DE2715821C2

DE2715821C2 - Verfahren zur in vitro-Zellkultur und Zellkultur-Reaktionsgefäß zur Durchführung dieses Verfahrens

Info

Publication number: DE2715821C2
Application number: DE2715821A
Authority: DE
Inventors: Joseph Feder; Katharine University City Mo. Ku; Mau Jung Creve Coeur Mo. Kuo
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1976-04-12
Filing date: 1977-04-07
Publication date: 1985-11-14
Also published as: JPS52125688A; ZA772208B; IT1077765B; NL7703847A; AU514239B2; FR2348270A1; DE2715821A1; CA1071556A; CH631207A5; AU2411277A; US4087327A; FR2348270B1; IL51858A0; NL188808B; BE853416A; JPS603474B2; IL51858A; GB1514906A; NL188808C

Description

Die Kultivierung lebender Zellen in vitro ist die Grundlage vieler Verfahren, so beispielsweise für die Herstellung von Virus-Impfstoffen, die Gewinnung wertvoller Nebenprodukte des Zellstoffwechsels und die Herstel- lung gewebeartiger Stoffe für künstliche Organe.

Für die Kultivierung von Zellen in vitro sind bisher verschiedene Verfahren entwickelt worden.. Bei einem weit verbreiteten Verfahren haften und wachsen die Zellen auf der flachen Seite-entsprechend geformter stationärer Behälter, beispielsweise üblichen Petrlschalen oder rechteckig geformten Kulturplatteri. Auch in den Vorrichtungen mit Plattenstapeln, In denen eine endlose Kunststoffolie um eine Reihe von in bestimmten Abständen voneinander angeordneten Trägern geführt wird, wie in der US-PS 38 43 454 beschrieben, werden flache Oberflächen angewendet. Für die Zellkultivierung In Elnschlcht-Kulturen kann anstelle von blankem Glas oder Kunststoff auch coliagenbeschlchtetes Glas als Träger verwendet werfen. Als dreidimensionale Trägermatrix wurde für die ZeliKultivIerung auch bereits ein collagenbeschichteter Celluloseschwamm vorgeschlagen. Nähere Einzelheiten über diese und andere konventionelle Zellkuiturverfahren sind in bekannten Standardwerken, beispielsweise dem von Kruse und Patterson, »Tissue Culture Methods and Applications«, Academic Press, New York 1973, zu finden.

Vor kurzem wurde die Verwendung hohler Fasern oder synthetischer Kapillaren als Trägermatrix für die Zeilkultur beschrieben [vgl. Knazek, »Science«, 178, 65-67 (1972)]. Eine zur Durchführung dieses Verfahrens geeignete spezielle Vorrichtung Ist in den US-PS 38 21 087 und 38 83 393 beschrieben. Bei dieser Vo,£chtung Ist ein

Bündel von Ultrafiltrationsverfahren in einem zylindrischen Gehäuse oder einer Hülse zusammengefaßt. Diese Vorrichtung arbeitet Un wesentlichen auf der Basis der Membranperfusion durch künstliche Kapillaren. Die große Oberfläche des Hohlfasersystems erlaubt den selektiven Transport durch die Faserwände hindurch und ermöglicht molekulare Austauschvorgänge zwischen dem das Faserinnere durchfließenden Flüssigkeitsstrom und einem Bad auf der Außenseite der Fasern durch einfache Gradientendiffusion.

Eine solche Hohlfaserapparatur wird von Knazek in »Federation Proc«, 33, 1978-81 (1974), und in »Exptl. Cell Res.«, 84, 251-254 (1974), näher beschrieben. Nach den dortigen Angaben wird sie zur Herstellung von HCG-Hormonen aus menschlichen Chorlocarcinomzellen erhalten. Dabei Ist die Wachstumsgeschwindigkeit elfmal größer als In einem 75 cm²-Elnsch!cht-Kolben gemäß Falcon. Hülsengeräte der von Knazek beschrlebenen Art und deren Verwendung In der Zellkultur sind In »American Lab.«, Oktober 1974, S. 33-38, beschrle-

so ben.

Obgleich diese bekannten Verfahren und Vorrichtungen nach Knazek für die Zellkultlvlerung durchaus brauchbar sind, hat sich In der Praxis gezeigt, daß die Anwendung einer Bündel- oder Hülsenanordnung mit Durchfluß des Kulturmediums durch die längsgerichteten Kapillarmembranen eine völlige Durchdringung des Faserbündels mit den Zellen verhindert und ein unerwünschtes Gefälle Im Strom des Kulturmediums erzeugt.

Die Unfähigkeit der Zelle, das Faserbündel völlig zu durchdringen, führt zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Zellen und zu einer unvollständigen Ausnutzung der für die Zellanlagerung vorhandenen Faseroberfläche. Das unerwünschte Gefälle besteht aus einer ungleichmäßigen Verteilung und Ausnutzung des flüssigen Kulturmediums. Beim Hindurchfließen des Kulturmediums durch das Reaktionsgefäß stehen der. zu kultivierenden Zellen In der Nähe des Einlasses mehr Nährstoffe zur Verfügung, während In Richtung auf den Auslaß die

u) Konzentration an Stoffwechselprodukten, wie z. B. Milchsäure, Im Kulturmedium zunimmt, wodurch In unerwünschter Welse der pH-Wert beeinflußt wird und andere toxische Einwirkungen auf die Zellen entstehen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu entwickeln, mit deren Hilfe es möglich Ist, die Nachtelle der bekannten Verfahren und Vorrichtungen zu eliminieren, Insbesondere für eine gleichmäßigere Verteilung des Zellwachstums auf den Fasern und eine bessere Ausnutzung der verfügbaren

μ Fuscroberflllche als bei den bisherigen Verfahren und Vorrichtungen zu sorgen.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst werfen kann, einerseits durch ein Verfahren zur In vltro-Zellkultur, d. h. zur Kultivierung von Zellen In vitro, bei dem die wachsenden Zellen auf einer Vielzahl von längsgerichteten Fasern, die einem Zellkultur-Reaktionsgefäß mit Ein- und

Auslässen für das Kulturmedium angeordnet sind, angelagert wetden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Fasern in einer flachen Schicht angeordnet werden und das Kulturmedium so verteilt wird, daß es gleichförmig durch die Faserschicht und quer zur Ebene der Faserlängsachsen fließt, und andererseits durch ein

Zellkultur-Reaktlonsgefäß mit einem Gehäuse, einer Reaktionskammer innerhalb des Gehäuses, Einlassen und Auslässen für ein Kulturmedium, die mit dieser Kammer in Verbindung stehen, und einer Vielzahl längsgerichteter, in der Kammer befestigter Fasern, zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die längsgerichteten Fasern in einer flachen Schicht angeordnet sind, und das ferner gekennzeichnet Ist durch eine den Fluß des Kulturmediums gleichförmig durch die Faserschicht und quer zur Ebene der Längsachsen der Fasern leitende Verteilervorrichtung.

Der quer zum Faserbett verlaufende Strom des Kulturmediums bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und Verwendung des erfindungsgemäßen Zellkultur-Reaktionsgefäßes und der verhältnismäßig kurze Weg durch das.- Faserbett ergeben zusammen einen einheitlicheren Kulturmediumstrom, als er bei dem parallelen Durchfließen eines Kapillarbündels gemäß den bisher bekannten Verfahren zu erzielen war. Ferner wird erfindungsgemäß eine gleichmäßigere Verteilung des Zellwachstums auf den Fasern und eine bessere Ausnutzung der verfügbaren Faseroberfläche erzielt. Das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß schließt auch die Nachteile der bekannten Reaktionsgefäße mit parallelem Durchstrom aus, bei denen die Zellen die Faserbündel nicht ausreichend durchdringen können und die Nährstoffe am Einlaß verbraucht werden, während eine graduelle Nährstoffverarmung und eine unerwünschte Stoffwechselproduktanreicherung auftreten ^:;ls der Nährmediumstrom das andere Ende der Reakticnskarnmer erreicht. 2ö

Gemäß einer bevorzugten Ausgestalttvsg der Erfindung erfolgt die Verteilung so, daß das Kulturmedium durch eine Einlaßverteilerplatts fließen muß, die eine Vielzahl von kleinen Perforationen aufweist und praktisch parallel zur Faserschicht und zwischen Ihr und dem Einlaß für das Medium angeordnet ist, wobei als Verteilerplatte vorzugsweise ein Metall-Mlkrofllter verwendet wird.

Gemäß weiteren bevorzugten Ausgestaltungen ist

ein Auslaß-Metall-Mikrofilter auf der Auslaßseite der Faserschicht und praktisch parallel zu Ihr angebracht; hat die Metall-Mikrofilter-Verteilerplatte auf der Eiruaßsette eine Porengröße von etwa 0,5 bis 10 μπι und der Metall-Mikrofilter auf der Auslaßseite hat eine Porengröße von etwa 10 bis 100 μπι; sind Zugangsmöglichkeiten zu der Kammer für die Beimpfung und Probenentnahme vorhanden; stehen getrennte Gaseinlässe und Gasauslässe mit der Kammer in Verbindung; ist die Gehäusedecke innen konisch, wodurch die Höhe der Kammer In allen Richtungen radial vom Deckelmittelpunkt ausgehend abnimmt, und ist der Auslaß für das Kulturmedium in der Mitte der Decke angeordnet; besteht das Gehäuse aus einem abnehmbaren Ober- und Unterteil und eines der Gehäuseteile Ist mit Vorsprüngen für eine wasserdichte Verbindung mit dem anderen Gehäuseteil versehen; die längsgerichteten Fasern bestehen aus einem fortlaufenden Faserstrang, der in praktisch gleichmäßiger Dicke um ein Trägergitter gewickelt ist;

besteht die Faserschicht aus etwa 1 bis 50 Lagen einzelner Fasern;

sind die längsgerichteten Fasern hohl und für Luft und Sauerstoff durchlässig und die Reaktionskammer weist Gaselnla J- und Gasauslaßleitungen für die Belüftung durch diese hohlen Fasersegmente auf; und besteht das Gehäuse aus einem abnehmbaren Ober- und Unierteil, von denen ein Gehäuseteil mit Vorsprüngen für eine wasserdichte Verbindung mit dem anderen Gehäuseteil ausgestattet ist, wobei die Faserschicht zwischen einem oberen Metall-Mikrofilter mit einer Porengröße von etwa 10 bis 100 μπι und eineiT· unteren Metall-Mikrofilter, der als Verteiler dient und eine Porengröße von etwa 0,5 bis 10 μπι aufweist, eingeschoben ist.

Das Wesen der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Erfindung besteht darin, daß längsgerichtete *5 hohle oder volle Fasern in einer flachen Schicht als Matrix für die Zellanlagerung angeordnet sind und der Strom des Kulturmediums praktisch gleichförmig durch die Faserschicht und quer zur Ebene der Längsachsen der Fasern geleitet wird. Durch die Verwendung eines relativ flachen Faserbettes und eines relativ kurzen Weges des Kulturmediumstroms wird das Gefälle von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten Im Vergleich zu aen bekannten Bündel- oder Hülsenanordnungen wesentlich verringert und eine vollständigere Ausnützung der Faserobcrfläche erzielt.

Der hier verwendete Begriff »flache Schicht« steht für eine Schicht oder ein Bett, dessen Länge und Breite wesentlich größer sind als die Dicke der Schicht.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegendem Zeichnungen näher erlämert. Es zeigt

Fig. 1 eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkultur-Reaktlonsgefäßes In perspektivischer Darstellung;

Flg. 2 eine auseinandergezogene Darstellung des Zellkultur-Reaktionsgefäßes gemäß Flg. 1, welche die Innenteile zeigt;

FI g. 3 einen Schritt entlang der Linie 3-3 der FI g. 1; «>

Flg. 4 eine auseinandergezogene Darstellung einer weiteren Ausführungsform des erflndungsgetnäßen Zellkultur-Reaktionsgefäßes; und

Flg. 5 eine perspektivische Darstellung einer dritten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Zellkultur-Reaktlonsgefäßes.

In den Flg. 1-3 bezeichnet die Ziffer 10 allgemein ein (Zellkultur-Reaktions-)Gefäß. Das Gefäß 10 besteht « aus einem Im allgemeinen rechteckigen, parallelen, mit Rohren versehenen Gehäuse 11 mit einem abnehmbaren Unterteil 12 und Oberteil 13. Das Unterteil 12 hat parallele (Selten-)wände 14 und IS sowie parallele (Stirn-) wände 16 und 17. In gleicher Welse hat das Oberteil 13 parallele (Seiten-)wände 18 und 1? und parallele

(Stlrn-)wände 10 und 21. Bei dem Oberteil 13 sind die unteren Teile der Wände 18, 19, 20 und 21 zurückgesetzt, so daß sie bündig in den Umfang der Innenselten der Wände 14, 15, 16 und 17 des Unterteils 12 passen, während die oberen Flanschteile der Wände 18, 19, 20 und 21 so gearbeitet sind, daß sie eben auf dem oberen Rand der Wände 14, 15, 16 und 17 aufsitzen.

s Die zwei Teile des Gehäuses 11 werden in geeigneter Welse mit konventionellen Befestigungen, wie Zwingen, Schrauben oder Bolzen 37 mit Flügelmuttern 22, wie abgebildet oder In ähnlicher Welse miteinander verbunden. Falls gewünscht, kann für die beiden Gehäuseteile auch ein Klebverschluß verwendet werden.

Im geschlossenen Zustand begrenzen die Ober- und Unterteile 12 und 13 eine Kammer 23 Innerhalb des Gehäuses. Der Boden 24 des Gehäuses Ist praktisch flach, während die Decke 25, wie abgebildet, Im allgemeilij nen eine konische Form hat, so daß die Höhe der Kammer 23 vom Mittelpunkt deir Decke 25 ausgehend radial in alle Richtungen abnimmt.

In die Wände des Gefäßes 10 und als Verbindung zu der Kammer 23 sind (Medlum-)elnlässe 26 und 27 In das Unterteil 11 und der (Medlum-)anschluß 28 In die Mitte des Oberteils eingefußt. Die Medlumelnlässe sind außerdem mit einem Mediumvorratsbehälter verbunden, aus dem das Medium über Pumpen oder durch hydrostatischen Druck zufließt (nicht abgebildet). Der Medlumaiislaß Ist mit einem Behälter für verbrauchtes Medium verbunden (nicht abgebildet). Ebenso Ist eine Zugabe (Einlaß) 29, der *ur Beimpfung und Probenentnahme verwendet werden kann, Im Oberteil 13 angebracht. Zu jedem der Me(lium-Elnlässe/-Auslässe 26, 27, 28 und 29 gehört ein Adapter .10, 3!, 32 bzw. 33 zur EeguUsrung dss Mcdiuir.flüsscs und zur Verteilung des Mediums In der Reaktionskammer.

Eine Schicht längsgerichteter Fasern 34 wird als relativ flaches, niederes Bett In der Kammer 23 auf einer rechteckigen Verteilerplatte 35 angeordnet. Eine Vielzahl von kleinen öffnungen 36 Ist In praktisch gleichmäßigen Abständen voneinander auf der Oberfläche der Verteilerplatte 35 für das Aufwärtsströmen des Mediums angeordnet. Diese Öffnungen oder Perforationen können z. B. etwa 1 bis 10 mm Durchmesser haben und können entsprechend bis zu beispielsweise etwa 10 cm voneinander entfernt liegen. Die Verteilerplatte 35 Ist In geeigneter Welse in der Kammer 23 montiert, so daß sie praktisch In einer horizontalen Ebene über den Einlassen 26 und 27 liegt. Diese Montierung kann mit konventionellen Mitteln, wie Haltern, Flanschen oder Verklebungen, erfolgen.

Die in dem Gefäß 10 für die Zellanlagerung verwendeten längsgerichteten Fasern können hohle Röhrchen

oder volle Fasern mit Durchmessern von Im allgemeinen etwa 100 bis 1000 μηι sein. Diese Fasern können aus jedem Material hergestellt werden, das für die Zellen nicht toxisch Ist, das leicht zu Fasern gesponnen werden kann und das die Zellanlagerung erlaubt. Zu den geeigneten Materlallen gehören z. B. verschiedene Acrylnltrllpolymere, Styrolpolymere, polyionische Polymere, Polycarbonate, Polysulfone, Polykohlehydrate wie Cellulose und Cellulosederivate, z. B. Celluloseacetat-, Cellulosetriacetat- und Cellulosepropionatester, Polypeptide wie Collagen, Siliconkautschukpolymere, Fluorkohlenstoffe und ähnliche synthetische Harze. Beispiele geeigneter Fasern aus diesen Stoffen und Verfahren zu Ihrer Herstellung sind In den US-PS 32 28 876, 35 83 907 und 38 21 087 beschrieben.

Die Fasern können wie in Flg. 2 parallel oder z.B. als geordnetes oder zufällig verteiltes Netz angeordnet werden. Das Faserbett kann auch mehrere Schichten überelnandergelagerter einzelner Fasern enthalten und Im allgemeinen Ist die Verwendung von einer bis zu etwa 50 Faserschichten möglich. Falls gewünscht, können zwischen einzelne Faserschichten Trägerplatten oder Distanzstücke eingeschoben werden. Diese Tragerplatten oder Distanzstücke können ähnlich wie die Verteilerplatte 35 sein, sie können auch als Gitter oder ähnliche Konstruktionen ausgebildet sein, durch die das Kulturmedium passleren kann. Das Faserbett kann auch aus einer fortlaufenden Faser bestehen, die so umgeschlagen und gefaltet wird, daß sie eine Vielzahl von längsgerichteten Strängen oder Segmenten bildet, die horizontal in der Kammer hin- und herlaufen. Eine fortlaufende Faser kann auch um ein Gitter oder eine Trägerplatte gewickelt werden und so leicht zwei oder mehr Faserschichten In dem Bett bilden. Falls gewünscht kann das Faserbett auch aufrecht, Schräg, gefaltet, sinusförmig, gewunden oder andersförmlg angeordnet werden, es muß aber eine relativ flache Faserschicht und ein relativ kurzer Mediumweg beibehalten und der Mediumfluß praktisch einheitlich durch das Faserbett und quer zur Ebene der Faserlängsachsen geführt werden.

Vorzugsweise hat das Faserbett einen Im allgemeinen quadratischen horizontalen Querschnitt, um die gleichmäßige Verteilung des Kulturmediums In alle Richtungen zu erleichtern.

In einem erläuternden Beispiel eines Faserbetts für ein rechteckiges Reaktionsgefäß mit Bettabmessungen von 10 cm χ 10 cm können etwa 300 Fasern mit einem Durchmesser von je 3,4 χ 10~² cm ideal in einer Schicht nebeneinander untergebracht werden. Eine Reaktionskammer mit fünf solcher Schichten hat dann eine effektive Faseroberfläche für die Zellanlagerung von etwa 1600 cm².

Das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß ist jedoch nicht auf diese speziellen Dimensionen beschränkt.
Beim Betrieb eines Mustergefäßes wird Zellkulturmedium durch die Einlasse 26 und 27 In die Kammer 23 geleitet. Das Medium wird durch Einlaß 29 mit einer Ausgangskultur einer geeigneten Säugetier-Zell-Linle beimpft und die Kultur bei einer Temperatur von etwa 20⁰C bis 4O⁰C, vorzugsweise etwa 35° C bis 37° C, «) bebrütet. Während der Inkubation kann regelmäßiger Mediumwechsel vorgenommen werden, wobei das verbrauchte Medium durch den Auslaß 28 abgegeben und frisches Medium durch die Einlasse 26 und 27 wieder eingeführt wird. Falls gewünscht, kann das Kulturmedium vor der Einleitung in das Zellkultur-Reak-Honsgefüß mit konventionellen Mitteln belüftet werden. Im Anschluß an die Inkubation können die gewünschten Stoffwechsel- oder Nebenprodukte des Zellwachstums aus dem verbrauchten Medium Isoliert werden. (··■ Proben des makromolekularen Materials können durch den Zugang 29 zu jedem Zeltpunkt während der Inkubation entnommen werden. Das Reaktionsgefäß wird vorzugsweise kontinuierlich betrieben, wobei die Einlasse 26 und 27 sowie der Auslaß 28 offengehalten und auf die gewünschte Fließgeschwindigkeit des Kulturmediums durch entsprechendes Pumpen oder den hydrostatischen Druck eingestellt werden.

Das Kulturmedium fließt In den unteren Teil der Kammer 23 unter die perforierte Verteilerplatte 35, die eine gleichmäßige Verteilung des Mediums sowie einen nach oben und quer zur Ebene der Faserlängsachsen gerichteten Fluß bfcwlrkt. Die Abnahme der Höhe des Oberteils 13 der Kammer 23 mit zunehmendem Abstand vom Mediumauslaß 28 unterstützt den gleichmäßigen Abfluß des verbrauchten Mediums oberhalb des Faserbettes; damit wird dem Bedarf an die Fasern durchfließendem Medium entsprochen, was zu einer größeren Glelchförmlgkelt der Durchströmung der Kammer führt.

1)er quer zum Faserbett verlaufende Fluß und der verhältnismäßig kurze Weg durch das Faserbett ergeben zusammen einen einheitlicheren Mediumstrom, als er bei dem parallelen Durchfließen eines Kapillarenbündels In den bisherigen Verfahren zu erzielen war. Ferner wird eine gleichmäßigere Verteilung des Zellwachstums auf den Fasern und bessere Ausnutzung tier verfügbaren Faseroberfläche erzielt. Die Anordnung des erflndungsgemäßen Gefäßes schließt also die Nachtelle der bisherigen Gefäße mit parallelem Durchstrom aus, bei denen die Zellen die Faserbündel nicht ausreichend durchdringen können und die Nährstoffe am Einlaß verbraucht werden, während eine graduelle Nährstoffverarmung und eine unerwünschte Stoffwechselprodukteanreicherung stattfinden, bis der Mediumstrom das andere Ende der Reaktionskammer erreicht hat.

In Fig. 4 Ist ein modifiziertes erfindungsgemäßes Zellkulturgefäß mit einem Unter- und einem Oberteil 12 >5 bzw. 13 dargestellt. Die Medlumelnlässe 26 und 27 und der Mediumauslaß 28 sind Im wesentlichen die gleichen wie In den Abbildungen 1 bis 3, ebenso der Zugang 29 und die Schicht längsgerichteter Fasern 34. Die perforierte Vcrtcüerplaite 35 der Flg. ΐ bis 3 wurde jedoch durch ein Metaii-Mikrofiiter 4ü ersetzt. Das Metall-Mikrofilter kann z. B. aus rostfreiem Stahl sein und hat vorzugsweise eine Porengröße von etwa 0,5 bis ΙΟμίη. Es bewirkt auf vorteilhafte Weise eine noch gleichmäßigere Verteilung des Kulturmediums als die Verteilerplatte 35. Das Faserbett kann auch zwischen zwei Metall-Mlkrofllter eingeschoben werden; In diesem Fall dient der untere Metall-Mlkrofllter 40 als Verteilerplatte, der obere Metall-Mlkrofllter 41 als Diffusionsbarriere, die die Zellen am Passieren durch den Auslaß hindert und den Rückfluß von verbrauchtem Medium aufhält. Der obere Metall-Mlkrofllter hat vorzugsweise eine Porengröße von etwa 10 bis 100 μπι. Bei dieser Ausführungsform sollte der Zugang 29 unter der horizontalen Ebene des oberen Filters liegen und die Decke 42 der Kammer Ist vorzugsweise flach und nicht konkav wie In den Fig. 1-3.

In Flg. 5 Ist ein (Zellkultur-)Gefäß 10 wie In den Flg. 1 bis 3 dargestellt, jedoch sind zusätzliche Vorrichtungen für die Belüftung während der Inkubation vorgesehen. Bei dieser Ausführungsform sind die längsgerichteten Fasersegmente hohl und für Luft und Sauerstoff durchlässig; die Reaktionskammer Ist mit Gasein- und - jslaßleltungen ausgestattet, die mit dem Inneren der hohlen Fasern In Verbindung stehen. So sind der Gaselnlaß 50 und der Gasauslaß 51 einander gegenüberliegend In den Stirnwänden 16 bzw. 17 angebracht. Der Gaseinlaß 50 erlaubt den Eintritt von Luft oder Sauerstoff durch ein Sammelstück In der Stirnwand 16 und von da aus in die offenen Enden der darin eingelassenen hohlen Fasern. Gasauslaß 51 ermöglicht die Entfernung des Abgases aus den anderen Faserenden, die In der Stirnwand 17 ebenfalls in einem Sammelstück eingelassen sind. Das frische Kulturmedium wird durch die Einlasse 26 und 27 eingeführt, das verbrauchte Medium wird wie oben durch den Auslaß 28 abgegeben. Wie in der Ausführung der Fig. ! bis 3 Ist der Zugang zur Beirnpfung und Probenentnahme durch den Elnlaß 29 möglich, die Adapter 52 und 53 ermöglichen eine Steuerung des Luft- oder Sauerstoffstroms durch das Zellkultur-Reaktlonsgefäß.

Es Ist ersichtlich, daß viele weitere Modifikationen und Änderungen der beschriebenen erfindungsgemäßen Ausführupgsformen möglich sind. So können zum Beispiel Überlauföffnungen oder zusätzliche Zugangs- und Zulauföffnungen an verschiedenen geeigneten Stellen In den Gefäßwänden angebracht werden. In den Ausführungsformen mit mehreren Faserschichten können geeignete Distanzstücke angebracht werden, um die jeweiligen Schichten in einem bestimmten Abstand voneinander zu halten. Die abnehmbaren oberen und unteren Gehäuseteile können weitere geeignete Vorsprünge haben, damit eine wasserdichte Verbindung der beiden Teile möglich ist. Die Faserenden können an den Selten- oder Stirnwänden der Reaktionskammer befestigt werden, sie können aber auch in einem auswechselbaren Sammelstück mit Vergußmasse gehalten werden, wie z. B. Epoxy und anderen härtenden organischen Klebemitteln, die als Dichtung für die Fasern dienen können. Die Medlumeinlässe können zusätzlich kleine Öffnungen haben, die um den Umfang einer in die Kammer führenden Rohrleitung angeordnet sind und eine radiale Verteilung des frischen Kulturmediums bewirken.

Das erfindungsgemäße Zellkultur-Gefäß mit flachem Bett kann auch zu Vielfacheinheiten zusammengestellt so werden. So kann zum Beispiel eine Vielzahl von Gefäßen leicht In einem Inkubator gestapelt werden und so ein Zellkultursystem mit allen hler beschriebenen Vorteilen Im größeren Maßstab bilden.

Zum Bau des Reaktionsgefäßes kann Metall oder Kunststoff verwendet werden, das zur Herstellung einer verhältnismäßig starren Konstruktion geeignet Ist. Im allgemeinen können für das Gefäß Spritzguß-Plastikteile oder bearbeitete Metallteile verwendet werden. Die Verwendung von durchsichtigem Kunststoff, wie z. B. von Polycarbonat, Polystyrol und Methylacrylat, wird bevorzugt, wenn die visuelle Beobachtung des Zellwac'nstums möglich sein soll. Rostfreier Su.nl 1st wegen seiner Eignung für die Dampfsterilisation bevorzugt. Im allgemeinen sind biologisch Inerte Stoffe für die Herstellung aller Teile der Reaktionskammer zu verwenden, die mit dem Kulturmedium und den Kulturprodukten In Kontakt kommen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die in diesen Beispielen verwendeten Zeil-Linien und Kulturmedien sind lediglich Beispiele bekannter Linien und Medien. In den erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen können auch andere übliche Säugetier-Zell-Linien, wie menschliche Lungenflbroblasten (WI-38), Nierenzellen von Rhesusaffen (MK-2) und Cervlxcarcinomzellen (HeLa) oder andere konventionelle Kulturmedien, wie »Eagle's basal medium« und »earie's« oder »Hank's balanced salt solution«, verwendet werden. Ebenso sind die in den Beispielen angewandten Impf-, Inkubations- und Gewinnungsverfahren nur beispielhaft zu verstehen.

Beispiel 1

3T3 Mäuseembryoflbroblasten, transformiert durch Affenvirus 40 (SV3T3), wurden bis zur Konfluenz in einem 75 cm¹ Falcon-Gewebekulturkolben gezüchtet, der 10 ml eines Kulturmediums aus »Dulbecco's modified Minimum Essential Medium (MEM)« mit 10% fetalem Kalbsserum enthielt. Nach Entfernung des verbrauchten Kulturmediums aus dem Kolben wurden die Zellen einige Minuten mit 2 ml 0,25% Trypsin In phosphatgepufferter Salzlö.'-ing trypslnlert, anschließend wurde das Trypsin durch Verdünnen mit weiteren 10 ml des gleichen Kulturmediunis Inaktiviert. L"is Zellen wurden verteilt und dann In eine sterile Spritze zur Beimpfung eines Zellkultur-Reaktlonsgefäßes gegeben.

ίο Ein erfindungsgemäßes Zeükultur-Gefäß mit flachem Bett wurde mit Äthylenoxid sterilisiert, zur Entfernung der Äthylenoxidreste mit sterilem Wasser ausgewaschen und mit einer Erstfüllung mit »Dulbecco's« modified Minimum Essential Medium (MEM)«, das 2% fetales Kalbsserum enthielt, equlllbrlert. Das Reaktionsgefäß war aus Plexiglas (Methylacrylatplastlk) und enthielt ein Faserbett mit den Abmessungen 10,16 cm mal 10,16 cm mal 1,27 cm (Höhe). Das Bett bestand aus 114 laufenden Metern eines fortlaufenden Stranges hohler Kaplllarfaser, der In praktisch gleicher Dicke um drei offenmaschlge Polyamidgitter gewickelt war. Der Faserstrang hatte einen Außendurchmesser von 340 μπι und war aus einem Polyvlnylchlorldacryl-Copolymer gesponnen.

Eine 10,16 cm mal 10,16 cm mal 0,3175 cm (Dicke) perforierte Verteilerplatte wurde direkt unter dem Faserbett angebracht.

Das Reaktionsgefäß wurde mit 10 ml der oben beschriebenen Zellsuspension (die 5x10' Zellen pro ml enthielt) beimpft und 5 Stunden bei 37⁰C Inkubiert. Gelegentlich wurde geschüttelt, um eine gleichmäßigere Anlagerung der Zellen an die Faser zu fördern. Anschließend an die Beimpfung wurde »Dulbecco's modified Minimum Essential Medium« mit 2% fetalem Kalbsserum mit einer Geschwindigkeit von 10 ml pro Stunde In das Reaktionsgefäß gepumpt und durch die perforierte Verteilerplatte In nach oben gerichtetem Strom quer zur horizontalen Ebene der Faserlängsachsen geleitet.

Mit zunehmender Zelldichte wurde die FHeßgeschwlndlgkelt nach und nach auf ein Maximum von 60 ml pro Stunde erhöht, die Inkubation wurde nach 24 Tagen beendet.

Nach Abschluß der Inkubation wurden die Zellen durch Abbau der Reaktionskammer und gründliches Auswaschen ihres Inhaltes In normaler physiologischer Salzlösung gewonnen. Die beim Waschen abgefallenen Zellen und das Faserbett mit den noch an den Fasern haftenden Zellen (der Mehrzahl der Zellen) wurden 15 Stunden mit In NaOH zur Verdauung des gesamten Zellwachstums behandelt. Das Verdauungsprodukt wurde dann eingefroren und für die DNA-Analyse zur Bestimmung der gewonnenen Zellmenge aufbewahrt.

Dieses Zellkulturverfahren wurde In einer ähnlichen Reaktionskammer mit flachem Bett wiederholt, jedoch betrug die gesamte Inkubationszelt 59 Tage.
Zum Vergleich wurde dieses Zellkulturverfahren In einem hülsenförmlgen Zellkulturgefäß mit parallelem Mediumfluß und einer Faseroberfläche, die der des Flachbettbehälters entsprach, wiederholt. Es wurden etwa 800 einzelne hohle Kapillarfasern aus dem gleichen Material und mit dem gleichen Durchmesser wie oben in einem Hülsenbünuei von 2 cm Durchmesser und 20 cm Länge angeordnet. Das Kulturmedium wurde nicht wie In der Kammer mit flachem Bett quer zum Faserbett geleitet, sondern strömte vom Einlaß an einem Ende der Hülse zum Auslaß am anderen Hülsenende. Wie bei der Reaktionskammer mit flachem Bett wurden zwei getrennte Inkubationen von 24 bzw. 59 Tagen durchgeführt.

Die DNA-Analysen der in den obigen Tests gewonnenen Zellen sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich:

Kammertyp

Inkubationszelt in Tagen

Zellanalyse mg DNA

Zelläquivalent*)

Flachbett	24	18,374	1,837 xlO'
Flachbett	59	18,84	1,84 χ 10'
Hülse	24	4,668	0,4668 χ 10'
Hülse	59	11,836	1,18 xlO'
*) Geschätzt über 10 l	ig DNA = 10' Zeilen

Zusätzlich zu der schnelleren Erzeugung einer größeren Zellmenge waren In der Flachbettkammer die Zellen gleichförmiger über die vorhandene Faseroberfläche verteilt, als In der Hülsenkammer.

Beispiel 2

Die Zellkulturverfahren von Beispiel 1 wurden In einem erfindungsgemäßen Gefäß mit flachem Bett wiederholt, wobei das Faserbett aus

a) Polysulfonfaser mit einem Außendurchmesser von 560 μπι und einer Gesamtlänge von 12,6 m und

b) Polyacrylnitrilfaser mit einem Außendurchmesser von 757 μΐη und einer Gesamtlänge von 89 m bestand.

Die gewonnenen Zellen wurden mittels DNA-Anilyse geschätzt und entsprachen

a) 1,9 χ 10' Zellen bei Polysulfonfasern nach 31täglger Inkubation und

b) 2,295 χ 10' Zellen bei Polyacrylnltrilfasern nach 34täglger Inkubation.

Beispiel 3

Nierenzellen junger Hamster (BHK) (ATCC Nr. CCLlO; vgl. J. Paul, Cell and Tissueculture, 1970. S. 410)
wurden in einem erfindungsgemäßen Gefäß mit flachem Bett gezüchtet. Es wurde »Dulbecco's modified Minimum Essential Medium«, das 10% fetales Kalbsserum enthielt, verwendet und das Medium während einer
23tägigen Inkubationszeit belüftet. Es wurden ähnlich gute Zellkulturresultate wie In Beispiel 1 und 2 erhalten.

»Dulbecco's modified Minimum Essential Medium« Ist ein handelsübliches Standard-Kulturmedium, vom
Hersteller als Dulbecco's MEM, 4,5 g/l Glucose bezeichnet [vgl. auch »In Vitro«, Vol. 6, Nr. 2, S. 89-94 (1970)].

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur In vltro-Zellkultur, bei dem die wachsenden Zellen auf einer Vielzahl von längsgerichteten Fasern, die in einem Zellkultur-Reaktionsgefäß mit Ein- und Auslässen für das Kulturmedium angeord- net sind, angelagert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Fasern in einer flachen Schicht angeordnet werfen und das Kulturmedium so verteilt wird, daß es gleichförmig durch die Faserschicht und quer zur Ebene der Faserlängsachsen fließt.

2. Zellkultur-Reaktionsgefäß mit einem Gehäuse, einer Reaktionskammer Innerhalb des Gehäuses, Einlassen und Auslassen für ein Kulturmedium, die mit dieser Kammer in Verbindung stehen, und einer Vlefzahl

ίο längsgerichteter, in der Kammer befestigter Fasern, zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die längsgerichteten Fasern In einer flachen Schicht angeordnet sind, und ferner gekennzeichnet durch eine den Fluß des Kulturmediums gleichförmig durch die Faserschicht und quer zur Ebene der Längsachsen der Fasern leitende Verteilervorrichtung.

3. Zellkültur-Reaktionsgefäß nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verteilervorrichtung aus einer Einlaß-Verteilerplatte mit einer Vielzahl kleiner Perforationen besteht und parallel zu der Faserschicht sowie zwischen Faserschicht und Mediumeinlaß angebracht ist.

4. Zellkültur-Reaktionsgefäß nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verteilerplatte ein Metall -Mikrofllter ist.