DE3884529T2

DE3884529T2 - Leader-anteile zur produktion von rekombinanten proteinen.

Info

Publication number: DE3884529T2
Application number: DE88902750T
Authority: DE
Inventors: Charles Cohen; James Huston; Peter Keck; Richard Ridge
Original assignee: Creative Biomolecules Inc
Current assignee: Creative Biomolecules Inc
Priority date: 1987-03-20
Filing date: 1988-03-04
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2008-03-05
Also published as: JP2535066B2; JPH01503117A; DE3884529D1; EP0305481B1; CA1334943C; WO1988007086A1; AU1482488A; EP0305481A1; AU601273B2

Description

Stand der Technik

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die gentechnologische Herstellung von Polypeptiden und deren Reinigung. Insbesondere bezieht sie sich auf gentechnologisch hergestellte Fusionspolypeptide, die eine neuartige, amphiphile α-Helix Aminosäuresequenz enthalten, die zur Förderung eines hohen Ausbildungsgrades sowie für die Isolierung und Reinigung des Fusionsproduktes nützlich ist.
Fortschritte in der DNA Rekombinationstechnologie, mit der es möglich ist, fremde Gene in verschiedene Zellen einzubauen, haben die Ausbildung von zellfremden Produkten ermöglicht. Das betreffende Protein wird oft durch intrazelluläre Enzyme abgebaut, und seine Abtrennung von anderen Stoffen, die durch Bausteine des Wirtsorganismus exprimiert wurden oder diese enthalten, kann schwierig sein. Ein Schutz vor intrazellulärem Abbau kann durch Fusion einer Sequenz von Aminosäuren mit dem Zielprotein erreicht werden, um eine enzymatische Verdauung innerhalb der Zelle zu vermeiden. Außerdem kann das Fusionsprotein dazu bestimmt sein, die Isolierung und Reinigung zu vereinfachen, wenn das gewünschte Protein mit einem Polypeptid fusioniert ist, dessen Eigenschaften bei der Reinigung nutzbar gemacht werden können.
Das Fusionsprodukt wird durch DNA kodiert, die das für das betreffende Protein kodierende Gen enthält, das mit einer für ein Polypeptid kodierenden DNA Sequenz anders gekoppelt ist als das betreffende Protein. Die Fusionsmethodik ist ausführlich diskutiert worden und unter Fachleuten allgemein bekannt. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0047600 offenbart z. B. ein Verfahren zur synthetischen Herstellung eines Rinderwachstumshormons durch Herstellung eines Fusionsproteins und Reinigung des Wachstumshormons vom Nährmedium des Wirtsorganismus.
Auch andere Proteine sind durch Fusionstechniken hergestellt worden.
Es ist allgemein bekannt, daß ein für eine Spaltungsstelle kodierendes genetisches Material zwischen der für das gewünschte Protein kodierenden DNA und der für das zusätzliche, fusionierte Material kodierenden DNA eingebaut werden kann. Exprimiert wird ein Vorläuferprotein, das die Aminosäuresequenz des Zielpolypeptids enthält, das mit einer oder mehreren, eine ausgewählte Spaltungsstelle und eine andere Aminosequenz bestimmenden Aminosäure(n) gekoppelt ist (siehe z. B. EPO 0035384, EPO 0161937 und EPO 0163573).
Das Fusionsprodukt kann auch einen Anteil zur Vereinfachung seiner Isolierung enthalten (siehe z. B. PCT 84/03103 und U.S. 4,431,739).
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Methode zur gentechnologischen Herstellung, Isolierung und Reinigung von Proteinen. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung einer Methode zur Herstellung der betreffenden Proteinrekombinante in verbesserter Ausbeute. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung einer Methode, die sich an jedes betreffende Polypeptid anpassen läßt, das für einen Wirtsorganismus kodiert und durch diesen exprimiert werden kann. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung einer neuartigen Familie von Leadersequenzen, die zu einem hohen Exprimierungsniveau führen und das enthaltene Fusionspolypeptid veranlassen, im zellulären Wirt unlösliche Aggregate (Einschlußkörperchen) zu bilden, und die eine Resolubilisierung und Reinigung des fusionierten Polypeptids erlauben. Noch ein Ziel ist die Bereitstellung eines solchen Verfahrens, das sowohl wirkungsvoll als auch kostengünstig ist.
Diese und weitere Ziele der Erfindung sind im folgenden aus Beschreibung, Zeichnung und Ansprüchen ersichtlich.

Zusammenfassung der Erfindung

Allgemein kennzeichnet die Erfindung ein Verfahren, das die spontane Bildung unlöslicher Aggregate oder Einschlußkörperchen, die reich an dem betreffenden Zielpolypeptid sind, innerhalb einer rekombinanten Wirtszelle, die in der Lage ist, das Zielpolypeptid zu exprimieren, fördert. Die Erfindung stellt in ihren verschiedenen Gesichtspunkten ein rekombinantes Fusionsprotein, die für das Fusionsprotein kodierende, rekombinante DNA sowie Verfahren zur Herstellung der betreffenden Polypeptide unter Verwendung dieser Reagenzien bereit. Das Fusionsprotein enthält ein Zielpolypeptid, das mit einem angekoppelten Polypeptid verbunden ist, das entweder eine Leader- oder Trailersequenz sein kann (entweder an das Amino- oder das Carboxylende des Ziels gebunden), und das in wäßriger Lösung eine amphiphile α-Helix-Struktur mit einer zentralen Achse und gegenüberliegenden, hydrophilen und hydrophoben Seitenflächen aufweist, wobei die hydrophobe Fläche axial benachbarte, unpolare Aminosäurereste und die hydrophile Fläche axial benachbarte, geladene Aminosäurereste aufweist, das Fusionsprotein innerhalb eines Wirtsorganismus spontan unlösliche Aggregate bildet, das angekoppelte Polypeptid ein prolinfreies Polypeptid folgender Struktur aufweist:
(N-C-S-N-S-C-N)b,
worin b eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist, N ein Vertreter aus der Gruppe unpolarer Aminosäurereste ist, und alle N zusammen die hydrophobe Fläche ausmachen, C ein Vertreter aus der Gruppe der geladenen Aminosäurereste ist, und alle C zusammen die hydrophile Fläche bilden,
S ein Vertreter aus der Gruppe der hydrophilen, neutralen Aminosäurereste ist,
und worin bis zu 2 der genannten N-, C- und S-Reste unabhängig voneinander Histidin sein können.
Bei Verwendung als Leadersequenz in prokaryotischen Zellausbildungssystemen führt die für die amphiphile Helix kodierende DNA zu einer starken Ausbildung, d. h. zur Herstellung von Fusionspolypeptid, das mindestens 10% der gesamten Proteinausbildung der Zelle aufweist, typisch 30 bis 40% und gelegentlich sogar 50%. Das Fusionsprotein ist gekennzeichnet durch die Fähigkeit, spontan innerhalb des Wirtszellorganismus, in dem es ausgebildet wird, unlösliche Aggregate zu bilden und so die Herstellung und Isolierung des Produktes zu vereinfachen.
Das angekoppelte Polypeptid des Fusionsproteins ist ein prolinfreies Polypeptid folgender Struktur:
(N-C-S-N-S-C-N)b
worin jedes N ein unpolarer Aminosäurerest,
jedes C ein geladener Aminosäurerest,
jedes S ein neutraler Aminosäurerest,
b eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist, und bis zu zwei der Aminosäurereste in jedem Repetiersegment Histidin sein können.
Alle geladenen Aminosäurereste zusammen machen die hydrophile Fläche und alle unpolaren Aminosäurereste zusammen die hydrophobe Fläche aus, wenn das Polypeptid seine Helixkonformation einnimmt.
Bevorzugte unpolare, geladene und verbindende Reste werden sowohl durch die Art des Restes, z. B. N, C oder S, als auch durch die Fähigkeit zur Helixbildung bestimmt, wie in der Literatur über Proteinsekundärstruktur dargelegt und in Tabelle 1 aufgeführt ist. Tabelle 1 Bevorzugter Aminosäurerest in Abhängigkeit von der Tendenz zur α-Helixbildung Restgruppe N C S
* Tendenz zur Helixbildung wie in der Literatur über Proteinsekundärstruktur von Fasman und Chou, Ann. Rev. Biochem., 1978, 47, S. 251-76 erklärt. Unter einem Wert von 1,00 neigen die Reste zur Helixspaltung.
Bevorzugte unpolare Reste für die Verwendung in amphiphiler α-Helixstruktur sind Methionin, Alanin, Leucin, Phenylalanin, Tryptophan, Isoleucin und Valin. Aus dieser Reihe werden aus sterischen Gründen bei der Helix-Helix Aggregation vorzugsweise Alanin und Leucin verwendet. Bevorzugte geladene Reste sind Glutaminsäure, Lysin und Asparaginsäure. Als Nebenrest bevorzugt (in der obengenannten Formel als S bezeichnet) wird Glutamin. Asparagin ist auch verwendet worden, obwohl es ein schwacher Helixbildner ist. Im allgemeinen kann ein Rest, der ein schwacher Helixbildner ist, toleriert werden, vorausgesetzt der überwiegende Teil der Helix weist bekannte, gute Helixbildner auf. Dies trifft jedoch nicht auf Prolin zu, das bekanntermaßen die Helix unterbricht.
In vielen Fällen wird bevorzugt, daß alle 7 Aminosäuresegmente der Helix sowohl eine anionische Aminosäure als auch eine kationische Aminosäure enthalten, damit die hydrophile Fläche auf der einen Seite des Zylinders der amphiphilen Helix eine neutrale Gesamtladung aufweist. In anderen Fällen, insbesondere wenn das Zielpolypeptid Aminosäurereste aufweist, die gemeinsam dem Zielpolypeptid eine Gesamtladung verleihen, werden für die geladenen Gruppen in einem Segment oder mehreren Segmenten der Helix entgegengesetzte Ladungen gewählt, so daß das Fusionsprotein im Endeffekt neutral ist. Außerdem führt die Plazierung von negativ geladenen Gruppen am N-ständigen (+) Ende und von positiv geladenen Gruppen am C-ständigen (-) Ende des Polypeptids zur Bildung von Dipolen, verteilt über die Peptidbindungen entlang der Helix, wodurch die Stabilität der Helix gefördert wird (siehe Shoemaker et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, S. 2349-2353).
Histidin kann an verschiedenen Stellen in den Helixsegmenten verwendet werden, da es in sauren oder neutralen Lösungen eine geladene, kationische Form annimmt und in basischen Lösungen neutral ist. Geladenes Histidin ist auch hydrophil. Ein histidinhaltiges Oligomer der Helix kann Einschlußkörperchen bilden, die leicht zu reinigen sind. Wenn eine Lösung mit gelösten Einschlußkörperchen nacheinander bei zwei verschiedenen pH Werten durch Ionenaustauscher durchgeleitet wird, kann z. B. eine beträchtliche Konzentration von Fusionsprotein erreicht werden.
Die erfindungsgemäße Methode umfaßt das Einfügen von DNA, die für das Fusionsprotein kodiert und in der Lage ist, dieses in einen zellulären Wirt zu exprimieren, diesem die Ausbildung des Fusionsproteins in Form von Einschlußkörperchen erlaubt, die Abtrennung der Einschlußkörperchen vom zellulären Wirt sowie die Spaltung des Fusionsproteins zur Freisetzung des Zielpolypeptids.
Wenn der Leader des Fusionsproteins His enthält, kann das Fusionsprotein vorteilhaft von verschiedenen anderen Proteinen in der Zelle abgetrennt werden, und zwar durch Auflösung der Einschlußkörperchen in Medien mit einer zweiten, anderen Ionenkonzentration oder einem anderen pH Wert.
Die Tendenz zur Zusammenlagerung von neutralen, amphiphilen Helicen wird bei Medien mit hoher Ionenkonzentration aufgrund der erhöhten Wechselwirkung der hydrophoben Flächen und bei Medien mit geringer Ionenkonzentration aufgrund der erhöhten Wechselwirkung der hydrophilen Flächen verstärkt. Durch die Fähigkeit, die komplette Ladung von His-haltigen Helices durch Änderung des pH Werts zu verändern, werden diese beiden Effekte der Zusammenlagerung modifiziert. Die Löslichkeit von histidinhaltigen Helices ist oft abhängig vom pH Wert.
Die gegenwärtig bevorzugten Helixstrukturen umfassen folgende Aminosäuresequenzen:
(Ala-Lys-Asn-Leu-Asn-Glu-Ala)d;
(Ala-Lys-Gln-Leu-His-Asp-Ala)d;
(Ala-His-Asn-Leu-Asn-Glu-Ala)d und
(Ala-Lys-Gln-His-Gln-Glu-Ala)d,
worin d eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung sind im folgenden aus der Beschreibung sowie den Abbildungen und Patentansprüchen ersichtlich.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung der Sekundärstruktur der erfindungsgemäßen, amphiphilen Helix, die zur Erklärung der Eigenschaften der Helix hilfreich ist.
Abbildung 2 ist eine schematische Darstellung der Helix aus Abbildung 1, in der die unpolaren und polaren Flächen der erfindungsgemäßen Helices abgebildet sind.
Abbildung 3 ist eine Darstellung der Struktur der fusionierten DNA, des Fusionsproteins und des Zielproteins, in der die bei der Durchführung der Erfindung auf der Molekülebene ablaufende Serie von Veränderungen gezeigt wird.
Abbildung 4 ist eine schematische Darstellung des gesamten, erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Abbildungen 5, 6 und 7 sind Darstellungen der Löslichkeit der drei Prototyp-Helices in Abhängigkeit vom pH-Wert, wobei die Löslichkeit ausgedrückt wird als der Teil des Peptids, der in die wäßrige, mobile Phase einer HPLC Säule mit hydrophoben Mitteln aufgetrennt wird. Die Auswirkung des pH-Werts auf die Löslichkeitseigenschaften der einzelnen Helices wird dadurch dargestellt. In diesen Abbildungen werden die verwendeten Puffersysteme durch folgende Symbole dargestellt:
- 10 mM Phosphat, Natriumion variabel von 10 mM bis 20 mM;
- 10 mM Azetat, Natriumion variabel von 5,3 mM bis 9,5 mM;
- 10 mM Phospat, 10 mM Azetat, Natriumion variabel von 0 mM bis 20 mM;
+ - 5 mM Phospat, 5 mM Pyrophosphat, Natriumion variabel von 10 mM bis 20 mM;
- 5 mM Phosphat, 5 mM Pyrophosphat, 20 mM Natriumion, Azetation variabel von 12 mM bis 0,8 mM.

Beschreibung

Bisher wurden die betreffenden Proteine durch Ausbildung eines Fusionsproteins, das entnommen, gereinigt und dann zur Entfernung des fremden Teils des Moleküls gespaltet wird, in Wirtszellen hergestellt. Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbesserung und nicht naheliegende Verfeinerung der allgemeinen Methode dar. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt im allgemeinen die Herstellung einer rekombinanten DNA, die bei Ausbildung in einem geeigneten Wirt, z. B. in prokaryotischen Zellen wie E. coli, im Überfluß ein Fusionspolypeptid erzeugt. Dieses Fusionspolypeptid besitzt unter anderen vorteilhaften Eigenschaften die Fähigkeit, im Wirtszellenorganismus spontan intrazelluläre Einschlußkörperchen zu bilden. Auch kann das Fusionspolypeptid so gestaltet sein, daß es aufgrund anderer, weiter unten beschriebener Eigenschaften des Moleküls wirksam gespalten werden kann.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Vorstellung, daß die intrazelluläre Stabilität und die Entnahme des Fusionsproteins verbessert werden könnten, wenn das betreffende Polypeptid direkt oder über eine Kopplungssequenz mit einem angekoppelten Polypeptid mit außergewöhnlichen Eigenschaften verknüpft wäre, vorzugsweise an seinem aminoständigen Ende. Insbesondere könnte das angekoppelte Polypeptid zu einem hohen Exprimierungsgrad führen, die Bildung von unlöslichen Einschlußkörperchen innerhalb der produzierenden Wirtszelle fördern und als Hilfe bei der Reinigung des Fusionsproteins vor der Spaltung genutzt werden. Die allgemeine Methode der Erfindung umfaßt den Aufbau der DNA Rekombinante, die ein Fusionspolypeptid kodiert, das bei Ausbildung zur Exprimierung einer mit einem Zielprotein verknüpften, amphiphilen α- Helix-Polypeptidstruktur führt, d. h. zu einem betreffenden Protein von eventuellem oder nachweislichem Nutzen.
Die DNA ist somit dazu bestimmt, eine Aminosäuresequenz zu kodieren, die bei Ausbildung und Vorliegen in wäßriger Lösung eine vorzugsweise ausgeprägte α-Helix bildet. Die Helix weist vorzugsweise ein(e) oder mehrere Einheit(en) oder Segment(e) auf, von denen wiederum jede(s) sieben Aminosäuren der allgemeinen Struktur NCSNSCN enthält. Der Buchstabe N bezieht sich allgemein auf unpolare, hydrophobe Aminosäurereste; der Buchstabe C bezieht sich allgemein auf geladene, hydrophile Aminosäurereste; der Buchstabe S bezieht sich auf Nebenaminosäurereste.
Bei diesem Typ der Helixstruktur hat jedes Segment somit drei unpolare und zwei geladene Reste. Alternativ dazu kann die Helix die Struktur CNSCSNC aufweisen. In diesem Fall hat jedes Segment zwei unpolare und drei geladene Reste. Eine solche Struktur hat einen hydrophileren Charakter, bezogen auf die bevorzugte NCSNSCN Sequenz, und diese Eigenschaft kann bei der Verleihung von Löslichkeit an von Natur aus wasserunlösliche Zielproteine von Vorteil sein. Wenn erwünscht, können verschiedene Segmente der Helix eine unterschiedliche, spezifische Aminosäuresequenz aufweisen. Selbstverständlich könnten die allgemeinen Formeln der erfindungsgemäßen Helices auch durch eine "phasenverschobene" Kennzeichnung dargestellt werden. So entsprechen Helices, die zum Beispiel durch die Formeln CSNSCNN oder SNSCNNC dargestellt werden, der hier offenbarten, bevorzugten Strukturbezeichnung. Ferner ist, obwohl vorzugsweise jedes C in jedem Segment eine geladene Aminosäure und jedes N eine unpolare Aminosäure aufweisen sollte, gelegentlich die Verwendung anderer Aminosäurearten zulässig, vorausgesetzt, daß die Ersatzaminosäuren einigermaßen gute Helixbildner sind und somit die α-Helixstruktur des angekoppelten Polypeptids nicht wesentlich verändern.
Wenn das Protein seine Sekundärkonfiguration einnimmt, ist das Ergebnis eine α-Helix mit gegenüberliegenden Flächen von unterschiedlichem Charakter. Die eine Fläche weist naheliegende, geladene Reste auf, wodurch dieser Seite des Helixzylinders hydrophile Eigenschaften verliehen werden. Die gegenüberliegende Seite weist naheliegende, hydrophobe Aminosäurereste auf, wodurch der gegenüberliegenden Seite hydrophobe Eigenschaften verliehen werden. Die Nebenreste (oder S Reste) sind vorzugsweise ungeladene, hydrophile Aminosäuren, deren Funktion in erster Linie darin besteht, die hydrophoben und hydrophilen Seitenflächen der Helix zu verbinden.
Histidin (His) ist unter den Aminosäuren insofern einzigartig als es, in Abhängigkeit vom Medium, in dem es vorliegt, kationisch oder neutral sein kann. Es kann anstelle des zentralen, unpolaren Restes in dem Segment mit sieben Aminosäuren, aus dem die Helix gebildet ist, als geladene Gruppe, als Nebengruppe oder überhaupt nicht verwendet werden, je nachdem, welche Helixeigenschaften gewünscht werden. In sauren Medien nimmt der Histidinrest ein Proton auf und wird positiv geladen und hydrophil. In basischen Medien bleibt der Histidinrest neutral und wird etwas hydrophil. Die Verwendung von Histidin in der Helixstruktur ermöglicht eine Veränderung der Gesamtladung und Löslichkeit der einzelnen Helixmoleküle durch Veränderung des pH Wertes der Lösung.
Die allgemeine Struktur der Helix ist in Abbildung 1 dargestellt. Wie abgebildet, kann die Helix wie um einen Zylinder (10) gewickelt dargestellt werden. Die Windung besteht aus einer Kette von Aminosäuren, die wie oben dargelegt, als N, C und S bezeichnet werden. Das Protein ist so strukturiert, daß auf der kreuzweise schraffierten Fläche (12) des Zylinders (10) nur die Reste C oder S erscheinen, während auf der gegenüberliegenden Fläche nur N oder S Reste erscheinen, und im allgemeinen die S Reste zwischen einer Fläche liegen, auf der C Reste oder geladene Reste vorherrschen, und der anderen Fläche, die überwiegend N oder unpolare Reste aufweist.
Durch Verwendung des Segments mit den sieben Aminosäuren als Repetiereinheit wird eine minimale Rotation um die zentrale Achse des Zylinders (14) der geladenen, hydrophilen Fläche (gekennzeichnet durch räumlich an die Helix angrenzende, geladene Aminosäurereste) sowie der unpolaren Fläche, die durch die räumlich angrenzenden unpolaren Reste gekennzeichnet ist, erreicht. Somit sind die Aminosäuren, die die hydrophilen, geladenen Flächen bestimmen, sowie die Aminosäuren, die die unpolaren Flächen bestimmen, immer auf den gegenüberliegenden Seiten des Zylinders der Helix angeordnet, wie schematisch in Abbildung 2 dargestellt ist, obwohl aufgrund der Geometrie der α- Helix beide Flächen eine leicht nach links verdrehte Helix aufweisen.
Die für den Einsatz in der Helix bevorzugten, unpolaren Reste sind Phenylalanin (Phe), Leucin (Leu), Alanin (Ala) und Tryptophan (Trp). Isoleucin (Ile), Valin (Val) und Methionin (Met) können auch verwendet werden. Prolin (Pro) ist auch unpolar, hat aber eine Seitenkette, die sich in einer Schleife wieder mit der Hauptkette verbindet, wodurch die Hauptkette gebogen und das Proton auf dem peptidgebundenen Stickstoff (wichtig für die Bildung der Wasserstoffverbindung) eliminiert wird, was zur Spaltung der α-Helixstruktur führt. Infolgedessen wird es vorzugsweise nicht in der Struktur der Helix eingesetzt. Die für den Aufbau der Helix brauchbaren, hydrophilen Aminosäuren sind die anionischen Aminosäuren Glutaminsäure (Glu) und Asparaginsäure (Asp) sowie die kationische Aminosäure Lysin (Lys), die dem Arginin (Arg) vorgezogen wird. Als nützliche Seitengruppen beim Aufbau der Helix werden Asparagin (Asn) und Glutamin (Gln) bevorzugt. Zystein (Cys) ist auch eine brauchbare, hydrophile Aminosäure, wird jedoch normalerweise als Seitengruppe nicht verwendet, weil es Dilsulfidverbindungen bilden kann und dadurch möglicherweise die Helixstruktur zerreißen und die Spaltung und Reinigung des Endprodukts erschweren kann.
Die Helix ist so gestaltet, daß in Medien mit hoher Ionenkonzentration, z. B. wäßrige Lösungen mit relativ hohen Konzentrationen geladener Spezies, die hydrophoben Flächen der Helices in getrennten Molekülen aufeinander einwirken und Micellen bilden. Umgekehrt herrschen in Medien mit niedriger Ionenkonzentration ionische oder hydrostatische Wechselwirkungen vor, und es werden wieder Aggregate gebildet. Zwischen diesen Extremen liegen die Bedingungen, unter denen das Fusionsprotein löslich ist.
Die Verwendung von Histidin als eine S Aminosäure, wenn ein C eine kationische und das andere eine anionische Aminosäure ist, führt zu einer Helix, die eine positive Gesamtladung bei niedrigem pH Wert aufweist und demzufolge durch elektrostatische Abstoßung daran gehindert wird, Aggregate zu bilden. Mit steigendem pH Wert, z. B. über 7, verliert der Histidinanteil ein Wasserstoffion und wird neutral. Die Helix hat dann eine neutrale Gesamtladung, die die Bildung von hydrophoben Aggregaten erlaubt. Solch eine Helix, die in einer E. coli Zelle exprimiert ist, führt zur Bildung von Einschlußkörperchen im intrazellulären pH Bereich, z. B. 7,6. Diese können gesammelt und in einem sauren Medium, z. B. bei einem pH Wert von 5, verteilt werden, bei dem sich das Fusionsprotein auflöst, wodurch weitere Behandlungen, einschließlich der Spaltung, erleichtert werden.
Die Anzahl der im Einzelfall verwendeten Einheiten der Helix wird unter Berücksichtigung der Größe und Löslichkeitseigenschaften des Zielpolypeptids empirisch bestimmt. Im allgemeinen sollte eine ausreichende Anzahl von Einheiten verwendet werden, um zu gewährleisten, daß die Löslichkeitseigenschaften der Helix vorherrschen. Zum Beispiel würde zur Erzielung der besten Ergebnisse ein großes, im wesentlichen neutrales Zielprotein mit einer Helix verbunden, die aus mindestens 10 Segmenten besteht. Umgekehrt sind für kleinere Proteine mit zum Beispiel 50 Aminosäuren weniger Repetiereinheiten erforderlich.
Ein anderer Aspekt beim Aufbau der Helix betrifft die Auswirkung der Ionenabstoßung unter den einzelnen Helices. In den meisten Fällen wird bevorzugt, daß eine der geladenen Aminosäuren anionisch und die andere kationisch ist, so daß die Gesamtladung neutral ist. Wie oben erwähnt, können die Ladungseigenschaften durch Einbringen von Histidin vom pH Wert abhängig gemacht werden. Die Ausnahme von dieser allgemeinen Regel liegt vor, wenn das Zielprotein selbst eine bedeutende Gesamtladung aufweist. In diesem Fall kann die intrazelluläre Bildung von Einschlußkörperchen durch Gestaltung einer Helix mit geladenen Gruppen, die durch entsprechende Auswahl der C Reste die Ladung am Zielprotein neutralisieren, begünstigt werden.
Die gesamte Struktur der bevorzugten, erfindungsgemäßen DNA, das durch sie kodierte Fusionsprotein und das daraus hervorgehende Zielpeptid sind schematisch in Abbildung 3 dargestellt. Die Referenzmerkmale in der DNA werden in das Protein als entsprechende, sensibilisierte Merkmale übertragen. Die DNA ist aus zwei ausgeprägten, miteinander verbundenen Nukleotidsequenzen zusammengesetzt. Die erste Sequenz kodiert ein Polypeptid, von dem der größte Teil oder alles schließlich entfernt wird. Verbunden mit dem 3' oder 5' Terminus der ersten Sequenz kodiert die DNA ein Zielpolypeptid, das betreffende Protein, das schließlich geerntet wird. In der Abbildung ist 3' der regulatorischen Sequenzen eine erste DNA Sequenz (8), die für drei Untersequenzen kodierende Nukleotide aufweist:
1) eine Sequenz (18), die die obenbeschriebene, erfindungsgemäße, amphiphile Helix enthält, eine hier als "Angel" oder "Angelbereich" bezeichnete Sequenz (16) und eine einen Spaltungsort kennzeichnende Aminosäure oder Aminosäuresequenz (14). Auch eine für eine weitere Aminosäuresequenz kodierende DNA (nicht abgebildet) kann dazugehören. Angehängt an die den Spaltungsort (14) kodierende DNA ist die das betreffende Protein kodierende DNA (22).
Das kodierte Fusionsprotein besteht aus der angekoppelten, amphiphilen Helix (18'), einem Angelbereich (16'), einem Spaltungsort (14') und dem Zielprotein (22'). Nach Entnahme und Reinigung des Schmelzproteins, gegebenenfalls unter Ausnutzung der Eigenschaften der Helix (18'), wird das Fusionsprotein am Spaltungsort (14') gespalten. Man erhält das Produkt 22''. Die Angel (16') und der Spaltungsort (14'), wie die Helix (18'), werden durch Manipulation der DNA eingefügt. Der Spaltungsort (14') dient als Aktionsort für ein vorher ausgewähltes Spaltungsmittel. Der Angelbereich (16') dient zur Verbesserung der Geschwindigkeit und/oder Spezifität der Spaltungsreaktion.
Die Verfahren zur Manipulation, Erweiterung und Rekombination von für die betreffenden Aminosäuresequenzen kodierender DNA sind Stand der Technik und werden daher hier nicht näher beschrieben. Methoden zur Identifizierung und Isolierung von für die betreffenden Proteine kodierenden Genen oder zum Aufbau solcher Gene sind wohlbekannt und entwickelt. Diese Verfahren sind in der Patentliteratur und anderer Literatur beschrieben (siehe z. B. U.S. Patent Nr. 4,431,739). Im allgemeinen beziehen die Methoden die Auswahl des für Aminosäuren kodierenden, genetischen Materials ein, die das betreffende Polypeptid entsprechend dem genetischen Code bestimmen.
Demzufolge kann das hier offenbarte DNA Konstruktionsprinzip unter Verwendung von bekannten Konstruktionstechniken genutzt werden. Dazu gehören die Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen, die sequenzspezifische Einschnitte in der DNA hervorrufen und zu "blunt ends" oder kohäsiven Enden führen, DNA Ligasen, Techniken für den enzymatischen Zusatz von "sticky ends" zu DNA mit "blunt ends", Aufbau von synthetischen DNAs durch Zusammensetzen kurzer Oligonukleotide, Techniken für die Synthese von cDNA sowie von synthetischen Sonden für die Isolierung von Genen mit einer speziellen Funktion. Verschiedene Promotersequenzen und andere regulatorische DNA Sequenzen, die mit dem Ziel der Exprimierung verwendet werden, sowie verschiedene Arten von Wirtszellen sind ebenfalls bekannt und verfügbar. Herkömmliche Transfektionstechniken und gleichermaßen konventionelle Techniken zur Klonierung oder Unterklonierung von DNA sind in der praktischen Anwendung dieser Erfindung hilfreich und dem Fachmann bekannt. Verschiedene Vektorarten können verwendet werden, z. B. Plasmide und Viren, einschließlich Tierviren und Bakteriophagen. Die Vektoren können verschiedene Markergene benutzen, die einer erfolgreich transfektionierten Zelle eine erkennbare, phenotypische Eigenschaft verleiht, die dazu genutzt werden kann herauszufinden, welche aus einer Familie von Zellen die DNA Rekombinante des Vektors erfolgreich inkorporiert hat. In Anbetracht des vorgenannten Standes der Gentechnologie ist es dem Fachmann möglich, die hier offenbarte Erfindung entsprechend in die Praxis umzusetzen.
Eine Methode zum Erhalt der die verschiedenen, hier offenbarten Helixstrukturen kodierenden DNA ist das Zusammensetzen synthetischer Oligonukleotide in einem konventionellen, automatisierten Polynukleotidsynthesizer und anschließende Ligation mit geeigneten Ligasen. Zum Beispiel können überlappende, komplementäre DNA Fragmente mit 15 Basen durch Phosphoramiditchemie synthetisiert werden, wobei die Endsegmente unphosphoryliert bleiben, um eine Polymerisierung während der Ligation zu verhindern. Ein Ende der synthetischen DNA bleibt, entsprechend dem Aktionsort einer bestimmten Restriktionsendonuklease, als "sticky end" übrig. Das andere Ende bleibt so übrig wie es dem Aktionsort einer anderen Restriktionsendonuklease entspricht. Alternativ kann die helixkodierende DNA durch Synthetisierung längerer, einsträngiger Fragmente, z. B. 50-100 Nukleotide lang, zum Beispiel in einem Biosearch Oligonukleotidsynthesizer mit anschließendem Zusammenfügen der Fragmente erzeugt werden.
Wie in Abbildung 3 dargestellt, wird der Angelbereich (16') durch ein DNA Segment (16) kodiert. Der ausgebildete Angelbereich (16') ist vorzugsweise ein unstrukturiertes Segment, das neben dem oder am Spaltungsort (14') liegt und mindestens zwei Aminosäuren aufweist, die dazu dienen, den Spaltungsort einer enzymatischen oder anderen Verdauung auszusetzen. Diese Eigenschaft der Angel fördert die Zugänglichkeit des Spaltungsorts für Enzyme oder andere Spaltungsreagenzien in der Umgebung der Spaltungsreaktion und schafft einen kinetischen Vorteil für die bevorzugte Verdauung am (an den) Aminosäurerest(en), der (die) den Spaltungsort bildet (bilden).
Die die Angelregion enthaltende Aminosäuresequenz kann stark variieren. Sie enthält oft ein flexibles Segment, das dem Teil des fusionierten Polypeptids ungefähr am Spaltungsort die Fähigkeit verleiht, eine lockere, im allgemeinen ungefaltete Konfiguration einzunehmen. Die Kombination von angelbestimmenden Aminosäuren wird deshalb gewählt, weil so bei Vorliegen des Fusionspolypeptids in der Spaltungsumgebung dem enthaltenen Polypeptidanteil spezifische Sekundäreigenschaften verliehen werden.
Der Angelbereich weist Aminosäuren auf, die keine feste Tertiärkonformation einnehmen, die den Zugang des Spaltungsmittels zu seinem angrenzenden Aktionsort sterisch hindern könnte. Aus diesem Grund enthält die für die Helix verwendete Angel typischerweise mindestens einen Prolinrest und ist frei von Zysteinresten. Die Anwesenheit von einem oder mehreren Prolinrest(en) schließt im wesentlichen die Bildung einer α-Helixstruktur in der Angelregion aus. In diesem Fall dient das Prolin dazu, die mögliche sterische Störung der Spaltung, die durch den naheliegenden, helikalen Leader verursacht werden kann, einzuschränken. Andererseits enthält Zystein eine Sulfhydryl- oder Thiolgruppe, die hochreaktiv ist und Disulfidverbindungen bilden kann. Die Anwesenheit von Zystein kann dem erwünschten Fehlen fester Sekundär- oder Tertiärkonformationen der Angelregion entgegenwirken, und seine Verwendung wird deshalb vermieden.
Vorzugsweise ist die Angelregion eine Polypeptidkette, die etwa zwei bis zwanzig Aminosäuren enthält. Außer ihrer Eigenschaft, frei von Zystein zu sein und typischerweise mindestens einen Prolinrest zu enthalten, kann die Angelsequenz andere Gestaltungsstrategien nutzen, die eine wirkungsvolle Spaltung in der vorgewählten Spaltungsumgebung fördern. Insbesondere wenn das vorgewählte Spaltungsmittel eine Endopeptidase ist, ist es wichtig, daß die Angelregion in den wäßrigen Umgebungen löslich ist. Aminosäuren mit geladenen Seitengruppen und hydrophilen Eigenschaften sind zur Förderung der Löslichkeit in der Angel enthalten. Dazu gehören die anionischen Reste Glu und Asp, die kationischen Reste Arg und Lys sowie die neutralen, hydrophilen Reste Ser und Thr.
Weitere Einzelheiten der Angelregion werden in der mitanhängigen Anmeldung Aktenzeichen (des Anwalts CRP-008) offenbart, eingereicht am selben Tag mit der hier vorliegenden Anmeldung. Die Offenbarung wird hier durch Bezugnahme einbezogen.
Das Zielprotein (22') wird von dem verbleibenden Fusionsmaterial bevorzugt in aktiver Form (22'') befreit oder in einer Form, die sogleich ihre native Konformation wieder einnimmt, wenn der Spaltungsort (14') durch das ausgewählte Spaltungsmittel hydrolysiert wird. Die Spezifität der Spaltungsmittel wird durch die Identität der Sequenz der Aminosäuren an oder in der Nähe der zu hydrolysierenden Peptidbindung bestimmt. Ein bestimmtes Spaltungsmittel kann möglicherweise die Bindung zwischen zwei spezifischen Aminosäuren oder eine einer spezifischen Sequenz von Aminosäuren folgenden Bindung erkennen.
Von vielen Spaltungsmitteln ist die Spezifität bekannt In der folgenden Tabelle sind verschiedene, bekannte Spaltungsmittel und ihre Primäraktionsorte (in manchen Fällen auch die Sekundäraktionsorte) aufgeführt. Tabelle 2 Spaltungsmittel Hauptaktionsort Andere Aktionsorte Trypsin Arg, Lys Chymotrypsin Trp, Phe, Tyr Leu, Met, His Elastase Neutrale, aliphatische Reste Pepsin Phe, leu, Trp Ala, Gly, Glu Papain Arg, Lys, Gly Große Spezifität Subtilisin Aromatische und aliphatische Reste Verschiedene Thermolysin Aminogebundene Verbindungen von aliphatischen Resten Ala, Phe kS. aureus Protease Glu Asp Endoproteinase Arg Arg C (Submaxillaris Protease) Clostripain Arg Thrombin Arg Kollagenase X-Gly-Pro X-Ala-Pro X-Gly-Thr Lysobacter Enzymogene (Endoproteinase Lys-C) Lys Mysobacter Al-l Protease Armillaria mellea Flavobacterium meringosepticum Pro Faktor Xa Ile-Glu-Gly-Arg CNBr Met BNPS-skatol Trp N-Brombernsteinsäureimid O-Jodosobenzoesäure HBr/DMSO NTCB Cys Metallisches Natrium in flüssigem Ammoniak Pro Hydroxylamin Asn-Gly Verdünnte Säure Asp-Pro
Weitere Spaltungsmittel sind bekannt. Die für den Einsatz in der Erfindung bevorzugten sind Enzyme mit einem Primäraktionsort, die an der C-terminalen Seite des Spaltungsortrestes (für an der Aminoseite des Zielpolypeptids befestigte Haken) oder an der N-terminalen Seite des Spaltungsortrestes (für an der Carboxylseite des Zielpolypeptids befestigte Haken) spalten. Das/Der zur Zeit am meisten bevorzugte Spaltungsmittel/Spaltungsort ist S. aureus V-8 Protease/Glu. Wenn dieses System verwendet wird, sollte Asp anstelle von Glu als C Rest in der Helix eingesetzt werden.
Der Spaltungsort im Fusionsprotein kann im allgemeinen irgendeine Aminosäure oder eine Sequenz von Aminosäuren enthalten, die durch ein Spaltungsmittel, das für den Ort in einer geeigneten Umgebung spezifisch ist, gespalten werden kann. Durch Auswahl eines Spaltungsmittels mit einem im Zielpolypeptid nicht vorhandenen Aktionsort kann die Spezifität der Spaltung erhöht und die Wahrscheinlichkeit unerwünschter Spaltung innerhalb eines Zielproteins oder an einem anderen Ort im Fusionspolypeptid gesenkt werden.
Das Fusionspolypeptid wird vorzugsweise unter Bedingungen gespalten, unter denen es seine native Konformation eingenommen hat. Dadurch wird die Anwesenheit von möglichen Spaltungsorten im Zielpolypeptid verdeckt. Da es frei von Zystein ist (oder paarige Cys Reste aufweist), bleibt das angekoppelte Polypeptid frei von Disulfidbindungen an fremde Verunreinigungen, und sein Spaltungsort, unterstützt durch die Angel, bleibt für die Verdauung durch das Spaltungsmittel offen. Wird die Spaltung vollzogen, nachdem das Fusionspolypeptid renaturiert und oxidiert wurde, kann das Zielpolypeptid durch eine oder mehrere Disulfidbindung(en) in seiner Tertiärkonformation gehalten werden.
Die Erfindung unterliegt im wesentlichen keiner Einschränkung im Hinblick auf die Identität des unter Anwendung der hier offenbarten Verfahren und Elemente herzustellenden Zielproteins (22''). Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist in der Tat, daß sie ein allgemeines Verfahren bereitstellt, das sich zur Vereinfachung der Herstellung von Rekombinanten irgendeines gewünschten Proteins ohne weiteres anpassen läßt. So kann die vorliegende Erfindung zur Herstellung von Wachstumsfaktoren, Hormonen, Lymphokinen, Enzymen, Antikörpern oder deren verschiedener Fragmente, einschließlich enzymatisch aktiver und inaktiver Proteine, kurzer Polypeptide und der verschiedenen, analogen Substanzen von allen obengenannten verwendet werden. Zu den uneingeschränkten Beispielen gehören EGF, IGF-1, α- und β-TGF, Humankollaginaseinhibitor, PDGF, CTAP, Interleukine, Interferone, industrielle Enzyme, thrombolytische Mittel, virale Hüllproteine, bakterielle Eiweißhüllen, Protein A und dessen Fragmente sowie verschiedene synthetische Peptide.
Das gesamte Verfahren zur erfindungsgemäßen Herstellung von Protein ist schematisch in Abbildung 4 dargestellt. Die amphiphile Helix und andere rekombinante DNA, die den Spaltungsort und den Angelbereich bilden, geeignete regulatorische Sequenzen und das für das Zielpolypeptid kodierende Gen werden nach einer Methode aus der großen Vielfalt der obendargestellten, bekannten Methoden aufgebaut. Nach Zusammensetzung der DNA wird wieder unter Anwendung herkömmlicher Methoden ein Ausbildungsvektor für die Inkorporierung in eine geeignete Wirtszelle, zum Beispiel E. coli, konstruiert.
Der Ausbildungsvektor (100 in Abbildung 4) enthält typischerweise eine Transkriptionseinheit (102), entsprechend der DNA in Abbildung 3, und ein Markergen (104), das der Wirtszelle eine phenotypische Eigenschaft verleiht, wodurch eine Auswahl erfolgreich transformierter Klone möglich wird. Die das Fusionsprotein exprimierenden Klone werden dann in Massen gezüchtet, um eine große Population von Zellen mit intrazellulären Einschlußkörperchen zu erhalten (106 in Abbildung 4). Die Zellen werden dann mit herkömmlichen Methoden lysiert, und die Einschlußkörperchen werden zum Beispiel durch Zentrifugierung gesammelt. Nach Abtrennung der Einschlußkörperchen von löslichen Proteinen im Überstand können die Einschlußkörperchen durch eine Lösung mit geeigneter (geeignetem) Ionenkonzentration und/oder pH Wert, wodurch die Aggregate der amphiphilen Helix mit ihrem angehängten Zielprotein im allgemeinen wie oben beschrieben getrennt werden, wieder aufgelöst werden. In einigen Fällen können diese aufgelösten Einschlußkörperchen ohne zusätzliche Reinigung gespalten werden, und die Spaltungsfragmente können zwecks Ernte des betreffenden Produkts abgetrennt werden. Alternativ dazu kann das Fusionsprotein einer Reihe von Solubilisierungs- und Ausfällungsverfahren unterzogen werden, die dazu dienen, Verunreinigungen mit anderen Löslichkeitseigenschaften als die einzigartigen Eigenschaften der Helix abzutrennen. Durch Spaltung der gereinigten Einschlußkörperchen wird dann das Produkt erhalten.
Wenn ein potentieller Spaltungsort zufällig in der Aminosäuresequenz des Zielpolypeptids vorhanden ist, begünstigt das obenoffenbarte Schema des angekoppelten Polypeptids die Spaltung am Ort (14'). Unter solchen Umständen, wenn die Reaktion vollständig abläuft, können beide Orte gespalten werden. Das Ergebnis wird dann sein, daß wenig oder kein intaktes Zielpolypeptid geerntet werden kann.
In diesem Fall kann die Spaltungsreaktion vor ihrem Abschluß abgebrochen, das Zielpolypeptid vom Reaktionsgemisch entfernt und der Rest des Fusionspolypeptids wieder gespalten oder im Kreislauf zurückgeführt werden. Durch diese Vorgehensweise kann der Verlust an Zielpolypeptid durch seine Entfernung aus der Reaktion, bevor die Protease den zweiten, weniger reaktiven Spaltungsort angreift, vermindert werden. Weitere Einzelheiten dieses Kreislaufspaltungsverfahrens werden in der mitanhängigen Anmeldung Aktenzeichen (des Anwalts CRP-014) offenbart, eingereicht am selben Tag mit der hier vorliegenden Anmeldung. Die Offenbarung wird hier durch Bezugnahme einbezogen.
Alternativ dazu kann die Spaltung des Zielpolypeptids entfallen, wenn man seine Aminosäuresequenz auf der DNA Ebene verändert, um Reste in seiner Struktur zu ersetzen, die durch chemisch ähnliche Reste, die unter den Bedingungen der Spaltungsreaktion nicht gespalten werden, gespalten werden könnten. Durch eine ähnliche Vorgehensweise kann eine unerwünschte Spaltung der amphiphilen Helix vermieden werden. Somit sollten, wenn S. aureus V-8 Protease das Spaltungsmittel der Wahl ist, Glu Reste nicht als geladener Rest (C) in der Struktur der Helix verwendet werden. Die Spaltungsreaktion wird dann unter Bedingungen durchgeführt, bei denen die S. aureus V-8 Protease an einem Glu Rest und nicht, oder mit verminderter Geschwindigkeit, an einem Asp Rest spaltet. Zum Beispiel fördern alkalische Mittel (mit einem pH Wert von z. B. ca. 8,0) sowie die Anwesenheit von Azetat oder Karbonat-Ion die Glu Spaltung und minimieren die Asp Spaltung. Bei Anwendung dieser Aminosäureaustauschmethode ist es oft nicht erforderlich, alle potentiellen Spaltungsorte im Zielprotein zu ersetzen, da sie in vielen Fällen, aufgrund der Stereochemie der renaturierten Zielproteine, für die Endoproteasehydrolyse nicht zugänglich sein werden.
Die bevorzugten Merkmale der Erfindung werden in den folgenden Beispielen ausführlicher dargestellt.

Beispiele

Für die Gestaltung einer amphiphilen Helix, die für die Herstellung von relativ kurzen Zielpolypeptiden, wie zum Beispiel humane, epidermale Wachstumsfaktoren und Calcitonin, nützlich ist, wurden zur Beurteilung eine Reihe von amphiphilen Prototyphelices zwecks Beurteilung durch Oligonukleotidsynthese und Ligation zur Herstellung von DNA Rekombinanten, die die im folgenden aufgeführten Proteine kodieren, konstruiert.
Die DNA Kodiersequenz für die Ah4A und Ah5A Leader wurde durch Synthetisierung von überlappenden, komplementären DNA Fragmenten mit 15 Basen gebildet, wobei jeweils die Phosphoramiditchemie genutzt wurde. Die Innenfragmente wurden phosphoryliert (Phosphat zugegeben zur 5' OH), während die Endfragmente unphosphoryliert blieben, um eine Polymerisierung von Gensegmenten während der Ligation der Fragmente zu verhindern. Bei dem linken (aminoständigen) Ende des synthetischen Gens blieben EcoR I "sticky ends", während das rechte Ende typischerweise BamH I "sticky ends" aufwies.
Die DNA Kodiersequenz für den Ah3B Leader wurde durch Synthetisierung von zwei komplementären DNA Fragmenten mit 74 Basen in einem Biosearch Oligonukletid-Synthesizer gebildet, wobei jeweils die Phosphoramiditchemie genutzt wurde. Bei der Gestaltung der Nukleotidsequenz der Helixregion erlauben die möglichen Kodons für die Aminosäuresequenz Ala Lys an solchen Stellen in der Sequenz den Einschluß eines Esp I Restriktionsortes. Dieser Ort ist für weitere Modifizierungen des Gens sehr nützlich, weil er hochspezifisch und in dem verwendeten Klonierungsvektor, pUC8, nicht vorhanden ist (Viera und Messing (1982), Gene, 19, S. 259). Folglich wurde ein einzelner Esp I Ort am Anfang des Kodierbereichs für das dritte Helixsegment aufgenommen. Anschließend wurde die für die Ah5B Helix kodierende Sequenz durch Synthetisierung der DNA für ein Dimermodell B mit Esp I Enden gebildet, die dann in die Sequenz für den Ah3B Leader durch Einschneiden der DNA Sequenz an der einzigartigen Esp I Stelle eingefügt wurde.
Die synthetische DNA wurde unter Anwendung der Linkermutagenese-Methode geklont. Die DNA für die Ah3B Anfangskodiersequenz wurde so gestaltet, daß zur Bildung einer Doppelhelix durch Dimerisierung überlappende Enden blieben, die mit einem Nco I Anfangsrestriktionsort und einem terminalen BamH I Ort kompatibel waren. Die synthetische DNA wurde in ein pUC Plasmid geklont, das diese Orte und ein dem Nco I Ort nahes EcoR I enthielt. Sowohl die Ah3B als auch die Ah5B Kodierbereiche konnten dann vor verschiedene, vorher existierende EGF Gene mit Spaltungsorten zur Bildung von Leader-Spaltungsort-EGF Elementen verlagert werden.
Eine Alternative zur Bildung der DNA Kodiersequenz für eine Reihe von "helix multimer regions" ist die Synthetisierung von drei DNA Bereichen: ein für das erste helikale Segment kodierender Bereich, einschließlich des Met Anfangskodons (ATG) und eines linksgerichteten, flankierenden Restriktionsortes für die Klonierung, ein für ein Innensegment, z. B. von Ala bis Ala, kodierender Bereich sowie ein für das letzte helikale Segment kodierender Bereich mit einem rechtsgerichteten, flankierenden Restriktionsort für die Verbindung der DNA für die Helix mit der DNA für den Spaltungsort und das Zielprotein-Gen. Die Enden der DNA Segmente sind so gestaltet, daß komplementäre 5' überhängende Enden bleiben, die den Ala Ala Bereich zwischen helikalen Segmenten abdecken. Durch Variation der relativen Mengen an für die End- und Innensegmente kodierender DNA kann die Länge helikaler, polymerer DNA, die während der Ligation der Fragmente gebildet wird, reguliert werden. Die tatsächliche Größe der resultierenden Klone wird durch Sequenzierung auf der DNA Ebene bestimmt.
Wie aus der vorangegangenen Liste von Helixstrukturen ersichtlich ist, benutzte die Ah5A Asn als Nebenaminosäuren, Leu und Ala als unpolare Aminosäuren, Lys als eine kationische Aminosäure und Glu als eine anionische Aminosäure, so daß kein Segment des 5 Segmente enthaltenden Oligomers eine Ladung aufwies. Die Sequenzierung des exprimierten Polypeptids deutete darauf hin, daß der Glu Rest im vierten Segment und der zweite Asn Rest im fünften Segment während der Synthese durch Lys bzw. Ser Reste ersetzt worden war. Die Helix Ah4A war mit Ah5A identisch, außer daß nur vier Repetiereinheiten verwendet wurden. Die Sequenzierung zeigte, daß der erste Ala Rest des ersten Segments während der Synthese durch Val ersetzt worden war. Die Helix Ah3B verwendete drei Repetiereinheiten, und Ah5B verwendete fünf Repetiereinheiten, in denen His als Nebenaminosäure verwendet wurde, Asp Glu ersetzte und Gln Asn in der Struktur der Ah5A und Ah4A Helices ersetzte.
Die Helix Ah5A wurde als Fusionsprotein mit folgender Aminosäuresequenz exprimiert:
Met-(Ah5A)-Asp-Pro-Pro-Pro-Glu-Leu-Arg-Arg-(EGF) worin EGF die Aminosäuresequenz von humanem, epidermalem Wachstumsfaktor ist, Asp-Pro-Pro-Pro-Glu als Angel diente und die Leu-Arg-Arg Sequenz einen für die Trypsinverdauung bei einem pH Wert von 8 in 1 M Harnstoff zugänglichen Spaltungsort enthielt. Bei der Ausbildung bildete dieses Fusionsprotein prompt Einschlußkörperchen, die 25% des gesamten, zellulären Proteins und 80% des unlöslichen Proteins ausmachten. Entsprechend den Voraussagen in der Theorie veränderte sich die Löslichkeit des Fusionsproteins bei Variation des pH Werts nicht wesentlich.
Die gefrorenen Zellen mit den Einschlußkörperchen wurden in einer Waschlösung (25% Sucrose, 25 mM Trispuffer, pH 8, 10 mM EDTA) bei einer Konzentration von ca. 100 mg/ml suspendiert. Die Zellen wurden dann zentrifugiert. Das Pellet wurde wieder in der obengenannten Lösung plus 1% Detergens (Natriumdodecylsulfat) suspendiert und 30 Minuten bei 0 ºC gehalten. Nach der Zentrifugierung wurde das Zellpellet wieder in der Waschlösung zur Entfernung des Detergens gewaschen, zentrifugiert, wieder in dem Tris-EDTA Puffer plus 0,01% Lysozym suspendiert, gefroren, einmal aufgetaut und dann zweimal 30 Sekunden auf Eis beschallt. Einschlußkörperchen und Zelltrümmer wurden wieder durch Zentrifugierung abgetrennt, und das Pellet wurde wieder in 6 M Harnstoff, 20 mM Trispuffer, pH 8 suspendiert, um die Einschlußkörperchen auf zulösen. Der verbleibende Feststoff wurde durch Zentrifugierung abgetrennt, und der gelöstes Fusionsprotein enthaltende Überstand wurde mit Harnstoff auf eine Endkonzentration von 1 M verdünnt.
Proben des solubilisierten Proteins wurden dann sowohl 15 Minuten als auch eine Stunde mit Trypsin verdaut (2 ug/ml und 10 ug/ml). Die Verdauung bei der niedrigeren Proteasekonzentration über 15 Minuten führte zu einer 100%igen Spaltung des EGF Fusionsproteins. In dieser Reaktion wurden auch fünf C-terminale Aminosäuren des EGF teilweise gespalten.
In einem zweiten Experiment wurden die Einschlußkörperchen wie oben beschrieben hergestellt und gespalten, allerdings mit dem Unterschied, daß 1% CHAPS Puffer (3[(3-Chloramidopropyl)dimethylammonio]-propansulfonat) vor der Beschallung zugegeben wurde. Die Verdauungsprodukte wurden an Polyacrylamidgelen getrennt. Durch Immunoblotting mit EGF Antikörper zeigte sich, daß ein Verdauungsfragment mit dem annähernd richtigen Molekulargewicht für EGF gebildet worden war. Höhermolekulare Verunreinigungen und Verdauungsfragmente können auf einer C-18 Säule durch Füllen und Waschen mit 10% CH&sub3;CN und Eluierung mit 60% CH&sub3;CN leicht vom EGF Produkt entfernt werden.
Ein dem obenbeschriebenen ähnliches Fusionspolypeptid, bei dem jedoch Ah4A als amphiphile Helix verwendet wurde, wurde dann in der Hoffnung exprimiert, daß vier Repetiereinheiten der helikalen Struktur sich als weniger standhaft gegenüber einer Solubilisierung erweisen würden. Das Fusionsprotein hatte die Struktur:
Met-(Ah4A)-Asp-Pro-Leu-Pro-Glu-Leu-Ser-Arg-EGF
In diesem Element erhöhte das Pro-Leu-Pro Tripeptid in der Angel die Zugänglichkeit von Trypsin zum Argininspaltungsort.
Bei der Ausbildung bildete dieses modifizierte Fusionsprotein sogleich Einschlußkörperchen, die 20% des gesamten, zellulären Proteins ausmachten und in Medien mit schwacher Ionenkonzentration löslich waren. Folglich konnte es erfolgreich durch Trypsin in 1 M Harnstoff bei pH 8 gespalten werden.
Die Einschlußkörperchen wurden wie oben beschrieben hergestellt, jedoch mit dem Unterschied, daß 25 mg/ml Zellen und CHAPS Puffer (10 mM) anstelle von Natriumdodecylsulfat im zweiten Schritt verwendet wurden. Erwartungsgemäß war das fusionierte Polypeptid löslicher als das Ah5A Element, und die Vorwäsche mit einem stärkeren Detergens führte zu einer deutlichen Produkteinbuße. Das Ergebnis war, daß die Einschlußkörperchen mehr Verunreinigungen enthielten, von denen einige mit Lösemitteln, zum Beispiel Dimethylsulfoxyd und 0,1 M Essigsäure, entfernt werden konnten.
Protein von Einschlußkörperchen, solubilisiert in 1 M Harnstoff, 2 mM Trispuffer, pH 8, 0,1 mM EDTA wurde entweder direkt verdaut oder von Phenylsiliziumdioxyd mit 30% CH&sub3;CN und 5 mM Boratpuffer, pH 8-9, durch Eluierung gereinigt. Die Verdauung erfolgte bei 37 ºC über 3 oder 10 Minuten unter Verwendung von 100, 10, 1,0 und 0,1 ug/ml Trypsin (pH 8). Eine Verdauung mit 1 ug/ml Trypsin über 3 Minuten war völlig ausreichend, um über die Hälfte des Siliziumdioxid gereinigten Materials zu spalten.
Die amphiphile Helix Ah3B wurde als Fusionsprotein mit folgender Sequenz ausgebildet:
ShLE-Met-(Ah3B)-Asp-Pro-Asp-Pro-Asp-Ala-Ala-Ile-Glu-Gly- Arg-EGF worin ShLE die kurze Trp Leadersequenz ist (Met-Lys-Ala- Ile-Phe-Val-Leu-Lys-Gly-Ser-Leu-Asp-Arg-Asp-Leu-Glu-Phe), die Asp-Pro-Asp-Pro-Asp-Ala-Ala Sequenz die Angel enthielt und die Ile-Glu-Gly-Arg Sequenz ein Erkennungsort für die Faktor Xa Spaltung ist.
Bei einem aus drei Segmenten bestehenden Helixleaderabschnitt wurden keine Einschlußkörperchen gebildet, es sei denn der Trp Leader wies einen Teil des Elements auf. Die Ah5B Leaderelemente bildeten aber intrazelluläre Einschlußkörperchen, unabhängig davon, ob sie mit dem ShLE Leader verbunden waren oder nicht. Protein wurde durch Waschen der Zellen mit 25% Sucrose, 25 mM Trispuffer, 10 mM EDTA und 100 mM NaCl (1 Stunde bei 0 ºC) zurückgewonnen. Die Zellen wurden dann zentrifugiert, einmal gewaschen mit 5 mM Trispuffer, 2 mM EDTA, gefroren, aufgetaut, auf 10 mM in EDTA eingestellt, mit 0,01% Lysozym gemischt, 30 Sekunden über Eis beschallt und zur Sammlung der Einschlußkörperchen wieder zentrifugiert.
Die Einschlußkörperchen wurden in 8 M Harnstoff und Gelprobenpuffer gelöst. Die erhaltene Lösung wurde auf ein 15%iges Polyacrylamidgel gegeben. Die Produktbande wurde ausgeschnitten, und das Protein wurde in Wasser bei Raumtemperatur 16 Stunden passiv eluiert. Reines β-Mercaptoethanol (BME) wurde zu der Lösung gegeben, so daß eine Konzentration von 0,1% erhalten wurde. Es wurde soviel Harnstoff zugegeben, daß die Konzentration 2 M betrug und soviel Natriumcholat, daß die Konzentration 0,1% erreichte. Diese Lösung wurde dann dialysiert gegen:
a) 5 mM Trispuffer, pH 7,5, 0,1% Natriumcholat, 2 M Harnstoff, 1 mM reduziertes Glutathion und 100 mM oxidiertes Glutathion; b) die gleiche Lösung, jedoch ohne Natriumcholat; c) die gleiche Lösung, jedoch ohne Natriumcholat oder Harnstoff; d) 50 mM Trispuffer, pH 8,4.
Die Spaltung wurde eine Stunde bei 37 ºC in Mengen von 14 ul mit ca. 1 ug Protein/SO mM Trispuffer, pH 8, 5 mM Ca&spplus;&spplus; und 7,5 uU, 75 uU und 750 uU Faktor Xa durchgeführt. Bei den niedrigeren Faktor Xa Konzentrationen wurden deutliche Bande von intaktem EGF gebildet.
Zur weiteren Beurteilung amphiphiler Helixstrukturen im Hinblick auf ihre Löslichkeitseigenschaften wurden folgende synthetische Dimeren mit Hilfe eines Biosearch Solid-Phase Peptidsynthesizers hergestellt:
Die Helix P-72 bestand aus der dimeren Form der Ah5A Helix. Die Helix P-81 bestand auch aus der dimeren Form der Ah5A Helix. Jede Einheit war mit der Ah5A identisch, jedoch mit dem Unterschied, daß His den kationischen Lys Rest als geladene Aminosäure ersetzte. P-87 bestand auch aus zwei, der Ah5A ähnlichen Repetiereinheiten, ausgenommen daß GIn anstelle von Asn als Nebenaminosäurerest verwendet und der zentrale, unpolare Leu Rest der Ah5A durch His ersetzt wurde.
Von den drei synthetischen Peptiddimeren wird erwartet, daß sie unter verschiedenen Lösungsbedingungen mit unpolaren Phasen unterschiedlich in Wechselwirkung treten.
Die Gesamtladung des Dimers P-72 ist null. Es enthält keine Gruppen, die in einem ungefähr neutralen pH Bereich titriert werden. Es wird daher erwartet, daß P-72, unabhängig vom pH Wert, mit unpolaren Phasen Aggregate bildet oder mit diesen in Wechselwirkung tritt.
Das Peptid P-81 wiederum hat bei einem niedrigen pH Wert (unter 7) eine Gesamtladung von 0, wenn His geladen ist, wird jedoch bei einem hohen pH Wert negativ geladen, wenn His seine Ladung verliert. Folglich wird von P-81 angenommen, daß es bei niedrigem pH Wert stärker mit einer unpolaren Phase in Wechselwirkung tritt als bei einem hohen pH Wert. Umgekehrt wird erwartet, daß das Peptid P-87, von dem vermutet wird, daß es bei niedrigem pH Wert positiv geladen und bei hohem pH Wert neutral ist, mit einer unpolaren Phase bei einem hohen pH Wert stärker in Wechselwirkung tritt, wenn das His titriert wurde und neutral ist. Da der intrazelluläre pH Wert von E. coli bei etwa 7,6 liegt, wird erwartet, daß P-87 unter physiologischen Bedingungen ein Aggregat bildet. Da außerdem das His, wenn es geladen ist, innerhalb des unpolaren Bereichs liegt, sollten Wechselwirkungen unpolarer Aggregation strikt unterbunden werden.
Um festzustellen, ob die synthetischen Helices die erwarteten Eigenschaften haben, wurde jeweils eine Untersuchung auf einer HPLC Säule mit einer unpolaren (C-18) stationären Phase durchgeführt.
Eine Probe einer synthetischen Peptidlösung wurde dann injiziert, und die Eluierungszeit (Zeit bis zum Aufsteigen vom Boden der Säule) wurde gemessen. Die Totzeit der Säule wurde durch Einspritzen eines kleinen, geladenen Moleküls, z. B. Zitrat oder Azetat, gemessen. Die Fraktion der in der wäßrigen, mobilen Phase solubilisierten Probe (im Gegensatz zu der an die hydrophobe, immobile Phase gebundenen) wird durch die Totzeit, dividiert durch die Eluierungszeit der Probe, bestimmt. Eine während der Tot zeit erscheinende Probe ist in der mobilen Phase vollständig löslich, während bei Erscheinen in zwei Totzeiten die Probe halb in der mobilen Phase solubilisiert und halb an die stationäre Phase gebunden ist. Durch dieses Verfahren kann die Affinität jedes einzelnen, synthetischen Peptids für die wäßrige, mobile Phase, bezogen auf die hydrophobe, stationäre Phase, in Abhängigkeit vom pH Wert gemessen werden.
Die HPLC Säule wurde isokratisch betrieben (konstantes Elutionsmittel). Von den verschiedenen Puffersystemen wurde eins ausgewählt. Die Eluierungszeiten für die synthetischen Peptide reagieren sehr empfindlich auf die Konzentration des verwendeten Acetonitrils. Aus diesem Grund wurde für alle Puffersysteme eine Konzentration von 13% verwendet. Bei dieser Konzentration wurde für die Peptide eine Eluierungszeit in Höhe der zwei- bis zwanzigfachen Totzeit bestimmt. Der pH Wert des jeweiligen Puffersystems wurde durch Variation des Verhältnisses der Lösungen A und B angepaßt, wobei der pH Wert der Lösung A niedrig und der der Lösung B hoch angesetzt wurde. Die Säule wurde equilibriert (Messung der Absorbanz bei 214 nm mit Basislinienkorrektur). Die Equilibrierungszeiten variierten in einigen Fällen bis zu mehreren Stunden, besonders wenn die pH Pufferkapazität des Puffersystems gering war.
Folgende Puffersysteme wurden verwendet:
für den pH Bereich von 6,8 bis 8,0 : 10 mM Phosphat mit 10 mM Natriumion in A und 20 mM Natriumion in B;
für den pH Bereich von 4,0 bis 5,5 : 10 mM Azetat mit 5,3 mM Natriumion in A und 9,5 mM Natriumion in B;
für den pH Bereich von 4,0 bis 8,0 : 10 mM Phosphat, 10 mM Azetat mit 0 mM Natriumion in A und 20 mM Natriumion in B;
für den pH Bereich von 6,0 bis 9,0 : 5 mM Phosphat, 5 mM Pyrophosphat mit 10 mM Natriumion in A und 20 mM Natriumion in B;
für den pH Bereich von 4,0 bis 10,0 : 5 mM Phosphat, 5 mM Pyrophosphat, 20 mM Natriumion mit 12 mM Azetation in A und 0,8 mM Azetation in B.
Da die Konzentrationen geladener Ionen zwecks Variation des pH Werts verändert werden müssen, verändert sich gleichzeitig mit dem pH Wert die Ionenkonzentration der mobilen Phase in diesen Puffersystemen. In den Systemen, in denen das Kation variiert wird, steigt die Ionenkonzentration mit steigendem pH Wert, während in den Systemen, in denen das Anion variiert wird, die Ionenkonzentration mit steigendem pH Wert sinkt.
In Abbildung 5 sind die Ergebnisse dieser Versuche am P-72 Peptiddimeren, das kein Histidin enthält, dargestellt. Die Darstellung zeigt die Veränderung beim Teilungskoeffizienten, der auf die sich in die mobile Phase aufteilende Fraktion der Helix in Abhängigkeit vom pH Wert hinweist. Wie abgebildet, nahm mit steigendem pH Wert die Auftrennung des Peptids in die hydrophobe (stationäre) Phase zu. Solch eine Wirkung wird für dieses Peptid nicht erwartet, da es keine Aminosäurereste enthält, die in dem in diesem Versuch verwendeten pH Bereich titriert werden. Dieser Effekt ist möglicherweise darauf zurückzuführen, daß die Ionenkonzentration der verwendeten Puffersysteme mit steigendem pH Wert etwas ansteigt, wodurch die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Helix und hydrophober, stationärer Phase zunehmen.
Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse für die histidinhaltige Helix P-81. Sie zeigen, daß mit steigendem pH Wert die sich in die mobile Phase aufteilende Fraktion der Helix zunimmt. Dies stimmt mit den erwarteten Ergebnissen überein, denn bei höherem pH Wert wird für P-81 eine negative Gesamtladung erwartet und somit eine Affinität für die wäßrige, mobile Phase, bezogen auf die unpolare, stationäre Phase.
Abbildung 7 zeigt die Versuchsergebnisse mit der Helix P-87. Wie dargestellt und entsprechend den Erwartungen zeigte bei Ladung des Histidinrestes bei niedrigem pH Wert das helikale Dimere eine hohe Affinität für ionische Mittel (mobile Phase), während oberhalb eines pH Werts von ca. 6,5 eine relativ geringe, im wesentlichen konstante Affinität für ionische Mittel zu beobachten ist.
In einem anderen Experiment wurde die Veränderung der Lichtstreuung durch Lösungen der synthetischen Peptide bei 90º zum einfallenden Strahl dazu genutzt, Veränderungen des Grades der Selbstaggregation infolge von Veränderungen des pH Werts und der Ionenkonzentration zu verfolgen. Die Lichtstreuung wurde mit einem Perkin-Elmer LS 5 Lumineszenz-Spektrophotometer beobachtet, wobei sowohl die Exzitations- als auch die Emissionsmonochromatoren auf eine Wellenlänge von 300 nm eingestellt waren. Jedes Peptid lag in destilliertem Wasser vor, und abwechselnd wurden steigende Konzentrationen von Essigsaure und Natriumhydroxyd zugegeben, um so zwischen sauren und basischen Bedingungen zu wechseln. Die Ergebnisse dieser Titrationen sind unten in Tabelle A aufgeführt. Die darin angegebenen Werte geben die durch die Lösung gestreute Lichtmenge an, bezogen auf die durch das Lösemittel unter denselben Bedingungen gestreute Lichtmenge. Tabelle A Ergebnisse der Lichtstreuung Probe Zugabe
¹ Ionenkonzentration der Lösung
² relatives 90º Streuungssignal
³ vorausgesagte Streuungsveränderung
&sup4; beobachtete Streuungsveränderung
Die Ergebnisse für P-81 zeigen, daß bei Sinken des pH Werts unter neutral, wo von dem Peptid eine Gesamtladung von 0 und eine Tendenz zur Aggregation erwartet wird, in einem Fall die Streuung zunimmt. Umgekehrt nimmt die Streuung ab, wenn der pH Wert über neutral liegt, wo von dem Peptid eine negative Gesamtladung und Dissoziation erwartet wird. Andererseits hat P-87 eine Extraladung, und es wird erwartet, daß es sich genau entgegengesetzt zu P-81 verhält. Die Streuungsveränderungen von P-87 Lösungen variieren wie vorausgesagt.

Claims

1. Rekombiniertes Fusionsprotein oder eine für ein solches Protein codierende DNA, wobei das Fusionsprotein ein Zielpolypeptid aufweist, das mit einem angekoppelten Polypeptid verbunden ist, welches in wäßriger Lösung eine amphiphile alpha- Helix-Struktur mit einer zentralen Achse und sich gegenüberstehenden hydrophilen und hydrophoben Seitenflächen besitzt, wobei die hydrophobe Fläche axial benachbarte unpolare Aminosäurereste und die hydrophile Fläche axial benachbarte geladene Aminosäurereste aufweist,

das Fusionsprotein innerhalb eines Wirtsorganismus spontan unlösliche Aggregate bildet, das angekoppelte Polypeptid ein Prolin-freies Polypetid folgender Struktur aufweist:

(N-C-S-N-S-C-N)b

wobei b eine ganze Zahl von i bis 30 ist;

N einen Vertreter aus der Gruppe unpolarer Aminosäurereste darstellt und alle N zusammen die hydrophobe Fläche ausmachen;

C einen Vertreter aus der Gruppe der geladenen Aminosäurereste darstellt; und alle C zusammen die hydrophile Fläche bilden;

S einen Vertreter aus der Gruppe hydrophiler, neutraler Aminosäurereste darstellt, und wobei bis zu 2 der genannten N-, C-, und S-Reste unabhängig voneinander Histidin sein können.

2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei N ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Alanin, Tryptophan und Methionin; C z. B. ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure, Glutaminsäure und Lysin; und S z. B. Glutamin sein kann.

3. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei eines der genannten C's ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure und Glutaminsäure und das andere der genannten C's Lysin ist, wobei eines der genannten C's ein kationischer Aminosäurerest und das andere ein anionischer Aminosäurerest ist.

4. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das Zielpolypeptid Aminosäurereste aufweist, die zusammen eine Nettoladung als erste Polarität ausmachen und wobei C aus Aminosäureresten besteht, die dem angekoppelten Polypeptid eine Nettoladung verleihen, die der ersten Polarität entgegengesetzt ist.

5. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei wenigstens eines der genannten N's, C's oder S's Histidin ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines Zielpolypeptids bestehend aus folgenden Schritten:

A. Einführen der DNA, die für ein Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 codiert und zu dessen Expression in der Lage ist, in einen zellulären Wirt;

B. Veranlassen des Wirtes zur Expression des Fusionsproteins zur Bildung von Einschlußkörpern, die unlösliche Aggregate des Fusionsproteins aufweisen;

C. Abtrennen der Einschlußkörper vom zellulären Wert;

D. Trennen des Fusionsproteins zur Freisetzung des Zielpolypeptids.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei (a) der Abtrennungsschritt den Schritt zur Ansammlung der Einschlußkörper aus dem zellulären Wert beinhaltet, die Einschlußkörper in Medium gelöst werden, das eine erste Ionenkonzentration besitzt und das darin enthaltene Fusionsprotein repräzipitiert wird, indem die gelösten Einschlußkörper in ein Medium gelangen, das eine zweite, andere Ionenkonzentration enthält; oder (b) wobei der Abtrennungsschritt den Schritt zur Ansammlung der Einschlußkörper aus dem zellulären Wirt beinhaltet, die Einschlußkörper in Medium gelöst werden, das einen ersten pH besitzt und das darin enthaltene Fusionsprotein repräzipitiert wird, indem die gelösten Einschlußkörper in ein Medium gelangen, das einen zweiten, anderen pH enthält.

8. Fusionsprotein gemäß Anspruch I, wobei das angekoppelte Polypeptid eine Polypeptidstruktur folgender Zusammensetzung aufweist:

(Ala-Lys-Asn-Leu-Asn-Glu-Ala)d;

(Ala-Lys-Gln-Leu-His-Asp-Ala)d;

(Ala-His-Asn-Leu-Asn-Glu-Ala)d;

(Ala-Lys-Gln-His-Gln-Glu-Ala)d;

wobei d eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt.

9. Verfahren zur Förderung der Bildung von Einschlußkörpern, die aus einem Zielpolypeptid besteht, das sich innerhalb eines zellulären Wirtes befindet, der das Zielpolypeptid exprimiert, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

Ligieren einer Ankopplungs-DNA an eine DNA, die für das Zielpolypeptid codiert, in Leserichtung, um eine Fusions-DNA zu erzeugen, wobei die Kopplungs-DNA eine Nukleotidsequenz aufweist, die für ein alpha-Helix-Polypeptid codiert, das eine zentrale Achse und sich gegenüberstehende hydrophile und hydrophobe seitenflächen aufweist, wobei die hydrophobe Fläche axial benachbarte unpolare Aminosäurereste und die hydrophile Fläche axial benachbarte geladene Aminosäurereste aufweist, wobei das alpha-Helix-Polypeptid spontan unlösliche Aggregate im zellulären Wirt bildet; und Expression der Fusions-DNA im zellulären Wert zur Bildung von unlöslichen Aggregaten, bestehend aus einem Fusionsprotein, für das die Fusions-DNA codiert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Ankopplungs- DNA für ein Prolin-freies Polypeptid folgender Struktur codiert:

(N-C-S-N-S-C-N)b

wobei b eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist;

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei (a) N ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Alanin, Tryptophan und Methionin; oder (b) C ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure, Glutaminsäure und Lysin; oder (c) S ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asparagin und Glutamin; oder (d) eines der genannten C's ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure und Glutaminsäure und das andere der genannten C's Lysin ist, wobei eines der genannten C's ein kationischer Aminosäurerest und das andere ein anionischer Aminosäurerest ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Zielpolypeptid Aminosäurereste aufweist, die zusammen eine Nettoladung als erste Polarität ausmachen und wobei C aus Aminosäureresten besteht, die dem angekoppelten Polypeptid eine Nettoladung verleihen, die der ersten Polarität entgegengesetzt ist.

13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei wenigstens eines der genannten N's, C's oder S's Histidin ist.

14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Fusions- DNA während des Expressionsschrittes wenigstens etwa 20% ihres Gesamtgewichts als unlösliche Aggregate produziert, die das Fusionsprotein enthalten.