FR2476124A1 - Procede de culture de cellules, unite de culture de cellules animales flottantes, et dispositif pour culture de cellules - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UNE UNITE DE CULTURE DE CELLULES ANIMALES FLOTTANTES. SELON L'INVENTION, ELLE COMPREND UNE ENVELOPPE 2 ET UN CERTAIN NOMBRE DE FIBRES CREUSES 1 ENFERMEES DANS L'ENVELOPPE, LES FIBRES CREUSES ETANT OUVERTES A CHAQUE EXTREMITE DE L'ENVELOPPE ET AYANT UN DIAMETRE DES PORES DE L'ORDRE DE 20 A A 10 A, ET PERMETTANT LE PASSAGE D'UN MILIEU DE CULTURE A L'INTERIEUR DES FIBRES CREUSES ET LA CULTURE DE CELLULES ANIMALES FLOTTANTES DANS L'ESPACE ENTRE L'ENVELOPPE ET LES FIBRES CREUSES. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT AUX CELLULES LYMPHOCYTAIRES, AUX CELLULES DE TUMEUR MEDULLAIRE, AUX CELLULES DE LYMPHOME, AUX CELLULES LEUCEMIQUES, AUX CELLULES DE MASTOCARCINOME, AUX CELLULES DE CANCER DU FOIE, AUX CELLULES LEUCOCYTAIRES ET AUTRES.
Description
La présente invention se rapporte à un procédé pour la culture de cellules
animales flottantes dansuoeunig de
culture de celules composée de fibres creuses. Plus parti-
culièrement, elle concerne un procédé pour la culture de cellules animales flottantes dans une unité de culture de cellules composée d'une enveloppe et de fibres creuses à extrémités ouvertes enfermées dans l'enveloppe, qui consiste à introduire un milieu de culture dans les fibres creuses et à mettre en culture les cellules animales flottantes dans l'espace entre l'enveloppe et les fibres creuses. La présente invention se rapporte également à une unité de culture de cellules animales flottantes
utilisée pour le procédé.
Divers procédés pour la mise en culture de cellules ainimales sont connus. Les cellules animales comprennent celles oui croissent et prolifèrent en étant attachées à une surface de croissance (cellules attachées) et celles qui croissent et prolifèrent à l'état flottant (cellules flottantes). Des progrès importants ont été effectués
dans l'étude de la culture des cellules attachées.
De telles cellules attachées peuvent généralement croître et proliférer uniquement dans une seule couche sur la surface d'attache. Cependant, Richard A. Knazek, et autres, ont réussi à faire croître et proliférer tridimenzionnellement des cellules attachées en employant un procédé o l'on fait croître les cellules attachées sur la surface externe de fibres creuses semi-perméables ou capillaires et o un milieu de culture traverse les fibres creuses ou capillaires(voir Journal Of Medicine, Vol. 296, nO3, pages 154-159 (1977)). De plus, dans le brevet U.S. n0 3.997. 396 est révélé un procédé pour la croissance et la prolifération tidimensienMes de cellules attachées, o les cellules attachées croissent sur une surface d'une membrane de fibre creuse et de l'oxygène
est fourni à l'autre surface.
Les cellules flottantes sont généralement faibles en comparaison avec les cellules attachées (voir Shoichi Oboshi et autres, Jingansaibo no Baiyo, Asakura Shoten, Tokyo, page 44 (1975)). On a considéré par conséquent qu'il était difficile de faire croltre et proliférer
les cellules flottantes aux fortes densités souhaitées.
De telles considérations ont conduit à la conclusion que tous les procédés ci-dessus décrits utilisant des fibres
creuses étaient limités à la culture des cellules attachées.
Les procédés qui sont généralement utilisés dans la culture des cellules flottantes comprennent un procédé de culture flottante stationnaire et un procédé de culture en suspension utilisant l'agitation, une agitation en rotation ou analogue. Cependant, ces procédés présentent des inconvénients parce que (1) il faut un équipement de grande échelle car il est difficile de faire croître et proliférer les cellules à de fortes densités; (2) on rencontre des difficultés pour séparer les cellules des milieux nutriti W des produits métaboliques, des déchets et autres; (3) il est difficQe d'échanger continuellement le milieu de culture; et (4) il y a une forte possibilité de contamination par dtautresmicro-organimes. Il est par conséquent tout à fait souhaitable de supprimer ces inconvénients, en particulier en tenant compte du fait
que les cellules flottantes donnent des produits métabo-
liques importants du point de vue médical et vétérinaire, comme le diagnostic et le traitement médical de diverses maladies. Comme on l'a décrit ci-dessus, les progrès dans les procédés de croissance et de prolifération de cellules animales attachées sont remarquables, et il est maintenant
devenu possible de faire croître et proliférer tridimen-
tionnellement les cellules animales attachées, c'est-à-
dire comme un tissu, en utilisant des fibres creuses. Par
ailleurs, la culture des cellules flottantes a été effec-
tuée par les procédés traditionnels ci-dessus décrits.
Selon ces procédés, il est difficile de faire croître
et proliférer des cellules flottantes à de fortes densités.
Par conséquent, divers problèmes sont posés par l'intro-
duction de produits métaboliques utiles à partir des
cellules flottantes par leur culture en grande quantités.
La présente invention a pour objet un procédé de culture permettant la croissance et la prolifération de cellules animales flottantes à la 'ois à une forte densité
et continuellement.
La présente invention-a pour autre objet une unité de culture de cellules efficace pour la culture de cellules
animales flottantes.
On a maintsnt découvert que quand des cellules animales flottantes sont mises en culture dans une unité de culture de cellules comprenant une enveloppe et des fibres creuses à extrémités ouvertes enfermées dans l'enveloppe, dans l'espace entre l'enveloppe et les fibres creuses, en faisant s'écouler un milieu de culture à l'intérieur des fibres creuses, les cellules flottantes croissaieatet proliféraient à de fortes densités. On a
également trouvé que tandis qu'il est généralement souhai-
table que le diamètre des pores des fibres creuses soit O x compris entre environ 20 A et 10' A, quand les fibres creuses ont des diamètres des pores se trouvant entre 102A et 5 x 10 A, les cellules flottantes croissent et prolifèrent
à des densités encore supérieures.
On pense que cela a pour raison le fait que, dans les conditions décrites, l'échange des agents nutritifs dans le milieu de culture et des produits métaboliques et déchets dans les cellules se passe très doucement, produisant un environnement favorable à la croissance et
la prolifération des cellules.
On a également trouvé que le procédé selon l'inven-
tion pouvait généralement s'appliquer à des cellules animales flottantes, et que le procédé donnait de bons résultats à la prolifération des cellulesflottantes obtenues
par fusion des cellules avec d'autres cellules.
L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts,
caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparal-
tront plus clairement au cours de la description explicative
qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention, et dans lesquels: - la figure 1 est une vue en perspective d'une unité de culture de cellules utile dans la mise en pratique de la présente invention; - la figure 2 est une coupe transversale faite suivant la ligne A-A de la figure 1 - la figure 3 est une coupe transversale faite suivant la ligne B-B de la figure 1; - la figure 4 est une coupe transversale faite suivant la ligne C-C de la figure 1; - la figure 5 est une vue en perspective d'un autre mode de réalisation d'une unité de culture de cellules utile dans la mise en pratique de l'invention; - la figure 6 est une coupe transversale faite suivant la ligne D-D de la figure 5 - la figure 7 est un schéma illustrant un dispositif de culture de cellules utilisant des unités de culture de cellules selon l'invention; et - la figure & est un graphique montrant la différence de densité des cellules entre le procédé selon l'invention et un procédé selon l'art antérieur, le nombre de jours de mise en culture étant indiqué en abscisse et la densité des cellules/densité des cellules implantées sur l'axe des ordonnées. La présente invention concerne un procédé de culture de cellules animales flottantes utilisant une unité de culture de cellules comprenant une enveloppe et des fibres creuses à extrémités ouvertes, ayant des diamètres des pores de 20 A a 105 A, enfermées dans l'enveloppe, les deux extrémités d'une fibre creuse étant ouvertesà l'extérieur de l'enveloppe, en faisant s'écouler un milieu de culture à l'intérieur des fibres creuses, les cellules animales flottantes croissant dans l'espace entre
l'enveloppe et les fibres creuses.
D'abord, on décrira les unités de culture de cellules et le dispositif utiles dans la mise en pratique du procédé
selon l'invention.
La structure de l'unité de culture de cellules n'est pas particulièrement limitée à condition que les fibres creuses aient des diamètres des pores compris entre 20 A O et 10' A, soient enfermées dans l'enveloppe et que les deux extrémités des fibres creuses soient ouvertes vers
l'extérieur de l'enveloppe.
On expliquera les exemples appropriés en se référant
aux dessins Joints.
Les figures 1 à 4 montrent un mode de réalisation d'une unité de culture de cellules selon l'invention, o un certain nombre de fibres creuses 1 sont enfermées dans une enveloppe 2 obtenue en collant ensemble deux feuUles en forme de sac. Les fibres 1 sont maintenues en place de chaque côté par des couches de fixation 3 et 3' et les
intérieurs des fibres creuses 1 ouvrent vers l'extérieur.
Destubes4 et 45 communiquant avec l'intérieur des fibres creuses 1 débouchentvers l'extérieur de l'enveloppe. Un milieu de culture peut être introduit et retiré au moyen des tubes 4 et 4'. De plus, des tubes 5 et 5' sont prévus, quI communiquent avec l'espace défini entre les fibres creuses 1 et l'enveloppe 2, etilsdhouchent vers l'extérieur de l'enveloppe. Les cellules flottantes peuvent être introduites et retirées par ces tubes 5 et 5'. Des parois latérales 6 et 6' obturent les deux extrémités de l'enveloppe 2 et maintiennent simultanément en place les tubes 4 et 4'. Des parois 7 et 7' maintiennent en place
les tubes 5 et 5' et obturent la limite des tubes 5 et 5'.
Les figures 5 et 6 illustrent un autre mode de réalisation o une enveloppe est formée en prévoyant des organesde connexion 2-b et 2-b' ayant des tubes 4 et 4' aux deux extrémités d'un tube 2-a recevant un certain nombre de fibres creuses 1. Ces fibres creuses 1 sont maintenues en place à chaque extrémité par des couches de fixation 3 et 3' de la même façon qu'on l'a décrit ci-dessus, et des tubes 5 et 5' par o les cellules flottantes sont introduites et retirées, sont prévus sur les parois latérales du tube 2-a. Un tube large peut être utilisé par le tube 2-a. Le diamètre interne du tube n'est pas limité mais il est généralement compris entre environ mm et environ 1Ocm. Dans les modes de réalisation ci-dessus, si l'enveloppe est faite en un matériau mou, les tubes et 5' ne doivent pas être nécessairement prévus parce que les cellules flottantes peuvent être introduites
et retirées en utilisant une seringue.
Les unités de culture de cellules ci-dessus décrites peuvent être incorporées dans un dispositif tel que celui illustré sur la figure 7, o les extrémités ouvertes des fibres creuses par exemple, dans une unité de culture de cellules 8, sont reliées par une pompe 10 à un réservoir 11 d'un milieu de culture en utilisant un tube 9 fait en un matériau ayant une excellente perméabilité aux gaz. Tout le dispositif, ou le dispositif à l'exception de la pompe 10,est placé dans un incubateur 12 au gaz carbonique gazeux, et la culture est effectuée à une
température constante.
Ci-après, on expliquera en plus de détails les pièces à utiliser dans l'unité et le dispositif de
culture de cellules.
Les fibres creuses peuvent être faites en toute substance semi-perméable n'exerçant pas d'influence néfaste sur les cellules flottantes. On peut citer,
comme exemples appropriés de ces substances, la polysul-
fone, la polyéther sulfone, le polyacrylonitrile-,
l'acétate de cellulose, un polycarbonate, du polyméthyl-
méthacrylate, de la cuprammonium cellulose et analogues.
Parmi ces substances, on préfère la polysulfone et la
polyéther sulfone parce que, comme on le décrira ci-
après et comme cela est indiqué dans les exemples, elles permettent la croissance et la prolifération des cellules flottantes à de fortes densités et elles peuvent être
stérilisées à la vapeur.
Afin d'augmenter le taux de prolifération des
cellules flottantes, il est nécessaire de fournir continuel-
lement et rapidement de grandes quantités d'agents nutritifs d'oxygéne de retirer les déchets cellulaires. Pour obtenir l'alimentation rapide et continue et l'enlèvement, les diamètres des pores présents dans les parois des fibres creuses doivent être d'au moins 20 A. On pense que la raison en est que les molécules géantes nécessaires pour la prolifération descellules flottantes, comme les protéines et les acides nucléiques, doivent être amené du côté du réservoir du milieu de culture. Cependant, quand les diamètres des pores présents dans les parois des fibres creuses dépassent 105 A, les cellules flottantestraversent les pores et la présente invention ne peut être mise en oeuvre. Des recherches détaillées ont révélé que si les diamètres des pores présents dans les parois des fibres creuses sont plus importants et que le taux de perméation des substances est plus important, l'allure de prolifération des cellules flottantes n'est pas toujours nécessairement plus important, et quele diamètre des pores approprié pour rendre maximale la prolifération et pour son maintien varie selon le type des cellules flottantes. En général, le diamètre optimal des pores est compris entre 102 A et 5 x 104 A. Bien entendu, dans ce cas, des pores ayant des diamètres de moins de 102 A et des pores ayant des diamètres de plus de 5 x 104 A peuvent coexister avec eux, à condition que les diamètres soient inférieurs à A. Les fibres creuses utilisées dans la présente invention peuvent facilement être produites selon les brevets U.S. n0 3.871.950, n0 3.888.771 et n0 3.896. 061
et les brevets britanniques n0 1.506.785 et n0 1.565.113.
La couche de fixation peut être faite en tout matériau n'endommageant pas les cellules flottantes, et
ne se détériorant pas pendant une étape de stérilisation.
En particulier, on préfère un polymère de silicone adhésif.
Divers matériaux peuvent être utilisés pour former l'enveloppe, ettous n 'exerçant pas de mauvaises influences sur les cellules flottantes peuvent être utilisés. On peut citer, comme exemples de ces matériaux, le verre, un polycarbonate, du polystyrène, un polymère
de silicone, une polysulfone, du polyéthylène, du polyuré-
iane et autres. Pour amener des quantités suffisantes d'oxygène aux cellules en prolifération, cependant, on préfère des matériaux ayant une excellente perméabilité aux gaz comme une pellicule ou un tube mince en polymère de silicone, une pellicule mince en polymère de silicone renforcée d'une maille de polyester, une pellicule ou un tube mince de polybutadiène, une pellicule ou un tube mince d'un copolymère siliconepolycarbonate, une pellicule poreuse en téflon, une pellicule poreuse de polypropylène, et autres. L'épaisseur de la pellicule ou du tube est
de préférence de 0,05 à 3mm.
Comme matériau pour former les tubes pour l'intro-
duction et le retrait du milieu de culture et des cellules flottantes, on peut employer les mêmes que ceux utilisés
pour l'enveloppe.
Le tube à utiliser pour relier l'unité de culture de cellules au réservoir du milieu de culture est également avantageusement fait en un matériau ayant une excellente perméabilité aurgaz. On peut citer comme exemple de tels matériaux, un polymère de silicone, du polybutadiène, un copolymère silicone-polycarbonate, et autres.Tandis que le milieu de culture traverse le tube, de l'oxygène
est amené à travers le tube.
Les cellules pouvant être mises en culture par le procédé selon l'invention ne sont pas limitées à condition que ce soit des cellules flottantes. Des exemples de telles cellules flottantes sont décrits en détails dans Soshiki Baiyo, de Juanosuke Nakai et autres, Asakura Shoten, Tokyo, pages 265-275 (1970) et Jingansaibo no Baiyo, de Shoichi Oboshi et autres, Asakura Shoten, Tokyo (1975). On peut citer comme exemples typiques de cellules flottantes, les cellules lymphocytaires, les cellules de tumeur médullaire, les cellules de lymphome, les cellules leucémiques, les cellules de mastocarcinome, les cellules
de cancer du foie, les cellules leucocytaires, et autres.
Le procédé selon l'invention est très efficace pour la prolifération des cellules de tumeurs médulaires, des cellules leucémiques et des cellules lymphocytaires, et il est également très efficace pour la prolifération des cellules flottantes obtenues par fusion de cellules de tumeurs médullaires et d'autres cellules comme les cellules
de la rate, les cellules lymphocytaires et analogues.
L'opération de culture selon l'invention peut être
effectuée selon la séquence qui suit, sans limitation.
D'abord, l'unité de culture de cellules, les tubes et le réservoir du milieu de culture sont stérilisés,
séparément ou à l'état o ils sont tous reliés ensemble.
Pour cette stérilisation, on peut employer une stérilisation à la vapeur, une stérilisation au gaz, une stérilisation par rayonnement, une stérilisation dans la formaline et autres. En particulier, on préfère la stérilisation à la
vapeur parce que l'opération est simple et quI un traite-
ment ultérieur n'est pas nécessaire après la stérilisation.
Comme la polysulfone et la polyétherfrulfone peuvent être stérilisées à la vapeur, on peut avantageusement les utiliser comme matériaux pour les fibres creuses. Dans le cas d'une stérilisation au gaz, d'une stérilisation à la formaline et autres, il est nécessaire de laver totalement le gaz résiduel, la formaline et autres>du dispositif après stérilisation en faisant s'écouler de façon répétée le
milieu de culture dans le dispositif de culture.
Après stérilisation, les cellules flottantes peuvent être implantées dans l'espace entre les fibres creuses et l'enveloppe en utilisant une seringue. Comme cellules flottantes on utilise habituellement celles en suspension dans un milieu de culture. La densité des cellules dans la suspension pour l'implantation est de préférence de à 5 x 106 cellules/ml, bien qu'elle puisse varier selon
le type de la cellule.
Quand l'implantation est terminée, tout le dispositif de culture, ou ce dispositif à l'exception de la pompe, est placé dans l'incubateur au gaz carbonique o sont amenés des gaz mélangés d'air-C02 ou 02-C02. La concentra- tion en CO2 est de préférence de 5 à 10% en poids. La température dans l'incubateur est ajustée à environ 35 à 380C et l'intérieur de l'incubateur est toujours maintenu à un état suffisamment humide pour empêcher l'eau d'être
excessivement retirée du perfusat.
Le procédé selon l'invention présente un certain nombre d'avantages par rapport au procédé selon l'art antérieur. Selon le procédé de l;invention, l'allure de prolifération des cellules flottantes est élevée, et on peut les faire croUtre à de plus fortes densités que dans le procédé en suspension. En général, les cellules
flottantes sont si faibles, par rapport aux cellules -
attachées, qu'il est difficile de les cultiver à une forte densité. On pense qu'avec l'augmentation de la densité des cellules, l'action mutuelle entre elles devient trop
importante, ce qui rend plus difficile leur maintien en vie.
Ainsi, on-suppose que le procédé de culture selon l'invention permet l'alimentation continue et rapide d'agents nutritifs et d'oxygène, et l'enlèvement rapide et continu des déchets cellulaires par les fibres creuses, par suite de quoi peuvent être créées des circonstances suffisamment appropriées aux cellules pour surmonter les effets néfastes de
l'action mutuelle entre elles.
Par conséquent, le procédé de culture selon l'invention permet la diminution de la dimension du dispositif pour la culture de grandes quantités de cellules flottantes. Par ailleurs, du fait de la semiperméabilité des fibres creuses, le milieu de culture contenant un produit métabolique, obtenu par les cellules flottantes à une pureté x- lativement élevée, peut facilement être séparé des cellules, par exemple, un milieu de culture il contenant des anticorps ou de lteFétoprot4ine peut facilement être séparé des cellules de tumeur médullaire ou des cellules du cancer du foie respectivement, en utilisant l'unité de culture de cellules animales flottantes selon l'invention. Le produit métabolique peut être séparé du milieu de culture ainsi obtenu d'une façon traditionnelle. Par exemple, 1' C-Pétoprotéine peut être purifiéeen dessalant le milieu de culture séparé des cellules du cancer du foie par fractionnement avec du sulfate d'ammonium, en dialysant avec une solution tampon
et en développant par une chromatographie d'échange d'ions.
En particulier, la technique de production d'anticorps spécifiquespar fusion des cellules de tumeurs médullaires et de diverses cellules produisant des anticorps a récemment progressé (voir Euroiean Journal of Immunology Volume 6, pages 511-519 (1976)). Le procédé selon l'invention est avantageux pour la culture de cellules hybrides produisant des anticorps spécifiques que l'on obtient par une telle fusion des cellules, et il permet la production de divers anticorps très purs à de grandes quantités. Ainsi, la valeur médicaleet vétérinaire de
la présente invention est importante.
Par ailleurs, dans les procédés selon l'art antérieur,Jl est nécessaire de séparer les cellules du milieu de culture afin d'échanger périodiquement ce milieu de culture. Par ailleurs, dans le procédé selon l'invention, une telle séparation n'est pas nécessaire
et le milieu de culture peut être amené continuellement.
C'est un grand avantage pour obtenir une culture pratique
en masse.
De plus, dans le procédé de culture en suspension, la possibilité d'une contamination par des micro-organismes
tels que des bactéries et de la moisissure est considéra-
blement importante, et il faut porter une attention
considérable à la culture sur de longues périodes de temps.
Par ailleurs, dans le procédé selon l'invention, quand les cellules flottantes sont implantées aseptiquement, les micro-organismes ne peuvent traverser les parois des fibres creuses et ne peuvent se mélanger avec des cellules flottantes. Par conséquent, des conditions aseptiques peuvent facilement être maintenues sur de longues périodes de temps. De même, si le milieu de culture est contaminé par des micro-organismes, les cellules flottantes ne peuvent
être contaminées par les micro-organismes.
Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer
en plus de détails la présente invention.
Exemple 1.
Six sortes de fibres creuses de polysulfone d'un diamètre interne de 20 P, d'un diamètre externe de 350 p et ayant des diamètres des pores de 18 A, 30 A, 50 A, A, 2 x 10î A et 5 x 10 A, respectivement, ont été produites en dissolvant une pulysulfone aromatique dans une solution mélangée de Nméthylpyrrolidone (solvant) de diméthyl sulfoxyde (non solvant), d'eau et de nitrate de sodium et en extrudant dans l'eau (liquide coagulant) à travers une tubulure de forme creuse. Alors, on inséra 100 de chacune des fibres creuses de polysulfone dans un tube en polymère de silicone ayant un diamètre interne de 1cm, un diamètre externe de 1,3cm et une longueur de 8cm, et les deux extrémités du tube en silicone furent obturées ainsi que le faisceau des fibres creuses en utilisant un adhésif en polymère de silicone. Après durcissement de l'adhésif en polymère de silicone, les tubes en silicone furent découpés à leurs extrémités, pour produire ainsi des unités de culture de cellules avec une couche de fixation en silicone et des fibres creuses à extrémités ouvertes. Alors, des tubes en polymère de silicone de cm de long (diamètre interne 3mm, diamètre externe 5mm) furent reliés aux deux extrémités des unités de culture des cellules cidessus produites en utilisant des organes de connexion. Ces tubes en polymère de silicone étaient reliés par une pompe à un réservoir de milieu de culture de 200 ml, fait en polymère de silicone pour produire ainsi
un dispositif de culture de cellules.
Après stérilisation àla vapeur du dispositif de culture de cellules cidessus produit, on introduisit ml d'un milieu de culture (consistant en 80% d'un milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco et 20% de sérum de cheval), dans le réservoir du milieu de culture et on fit circuler dans l'intérieur des fibres creuses par la pompe. La quantité totale d'une solution préparée en mettant en suspension 1,08 x 106 cellules de tumeurs médullaires de souris (MPC-11) dans I ml du même milieu de culture que celui utilisé ci-dessus>fut implantée en utilisant une seringue, dans l'espace entre les fibres
creuses et l'enveloppe.
Le dispositif, à l'exclusion de la pompe, fut placé dans une cimbre isothermique maintenue à 38 C, et on amena,dans la chambre isothermique, environ 200 à 300 ml/mn (pour 0,03 m2 de la chambre) d'un gaz mélangé consistant en 95% d'air et 5% de C02. Des échantillons furent pris surunecednIepoc de temps et le nombre de cellules ayant proliféré fut déterminé. Les résultats sont indiqués au tableau 1. Dans ce cas, au septième et
quinzième Joue, le milieu de culture fut changé.
Tableau 1.
i -,,,-, ,.
Diamètre Nombre de cellules 9ème jour 18ème Jour des pores implantées des fibres creuses() 18 (com- 1,08 x106 1,20 x 106 1,20 x 106 parai-son) 7 8 pr30 i 1,35 x 107 0,81 x 10 3,00 x 107 1,23 x 108 102 " 4,20 x 107 1,75 x 108 2 x 102 5,00 x 107 1,90 x 108 x 102 5,70 x 107 2,10 x 108
Exemple 2.
Dans cet exemple, on utilisa trois sortes de fibres creuses d'acétate de cellulose ayant un diamètre interne de 250 À, un diamètre externe de 350 p et un diamètre 2 x O 4 0 des pores de 10 A, 2 x 103 A, 5 x 10 A, respectivement. On inséra 30 de chacune des fibres creuses ci-dessus dans trois tubes en polymère de silicone, respectivement, chacun d'un diamètre interne de 1 cm, d'un diamètre externe de1,3 cm et d'une longueur de 8 cm, et on produisit un dispositif de culture de cellules de la même façon qu'à
l'exemple 1.
Seule l'unité de culture de cellules fut stérilisée au moyen d'oxyde d'éthylène gazeux pendant 5 heures, les autres pièces étant stérilisées à la vapeur. Après stérilisation, on mit en circulation 100 ml du même milieu de culture que celui utilisé à l'exemple 1, dans le dispositif, et on échangea pour un lot frais de milieu de culture une fois par jour. On répéta ce processus pendant trois jours pour retirer l'oxyde d'éthylène
résiduel.
Ensuite, des cellules de tumeurs médullaires de souris (MPC-11) furent inoculées et on les fit croître de la même façon qu'à l'exemple 1. Des échantillons furent pris sur une certaine période de temps, et on comptaau
moyen d'un microscope le nombre de cellules ayant proliféré.
Les résultats sont indiqués au tableau 2.
Tableau 2
Diamètre des Nombre de 9ème Jour 18 ème Jour pores des cellules fibres creuses implantées (X) 102 1,00 x 106 3,50 x107 1,50x108 2 x 103 " 4,75 x107 2,00x108 x 104 " 3,00 x107 1,40x108 [Aux7ème et 15ème joue,, le milieu de culture fut changé]. Pour une comparaison, on fit croltre les mêmes cellules que celles utilisées ci-dessus, en employant le même milieu de culture que ci-dessus, par un procédé en suspension. Comme procédé en suspension, on utilisa le procédé de ponction en bassin de 100ml. Les résultats sont indiqués sur la figure 8, o A indique des résultats de culture utilisant l'unité composée des fibres creuses ayant un diamètredes pores de 2 x 103 A, et B indique les résultats en utilisant le procédé en suspension. La flèche t sur la figure 8, indique l'échange du milieu de culture.
Exemple 3.
En utilisant 30 fibres creuses en acétate de cellulose d'un diamètre interne de 250 Y, d'un diamètre externe de 350 p et d'un diamètre des pores de 2 x 103 A, on produisit un dispositif de culture de cellules de
la même façon qu'à l'exemple 1.
Selon le procédé révélé par Millstein et autres (European Journal of Immunology, volume 6, pages 511-519 (1976)), on obtint des anticorps d'érythrocytespar la fusion des cellules de tumeurs médullaires de souris (MPC-11) et des cellules de rate de souris immunisées
par l'érythrocyte du mouton.
On mit 106 de ces cellules en suspension dans 1 ml du milieu de culture, on implanta dans l'unité de culture de cellules ci-dessus et on les fit crofre dans
les mêmes conditions qu'à l'exemple 1.
Pour la comparaison, les cellules furent mises en
culture par le même procédé en suspension qu'à l'exemple 2.
Les changementsdu nombre des cellules sur une certaine période de temps furent examinés, et les résultats
obtenus sont indiqués au tableau 3.
Tableau 3.
Procédé de culture Nombre de cellules implantées 9ème jour 18ème jour Unité de culture de cellules composée de fibres creuses 4,50 x 107 2,2 x 108
procédé en suspen-
sion (10ml) (procédé de ponction 106/mi en bassin) 2,10 x 107ml 8,0 x 107ml
Exemple -4.
En utilisant diverses fibres creuses, on produisit un dispositif de culture de cellulesde la même façon qu'à l'exemple 1. Des cellules de lymphome de Burkitt de cellules leucémiques humaines et de cellules de tumeur médullaire de souris furent implantées dans le dispositif de culture de cellules et on les fit crottre de la même façon qu'à l'exemple 1. Les résultats sont indiqués au
tableau 4.
Tableau 4.
Type de cellules Matériau des Diamètre interne/ fibres creuses diamètre externe _ _u Cellules de
lymphome de.
cellules leucémiques d'être humain Cellules de tumeur médullaire de souris Polycarbonate Acétate de Cellulose
Polyacrylo-
nitrile
Polvméth 1-
m tacrylate Polycarbonate Polyéther su Ione /250 /250
250/350
250/350
/250
250/350
ft n w wf # 1,20 x 108 7,00 x 107 2,50 x 7,00 x 1,10 x 1%> 4-
18 2476124
Exemple 5.
Des lymphocytes périphériques pris d'êtres humains (voir Leslie Hudson et Frank C. Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications pages 17-18) furent mis en suspension dans un milieu de culture RPMI 1640 (contenant % de sérum d'embryon de vache) afin que la densité des cellules soit de 10/ml et de 5 x 106ml. De la même façon qu'à l'exemple 1, on les implanta dans le même dispositif de culture de cellules qu'à l'exemple 2. Au bout d'une O10 semaine, les cellules furent sorties du dispositif et on mesura l'activité des lymphocytes par l'essai d'exclusion des pigments (idem pages 30-32) en utilisant du bleu Trypan, et on compara avec celle avant l'implantation. En même temps on répéta le processus par le procédé de culture flottante stationnaire, et les résultats sont indiqués
au tableau 5.
Tableau 5
Activité résiduelle au 7ème jour (%) Nombre de cellules Nombre de cellules implantées (10b/ml) implantées Méthode (5 x 100/ml) Culture utilisant des fibres creuses 80 75 Culture flottante stationnaire 60 0 capacité d'exclusiondu Activité résiduelle au 7ème Jour =pigment au 7ème jour x100O capacité d'exclusiondu
pigment avant implanta-
tion - Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents
19 2476124
techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinai-
sons, si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en òuvre dans le cadre de la protection comme revendiquée.
R E V E N D ICAT I 0 N S
1. Procédé de culture de cellules animales flottantes caractérisé en ce qu'il consiste à introduire un milieu
de culture dans une unité de culture de cellules compre-
nant une enveloppe et un certain nombre de fibres creuses enfermées dans ladite enveloppe, lesdites fibres creuses étant ouvertes à chaque extrémité vers l'extérieur de ladite enveloppe et ayant un diamètre des pores compris o c; O entre 20 A et 105 A, ledit milieu de culture passant par l'intérieur desdites fibres creuses et lesdites cellules animales flottantes étant mises en culture dans l'espace
entre ladite enveloppe et lesdites fibres creuses.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le diamètre des pores.des fibres creuses est compris entre 102 A et 5 x 104 A.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications
1 ou 2, caractérisé en ce que les fibres creuses précitées
sont faites en polysulfone ou polyétherisLfone.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications
ou 2 caractérisé en ce que les cellules animales flottantes précitées sont des cellules de tumeur médullaire, des cellules leucémiques, des cellules lymphocytaires ou des cellules de tumeur médullaire obtenues par fusion des cellules avec des cellules
de la rate ou des cellules lymphocitaires.
5. Procédé selon la revendication 1, caraotérisé en ce que les cellules animales flottantes précitées sont des cellules de tumeur médullaire obtenues par fusion des cellules avec des cellules de la rate ou des cellules lymphocytaires.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications
1 ou 2, caractérisé en ce que l'enveloppe précitée est faite en un polymère de silicone, un polybutadiène ou
un copolymère silicone-polycarbonate.
7. Procédé selon l'une queconque des revendications
1 ou 2, caractérisé en ce que l'unité de culture de cellules précitée est reliée à un réservoir de milieu de culture par un tube fait en un polymère de silicone,
du polybutadiène ou un copolymère silicone-polycarbonate.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications
1 ou 2, caractérisé en ce qu'on utilise un adhésif de polymère de silicone comme couche de fixation maintenant
en place les deux extrémités de la fibre creuse précitée.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications
1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules animales flottantes précitées sont implantées dans l'unité de culture de cellules précitée /à une concentration initiale
de 105 à 5 x 106 cellules/ml.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications
1 ou 2, caractérisé en ce que l'unité de culture de cellules précitée est placée dan un incubateur à gaz
carbonique o la concentration en C02 est de 5 à 10%.
11. Unité de culture de cellules animales flottantes caractérisée en ce qu'elle comprend un enveloppe (2) et un certain nombre de fibres creuses (1) enfermées dans ladite enveloppe, ladite fibre creuse étant ouverte à chaque extrémité vers l'extérieur de ladite enveloppe et ayant un diamètre des pores compris entre envrion A et 10' A, permettant le passage d'un milieu de culture à travers l'intérieur desdites fibres creuses et la culture de cellules animales flottantes dans l'espace
entre ladite enveloppe et lesdites fibres creuses.
12. Unité selon la revendication 11, caractérisée en ce que le diamètre des pores des fibres creuses précits est compris entre 102 A et 5 x 104 A.
13. Unité selon l'une quelconque des revendications
11 ou 12, caractérisée en ce que l'enveloppe précitée est faite en un polymère de silicone, du polybutadiène
ou un copolymère silicone-polycarbonate.
14. Unité selon l'une quelconque des revendications
11 ou 12, caractérisée en ce que ladite unité (8) est reliée à un réservoir de milieu de culture (11) par un
22 2476124
tube (9) fait en un polymère de silicone, du polybutadiène
ou un copolymère silicone-polycarbonate.
15. Unité selon l'une quelconque des revendications
11 ou 12, caractérisée en ce qu'un adhésif d'un polymère de silicone est utilisé comme couche de fixation (3, 3') maintenant en place les deux extrémités de la fibre creuse précitée. 16. Dispositif de culture de cellules caractérisé en ce qu'il comprend au moins une unité de culture de cellules animales flottantes selon l'une quelconque des
revendicationsll à 15.
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