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KR101757346B1 - 항-emap ii 항체 및 이의 용도 - Google Patents

항-emap ii 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR101757346B1
KR101757346B1 KR1020170038706A KR20170038706A KR101757346B1 KR 101757346 B1 KR101757346 B1 KR 101757346B1 KR 1020170038706 A KR1020170038706 A KR 1020170038706A KR 20170038706 A KR20170038706 A KR 20170038706A KR 101757346 B1 KR101757346 B1 KR 101757346B1
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antibody
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antigen
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seq
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박상규
강국진
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아주대학교산학협력단
(주)엘앤케이바이오메드
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Abstract

본 발명은 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산 분자, 또는 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 EMAP II 매개 질환, 예컨대, TNF-α 매개 질환 또는 알츠하이머병의 예방, 치료, 또는 진단에 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 EMAP II 항원의 검출 또는 정량에 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 종래의 항-EMAP II 항체에 비해 향상된 항원 결합능력을 나타내고, 보다 효과적으로 TNF-α 매개 질환을 치료할 수 있다.

Description

항-EMAP II 항체 및 이의 용도{Anti-EMAP II Antibody and Use thereof}
본 발명은 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산 분자, 또는 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 EMAP II 매개 질환, 예컨대, TNF-α 매개 질환 또는 알츠하이머병의 예방, 치료, 또는 진단에 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 EMAP II 항원의 검출 또는 정량에 사용하는 방법에 관한 것이다.
내피 단핵구 활성화 폴리펩티드 II(endotherial monocyte activating polypeptide II; EMAP II)는 아폽토시스가 진행되는 동안 전구 단백질인 p43 단백질의 C-말단 부위가 활성화된 케스페이즈-7에 의하여 분리되어 생성된다(Behrensdorf et al., FEBS Lett . 466:143-147, 2000).
EMAP II는 염증유발 반응을 매개하는 인자로, 단핵성 식세포(mononuclear phagocyte) 및 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leucocytes)에서 조직 인자(tissue factor), 종양괴사인자(tumor necrosis factor; TNF) 및 인터루킨-8(interleukin-8; IL-8)이 발현되도록 유도한다. EMAP II mRNA가 과발현되는 조직에서는 대식세포가 축적되는데, 이것은 EMAP II가 죽은 세포로 대식세포를 유인하는 화학주성 물질이라는 것을 의미한다. EMAP II는 사이토카인으로 작용하며, EMAP II N-말단의 15개 아미노산이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Knies, U. E. et al., PNAS USA, 95:12322-12327, 1998 등).
대한민국 공개특허 제2010-0093451호는 EMAP II(또한, ‘SCYE1’라고도 불림) 단백질에 특이적인 항-EMAP II 단일 클론 항체를 개시하고 있고, 이것이 염증 질환의 진단 및 치료에 이용될 수 있으며, 염증 반응을 매개하는 TNF-α 분비를 저해하고, 알츠하이머병의 치료에 효과를 나타냄을 보여준다. 또한, 대한민국 공개특허 제2012-0118918호는 인체 내에서 면역반응이 최소화된 항-EMAP II 키메라 또는 인간화 항체를 개시하고 있고, 이것이 EMAP II에 특이적으로 결합하는 모체 단일클론 항체와 동등한 결합 능력을 갖음을 보여준다.
만약, 모항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 중 특정 위치의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환이 발생한 항체 변이체가 보다 향상된 항원-항체 결합능력을 나타낸다면, 보다 적은 용량으로도 모항체와 동등하거나 그 이상의 치료 효과를 나타내면서도, 약물 부작용을 낮추고 보다 안정적인 투여가 가능해진다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 보다 향상된 항원 결합 능력으로 EMAP II에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 기존의 항체보다 EMAP II 결합 능력이 향상되고 TNF-α 억제 효과 및 관련 질환의 치료 효과가 현저히 우수한 신규 항체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 EMAP II 항원에 대한 결합 능력이 향상된 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 EMAP II 항원 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이들을 이용한 EMAP II 항원의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 EMAP II 매개 질환, 예컨대 TNF-α 매개 질환 또는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
1. 항-EMAP II 항체 및 그의 항원 결합 단편
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 항원 결합능력이 향상된 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 기존의 항체에 비해 EMAP II에 높은 친화도로 결합하여 이의 활성을 억제함으로써 우수한 TNF-α 억제 효과를 나타내므로, 항체 단독 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체 등과 함께 EMAP II 매개 질환, 예컨대 TNF-α 매개 질환 또는 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 항-EMAP II 항체는 서열번호 7로 구성된 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 구성된 경쇄 CDR2, 서열번호 11로 구성된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 12로 구성된 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 구성된 중쇄 CDR2, 서열번호 16으로 구성된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 항-EMAP II 항체의 일 구체예로서, 항-EMAP II 항체는 서열번호 3으로 구성된 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 항체는 인간화 항체일 수 있고, 구체적으로 인간 카파 또는 IgG 유래 불변 영역을 포함할 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일 클론 항체, 다클론 항체, 전장항체(full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한 상기 용어, “항체”는 이가(bivalent) 또는 이중 특이성 분자(예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단일 클론 항체”는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일 클론 항체는 다클론 항체가 여러 개의 에피토프에 결합할 수 있는 것과 달리, 특정 에피토프에 대해 단일 결합성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, “전장항체”는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에서 용어, “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH 및 3 개의 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, “경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VL 및 불변 영역 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체 변이체(antibody variant)"는 모항체의 아미노산 서열에 일부를 치환, 부가, 결실시켜 모항체보다 항체의 친화도 등을 개선시킨 변이체를 의미하며, 키메라 항체, 인간화 항체 등을 포함한다. 본 발명의 항체는 대한민국 공개특허 제2012-0118918호에 개시된 항체의 변이체로서, 본 명세서에서는 “항-EMAP II 항체” 및 “항-EMAP II 항체의 변이체”를 혼용하여 사용하였다.
본 발명에서 용어, “키메라 항체”는 생쥐 항체의 가변영역 및 인간 항체의 불변영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
본 발명에서 용어, "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다. 다만, 단순히 CDR 그래프팅만을 할 경우, 인간화 항체의 친화도가 떨어지게 되므로, CDR의 3 차원 구조에 영향을 줄 것으로 생각되는 몇 개의 중요한 FR 아미노산 잔기를 생쥐 항체의 것으로 친화시킴으로써 원래 생쥐 항체의 친화도와 같은 수준으로 올릴 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항-EMAP II 항체의 항원 결합 단편을 제공한다. 항체 결합 단편은 Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv일 수 있다.
본 발명에서 용어, “단편”, “항체 단편” 및 “항원 결합 단편”은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1 개의 항원 결합 부위를 가진다. 항체 분자의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344 등에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있음), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 개선된 EMAP II 항원 결합능력을 나타낼 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항 EMAP II 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띈 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이점에 기초하여, 아르기닌, 라신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
본 발명의 구체적 일실시예에서, 본 발명의 EMAP II 항체는 비교 대상 항체에 비해 단 4개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열을 갖지만, 항원-항체 결합 능력은 약 10배 가량 향상된 놀라운 효과를 보여준다(도 2 및 도 3).
또한, 본 발명의 또 다른 구체적 일실시예에서, 본 발명의 EMAP II 항체를 관절염 유도 마우스에 투여할 경우, 우수한 TNF-α 분비 억제 효과 뿐만 아니라 우수한 관절염 증상 치료 효과를 확인하였다(도 4 및 도 5).
2. EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 재조합 벡터, 형질전환체, 및 제조 방법.
2-1. EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또 다른 양태는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자이다. 상기 항체 및 그의 항원 결합 단편은 위에서 설명한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews(1990) 90:543-584). 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR1을 코딩하는 핵산 분자, 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR2를 코딩하는 핵산 분자, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR3을 코딩하는 핵산 분자; 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR1을 코딩하는 핵산 분자, 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR2를 코딩하는 핵산 분자, 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR3을 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
상기 구현예의 한 바람직한 양태로서, 상기 핵산 분자는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
2-2. 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터
본 발명의 또 다른 양태는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “벡터”는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR1을 코딩하는 핵산 분자, 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR2를 코딩하는 핵산 분자, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR3을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 경쇄 가변 영역 염기서열; 및/또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR1을 코딩하는 핵산 분자, 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR2를 코딩하는 핵산 분자, 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR3을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 중쇄 가변 영역 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 구현예의 한 바람직한 양태로서, 상기 벡터는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자 및/또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터에서 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동가능하게 연결(operatively linked)된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “작동가능하게 연결된”은 핵산 발현조절서열(예컨대, 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., (1984) 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., (1980) 14:399-445)가 조절부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터(Appl. Environ. Microbiol. (1998) 64:3932-3938; Mol. Gen. Genet. (1996) 250:734-741) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 관련 기술 분야에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 재조합 벡터는 pCL 발현 벡터, 구체적으로 pCLS05(대한민국 등록특허 제10-1420274호) 발현벡터를 조작하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 CMV 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서 관련 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.
2-3. 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체
본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포이다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 숙주 세포일 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터로 형질전환된 적합한 진핵세포 숙주 세포는 아스페르길러스 속(Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵세포, 곤충-유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포, 그리고 식물 또는 포유동물로부터 유래한 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 숙주세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 또는 293 세포일 수 있으며, 보다 구체적으로는 차이니즈 햄스터 난소 세포일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 바람직하지 않지만, Fab 및 Fv 등의 생산에는 사용될 수 있다.
본 발명에서, 숙주세포로의 “형질전환” 및/또는 “형질감염”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 상기와 같은 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
2-4. EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 형질전환 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법이다. 바람직하게는 본 발명의 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법은 배양된 형질전환 세포에서 EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법에서 형질전환 세포의 배양은 관련 기술 분야에 공지된 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 통상의 기술자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)에 개시되어 있다. 세포 배양은, 세포의 성장 방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
동물 세포 배양에 있어, 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분 및 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글라이세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 그리고 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 질소원은, 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함할 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
형질전환된 숙주세포를 배양하여 수득한 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 컬럼의 종류와 순서는 항체의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등으로부터 선택될 수 있다.
3. 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 EMAP II 항원 검출 용도
본 발명의 또 다른 양태는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 EMAP II 항원 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이들을 이용한 EMAP II 항원을 검출하는 방법이다.
상기 EMAP II 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트는 본 발명의 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 샘플에 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 효과적으로 EMAP II을 검출할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “항원-항체 복합체”는, 샘플 중의 EMAP II 존재 여부 또는 존재량을 확인하기 위한, EMAP II와 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.
EMAP II 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 이용한 EMAP II 항원의 정량 방법은 항원-항체 복합체의 형성을 확인하여 수행될 수 있으며, 상기 항원-항체 복합체의 형성 확인은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 또는 단백질칩(Protein Chip)등에 의해 이루어질 수 있으며 이로 제한되지는 않는다. ELISA에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2 차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코오스 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코오스 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.
4. 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 의약 용도
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 높은 친화도 EMAP II에 결합할 수 있으므로, 항체 단독 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 EMAP II 매개 질환, 예컨대 TNF-α 매개 질환 또는 알츠하이머병의 진단, 치료 또는 예방에 사용할 수 있다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약학적 조성물, 의약외품 조성물, 건강식품용 조성물의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, EMAP II 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EMAP II에 결합하여 그 활성을 억제함으로써 TNF-α의 분비를 효과적으로 저해하기 때문에, TNF-α 매개 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 하나의 양태는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 TNF-α 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이다. 상기 TNF-α 매개 질환은 어른 호흡곤란 증후군, 식욕부진, 암, 만성피로 증후군, 이식편 대 숙주 거부반응, 통각과민, 염증성 장질환, 신경염증성 질환, 대뇌 국소빈혈을 포함하는 국소빈혈 또는 재관류 손상, 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서의 뇌 손상, 당뇨병, 다발성경화증, 안질환, 동통, 췌장염, 폐섬유증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 혈청반응음성 다발성관절염, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선성 관절염, 장질환성 관절염, 다발성근염, 피부근염, 공피증, 전신성 경화증, 맥관염, 대뇌 맥관염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 발열, 다연골염 및 다발성근육통, 류마티스성 및 거대세포 동맥염, 패혈증성 쇼크, 방사선요법으로 인한 부작용, 전신성 홍반성루푸스, 측두하악골 관절 질환 및 갑상선염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, “치료”는 질환의 발전의 억제, 경감 또는 제거를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암 예방 또는 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1 일 투여량은 0.1-100 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.1-10 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1-2 mg/kg일 수 있다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 질환의 치료, 예방 및 진단하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화하여 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체-치료제(기능성 분자) 및 이중특이성항체-치료제(기능성 분자) 결합체 형태로 생체내로 투입하여 암의 치료에 이용할 수 있으며, 이에 대한 설명은 상기에서 설명한 바와 같다. 약제를 특이적 표적 부위로 표적화 하는데 적당하고 바람직한 여러 가지 조건은 예를 들어 문헌[Trouet et al., Plenum Press, New York and London, (1982) 19-30]에 보고되어 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 기능성 분자를 추가적으로 결합하거나 병용 투여하여 EMAP II와 관련된 질환의 예방, 치료 및 진단에 이용할 수 있다. 상기 기능성 분자는 화학물질, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 독소, 생물작용제 및 효소 저해물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적 일실시예에서, 본 발명의 EMAP II 항체를 콜라겐-유도된 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 마우스 모델에 본 발명의 약학적 조성물을 투여할 경우, 관절염 점수 완화 및 발 두께 감소가 확연한 것을 확인하였고(도 4), 혈액 내 TNF-α 수치 억제 효과도 뛰어남을 확인하였다(도 5). 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 TNF-α 매개 질환을 포함한 EMAP II 매개 질환의 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 약제학적 유효량으로 대상체, 예컨대 인간 또는 인간을 제외한 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, EMAP II 매개 질환, 예컨대 TNF-α 매개 질환 또는 알츠하이머병의 진단, 예방 또는 치료 방법이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 개체, 예컨대 인간 또는 인간을 제외한 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, EMAP II 매개 질환, 예컨대 TNF-α 매개 질환 또는 알츠하이머병의 진단 방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "개체"란, 상기 EMAP II에 의해 매개되는 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 항-EMAP II 항체는 기존의 항체에 비해 EMAP II 항원에 보다 높은 친화도로 결합하고, 보다 우수한 EMAP II 매개 질환, 예컨대, TNF-α 매개 질환 또는 알츠하이머병의 예방, 치료 효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EMAP II 항원 검출, 또는 EMAP II 매개 질환의 예방, 치료, 또는 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 환원성(reducing) 조건 하에서 본 발명의 항-EMAP II 항체를 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 항-EMAP II 항체의 항원 결합력을 ELISA를 이용하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 항-EMAP II 항체의 항원 결합력을 SPR 분석법을 이용하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 CIA 마우스 모델에서 본 발명의 항-EMAP II 항체의 관절염 억제 효과를 나타낸다.
도 5는 CIA 마우스 모델에서 본 발명의 항-EMAP II 항체의 TNF-α 분비 저해 효능을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 관련 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1. 항-EMAP II 항체 제조
실시예 1-1. 항-EMAP II 항체 변이체 가변 영역에 대한 아미노산 서열의 확보
공지된 인간 항-EMAP II 항체(BAP015-hum03)(대한민국 공개특허 제2012-0118918호)보다 높은 항원 친화도와 TNF-α 분비 억제 효과 및 EMAP II-매개 질환의 치료 효과를 갖는 항-EMAP II 항체 변이체를 얻기 위해, 친화성 성숙화(affinity maturation)를 수행하여 BAP015-hum03 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 돌연변이를 유발하였다(Bioatla에 의뢰).
이렇게 얻은 BAP015-hum03 항체 변이체의 서열을 분석하여, 각 항체 변이체들의 항체 가변 영역의 상보성 결정 영역(complementary determining region; CDR) 아미노산 서열을 확인하였다(표 1).
번호 구분 아미노산 서열 서열번호
1 L-CDR1 KASQDVSTAVA 서열번호 7
2 L-CDR2a SASYRYT 서열번호 8
3 L-CDR2b SASYRYW 서열번호 9
4 L-CDR2c SASYGYT 서열번호 10
5 L-CDR3 QQHYSIPYT 서열번호 11
6 H-CDR1 GYTFTSYTMH 서열번호 12
7 H-CDR2a YINPSSGFTNYNQKFKD 서열번호 13
8 H-CDR2b YINPRSGFTNYRQKFKH 서열번호 14
9 H-CDR2c YTNPSSGFTNYTQKFKD 서열번호 15
10 H-CDR3 RFAY 서열번호 16
BAP015-hum03 항체의 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 영역은 각각 L-CDR1, L-CDR2a, L-CDR3의 아미노산 서열로 구성되어 있고, 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 영역은 각각 H-CDR1, H-CDR2a, H-CDR3의 아미노산 서열로 구성되어 있다. BAP015-hum03 항체 변이체의 가변 영역으로서 L-CDR1(서열번호 7), L-CDR2b(서열번호 9) 및 L-CDR3(서열번호 11)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 BAP072-LC-T056W; L-CDR1(서열번호 7), L-CDR2c(서열번호 10), L-CDR3(서열번호 11)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 BAP072-LC-R54G으로 각각 명명하였고, H-CDR1(서열번호 12), H-CDR2b(서열번호 14), H-CDR3(서열번호 16)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 BAP072-CPS-15-HC; H-CDR1(서열번호 12), H-CDR2c(서열번호 15), H-CDR3(서열번호 16)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 BAP072-CPS-08-HC로 각각 명명하였다.
BAP015-hum03 항체 및 상기 제조된 BAP015-hum03 항체 변이체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 전체 아미노산 서열은 하기와 같다(표 2).
펩티드명 CDR 구성 아미노산 서열 돌연변이
경쇄 가변영역 BAP015-hum03-LC (서열번호 1) L-CDR1
L-CDR2a
L-CDR3		 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISRLEP EDFAVYYCQQ HYSIPYTFGQ G 기준 서열
BAP072-LC-T056W
(서열번호 3)		 L-CDR1
L-CDR2b
L-CDR3		 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYWGVPS RFSGSGSGTD FTFTISRLEP EDFAVYYCQQ HYSIPYTFGQ G T056W
BAP072-LC-R54G
(서열번호 5)		 L-CDR1
L-CDR2c
L-CDR3		 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYGYTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISRLEP EDFAVYYCQQ HYSIPYTFGQ G R054G
중쇄 가변영역 BAP015-hum03-HC
(서열번호 2)		 H-CDR1
H-CDR2a
H-CDR3		 EVQLVQSGAE VKKPGATVKI SCKVSGYTFT SYTMHWVRQA PGQGLEWMGY INPSSGFTNY NQKFKDRVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCASRF AYWGQG 기준 서열
BAP072-CPS-15-HC
(서열번호 4)		 H-CDR1
H-CDR2b
H-CDR3		 EVQLVQSGAE VKKPGATVKI SCKVSGYTFT SYTMHWVRQA PGQGLEWMGY INPRSGFTNY RQKFKHRVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCFSRF AYWGQG S054R,
N061R, D066H,
A097F
BAP072-CPS-08-HC
(서열번호 6)		 H-CDR1
H-CDR2c
H-CDR3		 EVQLVQSGAE VKKPGATVKI SCKVSGYTFT SYTMHWVRQA PGQGLEWMGY TNPSSGFTNY TQKFKDRVHI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAWYYCASRF AYWGQG I051T, N061T, T069H, M093W
위 표에서 볼 수 있듯이, 친화성 성숙화로 얻은 BAP015-hum03 항체 변이체의 경쇄 및 중쇄는 모항체와 모두 동일한 CDR1 및 CDR3을 보유하고 있고, 경쇄 및 중쇄 모두 CDR2의 서열에 1 내지 3개의 아미노산 치환 돌연변이가 일어난 것임을 확인하였다.
실시예 1-2. 항-EMAP II 항체 변이체 유전자의 발현 벡터 제조
항-EMAP II 모항체 경쇄 가변 영역(서열번호 1)과 중쇄 가변 영역(서열번호 2), 실시예 1-1에서 수득한 항체 변이체 경쇄 가변 영역(서열번호 3 또는 서열번호 5)과 중쇄 가변 영역(서열번호 4 또는 서열번호 6) 영역을 포유류 발현 벡터 pBAK2b(BioAtla사) 시스템에 각각 클로닝하였다.
벡터 내에서 각각의 경쇄 가변 영역을 인간 카파 불변 영역에 대한 프레임과 융합시키고, 중쇄 가변 영역을 인간 IgG1 불변 영역에 대한 프레임과 융합시켰다. 또한, 벡터 내에서 전장 IgG1 항체의 배지 내 분비를 위한 리더 펩티드 서열을 유전자에 첨가하였다. 유전자 클로닝 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같다.
그 결과, 경쇄 가변 영역과 중좨 가변 영역을 각각 조합한 항체 BAP072-EMAP II-1, BAP072-EMAP II-2, BAP072-EMAP II-3 및 BAP072-EMAP II-4를 생산하였다(표 3).
항체명 경쇄 가변 영역 중쇄 가변 역역 불변 역역
BAP015-hum03 BAP015-hum03-LC BAP015-hum03-HC 인간 카파 경쇄 불변 영역 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역
BAP072-EMAP II-1 BAP072-LC-T056W BAP072-CPS-15-HC
BAP072-EMAP II-2 BAP072-LC-T056W BAP072-CPS-08-HC
BAP072-EMAP II-3 BAP072-LC-R54G BAP072-CPS-15-HC
BAP072-EMAP II-4 BAP072-LC-R54G BAP072-CPS-08-HC
각 벡터의 5개의 클론들을 서열분석하여 발현벡터 내에서 LC 및 HC 판독 프레임의 통합 및 서열을 확인한 뒤, CHO 세포 내에서 발현 시험을 위해 3개의 클론을 선택하였다. 이후, 3개의 클론의 글리세롤 스톡을 제조하고 엔도톡신이 없는 플라스미드 DNA를 CHO 세포 내 발현시험을 위해 제조하였다.
실시예 1-3. CHO 세포에 형질전환 후 항-EMAP II 항체 변이체의 검출
위에서 얻어진 플라스미드 DNA를 이용하여 CHO-S 세포에 대해 형질전환을 수행하였다.
먼저, 형질감염 1주일 전 CHO-S 세포(CD-CHO)(Invitrogen)를 D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Invitrogen) 보충 혈청 내 단층 배양물 내로 옮겼다. 형질감염 1일 전 96 웰 포맷 내 형질감염 시료 당 100 ㎕의 혈청 보충 D-MEM 내에 0.4×105 세포를 플레이팅하였다. 각 형질감염 시료에 대하여 DNA-리포펙타민 복합체를 준비하였다. 25 ㎕ Opti-MEM 환원 혈청 배지 내에 플라스미드 DNA 0.2 ㎍을 희석시킨 후 혼합하였다. 25 ㎕ Opti-MEM 환원 혈청 배지 내 리포펙타민 2000(Invitrogen) 0.5 ㎕를 희석시켰다. 이를 혼합한 후 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 상기 희석한 DNA와 리포펙타민을 혼합한 후, 실온에서 20분간 인큐베이션하였다. 상기 DNA-리포펙타민 복합체 50 ㎕를 세포와 배지를 함유하는 각 웰에 첨가하고, 부드럽게 혼합하였다. 5% CO2, 37 ℃ 조건에서 세포를 밤새 인큐베이션하였다. 각 웰 내 배지를 흡입 제거하고, 각 웰에 혈청 보충 D-MEM 100 ㎕를 첨가하였다.
형질감염 48 시간 후 세포 배양 상층액을 수집하고, 수집된 세포 배양 상층액 내 재조합 IgG의 농도를 정량화하기 위해 ELISA를 수행하였다. 먼저, 세포 배양 상층액 내의 재조합 BAP015-hum03과 BAP072-EMAP II-1, BAP072-EMAP II-2, BAP072-EMAP II-3, BAP072-EMAP II-4의 IgG를 플레이트 상에 고정된 항-인간 Fc 항체를 이용하여 포집하였다. 결합된 재조합 IgG를 항-인간 IgG HRP 콘쥬게이트로 검출하고 표준품으로 시판되는 인간 IgG를 이용하여 정량하였다.
보다 구체적으로, 코팅용액 내에서 10 ㎍/㎕ 친화-정제 Fc 특이적 염소 항-인간 IgG(Sigma) 100 ㎕를 포함하는 Nunc-Immuno Maxisorp 96 웰 플레이트(Nalge Nunc)를 코팅한 후, 플레이트를 밀봉하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 200 ㎕ 세척용액으로 실온에서 5분간 200 rpm으로 교반하여 세척하였다. 그리고, 200 ㎕ 블로킹 용액을 첨가한 다음 실온에서 1 시간 동안 200 rpm으로 교반하였다. 100 ㎍/㎕ 표준 농도의 정제된 인간 혈청 IgG(Invitrogen) 또는 형질감염으로부터 얻은 상층액 100 ㎕를 중복하여 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 200 rpm으로 교반한 다음, 200 ㎕ 세척 용액으로 실온에서 5분간 200 rpm으로 2회 세척하였다. 블로킹 용액 내의 HRP 접합 친화 정제 염소 항-인간 항체(Promega)의 1:5000 희석물 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 200 rpm으로 교반한 후, 200 ㎕ 세척용액으로 실온에서 5분간 200 rpm으로 3회 세척하였다. 각 웰에 Sigma TMB 기질을 첨가한 후, 실온에서 인큐베이션하였다. 이후, 1N HCl 100 ㎕을 첨가하여 반응을 종결시킨 다음, 450 nm에서 판독하였다.
실시예 1-4. 항-EMAP II 항체 변이체의 분리 정제
각각의 DNA가 형질전환된 CHO-S 세포주를 상기에 언급된 바와 같이 배양하여 배양액을 회수한 후, 단백질 A 아가로스 비드(Invitrogen)에 로딩하여 각각의 항체를 결합시켰다. 그 다음, 상기 비드를 PBS로 세척 하고 0.1M 글리신(pH 3.0)으로 용출하여 1M Tris-HCl(pH 8.0)로 중화시킨 후, 다시 20% 글리세롤이 함유된 PBS로 투석하여 비환원성(non-reducing) 조건 및 환원성(reducing) 조건에서 SDS-PAGE 겔로 항체(BAP015-hum03, BAP072-EMAP II-1, BAP072-EMAP II-2, BAP072-EMAP II-3 및 BAP072-EMAP II-4)를 확인하였다(도 1). 수득한 항체는 70 ℃에서 보관하였다.
실시예 2. 항-EMAP II 항체 변이체의 항원 결합력 확인
실시예 2-1. ELISA에 의한 항체 변이체의 항원 결합력 비교
BAP015-hum03, BAP072-EMAP II-1, BAP072-EMAP II-2, BAP072-EMAP II-3 및 BAP072-EMAP II-4 항체의 항원 결합력을 비교하기 위한 선형 범위를 확인하기 위해, 매트릭스 실험을 다음과 같이 설정하였다.
96웰 플레이트의 각 웰을 1 ㎍/ml의 농도로 100 ㎕의 EMAP II 항원으로 코팅하고 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 5% BSA를 이용하여 코팅된 항원을 블로킹하고 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, BAP015-hum03, BAP072-EMAP II-1, BAP072-EMAP II-2,BAP072-EMAP II-3 및 BAP072-EMAP II-4 항체의 희석물(0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000 ㎍/ml)을 항원에 처리한 다음 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 뒤, 항-IgG-HRP 항체를 처리하고 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 세척 완충액으로 3회 세척한 뒤, 상온에서 30분 동안 기질을 처리하였다. 발색이 진행된 후 정지 용액을 넣고 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 항체들의 항원 결합력을 테스트하였다.
그 결과, BAP072-EMAP II-2, BAP072-EMAP II-3 및 BAP072-EMAP II-4 항체의 경우 O.D 2.5에 이르기 위한 항체 농도가 약 100 ng/ml 이상으로, BAP015-hum03 항체와 동등한 수준의 결합력을 보였으나, BAP072-EMAP II-1 항체는 O.D 2.5에 이르기 위한 항체 농도가 약 10 ng/ml에 불과해, 다른 항체들에 비해 항원 결합력이 무려 약 10배 정도 큰 것으로 나타났다(도 2).
실시예 2-2. SPR 분석을 통한 항-EMAP II 항체 변이체의 항원 결합력 비교
BAP015-hum03과 BAP072-EMAP II-1의 항원 결합력을 추가로 비교하기 위하여 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR) 방법을 이용하였다. SPR은 Reichert SR7500DC system(Reichert Technologies, Depew, NY)을 이용하였고 데이터 수집은 Scrubber2 소프트웨어를 이용 하였다. EMAP II 단백질 2.5 ㎍을 PEG 칩(Reichert Technologies)에 고정시킨 후 BAP015-hum03과 BAP072-EMAP II-1 항체를 흘려주어 결합력을 비교하였다.
그 결과, BAP015-hum03 항체의 KD값은 7.09×10-10M, BAP072-EMAP II-1 항체의 KD값은 6.3×10-11M을 보여, 상기 ELISA 결과와 마찬가지로 대조군인 BAP015-hum03에 비해 BAP072-EMAP II-1가 무려 약 10배 정도 더 강한 항원 결합력을 나타낸다는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 3. 마우스 관절염 치료 효과
본 발명의 항-EMAP II 항체의 관절염 치료 효과를 확인하기 위해, 콜라겐 유도 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 마우스 모델을 이용했다. 모델 마우스 제작을 위해, 6 주령된 무병원체(pathogen free) DBA/1 마우스(암컷)을 Orient Bio에서 구입하여 7 주령이 될 때까지 유지했다.
1차 면역화(immunization)를 위해, 200 mg의 네이티브 보바인(native bovine) 타입 II 콜라겐(type II collagen)(Chondrex)을 100 ml의 10 mM 아세트산에 녹였고, 200 mg의 비활성화된 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)(Sigma-Aldrich)을 함유하는 동량의 완전 프로인트 어주번트(Freund’s adjuvant)로 4 ℃에서 12 시간 동안 1000 rpm으로 교반하면서 철저히 혼합했다. 7 주령된 암컷 DBA/1 마우스를 100 ml의 혼합물로 꼬리의 기저 부위(basal region)에 피내 주사하여 1차 면역화시켰다.
1차 면역화 21 일째에, 마우스를 불완전 프로인트 어쥬번트(Sigma-Aldrich) 내의 보바인 타입 II 콜라겐 100 mg으로 부스트하여 2차 면역화시켰다.
1차 면역화 이후 70 일 동안, 관절염 중증도를 평가하기 위해 매주 1회씩 마우스를 관찰했다. 마우스의 발 두께를 버니어 캘리퍼(vernier caliper)로 측정했다. 두 명의 독립적인 관찰자가 마우스의 총 4 개의 다리를 평가하여 0에서 5까지의 관절염 점수를 매겼다(표 4).
관절염 점수 증상
0점 관절염의 징후 없음
1점 발 또는 발가락 하나의 발적(redness);
2점 소수의 몇몇 개별 발가락이 부어오르는 발목의 미약한 부기
3점 발목의 경증의 부기
4점 발가락을 포함하는 전체 발목의 중증 팽창
5점 다관절이 연루된 염증성 사지
2차 면역화 14일 후에 CIA 마우스가 완전히 발달한 것을 관찰했다. 관절염 점수가 4점 초과인 마우스 50 마리를 6개 그룹으로 균등하게 나누었다(그룹 1, 정상 대조군; 그룹 2, 비히클 처리군; 그룹 3, 5 mg/kg의 BAP015-hum03 처리군; 그룹 4, 1 mg/kg의 BAP072-EMAP II-1 처리군; 그룹 5, 2 mg/kg의 BAP072-EMAP II-1 처리군; 그룹 6, 5 mg/kg의 BAP072-EMAP II-1 처리군). 그리고 정상 대조군 마우스를 제외한 모든 마우스를 상기 그룹에 표시된 농도의 항체로 매주 1회씩 총 4회에 걸쳐 복강내 주사한 후 관절염 점수를 측정하였다. 관절염 점수는 더블 블라인드로 진행하였다.
그 결과, 항체 처리 일주일 후부터 관절염 증상이 완화되는 것을 확인 하였다. 5mg/kg 처리군간의 비교에서, BAP072-EMAP II-1 항체는 대조군인 BAP015-hum03 항체에 비하여 치료 1주 후부터 우수한 관절염 완화와 부푼 발 두께의 완화를 나타내어 조기에 치료 효과를 달성하였다(도 4). 나아가, 대조군 BAP015-hum03 항체 5 mg/kg의 치료 효과는 본 발명의 2 mg/kg의 BAP072-EMAP II-1 항체의 치료 효과와 유사한바, 본 발명은 저용량 투여로도 기존 항체의 관절염 완화 수준을 달성하는 우수한 치료 효능을 갖는 것으로 확인되었다. 이는 실시예 2에서 확인한 것과 같은 본 발명의 BAP072-EMAP II-1의 우수한 항원 결합 능력에 따른 것으로, 이를 통해 본 발명의 우수한 관절염 치료 효능이 입증되었다.
실시예 4. 마우스 TNF-α 분비 저해 효과
본 발명의 항-EMAP II 항체의 향상된 TNF-α 분비를 저해 효과를 확인하기 위해, ELISA를 통해 항체를 처리한 CIA 마우스의 혈청 내 TNF-α 수치를 조사하였다. ELISA는 마우스 TNF-α ELISA 키트(R&D systems, USA)를 구매하여 제조사의 지시사항에 따라 수행하였다. CIA 마우스의 제조와 항체 투여 스케쥴과 같은 실험 방법은 실시예 3에 기재된 것과 같다. 실시예 3-1에서 제작된 CIA 마우스에서 일주일에 1회씩 혈액을 샘플링하여 혈청을 분리한 후, TNF-α에 대한 ELISA를 실시하였다.
그 결과, BAP015-hum03, BAP072-EMAP II-1 항체 모두 염증 인자인 TNF-α 수치가 유의미하게 감소하는 경향을 보였다(도 5). 이중 BAP015-hum03와 BAP072-EMAP II-1의 TNF-α 수치 결과를 비교하면, 본 발명의 BAP072-EMAP II-1 항체가 BAP015-hum03 항체에 비해 더 현저하게 TNF-α 수치를 감소시키는 것으로 나타났다.
즉, 본 발명의 BAP072-EMAP II-1 항체는 대표적 염증 마커인 TNF-α를 효과적으로 억제함으로써 관절염을 비롯한 TNF-α 매개 질환에 우수한 치료 효과가 있음을 보여준다.
위 실시예들은 본 발명의 EMAP II 항체 변이체 또는 그의 항원 결합 부위가 선행문헌에 개시된 EMAP II 항체에 비하여 항원 결합능력 뿐만 아니라, EMAP II 매개 질환에 매우 우수한 효과가 있음을 보여준다. 특히, 본 발명의 EMAP II 항체 변이체는 TNF-α 억제 효과가 우수하여 TNF-α 매개 질환의 현저한 치료 효과를 나타낸다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION L&K BIOMED CO., LTD. <120> Anti-EMAP II Antibody and use thereof <130> P17-019-AJOU <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BAP015-hum03-LC <400> 1 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly 100 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BAP015-hum03-HC <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 <210> 3 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BAP072-LC-T056W <400> 3 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Trp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly 100 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BAP072-CPS-15-HC <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Arg Gln Lys Phe 50 55 60 Lys His Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Phe Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 <210> 5 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BAP072-LC-R54G <400> 5 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Gly Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly 100 <210> 6 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BAP072-CPS-08-HC <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Thr Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Thr Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val His Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Trp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 <400> 7 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR2a <400> 8 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR2b <400> 9 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Trp 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR2c <400> 10 Ser Ala Ser Tyr Gly Tyr Thr 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR3 <400> 11 Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR1 <400> 12 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR2a <400> 13 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR2b <400> 14 Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Arg Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 His <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR2c <400> 15 Tyr Thr Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Thr Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 16 Arg Phe Ala Tyr 1

Claims (16)

  1. 서열번호 7로 구성된 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 구성된 경쇄 CDR2, 및 서열번호 11로 구성된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 12로 구성된 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 구성된 중쇄 CDR2, 및 서열번호 16으로 구성된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항-EMAP II(endotherial monocyte activating polypeptide II) 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 3으로 구성된 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 카파 또는 인간 IgG 유래 불변 영역을 포함하는 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv인 것을 특징으로 하는 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  7. 제6항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 제7항의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 세포.
  9. 제8항의 형질전환 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 어른 호흡곤란 증후군, 식욕부진, 암, 만성피로 증후군, 이식편 대 숙주 거부반응, 통각과민, 염증성 장질환, 신경염증성 질환, 대뇌 국소빈혈을 포함하는 국소빈혈 또는 재관류 손상, 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서의 뇌 손상, 당뇨병, 다발성경화증, 안질환, 동통, 췌장염, 폐섬유증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 혈청반응음성 다발성관절염, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선성 관절염, 장질환성 관절염, 다발성근염, 피부근염, 공피증, 전신성 경화증, 맥관염, 대뇌 맥관염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 발열, 다연골염 및 다발성근육통, 류마티스성 및 거대세포 동맥염, 패혈증성 쇼크, 방사선요법으로 인한 부작용, 전신성 홍반성루푸스, 측두하악골 관절 질환, 갑상선염 및 알츠하이머병으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 어른 호흡곤란 증후군, 식욕부진, 암, 만성피로 증후군, 이식편 대 숙주 거부반응, 통각과민, 염증성 장질환, 신경염증성 질환, 대뇌 국소빈혈을 포함하는 국소빈혈 또는 재관류 손상, 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서의 뇌 손상, 당뇨병, 다발성경화증, 안질환, 동통, 췌장염, 폐섬유증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 혈청반응음성 다발성관절염, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선성 관절염, 장질환성 관절염, 다발성근염, 피부근염, 공피증, 전신성 경화증, 맥관염, 대뇌 맥관염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 발열, 다연골염 및 다발성근육통, 류마티스성 및 거대세포 동맥염, 패혈증성 쇼크, 방사선요법으로 인한 부작용, 전신성 홍반성루푸스, 측두하악골 관절 질환, 갑상선염 및 알츠하이머병으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 질환의 진단용 조성물.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 EMAP II 항원 검출용 조성물.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 EMAP II 항원 검출용 키트.
  16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항-EMAP II 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 샘플에 접촉시키는 단계를 포함하는 샘플 내 EMAP II 항원 검출 방법.
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