NO315426B1 - Fremgangsmåte for utvinning av meget ren virus-inaktivert Faktor VIII/von Willebrand faktor kompleks ved anionbytterkromatografi - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for utvinning av meget ren, virusinaktivert faktor VIII fra kryopresipitat ved anionbytterkromatografi.

I EP A 0 238 701 er beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av meget ren, ikke-infektuøs antihemofili-faktor, hvor fibrinogen, globuliner, albuminer og andre inngripende komponenter er fjernet fra kryopresipitatet ved etanolutfelling. Oppsamling fra kryopresipitatet er nødvendig, fordi faktor VIII inneholdes i materialet i bare meget små mengder. Dette oppsamlingstrinnet svekker imidlertid AHF-innholdet i sluttproduktet. Fremgangsmåtene som hittil er kjent for fremstilling av faktor VE gir bare meget små mengder aktivt stoff. Ved anvendelse av faktor VIII fremstilt ved konvensjonelle metoder, vil således pasienten bli bebyrdet med store mengder antigene stoffer. Dette er ikke uten risiko. Det har derfor vært gjort mange forsøk på å akkumulere faktor VDI ved separerings-metoder. Det har således vært forsøkt å oppnå produkter med høyere spesifikk aktivitet ved affinitetskromatografi ved anvendelse av antistoffer fra dyr rettet mot faktor VIII. Denne teknikk er imidlertid meget kostbar og kostnadsintensiv. På den annen side er denne teknikken heller ikke uten motforestillinger, fordi også en viss mengde av dyre-protein alltid vil elueres fra kolonnen ved hver kromatografiske separering.

Europeisk patentsøknad nr. 359 593 Bl beskriver en fremgangsmåte for separering av humane eller dyreplasmaproteiner ved kromatografi på en anionbytterharpiks som muliggjør preparering av rensede konsentrater av disse proteinene i ett trinn. Et kryopresipitat av plasma bestående av fibrinogen, fibronektin, faktor VIII og von Willebrand faktor blir anvendt som utgangsmateriale og konsentrering og isolering av forskjellige proteiner blir oppnådd ved suksessiv økning i ionestyrke av elueringsbufferen.

Europeisk patentsøknad nr. 88 108 458.6 beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av meget ren, virusfri antihemofilifaktor, hvorved et kryopresipitat inneholdende faktor VIII behandles med aluminiumhydroksyd og med biologisk kompatible organiske oppløsningsmidler/vaskemidler, ved en foretrukket utførelsesform fulgt av gelgjennomtrengningskromatografi ved anvendelse av ionebyttermateriale. Europeisk patentsøknad nr. 88 118 478.2 beskriver et kromatografisk materiale basert på kopolymerer av oligoetylenglykoler, glycidyl-metakrylater og pentaerytritol-dimetakrylater som spesielt egnet for fremstilling av meget ren, virusfri faktor Vin.

WO 90/14886 beskriver et medium for separering av proteiner. Materialet angitt der, beskriver en vannuoppløselig matriks som har flere polyamingrupper, hvilke polyamingrupper omfatter minst 3 basiske nitrogenatomer, som er adskilt med en kjede på minst to karbonatomer, idet minst 5 slike karbonatomer er tilstede når hver polyamin-gruppe har totalt 3 nitrogenatomer. Dette separeringsmedium er egnet for i det minste delvis rensning av faktor VID.

EP 0 343 275 Al angår en fremgangsmåte for fremstilling av meget ren antihemofilifaktor (AHF eller faktor VIH) som, ved rensning av kryopresipitat, er gjort virusfri ved behandling med biologisk kompatible organiske oppløsningsmidler/vaskemidler. Fremgangsmåten karakteriseres ved at kryopresipitatet, før virus fjernes fra dette, tines, ekstraheres med vann inneholdende fra 1 til 3 U/ml heparin ved pH 6,5-7,5, blandes deretter med en aluminiumhydroksydsuspensjon og, etter avkjøling til fra 10°C til 18°C og regulering av pH-verdi til fra 6 til 7, sentrifugeres og filtreres og behandles deretter videre på kjent måte. Det er spesielt fordelaktig at prøven, etter fjernelse av virus, underkastes gelgjennomtrengningskromatografi på ionebyttermaterialer.

Det er riktig at fremgangsmåten beskrevet i europeisk patentsøknad 88 108 458.6 gir en økning av utbytte av faktor VIII; utbyttet av den biologisk aktive faktor VEU er imidlertid fremdeles ikke optimalt.

Det tekniske problem som definerer målet for foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe en fremgangsmåte for å forbedre utvinning av biologisk aktiv faktor VEI fra kryopresipitatkilder og oppnå en mer økonomisk metode.

Dette problem er overraskende løst ved fremgangsmåten ifølge trekkene i krav 1. Underkravene angår foretrukne utførelsesformer for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fremgangsmåte for utvinning av en meget ren virusinaktivert faktor VITI/ von Willebrand faktor kompleks fra kryopresipitat ved anionbytterkromatografi, kjennetegnet ved at det som anionbyttermateriale anvendes et separeringsmateriale basert på bærere inneholdende hydroksylgrupper, hvor overflaten av disse bærerne er blitt belagt med kovalent bundne polymerer, hvilke polymerer inneholder gjentagende enheter som er like eller forskjellige og er representert ved formel I

hvor

R<1> betyr H eller CH3,

R* og R" hver betyr H eller CH3,

X betyr -NR<2>R<3>,

R<2> og R<3> hver betyr en alkyl-, fenyl-, fenylalkyl- eller alkylfenylgruppe med opp til 10 karbonatomer i alkylgruppen, hvilke grupper er mono- eller poly-substituerte med amino, mono- eller dialkylamino-, trialkylammonium, karboksyl, og kan være mono- eller poly-substituert med alkoksy, cyano, sulfonsyre-, acetoksy- eller acetaminogrupper, en cyklisk eller bicyklisk gruppe med fra 5 til 10 karbonatomer, hvor én eller flere CH- eller CHz-grupper er blitt erstattet av N eller NH, N eller NH og S, eller N eller NH og

O,

én av R 2 og R 3 kan også være H, mens R 2 og R 3 er blitt tilpasset hverandre slik at begge gruppene enten inneholder basiske grupper eller en av de to

gruppene er nøytrale, og

n er fra 2 til 100.

Separeringsmaterialene som skal anvendes ifølge oppfinnelsen består av bærerpartikler som beskrevet i EP-A-0 337 144. Disse er bærerpartikler med hydroksylgrupper, på hvilke et polymert materiale er podet via karbonatomene i a-stillingene i forhold til hydroksylgruppene. Bærermaterialene kan omfatte hvilke som helst vanlig kjente porøse og ikke-porøse kromatografibærere med primære eller sekundære alifatiske hydroksyl-funksjoner tilstede på overflaten. Blant disse er hydrofile polymerer basert på akrylater og/eller metakrylater, polyvinylalkoholbaserte polymerer, diolsubstituerte silikageler, agarosebaserte polysakkarider, cellulose, cellulosederivater eller dekstranbaserte polymerer foretrukket. Andre polymerer eller kopolymerer basert på monomerer, så som vinyl-forbindelser, akrylamid, (met)akrylsyre-estere eller (met)akrylnitril, i hydroksylert form, kan selvfølgelig også anvendes.

Det polymere materiale med formel I ifølge krav I bundet til bærerpartiklene gjennom karbonatomene i a-stilling i forhold til hydroksylgruppene, er avledet fra monomerer med formlene II og/eller III, hvor substituentene er som angitt nedenfor.

Disse monomerene er (met)akrylsyre (Y = -COOH), (met)-akrylsyrederivater

(Y = -CO-X), allylaminer (Y = -CH2NH2, -CH2NR<2>R<3>), (met)akrylnitriler (Y = -CN), akroleiner (Y = -CHO), vinylkarboksylater (Y = -OCOCHR<5>R<6>) eller vinylenkarbonater med formel III.

Alle disse monomerene er stoffer som er polymeriserbare i en vandig oppløsning via friradikal-initiert polymerisering, og har reversibelt bundne grupper som kan være nøytrale, sure eller basiske.

Hvis vinylkarbonatene med formel HI eller vinylkarboksylatene CR 7 R 8 =CR 1-OCOCHR5R6 med formel II anvendes, er det foretrukket at det resulterende produkt omdannes til et separeringsmateriale med hydroksylgrupper. Denne omdannelse til en hydroksylfase, utføres ved per se kjent mild alkalisk eller sur forsåpning. F.eks. kan omsetningen utføres med en metanoloppløsning av K2CO3 ved romtemperatur, som f.eks. beskrevet av Y. Tezuka et al., i Macromol. Chem. IM, 685-694 (1985).

R<1> i formlene I (kfr. krav 1), II og HI er fortrinnsvis hydrogen, dvs. akrylsyre-derivatene er foretrukket.

Y i formel O er fortrinnsvis -CO-X, -OCOCHR<5>R<6> eller -CH2NH2; deretter er -CN eller -CHO foretrukket. Følgelig representerer Y i formel I i første tilfelle -CO-X, -OH (ettersom gruppen -OCOCHR<5>R<6> omdannes til en hydroksylfase) eller -CH2NH2, og som andre preferanse, -CN eller -CHO.

R<5> og R<6> betyr uavhengig H eller en alkylgruppe med opptil 5 karbonatomer. Det er foretrukket at minst én av gruppene R<5> og R<6> er H. De følgende grupper er spesielt foretrukket: Acetyloksy, propionyloksy, butyryloksy, valeryloksy og heksanoyloksy.

X i formel II, betyr -OR<4>, -OH eller -NR<2>R<3>, og fortrinnsvis -NR<2>R<3>. Foretrukket er forbindelser hvor X betyr -NR 2 R 3 og én av R 2 og R 3 er H.

Gruppene R 2 og/eller R 3betyr fortrinnsvis en alkyl-, fenyl-, fenylalkyl- eller alkylfenylgruppe, hvor alkyl- og/eller fenyl-gruppene kan være mono- eller polysubstituert, fortrinnsvis mono- eller disubstituert, og spesielt foretrukket monosubstituert, med en alkoksy-, cyano-, amino-, mono- eller dialkylamino-, trialkylammonium-, karboksyl-, sulfonsyre-, acetoksy- eller acetaminogruppe.

Gruppene R 2 og/eller R 3betyr hver alkyl, aminoalkyl, mono- eller dialkylaminoalkyl, trialkylammoniumalkyl, hver med opp til 10 karbonatomer i alkylgruppen, fenyl som er usubstituert eller er blitt mono- eller polysubstituert med alkyl, alkoksy, alkoksyalkyl, cyano, cyanoalkyl, aminoalkyl, amino, mono- eller dialkylamino, mono- eller dialkylaminoalkyl, trialkylammonium, trialkylammoniumalkyl, karboksy, karboksyalkyl, sulfonsyre, sulfonsyrealkyl, acetoksy eller acetaminogruppe(r) med opptil 10 karbonatomer i alkylgruppen,

en cyklisk eller bicyklisk gruppe med fra 5 til 10 karbonatomer, hvor én eller flere CH- eller CH2-grupper er blitt erstattet av N eller NH, N eller NH og S, eller N eller NH ogO,

en av R<2> og R<3> kan også være H,

mens R<2> og R<3> er blitt tilpasset hverandre slik at begge gruppene enten inneholder basiske grupper eller en av de to gruppene er nøytrale.

Videre foretrukket er også alkylgrupper som er substituert med en cyano-, karboksy- eller sulfonsyregruppe. Således har R 2 og/eller R 3 de foretrukne betydningene, cyanometyl, cyanoetyl, cyanopropyl, cyanobutyl, cyanopentyl, cyanoheksyl, 2-cyanopropyl, 2-cyanobutyl, karboksylmetyl, karboksyletyl, karboksylpropyl, karboksylisopropyl, karboksylbutyl, karboksylpentyl, karboksylheksyl, karboksyl-2-metylpropyl, karboksyl-2-metylbutyl, sulfonsyremetyl, sulfonsyreetyl, sulfonsyrepropyl, sulfonsyrebutyl, sulfonsyre-pentyl, sulfonsyreheksyl, sulfonsyre-2-metylpropyl, sulfonsyre-2-metylbutyl, sulfonsyre-3-metylbutyl, sulfonsyre-2-metylpentyl, sulfonsyre-3-metylheksyl eller suIfonsyre-2-etyl-pentyl.

Det er videre foretrukket at alkylgruppene er monosubstituert med en amino-, mono- eller dialkylamino- eller trialkylammoniumgruppe. Alkylgruppene kan være like eller forskjellige, og kan ha opptil 10, fortrinnsvis opptil 6 karbonatomer, og spesielt foretrukket opptil 4 karbonatomer. De kan således ha de foretrukne betydningene, dimetylaminoetyl, dietylaminoetyl, metylaminoetyl, metylaminopropyl, dimetylamino-propyl, etylaminoetyl, propylaminoetyl, propylaminopropyl, dipropylaminoetyl, dipropylaminobutyl, dietylaminoetyl, trimetylammoniumetyl, trimetylammoniumpropyl, trimetylammoniumbutyl, trietylammoniumetyl, trietytammoniumpropyl, trietylammoniumetyl, aminoetyl, aminopropyl, aminobutyl eller aminopentyl. Alle disse alkyl- og substituerte alkylgruppene er også foretrukket som substituenter for fenylgruppen.

Likeledes foretrukket for R<2> og/eller R3 er et sulfon-sulfid med strukturen -(CH2)„-S02-(CH2)n-S-(CH2)nOH, idet n = 2, 3,4, 5 eller 6, fortrinnsvis 2,3 eller 4.

Fortrinnsvis har R 2 og/eller R 3også betydningen(e) en fenylgruppe, som fortrinnsvis er monosubstituert med cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, mono- eller dialkylamino, alkyl, alkoksy, alkoksyalkyl, mono- eller dialkylaminoalkyl, trialkylammonium- eller trialkylammoniumalkyl, karboksy, karboksyalkyl, sulfonsyre eller sulfonsyrealkyl. De foretrukne betydningene for disse substituentene svarer til de alkylgruppene og substituerte alkylgruppene angitt ovenfor som foretrukne. Substituenten på fenylgruppen er fortrinnsvis bundet i p-stillingen.

p-acetoksyfenyl, p-aminofenyl eller p-acetaminofenyl er også foretrukne betydninger for R 2 og/eller R 3 . Ytterligere foretrukne grupper for R 2 og/eller R 3 er en alkylfenyl- eller fenylalkyl-gruppe, hvor de angitte foretrukne betydniner også gjelder for alkyl-, de substituerte alkyl- eller substituerte fenylgruppene.

F.eks. er de følgende substituerte fenylgruppene således spesielt foretrukne: 4-cyanofenyl, 4-alkylfenyI, 4-(N,N-dimetylamino)-fenyl, 4-(N,N-dialkylaminoetyl)-fenyl, 4-etoksyfenyl, 4-etoksyetylfenyl, 4-trialkylammoniumfenyl, 4-karboksylfenyl, 4-sulfonsyre-fenyl, fenyletyl, 4-(N-etylamino)fenylpropyl eller 4-cyanofenyletyl.

Videre foretrukket er forbindelser med formel I og/eller monomerer med formel n, hvor R 2 og/eller R 3 er en cyklisk eller bicyklisk gruppe som kan være aromatisk eller mettet og inneholder fra 5 til 10 karbonatomer, i hvilke ringer én eller flere CH- eller CH2-grupper er erstattet med N eller NH, N eller NH og S, eller N eller NH og O.

R 2 og R 3 betyr således også fortrinnsvis pyridin, imidazolyl, indolyl, og videre foretrukket pyrrol, pyrimidin, pyrazin, kinolin eller isokinolin.

R 2 og/eller R 3 kan også f.eks. være tiazol, tiadiazol, morfolin, triazin, piperazin, benzotiazol, purin, pyrazol, triazol, pyrrolidin eller isoksazol.

Blant disse er aromatiske, heterocykliske grupper spesielt foretrukket.

For å gi egnede utbyttere, må gruppene R 2 og R 3være justert i forhold til hverandre, slik at begge gruppene inneholder enten en sur gruppe eller en basisk gruppe, eller én av gruppene er nøytrale. Fagfolk vil ikke ha noen problemer med å bestemme gruppene i henhold til dette og således kombinere egnede grupper for R<2> og R<3>, avhengig av funksjonen og målet for den ønskede ioneveksling.

Det er foretrukket at én av de to gruppene R 2 og R 3 er en nøytral gruppe.

R 7 og R 8 i monomerene med formel II er fortrinnsvis H, slik at R1 og R" i formel I er også fortrinnsvis hydrogen.

Også foretrukket er separeringsmaterialer hvor Y i formel I betyr -OH og én av gruppene R' og R" også betyr -OH. Da må vinylenkarbonatet med formel HI anvendes som monomer, og det resulterende produkt må deretter omdannes til hydroksylfasen.

R<7> og R<1> i formel III er fortrinnsvis H. I formel I betyr n antall repeterende enheter og er fra 2 til 100, fortrinnsvis fra 5 til 60, idet kjedelengder på fra 10 til 30 er foretrukket.

Woods, K., og Orme, Th., beskriver i EP-A-0 239 859 at det er fordelaktig, etter fjernelse av virus eller inaktivering, og før kromatografisk separering, å ekstrahere prøven med oljer, fortrinnsvis med soyaolje, ricinusolje og/eller bomullsfrøolje.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen lar for første gang meget ren antihemofili-faktor fremstilles i høyt utbytte, hvilken faktor har en spesifikk aktivitet som hittil ikke har vært oppnådd.

Et kommersielt tilgjengelig kryopresipitat deles i stykker på fra ca. 1 til 2 cm i størrelse, og får tine ved romtemperatur i 3 til 4 timer. Disse stykkene suspenderes under omrøring i ca. det dobbelte volum vann inneholdende 1 til 3 U/ml heparin-natrium ved temperaturer mellom 10°C og 25°C. Suspensjonen reguleres til en pH-verdi på minst 7,0 til 8,0, og fortrinnsvis fra 7,0 til 7,1, med 0,1M eddiksyre. Omrøring fortsettes ved romtemperatur i fra 15 til 60 minutter, fortrinnsvis i 30 minutter. Deretter tilsettes ca. 108 g 2% aluminiumhydroksydsuspensjon pr. 1 kg kryopresipitat, og blandingen omrøres ved romtemperatur i fra 1 til 10 minutter, fortrinnsvis i 5 minutter. Surhetsgraden reguleres deretter med syre, fortrinnsvis 0,1M eddiksyre, til en pH-verdi på fra 6,0 til 7,0, fortrinnsvis fra 6,5 til 6,6. Prøven avkjøles til fra 18°C til 10°C, fortrinnsvis fra 16°C til 14°C. Ved denne temperaturen underkastes blandingen sentrifugering, f.eks. i en Sharples AS-16 (Cepa 61) sentrifuge, med en hastighet på 1,0 L/min. Dette følges av frafiltrering av den overliggende væske, gjennom et Pall AB-1 UOIOZP filter. Virusinaktivering utføres fortrinnsvis etter sentrifugering og filtrering. Virusinaktivering ved hjelp av Tween/TNBP (tri-n-butylfosfat) har vist seg å være spesielt bra. Gode resultater oppnås også ved anvendelse av natriumcholat/TNBP. Tween/TNBP- eller natriumcholat/TNBP-blandingen kan så fjernes, f.eks. ved ekstraksjon med olje.

Prøven fylles på en kromatografikolonne inneholdende gelgjennomtrengnings-materialet kjent under handelsnavnet EMD-TMAE-Fractogel (M) 650, som oppviser ionebytteraktivitet. EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 er allerede karakterisert ovenfor. Kolonnekapasiteten er fortrinnsvis slik at 0,5 kg av kolonnematerialet pr. 1 kg kryopresipitat er til stede i kolonnen. Prøven fylles på kolonnen og vaskes med buffere. Etter eluering av prøven med en buffer med høyere ionestyrke, fortynnes det resulterende produkt med en buffer med et lavere saltinnhold og, om nødvendig, reguleres til en pH-verdi på fra 6,5 til 7,5, og fortrinnsvis fra 6,9 til 7,1. Deretter utføres en ytterligere filtrering, fortrinnsvis på nitrocellulosefiltere, som følges av sterilfiltrering.

De separeringsbuffere som er funnet å være spesielt fordelaktige, er de med en ionestyrke som er blitt regulert ved anvendelse av natriumklorid og/eller et kvaternært ammoniumsalt med minst én hydrokarbonkjede med fra 1 til 6 karbonatomer og med en hydrofil substituent, så som cholinklorid.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vaskes og kalibreres således kolonnen inneholdende ovennevnte Fractogel (M) 650 med en buffer A. Buffer A inneholder natriumklorid eller cholin i en konsentrasjon på fra 50 til 200 mM, fortrinnsvis 120 mM, og har en pH-verdi på fra 5,8 til 7,8, fortrinnsvis på fra 6,5 til 7,0.

Prøven påføres fortrinnsvis kolonnen fra en buffer med en osmolaritet på fra 200 til 600 mosm, fortrinnsvis fra 380 til 520 mosm, ved en pH-verdi på 5,8 til 7,8, fortrinnsvis fra 6,5 til 7,0. Det anbefales at kapasiteten til kolonnen ikke overstiger ca. 50IU av faktor VIII pr. 1 ml gel. Etter at kolonnen er fylt, blir den vasket med buffer A.

Kolonnen vaskes deretter med buffer B som også inneholder natriumcitrat, kalsiumklorid, glycin, men har en høyere ionestyrke enn buffer A. Konsentrasjonen av det kvaternære ammoniumsalt av ovennevnte type og/eller natriumklorid bør være mellom 150 mM og 250 mM, fortrinnsvis fra 180 til 200 mM, og pH-verdien bør være mellom 5,8 og 7,8, fortrinnsvis ca. 7,0.

Eluering av produktet fra kolonnen utføres med en buffer C som har en øket ionestyrke i forhold til buffer B. Innholdet av kvaternært ammoniumsalt av ovennevnte type, særlig cholinklorid, og/eller natriumklorid bør være innen området fra 200 mM og 500 mM, fortrinnsvis opptil 400 mM, ved en pH-verdi på fra 5,8 til 7,8, fortrinnsvis ca. 7,0.

Som utgangsmateriale kan blodplasma anvendes istedenfor kryopresipitat. I dette tilfelle anbefales kromatografibehandling i to trinn.

Ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppnås utvinning av faktor VAI i høyere utbytte og med høyere produktstabilitet. Det er fordelaktig at ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, blir den såkalte von-Willebrand faktor ikke fjernet, men forblir i faktor VIII fraksjonene. Det er således mulig å anvende faktor Vin preparater også for pasienter som lider av mangel på von-Willebrand faktor. Videre kan faktor VID også anvendes ved kontinuerlig infusjonsteknikk på grunn av tilstedeværelse av von-Willebrand faktor som letter naturlig stabilisering av faktor VIE.

Fremgangsmåten illustreres ytterligere ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Oppsamling av faktor VIII fra kryopresipitat

Et kommersielt tilgjengelig kryopresipitat deles i stykker på fra ca. 1 til 2 cm i størrelse og får tine ved romtemperatur i 3 til 4 timer. Disse stykkene suspenderes under omrøring i ca. det dobbelte volum av vann inneholdende 2 U/ml heparin-natrium ved temperaturer mellom 20°C og 25°C. Suspensjonen reguleres til pH fra 7,0 til 7,1 med 0,1M eddiksyre. Omrøring fortsettes ved fra 20°C til 25°C i 30 minutter. 108 g av en 2% aluminiumhydroksyd-suspensjon tilsettes pr. 1 kg kryopresipitat, og blandingen omrøres ved romtemperatur i 5 minutter. pH-verdien reguleres deretter med 0,1M eddiksyre til fra 6,5 til 6,6. Prøven avkjøles til fra 16°C til 14°C, og underkastes sentrifugering i en Sharples AS-16 (Cepa 61) sentrifuge med en hastighet på 1,0 L/min. Den overliggende væsken filtreres gjennom et Pall AB-1 UOIOZP filter.

EKSEMPEL 2

Preparering av den kromatografiske kolonnen

En kolonne inneholdende minst 0,5 1 ionebytterharpiks pr. 1 kg kryopresipitat anvendes for separering av det ekstraherte kryopresipitat. Høyden på kolonnen må være < diameteren. Etter at kolonnen er fylt med harpiksen, vaskes kromatografikolonnen først med 5 volumdeler 0,1M natriumkloridoppløsning. Dette følges av vasking med buffer A, med følgende sammensetning:

120 mM natriumklorid,

10 mM natriumcitrat.5 H2O,

120 mM glycin,

1 mM kalsiumklorid.2 H2O,

pH-verdi 6,5 til 7,0, regulert med IM HC1.

Alle bufrene må være virusfrie, ettersom de følgende operasjoner utføres med virusfrie ekstrakter av kryopresipitat.

EKSEMPEL 3

Prøven påføres på kolonnen, og absorpsjonen av strømmen observeres ved en bølgelengde på 280 nm. Filtratet oppsamles og undersøkes på faktor VTfl aktivitet, i forhold til produktet før det ble underkastet kolonneseparering. Kolonnen vaskes med buffer A, inntil absorpsjonen igjen har nådd den opprinnelige verdi. Kolonnen vaskes deretter med buffer B, inntil absorpsjonen igjen har nådd basislinjen.

Buffer B har følgende sammensetning:

180 til 200 mM natriumklorid,

10 mM natriumcitrat.5 H2O,

120 mM glycin,

1 mM kalsiumklorid.2 H2O,

pH-verdi 6,9 til 7,0.

Eluering av produktet utføres med buffer C. Proteinrfaksjonen som fremkommer etter tilsetning av buffer C oppsamles.

Buffer C har følgende sammensetning

400 mM natriumklorid,

1 mM natriumcitrat.5 H20,

120 mM glycin,

1,0 mM kalsiumklorid.2 H2O,

pH-verdi 6,9 til 7,0.

Etter at det ønskede produkt er blitt eluert, vaskes kolonnen med 5 volumdeler buffer D, som inneholder en IM natriumkloridoppløsning.

Regenerering av kolonnen utføres ved vasking av denne med 0,1N NaOH (3 kolonnevolumer), fulgt av vasking av kolonnen med 0,1N saltsyre (3 kolonnevolumer) og vasking av kolonnen med 5 kolonnevolumer av 25% alkohol i vann.

EKSEMPEL 4

De oppsamlede fraksjonene fortynnes med buffer E, bestående av

20 mM natriumcitrat,

80 mM glycin,

2,5 mM kalsiumklorid.2 H2O,

pH-verdi 6,9 til 7,1,

inntil de oppviser en aktivitet på 26 eller 35 U/ml. Om nødvendig, reguleres deretter pH-verdien til 6,9 til 7,1, som deretter følges av filtrering gjennom et 0,45 /im Sealklean Filter. En ytterligere sterilfiltrering utføres deretter.

EKSEMPEL 5

Hvis humant plasma anvendes som faktor VHI-kilde, anvendes følgende metoder: Friskt eller dypfrosset humant plasma får nå en temperatur på 20°C, eventuelt ved anvendelse av vannbad. Plasmaet fortynnes med 50 volum% vann og filtreres deretter. Plasmafiltratet påføres på en ionebytterkolonne inneholdende EMD-TMAE-Fractogel (M) 650, hvilken kolonne på forhånd var ekvilibrert med en buffer med følgende sammensetning:

50 mM natriumklorid,

10 mM natriumcitrat

120 mM glycin

lOOU/Lheparin,

pH-verdi 6,5 til 6,9

Etter at prøven er påført, vaskes ionebytterharpiksen flere ganger med vaskebuffer. Deretter økes konsentrasjonen av vanlig salt trinnvis ved først å anvende en buffer inneholdende 100 mM natriumklorid for vasking, fulgt av vasking med en buffer med 160 mM natrium og deretter med en buffer inneholdende 200 mM natriumklorid. Fraksjonene inneholdende faktor VIII oppsamles og stabiliseres ved tilsetning av 1,0 mg/ml humant serumalbumin. Det resulterende produkt behandles videre på samme måte som i Eksemplene 2 til 4, bortsett fra at det der anvendte kommersielt tilgjengelige kryopresipitat erstattes med de oppnådde kolonne-fraksjoner.

EKSEMPEL 6 - SAMMENLIGNINGSFORSØK

I hvert av to forsøk, bearbeides 0,3 kg kryopresipitat oppnådd fra identisk plasma, det ene i henhold til fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og det andre i henhold til fremgangsmåten ifølge EP 0 343 275 Al. Fraksjonene analyseres, og resultatene for bestanddelene er som vist i den følgende tabell.

Opparbeidelse i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen resulterer i 33 porsjoner hver inneholdende 270 LU av faktor VIII, svarende til et utbytte på 29.700 LU. av faktor Vm/kg kryopresipitat eller 297 I.U./kg plasma.

Opparbeidelse i henhold til fremgangsmåten ifølge EP 0 343 275 Al resulterer i bare 23 porsjoner, hver inneholdende 270 LU. av faktor VIII, svarende til et utbytte på 20.700 I.U. av faktor Vm/kg kryopresipitat eller 2071.U./kg plasma. Dette gir en fordel med hensyn til utbytte på nesten 51% i forhold til opparbeidelsesmetoden ifølge EP 0 343 275 Al.

Uønskede proteiner, så som fibrinogen og immunoglobulin M (IgM) fjernes mer effektivt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for utvinning av en meget ren virusinaktivert faktor VHI/ von Willebrand faktor kompleks fra kryopresipitat ved anionbytterkromatografi, karakterisert ved at det som anionbyttermateriale anvendes et separeringsmateriale basert på bærere inneholdende hydroksylgrupper, hvor overflaten av disse bærerne er blitt belagt med kovalent bundne polymerer, hvilke polymerer inneholder gjentagende enheter som er like eller forskjellige og er representert ved formel I hvor R<1> betyr HeherCHa, R' og R" hver betyr H eller CH3, X betyr-NR<2>R<3>, R2 og R3 hver betyr en alkyl-, fenyl-, fenylalkyl- eller alkylfenylgruppe med opp til 10 karbonatomer i alkylgruppen, hvilke grupper er mono- eller poly-substituerte med amino, mono- eller dialkylamino-, trialkylammonium, karboksyl, og kan være mono- eller polysubstituert med alkoksy, cyano, sulfonsyre-, acetoksy- eller acetaminogrupper, en cyklisk eller bicyklisk gruppe med fra 5 til 10 karbonatomer, hvor én eller flere CH- eller CH2-grupper er blitt erstattet av N eller NH, N eller NH og S, eller N eller NH og 0, én av R 2 og R 3 kan også være H, mens R 2 og R 3 er blitt tilpasset hverandre slik at begge gruppene enten inneholder basiske grupper eller en av de to gruppene er nøytrale, og n er fra 2 til 100.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved atYi formel I i krav 1 er hvor X er -NR<2>R<3>, R2 og R<3> hver betyr alkyl, aminoalkyl, mono- eller dialkylaminoalkyl, trialkylammoniumalkyl, hver med opp til 10 karbonatomer i alkylgruppen, fenyl som er usubstituert eller er blitt mono- eller poly-substituert med alkyl, alkoksy, alkoksyalkyl, cyano, cyanoalkyl, aminoalkyl, amino, mono- eller dialkylamino, mono- eller dialkylaminoalkyl, trialkylammonium, trialkylammoniumalkyl, karboksy, karboksyalkyl, sulfonsyre, sulfonsyrealkyl, acetoksy eller acetaminogruppe(r) med opptil 10 karbonatomer i alkylgruppen, en cyklisk eller bicyklisk gruppe med fra 5 til 10 karbonatomer, hvor én eller flere CH- eller CH2-grupper er blitt erstattet av N eller NH, N eller NH og S, eller N eller NH ogO, en av R 2 og R 3 kan også være H, mens R 2 og R 3 er blitt tilpasset hverandre slik at begge gruppene enten inneholder basiske grupper eller en av de to gruppene er nøytrale.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at Y i formel li krav 1 er -CN2NH2 eller -CHjNRV, R2 og R<3> er definert som i krav 1.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, for utvinning av et meget rent virusinaktivert faktor Vm/von Willebrand faktor kompleks fra kryopresipitat ved hjelp av anionbytter-kromatografi, ved anvendelse av et anion-byttermateriale ifølge minst ett av kravene 1 til og med 3, hvori rensningen av faktor Vin blir oppnådd ved vasking og eluering med buffere som har etter hvert økende ionestyrke, karakterisert ved at ionestyrken til bufferen reguleres ved hjelp av kvaternære ammoniumsalter med minst én hydrokarbonkjede som har fra 1 til 6 karbonatomer, og som bærer en hydrofil substituent alene eller i kombinasjon med et vanlig salt.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det kvaternære ammoniumsaltet er cholinklorid.

6. Fremgangsmåte ifølge minst ett av kravene 1 til og med 5, karakterisert ved at saltgradienten, etablert ved anvendte buffersystemer, er fra 0,1 til IM som totale konsentrasjoner av natriumklorid og/eller det kvaternære ammoniumsaltet ifølge kravene 4 og/eller 5.