CN118339181A

CN118339181A - 抵抗素特异性抗体及其用途

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Publication number: CN118339181A
Application number: CN202280079185.2A
Authority: CN
Inventors: 金孝洙; 张贤德; 朴范灿; 尹载烽; 朴哉垠; 梁素瑛; 田殷英; 金秀盈; 李智秀; 李载敏; 李东中; 宋知晏
Original assignee: Y Biologics Inc; Seoul National University Hospital
Current assignee: Y Biologics Inc; Seoul National University Hospital
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2022-11-04
Publication date: 2024-07-12
Also published as: WO2023080695A1; EP4428149A1; US20250019430A1; JP2024542149A; KR20230066257A

Abstract

本发明涉及抗抵抗素抗体及其用途，更具体而言，涉及通过阻断抵抗素/CAP1结合来抑制抵抗素活性的抵抗素抗体或其抗原结合片段、编码其的核酸、包括核酸的载体、用载体转化的细胞、用于制备抗体或其抗原结合片段的方法、包括抗体或其抗原结合片段的抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体、嵌合抗原受体、包含其的免疫细胞，以及用于预防或治疗可通过对抵抗素活性的抑制来治疗的疾病的组合物，包括该组合物的组合物。根据本发明，与抵抗素结合的新型抗体或其抗原结合片段通过与抵抗素结合而阻断抵抗素/CAP1结合，从而抑制抵抗素的活性，并且因此可用于开发与抵抗素相关的各种疾病的治疗剂。

Description

抵抗素特异性抗体及其用途

技术领域

本发明涉及抗抵抗素抗体及其用途，以及更具体而言，涉及通过阻断抵抗素/CAP1结合来抑制抵抗素活性的抵抗素抗体或其抗原结合片段、编码其的核酸、包括核酸的载体、用载体转化的细胞、用于制备抗体或其抗原结合片段的方法、包括抗体或其抗原结合片段的抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体、嵌合抗原受体、包括其的免疫细胞，以及用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的组合物。

背景技术

抵抗素是一种细胞因子，其最初被确定为诱导肥胖小鼠胰岛素抵抗的介质。它属于富含半胱氨酸的蛋白的家族，也称为抵抗素样分子(RELM)，并且与炎症过程的调节有关。另外，已知鼠抵抗素与肥胖介导的胰岛素抵抗和二型糖尿病的发展有关(Li et al,Endocrine 35:243-251,2009；Nakata et al,Biochem Biophys Res Commun.353:1046-1051,2007；Steppan et al,Nature409:307-312,2001)。

事实上，大鼠和人抵抗素的蛋白序列仅约60％相同，并且啮齿动物抵抗素首先主要在成熟脂肪细胞中表达和分泌，而人抵抗素主要在白细胞的外周血单核细胞(PBMC)和巨噬细胞中分泌。许多研究表明抵抗素在人和啮齿动物中的作用是不同的。

据报道，人抵抗素的作用是促进免疫细胞的募集和诱导促炎症因子的分泌，并且有证据表明，除了促进胰岛素抵抗外，其还诱导炎性疾病和动脉粥样硬化(Bokarewa etal,J Immunol.174:5789-5795,2005；Silswal et al,Biochem Biophys Res Commun.334:1092-1101,2005；Burnett et al,Atherosclerosis 182:241-248,2005；Jung et al,Cardiovasc.Res 69:76-85,2006；Reilly et al,Circulation 111:932-939,2005)。另外，存在于鼠和人动脉粥样硬化病变中的抵抗素被认为是人动脉粥样硬化的炎症性标志物，并通过激活单核细胞促进动脉粥样硬化(Cho et al,J Am Coll Cardiol 57:99-109,2011)。因此，人抵抗素可能是刺激导致动脉粥样硬化的单核细胞的关键因子。

人抵抗素诱导炎症的机制似乎会激活核因子κB(NF-κB)转录因子，但表现抵抗素促炎症作用的信号传导通路仍不清楚，并且抵抗素在癌症中的作用仍不清楚。

本发明的发明人在世界上首次发现了CAP1(腺苷酸环化酶关联蛋白1)，一种直接与人抵抗素相互作用的受体(Lee S et al,Cell Metabolism,19(3):484-97,2014)。因此，通过利用介导人抵抗素的作用的受体CAP1，有可能开发由抵抗素引起的疾病的治疗剂。

因此，本发明人通过阻断抵抗素/CAP1结合而真诚地努力治疗由抵抗素引起的疾病，诸如癌症，并因此产生了以高亲和力结合抵抗素的抵抗素特异性抗体，并证实了抗抵抗素抗体对可通过针对抵抗素/CAP1结合的抑制活性和抑制抵抗素的活性来治疗的疾病具有较高的治疗效果，并且已完成了本发明。

在背景技术部分中公开的信息仅仅是为了增强对本发明的背景的理解而提供的，并且因此它可能不包括形成对本领域技术人员来说已经显而易见的现有技术的信息。

发明内容

本发明的一个目的是提供针针对抵抗素的新抗体或其抗原结合片段。

本发明的另一个目的是提供编码抗体或其抗原结合片段的核酸。

本发明的仍另一个目的是提供包括核酸的载体、用载体转化的细胞以及用于使用载体制备抗体或其抗原结合片段的方法。

本发明的还另一个目的是提供包括抗体或其抗原结合片段的抗体药物缀合物或者双特异性或多特异性抗体。

本发明的另外的另一个目的是提供包括抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体，包括嵌合抗原受体的免疫细胞。

本发明的仍还另一个目的是提供用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的药物组合物，以及用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的方法，包括抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体、或嵌合抗原受体；抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体或嵌合抗原受体用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的用途；以及抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体或嵌合抗原受体在制备用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的药物中的用途。

为了实现上述目的，本发明提供了特异性结合抵抗素的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区，所述重链可变区包括含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；以及

轻链可变区，所述轻链可变区包括含有选自由SEQ ID NO:4至11组成的组的氨基酸序列的CDR1、含有选自由SEQ ID NO:12至19组成的组的氨基酸序列的CDR2以及含有选自由SEQ ID NO:20至27组成的组的氨基酸序列的CDR3。

本发明还提供了编码抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸。

本发明还提供了编码抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸。

本发明还提供了包括核酸的载体。

本发明还提供了用载体转化的细胞。

本发明还提供了产生抗体或其抗原结合片段的方法，包括(a)培养细胞；和(b)从所培养的细胞中回收抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供了包括抗体或其抗原结合片段的抗体药物缀合物或者双特异性或多特异性抗体。

本发明还提供了包括抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体，或者包括嵌合抗原受体的免疫细胞。

本发明还提供了用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的药物组合物，其包括抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体或嵌合抗原受体。

本发明还提供了使用抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体、或嵌合抗原受体来预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的方法；抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体或嵌合抗原受体用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的用途；以及抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体或嵌合抗原受体在制备用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的药物中的用途。

附图说明

图1示出了通过在初步纯化后用SDS-PAGE分析RETN-C-Fc抗原和RETN-flag-His抗原来确认纯度的结果。

图2a示出了在第一轮生物淘选中使用RETN-flag-His作为抗原的scFv噬菌体库的多噬菌体ELISA结果。

图2b示出了在第一轮生物淘选中使用RETN-C-Fc作为抗原的scFv噬菌体库的多噬菌体ELISA结果。

图3a示出了使用RETN-flag-His作为抗原的在第一轮生物淘选中获得的单克隆的抗原特异性结合分析结果。

图3b示出了使用RETN-C-Fc作为抗原的在第一轮生物淘选中获得的单克隆的抗原特异性结合分析结果。

图4示出了从第一次筛选获得的16种蛋白的抗原-受体结合抑制能力分析结果。

图5示出了使用OCTET的4种克隆的抗原亲和力分析结果。

图6示出了从第二次筛选获得的11种单克隆的抗原特异性结合分析的结果。

图7a示出了从第三次筛选的第一次生物淘选中获得的10种单克隆的抗原特异性结合分析的结果。

图7b示出了从第三次筛选的第二次生物淘选中获得的9种单克隆的抗原特异性结合分析的结果。

图8示出了具有良好抗原-受体结合抑制能力效果的5种抗体(11G01、27A04、32B05、32E06和32G09)。

图9a示出了对于20种克隆的RETN-flag-His抗原的特异性结合ELISA分析的结果。

图9b示出了20种克隆的非特异性结合ELISA分析结果。

图10示出了使用OCTET对6种克隆进行的抗原亲和力分析。

图11是制备轻链改组文库(LC改组文库)的示意图。

图12示出了通过用轻链改组文库进行生物淘选获得的scFv噬菌体库的多噬菌体ELISA结果。

图13示出了18种抗体优化克隆相对于亲本抗体RETN-5A2克隆的生产率变化。

图14示出了18种抗体优化克隆的SDS-PAGE分析结果。

图15a示出了18种优化抗体与RETN-flag-His抗原的结合的ELISA分析。

图15b示出了使用ELISA的18种优化抗体的非特异性结合分析。

图15c示出了13种优化抗体与完整形式抵抗素抗原的结合的ELISA分析。

图16示出了8种优化抗体与鼠抵抗素抗原的跨物种结合反应的ELISA分析。

图17a是抗原-受体竞争性酶免疫测定的示意图。

图17b示出了用于评价18种优化抗体的抑制抗原-受体结合的能力的抗原-受体竞争性酶免疫测定。

图18示出了通过拉下实验(pull down assay)分析的抗原-受体结合抑制能力。

图19示出了使用OCTET的7种优化抗体克隆的抗原亲和力分析。

图20示出了在用抵抗素治疗乳腺癌细胞后，如通过p65的磷酸化所测量的，抵抗素对NF-κB的激活。

图21示出了向小鼠给药5A2抗体和hIgG对照的药代动力学。

图22是说明由5A2抗体抑制体外乳腺癌细胞迁移的图。

图23是说明由5A2抗体抑制体内乳腺癌细胞转移的图。

图24是用于确定5A2抗体有效性的小鼠NASH模型实验的示意图。

图25示出了当向小鼠给药5A2抗体时对脂肪肝的抑制作用的H&E分析。

图26示出了当向小鼠给药5A2抗体时的如油红o测定所证实的对脂肪肝的抑制作用。

图27是示出当向小鼠给药5A2抗体时的胰岛素敏感性的图。

图28是示出当向小鼠给药5A2抗体时的空腹血糖水平的降低的图。

图29是示出当向小鼠给药5A2抗体时的LDL-胆固醇的降低的图。

图30是示出当向小鼠给药5A2抗体时的肝脏甘油三酯的降低的图。

图31是用于确定RETN-5A2_LS_2F11抗体有效性的小鼠IBD模型实验的示意图。

图32是说明在IBD小鼠模型中通过给药RETN-5A2_LS_2F11抗体而抑制小鼠体重减轻的图表。

图33是说明在IBD小鼠模型中通过给药RETN-5A2_LS_2F11抗体而抑制小鼠疾病活动评分增加的图表。

图34是说明在IBD小鼠模型中通过给药RETN-5A2_LS_2F11抗体对肠道长度保护的图表。

图35示出了当向IBD小鼠模型给药RETN-5A2_LS_2F11抗体时的组织学评分结果。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的相同含义。通常，本文所用的术语是本领域公知的，并且是通常使用的。

本发明人已经使用生物淘选方法筛选了新型抵抗素人抗体，该抗体对人抵抗素具有高亲和力和优异的抵抗素抗原-受体结合抑制能力，并且已经证实了所筛选的抵抗素人抗体表现出抑制癌细胞迁移和转移的抗癌效果。

因此，一方面，本发明提供了特异性结合抵抗素的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区，该重链可变区包括含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；以及

轻链可变区，该轻链可变区包括含有选自由SEQ ID NO:4至11组成的组的氨基酸序列的CDR1、含有选自由SEQ ID NO:12至19组成的组的氨基酸序列的CDR2以及含有选自由SEQ ID NO:20至27组成的组的氨基酸序列的CDR3。

在本发明中，轻链可变区是：

包括含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的轻链可变区；

包括含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3的轻链可变区；

包括含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3的轻链可变区；

包括含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR3的轻链可变区；

包括含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3的轻链可变区；

包括含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3的轻链可变区；

包括含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR3的轻链可变区；或者

包括含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3的轻链可变区。

而且，在本发明中，重链可变区优选包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列，并且轻链可变区优选包括选自由SEQ ID NO:32、34、36、38、40、42、44和46组成的组的氨基酸序列。更优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段包括但不限于，包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链可变区；以及包括选自由SEQ ID NO:32、34、36、38、40、42、44和46组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。

与本发明的抵抗素特异性结合的抗体的重链可变区CDR序列(SEQ ID NO:1、2和3)示出于下表1中。

与本发明的抵抗素特异性结合的抗体的轻链可变区CDR序列(SEQ ID NO:4至27)示出于下表2中。SEQ ID NO:11、19和27代表抵抗素5A2亲本抗体的轻链可变区CDR1、2和3的序列。

与本发明的抵抗素特异性结合的抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)和重链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)如下表3所示。

而且，与本发明的抵抗素特异性结合的抗体的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO:32、34、36、38、40、42、44和46)和轻链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO:33、35、37、39、41、43、45和47)如下表5所示。SEQ ID No:46代表抵抗素5A2亲本抗体的轻链可变区的氨基酸序列，以及SEQ ID No:47代表抵抗素5A2亲本抗体的轻链恒定区的氨基酸序列。

[表1]

重链可变区的CDR序列

[表2]

轻链可变区的CDR序列

[表3]

重链氨基酸序列

[表4]

重链核苷酸序列

[表5]

轻链氨基酸序列

[表6]

轻链核苷酸序列

如本文所用，术语“抗体”是指与抵抗素(特别是人抵抗素)特异性结合的抗抵抗素抗体。本发明的范围包括抗体分子的抗原结合片段以及与抵抗素特异性结合的完整抗体形式。

完整抗体为具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，并且每条轻链通过二硫键与重链连接。重链恒定区包括gamma(γ),mu(μ),alpha(α),delta(δ)和epsilon(ε)类型，其中亚类为gamma1(γ1),gamma2(γ2),gamma3(γ3),gamma4(γ4),alpha1(α1)和alpha2(α2)。轻链的恒定区具有kappa(κ)和lambda(λ)型。

抗体的抗原结合片段或抗体片段是指具有抗原结合功能的片段，包括Fab、F(ab')、F(ab')₂和Fv。在抗体片段中，Fab具有带有轻链和重链的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)的结构，并且具有一个抗原结合位点。Fab'与Fab的不同之处在于其具有铰链区，该铰链区在位于重链CH1结构域的C末端包含一个或多个半胱氨酸残基。F(ab')₂抗体由Fab'的铰链区中的半胱氨酸残基的二硫键而生成。用于生成具有仅含重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段的Fv片段的重组技术公开于PCT国际公开号WO88/10649、WO88/106630、WO88/07085、WO88/07086和WO88/09344中。双链Fv具有通过非共价键连接的重链可变区和轻链可变区，其中单链Fv(scFv)具有在C-末端通过共价键(通常经由肽接头)连接，或者直接连接的重链可变区和轻链可变区，这可以形成类似双链Fv的二聚体样结构。该抗体片段可以使用蛋白水解酶获得(例如，用木瓜蛋白酶限制性消化整个抗体产生Fab，以及用胃蛋白酶消化产生F(ab')₂片段)或者可以通过基因重组技术产生。

在一种实施方式中，根据本发明的抗体呈Fv的形式(例如，scFv)，或者呈完整抗体的形式。此外，重链恒定区可以选自以下同种型中的任何一种：gamma(γ),mu(μ),alpha(α),delta(δ)，epsilon(ε)。例如，恒定区是γ1(IgG1)、γ3(IgG3)或γ4(IgG4)。轻链恒定区可以是κ或λ同种型。

如本文所用，术语“重链”是指包括可变区结构域VH和三个恒定结构域CH1、CH2和CH3的全长重链及其片段，该可变区结构域VH包括具有足够的可变区序列以赋予抗原特异性的氨基酸序列。此外，如本文所用，术语“轻链”指包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL全长轻链及其片段，该可变区结构域VL包括具有足够的可变区序列以赋予抗原特异性的氨基酸序列。

本发明的抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、短链Fv(scFV)、短链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键合Fv(sdFV)或抗独特型(抗Id)抗体或抗体的表位结合片段。

单克隆抗体是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即群体中的单个抗体是相同的，除了可能存在痕量的可能天然发生的突变。单克隆抗体是高度特异的，因此它们定向针对单一抗原位点。与通常包括定向针对不同决定子(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂不同，每种单克隆抗体定向针对抗原上的单个决定子。

例如，可用于本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法产生，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核或植物细胞中产生(参见美国专利号4,816,567)。此外，单克隆抗体可以从噬菌体抗体文库分离。

“表位”是抗体可以与其特异性结合的蛋白决定子。表位通常由一组化学活性表面分子组成，诸如氨基酸或糖侧链，其通常具有特定的电荷特性以及特定的三维结构特征。空间和无定形表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合会丧失，但与后者的结合则不会。

“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是包含来自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的高变区的残基代替，其具有特异性、亲和力和靶向接受者的能力。

“人抗体”意指源自人免疫球蛋白的分子，其中包括含有互补晶体区和结构区的抗体的整个氨基酸序列由人免疫球蛋白组成。

它不仅包括其中重和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，而剩余的一条或多条链与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列同一或同源的“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，而且包括呈现出预期生物活性的抗体片段。

如本文所用，“抗体可变结构域”是指包括互补决定区(CDR；即，CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列的抗体分子的轻和重链部分。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。

“互补决定区"(CDR；即，CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域中的抗原结合所需的氨基酸残基。每个可变结构域通常具有三个CDR区，其标识为CDR1、CDR2和CDR3。

“Fv”片段是包含完整抗体识别和结合位点的抗体片段。该区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域组成，它们紧密且几乎共价结合为二聚体，例如，scFv。

“Fab”片段包含轻链中的可变结构域和恒定结构域以及重链中的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')₂抗体片段通常包含一对Fab片段，它们在其羧基末端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸共价连接。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其存在于单个多肽链中。Fv多肽还可以在VH和VL结构域之间包含多肽接头，使得scFv形成抗原结合靶向的结构。

根据本发明的抗体是对抗原的亲和力增加的抗体。术语“亲和力”是指特异性识别和结合抗原上特定位点的能力，并且高度的亲和力连同抗体对抗原的特异性一起，是免疫应答中的重要因素。亲和力可以使用本领域已知的各种测定法中的任何一种来确定，诸如放射免疫测定(RIA)和ELISA，并且可以用各种定量值来表示。抗体对抗原的亲和力通常可以通过特定抗体-抗原相互作用的解离常数(Kd)来表示。Kd值越低，抗体对抗原的亲和力越高。

本发明的抗体或抗体片段不仅可以包括本文所述的本发明抗抵抗素抗体的序列，而且可以在它们能够特异性识别抵抗素的范围内，包括其生物等同物。例如，可以对抗体的氨基酸序列进行额外的修饰以进一步改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。这种修饰包括，例如，抗体氨基酸序列残基的缺失、插入和/或置换。这些氨基酸修饰是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等来进行的。通过分析氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型，可以看出精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是生物功能等同物。

当考虑具有上述生物学等同活性的变体时，本发明的抗体或编码其的核酸分子也被解释为包括与序列ID号中列出的序列呈现出基本同一性的序列。基本同一性意指当本发明的序列与任何其他序列尽可能相近地比对，以及使用本领域公知的算法分析的经比对的序列时，呈现出至少90％同源性、最优选至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性或至少99％同源性的序列。用于序列比较的比对方法是本领域公知的。NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)在NBCI等处进行访问，并通过互联网连同序列分析程序诸如blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx一起使用。BLSAT可以于www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/进行访问。使用该程序比较序列同一性的方法可以于www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html获得。

基于此，本发明的抗体或其抗原结合片段可以与说明书中列出的特定或全部的序列相比具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。这种同源性可以通过本领域已知的方法进行序列比较和/或比对来确定。例如，序列比较算法(例如，BLAST或BLAST 2.0)、手动比对和目视检查可以用于确定本发明核酸或蛋白的序列同源性百分比。

另一方面，本发明涉及编码抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸。

在本发明中，优选的是编码与抵抗素特异性结合的包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的抗体的重链可变区的核酸，以及更优选编码SEQ ID NO:30的氨基酸序列的核酸，并且该序列如上表4所示。

又另一方面，本发明涉及编码抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸。

在本发明中，优选的是编码与抵抗素特异性结合的包括选自由SEQ ID NO:32、34、36、38、40、42、44和46组成的组的氨基酸序列的抗体的轻链可变区的核酸，以及更优选选自由SEQ ID NO:48、50、52、54、56、58、60和62组成的组的核酸，并且该序列如上表6所示。

术语“核酸”涵盖DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子，并且核苷酸(核酸的基本单位)不仅包括天然存在的核苷酸，而且还包括糖或碱基位点修饰的类似物。可以对编码本发明的重链可变区和轻链可变区的核酸的序列进行修饰。修饰包括核苷酸的添加、缺失或非保守或保守置换。

使用常规程序(例如，通过使用可以与编码抗体的重链和轻链的DNA特异性结合的寡核苷酸探针)可以容易地分离或合成编码抗体的DNA。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

可以通过分离编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸来重组产生抗体或其抗原结合片段。分离核酸并将其插入可复制载体以进一步克隆(扩增DNA)或进一步表达。

基于此，在还另一方面，本发明涉及包括核酸的载体。

如本文所用，术语“载体”包括质粒载体；黏粒载体；和病毒载体诸如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体作为在宿主细胞中表达靶基因的手段。在载体中，编码抗体的核酸与启动子可操作地连接。

“可操作地连接”意指核酸表达调控序列(例如，启动子、信号序列或转录调控结合位点的阵列)和另外的核酸序列之间的功能性连接，由此该调控序列调控其他核酸序列的转录和/或解码。

在原核细胞用作宿主的情况下，它通常包括能够驱动转录的强启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子和T7启动子)、起始降解的核糖体结合位点以及转录/降解终止序列。另外，例如，在真核细胞用作宿主的情况下，可以利用衍生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子和人肌肉肌酸启动子)，或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒(EBV)的启动子和劳氏肉瘤病毒(RSV)的启动子)，并且通常具有多腺苷酸化序列作为转录终止序列。

在一些情况下，载体可以与其他序列融合以便于纯化从此表达的抗体。所融合的序列的实例包括谷胱甘肽S-转移酶(法玛西亚公司(Pharmacia)，USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)和6x His(六组氨酸；凯杰公司(Qiagen)，USA))。

载体包括作为选择性标志物的本领域常用的抗生素抗性基因例如氨苄青霉素(ampicillin)、庆大霉素(gentamicin)、羧苄西林(carbenicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、链霉素(streptomycin)、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)、新霉素(neomycin)和四环素(tetracycline)的抗性基因。

表达上述抵抗素特异性抗体或其抗原结合片段的载体可以是其中在一个载体中同时编码编码重链可变区的核酸和编码轻链可变区的核酸的载体系统，或者是其中在不同载体中表达轻链和重链的系统。在后一种情况下，这两种载体可以通过共转染和靶向转化引入宿主细胞。此外，可以筛选用包括轻链(或重链)的载体转化的细胞，并且可以用包括重链(或轻链)的载体再次转化所选择的细胞以最终选择表达轻链和重链两者的细胞。

优选地，载体系统是其中编码抵抗素特异性抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸以及编码轻链可变区的核酸在一个载体中同时表达的系统，但不限于此。

在还另一方面，本发明涉及用上述载体转化的细胞。

在本发明中，细胞可以选自由以下组成的组，但不限于以下：动物细胞、植物细胞、酵母、大肠杆菌(E.coli)和昆虫细胞。

用于生成本发明抗体的细胞可以是但不限于原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。

可以使用原核宿主细胞诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)属的菌株(诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和Bacillus churringensis、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)。

然而，对动物细胞是兴趣最大的，并且有用的宿主细胞系的实例包括但不限于COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S或HT1080。

在仍还另一方面，本发明涉及产生抗体或其抗原结合片段的方法，包括(a)培养细胞；和(b)从所培养的细胞中回收抗体或其抗原结合片段。

细胞可以在各种培养基中培养。任何可商购的培养基都可以无限制地用作培养基。也可以以合适的浓度包括本领域技术人员公知的所有其他必要补充剂。培养条件(例如，温度、pH等)已经用于经选择用于表达的宿主细胞，并且这对本领域技术人员来说是显而易见的。

抗体或其抗原结合片段的回收可通过去除杂质(例如通过离心或超滤)并纯化所得产物(例如通过亲和色谱法)来实现。可以使用额外其他的纯化技术，例如，阴离子或阳离子交换色谱法、疏水作用色谱法或羟基磷灰石色谱法。

在仍另外的另一方面，本发明涉及其中药物缀合到与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段上的抗体药物缀合物(ADC)。

抗体药物缀合物要求药物在能够被递送到靶细胞之前稳定地与抗体结合。一旦递送到靶标，药物(例如抗癌药物)就必须与抗体分离并诱导靶细胞的死亡。这要求药物与抗体稳定结合，并同时具有足够的细胞毒性以在与抗体分离时诱导靶细胞死亡。

在本发明中，抗体或其抗原结合片段和细胞毒性物质(包括药物如抗癌剂)可以彼此连接(例如通过共价键、肽键等)并以缀合或融合蛋白的形式使用(在细胞毒性物质和/或标记物质是蛋白的情况下)。细胞毒性剂可以是对癌细胞尤其是实体癌症细胞有毒性的任何物质，并且可以是选自由以下组成的组的一种或多种，但不限于以下：放射性同位素、细胞毒性化合物(小分子)、细胞毒性蛋白和抗癌药物。细胞毒素蛋白可以是选自由以下组成的组的一种或多种，但不限于以下：蓖麻毒蛋白、皂草素(saporin)、白树毒素(gelonin)、苦瓜蛋白、debouganin、白喉毒素和假单胞菌毒素。放射性同位素可以是选自由以下组成的组的一种或多种，但不限于以下：131I、188Rh和90Y。细胞毒素化合物可以是选自由以下组成的组的至少一种，但不限于以下：倍癌霉素(duocarmycin)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧丙基)美登素(DM1)和吡咯并苯二氮(PBD)二聚体。

在本发明中，抗体药物可以根据本领域众所周知的技术来缀合。

在本发明中，抗体药物缀合物的特征为抗体或其抗原结合片段经由接头与药物连接。

在本发明中，接头可以是可切割接头或不可切割接头。

接头是抗抵抗素抗体和药物之间的连接位点，例如，接头在细胞内条件下是可切割的形式，使得药物可以经由接头在细胞内环境中的切割而从抗体中释放出来。

接头可以被细胞内环境中(例如在溶酶体或内体中)存在的切割剂切割，并且可以是可以被细胞内肽酶或蛋白酶(例如溶酶体或内体蛋白酶)切割的肽接头。通常，肽接头具有至少两个氨基酸的长度。切割剂可以包括组织蛋白酶B和组织蛋白酶D以及纤溶酶，并且可以水解肽以将药物释放至靶细胞中。肽接头可以被在癌组织中高度表达的巯基依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B切割，以及例如，可以使用Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly接头。此外，肽接头可以被细胞内蛋白酶切割，以及例如,可以是Val-Cit接头或Phe-Lys接头。

在本发明中，可切割接头可以是pH敏感的，这意指它在某些pH值下对水解敏感。一般来说，pH敏感性接头表示它可以在酸性条件下被水解。例如，可在溶酶体中水解的酸不稳定接头可以是，例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式乌头酰胺类、原酸酯、缩醛或缩酮。

接头也可以在还原条件下被切割，例如，二硫键接头。可以使用以下来形成各种二硫键：SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)以及SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)。

在本发明中，药物和/或药物-接头可以经由抗体的赖氨酸或经由二硫键链被还原时暴露的半胱氨酸随机缀合。在某些情况下，接头-药物可以经由基因工程标签(诸如肽或蛋白中存在的半胱氨酸)缀合。基因工程标签(例如，肽或蛋白)可以包括，例如能够被类异戊二烯转移酶(isoprenoid transferase)识别的氨基酸基序。肽或蛋白在肽或蛋白的羧基末端有一个缺失，或者在肽或蛋白的羧基(C)末端经由间隔单元的共价键而添加。肽或蛋白可以直接共价连接到氨基酸基序，或者共价连接到间隔单元并连接到氨基酸基序。氨基酸间隔单元由1至20个氨基酸组成，并且优选为甘氨酸单元。

接头可以包括被大量存在于溶酶体中或在一些肿瘤细胞中过表达的β-葡糖醛酸糖苷酶识别和水解的β-葡糖苷酸接头。与肽接头不同，它具有高度亲水性的优势，当与疏水性更强的药物结合时，可以增加抗体药物复合物的溶解度。

在这点上，可以将在韩国专利公开号2015-0137015中公开的β-葡糖苷酸接头(例如，包括自交联基团的β-葡糖苷酸接头)用于本发明。

另外，接头可以是，例如，不可切割接头，其中药物仅在抗体水解的一个步骤后释放以产生，例如，氨基酸-接头-药物复合物。这种类型的接头可以是硫醚或马来酰亚胺基己酰基团，并且在血液中可以是稳定的。

在本发明中，药物可以是化疗剂、毒素、微小RNA(miRNA)、siRNA、shRNA或放射性同位素。药物可以在表现出药理作用的制剂中与抗体缀合。

化疗剂可以是细胞毒性剂或免疫抑制剂。具体地，它可以包括可用作微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂的化疗剂。它还可以包括免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、驱虫剂，或其组合。

药物可以是选自由以下组成的组的至少一种：美登素(mytansinoid)、奥利司他(orlistatine)、氨喋呤、放线菌素、博来霉素(bleomycin)、沙利度胺(thalidomide)、喜树碱(camptothecin)、N8-乙酰基亚精胺、1-(2-氯乙基)-1,2-二甲基磺酰基肼、埃斯波霉素(esperamycin)、依托泊苷(etoposide)、6-巯嘌呤、海兔毒素(dolastatin)、单端孢霉烯(trichothecene)、卡奇霉素(kalikeamycin)、泰素(taxol)、紫杉烷、紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、甲氨蝶呤、长春新碱、长春碱、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥、倍癌霉素(duocamycin)、L-天门冬酰胺酶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、顺铂、卡铂、丝裂霉素(丝裂霉素A、丝裂霉素C)、达卡巴嗪、丙卡巴肼、拓泊替康(topotecan)、氮芥、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、CNU(双氯乙基亚硝脲)、伊立替康(irinotecan)、喜树碱、伊达比星(idarubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、放线菌素D、普卡霉素(plicamycin)、天门冬酰胺酶、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、白消安(busulfan)、曲奥舒凡(treosulfan)、氮烯咪胺(decarbazine)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、9-氨基喜树碱、克立那托(crisnatol)、三甲曲沙(trimetrexate)、麦考酚酸、噻唑呋啉(tiazofurin)、利巴韦林(ribavirin)、EICAR(5-乙炔基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-羧酰胺(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide)、羟基脲、去铁胺、氟尿苷、去氧氟尿苷、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖胞苷(ara C和胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside))、氟达拉滨(fludarabine)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬、甲地孕酮、戈舍瑞林(goserelin)、醋酸亮丙瑞林、氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺、EB1089、CB1093、KH1060、维替泊芬(verteporfin)、酞菁、光敏剂Pe4、去甲氧基-竹红菌竹素A(demethoxy-hypocrellin A)、干扰素-α、干扰素-γ、肿瘤坏死因子、吉西他滨(gemcitabine)、万珂(velcade)、瑞复美(revamid)、洛伐他汀(lovastatin)、1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子、星形孢菌素、放线菌素D、更生霉素、博来霉素A2、博来霉素B2、培洛霉素(peplomycin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、维拉帕米(verapamil)、毒胡萝卜素、核酸酶以及细菌或动物源的毒素，但并不限于此。

在本发明中，药物可以包括选自由胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼(hydrazine carboxylate)和芳基酰肼(arylhydrazide)基团组成的组的一种或多种亲核试剂，上述基团均与接头和接头试剂上的亲电基团反应形成共价键。

在还另一方面，本发明涉及包括与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段的双特异性或多特异性抗体。

双特异性抗体是结合或拮抗多于一个靶标的抗体，或者结合或拮抗两个不同靶标的抗体的组合，或者其中结合一个靶标的抗体与拮抗另一靶标的物质的抗体。

多特异性抗体是对至少三种不同抗原具有结合特异性的抗体。多特异性抗体可以包括大于三特异性的抗体，诸如三特异性抗体、四特异性抗体或靶向更多靶标的抗体。

产生双特异性或多特异性抗体的方法在本领域是公知的。传统上，在其中两条或更多条重链具有不同的特异性的条件下双特异性抗体的重组产生是基于两条或更多条免疫球蛋白重链/轻链对的共表达。

双特异性或多特异性抗体中所包括的抗抵抗素抗体以外的抗体所结合的抗原优选地是癌症相关抗原或免疫检验点蛋白抗原，其可以选自由以下组成的组：HGF、EGFR、EGFRvIII、Her2、Her3、IGF-1R、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Ang2、Dll4、NRP1、FGFR、FGFR2、FGFR3、c-Kit、MUC1、MUC16、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD40、CD52、CD70、CD79、DDL3、叶酸R1、粘连蛋白4、Trop2、gpNMB、Axl、BCMA、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、BTLA、4-1BB、ICOS、GITR、OX40、VISTA、TIM-3、LAG-3、KIR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、EphA2、EphA4、EphB2、E-选择素、EpCam、CEA、PSMA、PSA和c-MET，并且免疫活性细胞相关抗原可以选自TCR/CD3、CD16(FcγRIIIa)、CD44、CD56、CD69、CD64(FcγRI)、CD89或CD11b/CD18(CR3)，但不限于此。

在另一方面，本发明涉及包括与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)。

CAR可以包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中抗原结合结构域可以通过接头与跨膜结构域连接。包括抗原结合结构域的细胞外结构域也可以包括信号肽。

在仍另一方面，本发明涉及包括嵌合抗原受体的免疫细胞。

免疫细胞可以包括经遗传修饰以表达嵌合抗原受体的细胞，优选地，它们为T细胞或NK细胞。

在又另一方面，本发明涉及用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的药物组合物包括抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体或嵌合抗原受体。

在本发明中，抵抗素的活性可以通过经由抵抗素抗体阻断抵抗素/CAP1结合来抑制。

在本发明中，可以通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病优选为癌症、心血管代谢性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，但不限于此。

本发明可以是，例如，用于预防或治疗癌症、心血管代谢性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病的药物组合物，包括(a)药学有效量的根据本发明的与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段；和(b)药学上可接受的负载体。本发明还涉及预防或治疗癌症、心血管代谢性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，包括以患者所需的有效量向患者给药根据本发明的与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

因此，在另外的另一方面，本发明涉及预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的方法，包括向受试者给药包括抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体或嵌合抗原受体的组合物。

在仍还另一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体或嵌合抗原受体或包括其的组合物用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的用途。

又仍另一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、双特异性或多特异性抗体或嵌合抗原受体或包括其的组合物在制备用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的药物中的用途。

由于组合物、方法、使用和用途利用了本发明的抗抵抗素抗体或其抗原结合片段作为活性成分，因此省略重复描述。

“预防”意指抑制或延缓可以通过给药根据本发明的组合物来治疗的疾病的进展的任何行为，从而抑制抵抗素的活性，以及“治疗”意指抑制可以通过抑制抵抗素的活性来治疗的疾病的发展，或者减轻或消除该疾病。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的其中细胞群经历不受控制的细胞生长的生理病症。

“肿瘤”是由过度细胞生长或增殖引起的任何良性(非癌性)或恶性(癌性)的组织块，包括癌前病变。

术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”及其语法上的等同物是指来源于肿瘤或癌前病变的总细胞群，包括含有大部分肿瘤细胞群的非致瘤细胞和致瘤干细胞(癌症干细胞)。

在本发明中，“癌症”包括但不限于其中表达抵抗素的任何癌症。表达抵抗素的癌症优选选自由以下组成的组，但不限于以下：乳腺癌、转移癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、肝癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、胃癌、胰腺癌和复发性癌。

特别地，本发明的抗体或其抗原结合片段或包括其的药物组合物可以抑制癌症的转移。

在本发明中，“心血管代谢性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病”包括但不限于其中表达抵抗素的任何疾病。

在本发明中，心血管代谢性疾病优选选自由以下组成的组：肥胖症、高脂血症、高血压、动脉粥样硬化、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病、2型糖尿病、肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，但不限于此。

在本发明中，自身免疫性疾病优选选自由以下组成的组：慢性心脏病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、消化性糖尿病、特应性皮炎、自身免疫性脑脊髓炎、哮喘和克罗恩病，但不限于此。

在本发明中，炎性疾病可以优选地选自由以下组成的组：炎性皮肤病，诸如哮喘、湿疹、银屑病、痤疮、过敏、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、过敏性皮炎、慢性鼻窦炎或脂溢性皮炎；炎性肠病(IBD)，诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎；以及急性或慢性炎性疾病，诸如强直性脊柱炎、脓毒症、脓毒性休克、血管炎和滑囊炎，但不限于此。

本发明的药物组合物可以包括对抵抗素具有特异性的抗体或其片段，以及还可以包括用于给药本发明药物组合物的药学上可接受的负载体。

如本文所用，术语“药学上可接受的负载体”是指不会刺激生物且不会抑制所给药的化合物的生物活性和特性的负载体或稀释剂。配制成液体溶液的用于组合物的药学上可接受的负载体可以是无菌的和生物相容的，并且可以根据需要包括盐水、无菌水、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油和一种或多种这些组分的混合物，以及其它常规添加剂诸如抗氧化剂、缓冲剂或抑菌剂。它还可以与额外的稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘结剂或润滑剂一起配制成注射制剂，诸如水性溶液、混悬剂或乳剂、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。

本发明的药物组合物可以呈口服或肠胃外的各种不同制剂。配制时，通常使用稀释剂或赋形剂诸如填料、填充剂、粘结剂、湿润剂、崩解剂或表面活性剂来制备。用于口服给药的固体剂型包括片剂、丸剂、粉末、颗粒剂、胶囊剂等。这些固体剂型通过以下来制备：将一种或多种化合物与至少一种赋形剂诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等混合。除了简单的赋形剂外，还使用润滑剂诸如硬脂酸镁或滑石。用于口服给药的液体制剂包括混悬剂、溶液、乳剂和糖浆，并且除了通常使用的简单稀释剂诸如水或液体石蜡之外，还可以包括各种赋形剂，诸如润湿剂、甜味剂、调味剂或防腐剂。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水性溶液、非水性溶液、混悬剂、乳剂、冻干物和栓剂。非水性溶剂和混悬剂可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射的酯诸如油酸乙酯(ethylolate)。作为栓剂的基质，可以用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可油、月桂油、甘油明胶。

在还另外的另一方面，本发明提供了抑制表达抵抗素的肿瘤细胞的生长、迁移或转移的方法，包括接触抗体或其抗原结合片段。

肿瘤细胞包括但不限于表达抵抗素的任何类型的肿瘤细胞。优选地，表达抵抗素的肿瘤细胞可以以下是但不限于以下：乳腺癌细胞、转移癌细胞、子宫癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、结肠癌细胞、头颈癌细胞、膀胱癌细胞、肾细胞癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞或复发性癌细胞。

本发明涉及治疗癌症、心血管代谢性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，包括向个体给药药学有效量的抗体或其抗原结合片段的步骤。

用本发明的抗体或其抗原结合片段进行治疗的方法包括以药物有效量给药抗体或其抗原结合片段。对本领域技术人员来说显而易见的是，治疗医生可以在合理的医学判断范围内确定合适的总每日剂量，并且可以以单剂量或多剂量来给药。然而，为了本发明的目的，特殊患者的特定治疗有效量优选根据以下而变化：多种因素诸如要达到的反应类型和程度、特定组合物(包括在某些情况下是否使用其他制剂)、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径和治疗持续时间、与特定组合物组合使用或并行使用的药物以及医学领域众所周知的类似因素。

给药本发明组合物的个体包括但不限于哺乳动物，包括人。

本发明中的术语“给药”是指通过任何合适的方式将本发明的药物组合物引入患者中，并且本发明的组合物的给药途径只要其能够到达靶组织，则可以是经由各种途径，口服或肠胃外。

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员来说，显然这些实施例仅用于说明本发明，而不应被解释为限制本发明的范围。

实施例1：抵抗素抗原的表达和纯化

为了在动物细胞中表达RETN-C-Fc蛋白(其中人抗体Fc序列与抵抗素序列的C-末端融合)和RETN-flag-His蛋白(其中flag序列和组氨酸序列融合到抵抗素序列的C-末端)，用RETN-flag-His DNA转染HEK-293F细胞，并孵育一段时间，并收获培养物。对于转染，将DNA加入Freestyle 293表达培养基中，并加入200μg的聚乙烯亚胺(PEI)以进行多聚物(polyplex)反应。将多聚物反应在室温下孵育20min，然后加入到在HEK293培养基中孵育的1X 10⁶个细胞/80ml的HEK293F细胞培养瓶中，并然后在37℃、CO₂ 8％、85rpm下孵育7天。

7天后，收获培养物并以5000rpm离心10min以沉淀并去除培养物中的细胞和细胞碎片。为了纯化并获得所得上清液中的抗原蛋白，将RETN-C-Fc抗原DNA转染培养物的上清液与负载有重组蛋白A琼脂糖树脂的柱在4℃下反应16小时以将抗原蛋白吸附到树脂上，并然后用0.1MpH3.3的甘氨酸溶液洗脱。用1M Tris-HCl溶液将经洗脱的蛋白中和至pH7-7.4，并使用Maxi GeBAflex管(12000-14000MWCO，D050-100)用DPBS替换溶剂。为了纯化RETN-flag-His抗原，将培养物上清液与负载有Ni琼脂糖凝胶6fast Flow(GE health care，17531803)树脂的柱在4℃下反应16小时以将抗原蛋白吸附到树脂上，随后用500mM咪唑溶液洗脱。用DPBS对经洗脱的蛋白进行溶剂交换，并使用Maxi GeBAflex管(12000-14000MWCO，D050-100)进行浓缩。

使用SDS-PAGE凝胶测定经纯化的蛋白的纯度(图1)。

实施例2：抵抗素人抗体的初次筛选

实施例2-1：生物淘选

为了获得与抵抗素抗原结合的噬菌体的库，进行了生物淘选。将实施例1中产生的RETN-C-Fc或RETN-flag-His抗原包被到免疫吸附管上并进行封闭。通过用大肠杆菌感染人scFv文库并培养它们，然后收获并浓缩培养物来制备人抗体文库噬菌体。将人抗体文库噬菌体在抗原包被的免疫管中孵育，并洗脱与抗原结合的scFv噬菌体。回收从第一轮淘选获得的噬菌体，用大肠杆菌再感染，扩增，并使用RETN-C-Fc或RETN-flag-His抗原进行第二轮和第三轮的生物淘选。在每一轮中获得与抗原结合的多噬菌体库。

实施例2-2：多噬菌体ELISA

进行多噬菌体ELISA以确定与每轮中获得的scFv噬菌体库的与抗原特异性结合的程度。作为特异性抗原，将RETN-flag-His抗原和RETN-C-Fc抗原以100ng/孔包被于96孔免疫板(NUNC，439454)，并用脱脂乳封闭。对每个孔进行处理并与每轮中获得的scFv噬菌体反应，用PBS-T洗涤，并与作为第二抗体的抗M13-HRP(Amersham，27-9421-01)以1∶2000进行反应。经PBS-T洗涤后，将100μl的OPD(sigma，8787-TAB)溶液施加到每个孔中进行10min的底物反应。10分钟后，通过用50μl的1N H₂SO₄处理每个孔来停止底物反应，并使用分光光度计(thermo fisher scientific，51119200)在490nm处进行测量。

结果示出，随着每轮的进行，在每轮中获得的多噬菌体的库的抗原结合能力都有所强化(图2a和图2b)。

实施例2-3：阳性噬菌体筛选(单噬菌体ELISA)

将从对抗原具有高结合能力的三轮多噬菌体的库中获得的集落接种在1ml的2xYTCM(2％葡萄糖,5mM MgCl₂)培养基中，并置于96孔深孔板(Bionia，90030)中，并在37℃培养箱中孵育16小时。取100-200μl的经孵育的细胞培养物，使其OD600值为0.1，并接种至1ml的2xYTCM(2％葡萄糖，5mM MgCl₂)培养基中，并在37℃培养箱中孵育2-3小时。孵育后，以1∶20的M值加入M1辅助噬菌体，并接种至2xYTCMK(5mM MgCl₂，1mM IPTG)中，并在30℃孵育16小时。

用100ng/孔的抵抗素抗原包被96孔免疫板(NUNC，439454)，并用脱脂乳封闭。将孵育16小时的单克隆scFv噬菌体以100μl加入每个孔中持续2小时，并且每个孔用PBS-T洗涤，并与作为第二抗体的抗M13-HRP(Amersham，27-9421-01)以1∶2000进行反应。经PBS-T洗涤后，将100μl的OPD(sigma，8787-TAB)溶液施加到每个孔中进行10min的底物反应。10分钟后，通过用50μl的1N H₂SO₄处理每个孔来停止底物反应，并使用分光光度计(thermo fisherscientific，51119200)在490nm处进行测量。

获得了总计20种抗原特异性克隆(图3a和图3b)。

实施例3：经初次筛选的抵抗素人抗体的产生

实施例3-1：转化为IgG形式

将实施例2-3中筛选的20种抗抵抗素单克隆噬菌体抗体从scFv构建体转化为IgG构建体。为了将每个克隆的DNA插入至整个载体中，进行了其中在每条重链和轻链之前和之后添加限制性酶序列的PCR。用限制性酶处理所得的重链和轻链DNA以及整个载体，随后用连接酶(T4 DNA连接酶，thermofisher scientific，#EL0011)处理，并在22℃下进行连接反应10分钟以将重链和轻链序列插入载体。将所制备的载体在42℃下热休克转染至感受态细胞(XLI-blue)中，并然后铺展在LB氨苄青霉素平板培养基上并在37℃下孵育至少16小时以获得集落。将获得的集落接种在LB氨苄青霉素培养基上，并在37℃下孵育16小时。孵育结束后，收集菌落培养物并以3000rpm离心以获得上清液。使用DNA制备试剂盒(Nuclogen)从上清液中提取DNA。分析DNA序列以确认克隆成功。

实施例3-2：人抗体蛋白的产生

将所克隆的重链载体和轻链载体DNA以6∶4(轻链∶重链)的比率共转染入HEK293F细胞。将载体DNA与聚乙烯亚胺(PEI)混合以进行多聚物反应并转染至细胞中。在转染的第7天收获培养物，并通过重组蛋白A琼脂糖树脂纯化上清液中的蛋白。

实施例4：经初次筛选的抵抗素人单克隆抗体的特征

实施例4-1：抗原受体结合抑制能力分析

由体外拉下实验(pull-down assay)通过抑制CAP1与抵抗素的结合从候选抗体库中筛选出抗体。将与THP-1细胞裂解物融合的重组抵抗素蛋白Fc与每种抗体混合，并用Fc珠粒进行沉淀，并通过蛋白质印迹法测量结合的CAP1以比较抵抗素和CAP1的结合以及每种抗体的结合抑制效果。

具体地，通过保藏机构(distributor)美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection,ATCC)的细胞系培养方法获得THP-1(ATCC TIP-202，智人(Homosapiens)，人)细胞。将这些细胞在保持在37℃、CO₂和5％分压下的培养箱中，在RPMI-1640培养基(pH 7.4，包含100单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)中进行培养。用裂解缓冲液(20mM Tris pH7.5、150mM NaCl、1％ Triton X-100、0.25％脱氧胆酸钠、1mM EDTA、1mMNaF、1mM Na₃VO₄和蛋白酶抑制剂混合物)裂解THP-1细胞以提取蛋白，并将100ng的mFc-h抵抗素(mFc-hResistin)(0.5μg)蛋白和抗体加入经提取的THP-1蛋白(500μg)中并在4℃下孵育过夜。加入mFc珠粒(20μl)并在4℃拉下(pull down)3小时后，将它用裂解缓冲液洗涤三次，然后加入包含β-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液，在100℃下煮沸5分钟，并离心以获得上清液。通过使用hCAP1抗体和mFc-HRP抗体的蛋白印迹证实VS肽对hCAP1和mFc-h抵抗素的结合是否被抑制。

从初次筛选获得的16种蛋白的抗原-受体结合抑制能力分析产生了5种高效蛋白(1A2、2E12、5A2、3B5和4D12)(图4)。

实施例4-2：抗原亲和力分析

为了研究抗体和抵抗素抗原之间的亲和力，使用了Octet(Forte bio)系统，该系统能够使用生物传感器实时研究配体-受体结合。该系统是一种将抵抗素抗原蛋白结合到生物传感器上的仪器，使抗体流过，并光学地分析抗体与结合到传感器上的抗原的结合程度，在光波长水平上以高灵敏度测量抗体与抗原的结合水平。将对抵抗素抗原的亲和力表示为受体和配体之间的K_on(缔合常数，结合率)和K_dis(解离常数，解离率)，以及结合和解离反应的KD(平衡解离常数)。

结果显示，在抗原-受体结合抑制能力分析中表现出优异效果的5种候选抗体1A2、2E12、5A2、3B5和4D12中，除2E12之外的4种克隆示出抗原亲和力，其KD高达1nM(图5)。

实施例5：抵抗素人源抗体的二次筛选

实施例5-1：生物淘选

除了初次筛选之外，还进行了二次筛选以获得对抗原具有高亲和力的候选抗体。使用实施例1中产生的RETN-C-Fc或RETN-flag-His抗原，并且通过如实施例2所示包被免疫吸附管，使人抗体库噬菌体与抗原反应，随后洗脱与抗原结合的scFV噬菌体。总计进行三轮淘选，其中每轮产生与抗原结合的多噬菌体的库。

实施例5-2：scFv-噬菌体抗体的抗原特异性结合能力分析

通过单噬菌体ELISA对从生物淘选中获得的scFv多噬菌体库进行克隆以获得84种scFv单克隆。为了分析它们的抗原特异性结合能力，用抵抗素抗原和非特异性抗原以100ng/孔包被96孔免疫板(NUNC，439454)，并与单克隆scFv噬菌体进行反应。使第二抗体抗M13-HRP(Amersham，27-9421-01)进行反应，随后在每个孔中用100μl的OPD(sigma，8787-TAB)溶液进行底物反应10min。用1N H₂SO₄来停止底物反应，并使用分光光度计(thermofisher scientific，51119200)在490nm处进行测量。

这导致获得具有新序列和抗原特异性结合的11种新克隆(图6)。

实施例6：抵抗素人抗体的三次筛选

实施例6-1：生物淘选

除了初次和二次筛选之外，还进行了三次筛选以获得对抗原具有高亲和力的候选抗体。使用实施例1中产生的RETN-C-Fc或RETN-flag-His抗原，并且通过如实施例2所示用抗原包被免疫吸附管，使人抗体库噬菌体与抗原反应，随后洗脱与抗原结合的scFV噬菌体。总计进行三轮淘选，其中每轮产生与抗原结合的多噬菌体的库。

实施例6-2：scFv-噬菌体抗体的抗原特异性结合能力分析

通过单噬菌体ELISA对从生物淘选中获得的scFv多噬菌体库进行克隆，从而获得88种scFv单克隆。通过酶免疫测定分析它们的抗原特异性结合，导致获得具有新序列和抗原特异性结合的10个新克隆(图7a和图7b)。

实施例7：经二次和三次筛选的抵抗素人抗体的产生

实施例7-1：转化为IgG形式

将来自二次和三次筛选的总计20种单克隆噬菌体抗体从scFv结构转变为IgG结构。如实施例3中所述，通过连接将每个克隆的DNA插入生产载体并转化入感受态细胞(XLI-blue)。经转化的细胞在选择培养基中培养，并从中提取DNA并通过测序来确认。

实施例7-2：人抗体蛋白的产生

将所克隆的重链载体和轻链载体DNA以6:4(轻链:重链)的比率共转染入HEK293F细胞。通过混合聚乙烯亚胺(PEI)和载体DNA进行多聚物反应来转染细胞，并且使用大豆蛋白胨(BD，USA)作为增强子。在转染的第7天收获培养物，并通过重组蛋白A琼脂糖树脂纯化上清液中的蛋白。

实施例8：经二次和三次筛选的抵抗素人单克隆抗体的特征

实施例8-1：抗原受体结合抑制能力分析

由体外拉下实验通过抑制CAP1与抵抗素的结合从候选抗体库中筛选出抗体。将与THP-1细胞裂解物融合的重组抵抗素蛋白Fc与每种抗体混合，并用Fc珠粒进行沉淀，并通过蛋白质印迹法测量结合的CAP1以比较抵抗素和CAP1的结合以及每种抗体的结合抑制效果。

具体地，通过保藏机构(distributor)美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection,ATCC)的细胞系培养方法获得THP-1(ATCC TIP-202，智人(Homosapiens)，人)细胞。将这些细胞在保持在37℃、CO₂和5％分压下的培养箱中，在RPMI-1640培养基(pH 7.4，包含100单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)中进行培养。用裂解缓冲液(20mM Tris pH7.5、150mM NaCl、1％ Triton X-100、0.25％脱氧胆酸钠、1mM EDTA、1mMNaF、1mM Na₃VO₄和蛋白酶抑制剂混合物)裂解THP-1细胞以提取蛋白，并将100ng的mFc-h抵抗素(mFc-hResistin)(0.5μg)蛋白和抗体加入经提取的THP-1蛋白(500μg)中并在4℃下孵育过夜。加入mFc珠粒(20μl)并在4℃拉下(pull down)3小时后，将它用裂解缓冲液洗涤三次，然后加入包含β-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液，在100℃下煮沸5分钟，并离心以获得上清液。通过使用hCAP1抗体和mFc-HRP抗体的蛋白质印迹证实VS肽对hCAP1和mFc-h抵抗素的结合是否被抑制。

这产生了5个高效变体(11G01、27A04、32B05、32E06和32G09)(图8)。

实施例8-2：抗原特异性结合能力分析

进行酶联免疫特异性测定(ELISA)以研究经筛选的克隆与人抵抗素蛋白的特异性结合，并确定与其他抗原蛋白的非特异性结合。将96孔免疫板(NUNC，439454)用在DPBS中以10nM稀释的实施例1中制备的RETN-flag-His抗原和非特异性抗原包被，每孔加入100μl，并在4℃下孵育16小时。然后用在PBS中稀释至4％的脱脂乳在37℃下封闭1小时。将抗体蛋白用在PBS中稀释的1％脱脂乳分别稀释至1、10和100nM，每孔加入100μl，并在37℃下孵育2小时。用PBS-T洗涤后，将作为第二抗体的抗人Fc-HRP(Pierce(R)过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG Fc(thermo fisher scientific，31413))稀释至1∶10,000，并在37℃下反应1小时。经PBS-T洗涤后，将100μl的TMB(sigma，T0440)溶液处理到每个孔中进行10min底物反应。10分钟后，通过用50μl的1N H₂SO₄处理每个孔来停止底物反应，并使用分光光度计(thermofisher scientific，51119200)在490nm处进行测量。

结果，在抗原-受体结合抑制能力的分析中表现出优异效果的所有5种抗体11G01、27A04、32B05、32E06和32G09均显示出对RETN-flag-His抗原蛋白的高特异性结合能力(图9a)。另外，与5种非特异性抗原相比，在抗原-受体结合抑制能力的分析中表现出优异效果的所有5种抗体均未示出非特异性结合(图9b)。

实施例8-3：抗原亲和力分析

为了研究抗体和抵抗素抗原之间的亲和力，使用Octet(Forte bio)系统生物传感器进行了配体-受体分析。

结果示出，在抗原-受体结合抑制能力的分析中表现出优异效果的5种候选抗体中，有4种具有高达1nM的KDs的抗原亲和力(图10)。

实施例8-4：抗抵抗素先导抗体(leading antibody)筛选

从一次至三次筛选获得的40种单克隆抗体的序列分析结果中检查每个克隆的VH和VL的CDR位点，并使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/的NCBI网页上的IgBLAST程序分析与种系抗体家族的相似度。

结果示出于下表7。

[表7]

40种经一次至三次筛选的克隆的种系抗体家族的相似度

实施例9：抵抗素抗体RETN-5A2克隆的抗体优化

为了优化抗体，固定RETN-5A2克隆的重链，并添加了来自YBIOLOGICS的具有1x10⁶多样性的轻链(LC)库，以结合新的轻链和现有的重链创建轻链改组文库。通过以下创建轻链改组文库：用限制性酶切割RETN-5A2基因的轻链位点以去除它们，并且然后用相同的限制性酶切割1x10⁶多样性轻链库并将其连接到去除了轻链的RETN-5A2 DNA上。将经克隆的DNA转化到感受态细胞(XLI-blue)中，并将细胞合并在一起以创建文库(图11)。

实施例10：抵抗素人抗体的筛选

实施例10-1：生物淘选

为了使用作为亲本抗体的与抵抗素抗原结合的5A2抗体来获得经优化的噬菌体库，进行了生物淘选。将实施例1中制备的RETN-C-Fc或RETN-flag-His抗原包被到免疫吸附管上并进行封闭。将5A2抗体经优化的文库噬菌体与抗原包被的免疫吸附管反应，并洗脱与抗原结合的scFv噬菌体。回收所获得的噬菌体并再次感染大肠杆菌以进行扩增。

实施例10-2：筛选阳性噬菌体并获得单抗体序列

为了从所获得的scFv噬菌体库中获得针对抗原的噬菌体特异性scFv库，进行了噬菌体ELISA。将RETN-flag-His抗原以100ng/孔包被于96孔免疫板(NUNC，439454)，并用脱脂乳封闭。对每个孔进行处理并与每轮中获得的scFv噬菌体反应，用PBS-T洗涤，并与作为第二抗体的抗M13-HRP(Amersham，27-9421-01)以1∶2000进行反应。经PBS-T洗涤后，将100μl的OPD(sigma，8787-TAB)溶液施加到每个孔中进行10min的底物反应。10分钟后，通过用50μl的1N H₂SO₄处理每个孔来停止底物反应，并使用分光光度计(thermo fisher scientific，51119200)在490nm处进行测量。结果示出，经生物淘选后噬菌体库的抗原结合能力略有强化(图12)。

将从对抗原具有得到证实的结合能力的第一轮多噬菌体库中获得的集落接种在1ml的2xYTCM(2％葡萄糖,5mM MgCl₂)培养基中，并置于96孔深孔板(Bionia，90030)中，并在37℃培养箱中孵育16小时。取100-200的经孵育的细胞培养物，使其OD600为0.1，并接种至1ml的2xYTCM(2％葡萄糖，5mM MgCl₂)培养基中并在37℃培养箱中孵育2-3小时。孵育后，以1∶20的M值加入M1辅助噬菌体，并接种至2xYTCMK(5mM MgCl₂，1mM IPTG)中，并在30℃孵育16小时。

结果，获得了总计36种抗原特异性克隆，并对这36种克隆的序列进行了分析，以获得具有不同于现有序列的独特序列的18种克隆(表8)。

[表8]

18种优化克隆的种系抗体相似度

实施例11：抵抗素人抗体的产生

实施例11-1：转化为IgG形式

将18种筛选的抗抵抗素单克隆噬菌体抗体从scFv结构转化为IgG结构。为了将每个克隆的DNA插入到整个载体中，进行了其中在每条重链和轻链之前和之后添加限制性酶序列的PCR。用限制性酶并用连接酶(T4 DNA连接酶，thermofisher scientific，#EL0011)处理所得的重链和轻链DNA以及整个载体，随后在室温下进行10分钟的连接反应以将重链和轻链序列插入载体。将所制备的载体在42℃下热休克转染至感受态细胞(XLI-blue)中，并然后铺展在LB氨苄青霉素平板培养基上并在37℃下孵育至少16小时以获得集落。将获得的集落接种在LB氨苄青霉素培养基上，并在37℃下孵育16小时。孵育结束后，收获菌落培养物并以3000rpm离心以获得上清液。使用DNA制备试剂盒(Nuclogen)从上清液中提取DNA。

实施例11-2：人抗体蛋白的产生

将所克隆的重链载体和轻链载体DNA以6∶4(轻链∶重链)的比率共转染至HEK293F细胞。将载体DNA与聚乙烯亚胺(PEI)混合以进行多聚物反应并转染至细胞中。在转染的第7天，收获培养物并用重组蛋白A琼脂糖树脂纯化上清液中的蛋白。通过使用纳米液滴测量280nm处的吸光度来定量经纯化的蛋白的浓度，并基于此评价每种克隆的生产率(表9)。

结果，与亲本抗体5A2克隆相比，生产率平均提高了92％(图13)。

[表9]

18种经优化的抗体的蛋白产量

而且，通过在SDS-PAGE上添加还原和非还原蛋白来分析条带的模式，从而分析所产生的蛋白的纯度和大小来评价蛋白的表达。

结果示出，在非还原条件下，所有筛选的18种抗体的大小为150kDa，而在还原条件下，检测到两种大小的蛋白，预计其重链为～50kDa且其轻链为～25kDa(图14)。

实施例12：抵抗素人单克隆抗体的特征的评价

实施例12-1：抗原特异性和非特异性结合(包括结合人完整形式(human intact)的能力)

进行酶联免疫特异性测定(ELISA)以确定抵抗素优化的抗体蛋白的抵抗素抗原特异性结合。将实施例1中制备的RETN-flag-His抗原和非特异性抗原在DPBS稀释至10nM，并以每孔100μl加入至96孔免疫板(NUNC，439454)，并在4℃包被16小时。然后用在PBS中稀释至4％的脱脂乳在37℃下封闭1小时。将抗体蛋白用在PBS中稀释的1％脱脂乳分别稀释至1、10和100nM，每孔加入100μl，并在37℃下孵育2小时。用PBS-T洗涤后，将作为第二抗体的抗人Fc-HRP(Pierce(R)过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG Fc(thermo fisher scientific，31413))稀释至1:10,000，并在37℃下反应1小时。经PBS-T洗涤后，将100μl的TMB(sigma，T0440)溶液施加至每个孔中进行10min底物反应。10分钟后，通过用50μl的1N H₂SO₄处理每个孔来停止底物反应，并使用分光光度计(thermo fisher scientific，51119200)在490nm处进行测量。

结果，除了少数克隆(LS_1F09，LS_1G11)之外，大多数克隆都显示出类似于5A2的抗原结合反应(图15a)。另外，针对5种非特异性抗原的所有18种经优化的抗体都没有显示出非特异性结合(图15b)。

实施例1中产生的抗原具有在抗原的c-末端人工添加的人抗体Fc序列或组氨酸序列以便于纯化和分析。为了证实天然状态下对抗原的作用与人工构建的抗原上鉴定的抗体的作用相同，使用与天然结构相同的重组人抗原(重组人抵抗素，peprotech，#450-19)进行了酶联免疫特异性测定(ELISA)。除了产量和抵抗素抗原结合率显著低于亲本抗体5A2克隆的5种抗体(即LS_1E09、LS_2B10、LS_2B12、LS_2E11和LS_2D09)之外，对13种优化的抗体进行了评价。将重组人抗原(peprotech，#450-19)在96孔免疫板(NUNC，439454)中在DPBS中稀释至浓度为10nM，每孔100μL并在4℃下包被16小时然后用在PBS中稀释至4％的脱脂乳在37℃下封闭1小时。将抗体蛋白用在PBS中稀释的1％脱脂乳分别稀释至1、10和100nM，每孔加入100μl，并在37℃下孵育2小时。用PBS-T洗涤后，将其与作为第二抗体的抗人Fc-HRP(Pierce(R)过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG Fc(thermo fisher scientific，31413))以1∶10,000的稀释度在37℃下孵育1小时。经PBS-T洗涤后，将100μl的TMB(sigma，T0440)溶液施加至每个孔中进行10min底物反应。10分钟后，通过用50μl的1N H₂SO₄处理每个孔来停止底物反应，并使用分光光度计(thermo fisher scientific，51119200)在490nm处进行测量。

结果，包括亲本抗体5A2在内的所有克隆都显示出以与传统his标签抵抗素的结合方式非常相似方式与完整形式抵抗素的结合。由此，预期可以推断候选克隆针对天然抗原的效力(图15c)。

实施例12-2：与小鼠抗原的物种交联反应

除了产量和抵抗素抗原结合能力显著低于亲本抗体5A2克隆的5种抗体LS_1E09、LS_2B10、LS_2B12、LS_2E11和LS_2D09之外，进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以研究8种经优化抗体与小鼠抵抗素抗原的跨物种结合反应。小鼠抗原是来自peprotech的鼠抵抗素(#450-28)。小鼠抗原在DPBS的96孔免疫板(NUNC，439454)中稀释至10nM，每孔加入100μl并在4℃包被16小时然后用在PBS中稀释至4％的脱脂乳在37℃下封闭1小时。将抗体蛋白用在PBS中稀释的1％脱脂乳分别稀释至1、10和100nM，每孔加入100μl，并在37℃下孵育2小时。用PBS-T洗涤后，将其与作为第二抗体的抗人Fc-HRP(Pierce(R)过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG Fc(thermo fisher scientific，31413))以1∶10,000的稀释度进行稀释并在37℃下反应1小时。经PBS-T洗涤后，将100μl的TMB(sigma，T0440)溶液施加至每个孔中进行10min底物反应。10分钟后，通过用50μl的1N H₂SO₄处理每个孔来停止底物反应，并使用分光光度计(thermo fisher scientific，51119200)在490nm处进行测量。

结果，与对RETN-flag-His抗原的结合能力不同，亲本抗体5A2克隆和8种经优化的抗体不与小鼠抗原结合。这证实了没有发生针对小鼠抵抗素的跨物种结合反应(图16)。

实施例12-3：使用抗原-受体竞争性ELISA(抵抗素-CAP1竞争性ELISA)进行的抗原-受体结合抑制能力分析

为了评估抗体结合抵抗素和抑制抗原-受体结合的效力，进行了抗原-受体竞争性酶联免疫特异性测定(ELISA)。用抗原蛋白包被96孔板，用不同浓度的抗体处理，并且然后用受体处理以检测与抗原结合的受体蛋白。图17a示出了该测定的示意图。经包被的抗原蛋白是实施例1中制备的RETN-C-Fc蛋白，并且受体蛋白是购买的组氨酸缀合的CAP1-His(LSbio，LS-G13682-100)。

将在DPBS稀释至100nM的RETN-C-Fc蛋白以每孔100μl加入至96孔免疫板(NUNC，439454)，并将其在室温下包被16小时。然后用在PBS中稀释至4％的脱脂乳在37℃下封闭1小时。将抗体蛋白从500nM的峰值浓度系列稀释5倍至0.0064nM，每孔加入100μl并在室温下孵育2小时。用PBS-T洗涤后，将CAP1-His用在PBS中稀释的1％脱脂乳进行稀释至100nM，每孔加入100μl并在室温下孵育2小时。用PBS-T洗涤后，将抗组氨酸-生物素(Invitrogen，MA1-21315-BTIN)在PBS中的1％脱脂乳中稀释至1:2000，每孔加入100μl，并在室温下反应1小时，随后将链霉亲和素-HRP(thermo fisher scientific，21140)稀释至1:1000，并在室温下反应1小时。经PBS-T洗涤后，将100μl的TMB(sigma，T0440)溶液施加至每个孔中进行10min底物反应。10分钟后，通过用50μl的1N H₂SO₄处理每个孔来停止底物反应，并使用分光光度计(thermo fisher scientific，51119200)在490nm处进行测量。

结果，在实施例11和实施例12中生产率和抗原结合能力优于亲本抗体5A2的克隆中，选择了抗原-受体结合抑制能力高于5A2的前7种克隆(5A2_LS_1F11、5A2_LS_2B02、5A2_LS_2D07、5A2_LS_2F11、5A2_LS_2G03、5A2_LS_2E10和5A2_LS_2H10)(图17b)。

实施例12-4：抗原受体结合抑制能力分析

使用体外拉下实验通过抑制CAP1与抵抗素的结合从候选抗体库中筛选出抗体。将THP-1细胞裂解物与Fc融合的重组溶素蛋白和每种抗体混合，并用Fc珠粒进行沉淀，并通过蛋白质印迹法测量结合的CAP1以比较抵抗素和CAP1的结合以及每种抗体的结合抑制效果。

具体地，通过保藏机构(distributor)美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection,ATCC)的细胞系培养方法获得THP-1(ATCC TIP-202，智人(Homosapiens)，人)细胞。将THP-1细胞在保持在37℃、CO₂和5％分压下的培养箱中，在RPMI-1640培养基(在pH 7.4，包含100单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)中进行培养。用裂解缓冲液(20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、1％ Triton X-100、0.25％脱氧胆酸钠、1mM EDTA、1mM NaF、1mM Na₃VO₄和蛋白酶抑制剂混合物)裂解THP-1细胞以提取蛋白，并将100ng的mFc-h抵抗素(mFc-hResistin)(0.5μg)蛋白和抗体加入经提取的THP-1蛋白(500μg)中并在4℃下孵育过夜。加入mFc珠粒(20μl)并在4℃拉下(pull down)3小时后，将它用裂解缓冲液洗涤三次，然后加入包含β-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液，在100℃下煮沸5分钟，并离心以获得上清液。通过使用hCAP1抗体和mFc-HRP抗体的蛋白质印迹证实VS肽对hCAP1和mFc-h抵抗素的结合是否被抑制。

结果，获得了优于亲本抗体5A2的抗体(图18)。

实施例12-5：使用Octet(Forte bio)系统研究抗体和抵抗素抗原之间的亲和力

为了研究抗体和抵抗素抗原之间的亲和力，使用了Octet(Forte bio)系统，该系统能够使用生物传感器实时研究配体-受体结合。该系统是一种将抵抗素抗原蛋白结合到生物传感器上的仪器，使抗体流过它，并光学地分析抗体与结合到传感器上的抗原的结合程度，在光波长水平上以高灵敏度测量抗体与抗原的结合水平。将对抵抗素抗原的亲和力表示为受体和配体之间的K_on(缔合常数，结合率)和K_dis(解离常数，解离率)，以及结合和解离反应的KD(平衡解离常数)。

结果，在抗原-受体竞争性酶联免疫特异性测定中优于亲本抗体的7种抗体的抗原亲和力为KD 1nM或更小，其皆等于或优于亲本抗体5A2(图19)。

实施例13：抵抗素抗体的抗癌作用的分析

实施例13-1：抵抗素对NF-κB的激活

为了确定抗体对NF-κB活性的影响，当用抵抗素转染MB231细胞以激活NF-κB并加入5A2和IgG时，通过p65的磷酸化来测量NF-κB的活性(图20)。

具体地，使用保藏机构(distributor)美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection,ATCC)的细胞系培养方法，将MDA-MB-231(ATCC HTB-26，智人，人)293F细胞系在保持在37℃和5％ CO₂分压下的培养箱中，在DMEM培养基(pH 7.4，包括100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中进行培养。将每孔5.0x 10⁵个MB-231细胞接种至四个6孔板中，并在含1％FBS的DMEM(英杰生命技术公司(Invitrogen Life Technologies))培养基中用100ng/ml抗抵抗素5A2(Y-BIOLOGICS/ANRT)处理6小时，随后用50ng/ml重组人抵抗素(Y-biologic s/ANRT，韩国)连续处理10、30和60分钟。

对于蛋白质印迹分析，收获等量的细胞裂解物，并在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中裂解(Roche，Cat.11836153001)。将总蛋白(10至30μg)用以下特异性第一抗体进行免疫印迹；磷酸-Src(Tyr416)(Cell signaling Technology，#6943)、p-p65(Ser276)(Cellsignaling Technology,#3037)、总p65(Santa Cruz Biotechnology，sc-372)、p-CREB(Ser133)(Santa Cruz Biotechnology，sc-101663)、总CREB(Cell signalingtechnology,#9197)以及α-微管蛋白(Calbiochem，Cat.CP06)。抗小鼠IgG HRP和抗兔IgGHRP作为第二抗体购自Promega，并用ECL和ECL-PLUS(Amersham)检测。

实施例13-2：离体癌细胞迁移分析

为了确定抗体对抵抗素诱导的癌细胞迁移的影响，在用5A2抗体和IgG处理的MB231乳腺癌细胞系上进行细胞迁移实验。

将5x10⁵个MDA-MB-231乳腺癌细胞在6孔板中进行培养。在90％密度下，使用补充有1％血清的RPMI1640培养基使它们饥饿24小时。然后使用200p吸嘴(tip)造成划痕，随后加入100ng/ml重组抵抗素、100ng/ml人正常IgG和100ng/ml 5A2抗体。6小时后，使用徕卡显微镜(DMI3000 B)观察经迁移的细胞，并使用Image J软件基于细胞的迁移面积进行定量。

结果示出，100ng/ml抵抗素使MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移增加了大约137％。用作阴性对照组的人正常IgG将乳腺癌细胞迁移至与单独的抵抗素相似的水平，但是与单独的抵抗素相比，与抗抵抗素抗体5A2共处理抑制了55％的细胞迁移，与运载体(vehicle)组相比，抑制了76％的细胞迁移(图22)。

实施例13-3：体内癌细胞的转移

为了测量药代动力学，向小鼠给药5A2抗体和hIgG对照组以进行药代动力学实验(图21)。

此外，为了证实在体内5A2抗体对乳腺癌细胞的转移抑制能力，使用腺病毒在NOD/SCID小鼠中诱导高抵抗素血症(hyper-resistinmia)。通过发光图像和组织收获证实了高抵抗素血症促进了乳腺癌细胞向肝和肺的转移。具体地，将1x10⁷ pfu的Adv.GFP和Adv.hResistin腹腔注射(I.P.)至NOD/SCID小鼠中，并在一周后静脉内注射(I.V.)6x10⁵个过表达荧光素酶的MDA-MB-231细胞以诱导向相应器官的转移。然后，同时注射10mg/kg人正常IgG和10mg/kg 5A2抗体，并且此后以每周3次的频率连续给药。在第4周，对于给药150mg/kg荧光素的每个实验组都获得了发光图像。使用KODAK FX-PRO仪器获取图像。

以10mg/kg 5A2抗体给药4周(每周3次)导致向这些器官的转移显著减少。此外，当对可以通过收获相应的组织用肉眼识别的转移集落的数量进行比较时(图23中的箭头)，发现在5A2抗体组中转移集落的数量显著减少(图23)，类似于发光图像结果。

实施例14：抵抗素抗体对非酒精性脂肪性肝炎的作用分析

实施例14-1：抵抗素抗体在改善高脂肪饮食诱导的NASH中的作用的证实

为了确定抗体是否改善由高脂肪饮食诱导的NASH，用高脂肪饮食诱导小鼠2个月，高脂肪饮食喂食1个月并通过静脉内注射(I.V.)给予5A2(图24)。

将小鼠肝脏组织在4％ PFA中固定5天，然后石蜡包埋并用H&E染色，并将结果作为非酒精性脂肪性肝病活动评分(NAS)进行测量。5A2抗体组的NAS评分显著降低(图25)。

将小鼠肝组织制成OCT块并用油红O染色，并且结果示出，在5A2抗体组中中性甘油三酯和脂质显著减少(图26)。

实施例14-2：由抵抗素抗体使胰岛素敏感性增强的证实

5A2给药后4周进行胰岛素耐量试验。在测试前12小时，保持小鼠禁食并提供水。在胰岛素给药前，剪下小鼠尾的尖端，使用Roche AccuCheck血糖仪测量空腹血糖。然后，通过腹腔注射(I.P.)给药胰岛素0.75IU，并在15、30、60和120分钟时测量血糖。

结果示出，5A2抗体组中的胰岛素敏感性更高，特别是，在给药胰岛素后30分钟时，空腹血糖降低了56％，比对照组降低了20％或更多(图27)。

实施例14-3：抵抗素抗体在降低空腹血糖水平中的作用的证实

5A2给药后4周进行空腹血糖测试。将小鼠禁食12小时，并提供水。通过剪短小鼠尾的尖端并使用Roche AccuCheck血糖仪获得用于血糖测量的血液。

结果示出，过表达人抵抗素的人源化抵抗素小鼠的空腹血糖降低了105.2mg/dL，其低于对照组的空腹血糖(125.5mg/dL)(图28)。

实施例14-4：抵抗素抗体的降低LDL-胆固醇作用的证实

使用毛细血管血液收集管收集小鼠血液并分离成血清。将由胆固醇检测试剂盒(ab65390)提供的沉淀缓冲液与等量的血清混合，以13,000rpm离心，并分离成上清液(高密度脂蛋白)和沉淀(低密度脂蛋白)。将沉淀溶解在PBS中以获得LDL。两个独立实验的结果示出，与对照组相比，5A2抗体组中的LDL显著降低(图29)。

实施例14-5：抵抗素抗体在降低甘油三酯积累中的作用的证实

将50mg的小鼠肝脏在冷PBS中洗涤若干次，并在1ml的5％NP-40/ddH2O中均化。然后将其加热到100℃以溶解甘油三酯。使用甘油三酯测定试剂盒(ab65336)测量甘油三酯，并且与对照组相比，在5A2抗体组中观察到30％或更多的降低(图30)。

实施例15：抵抗素抗体对炎性肠病(IBD)的作用的分析

为了确定抗体是否可以改善急性肠疾病，通过用葡聚糖硫酸钠(DSS)以5％的浓度在饮用水中供水5天来诱导肠疾病，随后在第1-3天静脉内注射(I.V.)盐水、Remsima(1mg/kg)和RETN-5A2_LS_2F11抗体(10mg/kg)(图31)。

从给药DSS开始，每日测量小鼠体重，并且体重减轻在第3天开始发生。与盐水组相比，Remsima和RETN-5A2_LS_2F11两者均引起较少的体重减轻，其中RETN-5A2_LS_2F11比Remsima更有效，其相差3.6％(图32)。

疾病活动评分(DAI)是体重减轻(％)、粪便质量和血便的组合，以0到4的评分标准进行评分并求和。从开始给药DSS开始每日测量DAI，并在第3天开始增加。与盐水组相比，Remsima和RETN-5A2_LS_2F11两者均导致DAI的较小增加，其中RETN-5A2_LS_2F11比remsima更有效，其相差1.4(图33)。

小鼠结肠长度是从盲肠到肛门的测量的。在正常组中，肠的长度为7.1cm，DSS使肠的长度减少到4.9cm。与盐水组相比，Remsima和RETN-5A2_LS_2F11两者中的小鼠肠的长度减少的程度较低，其中RETN-5A2_LS_2F11示出比Remsima更好的肠长度保护，其相差0.5cm(图34)。

将小鼠结肠组织在4％ PFA中固定5天，然后石蜡包埋并用H&E染色，并通过组织学评分测量结果。与盐水组相比，Remsima和RETN-5A2_LS_2F11两者均引起组织学评分的较小增加，其中RETN-5A2_LS_2F11比remsima更有效，其相差0.8(图35)。

工业实用性

本发明的与抵抗素结合的新抗体或其抗原结合片段可以通过阻断抵抗素/CAP1结合来抑制抵抗素的活性，并且因此可用于开发与抵抗素相关的各种疾病的治疗剂。

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但是本领域的技术人员将会理解，提供该描述是为了说明的目的而阐述优选实施方式，并且不应该被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物来限定。

序列表自定义文本

附上电子文件。

Claims

1.一种与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段，包括：

重链可变区，其包括含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3；以及

轻链可变区，其包括含有选自由SEQ ID NO:4至11组成的组的氨基酸序列的CDR1、含有选自由SEQ ID NO:12至19组成的组的氨基酸序列的CDR2以及含有选自由SEQ ID NO:20至27组成的组的氨基酸序列的CDR3。

2.根据权利要求1所述的与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中，所述轻链可变区是：

3.根据权利要求1所述的与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述的与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中，所述轻链可变区包括选自由SEQ ID NO:32、34、36、38、40、42、44和46组成的组的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段，包括：重链可变区，其包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及

轻链可变区，其包括选自由SEQ ID NO:32、34、36、38、40、42、44和46组成的组的氨基酸序列。

6.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区。

7.根据权利要求6所述的核酸，其中，所述核酸包括SEQ ID NO:30的序列。

8.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区。

9.根据权利要求8所述的核酸，其中，所述核酸包括选自由SEQ ID NO:48、50、52、54、56、58、60和62组成的组的序列。

10.一种表达载体，其包括编码根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段的所述重链可变区的所述核酸和编码根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段的所述轻链可变区的所述核酸。

11.一种细胞，所述细胞用根据权利要求10所述的表达载体转化。

12.根据权利要求11所述的细胞，其选自由以下组成的组：动物细胞、植物细胞、酵母、大肠杆菌(E.coli)和昆虫细胞。

13.一种产生与抵抗素特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，包括以下步骤：

(a)培养根据权利要求11所述的细胞；和

(b)从细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

14.一种抗体药物缀合物(ADC)，其中，药物与根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段缀合。

15.根据权利要求14所述的抗体药物缀合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段经由接头与药物连接。

16.根据权利要求15所述的抗体药物缀合物，其中，所述接头是可切割接头或者不可切割接头。

17.根据权利要求14所述的抗体药物缀合物，其中，所述药物是化疗剂、毒素、微小RNA(miRNA)、siRNA、shRNA或放射性同位素。

18.一种双特异性或多特异性抗体，其包括根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段。

19.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段。

20.一种免疫细胞，包括根据权利要求19所述的嵌合抗原受体。

21.根据权利要求20所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是T细胞或NK细胞。

22.一种用于预防或治疗可通过抑制抵抗素活性来治疗的疾病的药物组合物，包括根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求14所述的抗体药物缀合物、根据权利要求18所述的双特异性或多特异性抗原受体或者根据权利要求19所述的嵌合抗原受体。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中，所述抵抗素的活性通过经由抵抗素抗体阻断抵抗素/CAP1结合来抑制。

24.根据权利要求22所述的药物组合物，其中，能够通过抑制所述抵抗素的活性来治疗的疾病是癌症、心血管代谢性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病。

25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、转移癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、肝癌、胶质母细胞瘤、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、胃癌、胰腺癌和复发性癌。

26.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，所述心血管代谢性疾病选自由以下组成的组：肥胖症、高脂血症、高血压、动脉粥样硬化、高胰岛素血症、胰岛素抵抗性糖尿病、2型糖尿病、肝病、非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎。

27.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：慢性心脏病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、消化性糖尿病、特应性皮炎、自身免疫性脑脊髓炎、哮喘和克罗恩病。

28.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，所述炎性疾病选自由以下组成的组：炎性皮肤病，诸如哮喘、湿疹、银屑病、痤疮、过敏、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、过敏性皮炎、慢性鼻窦炎或脂溢性皮炎；炎性肠病(IBD)，诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎；以及急性或慢性炎性疾病，诸如强直性脊柱炎、脓毒症、脓毒性休克、血管炎和滑囊炎。