DE60037370T2

DE60037370T2 - Sinusförmiges Zellkulturmodul zur Kultivierung von Hepatozyten

Info

Publication number: DE60037370T2
Application number: DE60037370T
Authority: DE
Inventors: Kazumori Kasuga-shi Funatsu; Hiroyuki Ijima; Kouji Nakazawa; Hiroshi Mizumoto
Original assignee: Funatsu Kazumori Kasuga; Toyobo Co Ltd
Current assignee: Funatsu Kazumori Kasuga; Toyobo Co Ltd
Priority date: 1999-08-25
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2008-11-27
Anticipated expiration: 2020-08-25
Also published as: EP1078982B1; DE60037370D1; US6284451B1; JP3553858B2; EP1078982A2; EP1078982A3; JP2001128660A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Modul, in das ein multizelluläres Aggregat eingearbeitet worden ist, wobei das multizelluläre Aggregat auf die Herstellung von brauchbaren zellulären Produkten unter Verwendung von tierischen Zellen oder ein künstliches Hybrid-(oder biologisches)Organ anwendbar ist.
Insbesondere betrifft diese Erfindung eine Technik zur Induktion der Bildung eines Aggregats von kultivierten Zellen unter Einsatz einer Zentrifugalkraft, wie ein Verfahren zur Ausbildung eines multizellulären Aggregats, das die Zellen für einen langen Zeitraum erhalten kann, ohne dass sie ihre spezifischen Funktionen verlieren, ein Modul für die Zellkultur, das eine sinusoidartige Struktur eines lebenden Körpers durch die Verwendung von Hohlfasern nachbildet, und ein Verfahren zur Zellkultur unter Verwendung des Moduls und der aggregatinduzierenden Technik in Kombination.
Diese Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines Kulturmediums, das zum Kultivieren des multizellulären Aggregats geeignet ist, und ein Kulturverfahren des multizellulären Aggregats unter Verwendung des Mediums.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Kulturvorrichtungen zur Vermehrung von tierischen Zellen zur Erzeugung von brauchbaren zellulären Produkten oder zur Verwendung der Zellen als Komponente eines künstlichen Hybridorgans sind üblicherweise bekannt. Bei solchen bekannten Kulturvorrichtungen wird eine Rührtankkultur verwendet, bei der ein Mikroträger für eine Kultur von Zellen mit hoher Dichte (W. R. Tolbert et al., Ann. Rep. Ferment. Proc., 6, 35 (1983) etc.), eine Fließbett- oder Festbettkultur unter Verwendung eines porösen Trägers ( JP 7-46988 B etc.) und eine Kultur unter Verwendung einer porösen Hohlfasermembran zur Immobilisierung von Zellen im Lumen des Raums außerhalb der Fasern (Naka et al., Artificial Organs, 28(1), 68–73 (1999) etc.) verwendet wird. Von diesen ist die Kultur unter Verwendung einer Hohlfasermembran dahingehend überlegen, als sie einen Schutz gegen eine Scherbelastung ergibt und ein Lecken verhindert, weil die Zellen durch die Hohlfasermembran vom Fluss eines Mediums getrennt sind. Darüber hinaus können vorhandene Dialysevorrichtungen und Plasmatrennvorrichtungen als Kulturvorrichtung, die auf die Hohlfasermembran anzuwenden ist, verwendet werden, weil sie eine Vielzahl von Hohlfasern in einem Bündel enthalten. Bei einer solchen Kulturvorrichtung vom Hohlfasertyp sind die Hohlfasern jedoch nicht gleichmäßig innerhalb des Kulturtanks (Moduls) angeordnet. Dies stellt umgekehrt dahingehend ein Problem dar, als, wenn Zellen im Raum des Moduls außerhalb der Fasern zu immobilisieren sind, der Abstand der Massenübertragung auf die Oberfläche der Hohlfasern sich in Abhängigkeit von der Position im Modul unterscheidet, wodurch eine Schwankung der Lebensfähigkeit und des Wachstums der Zellen bewirkt wird.
Die festsitzenden tierischen Zellen werden hauptsächlich mittels eines zweidimensionalen Einzelzellschicht-Kulturverfahrens kultiviert. Dieses Verfahren weist dahingehend ein Problem auf, als die kultivierten Zellen ihre Funktionen schnell verlieren. Beispielsweise verliert ein hochgradig differenzierter primärer Hepatozyt während mehrerer Tage einer Kultur unter den Bedingungen der Einzelzellschicht-Kultur seine Funktionen. Mit Hinblick auf solche Nachteile ist ein Versuch unternommen worden, eine Zellaggregat-Kultur zur Expression und Erhaltung von hochgradig differenzierten Funktionen zu entwickeln. Beispielsweise ist eine Kultur eines kugelförmigen multizellulären Aggregats (Sphäroid) von kultivierten Zellen unter Verwendung eines porösen Polyurethan-Schaumstoffs (PUF) bei der Entwicklung einer künstlichen Hybrid-Leber verwendet worden, die hohe Funktionen ausüben muss (Matsushita et al., Artificial Organs, 21(3), 1050–1054 (1992)).
Wenn ein Aggregat in einem Modul enthalten ist, hat das Zellaggregat eine extrem hohe Zelldichte, die ausreichend ist, um eine Kultur der Zellen mit hoher Dichte zu ermöglichen, wodurch wiederum die Größe des Moduls verringert wird. Andererseits ist der Verbrauch von Sauerstoff und Nährstoffen im Modul ebenfalls auffallend. Wenn Zellen mit einem hohen Sauerstoffverbrauch wie primäre Hepatozyten zu kultivieren sind, ermöglichen herkömmliche Vorrichtungen nur eine Zelldichte von etwa 1 × 10⁷ Zellen/cm³, weil eine unzureichende Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen für die Kultur der hochdichten Zellen eine Nekrose der Zellen im Aggregat ergibt, wodurch eine verschlechterte Funktion der Vorrichtung demonstriert wird. Aufgrund solcher Probleme ist es für die Zellen schwierig, unter den Bedingungen einer Kultur mit hoher Dichte die Lebensfähigkeit für einen langen Zeitraum beizubehalten, ohne dass inhärente Zellfunktionen beeinträchtigt werden.
Zur Erhaltung der Funktionen der primären Hepatozyten ist die Wichtigkeit der Zusammensetzung des Kulturmediums zusammen mit der Wichtigkeit der Zellmorphologie betont worden, und es gibt dokumentierte Berichte über Kulturmedien, die verschiedene ergänzende Faktoren enthalten. Beispielsweise gibt es Berichte über eine verbesserte Lebensfähigkeit von Hepatozyten durch die Zugabe von L-Alanin in hoher Konzentration zu einem Kulturmedium ( JP-A-5-336959 A ), eine Erhaltung der Albuminsekretion durch Hepatozyten unter Verwendung eines Kulturmediums, das Ascorbinsäure enthält ( JP-A-7-274952 A ), eine Erhaltung der Albuminsekretion durch sphäroidale Kulturhepatozyten für etwa 60 Tage durch die Verwendung von Williams E-Medium (WEM), das um Dexamethason, Glucagon, Insulin und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt ist (J. Z. Tong et al., Exp. Cell Res., 189, 87–92, 1990), eine Erhaltung der Fähigkeit zur Albumin-Sekretion von Kollagen-Sandwichkultur-Hepatozyten für etwa einen Monat durch die Verwendung von nach Dulbecco modifiziertem Eagleschem Medium, das um Prolin, Insulin, Glucagon, Hydrocortison und den EGF ergänzt ist (J. Lee et al., Biotech. Bioeng., 40, 298–305, 1992) und andere.
Die Beibehaltung der Funktion zur Entgiftung von Fremdverbindungen, im Körper erzeugtem Ammoniak und von Medikamenten, wie Hepatozyten sie zusätzlich zur Fähigkeit zur Synthetisierung von Proteinen (z. B. Albumin) aufweisen, ist nicht zu bewerkstelligen, während die Fähigkeit zur Metabolisierung von Ammoniak in einer herkömmlichen Kultur nur etwa 2 Wochen lang beibehalten werden kann.
US-A-5,525,144 und US-A-4,367,139 offenbaren zur Zellkultur geeignete Hohlfasermembranen, die Distanzstücke mit Poren umfassen, durch die die Hohlfasern angeordnet sind. Im Modul von US-A-5,525,144 gibt es wenigstens drei Distanzstücke und eine Mehrzahl davon im Modul von US-A-4,367,139 .
WO-A-97/12960 offenbart ein bioartifizielles Lebermodul, das Hohlfasern umfasst.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Daher besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Bildung eines Aggregats, das es verschiedenen tierischen Zellen ermöglicht, für einen langen Zeitraum zu überleben, ohne dass sie ihre inhärenten Funktionen verlieren, sowie eines Moduls, das ein solches Aggregat mit hoher Dichte umfasst, wobei das Modul zur Erzeugung vorteilhafter zellulärer Produkte brauchbar ist und auf ein künstliches Hybridorgan anwendbar ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens unter Verwendung eines Kulturmediums, das für eine Langzeit-Erhaltung verschiedener physiologischer Funktionen, insbesondere wenigstens der Fähigkeit zur Metabolisierung von Ammoniak zusätzlich zur Fähigkeit zur Sekretion von Albumin, von primären Hepatozyten in einer künstlichen Leber geeignet ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Kulturtechnik, die auf eine künstliche Hybridleber und als alternatives Verfahren zu Tierexperimenten (Sicherheitstest von Medikamenten etc. an Zellen statt an Tieren zum Schutz von Tieren) für einen längeren Zeitraum durch die Verwendung dieses Mediums angewandt werden kann.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass ein multizelluläres Aggregat mit hohen Funktionen gebildet werden kann, indem Zellen im Lumen oder im Raum außerhalb der Fasern des Moduls oder in einem anderen Kultur-Substrat unterstützt durch eine Zentrifugalkraft zwangsimmobilisiert werden, wodurch die Kontakthäufigkeit zwischen Zellen vergrößert wird. Sie haben auch gefunden, dass eine gewebeartige Struktur konstruiert werden kann, indem Zeilen in hoher Dichte im Raum oder Lumen außerhalb der Fasern von Hohlfasern mit einer halbdurchlässigen Membran immobilisiert werden und über die Hohlfasermembran Sauerstoff und Nährstoffe, die für das Überleben der Zellen erforderlich sind, zugeführt werden, wobei die Hohlfasern ein Modul darstellen, das eine sinusoidartige Struktur einschließt, die dem biologischen Kapillar-Netzwerk ähnlich ist, zusammen mit wenigstens zwei Distanzstücken mit kleinen Poren, die regelmäßig darin ausgebildet sind, wobei die Hohlfasern durch die kleinen Poren der Distanzstücke geführt sind, wodurch eine Struktur erhalten wird, die Hohlfasern umfasst, welche regelmäßig in einem sehr kleinen Abstand angeordnet sind. Es ist auch gefunden worden, dass die Verwendung von DMEM, das reich an Aminosäure, Vitaminen und einer Energiequelle ist, oder einer Mischung von 60 bis 90% DMEM und 10 bis 40% eines anderen Mediums, das um Prolin, EGF, Insulin, Hydrocortison, selenige Säure, Linolensäure, Kupfersulfat und Zinksulfat zur Kultur des multizellulären Leberaggregats ergänzt ist, zu einer deutlichen Verlängerung der Erhaltung der typischen Funktionen von primären Hepatozyten einschließlich der Fähigkeit zur Metabolisierung von Ammoniak führt.
Wenn dieses Medium in Kombination mit dem oben erwähnten Modul und dem Verfahren zur Bildung eines multizellulären Aggregats verwendet wird, kann eine künstliche Hybridleber hergestellt werden, die eine Erhaltung der typischen Funktionen von primären Hepatozyten einschließlich einer Fähigkeit zur Metabolisierung für wenigstens 4 Monate ermöglicht.
Demgemäß macht die vorliegende Erfindung ein Hybridmodul für eine künstliche Leber verfügbar, umfassend

(A) ein Modul zur Zellkultur, umfassend eine Struktur, die Hohlfasern umfasst, die gleichmäßig in einem Raum platziert sind und mittels zweier Dichtungsteile festgelegt sind, wenigstens zwei Distanzstücke, wobei die Distanzstücke in Nachbarschaft mit den beiden Dichtungsteilen platziert sind, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche Distanzstücke im Raum platziert sind und wobei die Distanzstücke kleine Poren haben, die regelmäßig darin angeordnet sind, und die Hohlfasern durch die kleinen Poren geführt sind und regelmäßig in einem sehr kleinen Abstand angeordnet sind, und
(B) Hepatozyten, die im Modul zur Zellkultur immobilisiert sind.

Eine solche Struktur ist dem Kapillarnetzwerk im lebenden Körper ähnlich und fördert bei einer effizienten, über die Hohlfasermembran erfolgenden Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen, die für das Überleben der Zellen erforderlich sind, die im Raum und/oder dem Lumen außerhalb der Fasern der Hohlfasern immobilisiert sind, die Bildung eines multizellulären Aggregats mit hohen physiologischen Funktionen und trägt zur Erhaltung von verschiedenen physiologischen Funktionen des multizellulären Aggregats bei.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Zellkultur verfügbar gemacht, umfassend ein Immobilisieren von Zellen in einem Lumen einer Hohlfaser oder einem Lumen oder einem Raum außerhalb der Fasern des Moduls in einem Modul zur Zellkultur oder im Raum zur Zellkultur durch die Anwendung einer Zentrifugalkraft und ein Kultivieren der immobilisierten Zellen, wobei das Modul eine Struktur umfasst, die Hohlfasern umfasst, die gleichmäßig in einem Raum platziert sind und mittels zweier Dichtungsteile festgelegt sind, wenigstens zwei Distanzstücke, wobei die Distanzstücke in Nachbarschaft mit den beiden Dichtungsteilen platziert sind, dadurch gekennzeichnet, dass die zusätzlichen Distanzstücke im Raum platziert sind und wobei die Distanzstücke kleine Poren haben, die regelmäßig darin angeordnet sind, und die Hohlfasern durch die kleinen Poren geführt sind und regelmäßig in einem sehr kleinen Abstand angeordnet sind.
Durch Einwirkenlassen der Zentrifugalkraft aggregieren die Zellen, wodurch die Kontakthäufigkeit erhöht wird, wodurch die Bildung von multizellulären Aggregaten gefördert wird.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Kultur von Hepatozyten verfügbar gemacht, das die typischen Funktionen von primären Hepatozyten einschließlich einer entgiftenden Wirkung für einen langen Zeitraum durch die Verwendung von DMEM oder einer Mischung von DMEM und einem anderen Medium wie einem Grundmedium aufrecht erhalten kann. Wenn Prolin, EGF, Insulin, Hydrocortison, selenige Säure, Linolensäure, Kupfersulfat und Zinksulfat zum DMEM oder einem DMEM enthaltenden Mediengemisch gegeben werden, können die Hepatozyten-Funktionen für einen längeren Zeitraum erhalten werden.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gehen aus den Ansprüchen hervor.
Wie oben aufgeführt ist, ermöglicht die Technik der vorliegenden Erfindung zur Induktion von kultivierten Zellaggregaten unter Anwendung einer Zentrifugalkraft die Bildung eines Aggregats, das im Vergleich zu herkömmlichen Kulturverfahren hohe Funktionen für einen langen Zeitraum beibehalten kann.
In Kombination mit dem Modul mit einer sinusoidartigen Struktur, das Hohlfasern umfasst, die darin regelmäßig angeordnet sind, ermöglicht die vorliegende Erfindung darüber hinaus im Vergleich zu herkömmlichen Modulen zur Zellkultur eine Kultur mit einer deutlich höheren Dichte. Darüber hinaus kann eine künstliche Hybridleber, die nicht nur die Fähigkeit zur Synthese von Proteinen beibehält, sondern auch die entgiftende Wirkung einschließlich der Fähigkeit zur Metabolisierung von Ammoniak für einen langen Zeitraum beibehält, erzeugt werden, indem die Hepatozyten in einem DMEM als Grundmedium enthaltenden Kulturmedium in einem Hybridmodul für eine künstliche Leber kultiviert werden, das hergestellt wird, indem die Technik zur Induktion von Aggregaten und das Modul der vorliegenden Erfindung kombiniert werden. Daher ergibt die vorliegende Erfindung eine auf herkömmliche Weise undurchführbare Entwicklung eines hochfunktionellen, kleinen Moduls zur Zellkultur, das als künstliches Hybridorgan und zur Erzeugung von brauchbaren zellulären Produkten brauchbar ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht ein Beispiel für das Modul vom Hohlfasertyp der Erfindung.
2(a) ist eine vergrößerte Ansicht der Umgebung eines in 1 dargestellten Distanzstücks, und 2(b) ist ein Querschnitt des Moduls in radialer Richtung.
3 ist eine schematische Ansicht, die die Zellen veranschaulicht, die im Raum zwischen den Hohlfasern in 1 immobilisiert sind.
4 veranschaulicht die Ammoniak-Metabolisierungsaktivität pro Zelleneinheit des von einer Zentrifugation stammenden multizellulären Hepatozyten-Aggregats der vorliegenden Erfindung.
5 veranschaulicht die Albumin-Sekretionsaktivität pro Zelleneinheit des von einer Zentrifugation stammenden multizellulären Hepatozyten-Aggregats der vorliegenden Erfindung.
6 veranschaulicht die Ammoniak-Metabolisierungsaktivität pro Volumeneinheit des Moduls vom Hohlfasertyp, das das Aggregat der vorliegenden Erfindung einschließt.
7 veranschaulicht die Auswirkung der Zusammensetzung des Mediums auf die Beibehaltung der Ammoniak-Metabolisierungsaktivität pro Zelleneinheit des von einer Zentrifugation stammenden multizellulären Hepatozyten-Aggregats der vorliegenden Erfindung.
8 veranschaulicht die Auswirkung der Zusammensetzung des Mediums auf die Beibehaltung der Harnstoff-Syntheseaktivität pro Zelleneinheit des von einer Zentrifugation stammenden multizellulären Hepatozyten-Aggregats der vorliegenden Erfindung.
9 veranschaulicht die Auswirkung der Zusammensetzung des Mediums auf die Beibehaltung der Albumin-Sekretionsaktivität pro Zelleneinheit des von einer Zentrifugation stammenden multizellulären Hepatozyten-Aggregats der vorliegenden Erfindung.
In den obigen Figuren veranschaulicht 1 ein Gehäuse, veranschaulicht 2 eine Hohlfaser, veranschaulicht 3 ein Distanzstück, veranschaulicht 4 ein Dichtungsteil, veranschaulicht 5 einen Raum außerhalb von Fasern, veranschaulicht 6 einen Zelleinlass, veranschaulicht 7 einen Mediumflusseinlass, veranschaulicht 8 einen Mediumflussauslass, veranschaulicht 9 eine kleine Pore im Distanzstück und veranschaulicht 10 ein multizelluläres Aggregat.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Nachfolgend wird ein Verfahren zur Bildung eines Zellaggregats unter Anwendung einer Zentrifugalkraft ausführlich erläutert. Wenn eine geeignete Zentrifugalkraft auf eine Zellsuspension einwirkt, sedimentieren die Zellen aufgrund der Zentrifugalkraft unter Bildung eines Zellaggregats. In dieser Stufe liegen die Zellen in einem dicht gepackten Zustand mit einer extrem hohen Kontakthäufigkeit zwischen den Zellen vor. Wenn Sauerstoff und geeignete Nährstoffe den Zellen in diesem Zustand zugeführt werden, kann ein Aggregat gebildet werden, in dem die Zellen für einen langen Zeitraum hohe Funktionen exprimieren können. Zum Beispiel werden Hepatozyten im Lumen einer Hohlfaser mit einer halbdurchlässigen Membran mittels einer Zentrifugalkraft hochdicht immobilisiert, und Sauerstoff und Nährstoffe werden von der Außenseite der Hohlfaser zugeführt, und die metabolischen Exkrete werden entfernt. Als Folge bilden die Zellen ein zylindrisches Aggregat im Lumen der Hohlfaser. Die hochdichte Immobilisierung der Zellen durch Einwirkung einer Zentrifugalkraft ist nicht auf das Lumen der Hohlfaser beschränkt. Wenn die Hohlfasern beispielsweise regelmäßig angeordnet werden, wie unten aufgeführt ist, können die Zellen im Raum außerhalb der Fasern zwischen den Hohlfasern immobilisiert werden. Auf jeden Fall können die Zellen eine gewebeartige Struktur in einer Umgebung bilden, in der die Zellen überleben können.
Die Zentrifugalkraft wird auf eine Höhe innerhalb des Bereichs eingestellt, in dem die zu verwendenden Zellen frei von Schäden sind. Im Fall von primären Ratten-Hepatozyten beträgt die Zentrifugalkraft vorzugsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, nicht mehr als 1500 × G, noch mehr bevorzugt von 5 × G bis 400 × G. Die Zentrifugationszeit kann auch gemäß der Zentrifugalkraft eingestellt werden.
Die Hohlfaser, die zur Bildung eines multizellulären Aggregats in der vorliegenden Erfindung durch die Einwirkung einer Zentrifugalkraft zu verwenden ist, ist keiner speziellen Einschränkung unterworfen, solange sie eine semipermeable Membranstruktur hat. Ihr Innendurchmesser beträgt vorzugsweise 20–1000 μm, noch mehr bevorzugt 50–500 μm, am meisten bevorzugt 50–150 μm. Das Modul zur Zellkultur, das zur Bildung des multizellulären Aggregats in der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, ist keiner speziellen Einschränkung unterworfen, solange es eine Hohlfasermembran hat. In einem bevorzugten Modus wird ein unten erwähntes Modul zur Zellkultur verwendet, das eine Struktur hat, bei der die Fasern in einem sehr kleinen Abstand regelmäßig angeordnet sind.
Ein Modul zur Zellkultur, das die Struktur einschließt, bei der die Fasern in einem sehr kleinen Abstand regelmäßig angeordnet sind (hiernach auch als sinusoidartige Struktur bezeichnet), ist nachfolgend erläutert. Mit der hier verwendeten sinusoidartigen Struktur ist eine Struktur gemeint, die eine Mehrzahl von Hohlfasern (vorzugsweise mit dem oben erwähnten Innendurchmesser) wie Kapillaren enthält, die in einem sehr kleinen Abstand von mehreren hundert Mikrometern, vorzugsweise 20–1000 μm, noch mehr bevorzugt 50–500 μm, am meisten bevorzugt 50–150 μm, regelmäßig angeordnet sind. Diese Struktur befördert Sauerstoff und Nährstoffe zu den Zellen, die im Inneren oder Äußeren einer Hülle vorhanden sind, und entfernt Exkrete. 1, 2 und 3 veranschaulichen eine Ausführungsform des Moduls zur Zellkultur der vorliegenden Erfindung.
Das in 1 veranschaulichte Verfahren zur Bildung eines Moduls ist nachfolgend erläutert. Die zu verwendenden Distanzstücke sind so übereinander geschichtet, dass die kleinen Poren in den Distanzstücken aufeinander ausgerichtet sind und Hohlfasern durch die aufeinander ausgerichteten kleinen Poren geführt werden. Wenn die Hohlfasern hindurchgeführt sind, werden die Distanzstücke um einen gewünschten Abstand voneinander entfernt und in gegebenen Positionen in einem Gehäuse 1 festgelegt. Die Hohlfasern werden mittels eines Dichtungsteils 4 festgelegt. Das Dichtungsteil kann gebildet werden, indem ein Vergussmittel mit Zentrifugalkraft in ein gegebenes Teil injiziert wird und das gehärtete Teil nach dem Härten des Vergussmittels mit einer scharfen Klinge geschnitten wird, wodurch die Öffnung der Hohlfaser freigelegt wird.
In 1 ist eine sinusoidartige Struktur, die aus einer zweckmäßigen Zahl von Hohlfasern 2 besteht, in einem Gehäuse 1 angeordnet. Jede Hohlfaser, aus der die sinusoidartige Struktur besteht, ist durch eine kleine Pore 9 eines Distanzstücks 3 geführt und wird vom Dichtungsteil 4 festgelegt. Das heißt, das jede Hohlfaser 2 in einem Raum 5 in einem Abstand zwischen den kleinen Poren 9 in den Distanzstücken 3, die mit einer Anzahl von zwei der mehr angeordnet sind, wie in 2 veranschaulicht ist, gleichmäßig angeordnet ist.
Wenn die Zellen im Raum außerhalb der Fasern in einem Modul dieser Konstruktion immobilisiert sind, werden die Zellen 10, die von einem Zelleinlass 6 gespeist werden, der im Gehäuse 1 an einer oder mehreren Positionen ausgebildet ist, durch die Einwirkung einer Zentrifugalkraft mit einer hohen Dichte um jede im Raum 5 angeordnete Hohlfaser immobilisiert. Das Kulturmedium wird von einem Kulturmedium-Fließeinlass 7 an jeder Hohlfaser, aus der die sinusoidartige Struktur besteht, verteilt und befördert, wie in 3 veranschaulicht ist, Sauerstoff und Nährstoffe zu den Zellen 10, die im Raum 5 immobilisiert sind, nimmt das Produkt und metabolische Exkrete der Zellen auf und wird vom Modul durch einen Kulturmedium-Fließauslass 8 aus dem Modul abgelassen.
Es ist auch möglich, eine unabhängige Funktion der Zufuhr des Kulturmediums oder des Ablasses der regelmäßig angeordneten Hohlfasern zu verleihen. Das heißt, dass eine Hohlfaser für die Zufuhr von Kulturmedium ein geschlossenes Ende am Dichtungsteil 4 hat und das Kulturmedium, das durch diesen Teil dem Modul zugeführt wird, unter Zwang in den Raum 5 geleitet wird, wo es in direkten Kontakt mit den Zellen 10 gelangt und nach einem Austausch von verschiedenen Substanzen durch die Hohlfaser für den Kulturmedium-Ablass aus dem Modul heraus abgelassen wird. Auf vergleichbare Weise kann eine Hohlfaser als unabhängige Leitung für die Sauerstoffzufuhr vorgesehen sein.
Bei dieser Konstitution sind die Hohlfasern zur Bereitstellung von Sauerstoff und Nährstoffen und zur Gewinnung des Produkts und der metabolischen Exkrete der Zellen im Modul in einem sehr kleinen Abstand angeordnet, wodurch im Modul das Mikrosinusoid im menschlichen Körper reproduziert wird. Durch das Immobilisieren der Zellen in einer hohen Dichte um die Hohlfasern herum durch das Einwirkenlassen der Zentrifugalkraft und das Kultivieren der Zellen kann ein Zellaggregat mit hohen Funktionen gebildet werden. Die mittels Zentrifugalkraft immobilisierten Zellen haben eine Dichte von 1 × 10⁷ bis 1 × 10⁹ Zellen/ml, die in Abhängigkeit vom Zelltyp und der anzuwendenden Zentrifugalkraft jedoch einer Variation unterliegen kann. Wenn die Zellen in einen solchen Zustand mit hoher Dichte gebracht werden oder wenn sie ein Aggregat bilden, ist diejenige der zuzuführenden Substanzen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit ein einschränkender Faktor wird, Sauerstoff, und der Abstand zwischen den Hohlfasern in einem Hohlfaserbündel 2 kann unter Berücksichtigung des Sauerstoffverbrauchs der im Raum 5 immobilisierten Zellen bestimmt werden. Dies kann erreicht werden, indem der Abstand zwischen den im Distanzstück 3 ausgebildeten kleinen Poren 9 geregelt wird. Insbesondere beträgt der Abstand zwischen Hohlfasern vorzugsweise 20–1000 μm, noch mehr bevorzugt 50–500 μm, am meisten bevorzugt 50–150 μm. Der Abstand wird unter Berücksichtigung des Sauerstoffverbrauchs der Zellen bestimmt und ist nicht auf den obigen Bereich beschränkt.
Die kleine Pore 9, die im Distanzstück 3 eingestellt ist, kann einen Durchmesser haben, der zweckmäßigerweise gemäß dem Durchmesser der zu verwendenden Hohlfaser eingestellt wird. Der Durchmesser ist vorzugsweise mehr als 20–100 μm größer als der Durchmesser der zu verwendenden Hohlfaser, jedoch nicht auf diesen Bereich beschränkt. Darüber hinaus sind die Distanzstücke 3 im Allgemeinen in Nachbarschaft zu den beiden Dichtungsteilen 4 des Hohlfaserbündels 2 angeordnet, können aber darüber hinaus nach Bedarf im Raum 5 angeordnet sein. Wenn die Hohlfaser beispielsweise länger ist, können weniger Distanzstücke 3 im Raum 5 hinzugefügt werden, um die Anordnung der Hohlfasern regelmäßiger zu machen.
Wenn die Hohlfaser lang ist, kann eine Welle mit einem Durchmesser, der kleiner als der Innendurchmesser der Hohlfaser ist, durch die Hohlfaser geführt sein, um ein Absacken der Hohlfaser zwischen den beiden Distanzstücken zu verhindern. Wenn eine Welle verwendet wird, ist das Material der Welle frei von jeder speziellen Einschränkung, sofern es eine überlegene Biokompatibilität hat, wobei eines mit einer glatten Außenfläche, die eine Beschädigung des Inneren der Hohlfaser verhindert, und mit einer relativ hohen Festigkeit bevorzugt ist.
Die kleinen Poren 9, die im Distanzstück 3 ausgebildet sind, und somit die Hohlfasern können so ausgerichtet sein, dass sie eine dreieckige Anordnung bilden, um die im Raum 5 immobilisierten Zellen effizient zu kultivieren, wobei sie aber auch eine rechteckige Anordnung oder eine andere Form einnehmen können.
Die Hohlfaser, die Substanzen mit den Zellen austauscht, hat einen Innendurchmesser, der frei von jeder speziellen Einschränkung ist. Er beträgt vorzugsweise 20–1000 μm, noch mehr bevorzugt 50–500 μm, am meisten bevorzugt 50–150 μm. Die Hohlfaser hat eine Membrandicke von 10–200 μm. Das Material der Hohlfaser ist frei von jeder speziellen Einschränkung, sofern es nicht nachteilig auf die Zelle oder Körperflüssigkeit einwirkt. Beispielsweise werden Cellulosematerialien, Polysulfon, Polypropylen verwendet. Mit Hinblick auf die Austauschbarkeit des Materials ist der mittlere Porendurchmesser der porösen Hohlfasermembran wünschenswerterweise größer und beträgt 0,1–5 μm. Der Porendurchmesser ist nicht auf diesen Bereich beschränkt, sondern kann zweckmäßigerweise gemäß dem Verwendungsgegenstand eingestellt werden. Wenn beispielsweise Plasma in das Modul eingeführt wird, kann eine Membran mit einer kleineren fraktionierten Molmasse mit einem Porendurchmesser von weniger als 0,1 μm verwendet werden, um eine heterologe Immunreaktion zu unterdrücken.
Das Modul hat die obige Konstitution, wenn die Zellen im Raum außerhalb der Hohlfaser immobilisiert sind. Es ist auch möglich, Zellen mittels einer Zentrifugalkraft im Lumen von Hohlfasern zu immobilisieren. In diesem Fall werden die Zellen im Hohlfaserlumen mittels einer Zentrifugalkraft immobilisiert, und die beiden Enden der Hohlfaser werden verschlossen. Das Kulturmedium fließt aus der Hohlfaser heraus und tauscht Substanzen mit den Zellen über die Hohlfasermembran aus. Ein Gehäuse 1 hat zwei oder mehr Anschlüsse für den Fluss des Kulturmediums.
Das Material des Moduls ist frei von jeder speziellen Einschränkung, sofern es hinsichtlich der Biokompatibilität überlegen ist. Es kann jedes Material verwendet werden, das herkömmlicherweise für die künstliche Dialysevorrichtung, die Plasma-Trennvorrichtung verwendet wird. Bei dem Klebstoff, der für den Dichtungsteil 4 zu verwenden ist, um die Hohlfasern festzulegen und die Zellen im Kulturmedium von der zirkulierenden Flüssigkeit zu trennen, kann es sich um einen herkömmlichen handeln. Beispielsweise können Polyurethan, Silicon und Epoxyharz verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung sind die zu kultivierenden Zellen frei von jeder speziellen Einschränkung hinsichtlich der Art und des Ursprungs der Zellen. Die Zellen können vom Menschen, der Maus, der Ratte oder beliebigen anderen Tieren stammen. Insbesondere kann, wenn Hepatozyten in einem Modul mit einer sinusoidartigen Struktur unter Einwirkung der oben erwähnten Zentrifugalkraft immobilisiert werden, ein kompaktes Hybridmodul für eine künstliche Leber hergestellt werden, das anders als die herkömmliche künstliche Hybrid-Leber hohe Funktionen für einen langen Zeitraum beibehalten kann.
In der vorliegenden Erfindung werden die Zellen mittels einer Zentrifugalkraft immobilisiert, wodurch aufgrund der während der Zellimmobilisierung einwirkenden kleinen Scherbelastung eine dreidimensionale Mehrfachschicht von Zellen in einem gut lebensfähigen Zustand erhalten wird. Darüber hinaus dienen die regelmäßig angeordneten Hohlfasern (der Raum außerhalb der Hohlfaser, wenn Zellen im Hohlfaserlumen immobilisiert sind) als Kapillare im lebenden Körper, wodurch ein guter Substanzaustausch mit den Zellen ermöglicht wird. Die Hohlfaser kann so angeordnet sein, dass ein Substanzaustausch mit jeder Zelle im Raum verfügbar ist. Dies ermöglicht seinerseits die Positionierung der Zellen in einem sehr kleinen Raum, der das Innere des lebenden Körpers mit einer Zelldichte (1 × 10⁸–1 × 10⁹ Zellen/cm³) imitiert, die mit derjenigen im Inneren eines lebenden Gewebes vergleichbar ist. Folglich bilden die Zellen, die mittels einer Zentrifugalkraft mit hoher Dichte immobilisiert sind, ein Aggregat, ohne dass eine Zellnekrose in einem frühen Zustand der Kultur auftritt. Daher können die Zellen als Hohlfaser-Kulturmodul auf verschiedene Anwendungen angewandt werden, bei denen die Zellen überleben können, ohne inhärente Funktionen während der Kultur verschiedener tierischer Zellen zu verlieren. Spezifische Anwendungsgebiete umfassen künstliche Hybridorgane wie eine künstliche Hybrid-Leber und eine künstliche Hybrid-Pankreas, die unter Verwendung kultivierter Zellen hergestellt werden, einen Organsimulator, bei dem kultivierte Zellen zur Analyse eines Medikamenten-Metabolismus verwendet werden, und einen Bioreaktor, bei dem kultivierte Zellen zur Erzeugung von brauchbaren zellulären Produkten verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung macht auch ein Verfahren zum Kultivieren von Hepatozyten verfügbar, das die Beibehaltung von typischen Funktionen des primären Hepatozyten für einen langen Zeitraum zur Kultur einer künstlichen Hybrid-Leber unter Verwendung des Moduls zur Zellkultur und der Technik zur Bildung eines multizellulären Aggregats der vorliegenden Erfindung ermöglicht, das die Verwendung von DMEM oder eines Mischmediums von DMEM und einem anderen Medium als Grundmedium umfasst. Mit dem hier verwendeten Begriff "typische Funktionen des primären Hepatozyten" sind entgiftende Funktionen einschließlich wenigstens der Fähigkeit zur Metabolisierung von Ammoniak zusätzlich zur Fähigkeit zur Sekretion von Albumin gemeint.
Das andere Medium, das in der vorliegenden Erfindung mit DMEM zu vermischen ist, ist ein Medium, das herkömmlicherweise als Grundmedium zur Kultur von Tierzellen verwendet wird, und es ist frei von jeder speziellen Einschränkung, sofern es die Wirkung einer Langzeit-Beibehaltung der Funktionen von primären Hepatozyten mittels DMEM nicht hemmt oder solange es die Wirkung erhöht. Beispielsweise können Ham-F-10-Medium, F-12-Medium, Williams E-Medium, MCDB153-Medium, RPMI-1640-Medium, 199-Medium, L-15-Medium verwendet werden. Bevorzugt sind Ham-F-12-Medium, Williams E-Medium, MCD6153-Medium, RPMI-1640-Medium. Das Mischungsverhältnis von DMEM und einem anderen Medium kann zweckmäßigerweise innerhalb des Bereichs eingestellt werden, der frei von einer nachteiligen Auswirkung auf die Wirkung des DMEM ist oder welcher der Wirkung zweckdienlich ist. Das Grundmedium der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Mischmedium, das 60–90% DMEM und 10–40% eines anderen Mediums enthält.
Das Medium, das für das oben erwähnte Verfahren zur Kultur von Hepatozyten zu verwenden ist, kann neben DMEM oder dem oben erwähnten DMEM enthaltenden Mischmedium beliebige Ergänzungen enthalten. Vorzugsweise enthält es Prolin, EGF, Insulin, Hydrocortison, selenige Säure, Linolensäure, Kupfersulfat und Zinksulfat als Ergänzungen. Somit nutzt die vorliegende Erfindung ein Medium, das DMEM oder ein Mischmedium aus DMEM und einem anderen Medium als Grundmedium und Prolin, EGF, Insulin, Hydrocortison, selenige Säure, Linolensäure, Kupfersulfat und Zinksulfat als zusätzliche Komponenten enthält. Dieses Medium kann unter Verwendung des Moduls für die Zellkultur und der Technik zur Bildung eines multizellulären Aggregats der vorliegenden Erfindung in Kombination vorteilhaft zur Hepatozytenkultur verwendet werden. Darüber hinaus kann das Medium zur herkömmlichen Hepatozytenkultur und für eine andere typische Kultur von tierischen Zellen und Geweben verwendet werden.
Die Konzentrationen an Prolin, EGF, Insulin, Hydrocortison, seleniger Säure, Linolensäure, Kupfersulfat und Zinksulfat, die im Kulturmedium der vorliegenden Erfindung enthalten sein müssen, sind frei von jeder speziellen Einschränkung, sofern sie die Wirkung des DMEM, das beim Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Kultur von Hepatozyten eingesetzt wird, nicht verhindern. Vorzugsweise sind die Konzentrationen der signifikanten Verstärkung der Wirkung von DMEM im Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Kultur von Hepatozyten zweckdienlich. Mit dem hier verwendeten Begriff "Wirkung von DMEM" ist eine Wirkung zur Erhaltung von entgiftenden Funktionen einschließlich wenigstens der Ammoniak metabolisierenden Fähigkeit eines Hepatozyten für einen langen Zeitraum zusätzlich zur Fähigkeit der Sekretion von Albumin gemeint. Beispielsweise hat jede zuzugebende Komponente eine Konzentration von vorzugsweise 0,1–1000 mg/l für Prolin, 1–1 × 10⁶ ng/l für den EGF, 1–1 × 10⁹ ng/l für Insulin, 1–1 × 10⁵ μg/l für Hydrocortison, 0,1–1 × 10⁵ nM für selenige Säure, 0,1–1 × 10⁶ μg/l für Linolensäure, 1–1 × 10⁶ nM für Kupfersulfat und 0,1–1 × 10⁹ pM für Zinksulfat.
Das Kulturmedium kann neben den oben erwähnten Ergänzungen andere Mediumkomponenten enthalten, solange sie die Wirkung von DMEM im Hepatozyten-Kulturmedium der vorliegenden Erfindung nicht hemmen. Die Mediumkomponenten, die zusätzlich enthalten sein müssen, können aus herkömmlicherweise bekannten ergänzenden Faktoren ausgewählt sein.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf Beispiele ausführlicher erläutert. Die vorliegende Erfindung wird durch diese Beispiele keinesfalls eingeschränkt.
Beispiel 1
Primäre Ratten-Hepatozyten (5 × 10⁵ Zellen), die mittels des Kollagenase-Perfusionsverfahrens hergestellt worden waren, wurden im Lumen einer Cellulosetriacetat-Hohlfaser zur Plasmatrennung (hergestellt von Toyo Boseki, Typ AP250N15, Innendurchmesser 285 μm, Außendurchmesser 387 μm) mittels einer 90-sekündigen Zentrifugation bei 60 × G immobilisiert. In dieser Stufe betrug die Hepatozytendichte im Lumen der Hohlfaser 4,5 × 10⁷ Zellen/cm³. Fünf Hohlfasern (Länge 3 cm), die die Hepatozyten enthielten, wurden in einer Kulturschale mit einem Durchmesser von 35 mm (hergestellt von Iwaki Glass) angeordnet, und 2 ml eines serumfreien Mediums (hormonell definiertes Medium; HDM), das erhalten worden war, indem 50 ng/ml EGF (hergestellt von Funakoshi), 10 mg/l Insulin (hergestellt von Sigma), 0,1 μM Kupfersulfat-5-Hydrat (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 3 μg/l selenige Säure (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 50 pM Zinksulfat-7-hydrat (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 50 μg/l Linolensäure (hergestellt von Sigma), 58,8 mg/l Penicillin (hergestellt von Meiji Seika), 100 mg/l Streptomycin (hergestellt von Meiji Seika), 1,05 g/l Natriumhydrogencarbonat (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 1,19 g/l HEPES (hergestellt von Dojindo Molecular Technologies, Inc.) zu Williams E-Medium (WEM; 10,8 g/l, hergestellt von Sigma) erhalten worden war, wurden zugegeben. Die Hepatozyten wurden auf einem Schüttler unter einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid und 95% Luft bei 45 U·/min einer Rotationskultur unterzogen. Die leberspezifischen Funktionen wurden hinsichtlich der Metabolisierungsaktivität bestimmt, indem 1 mM Ammoniak zum Kulturmedium gegeben und die Änderung der Konzentration als Funktion der Zeit quantitativ gemessen wurde. Darüber hinaus wurde die Albuminsekretionsaktivität untersucht, indem die Albuminkonzentration im Medium quantitativ gemessen wurde.
Als Kontrolle wurden Hepatozyten (3,0 × 10⁶ Zellen) in einer Platte aus Polyurethan-Schaumstoff (PUF) von 25 mm × 25 mm × 1 mm auf einer Kulturschale mit einem Durchmesser von 35 mm inokuliert. Eine mit Kollagen beschichtete Schale mit einem Durchmesser von 35 mm (hergestellt von Iwaki Glass) wurde mit den Hepatozyten (2,5 × 10⁵ Zellen) beimpft und als Monoschicht kultiviert, gefolgt von einem Vergleich der Funktionen. 4 zeigt die Änderungen der Ammoniak-Metabolisierungsrate pro Zelleneinheit im Laufe der Zeit.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Bildung des von einer Zentrifugation stammenden multizellulären Hepatozyten-Aggregats zu einer höheren Ammoniak-Metabolisierungsaktivität führte, die im Vergleich zu herkömmlichen Kulturverfahren für eine Kultur von 2 Wochen erhalten wurde. 5 veranschaulicht die Änderungen der Albumin-Sekretionsrate pro Zelleneinheit im Laufe der Zeit. Die Ergebnisse zeigen, dass das von einer Zentrifugation stammende multizelluläre Hepatozyten-Aggregat im Vergleich zu Aggregaten, die mittels herkömmlicher Kulturverfahren gebildet wurden, die Albumin- Sekretionsaktivität für einen langen Zeitraum erhalten kann, wodurch die Fähigkeit des von einer Zentrifugation stammenden multizellulären Hepatozyten-Aggregats zur Erhaltung hoher Leberfunktionen für einen langen Zeitraum demonstriert wird.
Beispiel 2
Kleine Poren (Durchmesser 500 μm) wurden in einem Modul (Innendurchmesser 9 mm, Länge 27 mm) mit einem Lochabstand von 600 μm unter Bildung einer dreieckigen Anordnung angeordnet. Es wurde ein Modul hergestellt, das 187 der in Beispiel 1 verwendeten Hohlfasern enthielt, die mittels zwei solcher Distanzstücke regelmäßig angeordnet waren. Primäre Rattenhepatozyten wurden mittels einer 3-minütigen Zentrifugation bei 60 × G im Raum außerhalb der Fasern in diesem Modul immobilisiert. Ein Kulturmedium, HDM, wurde mit einer Fließrate von 30 ml/min durch das Hohlfaserlumen perfundiert. In dieser Stufe betrug die Zelldichte pro Volumeneinheit des Moduls 3 × 10⁷ Zellen/cm³.
Zur Auswertung der Funktionen des Moduls wurde das Kulturmedium mit Ammoniak mit einer Konzentration von 1 mM beladen, und Änderungen der Ammoniakkonzentration und der Menge des synthetisierten Harnstoffs wurden quantitativ gemessen, um die Ammoniak-Metabolisierungsaktivität und die Harnstoff-Syntheseaktivität zu bestimmen. 6 zeigt die Änderungen der Ammoniak-Metabolisierungsrate pro Volumeneinheit des Moduls im Laufe der Zeit.
Als Kontrolle wurde die Aktivität des Moduls gemessen, bei dem ein Sphäroid im porösen Träger immobilisiert worden war. Das Modul der vorliegenden Erfindung wies im Vergleich zu einem Modul vom Sphäroidtyp, das dasselbe multizelluläre Hepatozytenaggregat einschloss, eine Kultur mit einer höheren Dichte auf. Die Fähigkeit zur Metabolisierung von Ammoniak pro Modul war beim Maximum der Aktivität 4 Mal größer als beim Modul des Sphäroidtyps.
Beispiel 3
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1, außer, dass als Kulturmedium ein serumfreies Medium (Medium A) verwendet wurde, das hergestellt wurde, indem 60 mg/l Prolin, 50 ng/ml EGF (hergestellt von Funakoshi), 10 mg/l Insulin (hergestellt von Sigma), 7,5 mg/l Hydrocortison (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0,1 μM Kupfersulfat-5-hydrat (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 3 μg/l selenige Säure (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 50 pM Zinksulfat-7-hydrat (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 50 μg/l Linolensäure (hergestellt von Sigma), 58,8 mg/l Penicillin (hergestellt von Meiji Seika), 100 mg/l Streptomycin (hergestellt von Meiji Seika), 1,05 g/l Natriumhydrogencarbonat (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 1,19 g/l HEPES (hergestellt von Dojindo Molecular Technologies, Inc.) zu nach Dulbecco modifiziertem Eagleschem Medium (DMEM; 13,5 g/l, hergestellt von Gibco) gegeben wurden, wurden Rattenhepatozyten kultiviert und die Fähigkeit zur Metabolisierung von Ammoniak, die Fähigkeit zur Synthese von Harnstoff und die Fähigkeit zur Sekretion von Albumin als Funktion des Zeitablaufs bestimmt. Insbesondere wurde das Kulturmedium mit Ammoniak mit einer Konzentration von 1 mM beladen und 24 h lang umgesetzt. Die Ammoniakmenge, die während der Reaktion metabolisiert wurde, und die synthetisierte Menge an Harnstoff wurden zur Bestimmung einer jeden Aktivität quantitativ gemessen. Auf vergleichbare Weise wurde die im Medium sezernierte Albuminmenge quantitativ gemessen, um die Aktivität der Sekretion von Albumin zu bestimmen.
Dieselbe Aktivitätsbestimmung wurde hinsichtlich der Hepatozyten durchgeführt, die unter Verwendung von HDM (Medium B) kultiviert wurden, das dasselbe WEM wie in Beispiel 1 als Grundmedium enthielt, und die langfristige Erhaltung der Hepatozyten-Funktionen wurde zwischen den beiden verglichen.
Die Änderungen der Ammoniak-Metabolisierungsrate, der Harnstoff-Syntheserate bzw. der Albumin-Sekretionsrate pro Zelleneinheit sind in 7, 8 bzw. 9 veranschaulicht. Wenn Medium B verwendet wurde, zeigten die Fähigkeit zur Metabolisierung von Ammoniak, die Fähigkeit zur Synthese von Harnstoff und die Fähigkeit zur Sekretion von Albumin der Hepatozyten mit dem Fortschritt der Kultur eine schnelle Abnahme und verschwanden bei einer Kultur von 4 bis 5 Wochen. Wenn Medium A verwendet wurde, behielten die Hepatozyten eine gute Aktivität der obigen Funktionen sogar in der 23. Woche der Kultur, wenn auch mit niedrigeren als den anfänglichen Aktivitäten.
Aus dem Obigen ist gefunden worden, dass die Kultur eines mehrzelligen Hepatozyten-Aggregats, das durch eine Zentrifugen-Zellimmobilisierung in einem Kulturmedium gebildet wird, das um Prolin, EGF, Hydrocortison, selenige Säure, Linolensäure, Kupfersulfat und Zinksulfat ergänztes DMEM enthält, eine Erhaltung hoher Leberfunktionen für einen langen Zeitraum von wenigstens 5 Monaten ergibt.

Claims

Hybridmodul für eine künstliche Leber, umfassend (A) ein Modul zur Zellkultur, umfassend eine Struktur, die Hohlfasern (2) umfasst, die gleichmäßig in einem Raum (5) platziert sind und mittels zweier Dichtungsteile (4) festgelegt sind, wenigstens zwei Distanzstücke (3), wobei die Distanzstücke (3) in Nachbarschaft mit den beiden Dichtungsteilen (4) platziert sind, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche Distanzstücke (3) im Raum (5) platziert sind und wobei die Distanzstücke (3) kleine Poren (9) haben, die regelmäßig darin angeordnet sind, und die Hohlfasern (2) durch die kleinen Poren (9) geführt sind und regelmäßig in einem sehr kleinen Abstand angeordnet sind, und (B) Hepatozyten, die im Modul zur Zellkultur immobilisiert sind.
Verfahren zur Zellkultur, umfassend ein Immobilisieren von Zellen (10) in einem Lumen einer Hohlfaser (2) in einem Modul zur Zellkultur oder im Raum außerhalb der Fasern des Moduls zur Zellkultur durch die Anwendung einer Zentrifugalkraft und ein Kultivieren der immobilisierten Zellen (2), wobei das Modul eine Struktur umfasst, die Hohlfasern (2) umfasst, die gleichmäßig in einem Raum (5) platziert sind und mittels zweier Dichtungsteile (4) festgelegt sind, wenigstens zwei Distanzstücke (3), wobei die Distanzstücke (3) in Nachbarschaft mit den beiden Dichtungsteilen (4) platziert sind, dadurch gekennzeichnet, dass zu sätzliche Distanzstücke (3) im Raum (5) platziert sind und wobei die Distanzstücke (3) kleine Poren (9) haben, die regelmäßig darin angeordnet sind, und die Hohlfasern (2) durch die kleinen Poren (9) geführt sind und regelmäßig in einem sehr kleinen Abstand angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zellen (10) Hepatozyten sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zellen in einem Kulturmedium kultiviert werden, das ein nach Dulbecco modifiziertes Eaglesches Medium als Grundmedium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zellen in einem Kulturmedium kultiviert werden, das ein nach Dulbecco modifiziertes Eaglesches Medium und ein anderes Medium als Grundmedium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Kulturmedium ein Mediengemisch aus einem nach Dulbecco modifizierten Eagleschen Medium und einem anderen Medium als Grundmedium und Prolin, den epidermalen Wachstumsfaktor, Insulin, Hydrocortison, Selenigsäure, Linolensäure, Kupfersulfat und Zinksulfat umfasst.
Hybridmodul für eine künstliche Leber, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 3.
Verwendung eines Mediums, das ein nach Dulbecco modifiziertes Eaglesches Medium als Grundmedium und Prolin, einen epidermalen Wachstumsfaktor, Insulin, Hydrocortison, selenige Säure, Kupfersulfat und Zinksulfat umfasst, für das Verfahren nach Anspruch 2.
Verwendung eines Mediums, das ein Mediengemisch aus einem nach Dulbecco modifizierten Eagleschen Medium und einem anderen Medium als Grundmedium und Prolin, den epidermalen Wachstumsfaktor, Insu lin, Hydrocortison, selenige Säure, Linolensäure, Kupfersulfat und Zinksulfat umfasst, für das Verfahren nach Anspruch 2.
Verwendung nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, die zum Kultivieren von Hepatozyten verwendet wird.