Doppelsträngige Oligonukleotidkassetten mit kohäsiven Enden wurden verwendet, um Substitutionen bei gezielten Resten durch Ligation in dieselben Stellen im hBAFF-R(2-71):IgG1-Gen einzuführen.
  • Expressionsplasmide wurden mit Hilfe von Lipofectamin 2000 in 293EBNA-Zellen wie in Beispiel 5transfiziert. Die Aggregation wurde durch das Fahren einer nichtreduzierenden SDS-PAGE von konditioniertem Medium 20 Stunden nach Transfektion bestimmt, gefolgt von Western-Transfer und Detektion mit HRP-konjugiertem Anti-Human-IgG (1:100, Jackson ImmunoResearch) und ECL-Detektion wie in Beispiel 12.
  • Immunpräzipitations-Experimente wurden mittels 100 μl konditionierten Mediums 20 Stunden nach Transfektion in 1 ml DMEM/10% FBS/0,2% NaN3 mit 200 ng flag-huBAFF. Proben wurden 30 Minuten bei 4°C geschüttelt, 30 μl Protein-A-Sepharose wurde pro Gefäß zugegeben und das Schütteln weitere 30 Minuten fortgesetzt. Die Sepharose-Kügelchen wurden abzentrifugiert und drei Mal mit 1 ml kaltem PBS gewaschen. Die Kügelchen wurden in 2X SDS-reduzierendem Puffer resuspendiert und auf 4-20%-Acrylamid-Gele geladen. Nach Western-Transfer wie bereits beschrieben wurde die Fähigkeit, flag-BAFF zu immunpräzipitieren durch Inkubation der Filter mit 1 μg/ml HRP-konjugierte Anti-flag-M2 (Sigma), gefolgt von ECL-Detektion, sichtbar gemacht.
  • Ergebnisse:
  • Während das humane BAFF-R:Fc stark aggregiert ist, ist das murine BAFF-R:Fc nur schwach (<10%) aggregiert. Die Deletionsanalyse hat gezeigt, dass der gesamte C-terminale BAFF-R-Teil von A71 bis V36 (letztes Cys der cysteinreichen Domäne (CRD) ist C35) ohne Verminderung der Aggregatbildung deletiert werden kann. Dies würde bedeuten, dass die N-terminale und die CRD-Region von hBAFFR für die Aggregatbildung erforderlich sind.
  • Anfangs wurden mehrere murin-humane BAFF-R:Fc-Chimären erzeugt, in denen verschiedene Mengen N-terminaler humaner BAFF-R-Sequenz durch die homologe murine Sequenz ersetzt wurden und auf den Effekt auf die Proteinaggregation hin untersucht wurden. Die Aminosäuresequenzen dieser und nachfolgender Substitutionen in hBAFF-R:Fc sind in 20 gezeigt. Diese Abbildung zeigt den BAFF-R-Bestandteil sowohl des „Wildtyp"humanen (9) und -murinen BAFF-R:Fc, wobei die Numerierung den Aminosäureresten von Volllängen-Human (2D) (SEQ ID NO:5) oder -Maus-BAFF-R (4B) (SEQ ID NO:9) entspricht. 20 zeigt auch die hBAFF-R:Fc-Klone mit Substitutionen, wobei die substituierten Reste in fetter, roter, unterstrichener Schrift angedeutet sind. Die Chimären, die weniger als die ersten 21 murinen Reste (Q21) vor dem Wechsel zu human enthalten, scheinen ähnlich wie Wildtyp-hBAFF-R:Fc zu aggregieren; jene, die jedoch mindestens die ersten 39 murinen Reste enthalten, aggregieren in einer bedeutend verminderten Weise, ähnlich wie mBAFF-R. Von den weiteren neun Resten, die zwischen diesen zwei chimären BAFF-R:Fc-Konstrukten verschieden sind, unterscheiden sich vier zwischen Maus und Mensch. Das würde bedeuten, dass mindestens einer der humanen Reste zwischen C19 und L27, einer Region innerhalb der CRD, für die Aggregation erforderlich ist.
  • Konstrukte, die die humanen Reste mit denen, die den murinen entsprechen, nur an diesen 4 Stellen oder einer Teilmenge davon ersetzen, wurden mit Standardtechniken hergestellt. Wurden nur die 4 Reste V20N P21Q A22T L27P im humanen BAFF-R-Bestandteil substituiert, aggregierte dieses modifizierte BAFF-R:Fc nicht. hBAFF-R (V20N P21Q A22T L27P):Fc konnte immer noch mit BAFF Wechselwirken, wie durch Immunpräzipitation analysiert. Die V20N L27P-Substitution verminderte auch die Aggregation von hBAFF-R:Fc von etwa 90% auf etwa 10%. Dazwischen liegende Aggregationsstufen wurden mit P21Q L27P (40%), L27P (60%), V20N L27A (60%) und V20N L27N (60%) beobachtet. Keine der folgenden Substitutionen verminderte die Proteinaggregation: V20N P21Q A22T; V20N A22T; V20N P2Q; V20N; und P21Q.
  • Beispiel 18
  • Diese Beispiel beschreibt p21-Arc, ein mit BAFF-R assoziiertes Protein. Das zur Bestimmung einer solchen Wechselwirkung verwendete Verfahren war Immunpräzipitation.
  • Methoden
  • Ein die cDNA enthaltendes Konstrukt mit einem am N-Terminus angehängten myc-Tag, das für die intrazelluläre Domäne von BAFF-R (BAFF-R-i.c.d.) kodiert, wurde hergestellt und in ein CH269-Plasmid an den NheI (5') und XhoI (3')-Stellen subkloniert. Die 293E-Zellen wurden mit diesem Konstrukt transfiziert und 72 Stunden danach mit Lysepuffer, enthaltend 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF and 1% Brij 97, lysiert. Die Zellysate wurden mit einer Tischzentrifuge bei 10000g für 5 Minuten klar gemacht und mit einem monoklonalen anti-myc-Antikörper, 9E10, immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden durch eine 10-20% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transgeblottet. Die geblotteten Proteine wurden mit 0,2% Ponceau-S-Lösung visualisiert, und die Bereiche, die Proteinen entsprachen, die spezifisch mit BAFF-R assoziiert sind, wurden ausgeschnitten und N-terminaler Aminosäuresequenzanalyse unterworfen. Eine zweideutige Suche in der nichtredundanten Proteindatenbank mit Hilfe des PATTERN SEARCH-Algorithmus' wurde für die erhaltenen N-terminalen Sequenzdaten durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Eines der spezifisch mit der myc-getaggten cytoplasmatischen Domäne von BAFFR assoziierten Proteine hat ein scheinbares Molekulargewicht von 21 kDa. Dieses Protein wurde unzweideutig als p21-Arc identifiziert (Actin-verwandter Proteinkomplex). P21-Arc ist eine Komponente eines Sieben-Untereinheiten-Proteins, genannt Arp2/3-Komplex, für das gezeigt wurde, dass es an der Actin-Polymerisation beteiligt ist (Welch et al. (1997) J. Cell Biol. 138:357). Kürzlich wurde ein actinbindendes Protein, Filamin, als mit dem Tumornekrosefaktor-Rezeptor-assoziierten Faktor 2 (TRAF2) (Leonardi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:271) assoziiert beschrieben. Daher legt die Identifikation von p21-Arc in der Koimmunpräzipitation mit BAFFR-zytoplasmatischer Domäne nahe, dass p21-Arc entweder direkt mit BAFFR assoziiert ist, oder mit BAFFR indirekt über seine Assoziation mit TRAF2 und/oder einem anderen TRAF-Protein, welches wiederum mit BAFF-R assoziiert, assoziiert ist. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (75)

  1. Ein isoliertes BAFF-R (B-Zell-Aktivierungsfaktor der TNF-Familie-Rezeptor)-Polypeptid, umfassend: (a) SEQ ID NO:5; (b) ein Fragment von SEQ ID NO:5, das an BAFF (B-Zell-Aktivierungsfaktor der TNF-Familie) bindet; (c) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 70% identisch mit SEQ ID NO:5 oder einem Fragment von SEQ ID NO:5 ist; (d) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 80% identisch mit SEQ ID NO:5 oder einem Fragment von SEQ ID NO:5 ist; (e) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 90% identisch mit SEQ ID NO:5 oder einem Fragment von SEQ ID NO:5 ist; (f) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 95% identisch mit SEQ ID NO:5 oder einem Fragment von SEQ ID NO:5 ist; (g) SEQ ID NO:5 oder ein Fragment von SEQ ID NO:5, modifiziert durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen, wobei die modifizierte Sequenz an BAFF bindet.
  2. Das isolierte BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid umfaßt: (a) SEQ ID NO:10; (b) ein Fragment von SEQ ID NO:10, das an BAFF bindet; (c) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 70% identisch mit SEQ ID NO:10 oder einem Fragment von SEQ ID NO:10 ist; (d) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 80% identisch mit SEQ ID NO:10 oder einem Fragment von SEQ ID NO:10 ist; (e) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 90% identisch mit SEQ ID NO:10 oder einem Fragment von SEQ ID NO:10 ist; (f) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 95% identisch mit SEQ ID NO:10 oder einem Fragment von SEQ ID NO:10 ist; (g) SEQ ID NO:10 oder ein Fragment von SEQ ID NO:10, modifiziert durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen, wobei die modifizierte Sequenz an BAFF bindet.
  3. Das isolierte BAFF-R-Polypeptid nach Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Polypeptid umfaßt: (a) Aminosäuren 19-35 von SEQ ID NO:5; (b) Aminosäuren 19-35 von SEQ ID NO:5, modifiziert durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen, wobei die modifizierte Sequenz an BAFF bindet; (c) SEQ ID NO:13; oder (d) SEQ ID NO:13, modifiziert durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen, wobei die modifizierte Sequenz an BAFF bindet.
  4. Das isolierte BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) SEQ ID NO:15; (b) SEQ ID NO:16; (c) SEQ ID NO:17; (d) SEQ ID NO:18; (e) SEQ ID NO:19; (f) SEQ ID NO:20; (g) SEQ ID NO:21; (h) SEQ ID NO:22; (i) SEQ ID NO:23; (j) SEQ ID NO:24; (k) SEQ ID NO:25; (l) SEQ ID NO:26; (m) SEQ ID NO:27; (n) SEQ ID NO:28; (o) SEQ ID NO:29; (p) SEQ ID NO:30; (q) SEQ ID NO:31; (r) SEQ ID NO:32; (s) einem Fragment einer Sequenz aus (a)-(r), das an BAFF bindet; und (t) einer Sequenz aus (a)-(s), modifiziert durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen, wobei das modifizierte Polypeptid an BAFF bindet.
  5. Das isolierte BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 4, umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) SEQ ID NO:19; (b) SEQ ID NO:22; (c) SEQ ID NO:24; (d) SEQ ID NO:25; (e) SEQ ID NO:26; (f) SEQ ID NO:27; und (g) einem Fragment einer Sequenz aus (a)-(f), das an BAFF bindet.
  6. Das isolierte BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Polypeptid an BAFF bindet und eine erniedrigte Neigung zu Aggregation, verglichen mit dem korrespondierenden nativen BAFF-R-Polypeptid, besitzt und: (a) SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:10, wobei eine oder mehrere nichtkonservierte Aminosäuren in der Region C19-L27 des nativen BAFF-R-Polypeptids mit korrespondierenden Aminosäuren eines BAFF-R-Polypeptids nach SEQ ID NO:9 substituiert sind; oder (b) ein Fragment von (a), das an BAFF bindet; umfaßt.
  7. Das isolierte BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 6, wobei die Substitutionen an einer oder mehreren Stellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) V20, P21, A22 und L27 von SEQ ID NO:10; (b) V41, P42, A43 und L48 von SEQ ID NO:12; und (c) C19 bis L27 eines Fragments von SEQ ID NO:10, umfassend Aminosäuren 2-71; eingeführt werden.
  8. Das isolierte BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 7, umfassend Aminosäuren 2-71 von SEQ ID NO:10, wobei die abgeänderten Aminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: (a) V20N, P21Q, A22T und L27P; (b) V20N und L27P; (c) P21Q und L27P; (d) L27P; (e) V20N und L27A; und (f) V20N und L27S.
  9. Das isolierte BAFF-R-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Polypeptid ein chimäres Protein ist.
  10. Das chimäre BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 9, umfassend: (a) SEQ ID NO:12; (b) ein Fragment von SEQ ID NO:12, das an BAFF bindet; (c) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und mindestens 80% identisch mit SEQ ID NO:12 oder einem Fragment von SEQ ID NO:12 ist; oder (d) SEQ ID NO:12 oder ein Fragment von SEQ ID NO:12, modifiziert durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen, wobei die modifizierte Sequenz an BAFF bindet.
  11. Das chimäre BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 10, umfassend Aminosäuren 23-92 von SEQ ID NO:12 und die Fc-Region von menschlichem IgG1.
  12. Das chimäre BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 9, umfassend: (a) die Fc-Region eines Antikörpers; (b) von einem Immunglobulin-Protein abgeleitete Sequenzen; (c) eine heterologe Signalsequenz; oder (d) Glutathion-S-Transferase.
  13. Das chimäre BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 9, umfassend eine konstante Region eines Immunglobulins und ein BAFF-R-Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem aus SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 und SEQ ID NO:32; und (b) ein Fragment aus (a), das an BAFF bindet.
  14. Ein isoliertes BAFF-R-Polypeptid, umfassend: (a) SEQ ID NO:9; (b) ein Fragment von SEQ ID NO:9, das an BAFF bindet; (c) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 70% identisch mit SEQ ID NO:9 oder einem Fragment von SEQ ID NO:9 ist; (d) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 80% identisch mit SEQ ID NO:9 oder einem Fragment von SEQ ID NO:9 ist; (e) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 90% identisch mit SEQ ID NO:9 oder einem Fragment von SEQ ID NO:9 ist; (f) SEQ ID NO:9 oder ein Fragment von SEQ ID NO:9, modifiziert durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen, wobei die modifizierte Sequenz an BAFF bindet.
  15. Ein isoliertes BAFF-R-Polypeptid, umfassend: (a) SEQ ID NO:14; (b) ein Fragment von SEQ ID NO:14, das an BAFF bindet; (c) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 70% identisch mit SEQ ID NO:14 oder einem Fragment von SEQ ID NO:14 ist; (d) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 80% identisch mit SEQ ID NO:14 oder einem Fragment von SEQ ID NO:14 ist; (e) eine Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 90% identisch mit SEQ ID NO:14 oder einem Fragment von SEQ ID NO:14 ist; (f) SEQ ID NO:14 oder ein Fragment von SEQ ID NO:14, modifiziert durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen, wobei die modifizierte Sequenz an BAFF bindet.
  16. Ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die für ein BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 14 oder Anspruch 15 kodiert.
  17. Ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die für ein BAFF-R-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-13 kodiert.
  18. Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 17, wobei das Molekül eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, die ausgewählt ist aus Gruppe bestehend aus: (a) SEQ ID NO:3; (b) SEQ ID NO:4; (c) SEQ ID NO:6; (d) SEQ ID NO:11; (e) Nukleotiden 67-276 von SEQ ID NO:11; (f) Nukleotiden 67-276 und 280-960 von SEQ ID NO:11; (g) einem Fragment von mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz aus (a)-(e); (h) einem Fragment einer Sequenz aus (a)-(f), das für ein Polypeptid kodiert, das an BAFF bindet; (i) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das an BAFF bindet und zu mindestens 70% identisch mit einer Sequenz aus (a)-(h) ist; (j) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das an BAFF bindet und zu mindestens 80% identisch mit einer Sequenz aus (a)-(h) ist; (k) einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das an BAFF bindet und zu mindestens 90% identisch mit einer Sequenz aus (a)-(h) ist.
  19. Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, wobei das Molekül für ein BAFF-R-Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus Gruppe bestehend aus: (a) SEQ ID NO:5 oder einem Fragment von SEQ ID NO:5, das an BAFF bindet; (b) SEQ ID NO:10 oder einem Fragment von SEQ ID NO:10, das an BAFF bindet; (c) SEQ ID NO:13 oder einem Fragment von SEQ ID NO:13, das an BAFF bindet; (d) einer Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 70% identisch mit einer Sequenz aus (a)-(c) ist; (e) einer Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 80% identisch mit einer Sequenz aus (a)-(c) ist; und (f) einer Aminosäuresequenz, die an BAFF bindet und zu mindestens 90% identisch mit einer Sequenz aus (a)-(c) ist.
  20. Das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, das kürzer als Vollängen-BAFF-R ist und an BAFF bindet.
  21. Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 17, wobei das kodierte Polypeptid ausgewählt ist aus Gruppe bestehend aus: (a) SEQ ID NO:19; (b) SEQ ID NO:22; (c) SEQ ID NO:24; (d) SEQ ID NO:25; (e) SEQ ID NO:26; (f) SEQ ID NO:27; und (g) einem Fragment von einer Sequenz aus (a)-(f), das an BAFF bindet.
  22. Ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die (a) unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder Nukleotide 67-276 von SEQ ID NO:11 hybridisiert; (b) unter stringenten Bedingungen an ein Komplement von SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 hybridisiert; oder (c) komplementär zu einer Nukleinsäure der SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder Nukleotiden 67-276 von SEQ ID NO:11 ist, wobei die stringenten Bedingungen in (a) und (b) 6x SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA und 500 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 65°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschen in 0,2x SSC, 0,1% BSA bei 50°C sind, und wobei die Sequenz von Nukleotiden aus (a), (b) und (c) nicht EST AI 250289 , SEQ ID NO:2 oder GenBank-Zugriffsnummer Z99716 ist.
  23. Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 22, wobei die Sequenz von Nukleotiden komplementär zu dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 18 ist.
  24. Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 16, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) SEQ ID NO:8; (b) einem Fragment von SEQ ID NO:8, umfassend mindestens 100 aufeinanderfolgende Nukleotide; (c) einer Nukleinsäuresequenz, die für SEQ ID NO:14 kodiert; (d) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 70% identisch mit SEQ ID NO:14 ist und an BAFF bindet; (e) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 90% identisch mit SEQ ID NO:14 ist und an BAFF bindet; und (f) einer Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu einer Sequenz aus (a)-(e) ist.
  25. Ein Vektor, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 17 bis 23.
  26. Eine Zelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 25.
  27. Die Zelle nach Anspruch 26, wobei die Zelle eine Eierstockzelle des Chinesischen Hamsters ist.
  28. Die Zelle nach Anspruch 26, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 19.
  29. Ein Antikörper oder ein Polypeptid, umfassend eine Antigen-Binderegion des Antikörpers, wobei der Antikörper oder die Antigen-Binderegion des Polypeptids spezifisch an den BAFF-R-Teil des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 15 bindet.
  30. Der Antikörper oder ein Polypeptid nach Anspruch 29, wobei der Antikörper oder die Antigen-Binderegion des Polypeptids spezifisch an ein BAFF-R-Polypeptid bindet, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) SEQ ID NO:5; (b) SEQ ID NO:10; (c) SEQ ID NO:13; und (d) einem Fragment einer Sequenz aus (a)-(c), das an BAFF bindet.
  31. Der Antikörper oder das Polypeptid nach Anspruch 29 oder 30, wobei der Antikörper oder die Antigen-Binderegion des Polypeptids eines oder mehrere der folgenden sind: (a) monoklonal; (b) polyklonal; (c) chimär; (d) humanisiert; (e) ein Einzelkettenantikörper; (f) ein Fab-Fragment; und (g) ein F(ab)'2-Fragment.
  32. Der Antikörper oder das Polypeptid nach Anspruch 31, wobei der Antikörper oder die Antigen-Binderegion des Polypeptids spezifisch an ein Polypeptid nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 bindet.
  33. Der Antikörper nach Anspruch 29 oder Anspruch 30, hergestellt durch: (a) Hybridomklon #2.1, hinterlegt als ATCC-Nr. PTA-3689; oder (b) Hybridomklon #9.1, hinterlegt als ATCC-Nr. PTA-3688.
  34. Der Antikörper nach einem der Ansprüche 29 bis 33 oder das Polypeptid nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei der Antikörper oder oder die Antigen-Binderegion des Polypeptids die Bindung von BAFF an BAFF-R verhindert.
  35. Der Antikörper oder das Polypeptid nach Anspruch 34, wobei der Antikörper oder die Antigen-Binderegion des Polypeptids humanisiert ist.
  36. Der Antikörper oder das Polypeptid nach Anspruch 30, wobei der Antikörper oder die Antigen-Binderegion des Polypeptids humanisiert ist.
  37. Ein Hybridom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hybridomklon #2.1, hinterlegt als ATCC-Nr. PTA-3689, und Hybridomklon #9.1, hinterlegt als ATCC-Nr. PTA-3688.
  38. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein(en) oder mehrere: (a) Polypeptid(e) nach einem der Ansprüche 1 bis 13; und (b) Antikörper oder eine Antigen-Binderegion des Antikörpers umfassende(s) Polypeptid(e), nach einem der Ansprüche 29 bis 36.
  39. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 38, umfassend den Antikörper oder das eine Antigen-Binderegion des Antikörpers umfassende Polypeptid nach Anspruch 36.
  40. Das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13, oder der Antikörper oder das eine Antigen-Binderegion des Antikörpers umfassende Polypeptid nach einem der Ansprüche 29 bis 36, zur Verwendung in der Therapie.
  41. Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13, oder des Antikörpers oder des eine Antigen-Binderegion des Antikörpers umfassenden Polypeptids nach einem der Ansprüche 29 bis 36, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung eines B-Zell-vermittelten Zustandes, einer Plasmazell-Störung, einer Autoimmunkrankheit, eines tumorigenen Zustandes, der Hypertonie, einer kardiovaskulären Störung, einer Nierenstörung, einer B-Zell-lymphoproliferativen Störung, des Burkett-Lymphoms, einer immunsuppressiven Krankheit, einer Organtransplantation, einer Entzündung oder von HIV.
  42. Die Verwendung nach Anspruch 41, wobei die Plasmazell-Störung multiples Myelom, Waldenström-Makroglobulinämie, Schwerkettenkrankheit, primäre oder immunozytenassoziierte Amyloidose oder Monoklonale Gammopathie unklarer Signifikanz (MGUS) ist.
  43. Die Verwendung nach Anspruch 41, wobei die Autoimmunkrankheit rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, Myasthenia gravis, autoimmune hämolytische Anämie, idiopathische thrombozytopenische Purpura, Antiphospholipid-Syndrom, Chagas-Krankheit, Basedowsche Krankheit, Wegener-Granulomatose, Polyarteriitis nodosa oder Glomerulonephritis ist.
  44. Die Verwendung nach Anspruch 41, wobei der tumorigene Zustand ein B-Zell-Karzinom, Leukämie oder Lymphom ist.
  45. Die Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Medikament formuliert ist zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung von systemischem Lupus erythematodes.
  46. Die Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Medikament formuliert ist zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung von rheumatoider Arthritis.
  47. Die Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Medikament das Polypeptid nach Anspruch 3 oder Anspruch 5 umfaßt und formuliert ist zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung von systemischem Lupus erythematodes.
  48. Die Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Medikament den Antikörper oder das eine Antigen-Binderegion des Antikörpers umfassende Polypeptid nach Anspruch 36 umfaßt und formuliert ist zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung von systemischem Lupus erythematodes.
  49. Die Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Medikament das Polypeptid nach Anspruch 3 oder Anspruch 5 umfaßt und formuliert ist zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung von rheumatoider Arthritis.
  50. Die Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Medikament den Antikörper oder das eine Antigen-Binderegion des Antikörpers umfassende Polypeptid nach Anspruch 36 umfaßt und formuliert ist zur Behandlung, Vorbeugung oder Verzögerung von rheumatoider Arthritis.
  51. Eine isolierte Nukleinsäure-Sonde, bestehend aus von 10 bis 50 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, ausgewählt aus: (a) einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6; (b) SEQ ID NO:8; (c) einer Sequenz, die komplementär ist zu einer Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6; und (d) Degenerierten von (a) oder (b), die für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren.
  52. Ein Verfahren zur Herstellung eines BAFF-R-Polypeptids, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Zelle nach einem der Ansprüche 26 bis 28; (b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die zur Expression des BAFF-R-Polypeptids genügen; und (c) Gewinnen des BAFF-R-Polypeptids.
  53. Ein Verfahren zur Identifizierung eines funktional aktiven mutierten BAFF-R-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-15, wobei das Verfahren das Beurteilen des mutierten BAFF-R nach einer oder mehrerer der folgenden Aktivitäten umfaßt: (a) der Fähigkeit zur Bindung an BAFF; (b) der Fähigkeit, an ein intrazelluläres Zielprotein oder einen biologisch aktiven Teil davon zu binden; und (c) der Fähigkeit, spezifisch an einen anti-BAFF-R-Antikörper zu binden, wobei das Vorliegen einer oder mehrerer dieser Aktivitäten anzeigt, daß das mutierte BAFF-R funktional aktiv ist.
  54. Ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Aktivität von BAFF-R moduliert, umfassend die Schritte: (a) Kontaktieren eines BAFF-R nach einem der Ansprüche 1-15 mit einer Verbindung; und (b) Bestimmen, ob die Aktivität des BAFF-R moduliert wurde.
  55. Ein Verfahren zur Herstellung eines BAFF-R-Polypeptids mit verminderter Neigung zur Aggregation, verglichen mit dem korrespondierenden nativen BAFF-R-Polypeptid, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit einer Nukleinsäure, die für ein BAFF-R-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-15 kodiert, in dem eine oder mehrere nichtkonservierte Aminosäure(n) in der Region C19-L27 mit korrespondierenden Aminosäuren des BAFF-R-Polypeptids von SEQ ID NO:9 substituiert sind; (b) Kultivieren der Zelle under Bedingungen, die zur Expression des BAFF-R-Polypeptids mit substituierter/n Aminosäure(n) genügen; und (c) Gewinnen des BAFF-R-Polypeptids aus (b).
  56. Das Verfahren nach Anspruch 55, wobei die nichtkonservierte Aminosäure eine nichtpolare Aminosäure ist.
  57. Das Verfahren nach Anspruch 56, wobei die nichtpolare Aminosäure gegen eine Aminosäure ausgetauscht ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Prolin, Serin und Alanin.
  58. Ein nichthumanes transgenes Tier, in dem exogene BAFF-R-Sequenzen, die für das BAFF-R-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-15 kodieren, in dessen Genom eingeführt worden sind oder in dem endogene BAFF-R-Sequenzen geändert worden sind.
  59. Ein Kit, umfassend mindestens einen Antikörper nach einem der Ansprüche 29 bis 36 und eine Kontrolle.
  60. Ein Verfahren zur Identifizierung von Zellen oder Geweben, die BAFF-R falsch exprimieren, umfassend: (a) das Kontaktieren einer Oligonukleotid-Sonde, die mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide einer Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 und Sequenzen, die komplementär sind zu einer aus: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6, mit einer biologischen Probe eines Subjekts; und (b) das Messen des Niveaus einer BAFF-R-kodierenden Nukleinsäure in der biologischen Probe durch Detektieren des BAFF-R-mRNA-Niveaus; oder alternativ (c) das Bestimmen, ob eine BAFF-R-Nukleinsäure in der biologischen Probe mutiert oder deletiert wurde.
  61. Ein Diagnosekit zur Identifizierung von Zellen oder Geweben, die BAFF-R falsch exprimieren, umfassend eine Oligonukleotid-Sonde, die mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide einer Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 und Sequenzen, die komplementär sind zu einer aus: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6.
  62. Ein Kit zur Detektion der Anwesenheit von BAFF-R in einer biologischen Probe, umfassend: eine markierte Verbindung oder ein markiertes Agens, die/das das BAFF-R-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-15 oder eine für das BAFF-R-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-15 kodierende mRNA detektieren kann; ein Mittel zur Bestimmung der Menge an BAFF-R in der Probe; und ein Mittel zum Vergleichen der Menge an BAFF-R-Polypeptid oder mRNA in der Probe mit einem Standard.
  63. Ein in-vitro-Verfahren zur Diagnose eines B-Zell-vermittelten Zustandes in einem Subjekt, umfassend die Schritte: (a) Messen der Menge an BAFF-R-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-15 oder an einer für ein BAFF-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-15 kodierenden BAFF-R-Nukleinsäure in einer biologischen Probe aus dem Subjekt; und (b) Vergleichen der Menge an BAFF-R-Polypeptid oder BAFF-R-Nukleinsäure in der Probe des Subjekts mit der Menge an BAFF-R-Polypeptid oder BAFF-R-Nukleinsäure in einer Kontroll-Probe, wobei ein Unterschied in der Menge an BAFF-R-Polypeptid oder BAFF-R-Nukleinsäure in der Probe des Subjekts verglichen mit der Menge an BAFF-R-Polypeptid oder BAFF-R-Nukleinsäure in der Kontroll-Probe anzeigt, daß das Subjekt in einem B-Zell-vermittelten Zustand ist.
  64. Verwendung (a) des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13; (b) des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 17 bis 23; (c) des Antikörpers nach einem der Ansprüche 29 bis 36; oder (d) der Sonde nach Anspruch 51, zur Herstellung eines diagnostischen Reagenzes zur Diagnose eines B-Zell-vermittelten Zustandes.
  65. Ein BAFF-R-Polypeptid, hergestellt durch das Verfahren: (a) Kultivieren einer Wirtszelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-15 kodiert, unter Bedingungen, die zur Expression des BAFF-R-Polypeptids genügen; und (b) Isolieren des exprimierten Polypeptids.
  66. Ein chimäres Polypeptid, hergestellt durch das Verfahren: (a) Kultivieren einer Wirtszelle, umfassend eine Nukleinsäure, die kodiert für: (i) ein BAFF-R-Polypeptid, umfassend (i) SEQ ID NO:10 oder ein Fragment von SEQ ID NO:10, das an BAFF bindet; und (ii) ein Nicht-BAFF-R-Polypeptid, unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionsproteins genügen; und (b) Isolieren des exprimierten chimären BAFF-R-Polypeptids.
  67. Das BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 65 oder das chimäre Polypeptid nach Anspruch 66, wobei das BAFF-R-Polypeptid Aminosäuren 2-71 von SEQ ID NO:10 oder ein Fragment davon, das an BAFF bindet, umfaßt.
  68. Das BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 65 oder das chimäre Polypeptid nach Anspruch 66, wobei das BAFF-R-Polypeptid Aminosäuren 2-71 von SEQ ID NO:10 umfaßt.
  69. Das chimäre Polypeptid nach einem der Ansprüche 66 bis 68, wobei das Nicht-BAFF-R-Polypeptid die Fc-Domäne von menschlichem IgG umfaßt.
  70. Das BAFF-R-Polypeptid nach Anspruch 65 oder das chimäre Polypeptid nach einem der Ansprüche 66 bis 69, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.
  71. Das Polypeptid nach Anspruch 70, wobei die Säugerzelle eine Eierstockzelle des Chinesischen Hamsters ist.
  72. Das Polypeptid nach Anspruch 70, wobei die Säugerzelle eine 293-EBNA-Zelle ist.
  73. Ein in-vitro-Verfahren zur Detektion von BAFF-R in einer biologischen Probe aus einem Subjekt, umfassend das Detektieren eines BAFF-R-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-15 in einer biologischen Probe aus dem Subjekt mittels des Antikörpers oder des eine Antigen-Binderegion eines Antikörpers umfassenden Polypeptids nach einem der Ansprüche 28 bis 35.
  74. Das Verfahren nach Anspruch 73, wobei der Antikörper oder die Antigen-Binderegion des Polypeptids eines oder mehrere der folgenden sind: (a) monoklonal; (b) polyklonal; (c) chimär; (d) humanisiert; (e) ein Einzelkettenantikörper; (f) ein Fab-Fragment; und (g) ein F(ab)'2-Fragment.
  75. Ein in-vitro-Verfahren zur Bestimmung, ob eine genomische BAFF-R-Sequenz mutiert oder deletiert wurde, umfassend das Bestimmen, ob ein BAFF-R-Nukleinsäuremolekül in einer biologischen Probe aus einem Subjekt mutiert oder deletiert wurde, mittels eines Nukleinsäuremoleküls, das unter stringenten Bedingungen an genomische Sequenzen des humanen BAFF-R (SEQ ID NO:10) oder des murinen BAFF-R (SEQ ID NO:9) hybridisieren kann, wobei die stringenten Bedingungen 6x SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA und 500 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 65°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschen in 0,2x SSC, 0,1% BSA bei 50°C sind.
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