DE2728214A1

DE2728214A1 - Zur verwendung bei der affinitaetschromatographie geeignetes polymeres

Info

Publication number: DE2728214A1
Application number: DE19772728214
Authority: DE
Inventors: John C M Tsibris
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1976-06-30
Filing date: 1977-06-23
Publication date: 1978-01-12
Also published as: US4162355A; SE7707553L; SE431877B

Description

Anmelder: The Board of Regents for and on behalf of The University of Florida
Tallahassee, Florida 32304, USA

Zur Verwendung bei der Affinitätschromatographie geeignetes Polymeres

Bei der Erforschung von biologischen Materialien ist in neuerer Zeit die AffinitätsChromatographie besonders wertvoll geworden. Sie ist besonders zur Reinigung von verschiedenen biologisch aktiven Molekülen, z.B. kleinen Liganden, Proteinen, Nucleinsäuren und Enzymen, geeignet. Bei der Affinitätschromatographie wird ein Substrat auf dem Träger während der Chromatographie immobilisiert. Bei Verwendung einer Säule des immobilisierten Substrats können Materialien mit einer Affinitäts- oder Bindungsspezifizität gegenüber den Verbindungen, die an die stationäre Phase gebunden sind, von anderen Materialien in Gemischen abgetrennt werden.

Bis jetzt werden komplexe Polysaccharidsubstanzen, z.B. Agaroseperlen etc., bei der Affinitätschromatographie verwendet. Ein geeigneter Ligand wird nach einer Vielzahl von Methoden an die Polysaccharidmatrix gebunden. Wenn ein flüssiges Gemisch, das Moleküle enthält, die eine Bindungsaffinität gegenüber dem Liganden auf der Säule haben, dann werden die Materialien mit einer Affinität für den Liganden bevorzugt an das unlösliche und stationäre Substrat gebunden. Das gebundene Material kann sodann in der Weise eluiert werden, daß man eine Lösung durch die Säule leitet, die die Bindungsaffinität des Materials für den Liganden vermindert.

Das unlösliche Material oder Material der stationären Phase sollte vorzugsweise sich mit den abzutrennenden Materialien nur sehr schwach umsetzen, um eine nicht-spezifische Adsorption zu mlnimalisieren. Das unlösliche Material sollte im Idealfall gleichförmige kugelförmige Teilchen haben, die gute Fließ- und mechanische Eigenschaften haben und die ihre unlöslichen Eigenschaften nach Konjugation mit dem jeweiligen Liganden beibehalten. Das Substrat sollte bei allen Bedingungen der Affinitätschroroatographioverfahren mechanisch und chemisch stabil sein. Weiterhin sollte die unlösliche Phase ein lockeres poröses Netzwerk bilden, das einen gleichförmigen Fluß des zu fraktionierenden Gemisches durch das gesamte· GefUge gestattet.

Derzeit wird als stationäres Substrat für die Affinitätschromatographie meistens Agarose oder ein anderes Polysaccharidmaterial verwendet. Diese Materialien haben jedoch keine idealen Fließeigenschaften und sie neigen dazu, sich unter Druck zu einer festen Masse zusammenzubacken, wodurch ein gleichförmiger Fluß des Gemisches, das fraktioniert werden soll, erschwert wird. Dazu kommt noch, daß die derzeit verwendeten Polysaccharidmaterialien bei allen Bedingungen, die bei der Flüssigkeitschromatographie von biologischen Materialien angewendet werden, nicht genügend stabil sind, so daß ihre Gebrauchszeit verkürzt wird.

Ein besonders großer Nachteil von Polysaccharidträgern rührt von der Tatsache her, daß es gewöhnlich erforderlich ist, Cyanhalogenide zu verwenden, um den Liganden daran zu binden. Die Verwendung von Cyanhalogeniden führt jedoch zu der Bildung von Isoharnstoffgruppen in dem Substrat, wodurch eine Anionenaustauscherkapazität hervorgerufen wird. Die Anwesenheit dieser Isoharnstoffgruppen macht das Substrat

7Ο9Ιβ27ϋ70Τ

für die Reinigung von sauren Enzymen (d.h. solchen mit einem isoelektrischen Punkt von 4 bis 6) durch eine Affinitätschromatographie ungeeignet. Polysaccharidträger, die mit Cyanhalogenen behandelt worden sind, sind auch gegenüber organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Chloroform und Benzol, unverträglich und sie sind außerdem mikrobiellen Angriffen unterworfen.

Ein weiterer Nachteil der Polysaccharidträger besteht darin, daß sie für Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographieverfahren nicht geeignet sind. Bei diesen Materialien werden das zu fraktionierende Material und auch die Eluierungsmedien etc. durch die Säule unter hohem Druck gepreßt, wodurch die Gesamttrennzeit erheblich vermindert wird. Die Polysaccharidträger sind aber für diese Anwendungszwecke völlig ungeeignet, da sie dazu neigen, unter Druck zu einer undurchlässigen Masse zusammengepackt zu werden. Die Anwendung von Hochdrucktechniken wäre aber besonders zur Reinigung biologisch aktiven Molekülen, wie Enzymen etc., wegen der Instabilität der meisten biologisch aktiven Moleküle vorteilhaft. Bei den meisten Affinitätschromatographieverfahren, die mit Schwerkraft arbeiten, sind lange Zeiträume, d.h. 1 bis 3 Tage, erforderlich, um das Verfahren durchzuführen, wodurch diese Verfahren zur Behandlung von hoch-instabilen Enzymen etc. ungeeignet sind. Feste Träger, z.B. Glasperlen, scheinen in idealer Weise als Absorptionsmedien für Affinitätschromatographioverfahren geeignet zu sein, und zwar insbesondere für solche, die unter hohen Drücken durchgeführt werden. Ihre hohen Starrheits- und Festigkeitseigenschaften machen sie in idealer Weise für gepackte chromatographische Säulen geeignet.

Auf diesem Gebiet tätige Wissenschaftler haben Jedoch zum Ausdruck gebracht, daß Gläser ungeeignet sind. Lowe et al.

- Ii -

("Affinity Chromatography", John Wiley, London, 17, 197A) führen aus, daß Gläser stark basische und einige neutrale Proteine absorbieren und daß hierdurch ihre weite Verwendung für selektive funktioneile Reinigungen in Frage gestellt wird. Zaborsky ("Separation and Purification Methods", Band 3, 1 (197A)) weist darauf hin, daß Glasträger bis zu einem gewissen Ausmaß bei hohen pH-Vierten löslich sind. Schließ· lieh ist auch noch kein zufriedenstellendes Verfahren vorgeschlagen worden, um Glasperlen mit Liganden enthaltenden Materialien zu beschichten, die für die Verwendung bei der Affinitätschromatographie geeignet sind.

Aufgabe der Erfindung ist es, Zwischenprodukte, Copolymere, die geeignete Liganden enthalten, und unlösliche Substrate der stationären Phase, die an die Copolymeren gebunden sind, zur Verwendung bei Affinitätschromatographieverfahren zur Verfugung zu stellen.

Die Affinitätschromatographie wird in folgender Literaturstelle Cuatrecasas et al., "Advances in Enzymology", 36, (1972) sowie in der US-PS 3 715 3A3 beschrieben, wobei auch verschiedene Polymere von Vinylaminimiden beschrieben werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein zur Verwendung bei der Affinitätschromatographie geeignetes Polymeres, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Polymeres von (1) mindestens einem Aminimid der allgemeinen Formel:

O . ^R3

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worin R₁ und R₂, die gleich oder verschieden sind, für Niedrigalkyl stehen, R, für eine organische Gruppe, vorzugsweise Niedrigalkyl, Hydroxyalkyl, Phenyl oder Polyoxypropylen steht und Z für den Rest einer polymerisierbaren Vinylverbindung, z.B. von Acrylsäure, Methacrylsäure oder Crotonsäure, steht,

und (2) einer Vinylverbindung mit mindestens einer daran hängenden Halogenmethylgruppe umfaßt.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Polymeres der oben beschriebenen Art, bei dem ein Aminligand, der Bindungsstellen für die.AffinitatsChromatographie liefert, an das Polymere durch Reaktion des primären Amins mit einem Teil der daran hängenden Halogenmethylgruppen angekuppelt worden ist. Gegebenenfalls ist der Rest der daran hängenden Halogenmethylgruppen mit einem Amin umgesetzt worden, welches eine daran hängende hydrophile Gruppe, z.B. eine Carboxyl·, Amino-, Hydroxyl-, Sulfonyl-, Phosphonyl-, Sulfidogruppe etc., enthält.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein für die Affinitätschromatographie geeignetes System, welches eine ^äule aus dem obigen Polymeren oder einem Trägermaterial, das mit dem oben beschriebenen Liganden enthaltenden Polymeren beschichtet ist, umfaßt.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Beschichten eines Trägermaterials mit einem Polymeren, wobei das Polymere zur Verwendung für die Affinitätschromatographie geeignet ist, bei dem man ein Trägermaterial mit einer Lösungsmittellösung des obigen Liganden enthaltenden Polymeren in Berührung bringt, das Lösungsmittel entfernt und sodann den beschichteten Träger mit einem Nicht-Lösungsmittel

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für das Endprodukt, welches ein Amin mit einer daran hängenden hydrophilen Gruppe enthält, kontaktiert, wobei sich das AmIn mit dem Rest der Halogenmethylgruppen umsetzt und die Bindung zwischen dem Polymeren und dem Träger verstärkt.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Affinitätschromatographieverfahren, bei dem das verwendete Adsorbens das obige Polymere oder einen Träger, der mit dem Polymeren beschichtet ist, umfaßt.

Schließlich betrifft die Erfindung noch verschiedene Zwischenverbindungen und Zusammensetzungen, die für die Herstellung der adsorbierenden Polymeren geeignet sind.

Die basischen Aminimidcopolyraeren, die zur Bildung von Liganden enthaltenden Polymeren geeignet sind, welche für die Affinitätschromatographie verwendet werden können, sind zum größten Teil in herkömmlichen organischen Lösungsmitteln löslich. Diese Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln ermöglicht die relativ leichte Ankupplung des Liganden. Die Neutralisierung der restlichen Halogenmethylgruppen nach der Bildung des den Liganden enthaltenden Polymeren durch Umsetzung mit einem primären Amin, welches eine hydrophile Gruppe enthält, macht das resultierende Polymere in organischen Lösungsmitteln unlöslich, jedoch durch Wasser benetzbar. Dies stellt eine sehr vorteilhafte Eigenschaft dar, da das Substrat während des Trennprozesses unlöslich und stationär, jedoch hoch-empfindlich gegenüber einer Eluierung mit wäßrigen Lösungen bleibt. Die modifizierten Polymeren haben daher eine ausgezeichnete chemische Stabilität,mechanische Festigkeit, eine gute Fließgeschwindigkeit, eine gute Verträglichkeit mit organischen Lösungsmitteln, die

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die Synthese und die Entfernung von nicht-umgesetzten Liganden erleichtert, sowie schwache lonenaustauschereigenschaften in der Nähe des Neutralpunkts.

Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß Polymere, die nur den Liganden enthalten und deren restliche Halogenmothylgruppen nicht neutralisiert sind, ebenfalls Eignung für Affinitätschromatographieverfahren haben.

Das Grundpolymere gemäß der Erfindung ist ein Polymeres von mindestens einem Aminimid der allgemeinen Formel:

- C - N - N- R,

^R3

worin R₁ und Rp, die gleich oder verschieden sein können, für Niedrigalkyl stehen, R* für eine organische Gruppe, vorzugsweise Niedrigalkyl, Hydroxyalkyl, Phenyl oder Polyoxypropylen steht und Z für den Rest einer polymerisierbaren Vinylverbindung, z.B. von Acrylsäure, Methacrylsäure oder Crotonsäure, steht, mit einer Vinylverbindung mit mindestens einer daran hängenden Halogenmethylgruppe.

Beispiele für bevorzugte Aminimide sind:

1,1-Dimethyl-1-(2-hydroxyoctyl)-aminroethacrylimid, 1,1-Dimethyl-1-(2-hydroxypropyl)-aminmethacrylimid und 1,1-Dimethyl-1-(2-polyoxypropylen)-aminmethacrylimid.

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AS 27282U

Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß alle beliebigen polymerlslerbaren Amlnlmlde dazu herangezogen werden können, um Polymere gemäß der Erfindung zu bilden. In dieser Hinsicht kann R, in der obigen Strukturformel der Rest Jeder beliebigen organischen Gruppe sein." -

Alle Vinylverbindungen, die mindestens eine daran hängende Halogenmethylgruppe enthalten, können mit dem Amlnimid copolymerislert werden, um das Grundpolymere bzw. das basische Polymere zu bilden. Bevorzugte Vinylverbindungen sind z.B. Halogenmethylstyrole, vorzugsweise ein Gemisch aus hO% p- und 60?ό m-Chlormethylstyrol, und R - CH « C - CHpX, worin

*1

R und R₁, die gleich oder verschieden sein können, für Wasserstoff oder Niedrigalkyl stehen.

Die Aminimide können in der Weise hergestellt werden, daß man das entsprechend substituierte Hydrazin mit dem entsprechenden Epoxid und einem Vinylgruppen enthaltenden Carbonsäureester umsetzt. Es kann nach den Verfahrensweisen gemäß den US-PS'en 3 485 806 und 3 715 3^3 gearbeitet werden, um das Aminimidmonomere herzustellen. Im allgemeinen sind die Reaktionsbedingungen, die für die Durchführung der Reaktion erforderlich sind, nicht kritisch. Es können alle polymerisierbaren Aminimide, die in den obigen US-Patentschriften beschrieben werden, zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polymeren verwendet werden.

Das Polymere wird sodann mit einem geeigneten Aminliganden kontaktiert, der Bindungsstellen für den in Betracht gezogenen Affinitätschromatographieprozeß liefert. Der Ligand wird kovalent an das Polymere durch Umsetzung seiner Amingruppen mit einem Teil der daran hängenden Halogenmethyl-

i\<c

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gruppen gekuppelt. Wie für den Fachmann ersichtlich ist, ist es lediglich erforderlich, eine kleine Anzahl von Ligandengruppen auf das Copolymere zu kuppeln. Das Vorhandensein eines Überschusses von Bindungsstellenliganden ist aus mehreren Gründen heraus nachteilig. Zum ersten-enthalten die zu fraktionierenden emische nur nanomolare bis millimolare Konzentrationen der abzutrennenden biologischen Moleküle. Zum zweiten macht das Vorhandensein von zu vielen Liganden das Polymere nicht-spezifisch und führt zur Adsorption von unerwünschten Molekülen. Im allgemeinen enthält das resultierende modifizierte Polymere etwa 1 bis etwa 100 Mikromol Ligand pro g, bezogen auf das Trockengewicht des Aminimidpolymeren. Vorzugsweise enthält es etwa 1 bis etwa 40 Mikromol pro g Trockengewicht. Naturgemäß hängt die Menge des in dem Polymeren vorhandenen Liganden bis zu einem großen Ausmaß von der in Betracht gezogenen Affinitätschromatographiemethode ab.

Geeignete Aminliganden schließen alle beliebigen primären oder sekundären Amine ein, die zu einem Substrat analog sind, das aus Gemischen unter Anwendung von Affinitätschromatographietechniken abgetrennt wird.

Die vorliegende Erfindung ist besonders gut für die Abtrennung von Enzymen aus ihren Gemischen geeignet. Jedoch können praktisch alle beliebigen organischen Moleküle, die für Affinitätschromatographietrennmethoden geeignet sind, gemäß der Erfindung fraktioniert werden, indem man sie an das Aminimidpolymere eines Amins, das dem Molekül analog ist, kuppelt.

Bevorzugte Aminanalogen oder -liganden sind z.B.:

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CH₂OH

(CH₂)

n(ch₂)_xnh₂

x - 2 oder 6

/
N N

H₂N-(CH₂)₆NH-CH

CH₉ - R

²

(CHOH) ..

Hydroxyl

oder

R = Fhosphon)! oder

Adenosiiu

diphos- * phat

Il O

- /I Al

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Das resultierende modifizierte Aminimidpolymere ist immer noch in organischen Lösungsmitteln relativ gut löslich. Um das Polymere in organischen Lösungsmitteln unlöslich, jedoch mit Wasser benetzbar zu machen, können die restlichen Halogenmethylgruppen mit einem primären oder sekundären Amin, das ebenfalls eine daran hängende hydrophile Gruppe, z.B. eine Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Sulfonyl-, Phosphonyl-, SuIfidogruppe etc., enthält, umgesetzt v/erden.

Bevorzugte hydrophile Gruppen enthaltende Amine sind Monoäthanolamin oder Verbindungen der Formel:

R
HN - (CH₂)_X - Y

irorin χ - 2 bis 10, Y für OH, NH₂, COOH, SO₃H, PO₃H, SH steht und R für Niedrigalkyl oder H steht.

Die Erfindung schließt auch einen geeigneten ^räger für _r' die Affinitätschromatographie ein, der mit den oben bev schriebenen Aminimidpolymeren beschichtet ist.

Bevorzugte Träger für die Affinitätschromatographie sind Mikroglasperlen, was auf ihre mechanische Festigkeit, ihre guten Packeigenschaften und ihre relative Stabilität zurückzuführen ist. Die erfindungsgemäßen modifizieren Aminimidpolymere ermöglichen nun die Beschichtung von Prägern, wie solchen Glasperlen, mit einem Material, wodurch die Affinitätschromatographiemethoden stark verbessert werden. Andere geeignete Trägermaterialien sind z.B. KUgelchen bzw. Perlen aus Stahl, Nickel, Teflonmikroteilchen und porösem Glas.

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/NIPEQTED

Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Beschichten eines Trägers mit dem modifizierten Polymeren. Da das Polymere, das den Aminliganden angekuppelt durch die Halogenmethylgruppe enthält, immer noch in vielen organischen Lösungsmitteln löslich ist, wird eine. Lösung des Liganden enthaltenden Polymeren in einem organischen Lösungsmittel mit dem Träger kontaktiert und das Lösungsmittel wird beispielsweise durch Abdampfen, Vakuumdestillation etc. entfernt, um einen beschichteten Träger herzustellen. Letzterer wird sodann mit einem Nicht-Lösungsmittel für das Endpolymere in Berührung gebracht, wobei das Lösungsmittel ein Amin mit hydrophilen Gruppen enthält, wodurch der Rest der Halogenmethylgruppen angekuppelt wird, wodurch eine unlösliche Phase erhalten wird, die das Endpolymere enthält. Im Idealfall wird ein tertiäres Amin, z.B. Triethylamin, der Endlösung zugesetzt, um den Halogenwasserstoff zu binden, der während des Prozesses freigesetzt wird.

Geeignete Lösungsmittel für die verschiedenen Stufen liegen für den Fachmann auf der Hand. Im Einzelfall hängt die Auswahl stark von dem jeweils verwendeten Aminliganden und dem Amin, das die hydrophile Gruppe enthält, ab. Geeignete Lösungsmittel für die Beschichtungsstufe sind z.B. Benzol, Chloroform, Dichlormethan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxld oder andere Lösungsmittel, die kein aktives Wasserstoffatom enthalten.

Die Endunlöslichkeitsmachung des Überzugs und die Kupplung mit dem die hydrophile Gruppe enthaltenden Amin verstärkt die Haftung des Endpolymeren an dem Trägermaterial erheblich. Geeignete Nicht-Lösungsmittel für das Endpolymere sind z.B. Diäthyläther, n-Pentan, Hexene, Petroläther (30 bis 60⁰C Kp) und Gemische davon.

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- yt -

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Nachstehend wird ein Realctionsschema angegeben, das die
Bildung eines Aininimidcopolymeren darstellt, welches einen Benzo-[a]-pyrenaminliganden und Monoäthanolamin als eine hydrophile Gruppe enthaltendes primäres Aminkupplungsmittel enthält: ...

CH, 0

I ³ (I

CH

CH, = C - C - N - N - CH₉ - CH - R

CH₂ « CH

CH

CH₂Cl

: O CH₃

I Il - +/

CH,-C-C-N-N-CH,-CH-R

I
CH₉

I ^z

CH₃ OH

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CH, -

I Il C - C

H.

N - N- CH, - CH - R

\ ² I

CH₃ OH

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CH₂N-CH₂CH₂OH

Das Aminimidpolymere ist im Gegensatz zu allen bekannten Trägern für die Äffinitätschromatographie am Anfang in organischen Lösungsmitteln löslich. Die Kupplung des Polymeren des Aminliganden kann direkt ohne vorhergehende Aktivierung des Harzes mit Cyanohalogeniden etc. und in
einer homogenen Lösung erreicht werden. Die restlichen
Halogenmethylgruppen auf dem Harz werden sodann mit Monoäthanolamin umgesetzt, um das Polymere in organischen Lösungsmitteln unlöslich, jedoch mit Wasser benetzbar zu machen .

Das resultierende ein Benzo-[a]-pyrenanaloges enthaltende Aminimidpolymere ist für die Reinigung von Enzymgemischen geeignet, die Enzyme enthalten, welche Benzo-[a]-pyren me-

tabolisieren.

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Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 Herstellung des Aminimidpolymeren:

0,63 Mol 1,1 -Dimethyl-1 - (2-hydroxyoctyl )-aminmethacry3Jmid und 0,37 Mol Chlormethylstyrol (40$ p- und 60% m-) wurden mit m-Xylol vermischt. Die Polymerisation wurde initiiert, indem in Gegenwart eines a,a^f-Azobisisobutyronitril-freie-Radikale-Initiators auf 90⁰C erhitzt wurde. Die Polymerisation wurde 5 h lang unter Np durchgeführt. Das Produkt vmrde zweimals- aus Diäthyläther ausgefällt. Die Elementaranalyse zeigte, daß es 2,15 mÄq Benzylchlorid pro g trockenes Harz enthielt. 1-Acetyl-benzo~[a]-pyren vmrde aus C-Benzo» [a]-pyren gemäß Windaus und Raichle "Ann.", 537, 157 bis 170 (1939) hergestellt. Das zweimal umkristallisierte Produkte hatte folgende Eigenschaften: Fp 189 bis 191°C, ^_c„_o

bei 6,0 um (CHCl,); NMR (C²HCl,) Methyl 2,85 ppm aus TMS-' 14

Standard. Anhand der Zählung des C-Gehalts der TLC-Flecken wurde die Reinheit zu 97?6 bestimmt. Ausbeute 50^. Der Aininligand des obigen Reaktionsschemas wurde nach der Methode von Weingarten et al. "J. Org. Chera.", 32, 3256 bis 3249 (1967) hergestellt, wobei überschüssiges 1,6-Hexandiamin verwendet wurde. Es wurde isoliert und hatte ^_c_m bei 6,08 nm

(CHCl-,). Nach der spezifischen Radioaktivität und den NKR-

Spektren in Gegenwart oder Abwesenheit von H^O v/ar es ca. 90% rein. Ausbeute 80$. Die Kupplung des Liganden auf das
Polymere wurde in Benzol in Gegenwart von Triätl^lamin (ein sechsfacher molarer Überschuß des Liganden wurde über den
gewünschten Benzo-[a]-pyrengehalt des Polymeren zugesetzt) 3 h lang bei 40⁰C durchgeführt. Das Monoäthanolamin (5-facher molarer Überschuß gegenüber dem Ausgangs-Benzylchlorid)

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-VS-43

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wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 30 h bei 40°C erhitzt. Das Polymere wurde abfiltriert und mit Benzol, Methanol/ Chloroform (1 : 4 V/V), Äther, Äthanol, einer Pufferlösung, Äthanol, Chloroform und Äther gewaschen. Die Ausbeute betrug 80 bis 87Ji. Der Ligandengehalt. (6 uMol Benzol_r[a]-pyren g trockenes Harz) wurde anhand von Messungen der Radioaktivität durch Szintillationszählung ermittelt. 1 g trockenes Harz lieferte ungefähr 4 ml nasses Harz. Vor dem Packen einer Säule wurde das trockene Harz mit Äthanol befeuchtet und auf einem Filter mit Puffer gewaschen. Nach der Verwendung wurde das Harz gewaschen, mit Protease behandelt, mit Wasser, organischen Lösungsmitteln gewaschen und im Dunkeln gelagert. ·

Herstellung von Enzymen, die Benzo-[a]-pyren metabolisieren:

Männliche Ratten (60 bis 70 g) vom Long-Evans-Stamm erhiel ten eine intraperitoneale Injektion pro Tag über einen Zeitraum von 3 Tagen von 3-Methylcholanthren (25 mg/kg) in Maisöl. Sie wurden 18 h vor dem Abtrennen des Kopfes fasten gelassen. Jede Leber wurde mit 50 ml kalter Salzlösung durchströmt. Mlkrosomen, erhalten gemäß Lu et al. "J. Biol. Chem.", 247, 1727 bis 1734 (1972), wurden in Abwesenheit eines Detergens beschallt und auf eine Sephadex-G-10-Säule aufgebracht, die mit 0,33M-TrIs-Cl, pH 7,7, ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Alle roten Fraktionen, die mit dem Gleichgewichtspuffer eluiert wurden, wurden kombiniert und mit Natriumcholat (1 mg Cholat pro mg Protein) behandelt und 1 h bei 105000 xg zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde anaerobisch bei 4°C 48 h lang gegenüber vielen Chargen eines 50nM-Kaliumphosphatpuffers mit pH-Wert 7,5 und einer Endcharge des gleichen Puffers, enthaltend 20?s Glycerol (nachstehend als Puffer bezeichnet) dialysiert.

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3k

Das Produkt wurde auf eine mit Puffer ins Gleichgewicht gesetzte Aminiraidsäule (1,5 x 13 cm) gebracht. Die Säulen wurden bis 8 bis 9°C mit Fließgeschwindigkeiten von 0,5 ml/ min unter Anwendung eines hydrostatischen Kopfdrucks von 1 m betrieben. 10 bis 12 ml-Fraktionen wurden gesammelt.

Teilweise gereinigte Cytochrom-P-450-Reduktase (von Cytochrom P-450 frei) von Phenolbarbital induzierten Rattenlebermikrosomen wurde mit Q,12# Renex-690-KCl von DEAE-Sephadex A-25 eluiert (Dignam, J.D. und Strobel, H.W. (1975) _t "Biochem. Biophys. Res. Commun.¹¹, 63» 845 bis 852).

Cytochrom P-448, Cytochrom P-420 (Omura T. und Sato R.(1964), »J. Biol. Chem." 239, 2379 bis 2385) und Protohem (Appleby, CA. und Morton, R.K. (1959), "Biochem. J.", 73, 539 bis 550) wurden nach den angegebenen Methoden bestimmt. Das Protein wurde durch eine Mikrobiuret- oder modifizierte Lowry-Methode (Want, CS. und Smith R.L. (1975), "Anal. Biochem.", 63, 414 bis 417) bestimmt, wobei Rinderserumalbumin als Standard verwendet wurde.

P-448,in der Rattenleber mit 3-Methylcholanthren induziert, unterscheidet sich katalytisch und spektral von P-450, der terminalen Oxidase von Monooxygenasen, die mit Phenobarbital induziert werden und die die Einarbeitung von molekularem Sauerstoff in Arzneimittel, Steroide, Kohlenwasserstoffe etc. katalysieren. P-446, das aus Mikrosomen solubilisiert werden kann, ist ausgedehnt gereinigt worden und katalysiert in einem rekonstituierten System, nämlich nach Zugabe der zwei anderen erforderlichen Komponenten P-448-Reduktase und eines Lipids die Erzeugung von Benzo-[aj-pyren-arenoxiden, die derzeit als die letztlichen karzinogenen Formen von polycyclischen Kohlenwasserstoffen angesehen werden.

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Durch die Erfindung wird ein Polymeres zur Verfügung gestellt, welches ein kovalent gebundenes wasserunlösliches Analoges von Benzo-[a]-pyren enthält. Es wird dazu verwendet, um Cytochrom-P-448-Fraktionen zu trennen und zu reinigen und Enzymzubereitungen zur-Verfugung zu stellen, die Benzo-[a]-pyren metabolisieren können. Diese P-448-Zubereitungen ergeben verschiedene Mengen von zwei Gruppen von Benzo-[a]-pyrenphenolen.

Nach Zugabe von UDP-Glucuronat zu den drei P-448-rekonstituierten Systemen werden wasserlösliche BP-Metabolite, vermutlich Glucuronide, zu Kosten von BP-Chinonen und BP-Phenolen erzeugt werden. Nachfolgend setzt die Behandlung dieser Metaboliten mit ß-Glucuronidase oder durch eine milde saure Behandlung fast ausschließlich die BP-Chinone wieder frei.

In Tabelle I sind die Ergebnisse bei der Eluierung von P-448, P-420 (die inaktive Form(en) von P-448) und von Protohem (das auch Cytochrom b5 einschließen würde) aus der unsubstituierten Säule (d.h. nur dem oben beschriebenen Copolymer en, das nur mit Monoäthanolamin A1D-EA umgesetzt wurde) zusammengestellt. Daraus kann entnommen werden, daß a) das mit Monoäthanolamin behandelte Polymere keine Affinität für P-448 und P-420 hat und daß 60% von P-448 möglicherweise gegenüber P-420 auf der Säule inaktiviert worden sind, da eine 220%ige Ausbeute von eluiertem P-420 vorliegt; b) die KCl-Eluierung von nur 3% P-448 und die quantitative Eluierung von Huhnovalbumin, PI = 4,8, bestätigt, daß dieses Polymere vernachlässigbare Anionenaustauschereigenschaften hat; und c) die Wiedergewinnung von nur 40 bis 60% Protein und Protohem zeigt die Affinität einiger Proteine, die aus Mikrosomen mit Na-Cholat extrahiert worden sind, für die hydrophoben Bereiche des Polymeren.

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- 19 Tabelle I - Chromatographie des Cholatextrakts von Mikrosomen auf der Kontrollsäule (AID-EA)

Probe

Volumen Protein Cytochrom P-448⁺ P-420⁺

ml mg % nMol nMol-mg"*¹ Protein % nMol %

Protohem (Pyridinhemochromogen) nHol %

1. aufgebraucht auf AID-EA (Cholatex- trakt von Mikro somen)	50,0	61,3	150,0	100 27,	VJl	0,	18	100	26,	5	100	295,0	100
2. mit Puffer eluiert77,8	67,1	37,3	24,9/10,	9	0,	29	39,6	57,	1	215,5	151,7	51,4
23- mit 0,5M-KCl* φ eluiert	87,4	9,6	6,5 0,	9	0,	10	3,3	1,	4	5,3	13,0	M
•4. mit 0,1% Triton JJ N-101 eluiert	2,4	1,6 0		0		0	0		0	2,7	0,9
^•5. mit 0,5% Renex- 3 690 eluiert	6,0	4,0 0		0		0	0		0	6,9	2,3

•Gesantwiedergewinnung

36,9

42,9

220,8

59,0

* KCl und Detergentien werden in Puffer (50 mM Kaliumphosphet, pH 7,3, enthalten 20% Glycerin)

aufgelöst, Säulengröße 1,5 x 10 cm.
⁺ Die Mikrosomen enthielten vor der Behandlung mit Sephadex G-10 0,57 nMol P-448 und 0,06 nMol

P-420 pro mg Protein. *°

OO

27282U

Tabelle II zeigt eine 60-fache Reinigung von P-448 mit einer Ausbeute von 74% nach einem einzigen Durchlauf durch die Säule, die das Polymere enthält, welches sowohl mit dem Benzo- Ca]-pyren-Analogen als auch mit Monoäthanolamin behandelt worden ist (A1D-BP). Errechnet aus den Ausgangs-Mikrosomen beträgt die P-448-Reinigung mehr als das 10-fache bei einer Gesamtausbeute von 1796. Es sollte beachtet werden, daß Renex-690 (ein nicht-ionogenes Detergens, ähnlich wie Triton-N101) selbst P-448 nicht eluieren kann. Dieses unerwartete Erfordernis nach zwei Detergentien für die Eluierung kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß das Polymere kleine hydrophobe Moleküle (polycycllsche Kohlenwasserstoffe und Steroide, Polyamine etc.) und nicht-ionogene Detergentien bindet (die UV-Absorption der ersten P-448-Fraktionen beträgt 10 bis 2096 derjenigen der angewendeten Triton- und Renex-Puffer).

Ein Viertel des aufgebrachten P-448 (und die Hauptmenge des eluierbaren P-420) bindet das Polymere nicht. Dies ist nicht auf eine Überlastung der Säule zurückzuführen, da die gleiche Fraktion von P-448 mit einem Puffer eluiert wird, wenn nur die Hälfte von P-448 aufgebracht wird. Diese Erscheinung rührt möglicherweise von der Tatsache her, daß entweder eine andere Art von P-448 oder endogene Liganden, wie kleine Moleküle, Proteine oder eng gebundenes Cholat, die Affinität für das Polymere vermindern. Die quantitative Gewinnung von P-448 aus der A1 D-BP-Säule ist dahingehend zu interpretieren, daß immobilisiertes BP (Substrat) P-448 stabilisier^ und sie zeigt, daß solche Aminimidpolymere für die Affinitätschromatographie von sauren Proteinen am besten geeignet sind (alle bekannten Komponenten von P-448-Monooxygenase haben pl-Verte zwischen 4,3 und 5,6, bestimmt durch isoelektrische Stabfokussierungselektrophorese).

?O9882/O7I1

- 21 -

Tabelle Il - Reinigung von P-448* (extrahiert durch Cholat aus Mikrosoinen) auf der AID-BP-Säule

Probe

VoIu- Protein men mg % ml

Cytochrom p-448** P-420**

nMol nMol-mg-¹ Protein % nMol %

Protohem (Pyridinhenochromogen) nMol %

1. aufgebracht auf AID-BP 75,0

2. mit Puffer

eluiert 186,0

3. mit 0,5M-KCl⁺

2 eluiert 78,9 «*4. mit 0,156 Triton-

• N-101 eluiert 77,7 oo

μ 5. mit 0,596 Renex-

"*· 690 eluiert

** a) erster

5 Peak 87,5

-* b) zweiter Peak 87,3

5,0	100	64,0	0,13
8	11,7	17,6	0,30
4,3	0,9	0,6	0,14
1,8	0,4	0	0
4,3	0,9	35,0	8,14
1,5	0,3	12,4	8,27

207,0 100 307,0 27,5 49,0 123,6 98,8 0,9 0,9 0,4 1,5 0 0 0

55,0 8,2 4,0 73,0

19,0

0, 35,5

100 32,2 0,5 0

24,0 12,0

Gesamtwiedergewinnung (%)

14,2

28,0 ;

68,2

* Es wurde ein anderer Ansatz wie in Tabelle I verwendet. Die Säule wurde mit einem schwarzen Tuch bedeckt.

+ KCl und die Detergentien werden in Puffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,3, enthaltend 20% Glycerin) aufgelöst.

** Die Mikrosomen enthielten vor der Behandlung mit Sephadex G-10 0,6 nMol P-448 und 0,06 nMol

P-420 pro mg Protein. Die P-448-Ausbeute aus den Ausgangs-Mikrosoraen für die Stufe 1 betrug 24#.

Benzo- [a j-pyren-Metabolisaius: 2 7 2 8 2 1 A

P-448-Fraktionen, aus der Benzo-[a]-pyren-Säule eluiert, wurden auf ihre katalytische Aktivität gegenüber Benzo-[a]-pyren getestet (Tabelle III, Versuche 1, 3,-5 und 7). Die gebildeten Meteboliten von BP wurden durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) abgetrennt und radiochemisch quantitativ bestimmt. Vor der Inkubierung wurde das bei den Versuchen verwendete [ CJBP durch HPLC von BP-Metaboliten (hauptsächlich Chinonen) gereinigt, die während der Lagerung im Dunkeln der Vorrats-BP-Dioxanlösung erzeugt worden waren.

709882/0791

- 23 -

Tabelle III - Metabolismus von Benzo-[a]-pyren durch rekonstituierte Leber-P-448-Monooxygenase in Gegenwart oder Abwesenheit von UDFG

Versuch Quelle von P-448	Cholatextrakt von Mikrosomen	Metaboli-	OTPG	1	Diol	3	Chinon	Phenol	2	Phenol 1	1,2
		siert (%)	6,8	2	6,4	1 & 2	1	35,0	Phenol 2	3,1
1	Puffereluat aus AID-BP-Säule	4,6	+ 9,7	3,2	8,1	18,8	29,6	50,2	1 :	0,5
2		2,8	- 13,0	4,0	10,5	12,0	16,0	15,3	1 :	0,8
3	erster Peak des Renes-Eluats aus der AID-BP-Säule	12,7	+ 21,8	6,3	15,3	24,8	30,1	20,1	1 :	1,0
4		9,5	4,8	11,0	5,3	8,0	23,8	40,8	1 :	1-9
VJl	zweiter Peak des Rsnex-Eluats aus der AID-BP-Säule	6,2	+ 9,7	2,1	7,0	20,4	26,4	41,7	1 :	1,3
6		3,0	- 4,8	3,6	4,5	15,9	22,0	39,7	1 :	1,5
7	4,2	+ 9,3	1,7	5,6	18,8	30,5	36,3	1 :
8	1,7	2,5	22,0	24,2	1 :

27282

Die Zahlen bei jedem Versuch stellen die Prozent jeder Gruppe von Metaboliten - extrahiert in der organischen Phase -, ausgedrückt als Verhältnismenge der gesamten radioaktiven Eluierung vor dem Benzo-[a]-pyren, dar. (Bedingungen der HPLC: 50⁰C, 350 psig, linearer Gradient von 3% pro min von 30 bis 7090, Methanol-Wasser, die Fraktionen wurden im Verr lauf von 30 bis 60 see gesammelt).

1 ml Inkubationsgemische enthielten: 0,2 nMol P-448, 120 Einheiten NADPH-Cytochrom-c-Reduktase, 0,1 mg Lipide, 0,5 uMol NADPH, 3 uMol MgCl₂, 100 uMol Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3) und 75 bis 95 nMol HPLC-gereinigtes [¹⁴C]-BP (9750 cpm pro nMol BP), gelöst in 0,05 ml Aceton. Zu jedem der zwei Inkubierungsgemische jeder P-448-Fraktion wurden identische Mengen von BP zugesetzt. 3 iiMol UDPG wurden, v/ie angegeben, zugesetzt. Beim Versuch 1 wurden 50 Einheiten (nMol) Styrolglycol pro min bei 37°C von gereinigter Epoxidhydrase zugesetzt. Die Inkubierung erfolgte 10 min bei 37°C. Die Reaktion wurde mit 1 ml Aceton und 2 ml Äthylacetat abgebrochen. Nach 30-sekundigem Mischen und Zentrifugieren wurde die organische Phase entfernt. 1 ml Äthylacetat wurde auf die wäßrige Schicht aufgeschichtet, entfernt und mit dem Rest der organischen Phase vereinigt. Nach Entfernung der Lösungsmittel bei 40⁰C mit einem Stickstoffstrom wurde der Rückstand in 10 ul Dioxan aufgelöst und in die HPLC-Säule injiziert.

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3Ä 27282H

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert eine HPLC-Anwendung der vorliegenden Erfindung.

1,5 g Methylacrylimid-chlormethyl-styrol-BP-Polymerisat
(AID-BP) gemäß Beispiel 1 wurden in Chloroform gelöst und mit 30,5 g Cipax-Glaskugeln in einem rotierenden Kolben
2 bis 3 Stunden gemischt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgetrennt, so daß mit dem AID-BP-Polymerisat beschichtete Kugeln erhalten wurden. Die trockenen Kugeln wurden langsam zu einer gerührten Lösung von Diäthyläther gegeben, das Monoäthanolamin und Triäthylamin (10-fächer
molarer Überschuß gegenüber den anwesenden C1CH₂-Gruppen) enthielt, wodurch die verbleibenden ClCHp-Gruppen mit dem Monoäthanolamin verbunden wurden und so die Polymerisat-Schicht auf den Kugeln versiegelt wird. Die erhaltene Polymerisat-Schicht ist in organischen Lösungsmitteln unlöslich, jedoch mit Wasser befeuchtbar.

Die so beschichteten Kugeln wurden in eine Standard-HPLC-Kolonne aus V2A-Stahl (0,8 χ 43 cm) geschichtet. Die Kolonne wurdemit einer HPLC (200 p.s.i.) verbunden und die Kugeln mit 300 ml 30#-igem Methanol-Wasser bei 50⁰C gewaschen. Die Kolonne wurde sodann mit 300 ml 50 mM-Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Hiernach wurdedie Kolonne mit einem 20%-ig Glyzerin enthaltenden Puffer ins Gleichgewicht bei 8°C gebracht, um die abzutrennenden Membranenzyme zu stabilisieren.

Das HPLC wurde sodann verwendet, um die im Beispiel 1 verwendete Enzymzusammensetzung (30 bis 50 Nanomol Cytochrom p-448 von cholatextrahierten Rattenlebermikrosomen) zu fraktionieren. Die Eluierung erfolgte mit KCl, einer Deter-

709882/0781

³³ 27282U

genslösung in Glycerinpuffer. Die Wiedergewinnung und Reinigung der Enzyme ist ähnlich wie das Schwerkraftsfließsystem des Beispiels 1. Jedoch ermöglichte die Anwendung der beschichteten Glasperlen und der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographietechnik eine Vervollständigung dieses Versuchs in 5 h im Vergleich zu den 2 bis 4 Tagen, die im Schwerkraftssystem erforderlich sind.

Naturgemäß können Versuchsbedingungen hinsichtlich des Drucks, der Temperatur, der Konzentration des Polymeren auf dem immobilisierten Substrat etc. je nach der Natur des zu fraktionierenden und/oder reinigenden Materials variiert werden.

Die Liganden enthaltenden Polymeren gemäß der Erfindung können als solche in Schwerkrafts-Flußaffinitätschromatographiesystemen (Beispiel 1) verwendet werden oder sie können auf geeignete Träger, wie Glasperlen, aufgeschichtet werden, um entweder für Schwerkraftsfluß- oder Hochdruck-Chromatographiesysteme (Beispiel 2) verwendet zu werden. Durch die Erfindung wird daher eine neue Klasse von absorbierenden Materialien für die Affinitätschromatographie zur Verfügung gestellt. Das Copolymere braucht lediglich mit einem geeigneten Bindungsstellenliganden modifiziert zu werden, um jedes beliebige Gemisch zu fraktionieren, zu trennen oder zu reinigen. Somit kann das Substrat gegenüber praktisch jeder Komponente eines Gemische durch richtige Auswahl des Liganden spezifisch gemacht werden. Obgleich die Erfindung in idealer Weise für die Trennung und/oder Reinigung von Gemischen aus biologisch aktiven Molekülen geeignet ist, wird für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Absorbentien für die Trennung praktisch jedes Gemisches verwendet werden können.

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Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung des Aminanalogen von Östron.

4- C-Östron (1,08 uMol) und 2,6 mMol nicht-markiertes Östron wurden in 70 ml Toluol aufgelöst und mit 39 mMol Hexamethylendiamin umgesetzt. Das Reaktionsgemisoh wurde 24 h mit 5 mg Toluolsulfonsäure-Katalysator am Rückfluß erhitzt. Ein 5Ä-Molekularsieb wurde zur Entfernung des Wassers verwendet. Das Produkt wurde heftig mit Wasser gewaschon, um überschüssiges Diaiain zu entfernen. Sodann wurde es mit Chloroform und Äthyläther gewaschen. Das Produkt wurde durch das IR-Spektrum (C=N-Streckung bei 6,0 um) und durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus 90:10-Benzol/Methanol-Lösungsmittel bestätigt. Das Produkt wurde auch mit einem Ninhydrinspray und mit einem Fluorescaminspray auf primäre Amingruppen getostet. Die Ausbeute bstrug 25/6. Es wurde festgestellt, daß das Produkt die folgende Struktur hatte:

. N(CH₂) CH₃H

Das Verfahren wurde unter Verwendung von Äthylendiamin wiederholt, wodurch das entsprechende Äthylendiaminanaloge von östron erhalten wurde.

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ZS 27282U

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von 4-[N-Imidazoyl]-benzylarcin.

a) Herstellung von 4-[N-Imidazoyl]-benzonitril:

30 mMol [2- C]-Imidazol wurden in 2,5 ml Chloroform aufgelöst und mit 18 ml Dimethylformamid vermischt, welche 30,2 mMol p-Fluorbonzonitril und 3,2 g Na₂CO, enthielt. Das Gemisch wurde 3 Tage bei 125°C gerührt (Johnson, "J. Med. Chem.", Band 12, Seite 1024 (1969)). Das Produkt wurde isoliert und zweimal aus Benzol:Hexan (1 : 1) umkristallisiert. Ausbeute 4856; Fp 152 bis 154⁰C; Elementaranalyse: gefunden: 70,8556 C, 4,1396 H und 24,81# N; theoretisch: 70,9996 C, 4,1796 H und 24,8496 N.

b) Herstellung von Benzylamin:

Natrium-bis-(2-methoxyäthoxy)-aluminiumhydrid wurde dazu verwendet, um das obige Nitril in Toluol nach der Methode von Bazant et al. "Tetrahedron Letters" (1968), Seite 3303, zu reduzieren. Nach 4-stündlgem Rückflüssen wurde das Reaktionsgemisch abgekühlt und mit Wasser versetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die Wasserphase wurde kontinuierlich 20 h lang mit Benzol extrahiert. Die Dünnschichtchromatographie der kombinierten organischen Phasen auf Aluminiumoxidschichten mit Benzol-Methanol-Triäthylamin (94:5:1) als Lösungsmittel lieferte drei Flecken. Der Flecken am Be-

ginn hatte 75% der C-ZÖhlungen und lieferte einen positiven Test für primäres Amin mit dem Fluorescaminspray (Ausgangsnitril). Imidazol und Benzylamin hatten Rc-Werte von 0,66, 0,09 und 0,37.

T09882/0791

Claims

Patentansprüche

1. Zur Verwendung bei der Affinitätschromatographie geeignetes Polymeres, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polymeres von (1) mindestens einem Aminimid der allgemeinen Formel:

worin R₁ und R«, die gleich oder vorschieden sind, für Niedrigalkyl stehen, R, für eine organische Gruppe, vorzugsweise Niedrigalkyl, Hydroxyalkyl, Phenyl oder Polyojrypropylen steht und Z für den Rest einer polymerisierbaren Vinylverbindung 3teht,

2. Polymeres nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aminimid 1,1-Dimethyl-1-(2-hydroxyoctyl)-aminmethacrylimid ist und daß die Vinylverbindung Chlormethylstyrol ist.

3. Polymeres nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Aminiig&nd, der Bindungsstellen für die AffinitätsChromatographie liefert, an das Polymere durch Umsetzung des Amins mit einem Teil der daran hängenden Halogenmethylgruppen gekuppelt ist und daß der Rest

709882707*1

27282U

der daran hängenden Halogenmethylgruppen mit einem Ainin umgesetzt wird, welches eine daran hängende hydrophile Gruppe aufweist.

4. Polymeres nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Aminligand, der Bindungsstellen für die Affinitätschroraatographie liefert, an das Polymere durch Umsetzung des Amins mit einem Teil der daran hängenden Halogenmethylgruppen angekuppelt ist.

5. Polymeres nach Anspruch 3_f dadurch gekennzeichnet, daß das eine hydrophile Gruppe enthaltende primäre Amin Monoäthanolamin ist.

6. Polymeres nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminligand

-NH₂

7. Polymeres nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminligand 4-(N-Imidazoyl)-benzylamin mit der Strukturformel:

J7O98827Ü78T

50 -

27282U

8. Polymeres nach Anspruch 3, dadurch

zeichnet, daß der Aminllgand

g e k e η η -

N(CH₂)₂NH₂

9. Polymeres nach Anspruch 3, dadurch g e k e η η

zeichnet, daß der Aminllgand

N(CH₂)

■ 709882/0781 ist_f worin χ den Wert 2 oder 6 hat.

- yi -

10. Polymeres nach Anspruch 3_t dadurch zeichnet, daß der Aminiigand

27282U

g e k e η η -

3^ΛΠ2

11. Polymeres nach Anspruch 3» dadurch zeichnet, daß der Aminligand

g e k e η η -

CH.-R
²

-(CH₂)₆NH-CH₂

ist, worin R für Hydroxyl, Phosphonyl oder Adenosindiphosphat steht.

709882/Ö781

°. 27282U

12. Für die Affinitätschromatographie geeignetes System, dadurch gekennzeichnet , daß es eine Säule eines Trägermaterials umfaßt, welches mit dem Polymeren gemäß Anspruch 3 beschichtet ist.

13· System nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial aus Glasperlen besteht.

14. Für die Affinitätschromatographie geeignetes System, dadurch gekennzeichnet , daß es eine Säule aus dem Polymeren gemäß Anspruch 3 umfaßt.

15. Für die AffinitätsChromatographie geeignetes System, dadurch gekennzeichnet , daß es eine Säule eines Trägermaterials umfaßt, welches mit dem Polymeren gemäß Anspruch 4 beschichtet 1st.

16. Für die Affinitätschromatographie geeignetes System, dadurch gekennzeichnet, daß es eino Säule des Polymeren gemäß Anspruch 4 umfaßt.

17. Verfahren zum Beschichten eines Trägers mit einem Polymeren, wobei der beschichtete Träger zur Verwendung für die Affinitätschromatographie geeignet ist, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Träger mit einer Lösungsmittellösung des Polymeren gemäß Anspruch 4 kontaktiert, daß man das Lösungsmittel entfernt und daß man den beschichteten Träger mit einem Nicht-Lösungsmittel für das fertige Polymere, enthaltend ein primäres Amin mit einer daran hängenden hydrophilen Gruppe, kontaktiert, wobei sich das Amin mit dem Rest der Halogenmethylgruppen

7O9882/Ö7Ö1

27282U

umsetzt und die Bindung zwischen den Polymeren und dem Träger verstärkt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Nicht-Lösungsmittel für das Polymere Monoäthanolamin enthält.

19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß der Träger aus Glasperlen besteht.

20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Aminimid 1,1-Dimethyl-1-(2-hydroxyoctyl)-aminmethacrylimid ist, daß die Vinylverbindung Chlormethylstyrol ist und daß der primäre Aminligand

21. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch g e k e η η zeichnet , daß das Aminimid 1,1-Dimethyl-1-(2-hydroxyoctyl)-aminmethacrylimid ist, daß die Vinylverbindung ein Chlormethylstyrol ist und daß der primäre Aminligand

709882/Ü78T

27282H

CH₂ - NH₂

22. Affinitätschromatographieverfahren, dadurch g e kennzeichnet , daß das Adsorbens das System gemäß Anspruch 12 umfaßt.

23. Affinitätschromatographieverfahren, dadurch g e kennzeichnet, daß das Adsorbens das System gemäß Anspruch 14 umfaßt.

24. Affinitätschromatographieverfahren, dadurch g e kennzeichnet , daß das Adsorbens das System gemäß Anspruch 15 umfaßt.

25. Affinitätschromatographieverfahren, dadurch g e kennzeichnet, daß das Adsorbens das System gemäß Anspruch 16 umfa0t.

26. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das Chromatographieverfahren ein Hochdruck-FlUssigkeits-Chromatographieverfahren ist.

BR/WK/rm

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