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DE4204694C3 - Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chromatographie - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chromatographie

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Publication number
DE4204694C3
DE4204694C3 DE4204694A DE4204694A DE4204694C3 DE 4204694 C3 DE4204694 C3 DE 4204694C3 DE 4204694 A DE4204694 A DE 4204694A DE 4204694 A DE4204694 A DE 4204694A DE 4204694 C3 DE4204694 C3 DE 4204694C3
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DE
Germany
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alkyl
radicals
sulfonic acid
atoms
mono
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
DE4204694A
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English (en)
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DE4204694A1 (de
DE4204694C2 (de
Inventor
Monika Stadler
Horst Dr Schwinn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Octapharma AG
Original Assignee
Octapharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6451895&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE4204694(C3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Octapharma AG filed Critical Octapharma AG
Priority to DE4204694A priority Critical patent/DE4204694C3/de
Priority to CA002129045A priority patent/CA2129045C/en
Priority to RU9394035758A priority patent/RU2096414C1/ru
Priority to KR1019940702645A priority patent/KR100240310B1/ko
Priority to DE69330458T priority patent/DE69330458T3/de
Priority to DK93902233T priority patent/DK0625161T4/da
Priority to EP93902233A priority patent/EP0625161B9/de
Priority to AT93902233T priority patent/ATE203249T1/de
Priority to JP51290293A priority patent/JP3556947B2/ja
Priority to US08/284,403 priority patent/US5714590A/en
Priority to ES93902233T priority patent/ES2157920T5/es
Priority to AU33517/93A priority patent/AU670776B2/en
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Priority to PT93902233T priority patent/PT625161E/pt
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Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das in den Ansprüchen 1 bis 4 angegebene Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chromatographie aus Blut­ plasma oder Kryopräzipitat.
In der EP-A-02 38 701 wird ein Verfahren zur Herstellung eines hochreinen, virusfreien Antihämophiliefaktors be­ schrieben, wobei das Kryopräzipitat mittels Ethanol­ fällung von Fibrinogen, Globulinen, Albuminen und anderen störenden Bestandteilen befreit wird. Die Anreicherung aus dem Kryopräzipitat ist notwendig, da Faktor VIII nur in äußerst geringen Mengen in dem Material enthalten ist. Dieser Anreicherungsschritt beeinträchtigt jedoch den Gehalt an AHF im Endprodukt. Die bisher bekannten Verfah­ ren zur Herstellung von Faktor VIII ergeben nur geringe Mengen an wirksamer Substanz. Bei der Applikation des auf herkömmlichem Wege hergestellten Faktors VIII belastet man den Patienten daher mit großen Mengen antigener Sub­ stanzen. Diese Verfahrensweise ist nicht unbedenklich. Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, den Faktor VIII durch Trennungsoperationen weiter anzureichern. So wurde versucht, mittels Affinitätschromatographie mit gegen Faktor VIII gerichteten tierischen Antikörpern Produkte mit höherer spezifischer Aktivität zu erhalten. Diese Technik ist jedoch sehr aufwendig und kostenintensiv. Zum anderen ist sie auch deshalb nicht unbedenklich, da stets eine gewisse Menge tierischen Eiweißes bei jeder chroma­ tographischen Trennung aus der Säule gewaschen wird.
Die EP-8 81 08 458.6 beschreibt ein Verfahren zur Herstel­ lung eines hochreinen, virusfreien Antihämophiliefaktors, in dem ausgehend von Kryopräzipitat der Faktor VIII durch Behandlung mit Aluminiumhydroxid und biokompatiblen or­ ganischen Lösungsmitteln/Detergenzien in bevorzugter Weise eine Gelpermeationschromatographie an Ionenaus­ tauschermaterialien durchgeführt wird. Als besonders ge­ eignet wird ein Chromatographiematerial auf Basis von Copolymerisaten aus Oligoethylenglycolen, Glycidylmeth­ acrylaten und Pentaerythroldimethacrylaten genannt.
Zwar wird durch das in der EP-8 81 08 458.6 beschriebene Verfahren eine Ausbeutesteigerung an Faktor VIII ver­ zeichnet, jedoch ist die Ausbeute an biologisch aktivem Faktor VIII nach wie vor nicht optimal.
Die WO 90/14 886 beschreibt Materialien zur Chromatographie mit Polyalkylaminketten, die an der Oberfläche eines chromatographischen Trägers verankert sind. Dies bedeutet, daß unbedingt die den endständigen funktionellen Rest tragende Gruppe über Stick­ stoffatome mit dazwischenliegenden Alkylengruppen an diese Oberfläche gebunden sind.
Diese Polyamingruppierungen sind über Kupplungsreagenzien mit der das Chromatographiematerial bildenden Matrix verbunden. Dazu werden Substanzen wie Cyanogenbromid, Epichlorhydrin, Carbonyl­ diimidazol oder 1,4-Butandioldiglycidylether verwendet. Diese "linking group" wird dadurch charakterisiert, daß sie bis zu 10 Kohlenstoffatome enthalten soll, die durch Sauerstoffatome unter­ brochen sein kann und weitere Substituenten wie Hydroxyl oder Oxo-Gruppen enthalten kann.
Die EPO 3 43 275 A1 beschreibt die Reinigung von Faktor VIII mit Hilfe der Anionenaustauscher-Chromatographie, wie beispielsweise TSK DEAE-Fractogel.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist also die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem sich die Isolierung von biologisch aktivem Faktor VIII aus den Quellen Kryopräzipitat oder Blutplasma verbessern läßt und eine wirtschaftlichere Arbeitsweise gewährlei­ stet.
Überraschenderweise wird dieses Problem gelöst durch ein Verfahren gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1. Die Unter­ ansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des er­ findungsgemäßen Verfahrens. Die im erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Trennmaterialien bestehen aus Trägerteilchen, wie sie in der EP-A-03 37 144 offenbart werden. Dies sind Trägerteilchen mit Hydroxyl­ gruppen, auf die über die alpha-C-Atome der Hydroxylgrup­ pen ein polymeres Material aufgepfropft ist. Als Träger­ teilchen kommen alle allgemein bekannten porösen und unporösen Chromatographieträger, die primäre oder sekun­ däre, aliphatische Hydroxylfunktionen an der Oberfläche aufweisen, in Frage. Dabei sind bevorzugt hydrophile Polymere auf Acrylat- und Methacrylatbasis, Polymere auf Polyvinylalkohol-Basis, diolsubstituierte Kieselgele, Polysaccharide auf Agarose-Basis, Cellulose, Cellulose­ derivate oder Polymere auf Dextran-Basis. Es können aber selbstverständlich auch andere Polymere oder Copolymere auf der Grundlage von Monomeren wie Vinylverbindungen, Acrylamid, (Meth)Acrylsäureestern oder (Meth)-Acrylnitril in hydroxylierter Form eingesetzt werden.
Das polymere Material, das über die α-C-Atome der Hy­ droxylgruppen an die Trägerteilchen gebunden ist, basiert auf den Monomeren der Formeln II und/oder III.
CR⁷R⁸ = CR¹-Y II
Diese Monomeren stellen (Meth)Acrylsäure (Y = -COOH), (Meth)-Acrylsäurederivate
Allylamine (Y=-CH₂NH₂, -CH₂NR²R³), (Meth)-Acrylnitrile (Y = -CN), Acroleine (Y = -CHO), Vinylcarboxylate (Y = -OCOCHR⁵R⁶) oder Vinylencarbonate der Formel III dar.
Alle diese Monomere stellen in wäßriger Lösung radika­ lisch polymerisierbare Substanzen mit reversibel binden­ den Gruppen dar, die neutral, sauer oder basisch sein können.
Werden als Monomere Vinylencarbonate der Formel III oder Vinylcarboxylate CR⁷R⁸ = CR¹-OCOCHR⁵R⁶ der Formel II ein­ gesetzt, so wird vorzugsweise das erhaltene Produkt an­ schließend in ein Trennmaterial mit Hydroxylgruppen über­ führt. Diese Überführung in eine Hydroxyl-Phase wird durch eine an sich bekannte milde alkalische oder saure Verseifung erreicht. Beispielsweise kann die Reaktion mit methanolischer K2CO3-Lösung bei Raumtemperatur, beschrie­ ben z. B. von Y. Tezuka et al., in Macromol. Chem. 186, 685-694 (1985), durchgeführt werden.
In den Formeln I, II und II bedeutet R¹ vorzugsweise H, d. h. die Acrylsäurederivate sind bevorzugt.
Y in Formel II bedeutet vorzugsweise
-OCOCHR⁵R⁶ oder -CH₂NH₂, in zweiter Linie bevorzugt -CN oder -CHO. Dementsprechend bedeutet Y in Formel I in erster Linie bevorzugt
-OH (da vorzugsweise die -OCOCHR⁵R⁶-Gruppe in eine Hy­ droxylphase umgewandelt wird) oder -CH2NH2, in zweiter Linie bevorzugt -CN oder -CHO.
R5 und R6 bedeuten unabhängig voneinander H oder eine Alkylgruppe mit bis zu 5 C-Atomen. Vorzugsweise ist min­ destens einer der Reste R5 und R6 H. Folgende Reste sind besonders bevorzugt: Acetyloxy-, Propionyloxy-, Butyryl­ oxy-, Valeryloxy- und Hexanoyloxy-Rest.
X bedeutet sowohl in Formel I als auch in Formel II -OR4, -OH oder -NR2R3, vorzugsweise -NR2R3.
Bevorzugt sind dabei Verbindungen, in denen X -NR2R3 be­ deutet und einer der Reste R2 und R3 H ist.
Die Reste R2 und/oder R3 bedeuten bevorzugt eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenylgruppe, wobei die Alkyl- und/oder die Phenylgruppe ein- oder mehrfach, vorzugsweise ein- oder zweifach, insbesondere bevorzugt einfach, substituiert sein kann durch einen Alkoxy-, Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammo­ nium-, Carboxyl-, Sulfonsäure-, Acetoxy- oder Acetamino- Rest.
Die Reste R2 und/oder R3 bedeuten bevorzugt Alkyl, Alk­ oxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkyl­ aminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Carboxyalkyl oder Sulfonsäurealkyl mit bis zu 10 C-Atomen, bevorzugt bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 C-Atomen in der Alkylgruppe, die linear oder verzweigt sein kann. R2 und/oder R3 bedeuten demnach bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Methoxymethyl, Ethoxy­ methyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-Oxapentyl, 2-, 3-, 4- oder 5-Oxahexyl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Oxaheptyl, Iso­ propyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Isopentyl, 2- Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-methylbutyl, 3-Oxa- 4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl, 2-Methyl-3-oxahexyl, ferner auch Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl.
Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eine Cyano, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vor­ liegen. Demnach bedeuten R2 und/oder R3 bevorzugt Cyano­ methyl, Cyanoethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl, Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxylmethyl, Carboxylethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Car­ boxylbutyl, Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2- methylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl, Sulfonsäureethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl, Sulfonsäurepentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2- methylpropyl, Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3- methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3- methylhexyl oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl.
Ferner sind die Alkylgruppen bevorzugt einfach substi­ tuiert durch eine Amino-, Mono- oder Dialkylamino- oder Trialkylammoniumgruppe. Die Akylgruppen können dabei gleich oder verschieden sein und bis zu 10, vorzugsweise bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 C- Atomen, besitzen und bedeuten demnach vorzugsweise Di­ methylaminoethyl, Diethylaminoethyl, Methylaminoethyl, Methylaminopropyl, Dimethylaminopropyl, Ethylaminoethyl, Propylaminoethyl, Propylaminopropyl, Dipropylaminoethyl, Dipropylaminobutyl, Diethylaminoethyl, Trimethylammo­ niumethyl, Trimethylammoniumpropyl, Trimethylammonium­ butyl, Triethylammoniumethyl, Triethylammoniumpropyl, Triethylammoniumethyl, Aminoethyl, Aminopropyl, Amino­ butyl oder Aminopentyl. Alle diese Alkyl- und substi­ tuierten Alkylgruppen sind ebenfalls bevorzugt als Sub­ stituenten an der Phenylgruppe.
Bevorzugt für R2 und/oder R3 ist auch ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH2)n-SO2-(CH2)-S-(CH2)nOH mit n=2, 3, 4, 5 oder 6, vorzugsweise 2, 3 oder 4.
Vorzugsweise hat R2 und/oder R3 auch die Bedeutung einer Phenylgruppe, die vorzugsweise einfach substituiert ist durch Cyano, Cyanoalkyl, Amino, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylamino, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Mono- oder Di­ alkylaminoalkyl, Trialkylammonium- oder Trialkylammonium­ alkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder Sulfon­ säurealkyl. Die bevorzugten Bedeutungen dieser Substi­ tuenten entsprechen den vorstehend angegebenen bevorzug­ ten Alkylgruppen und substituierten Alkylgruppen. Der Substituent an der Phenylgruppe sitzt vorzugsweise in p-Stellung.
p-Acetoxyphenyl, p-Aminophenyl oder p-Acetaminophenyl sind ebenfalls bevorzugte Bedeutungen für R2 und/oder R3.
Bevorzugt für R2 und/oder R3 ist ferner eine Alkylphenyl- oder Phenylalkylgruppe, wobei ebenfalls die angegebenen bevorzugten Bedeutungen für die Alkyl-, substituierten Alkyl- oder substituierten Phenylgruppen gelten sollen.
Demnach gelten folgende substituierte Phenylgruppen bei­ spielsweise als besonders bevorzugt: 4-Cyanophenyl, 4- Alkylphenyl, 4-(N,N-Dimethylamino)-phenyl, 4-(N,N-Di­ alkylaminoethyl)-phenyl, 4-Ethoxyphenyl, 4-Ethoxyethyl­ phenyl, 4-Trialkylammoniumphenyl, 4-Carboxylphenyl, 4- Sulfonsäurephenyl, Phenylethyl, 4-(N-Ethylamino)phenyl­ propyl oder 4-Cyanophenyl-ethyl.
Des weiteren sind Einheiten der Formel I bzw. Monomere der Formel II bevorzugt, in denen R2 und/oder R3 einen cyclischen oder bicyclischen Rest, der aromatisch oder gesättigt sein kann, mit 5-10 C-Atomen, worin ein- oder mehrere CH- oder CH2-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind, bedeuten.
R2 und R3 bedeuten demnach bevorzugt auch einen Pyridin­ rest, Imidazolylrest, Indolylrest, ferner bevorzugt einen Pyrrol-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Chinolin- oder Isochino­ linrest.
R2 und/oder R3 können beispielsweise auch einen Thiazol-, Thiadiazol-, Morpholin-, Triazin-, Piperazin-, Benzo­ thiazol-, Purin-, Pyrazol-, Triazol-, Pyrrolidin- oder Isoxazol-Rest bedeuten.
Insbesondere bevorzugt sind dabei die aromatischen, hete­ rocyclischen Reste.
Die Reste R2 und R3 müssen, um zu geeigneten Austauschern zu gelangen, so aufeinander abgestimmt werden, daß entwe­ der beide Reste eine saure oder basische Gruppe enthalten oder aber einer der Reste neutral ist. Dem Fachmann be­ reitet es keine Schwierigkeit, die Gruppen entsprechend zuzuordnen und somit geeignete Reste für R2 und R3 zu­ sammenzustellen, je nach Funktion und Aufgabe des ge­ wünschten Ionenaustauschers.
Vorzugsweise ist einer der beiden Reste R2 und R3 ein neutraler Rest.
R4 bedeutet bevorzugt Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Carboxyalkyl oder Sulfonsäurealkyl mit bis zu 10 C- Atomen, vorzugsweise mit bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt mit bis zu 4 C-Atomen in der Alkylgruppe, die linear oder verzweigt sein kann. R4 bedeutet demnach be­ vorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Hexyl, Methoxy­ methyl, Ethoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-Oxa­ pentyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Iso­ pentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-methyl­ butyl, 3-Oxa-4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl oder 2-Methyl-3-oxahexyl.
Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eine Cyano, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vor­ liegen. Demnach bedeutet R4 bevorzugt Cyanomethyl, Cyano­ ethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl, Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxymethyl, Carboxyl­ ethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Carboxylbutyl, Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2-methylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl, Sulfonsäure­ ethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl, Sulfonsäure­ pentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2-methylpropyl, Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3-methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3-methylhexyl oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl.
Alle diese Alkyl- und substituierten Alkylgruppen sind ebenfalls bevorzugt als Substituenten an der Phenyl­ gruppe.
Vorzugsweise hat R4 auch die Bedeutung einer Phenyl­ gruppe, die vorzugsweise einfach substituiert ist durch Cyano, Cyanoalkyl, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder Sulfonsäurealkyl. Die be­ vorzugten Bedeutungen dieser Substituenten entsprechen den vorstehend angegebenen bevorzugten Alkylgruppen und substituierten Alkylgruppen. Der Substituent an der Phenylgruppe sitzt vorzugsweise in p-Stellung.
R7 und R8 in den Monomeren der Formel II bedeuten vor­ zugsweise H, und damit haben auch R′ und R′′ in Formel I vorzugsweise die Bedeutung Wasserstoff.
Bevorzugt sind auch Trennmaterialien, bei denen in For­ mel I Y = -OH ist und einer der Reste R′ und R′′ ebenfalls -OH bedeutet. Als Monomeres muß dann ein Vinylencarbonat der Formel III eingesetzt werden, und das bei der Poly­ merisation entstandene Produkt anschließend in eine Hy­ droxylphase überführt werden.
R⁷ und R¹ in Formel III bedeuten vorzugsweise H. n in Formel I stellt die Anzahl der wiederkehrenden Einheiten dar und bedeutet 2-100, vorzugsweise 5-60, insbesondere sind Kettenlängen von 10-30 bevorzugt.
Die EP-0 416 983 A1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Faktors VIII/von Willebrand-Faktor-Konzentrats für die Blutkoagulation ausgehend von vollständigem Blutplasma. Dort wird erwähnt, daß sogenanntes Tentakelmaterial der Firma Merck geeignet ist, als Anionenaustauscher-Material zu fungieren.
Woods, K. und Orme, Th. beschreiben in der EP-A-02 39 859, daß es von Vorteil ist, nach der Virusentfernung oder -inaktivierung und vor der chromatographischen Trennung die Probe mit Ölen zu extrahieren, vorzugsweise mit Sojaöl, Rizinöl und/oder Baumwollsamenöl.
Durch die erfindungsgemäßen Maßnahmen ist es erstmals möglich, in hohen Ausbeuten einen hochreinen Antihämo­ philiefaktor herzustellen, der eine bisher nicht er­ reichte spezifische Aktivität aufweist.
Handelsübliches Kryopräzipitat wird bei Raumtemperatur innerhalb von 3 bis 4 Stunden aufgetaut und in Stücke von ca. 1 bis 2 cm zerteilt. Diese Stücke werden bei Tempera­ turen zwischen 10 und 25°C durch Rühren suspendiert in etwa dem doppelten Volumen Wasser, welches 1 bis 3 U/ml Heparin-Natrium enthält. Die Suspension wird mit 0,1 M Essigsäure auf einen pH-Wert von mindestens 7,0 bis 8,0, vorzugsweise 7,0 bis 7,1, eingestellt. Es wird 15 bis 60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten bei Raumtemperatur ge­ rührt. Daraufhin werden etwa 108 g 2% Aluminiumhydroxid- Suspension pro kg Kryopräzipitat hinzugefügt und 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei Raumtemperatur ge­ rührt. Mit Säure, vorzugsweise 0,1 M Essigsäure, wird der Säuregehalt auf pH 6,0 bis 7,0, vorzugsweise 6,5 bis 6,6, eingestellt. Die Probe wird auf 10 bis 18°C, vorzugsweise 14 bis 16°C, gekühlt. Man zentrifugiert bei dieser Tempe­ ratur, beispielsweise in einer Sharples AS-16 (Cepa 61)- Zentrifuge mit einer Rate von 1,0 L/min. Danach schließt sich eine Filtration des Überstandes, beispielsweise durch ein Pall AB-1 UO1OZP-Filter an. Vorzugsweise nach dem Abzentrifugieren und Filtrieren erfolgt eine Virus­ inaktivierung. Besonders bewährt hat sich die Virusin­ aktivierung mit Hilfe von Tween/TNBP (Tri-n-Butylphos­ phat). Gute Ergebnisse werden auch mit Natriumcholat/TNBP erzielt. Das Tween/TNBP- bzw. Natriumcholat/TNBP-Gemisch kann beispielsweise durch Ölextraktion wieder entfernt werden.
Man gibt die Probe auf eine Chromatographiesäule, die ein Gelpermeationsmaterial mit Ionenaustauscheraktivität auf­ weist, das unter dem Handelsnamen EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 bekannt ist. EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 wurde oben bereits charakterisiert. Die Säulenkapazität soll vor­ zugsweise so beschaffen sein, daß 0,5 kg des Säulenmate­ rials pro kg Kryopräzipitat sich in der Säule befinden. Die Säule wird mit der Probe beschickt und mit Puffern gewaschen. Nach Elution der Probe mit einem Puffer höhe­ rer Ionenstärke wird das erhaltene Produkt mit einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt verdünnt und, falls nö­ tig, auf pH 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 6,9 bis 7,1, ein­ gestellt. Danach wird erneut filtriert, vorzugsweise an Nitrocellulosefiltern, worauf sich eine Sterilfiltration anschließt.
Erfindungsgemäß wird die Ionenstärke des Trennpuffers durch quartäres Ammoniumsalz mit mindestens einer hydrophil substituierten Kohlenwasserstoff­ kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Cholinchlorid, eingestellt wird.
So wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Säule, enthal­ tend das oben beschriebene Fractogel (M) 650 mit einem Puffer A gewaschen und äquilibriert. Der Puffer A enthält eine Natriumchlorid- oder Cholinchloridkonzentration von 50 bis 200 mM, vorzugsweise 120 mM, bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugsweise 6,5 bis 7,0.
Die Probe wird vorzugsweise aus einem Puffer, der eine Osmolarität von 200 bis 600 m Osmol, bevorzugt 380 bis 520 m Osmol, bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugs­ weise 6,5 bis 7,0, aufweist, auf die Säule aufgetragen. Es empfiehlt sich, daß die Kapazität der Säule 50 I.E. Faktor VIII/ml Gel nicht überschreitet. Nach dem Auftra­ gen wird die Säule mit Puffer A gewaschen.
Danach wäscht man mit Puffer B, der ebenfalls Natrium­ citrat, Calciumchlorid, Glycin enthält, jedoch eine höhere Ionenstärke als der Puffer A aufweist. Die Konzen­ tration an quartärem Ammoniumsalz der oben beschriebenen Art und/oder Natriumchlorid sollte zwischen 150 und 250 mM, vorzugsweise 180 bis 200 mM, betragen, der pH- Wert sollte zwischen 5,8 bis 7,8, vorzugsweise bei ca. 7,0, liegen.
Die Elution des Produkts von der Säule erfolgt mit einem Puffer C, der eine gegenüber Puffer B nochmals erhöhte Ionenstärke aufweist. Der Gehalt an quartärem Ammonium­ salz der oben beschriebenen Art, insbesondere Cholin­ chlorid und/oder Natriumchlorid, sollte im Bereich von 200 und 500 mM liegen, vorzugsweise ca. 400 mM betragen bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugsweise ca. 7,0.
Es kann anstelle des Kryopräzipitats auch von Blutplasma ausgegangen werden. In diesem Fall empfiehlt sich eine zweistufige chromatographische Aufbereitung.

Claims (4)

1. Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinakti­ viertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chro­ matographie aus Blutplasma oder Kryopräzipitat unter Verwendung eines Anionenaustauschermaterials auf Basis von hydroxylgruppenhaltigen Trägern, deren Oberflächen mit kovalent gebundenen Polymeren beschichtet sind, die Polymeren gleiche oder verschieden wiederkehrende Einheiten der Formel I enthalten, worin
R¹ H oder CH₃ -CN, -CHO, -OH, -CH₂-NH₂ oder -CH₂NR²R³,
R′ und R′′ jeweils H oder CH3, und falls Y=-OH kann einer der Reste R′ und R′′ auch -OH sein,
X -OH, -NR2R3 oder -OR4,
R2 und R3 jeweils eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenyl­ gruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach substituiert sein können durch Alkoxy-, Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammonium-, Carboxyl-, Sulfon­ säure- Acetoxy- oder Acetamino-Reste,
einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5-10 C- Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH2-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind,
oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH2)n-SO2-(CH2)n S(CH2)nOH mit n=2-6 bedeuten und einer der Reste R2 und R3 auch H bedeuten kann,
wobei R2 und R3 so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind,
n 2 bis 100,
und R4 eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkyl­ phenylgruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkyl­ gruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach sub­ tituiert sein können durch Alkoxy-, Cyano-, Carboxyl-, Sulfonsäure- oder Acetoxy-Reste, bedeutet, aufweisen, wobei die Reinigung des Faktors VIII durch Waschen und Elution mit Puffern steigender Ionenstärke durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferionenstärke mittels quartären Ammoniumsalzen mit mindestens einer hydrophil substituierten Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 C-Atomen allein oder in Kombination mit Kochsalz eingestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des Anspruchs 1 mit X = -NR²R³ ist,
worin
R² und R³ jeweils Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Carboxyalkyl, Sulfonsäurealkyl mit jeweils bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe,
unsubstituiertes oder durch einen oder mehrere Alkyl-, Alkoxy-, Alkoxyalkyl, Cyano-, Cyanoalkyl-, Aminoalkyl-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Mono- oder Dialkylaminoalkyl-, Trialkylammonium-, Trialkylammoniumalkyl-, Carboxy-, Carboxyalkyl, Sulfonsäure-, Sulfonsäurealkyl-, Acetoxy- oder Acetamino-Gruppe(n) substituiertes Phenyl mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe, einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5-10 C- Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH2-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind,
oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH2)n-SO-(CH2)n- S-(CH2)nOH mit n=2-6 bedeuten und einer der Reste R2 und R3 auch H bedeuten kann, wobei R2 und R3 so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das quartäre Ammoniumsalz Cholinchlorid ist.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Salzgradient, aufgebaut auf den verwendeten Puffersystem, 0,1 bis 1,0 M beträgt als Summe aus der Konzentration von Natriumchlorid und/oder dem quartären Ammoniumsalz nach Anspruch 1 und/oder 3.
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