DE3035118C2

DE3035118C2 - Verfahren zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE3035118C2
Application number: DE3035118A
Authority: DE
Inventors: Fusakazu Chigasaki Kanagawa Hayano; Koichi Fuji Shizuoka Yoshida
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1979-09-18
Filing date: 1980-09-17
Publication date: 1982-09-23
Also published as: DE3035118A1; JPS5642584A; FR2476124A1; GB2062006B; FR2476124B1; US4391912A; GB2062006A

Description

Verfahren zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Es sind verschiedene Methoden zur Kultivierung von Tierzellen bekannt. Tierzellen umfassen solche, die wachsen und sich vermehren, während sie an eine Wachstumsoberfläche gebunden sind (sie werden als »haftende Zellen« bezeichnet), und solche, die in einem schwimmenden Zustand wachsen und sich vermehren (sie werden als »schwimmende Zellen« bezeichnet).

Derartige haftende Zellen können im allgemeinen nur in einer einzigen Schicht auf der Oberfläche wachsen und sich vermehren, auf der sie haften. Richard A. Knazek et al. erzielten jedoch ein dreidimensionales Wachstum und eine dreidimensionale Vermehrung von haftenden Zellen durch eine Methode, bei der man die haftenden Zellen auf der äußeren Oberfläche von semipermeablen Hohlfasern oder Kapillaren wachsen läßt und ein Kulturmedium durch die Hohlfasern oder Kapillaren durchleitet (Journal of Medicine, Bd. 296, Nr.

3, Seiten 154-159 [1977]). Ferner ist in der US-PS 39 97 395 eine Methode zur Erzielung von dreidimensionalem Wachstum und dreidimensionaler Vermehrung haftender Zellen beschrieben, bei der man die haftenden Zellen auf einer Oberfläche einer Hohlfasern,-imbran

ίο wachsen läßt und Sauerstoff der anderen Oberfläche zuführt

Schwimmende Zellen sind im Vergleich zu haftenden Zellen im allgemeinen schwach bzw. anfällig (siehe Jingansaibo no Baiyo, Asakura Shoten, Tokyo, S. 44 Π975) (Shoichi Oboshi et al.)). Es wurde daher als schwierig angesehen, die schwimmenden Zellen in der gewünscht hohen Dichte wachsen und sich vermehren zu lassen.

Diese Annahmen führten zu dem Schluß, daß alle genannten Methoden unter Verwendung von Hohlfasern auf die Kultivierung der haftenden Zellen beschränkt sind.

Methoden, die man im allgemeinen bei der Kultivierung von schwimmenden Zellen anwendet, sind beispielsweise eine stationäre Methode der schwimmenden Kultur bzw, eine stationäre Schwimmkulturmethode und eine Sutaensionskulturmethode unter Anwendung von beispielsweise Schütteln oder rotierendem Rühren. Diese Methoden weisen jedoch die nachstehenden Nachteile auf: (1) Man benötigt eine riesige Vorrichtung, weil es schwierig ist, die Zellen in hoher Dichte wachsen und sich vermehren zu lassen; (2) es ergeben sich Schwierigkeiten beim Abtrennen der Zellen von beispielsweise den Nährstoffen, metabolisehen Produkten und Abfällen; (3) es ist schwierig, das Kulturmedium kontinuierlich auszutauschen; und (4) die Möglichkeit der Verunreinigung durch andere Mikroorganismen ist groß. Es war daher höchst wünschenswert, diese Nachteile insbesondere deswegen zu überwinden, weil die schwimmenden Zellen metabolische Produkte erzeugen, die vom medizinischen und tiermedizinischen Standpunkt aus wichtig sind, z. B. zur Diagnose und medizinischen Behandlung verschiedener Krankheiten. Es wurden bemerkenswerte Fortschritte bei dem Wachstum und der Vermehrung von haftenden Tierzellen erzielt, und es ist bereits möglich, die haftenden Tierzellen dreidimensional wachsen und sich vermehren zu lassen, d. h. wie ein Gewebe, indem man Hohlfasern verwendet. Andererseits wurde die Kultivierung der schwimmenden Zellen bisher auf die beschriebene übliche Weise durchgeführt. Bei diesen Methoden ist es schwierig, die schwimmenden Zellen in hoher Dichte wachsen und sich vermehren zu lassen. Dadurch ergeben sich verschiedene Probleme bei der Herstellung von brauchbaren metabolischen Produkten aus den schwimmenden Zellen durch ihre Kultivierung in großen Mengen.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Kultivierungsverfahren vorzusehen, das das Wachstum und die Vermehrung von schwimmenden Tierzellen sowohl in hoher Dichte als auch kontinuierlich ermöglicht. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, eine Zellkultureinheit vorzusehen, die man zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen wirksam verwenden kann.

Diese Aufgaben werden gemäß der Erfindung (vgl. Patentansprüche 1 und 2) gelöst.

Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen, das da-

durch gekennzeichnet ist, daß man ein Kulturmedium in eine Zellkultureinheit einführt, die ein Gehäuse und eine Mehrzahl von Hohlfasern im Gehäuse eingeschlossen umfaßt, wobei die Hohlfasern an ihren beiden Enden zur Außenseite des Gehäuses offen sind und einen Porendurchmesser von 2,0 nm bis ΙΟ⁴ nm aufweisen, und man das Kulturmedium durcli das Innere der Hohlfasern durchleitet und die schwimmenden Tierzellen im Raum zwischen dem Gehäuse und den Hohlfasern kultiviert to

Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens, die durch ein Gehäuse und eine Mehrzahl von Hohlfasern gekennzeichnet ist, die in dem Gehäuse eingeschlossen sind, wobei die Hohlfasern an ihren beiden Enden zur Außenseite des Gehäuses offen sind und einen Porendurchmesser von 2,0 bis 10⁴ nm aufweisen; und die ferner durcli eine Anordnung gekennzeichnet ist, die das Durchleiten eines Kulturmediums durch das Innere der Hohlfasern und die Kultivierung von schwimmenden Tierzellen im Raum zwischen dem Gehäuse und den Hohlfasern erlaubt

Die Patentansprüche 3 bis 6 nennen Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Nach dem Anspruch 2 sind also jeweils beide Enden der genannten Hohlfasern zur Außenseite des Gehäuses offen bzw. durch die Gehäusewandung (gegebenenfalls mit Hilfe von Zu- und Ableitungen) geführt

Der Porendurchmesser der Hohlfasern liegt im Bereich von 2 bis 10⁴ nm; bei einem Porendurchmesser der Hohlfasern im Bereich von 10" bis SxllPnm wachsen und vermehren sich die schwimmenden Zellen besonders gut

Vermutlich ist die Ursache dafür die Tatsache, daß unter den erfindungsgemäßen Bedingungen der Austausch der Nährstoffe im Kulturmedium gegen die Stoffwechselprodukte und Abfälle in den Zellen sehr glatt verläuft, wodurch man eine Umgebung erzielt, die für das Wachstum und die Vermehrung der Zellen vorteilhaft ist

Das erfinüungsgemäße Verfahren kann man allgemein auf schwimmende Tierzellen anwenden, und man erzielt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gute Ergebnisse bei der Vermehrung von schwimmenden Zellen, die man durch Zellfusion mit anderen Zellen erhalten hat

Nachstehend wird die Erfindung dutch Figuren näher erläutert Es zeigt

F i g. 1 eine perspektivische Ansicht einer Zellkultureinheit, die man bei der Ausführung der Erfindung verwenden kann,

Fig.2 einen Querschnitt, der entlang der Linie A-A von F i g. 1 verläuft,

F i g. 3 einen Querschnitt, der entlang der Linie C-C von F i g. 1 verläuft,

F i g. 4 einen Querschnitt, der entlang der Linie B- B von F i g. 1 verläuft,

Fig.5 eine perspektivische Ansicht einer anderen Ausführungsform der Zellkultureinheit, die man bei der Durchführung der Erfindung verwenden kann,

F i g. 6 einen Querschnitt, der entlang der Linie D-D von F i g. 5 verläuft,

F i g. 7 ein Schema, das eine Zellkultivierungsvorrichtung unter Verwendung von erfindungsgemäßen Zellkultureinheiten darstellt und bs

Fig.8 ein Diagramm, das die Differenz in der Zelldichte bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eeeenüber einer Methode des Standes der Technik zeigt.

Zunächst werden die Zellkultureinheiten, die man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwenden kann bzw. die erfindungsgemäße Vorrichtung näher erläutert.

Die Fig. 1 bis 4 zeigen eine Ausführungsform einer erfindungsgemäß verwendbaren Zellkultureinheit bzw. einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, bei der eine Mehrzahl von Hohlfasern 1 in einem Gehäuse 2 eingeschlossen sind, das man durch Verbindung zweier Flachmaterialien bzw. Platten in Taschenform erhalten hat Die Hohlfasern 1 werden auf jeder Seite durch Befestigungsschichten 3 und 3' an Ort und Stelle gehalten; und das Innere der Hohlfasem 1 ist nach außen offen. Die Rohre 4 und 4', die mit dem Inneren der Hohlfasem 1 in Verbindung stehen, sind zur Außenseite des Gehäuses offen bzw. durch die Gehäusewandung (Seitenwände 6 und 6' des Gehäuses in den F i g. 1 bis 3 und 5 bis 6) geführt. Man kann ein Kulturmedium durch die Rohre 4 und 4' einführen und abziehen. Ferner sind die Rohre 5 und 5' vorgesehen, die mit dem Raum in Verbindung stehen, der zwischen der ■) lohlfasem 1 und dem Gehäuse 2 vorgesehen ist, und dk r.ir Außenseite des Gehäuses offen sind. Durch diese Rohre 5 und 5' kann man die schwimmenden Zellen einführen und abziehen. Die Seitenwände 6 und 6' verschließen beide Enden das Gehäuses 2 und halten gleichzeitig die Rohre 4 und 4' an Ort und Stelle. Die Wände 7 und T halten die Rohre 5 und 5' an Ort und Stelle und dichten die Rohre 5 und 5' gegen die Platten ab.

Die Fig.5 und 6 zeigen eine weitere Ausführungsform, bei der man ein Gehäuse bildet, indem man die Verbindungsglieder 2b und 2b' vorsieht die die Rohre 4 und 4' an beiden Enden einer Röhre 2a aufweisen, die eine Mehrzahl von Hohlfasem 1 faßt. Diese Hohlfasem 1 werden an jedem Ende durch Befestigungsschichten 3 und 3' auf oben beschriebene Weise an Ort und Stelle gehalten, und die Rohre 5 und 5', durch die man die schwimmenden Zellen einführt und abzieht sind an den Seitenwänden der Röhre 2a vorgesehen. Man kam ein weites Rohr als Röhre 2a verwenden. Der innere Durchmesser der Röhre ist nicht begrenzt, beträgt im allg ^meinen jedoch etwa 5 mm bis etwa 10 cm.

Wenn man bei den genannten Ausführungsformen das Gehäuse aus einem weichen Material herstellt, muß man die Rohre 5 und 5' nicht vorsehen, weil man die schwimmenden Zellen unter Verwendung einer Spritze einführen und abziehen kann.

Die beschriebenen Zellkultureinheiten kann man in einer Kultivierungsvorrichtung gemäß F i g. 7 vorsehen, wobei man beide offenen Enden der Hohlfasem in beispielsweise Zellkultureinheit 8 mittels einer Pumpe 10 mit einem Vorratsbehälter 11 für das Kulturmedium unter Verwendung eines Rohres 9 verbindet, das aus einer¹ Material mit ausgezeichneter Gasdurchlässigkeit besteht. Die gesamte Kultivierungsvorrichtung oder die Kultivierungsvorririitung mit Ausnahme der Pumpe 10 ordnet man in einem Kohlendioxidgas-Inkubator 12 an und führt die Kultivierung bei einer konstanten Temperatur durch. Eine für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbare Kultivierungsvorrichtung kann mindestens eine der beschriebenen Zeilkultureinheiten enthalten.

Die Hohlfasem können aus einer beliebigen semipermeablen Substanz hergestellt sein, die keine schädlichen Einflüsse auf die schwimmenden Zellen ausübt. Geeignete Beispiele für derartige Substanzen sind Polysulfon, Polyäthersulfon, Polyacrylnitril, Celluloseacetat, PoIycarbonat, Polymethylmethacrylat und Kupferoxidam-

moniak-Cellulose. Von diesen Substanzen sind Polysulfon und Polyäthersulfon zweckmäßig, weil sie das Wachstum und die Vermehrung schwimmender Zellen in hoher Dichte erlauben, und weil man sie dampfsterilisieren kann.

Um die Wachstumsgeschwindigkeit bzw Wachstumsrate der schwimmpnden Zellen zu steigern, ist es nötig, große Mengen an Nährstoffen und Sauerstoff rasch und kontinuierlich zuzuführen und Zellabfälle rasch und kontinuierlich zu entfernen. Um die rasche und kontinuierliche Zufuhr und Abfuhr zu erzielen, sollten die Purenduivhmcsser in den Wänden der Hohlfaser!] mindestens 2,0 ηm betragen. Der Grund dafür isi vermutlich, daß man Riesenmolekülc die für die Vermehrung der schwimmenden Zellen nötig sind, wie /. B. Proteine und Nucleinsäuren, von der Seite des Vorratsbehälter* des Kulturmediums zuführen muß. Wenn jedoch der Durchmesser der Poren in den Wänden der Hohlfasern 10⁽ nm überschreitet, gehen die schwimmenden Zellen durch die Poren durch, und man kann das erfindungsgemäße Verfahren nicht durchführen. Wenn der Durchmesser der Poren in den Wänden der Hohlfasern größer ist und die Durchdringungsgeschwindigkeii der Substanzen höher ist, ist die Vermehrungsgeschwindigkeit der schwimmenden Zellen jedoch nicht immer notwendigerweise größer, und der geeignete Porendurchmesser für eine maximale Vermehrung und Erhaltung variiert in Abhängigkeit '.om T)p der schwimmenden Zellen. Im allgemeinen beträgt der optimale Porendurchmesser 10' bis 5;<10'nm. Selbstverständlich können in diesem Fall Poren mit einem Durchmesser von weniger als IO:im und Poren mit einem Durchmesser von mehr als 5 χ 10^! nm auch vorhanden sein, sofern ihr Durchmesser 10" nm nicht übersteigt und 2,0 nm nicht unterschreitet.

Die Hohifasern, die man erfindungsgernäß verwendet, kann man leicht gemäß den US-PS 38 71 950. 38 88 771 und 38 % 061 und den GB-PS 15 06 735 und 15 65 113 Herstellen

Die Befestigungsschicht kann aus einem beliebigen Material hergestellt sein, das die schwimmenden Zellen n.icht schädigt und durch eine Sterilisierungsstufe nicht beeinträchtigt wird. Insbesondere bevorzugt man einen S iikonpoiymer-Klebstoff als die beiden Enden der Hohifasern an Ort und Stelle haltende Befestigungsschicht in der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Verschiedene Materialien kann man zur Bildung des Gehäuses verwenden, sofern sie keine nachteiligen Einflüsse auf die schwimmenden Zellen ausüben. Beispiele für derartige Materialien sind Glas, Polycarbonat. Polystyrol, Silikonpolymere, Polysulfon, Polyäthylen und Polyurethan. Um ausreichende Mengen an Sauerstoff zur Vermehrung der Zellen zuzuführen, nimmt man jedoch Materialien mit einer ausgezeichneten Gasdurchlässigkeit, wie z. B. einen dünnen Silikonpolymerfüm oder ein dünnes Silikonpolymerrohr, einen dünnen Silikonpolymerfilm, der mit einem Polyesternetz verstärkt ist einen dünnen Polybutadienfilm oder ein dünnes Polybutadienrohr, einen dünnen Silikon/Poiycarbonat-Mischpolymerfilm oder ein dünnes Silikon/ Polycarbonat-MischpolymeiTohr, einen porösen Polytetrafluoräthylenfilm oder einen porösen Polypropylenfilm. Die Dicke des Films oder Rohrs beträgt zweckmäßig 0,05 bis 3 mm. Vorzugsweise ist das erfindungsgernäß verwendete Gehäuse bzw. das Gehäuse in der erfindur.gsgernäßer. Vorrichtung aus Silikonpolymer, Polybutadien oder einem Silikon/Polycarbonat-Mischpolymer hergestellt.

Als Material der Rohre zum Einführen und Abziehen des Kulturmediums und der schwimmenden Zellen kann man die gleichen Materialien verwenden, wie man für das Gehäuse verwendet.

Das Rohr zur Verbindung der Zellkultureinheit mit dem Vorratsbehälter des Kulturmediums ist auch zweckmäßig aus einem Material mit ausgezeichneter Gasdurchlässigkeit hergestellt. Beispiele für derartige Materialien sind Silikonpolymer, Polybutadien und ein

;n Silikon/Polycarbonat-Mischpolymeres. Während man das Kulturmedium durch das Rohr leitet, führt man Sauerstoff dem Kulturmedium durch das Rohr zu.

Die Zellen, die man mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kultivieren kann, sind keinen Begrenzungen

, unterworfen, sofern sie schwimmende Zellen sind. Beispiele für derartige schwimmende Zellen sind genauer in Soshiki Baiyo, Asakura Shoten, Tokyo, Seilen 265 bis 275 (1970) (Jtinnosuke Nakai et al.) und Jingansiiibo no Baiyo, Asakura Shoten, Tokyo (1975) ι (Shoichi Oboshi et al.) beschrieben. Typische Beispiele für schwimmende Zellen sind l.ymphocytenzellen, Knochenmarktumorzellen, Lymphomzellen, Leukämiezellcn, Brustkrebszellen, L.eberkrebszellen und Leukozytenzellen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist

:-, besonders wirksam bei der Vermehrung von Knochentnarktumorzellen, Leukämiezellen und LymphocytenzeMeT und es ist ferner besonders wirksam bei der Vermehrung von schwimmenden Zellen, die man durch Zellfusion von Knochenmarktumorzellen und anderen

:i. Zellen erhalten hat, wie z. B. Milzzellen oder Lymphocytenzellen.

Den Arbeitsgang der Kultivierung gemäß der Erfindung kann man auf nachstehende Weise durchführen.

ι-, Zuerst sterilisiert man die Zellkultureinheit, die Rohre und den Vorratsbehälter für das Kulturmedium getrennt voneinander oder in dem Zustand, in dem sie miteir ander verbunden sind. Für diese Sterilisation kann man beispielsweise eine Dampfsterilisation, Gassterili-

Ji! sation. Bestrahlungssterilisation oder Formalinsterilisation anwenden. Besonders günstig ist die Dampfsterilisalion. weil der Arbeitsgang einfach isi und man keine Nachbehandlung nach der Sterilisation braucht. Da man Polysulfon und Polyäthersulfon dampfsterilisieren kann,

4-, kann man sie zweckmäßig als Material für die Hohlfasern verwenden. Im Fall beispielsweise der Gassterilisation oder Formalinsterilisation ist es nötig, das restliche Gas oder Formalin aur der Vorrichtung nach der Sterilisation vollständig auszuwaschen, indem

->o man wiederholt Kulturmedium durch die Kultivierungsvorrichtung durchleitet.

Nach der Sterilisation kann man die schwimmenden Zellen in den Raum zwischen den Hohlfasern und dem Gehäuse unter Verwendung einer Spritze einimpfen.

Als schwimmende Zellen verwendet man im allgemeinen Zellen, die in einem Kulturmedium suspendiert sind. Die Zelldichte der Suspension für die Einimpfung beträgt zweckmäßig 10⁵WsSx 10⁶ Zellen/ml, obwohl sie je nach Typ der Zellen variieren kann.

t-,0 Nach Beendigung des Einimpfens setzt man die gesamte Kultivierungsvorricntung oder die Vorrichtung mit Ausnahme der Pumpe in den Kohlendioxidgasinku bator, in den man ein Gasgemisch von Luft/CC>2 oder O2/CO2 zuführt Die CO₂-Konzentration beträgt am besten 5 bis 10 Gew.-°/o. Die Temperatur im Inkubator stellt man auf etwa 35 bis 38° C ein, und man hält das Innere des Inkubators ständig in einem ausreichend feuchten Zustand, so daß man verhindert, daß Wasser zu

sehr aus clem durchtränkenden Medium bzw. Perfusat entfernt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeigt eine Anzahl von Vorteilen gegenüber den Methoden des Standes der Technik.

Gemäß dem erfindungsgemäDen Verfahren ist die Vermehrungsgeschwindigkeit der schwimmenden Zellen groi* und man kann sie in höherer Dichte als bei der Suspensionsmethode wachsen lassen. Im allgemeinen sind die schwimmenden Zellen im Gegensatz zu den haftenden Zellen so schwach, daß es schwier.g ist, sie in hoher Zelldichte zu kultivieren. Wenn die Zelldichte zunimmt, wird vermutlich die gegenseitige Beeinflussung zwischen den Zellen stark, und erschwert es ihnen, ihr Leben aufrecht zu erhalten. Demgemäß nimmt man an, daß das Kultivierungsverfahren gemäß der Erfindung die kontinuierliche und rasche Zufuhr von Nährstoffen und Sauerstoff und die kontinuierliche und rasche Entfernung von Zcüabfällcn durch die üohifasern erlaubt, wodurch man Bedingungen erzeugt, die genügend vorteilhaft für die Zellen sind, so daß sie die nachteiligen Wirkungen der gegenseitigen Beeinflussung zwischen den Zellen überwinden.

Daher erlaubt die Kultivierungsmethode gemäß der Erfindung eine Minimalisierung der Vorrichtungsgröße bei der Kultivierung großer Mengen von schwimmenden Zellen. Ferner kann man aufgrund der Semipermeabilität der Hohlfasern ein Kulturmedium mit einem Gehalt an einem metabolischen Produkt, das von den schwimmenden Zellen erzeugt wurde, in relativ hoher Reinhf '. leicht von den Zellen abtrennen; beispielsweise kann man ein Kulturmedium, das Antikörper oder alpha-Fetoprotein enthält, leicht von Knochenmarktumorzellen bzw. l.eberkrebszellen abtrennen, wenn man die Zellkultureinheit der schwimmenden Tierzellen gemäß der Erfindung verwendet. Das metabolische Produkt kann man aus dem so erhaltenen Kulturmedium auf übliche Weise abtrennen. Beispielsweise kann man ein alpha-Fetoprotein reinigen, indem man das Kulturmedium, das man von Leberkrebszellen abgetrennt hat, gegen eine Ammoniumsulfatfraktionierung aussalzt bzw. mit Ammoniumsulfat fraktioniert aussalzt, mit einer Pufferlösung dialysiert und mit einer lonenaustauschchromatographie entwickelt. Insbesondere sind die Methoden zur Herstellung von spezifischen Amikörpern durch Zellfusion von Knochenmarktumorzellen und verschiedenen Zellen, die Antikörper erzeugen, in letzter Zeit fortgeschritten (siehe European Journal of Immunology, Bd. 6, Seiten 511—519 [1976]). Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Kultivierung von Hybridzellen geeignet, die spezifische Antikörper erzeugen, und die man durch eine derartige Zellfusion erhalten hat, und es ermöglicht die Herstellung von verschiedenen hochreinen Antikörpern in großen Mengen. Demgemäß ist der medizinische und tiermedizinische Wert der Erfindung bedeutend.

Ferner ist es bei den Methoden des Standes der Technik nötig, die Zellen von dem Kulturmedium abzutrennen, um periodisch das Kulturmedium auszutauschen. Dagegen ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine derartige Abtrennung nicht nötig, und man kann das Kulturmedium kontinuierlich zuführen. Das ist ein großer Vorteil zur Erzielung einer praktischen Massenkultivierung.

Ferner ist bei der Methode der Suspensionskultivierung die Möglichkeit einer Verunreinigung mit Mikroorganismen bemerkenswert groß, wie z. B. mit Bakterien oder Schimmel, und man muß beträchtliche Aufmerksamkeit bei der Kultivierung über lange Zeiträume aufwenden. Dagegen können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, sobald die schwimmenden Zellen aseptisch eingeimpft sind, keine Mikroorga-

-, nismen durch die Wände der Hohlfasern durchgehen und sich mit den schwimmenden Zellen vermischen. Daher kann man aseptische Bedingungen leicht über lange Zeiträume aufrecht erhalten. Sogar wenn das Kulturmedium durch Mikroorganismen verunreinigt

in werden sollte, werden die schwimmenden Zellen nicht durch die Mikroorganismen verunreinigt.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

jCv-nS /ΛΓίέιι Vui'i rüiysuiiuiiiiumiaseni inii einem

.ή inneren Durchmesser von 250 μηι, einem äußeren Durchmesser von 350 μπι und einem Porendurchmesser von 1,8 nm, 3 nm, 5 um, 10 nm, 20 nm bzw. 50 nm stellte man her, indem man ein aromatisches Polysulfon in einer gemischten Lösung von N-Methylpyrrolidon

r, (Lösungsmittel), Dimethylsulfoxid (nicht als Lösungsmittel), Wasser und Natriumnitrat löste und in Wasser (Koagulierungsflüssigkeit) durch eine Ringlochdüse extrudierte. Danach führte man je 100 jeder der Polysulfonhohlfasem in eine Silikonpolymerröhre mit

in einem inneren Durchmesser von 1 cm, einem äußeren Durchmesser von 1,3 cm und einer Länge von 8 cm ein und verschloß beide Enden der Silikonröhre zusammen mit dem Bündel der Hohlfasern unter Verwendung eines Silikonpolymer-Klebstoffs. Nachdem der Silikon-

j-, polymer-Klebstoff gehärtet war, schnitt man die Silikonröhren an ihren Enden ab und stellte dadurch Zellkultureinheiten mit einer Silikon-Befestigungsschicht und Hohlfasern mit offenen Enden her. Danach verband man Silikonpolymerrohre von 50 cm Länge (innerer Durchmesser 3 mm, äußerer Durchmesser 5 mm) mit beiden Enden der wie beschrieben hergestellten Zellkultureinheiten unter Verwendung von Verbindungsgliedern. Diese Silikonpolymerrohre verband man mittels einer Pumpe mit einem 200-ml-Vorratsbehälter des Kulturmediums, der aus Silikonpolymer hergestellt war, und stellte dadurch eine Zellkultivierungsvorrichtung her.

Nach der Dampfsterilisation der wie oben hergestellten Zellkultivierungsvorrichtung führte man 100 ml

so eines Kulturmediums (bestehend aus 80% von mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Kulturmedium und 20% Pferdeserum) in den Vorratsbehälter für das Kulturmedium ein und ließ es durch das Innere der Hohlfasern mit Hilfe der Pumpe zirkulieren. Die Gesamtmenge einer Lösung, die man durch Suspendieren von 1,08x10⁶ Knochenmarktumorzellen von Mäusen (MCP-Il) in 1 ml des gleichen Kulturmediums wie oben hergestellt hatte, impfte man mit einer Spritze in den Raum zwischen den Hohlfasern und dem Gehäuse.

Die Vorrichtung mit Ausnahme der Pumpe setzte man in eine isotherme Kammer, die man bei 38° C hielt, und führte etwa 200 bis 300 ml/min (pro 0,03 m² Kammerfläche) eines Gasgemisches, das aus 95% Luft und 5% CO2 bestand, in die isotherme Kammer ein. Man entnahm Proben über einen Zeitraum und bestimmte die Anzahl der vermehrten Zellen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt In diesem Fall tauschte man am 7. und am 15. Tag das Kulturmedium aus.

Tabelle 1

10

l'orendurchmesser der
llohlfiiscrn (0,1 nm)

Λη/ahl dor
eingeimpften /eilen IS. liiu

18 {Vergleich)	Ι,08 x	1 Ο	1,20 x	K)"	1,20 x	K)"
30	1,08 x	ΙΟ"	1,35 x	H)"	0,81 x	10^s
50	1,08 x	10"	3,00 X	K)'	1,23 x	10^s
10-'	1,08 x	10"	4.20X	KV	1,75 x	10^s
2 x 10-	1.08 X	in"	5.00 X	10'	1,90 X	10^s
5 x I Ο	1.08 X	10"	5.70 x	10"	2.10 x	10^s

Beispiel 2

Man verwendete drei Arten von Celluloseacetathohltasern mit einem inneren Durchmesser von 250 μιπ, einem äußeren Durchmesser von 350 μιη und Porendurchmessern von 10 nm, 2xlO²nm bzw. äxKPnm. Jeweils 30 der genannten Hohlfasern führte man in drei Silikonpolymerröhren ein, die jeweils einen inneren Durchmesser von 1 cm, einen äußeren Durchmesser von 1,3 cm und eine Länge von 8 cm aufwiesen, und man stellte eine Zeilkultivierungsvorrichtung auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 her.

Nur die Zellkultureinheit sterilisierte man mit Äthylenoxidgas 5 h lang, und die anderen Teile dampfsterilisierte man. Nach der Sterilisation ließ man 100 ml des gleichen Kulturmediums wie in Beispiel 1 durch die Vorrichtung zirkulieren und tauschte es gegen frisches Kulturmedium einmal am Tag aus. Diesen Arbeitsgang wiederholte man 3 Tage lang und entfernte das restliche Äthylenoxid.

Danach impfte man Knochenmarktumorzellen von Mäusen (MCP-11) auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 ein und ließ sie wachsen. Man entnahm Proben über einen Zeitraum und zählte die Anzahl der vermehrten Zellen mit einem Mikroskop. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Porendurch messer der Hohlfasern (li.l nm)	Anzahl der eingeimpften Zelien	10⁶	9. Tag	10⁷	18. Tag	10⁸
lo-	ι,οοχ	10"	3,5OX	10⁷	1,50X	10⁸
2 X 10³	ι,οοχ	10⁶	4.75 x	10⁷	2,0OX	10⁸
5 X 10⁴	ι,οοχ	3	3,0OX		1,4OX
	Tabelle

(Am 7. und am 15. Tag tauschte man das Kulturmedijm aus.)
Zum Vergleich ließ man die gleichen Zellen wie oben

.X) IM ueiii gleichen Kulturmedium "wie über! ΐΤΐΐί CiTiCr Suspensionsmethode wachsen. Als Suspensionsmethode wandte man die Anzapfmethode im 100-ml-Maßstab an. Die Ergebnisse sind in F i g. 8 gezeigt, wobei A die Kultivierungsergebnisse unter Verwendung der Kultureinheit aus den Hohlfasern mit einem Porendurchmesser von 2 χ 10² nm anzeigt und B die Krgebnisse unter Anwendung der Suspensionsmethode anzeigt. Der Pfeil j in Fig.8 zeigt an, daß man das. Kulturmedium ausgetauscht hatte.

Beispiel 3

Unter Verwendung von 30 Celluloseacetathohlfasern

j5 mit einem inneren Durchmesser von 250 μηι, einem äußeren Durchmesser von 350 μιτι und einem Porendurchmesser von 2 χ 10² nm stellte man eine Zellkultivierungsvorrichtung auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 her.

Gemäß der Methode, die im European Journal of Immunology, Bd. 6, Seiten 5t 1 bis 519 (1976) (Millstein et al.) beschrieben ist, erhielt man Erythrc "ytenantikörper von Schafen durch Zellfusion von Knochenmarktumorzellen von Mäusen (MPC-Il) und Milzzellen von Mäusen, die man mit Schafserythrocyten immunisiert hatte.

10* dieser Zellen suspendierte man in 1 ml des Kulturmediums, impfte es in die genannte Zellkultureinheit ein und ließ es darin unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 wachsen.

Zum Vergleich kultivierte man die Zellen mit der gleichen Suspensionsmethode wie in Beispiel 2.

Die Veränderung in der Zellanzahl im Laufe der Zeit untersuchte man, und die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt

Kultivierungsmethode

Anzahl der

eingeimpften

Zellen

9. Tag

18. Tag

Zellkultureinheit mit	Hohlfasern	10⁶	4,5OX	10'	2,2	X	10⁸
Suspensionsmethode	(10 ml)	10⁶/ml	2,10X	10⁷/ml	8,0	X	10⁷/ml
(Anzapfmethode)

Beispiel 4

Unter Verwendung verschiedener Hohlfasern stellte man Zellk'jliivierungsvorrichtungen auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 her. Man impfte Burkitt-Lymphomzel-

len von menschlichen Leukämiezellen und Knochermarktumorzellen von Mäusen in die Zeilkultivierungsvorrichtung auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 und ließ sie wachsen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Zclltyp	Material der I loh !fasern	innerer	l'oren-	Anzahl der Zellen	18. Tag	10"
		Durch messer/	durch- mcsscr	eingeimpft		\|/>.S I Kf
		,'iuBerer Durch	(0.1 mm)			10"
		messer				10"
		(VIII)			5,00 x	10"
Lyrnphomzellen von	Polycarbonat	200/250	25	2.00 x 10"	1 "ΙΛ v/ I ,ZU 'N	10⁸
menschlichen Leukämie	Ceiiuiuseucciai	200/25·"	.nl I U	z,im ^- 11*	7,00x
zellen	Polyacrylnitril	250/350	50	2.00 x 10"	2,50 X
Knochenmarktumorzellen	Poly met hy I methacry hu	250/350	M)	2.00 x 10"	7.00 x
	Polycarbonat	200/250	25	2.00X 10"	1.10 x
VUlI IVlclU^CII	Polyäthersulfon	250/350	40	2.00 x 10"

Beispiel 5

Periphere Lymphocyten, die man vom Menschen genommen hatte (vgl. Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Seiten 17 bis 18 [Leslie Hudson und Frank C. Hay]) suspendierte man in einem Kulturmedium RPMI 1640 (mit einem Gehalt an 20% Embryoserum von Kühen), so daß man eine Zelldichte von 10/ml bzw. 5 χ lOVml erzielte. Auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 impfte man sie in die gleiche Zellkultivierungsvorrichtung wie in Beispiel 2 ein. Nach einer Woche entnahm man die Zellen aus der Vorrichtung und maß die Aktivität der Lymphocyten mit dem Pigmentausschlußtest (s. o. Seiten 30 bis 32) unter Verwendung von Trypanblau und verglich sie mit der vor dem Einimpfen. Zur gleichen Zeit wiederholte man den Arbeitsgang unter Verwendung der Methode der stationären Schwimmkultur: die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle

Methode	Restaktivität	am 7. Tag (%)
	Zahl der	Zahl der
	eingeimpften	eingeimpften
	Zellen	Zellen
	= K)¹VmI	=■■ 5 x 10¹VmI)
Kultivierung unter	80	75
Verwendung von
Hohlfasern
Stationäre Schwimm	60	0
kultur

Restaktivität am 7. Tag =

Pigrr.entausschlußfahigkeit am 7. Tag 100.

Pigmentausschlußfähigkeii vor dem Einimpfen Der Ausdruck »Tierzellen« umfaßt in diesem Zusammenhang auch menschliche Zellen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Kultivierung von schwimmenden Tierzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium in eine Zellkultureinheit einführt, die ein Gehäuse und eine Mehrzahl von Hohlfasern im Gehäuse eingeschlossen umfaßt, wobei die Hohlfasern an ihren beiden Enden zur Außenseite des Gehäuses offen sind und einen Porendurchmesser von 2,0 nm bis 10⁴ nm aufweisen, und man das Kulturmedium durch das Innere der Hohlfasern durchleitet und die schwimmenden Tierzellen im Raum zwischen dem Gehäuse und den Hohlfasern kultiviert.

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Gehäuse und eine Mehrzahl von Hohlfasern, die in dem Gehäuse eingeschlossen sind, wobei die Hohlfasern an ihren beiden Enden zur Außenseite des Gehäuses offen sind und einen Porendurchmesser von 2.0 bis 10*nin aufweisen, und durch eine Anordnung, die das Durchleiten eines Kulturmediums durch das Innere der Hohlfasern und die Kultivierung von schwimmenden Tierzellen im Raum zwischen dem Gehäuse und den Hohlfasern erlaubt

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch einen Porendurchmesser der Hohlfasern im Bereich von 10 nm bis 5 χ 10³ nm.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse aus Silikonpolymer, Polybutadien oder einem Silikon/Polycarbonat-Mischpolymer hergestellt ist.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkultureinheit mit einem Vorratsbehälter für das Kulturmedium durch ein Rohr verbunden ist, das aus Silikonpolymer, Polybutadien oder einem Silikon/ Polycarbonat-Mischpolymer hergestellt ist

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Silikonpolymer-Klebstoff als die beiden Enden der Hohlfasern an Ort und Stelle haltende Befestigungsschicht