DE3856549T2

DE3856549T2 - Apparat zur Zellpermeabilisierung und Zellfusion unter Verwendung elektrischer Radiofrequenz-Impulse

Info

Publication number: DE3856549T2
Application number: DE3856549T
Authority: DE
Inventors: Donald C. Chang
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1987-10-09
Filing date: 1988-10-05
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2008-10-06
Also published as: US4970154A; EP0710718B1; DE3855330T2; AU2787989A; US5304486A; DE3855330D1; EP0710718A1; DE3856549D1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Porenbildung und Verschmelzung von biologischen Zellen durch Anwendung eines leistungsstarken gepulsten elektrischen Radiofrequenz-Feldes. Im Besonderen bezieht es sich auf die Permeabilisierung und Verschmelzung von Zellen in vielen unterschiedlichen Gebieten einschließlich Gentransfektion, Mikroinjektion von Zellen, Produktion von monoklonalen Antikörpern, und dem Erzeugen neuer biologischer Spezies durch Hybridisierung.

Hintergrund

Die Porenbildung (Porierung) und Verschmelzung (Fusion) von Zellen spielt eine sehr wichtige Rolle in der modernen Biotechnologie. Ein Schlüsselschritt der Gentechnologie ist beispielsweise das Einführen von exogenem genetischen Material in eine Wirtzelle. Diese Insertion von Genen wird entweder erreicht durch Permeabilisierung der Zellmembran, um das Einbringen genetischen Materials zu ermöglichen (d. h. Gentransfektion), oder durch Fusion der Wirtzelle mit einer Zelle, welche das gewünschte genetische Material enthält. Die Zellfusion ist ebenfalls bedeutsam für die Produktion von monoklonalen Antikörpern. Der Vorgang der Produktion von monoklonalen Antikörpern setzt die Fusion von Antikörper-produzierenden Zellen mit sich kontinuierlich teilenden Krebszellen voraus (G. Galfre et al., Nature 266: 550-552 (1977; M. M. S. Lo et al., Nature 310: 794-796 (1984)). Eine hocheffektive Methode, Arzneimittelwirkstoffe, welche normalerweise nicht in die Zelle eindringen können, freizusetzen, besteht darin, die Zelle mit Liposomen oder Erythrozyten-Ghosts zu verschmelzen, welche mit spezifischen Arzneimitteln vorbeladen wurden (Schlegel & Lieber, Cell Fusion, Hrsg. A. E. Sowers, Plenum Press (1987)).
Die konventionellen Methoden der Zellverschmelzung basieren hauptsächlich auf der Wirkung von Viren (J. White et al., J. Cell Biol. 89: 674-679 (1981)); oder chemischen Agenzien, wie Polyethylenglykol (R. L. Davidson et al., Somatic Cell Genetics 2: 271-280 (1976)). Virusinduzierte und Chemikalieninduzierte Methoden zur Verschmelzung haben viele Nachteile. Nicht nur ist die Ausbeute der Fusion sehr niedrig, typischerweise weniger als 0,01%, aber die Standardverfahren zur Verschmelzung können auch beträchtliche Nebeneffekte auf die verschmolzenen Zellen ausüben, wodurch ihr Nutzen für viele Bereich sehr begrenzt ist.
Alternative Verfahren, welche die Zellverschmelzung und Zellporenbildung durch elektrische Felder induzieren, wurden entwickelt (Pohl, US-Patent Nr. 4 476 004; Sowers, US-Patent Nr. 4 622 302; Schoner, US-Patent Nr. 4 578 167; E. Neumann et al., Naturwissenschaften 67: 414-415 (1980); U. Zimmerman und J. J. Nienken, J. Membrane Biol. 67: 165-182 (1982); G. W. Bates et al., Cell Fusion, Plenum Press, Seiten 367-395 (1987)). Das Grundprinzip dieser Methoden der Elektroverschmelzung ist, ein gepulstes sehr starkes elektrisches Gleichstromfeld an die Zelle zu legen. Dieses Gleichstromfeld wird normalerweise erzeugt durch kurzes Anschalten einer Gleichstromquelle oder durch Entladen eines Kondensators. Das angelegte Gleichstromfeld hat eine Stärke von mehreren kV/cm. Dieses externe elektrische Feld induziert ein großes Zellmembranpotenzial. Wenn das Membranpotenzial eine ausreichende Größenordnung besitzt, findet ein reversibler Zusammenbruch eines kleinen Bereiches der Zellmembran statt. Dieser Zusammenbruch hat die Bildung von physischen Poren auf der Oberfläche der Zelle zur Folge. Dieser Prozess wird als Elektroporenbildung (Elektroporierung) beschrieben. Intrazelluläres und extrazelluläres Material können durch die Pore hindurch ausgetauscht werden, während sie offen ist. Nach Abschalten des Gleichstromfelds schließt sich die Pore normalerweise schnell wieder. Wenn eine Pore zwischen zwei nahe beieinander liegenden Zellen gebildet wird, wird eine zytoplasmatische Brücke über die Pore gebildet. Wenn das Gleichstromfeld abgeschaltet wird, kann sich die Pore nicht wieder verschließen. Stattdessen fängt die zytoplasmatische Brücke normalerweise an, sich zu vergrößern, was letztendlich die beiden Zellen zur Verschmelzung bringt.
Obwohl das Verfahren der Gleichstromelektroverschmelzung erfolgreich für eine Anzahl biologischer Zellen angewendet wurde, einschließlich Pflanzenprotoplasten (U. Zimmerman et al., Biochem. Biophys. ACTA 641: 160-165 (1981); G. W. Bates et al., Cell Fusion, Plenum Press, Seiten 479-496 (1987); Erythrozyen (A. E. Sowers, J. Cell. Biol. 102: 1358-1362 (1986); Chang und Hunt, Proceedings of the International Symposium on Molecular Mechanisms of Membrane Fusion, Buffalo, New York, Seite 26 (1987); D. A. Stenger und S. W. Hui, J. Membrane Biol. 93: 43-53 (1986); Tumorzellen (M. M. S. Lo et al., Nature 310: 794-796 (1984); J. Tessie et al., Science 216: 537-538 (1982); Hefezellen (H. J. Halfmann et al. Archiv. Microbiol. 134: 1-4 (1983)); und Blastomere und Eizelle (J. Z. Kubiac und A. K. Jarkowski, Exp. Cell Res. 157: 561-566 (1985)), hat die Verwendung dieses Verfahrens immer noch viele Einschränkungen. Erstens können nicht alle Zellarten mit der gleichen Leichtigkeit fusioniert werden. In der Tat ist es extrem schwierig, viele Zellarten mit Gleichstromimpulsen zu verschmelzen. Zweitens gibt es viele unbekannte Faktoren, welche die Ausbeute der Verschmelzung beeinflussen. Die Verschmelzung von bestimmten Zellarten kann in einem Labor erfolgreich sein, aber in anderen nicht. Das Gleichstrompulsverfahren ist immer noch eher eine Kunst als ein gut nachvollziehbares Verfahren. Drittens ist es sehr schwierig, das Gleichstromimpulsverfahren zur Verschmelzung von Zellen verschiedener Größe zu verwenden. Das letztgenannte Problem tritt auf, weil das Membranpotenzial, welches durch das externe Gleichstromfeld induziert wird, proportional dem Durchmesser der Zelle ist. Daher ist das induzierte Potenzial für größere Zellen stärker. Es ist fast unmöglich, eine angemessene Feldstärke für ein externes Feld zu wählen, um Zellen zweier verschiedener Größen zu verschmelzen. Wenn das externe Feld gerade ausreichend ist, um einen Membranzusammenbruch in der größeren Zelle zu induzieren, ist es nicht ausreichend, das kritische Membranpotenzial in der kleineren Zelle zu induzieren. Wenn andererseits das Externe Feld angehoben wird, um einen Membranzusammenbruch in der kleinen Zelle zu verursachen, wird das starke Potenzial, welches in der größeren Zelle induziert ist, einen irreversiblen Membranzusammenbruch und die Zerstörung der Zelle verursachen.
Weitere Beispiele bekannter früherer Verfahren sind wie folgt:
EP-A-0 128 567 offenbart ein Verfahren zur Zellverschmelzung von zwei oder mehr Zellen durch Behandlung der Zellen mit Chemikalien oder Viren zur Induktion eines Aufschlusses und durch Exposition der Zellen an ein externes nicht-homogenes elektrisches Feld mit einer Radiofrequenz von 5 kHz bis 2 MHz, und Feldstärke von 10 V/cm bis 2000 V/cm.
US-Patent Nr. 4 578 168 offenbart einen Apparat zur elektrischen Zellverschmelzung, aufweisend ein Metallgefäß als erste Elektrode und einen Draht, der die zweite Elektrode bildet eine Abdeckung verbunden mit der zweiten Elektrode, und der Möglichkeit, elektrische Strompulse anzulegen mit einer Frequenz im Bereich von 20 kHz bis 20 MHz und einem elektrischen Feld von 100 bis 500 V/cm.
US-Patent Nr. 3 095 359 offenbart ein Verfahren zur Auftrennung von Zellen, wobei Zellen einem gepulsten Radiofrequenz-elektromagnetischen Feld ausgesetzt werden, bei einer Frequenz von 1 bis 250 mc, einer Spannung von 0 bis 100 KV, mit einer Impulsdauer von 1 us bis 10 ms.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zur Porenbildung und Verschmelzung von biologischen Teilchen bereit, welche die o. g. Probleme löst. Anders als konventionelle Verfahren zur elektrischen Verschmelzung, welche Gleichstromimpulse verwenden, um ein Zusammenbrechen der Membran zu induzieren, verwendet die vorliegende Erfindung einen Impuls oder Impulse eines mit Radiofrequenz (RF) oszillierenden elektrischen Feldes, um reversibel Zellen zu permeabilisieren und Zellverschmelzung zu induzieren, wobei das Feld einen Frequenzbereich von 10 kHz bis 100 MHz aufweist; einen Impulsdauerbereich von 1 us bis 10 ms; und einen Impulsamplitudenbereich von 1 KV/cm bis 20 KV/cm. Das Hochleistungs-RF-Feld verursacht eine oszillierende Bewegung der Zellmembran durch den Prozess der Elektro-Kompression. Permeabilisierung der Zellmembran wird verursacht durch eine Kombination von elektrischem Zusammenbruch und einer örtlichen Sonikation, induziert durch das RF-Feld. Daher ist dieses oszillierende elektrische Feld effektiver zur Durchbrechung der Zellmembran als ein Gleichstromfeld. Da diese neue Methode nur physikalische Mittel (d. h. RF-elektrische Energie) verwendet, um die Zellporenbildung und Zellverschmelzung zu induzieren, ist sie frei von biologischer und chemischer Kontamination. Die vorliegende Erfindung liefert Ergebnisse in Sekunden, liefert viel höhere Ausbeuten als konventionelle Methoden und hat minimale biologische Nebeneffekte. Daher ist sie eine schnelle, saubere, effiziente und sichere Methode.
Die verbesserte Effizienz der Zellporenbildung und Zellverschmelzung, welche durch die Methode dieser Erfindung ermöglicht wird, ist von besonderer Bedeutung bei medizinischen Anwendungen. Ein Beispiel ist die Produktion von Antikörpern für therapeutische Zwecke. Da der menschliche Körper normalerweise tierische Antikörper abstößt, müssen solche therapeutischen Antikörper von Hybridomen menschlicher Zellen produziert werden; menschliche Hybridome lassen sich jedoch nur extrem schwierig durch konventionelle Methoden (einschließlich der Elektroverschmelzung durch Gleichstromfelder) bilden. Die Methode der vorliegenden Erfindung wird dazu beitragen, die Effizienz der Bildung menschlicher Hybridome zu verbessern. Ein weiteres Beispiel einer medizinischen Anwendung dieser Methode ist die Gentherapie. Viele genetische Erkrankungen können behandelt werden, indem man das therapeutische Gen in vitro in Patientenzellen einbringt und diese Zellen anschließend in den Körper des Patienten zurück verpflanzt. Die konventionellen Methoden der Zellporenbildung (einschließlich der Gleichstromfeldmethode) benötigen normalerweise eine große Anzahl von Zellen (typischerweise 5 bis 10 Millionen Zellen), um die Gentransfektion durchzuführen und sind daher zur Anwendung in der Humantherapie nicht geeignet. Andererseits ist gezeigt worden, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung in der Lage ist, geringe Anzahlen von Zellen mit hoher Effizienz zu transfizieren und für die Gentherapie außerordentlich nützlich sein wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Porenbildung und zur Schmelzung von biologischen Teilchen entsprechend den Ansprüchen 1, 11, 13, 19. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Hochleistungs-Funktionsgenerator nach Anspruch 24 zur Porenbildung und Verschmelzung von biologischen Teilchen und Zellen.
Weiterhin offenbart ist ein Verfahren zur Bildung von Hybridomzellen durch Verschmelzung von Zellen mit einem RF-elektrischen Feld.
Weiterhin offenbart ist ein Verfahren, welches die Effizienz der Produktion monoklonaler Antikörper deutlich verbessert.
Weiterhin offenbart ist die Erzeugung neuer Spezies durch die Verschmelzung von Zellen unterschiedlicher Spezies unter Verwendung von Hochleistungs- RF-Impulsen.
Weiterhin offenbart ist das Einbringen von Chemikalien und biologischen Molekülen in Zellen durch die Verfahren der Porenbildung und/oder Verschmelzung.
Daher ist durch das Erreichen der o. g. Ziele in Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Porenbildung biologischer Partikel zur Verfügung gestellt, aufweisend die Schritte des Einbringens einer Vielzahl biologischer Partikel in Lösung zwischen zwei Elektroden und des Anlegens eines gepulsten Radiofrequenz-schwingenden Hochleistungsfeldes an die Elektroden zur Porenbildung der Partikel. Die biologischen Partikel können entweder Suspensionszellen in Lösung oder adhärente Zellen in Zellkultur sein. Eine weitere Ausführung dieses Verfahrens schließt die Verschmelzung biologischer Partikel ein, wobei die suspendierten biologischen Partikel in ein Gefäß eingebracht werden, welches das Aggregieren der biologischen Partikel vor dem Anlegen des gepulsten RF-Feldes erlaubt.
Ein alternatives Verfahren schließt die Verschmelzung von biologischen Partikeln durch Anlegen eines schwachen Wechselstromfeldes (z. B. 100 bis 400 V/cm) vor und nach dem schwingenden gepulsten Radiofrequenzfeld ein. Das schwache elektrische Feld kann die Partikel dazu bringen, sich elektrophoretisch zu bewegen und "Perlenketten" zu bilden.
Die biologischen Partikel können eine Vielzahl von Materialien sein, einschließlich biologischer Zellen (Human-, Tier- oder Pflanzenzellen), Liposome, Vehikel, Erythrozyten Ghosts, Protoplasten, Bakterien und Hefen.
Das gepulste RF-Feld, welches zur Porenbildung und Verschmelzung von Zellen angelegt wird, kann ein oszillierendes Feld einer einzelnen Frequenz oder einer Mischung von Frequenzen sein. Das RF-oszillierende Feld kann im Frequenzbereich von 10 kHz bis 100 MHz mit einer Impulsdauer von ungefähr 1 us bis 10 ms und 1 Impulsamplitude von bis zu 20 KV/cm sein. In einer bevorzugten Ausführung ist das mit gepulster Radiofrequenz oszillierende Feld in einem Frequenzbereich von 0,02 MHz bis 10 MHz, einem Impulsdauerbereich von 20 bis 2000 us und einer Impulsamplitude von 2 KV/cm bis 10 KV/cm. Die Wellenform des Radiofrequenzfeldes kann sinusförmig, dreieckig, sägezahnförmig oder quadratisch sein.
Weiterhin offenbart ist die Verschmelzung von Zellen zur Erzeugung neuer Spezies, das Einbringen von Chemikalien und natürlichen oder künstlich erzeugten genetischem Material in Zellen, und die Erzeugung von Hybridomzellen. Durch die geeignete Auswahl von Zellen und Materialien können neue Spezies erzeugt werden, entweder durch die Kombination von genetischem Material von zwei verschiedenen Spezies durch die Verschmelzung ihrer Zellen, oder durch die Isolierung oder Synthese von genetischem Material und dem anschließenden Einbringen des genetischen Materials in Zellen durch sowohl Zellvorbildung als auch Zellverschmelzung. Hybridomzellen werden durch die Verschmelzung von Antikörper-produzierenden Zellen mit sich kontinuierlich teilenden Krebszellen erzeugt. Chemikalien, Arzneimittel, DNA, RNA und andere Moleküle können in Zellen eingebracht werden durch das Beladen von Vehikeln, Liposomen oder Erythrozyten Ghosts vor der Verschmelzung mit den Zielzellen.
Ein weiterer Teil der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Porenbildung oder Verschmelzung von biologischen Partikeln, aufweisend einen ein nicht leitfähiges Material aufweisenden Behälter, der zur Aufnahme von Flüssigkeit in der Lage ist, wobei der Behälter eine Einlassöffnung zum Empfangen der biologischen Teilchen aufweist. Die Vorrichtung enthält auch Elektroden, die äquidistant voneinander angeordnet sind und in den Behälter eingefügt sind. Ein Hochleistungs-Funktionsgenerator ist an die Elektroden angeschlossen und ist in der Lage, ein elektrisches Radiofrequenzfeld und/oder ein Wechselstromfeld zu erzeugen. In einer Ausführung ist der Behälter so geformt, dass biologische Partikel sich sammeln können.
Ein weiterer Teil der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Porenbildung und zur Schmelzung biologischer Teilchen, bestehend aus eine Glaskammer, die mit einem optischen Mikroskop zur Beobachtung der Porenbildung und Verschmelzung der Zellen verwendet wird.
Ein weiterer Teil ist eine Vorrichtung zur Zellporenbildung und Verschmelzung, welche tragbar ist. Diese Vorrichtung enthält einen Griff und äquidistante Elektroden. Die Elektroden können an der Seite oder am Boden angebracht sein und können in einer Vielzahl von Formen entworfen sein, einschließlich Ringe, Kreise, Doppelhelices, Quadrate, Ellipsen, konzentrische Ringe, konzentrische Quadrate, ineinander greifende Anordnungen, Spiralen und parallele Platten.
Andere und weitere Vorrichtungen, Eigenschaften und Vorteile werden offensichtlich an Hand der folgenden Beschreibung der momentan bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, welche zum Zweck der Offenlegung gemeinsam mit den begleitenden Zeichnungen beschrieben ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung wird besser verständlich durch das Nachlesen der folgenden Spezifikation und den Bezug auf die begleitenden Zeichnungen, welche ein Teil davon bilden, in der Beispiele von Ausführungen der Erfindung gezeigt werden und worin:
Fig. 1 ist ein Schema einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei eine Kammer verwendet wird, die die Schwerkraft-bedingte Ansammlung von Zellen erlaubt. 1A ist eine Draufsicht der Vorrichtung von oben, und 1B ist eine Querschnittansicht der Vorrichtung, welche die Verschmelzungskammer zeigt.
Fig. 2 zeigt Diagramme von Beispielen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Radiofrequenz-(RF)-Impulse. 2A ist ein symmetrischer Einzelfrequenz-RF-Impuls, 2B ist ein asymmetrischer RF-Impuls, 2C ist ein Mehrfachfrequenz-RF-Impuls, in 2D sind aufeinander folgende RF-Impulse verschiedener Frequenzen, und 2E ist ein schwaches Wechselstromfeld, gefolgt von einem leistungsstarken RF-Impuls, gefolgt von einem schwachen Wechselstromfeld.
Fig. 3 ist ein Schema einer Ausführung der vorliegenden Erfindung, welche eine großvolumige Kammer zur Zellporenbildung und/oder Zellverschmelzung zeigt. 3A ist eine Draufsicht der Verschmelzungskammer, und 3B ist eine Querschnittansicht, welche die Anordnung der Elektroden in der Kammer zeigt.
Fig. 4 ist ein Schema einer Kammer zur Zellporenbildung und/oder Zellverschmelzung unter lichtmikroskopischen Beobachtungen. 4A ist eine schräge Draufsicht der Kammer, und 4B ist eine Querschnittansicht der Kammer.
Fig. 5 ist ein Schema einer tragbaren Vorrichtung zur Zellporenbildung und/oder Zellverschmelzung, welche eine seitliche Kontaktanordnung verwendet. 5A zeigt eine schräge Draufsicht der Vorrichtung, und 5B zeigt eine Querschnittansicht der Elektrode, die in den Zellbehälter eingeschoben wird.
Fig. 6 ist ein Schema einer doppelhelikalen Ausführung der Elektrodenanordnung mit seitlichem Kontakt. 6A zeigt eine schräge Draufsicht der helikalen Ausführung der Elektrodenanordnung, und 6B zeigt eine seitliche Ansicht derselben Anordnung.
Fig. 7 ist eine schematische Ansicht einer Konstruktion mit segmentiertem Ring für die Elektrodenanordnung mit seitlichem Kontakt. 7A zeigt eine seitliche Ansicht der Elektrodenanordnung, 7B zeigt die Verbindung der Elektrodenringe in der Elektrodenanordnung, und 7C ist eine Draufsicht eines einzelnen Elektrodenrings.
Fig. 8 ist das Schema einer rechteckigen Elektrodenanordnung zur Zellporenbildung und Zellverschmelzung. 8A zeigt eine Seitenansicht der Elektrodenanordnung, und 5B zeigt die Verbindung der Elektrodenrechtecke in der Elektrodenanordnung.
Fig. 9 ist ein Schema einer Vorrichtung zur Zellverschmelzung und Zellporenbildung mit einer Elektrodenanordnung mit einem Bodenkontakt.
Fig. 10 ist ein Schema einer Doppelspiralkonstruktion für die Bodenkontakt- Elektrodenanordnung. 10A zeigt eine seitliche Ansicht, und 10B zeigt eine Draufsicht der Elektrode.
Fig. 11 ist eine schematische Ansicht einer Konstruktion mit konzentrischen Ringen für die Bodenkontakt-Elektrodenanordnung. 11A zeigt eine seitliche Ansicht, und 118 zeigt eine Draufsicht der Elektrode.
Fig. 12 ist eine schematische Ansicht von verschiedenen Konstruktionen für Bodenkontakt-Elektrodenanordnung. 12A ist eine Draufsicht einer quadratischen Spiralanordnung, 12B ist eine Draufsicht einer Anordnung von konzentrischen Quadraten, 12C ist eine Draufsicht einer ineinander greifenden Anordnung, und 12D ist eine Draufsicht einer Anordnung von parallelen Platten.
Fig. 13 ist ein Schema einer Sonde für die Zellporenbildung und Zellverschmelzung einer kleinen Anzahl von Zellen, wobei die RF-Methode verwendet wird. Die Außenseite der Metallelektrode ist so konstruiert, dass sie in die Löcher eine 96-Loch-Zellkultur-Platte hinein passt. 13A ist eine dreidimensionale Ansicht der Sonde, 13B ist eine Querschnittansicht, und 13C ist eine seitliche Ansicht eines Teils der Elektrode.
Fig. 14 ist ein Blockschaltbild des Apparats, der die Quelle des Wechselstromfelds für die Dielektrophorese und die leistungsstarken RF-Impulse zur Zellporenbildung und/oder Zellverschmelzung zur Verfügung stellt.
Fig. 15 ist eine Elektronenmikroskopaufnahme, welche die Oberfläche eines menschlichen Erythrozyten nach RF-Porenbildungsbehandlung zeigt. Drei RF- elektrische Feldimpulse wurden angewendet mit einem Intervall von 1 sec. Die Zellen wurden in flüssigem Freon, welches mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde, (Temperatur 90ºK), schockgefroren. Die gefrorene Probe wird durch Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie untersucht. Vergrößerung 50.000fach.
Fig. 16 ist eine Fluoreszenz-Mikroskopaufnahme, welche die Ereignisse der Verschmelzung zwischen humanen Erythrozyten zeigt. Erythrozyten wurden durch das Verfahren der Dielektrophorese in Form von Perlenketten angeordnet Ungefähr 10% der Zellen wurden vorher mit einem fluoreszenten Farbstoff, der im Fluorszenzmikroskop helle Bilder liefert, markiert. Die unmarkierten Zellen konnten nicht gesehen werden. 16A zeigt, wie die Zellen ausgesehen haben, bevor die RF-Impulse angewendet wurden. Es wurde kein Transfer des Farbstoffes zwischen markierten und nicht-markierten Zellen gesehen. 16B zeigt, wie die Zellen ausgesehen haben 4 min. nachdem 3 RF-Impulse (40 us breit, 300 kHz, 5 KV/cm, angewendet wurden. Einige der markierten Zellen verschmolzen mit ihren benachbarten unmarkierten Zellen, was den Transfer des fluoreszenten Farbstoffes zwischen ihnen ermöglichte.
Fig. 17 ist ein Diagramm, welches die gemessene Ausbeute der Verschmelzung zwischen humanen Erythrozyten unter Anwendung von drei elektrischen Impulsen (4 KV/cm, 100 us) zeigt. Es zeigt sich, dass die Ausbeute der Verschmelzung mit der Schwingungsfrequenz variiert.
Fig. 18 ist eine Zeitserie von Lichtmikroskopaufnahmen, welche die Verschmelzung einer Xanthophor-Zelle mit einer Fischtumorzelle zeigt, induziert durch gepulste RF-Felder. 15A ist vor Fusion aber nachdem die Xanthophore (durch den Pfeil markiert) mit zwei Tumorzeilen durch die Elektrophorese in nahen Kontakt gebracht wurde. 15B ist zwei Minuten nach Anwendung der RF- Impulse, 15B zeigt, das die Xanthophore schon mit der Verschmelzung mit einer der Tumorzellen begonnen hat, und 15C ist vier Minuten nach Anwendung der RF-Impulse, 15C zeigt dass die Xanthophore und die Tumorzelle komplett zu einer einzelnen runden Zelle verschmolzen sind.

Detaillierte Beschreibung

In der folgenden Beschreibung sind gleiche Teile durch die Spezifikationen und Zeichnungen hindurch mit den gleichen Bezugsziffern markiert. Die Zeichnungen sind nicht unbedingt maßstabgetreu, und gewisse Merkmale der Erfindung können im Maßstab vergrößert sein oder in schematischer Form gezeigt sein im Interesse der Klarheit und Genauigkeit. Dem Fachmann wird klar sein, dass verschiedene Substitutionen und Modifikationen an der vorliegenden Erfindung gemacht werden können, ohne das Wesen oder den Umfang der Erfindung zu verlassen.
Eine Ausführungsform weist eine Vorrichtung zur Porenbildung biologischer Partikel, aufweisend die Schritte des Einbringens von biologischen Partikeln zwischen zwei Elektroden und der Anwendung eines mit Radiofrequenz schwingenden elektrischen Feldes an den Elektroden, auf, Fig. 1. Eine Vielfalt biologischer Partikel kann verwendet werden, einschließlich biologischer Zellen, Erythrozyten-Ghosts, Liposomen, Protoplasten, Bakterien und Hefen. Die biologischen Partikel können Suspensionszellen in Lösung sein oder können adhärente Zellen in Zellkultur sein.
Wenn eine Zelle in ein elektrisches Feld gebracht wird, wird ein elektrisches Potenzial an der Zellmembran induziert. Für eine kugelförmige Zelle ist das durch ein externes elektrisches Feld induzierte Membranpotenzial
Vm = 1,5 rE cos θ (1)
worin r der Radius der Zelle ist, E die Feldstärke des externen Feldes und θ der Winkel zwischen der Feldrichtung des externen Feldes und des Normalvektors der Membran an dem spezifischen Ort ist.
Das induzierte elektrische Feld innerhalb der Membran ist
Em = Vm/d = 1,5 (r/d) E cos θ (2)
worin d die Dicke der Membran ist. Da d viel kleiner als r ist (d ist ca. 6 · 10&supmin;&sup7; cm, während r in der Größenordnung von mehreren Mikrometern liegt), ist Em circa tausendfach größer als das angelegte Feld E. Das große elektrische Feld innerhalb der Membran verursacht zwei Effekte. Erstens übt es eine starke Kraft auf die Phosphat-Gruppe der Lipidmoleküle in der Membran aus und neigt dazu, sie in Richtung des Feldes zu bewegen. Zweitens komprimiert es die Membran. Wenn das externe elektrische Feld oszilliert, durchlaufen die Lipidmoleküle innerhalb der Membran ebenfalls eine schwingende Bewegung.
In dieser Anordnung fungiert die Zelle selbst als Antenne, und die Membran ist ein Wandler, welcher die elektrische Schwingung in eine mechanische Schwingung umwandelt. Daher ist es möglich, eine Ultraschallbewegung in der Zellmembran durch Anlegen eines externen RF-Feldes zu erzeugen. Da das induzierte Potenzial an einem gegebenen Ort auf der Membran eine Funktion des Winkels zwischen der Orientierung der Membran und des elektrischen Feldvektors ist, ist das induzierte Potenzial nicht gleichförmig über der gesamten Zelloberfläche. Die angelegte Energie ist auf die Pole der Zelle fokussiert, d. h. bei θ = 0º oder 180º. Weil die Amplitude des externen Felds so eingestellt werden kann, dass es ausreichend Sonikationsleistung gibt, um die Zellmembran an den Polen, aber nicht an anderen Stellen der Membran zum Zusammenbruch zu bringen, kann die Sonikation lokal begrenzt werden. Experimente deuteten darauf hin, dass dieser lokale Membranzusammenbruch, welcher durch das extern angelegte gepulste RF-Feld induziert wird, reversibel ist. Das heißt, dass die Pore (n), die durch das RF-Feld induziert wird (werden), sich nach dem Abschalten des Feldes schnell (innerhalb von Minuten) wieder verschließen. Außerdem bleiben die meisten Zellen anscheinend lebensfähig.
Eine derartige temporäre Permeabilisierung der Zellmembran wird als Zellporenbildung bezeichnet. Während dieses Zeitabschnitts, in welchem Poren gebildet werden, findet ein kurzfristiger Austausch von intrazellulären und extrazellulären Materialien statt. Viele Moleküle, einschließlich Arzneimittel, Antikörper und Genabschnitte, welche normalerweise nicht die Zellmembran durchdringen können, können durch die temporär geöffneten Poren, welche durch das gepulste RF-Feld induziert wurden, in die Zelle eindringen.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung weist eine Vorrichtung zur Verschmelzung von Zellen auf. Damit biologische Partikel verschmolzen werden können, müssen sie sich in großer Nähe befinden. Wenn sich Zellen in großer Nähe befinden, spricht man von einem Ansammeln. Zwei alternative Verfahren können verwendet werden, um Zellen vor der Verschmelzung anzusammeln. In einem wird ein Behälter verwendet mit einer Form, die ein Ansammeln der biologischen Partikel durch Schwerkraft ermöglicht. Beispielsweise kann der Boden des Behälters in eine konkaven Form gemacht werden (siehe Fig. 1 und 3). Das ermöglicht, dass sich die Zellen ansammeln. Wenn die Zellen durch das angelegte RF-Feld permeabilisiert werden, können nahe aneinander liegende Zellen zytoplasmatische Brücken bilden. Dieser Vorgang hat die Verschmelzung der Zellen zur Folge.
Alternativ kann ein kontinuierliches Wechselstromfeld mit schwacher Amplitude an die beiden Elektroden angelegt werden. Die Frequenz liegt in einem Bereich von ca. 60 Hz bis ca. 10 MHz. Typischerweise wird eine Feldstärke von 100 bis 400 V/cm verwendet. In dem Wechselstromfeld mit niedriger Amplitude wirken die Zellen als Dipole und ordnen sich parallel zur Feldrichtung an und bilden schließlich eine lange Kette von Zellen, die aussieht wie "Perlenketten". Dieser Vorgang wird als "Dielektrophorese" bezeichnet (H. P. Schwan und LD. Sher, J. Electrochem. Soc. 116: 22C-26C (1969); H. A. Pohl et al., J. Biol. Phys. 9: 67-86 (1981)). Das Heranbilden dieser Perlenketten benötigt normalerweise ein paar Sekunden bis zu einer Minute.
Die vorliegende Erfindung benutzt ein gepulstes RF-Feld, um Zellporen zu bilden und/oder Zellen zu verschmelzen und hat einen deutlichen Vorteil gegenüber der konventionellen Elektroverschmelzungsmethode, welche ein gepulstes Gleichstromfeld verwendet. Erstens ist das RF-Feld ein viel effizientes Mittel, um Energie auf die Zellmembran zu übertragen als das Gleichstromfeld. Die vorliegende Erfindung verwendet eine örtliche Sonikation, um die Zellmembran zum Zusammenbruch zu bringen. Dieses Verfahren ist viel effizienter als das Gleichstrom-Impulsverfahren, welches sich allein auf den elektrischen Zusammenbruch verlässt. Die Zellmembran besteht aus Makromolekülen, welche charakteristische Frequenzen der thermischen Bewegung besitzen. Wenn die Frequenz des angelegten schwingenden Feldes mit einer dieser natürlichen Frequenzen übereinstimmt wird ein Resonanzzustand erreicht, und die Effizienz der Energieübertragung ist deutlich verstärkt. In realen biologischen Zellen kann der Resonanzgipfel sehr breit sein. Das gepulste Radiofrequenzfeld kann sorgfältig variiert werden, um die passende Resonanzfrequenz der vorliegenden Zellen zu erreichen. Folglich wird die Fähigkeit den Membranzusammenbruch zu induzieren, weniger Leistung benötigen als ein Gleichstromfeld und in einem geringeren Risiko, die Zelle irreversibel zu schädigen resultieren.
Zweitens beseitigt diese Erfindung die Schwierigkeiten, auf die man trifft, wenn konventionelle Verfahren verwendet werden, um Zellen verschiedener Größen zu verschmelzen. Um einen elektrischen Zusammenbruch der Zellmembran zu induzieren, muss das durch das Feld induzierte Membranpotenzial einen bestimmten kritischen Wert, Vc (typischerweise 1 V), übersteigen. Solch ein Zusammenbruch kann reversibel sein, und die Membran wird sich nach Abschalten des externen Feldes wieder verschließen, wenn das induzierte Membranpotenzial nicht sehr viel größer als Vc ist. Normalerweise bleibt die Zelle nach einem solchen reversiblen Zusammenbruch lebensfähig. Andererseits ist der Membranzusammenbruch irreversibel, wenn das induzierte Potenzial viel größer als Vc ist. Die Zelle ist permanent geschädigt und wird nicht lebensfähig bleiben. Aus Gleichung 1 ist ersichtlich, dass bei Zellen von verschiedener Größe, die in einem elektrischen Feld sind, das induzierte Membranpotenzial für die größeren Zellen stärker ist als für die kleineren Zellen. Diese Größenabhängigkeit des Membranpotenzials verursacht ein Problem, wenn man versucht, Zellen verschiedener Größe unter Verwendung eines Gleichstromfeldes zu verschmelzen. Es sei gegeben, dass zwei Zellen, A und B, verschmolzen werden sollen und dass der Radius von Zelle A, ra, etwa doppelt so groß ist wie der Radius von Zelle B, rb. Um einen reversiblen Zusammenbruch der Membran in Zelle B zu verursachen, muss das angelegte externe Feld ausreichend stark sein, so dass 1,5 E rb größer ist als Vc Das gleiche angelegte elektrische Feld wird jedoch ein viel größeres Vm in Zelle A induzieren und wird einen irreversiblen Zusammenbruch der Membran verursachen, welcher zur Schädigung dieser Zelle führt. Daher ist es sehr schwierig, Gleichstromimpulse zur Verschmelzung von Zellen von signifikant unterschiedlicher Größe zu verwenden.
Dieses Problem kann durch Anlegen eines gepulsten Radiofrequenzfeldes gelöst werden. Wenn das angelegte Feld ein mit Radiofrequenz schwingendes Feld und nicht ein Gleichstromfeld ist, ist die Amplitude des induzierten Membranpotenzials eine Funktion der Frequenz. Das in Gleichung 1 vorhergesagte Membranpotenzial ist unter der Bedingung eines stationären Zustands hergeleitet. Das induzierte Potenzial entsteht nicht augenblicklich bei Anlegen des externen Feldes. Wenn das externe Feld stationär ist, wird das Membranpotenzial Vm nach einer ausreichenden Zeit erreichen. Die Zeit, die benötigt wird, diesen stationären Zustand des Membranpotenzials zu erreichen, wird als Relaxationszeit bezeichnet, oder t, welche gegeben ist durch
1/τ = 1/RmCm + 1/rCm (Ri + 0,5 Re) (3)
worin Rm und Cm der spezifische Widerstand und die spezifische Kapazität der Membran und Ri und Re der spezifische Widerstand des intrazellulären Mediums und respektive des extrazellulären Mediums sind (C. Holzapfel et al., J. Membrane Biol., 67: 13-26 (1982). Für eine Zelle mit einem Durchmesser von mehreren Mikrometern liegt τ typischerweise in der Größenordnung von 1 us.
Da Rm in den meisten Zellen sehr groß ist, kann aus praktischen Gründen Gleichung 3 vereinfacht werden zu
τ = rCm (Ri + 0,5 Re) (4)
Daher ist die Relaxationszeit angenähert proportional dem Radius der Zelle.
Weil der Aufbau des Membranpotenzials eine Zeitdauer benötigt, welche durch die Relaxationszeit τ charakterisiert ist ist das Membranpotenzial, welches durch ein RF-Feld induziert wird, frequenzabhängig. Wenn ein Frequenzfeld mit einer Frequenz, die kleiner ist als 1/τ, angelegt wird, hat das Membranpotenzial keine Schwierigkeiten, dem externen Feld zu folgen. Das angelegte Feld wird eine 100% zelluläre Erwiderung in Vm erzeugen. Wenn andererseits die Frequenz des angelegten Radiofrequenzfeldes größer als 1/τ ist, kann das Membranpotenzial nicht mit den Veränderungen im angelegten Feld Schritt halten, und die Erwiderung des Membranpotenzials wird weniger als 100% sein. Im Allgemeinen ist das maximale durch ein RF-Feld induzierte Membranpotenzial
V(ω) = 1,5 rE cos θ X(ω) (5)
worin r, E und θ die gleiche Bedeutung haben wie in Gleichung 1, ω ist die Winkelfrequenz, und X(ω) ist eine Funktion der Frequenz, so dass
X(ω) = [1 + (ωτ)²]-1/2 (6)
wenn ω < 1/τ, nähert sich X(ω) 1.
Wenn ω > 1τ, nimmt X(ω) mit zunehmender Frequenz sehr schnell ab.
Dieser frequenzabhängige Effekt kann verwendet werden, um Zellen verschiedener Größe zu verschmelzen. Nach Gleichung 4 ist τ der Zelle etwa proportional zu r. Daher wird die größere Zelle ein längeres τ haben. Um die Zellen A und B zu verschmelzen, wird ein gepulstes RF-elektrisches Feld angelegt, das eine Freqenz ω hat so dass
1/τa < ω < 1/τb (7)
Da die Frequenz weniger als 1/τb ist, nähert sich X(ω) für Zelle B dem Wert 1 an, und das Feld wird daher einen vollen Effekt auf die kleine Zelle erzeugen. Da die Frequenz andererseits größer ist als 1/τa, kann das induzierte Membranpotenzial in Zelle A den Schwankungen des angelegten Feldes nicht vollständig folgen, d. h. X(ω) in Zelle A ist weniger als 1. Daher ist in einem gepulsten Radiofrequenzfeld der Effekt des anregenden Feldes, der von der kleineren Zelle verspürt wird, größer als der Effekt auf die große Zelle. Folglich kann ein gepulstes Radiofrequenzfeld angelegt werden, welches einen reversiblen Zusammenbruch der Membran der kleineren Zelle induziert, ohne die größere Zelle irreversibel zu schädigen.
Eine Ausführungsform einer Vorrichtung 10 zur Porenbildung oder Verschmelzung von biologischen Partikeln ist in Fig. 1 gezeigt. Es ist eine Verschmelzungskammer, welche einen nicht leitfähigen Behälter 13 enthält, der die Lösung 16 von biologischen Partikeln 19 enthält. Der Behälter hat einen leicht konkaven Boden 22, so dass die biologischen Partikel 19 sich unter Schwerkraft zwischen den Elektroden 25 ansammeln. Die Elektroden 25 sind ein Paar äquidistanter Metalldrähte oder Metallbänder aus nicht-toxischem Material, wie Platin oder chirurgischem Stahl. Die Elektroden können parallele Drähte sein oder können fast jede Form oder Konstruktion besitzen. Der Behälter 13 hat eine Zugangsöffnung 28, durch die biologische Partikel 19 zugefügt oder entfernt werden können.
Um Zellporenbildung oder Zellverschmelzung zu induzieren, erzeugt ein Hochleistungs-Funktionsgenerator 31 einen oder viele Hochleistungs-RF-Impulse, welche durch das Elektrodenpaar 25 angelegt werden. Die Form der Impulse kann die in Fig. 2 gezeigten Formen beinhalten. In Fig. 2 ist der Impuls eine symmetrische RF-Schwingung mit einer einzelnen Frequenz. In Fig. 2B besteht der RF-Impuls aus einer asymmetrischen sinusförmigen Welle mit einer einzelnen Frequenz. In Fig. 2C enthält der RF-Impuls eine Mischung aus sinusförmigen Wellen multipler Frequenzen (in diesem Beispiel zwei Frequenzen). In Fig. 2B werden alternierende sinusförmige Impulse verschiedener Frequenzen verwendet. In der bevorzugten Ausführungsform wird der in Fig. 2B gezeigte Impuls verwendet, weil er es erlaubt, die angelegte Energie des Feldes effizienter zur Induktion der Zellporenbildung oder Zellverschmelzung zu verwenden. Obwohl die bevorzugte Wellenform des radiofrequenten elektrischen Feldes sinusförmig ist, können andere Wellenformen mit sich wiederholenden Formen verwendet werden. Zum Beispiel können dreieckige Wellen, quadratische Wellen und Sägezahnwellen verwendet werden, um verschiedene Zellsorten zu verschmelzen oder Zellporen zu bilden.
Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass die Parameter des gepulsten Feldes verändert werden, um an die Eigenschaften verschiedener biologischer Proben angepasst zu werden. Die Radiofrequenz innerhalb des Impulses kann innerhalb des kompletten Radiofrequenzbereiches von 10 kHz bis 100 mHz variieren. Üblicherweise wird ein Wert in der Größenordnung von 0,02 bis 10 mHz zur Porenbildung und/oder Verschmelzung von biologischen Zellen verwendet.
Die Impulsbreite kann von etwa 1 us bis 10 ms variieren. In der bevorzugten Ausführungsform werden etwa 20 us bis 2 ms verwendet.
Die Feldstärke wird durch Variieren der Impulsamplitude geregelt. Zur Porenbildung und Verschmelzung von Zellen wird der Bereich von 1 bis 20 KV/cm verwendet. In der bevorzugten Ausführungsform werden Impulse der Feldstärke von etwa 10 KV/cm verwendet.
Der Impuls kann ein einzelner Impuls, eine Impulsfolge oder mehrere Impulsfolgen sein. Eine Impulsfolge sind mehrere Impulse mit dazwischen liegenden Intervallen; z. B. eine Serie von 10 Impulsen mit 0,5 ms Breite, wobei jeder Impuls durch 0,5 s getrennt ist. In manchen Fällen, wie der Verschmelzung von HL-60-Zellen wird die maximale Verschmelzungsausbeute durch das Anwenden mehrfacher Impulse verbessert.
Die RF-Impulse, welche für die Zellporenbildung und Zellverschmelzung verwendet werden, sind ähnlich. Der Hauptunterschied ist, dass die Zellen sich zur Zellverschmelzung ansammeln müssen (in große Nähe gebracht werden müssen), bevor der leistungsstarke RF-Impuls angewendet wird. Außerdem müssen die Zellen nach Anwendung des RF-Impulses in großer Nähe gehalten werden. Die oben beschriebene Vorrichtung brachte die Zeilen durch Schwerkraftbedingte Ansammlung zusammen. Eine alternative und effizientere Methode zur Zeltansammlung ist die Dielektrophorese, wobei ein kontinuierliches elektrisches Wechselstromfeld an die Elektroden angelegt wird vor und nach der Anwendung des leistungsstarken RF-Impulses. Die Amplitude dieses kontinuierlichen Wechselstromfeldes ist üblicherweise im Bereich von 100 bis 400 V/cm. Seine Frequenz kann von etwa 60 Hz bis etwa 10 mHz variieren. Während der Zellverschmelzung in der bevorzugten Ausführungsform kann das eigentliche elektrische Feld, welches an die Elektroden angelegt wird, so aussehen wie das in Fig. 2E Gezeigte.
Eine weitere Vorrichtung zur Porenbildung und/oder Fusion von großvolumigeren Zellen ist in Fig. 3 gezeigt. Eine Anordnung von äquidistanten Elektroden 25 anstatt eines einzelnen Paares von Elektroden wird verwendet, um das Wechselstromfeld und das gepulste RF-Feld anzuwenden. Der Boden dieser Verschmelzungskammer kann entweder flach oder leicht konkav sein. Er besteht aus transparentem Material, wie Glas oder durchsichtigem Kunststoff. Diese Kammer kann auf einem inversen Lichtmikroskop platziert werden, so dass die Ereignisse der Zellverschmelzung und/oder Zellporenbildung direkt verfolgt werden können. Da die Effekte verschiedener experimenteller Bedingungen mit dieser Konstruktion zeitgerecht untersucht werden können, wird sie zum Feststellen der optimalen Bedingungen der Zellverschmelzung und/oder Zellporenbildung nützlich sein.
Die Elektroden können in jedem Muster angeordnet werden, so lange sie zueinander äquidistant gehalten werden. In den bevorzugten Ausführungsformen schließen die Muster ineinander greifende Anordnungen, konzentrische Kreise und doppelte Spiralen ein.
Eine weitere bevorzugte Vorrichtung 10 zur Zellporenbildung und Zellverschmelzung ist in Fig. 4 gezeigt. Diese Vorrichtung 10 ist so konstruiert, dass die Beobachtung der Zellverschmelzung unter einem Lichtmikroskop und unter Verwendung eines kleinen Volumens an Zellsuspension ermöglicht wird. Diese Vorrichtung ist aus zwei Glasplatten 34 gebildet, welche durch Abstandhalter 37 von etwa 0,3 mm Dicke auseinander gehalten werden, wobei die Zellsuspension 19 zwischen den Glasplatten 34 ist. In einer Ausführung werden dünne Glasplatten, wie z. B. Deckgläschen, verwendet. Elektroden 25 sind zwei parallele Platindrähte, welche etwa 0,5 mm auseinander sind Die Platinumdrahtelektroden 25 werden an dem Hochleistungs-Funktionsgenerator 31 angeschlossen. Der Hochleistungs-Funktionsgenerator kann sowohl elektrische Wechselstromfelder als auch gepulste Radiofrequenzfelder erzeugen. Eine Einlassröhre 41 und eine Auslassröhre 44 werden verwendet, um Zellen in den Raum zwischen den Elektroden einzubringen und zu entfernen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Zellporenbildung und Zellverschmelzung ist in Fig. 5 gezeigt. Der Zweck dieser Vorrichtung ist es, ein sehr großes Volumen von suspendierten biologischen Partikeln zu verschmelzen oder zu porieren; einschließlich biologischer Zellen, Protoplasten, Bakterien und Hefen. Diese Vorrichtung 20 ist zur leichten Anwendung, Instandhaltung und Säuberung konstruiert. Die Zellsuspension ist in einem nicht- leitenden zylindrischen Behälter 13 enthalten. Die Elektrodenanordnung 50 ist an einem isolierten Tragegriff 47 angebracht. Um suspendierte Zellen zu porieren oder zu verschmelzen wird die Elektrodenanordnung in dem Zellbehälter 13 durch Manipulieren des Tragegriffes 47 abgesenkt. Die Elektroden 25 sind an einem Hochleistungs-Funktionsgenerator 31 durch die Anschlussmöglichkeit 49 angeschlossen. Das Wechselstromfeld zur Zellverschmelzung und die leistungsstarken RF-Impulse zur Zellporenbildung und/oder Zellverschmelzung werden dann an die Elektroden 25 in der Elektrodenanordnung 50 angelegt.
In dieser Vorrichtung 20 ist die Elektrodenanordnung 50 ein vertikaler Zylinder 53, und die Metallelektroden 25 sind an der Seite exponiert (d. h. an den zylindrischen Flächen). Der Zylinder kann jedes nicht-leitende Material sein, z. B. Glas, Kunststoff, oder Teflon. Wenn die Elektrodenanordnung 50 in Zellbehälter 13 abgesenkt wird, werden die suspendierten Zellen 19 verdrängt und bilden eine dünne Schicht der Zellsuspension 19, welche die Elektrodenanordnung umgibt. Daher befinden sich alle Zellen in großer Nähe zu den Elektroden.
Wenn ein elektrisches Potenzial an die Elektroden angelegt wird, sind die Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt.
Eine Konstruktion der Elektrodenanordnung 50 ist in Fig. 6 gezeigt. Zwei Metalldrähte oder Bänder sind gewunden, um eine Doppelhelix-Elektrode 25 zu bilden. Die Helices sind in ihrer Form identisch, außer dass eine zwischen der anderen positioniert ist. Diese beiden Helices sind an einen zylindrischen Träger 53 angebracht. Der Abstand zwischen diesen beiden Helices wird konstant gehalten. Daher ist die Amplitude eines elektrischen Feldes, das zwischen beiden Helices erzeugt wird, wenn ein elektrisches Potenzial an die beiden Metalldrähte angelegt wird, entlang ihrer gesamten Länge gleichförmig).
Eine weitere Ausführungsform der Elektrodenanordnung 50 zur Zellporenbildung und Zellverschmelzung ist in Fig. 7 gezeigt. Hier weist die Elektrodenanordnung 50 einen Stapel von Metallringelektroden 25 auf, welche durch nicht- leitende isolierende Abstandhalter 53 mit festgelegter Dicke getrennt werden. Diese Ringelektroden 25 sind miteinander in einer alternierenden Anordnung verbunden, um zwei Sätze an Elektroden 25 zu bilden, welche anschließend jeweils an die Ausgangsklemmen des Hochleistungs-Funktionsgenerators angeschlossen werden. Die Ringe haben eine Anschlussmöglichkeit 56 und eine Aussparung 59 für die Durchführung der Drähte zu der anderen Elektrode 25.
Die Elektroden 25 müssen nicht kreisförmig sein, sondern können jede Form haben. Formen, welche verwendet werden können, schließen kreisförmige, rechteckige - wie in Fig. 8 - oder elliptische Formen ein.
Eine weitere Ausführung zur Zellporenbildung und Zellverschmelzung ist in Fig. 9 gezeigt. Die Zellsuspension 19 ist in einem nicht-leitenden Behälter 13 enthalten. Eine Elektrodenanordnung 50 ist am Tragegriff 47 angebracht, welcher benutzt werden kann, um die Position der Elektroden zu beeinflussen. Anders als in den vorhergehenden Vorrichtungen sind die Elektroden dieser Ausführungen am Boden der Elektrodenanordnung 50 exponiert. Diese Vorrichtung ist daher besonders nützlich zur Porenbildung und/oder Verschmelzung von kultivierten Zellen, welche auf dem Boden von Zellkulturschalen adhärieren.
Eine Konstruktion der Bodenkontakt-Elektrodenanordnung 50 ist in Fig. 10 gezeigt. Die Elektrodenanordnung 50 besteht aus zwei Metallbandspiralen, welche als die "geerdete" (-) und "Spannungs-" (+) Elektroden 25 dienen. Die beiden Spiralen sind so positioniert, dass der Abstand zwischen den Spiralen konstant gehalten wird. Die Anordnung in gleichem Abstand stellt sicher, dass ein an die beiden Elektroden 25 angelegtes elektrisches Feld über die gesamte Fläche, welche von der Elektrodenanordnung bedeckt wird, eine gleichförmige Feldstärke hat.
Außer der spiralförmigen Konstruktion können andere Anordnungen einschließlich multipler konzentrischer Ringe, rechteckiger Formen, ineinander greifender Anordnungen, paralleler Platten oder elliptischer Formen verwendet werden (siehe Fig. 11 und 12). Die Ringe oder Formen sind in abwechselnder Art und Weise in zwei Gruppen angeschlossen. Eine Gruppe dieser Ringe oder Formen ist an die "geerdete" (-) Klemme angeschlossen, während die andere Gruppe von Ringen oder Formen an die "Spannungs-" (+) Klemme des Hochleistungs-Funktionsgenerators angeschlossen ist. Die Abstände zwischen den Ringen oder Formen sind konstant, so dass die Stärke des elektrischen Feldes, welches zwischen benachbarten Ringen oder Formen erzeugt wird, durch die gesamte Anordnung hindurch gleichförmig ist. In den Bodenkontakt- Elektrodenanordnungen können die Elektrodendrähte, Platten oder Bänder sein. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Breite der Elektroden größer als die Tiefe der Zellsuspension.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Zellporenbildung und Zellverschmelzung ist in Fig. 13A bis 13C gezeigt. Die Sonde 20 erlaubt Zellverschmelzung oder Gentransfektion für ein kleines Volumen von Zellsuspension. Die Probe 20 passt in eine Flachboden 96-Lochzellkulturplatte, z. B. Corning Modell 25860. Die Sonde 20 enthält zwei koaxiale Elektroden 25. Die innere Elektrode 25A ist ein solider Zylinder, und die äußere Elektrode 25B ist eine hohle Röhre. Die koaxialen Elektroden 25 können aus einer Vielzahl von leitenden Materialien bestehen. In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die koaxialen Elektroden aus rostfreiem Stahl. Die koaxialen Elektroden 25 sind an einen nicht-leitenden isolierenden Halter 54 angebracht, der vorzugsweise aus Teflon oder Kunststoff besteht.
Die Lücke zwischen der inneren 25a und äußeren 25b koaxialen Elektroden kann von etwa 0,5 bis 2,0 mm variieren. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Elektrode 25 eine Lücke von 0,7 mm. Mit dieser Sonde 20 ist das Gesamtvolumen von zu suspendierenden oder zu porierenden Zellen etwa 80 ul, und es ist möglich, Zellfusion oder Zellverschmelzung mit so wenig wie 20 ul Zellsuspension durchzuführen.
Die Sonde 20 hat einen Haltegriff 47 aus einem nicht-leitenden Material, vorzugsweise Teflon. Die Haltevorrichtung 55 hält die äußere Elektrode 25a fest.
Diese Konstruktion hat mehrere Vorteile. Neben der Möglichkeit, kleine Volumina von Zellsuspension zur Zellverschmelzung oder Zellporenbildung zu verwenden, ist sie auch einfach zu benutzen und außerordentlich kosteneffektiv. Anders als die meisten kommerziell erhältlichen Geräte, welche eine Küvette zur Transfektion einer Zellprobe benötigen, kann diese Sande reihenweise viele Zellproben transfizieren durch Verwendung von Platten mit vielen Vertiefungen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Zellporenbildung und Zellverschmelzung ist in Fig. 14 gezeigt. Diese Abbildung zeigt ein Blockschaltbild des Hochleistungs-Funktionsgenerators, der sowohl das Wechselstromfeld zur Dielektrophorese und die leistungsstarken RF-Impulse zur Zellfusion und/oder Zellporenbildung zeugt. Die Schaltung zwischen dem Wechselstromfeld und dem RF-Feld wird durch ein quecksilberbenetztes Relais kontrolliert. Die RF-Impulse werden durch Weiterleiten des Ausgabesignals eines Radiofrequenz-Oszillators und anschließendes Leiten durch einen MOS- FET-Leistungsverstärker erzeugt, dessen Leistung bis zu 20 kW betragen kann.
Alternativ können das Wechselstromfeld und das gepulste RF-Feld durch Erzeugen der benötigten elektrischen Welle mit einem digitalen Computer und Verstärken dieser Wellenformen durch einen Leistungsverstärker generiert werden. In dieser Ausführung kann das Protokoll vollständig durch den Computer kontrolliert werden, und daher wird keine Relaisschaltung benötigt. Dieser computerkontrollierte Hochleistungs-Funktionsgenerator hat mehrere Vorteile. Erstens können sehr komplexe Wellenformen erzeugt werden, um die Verschmelzung und/oder Porenbildung verschiedener Zelltypen zu optimieren. Zweitens kann jedes Protokoll separat in einer Datenspeichervorrichtung, z. B. eine magnetische Diskette, gespeichert werden, falls der Hochleistungs-Funktionsgenerator für mehr als ein Protokoll oder durch mehr als einen Benutzer verwendet wird. Da die Protokolle schnell aufgerufen werden, kann der Hochleistungs-Funktionsgenerator neu programmiert werden, um die gewünschte Wellenform zu erzeugen, ohne manuell alle Parameter nachzujustieren. Drittens kann der gleiche Computer als digitales Oszilloskop verwendet werden, um das eigentliche elektrische Feld, welches an die Zellen angelegt wird, aufzunehmen. Diese Aufnahme kann in einer Datenspeicherungsvorrichtung als permanente Aufzeichnung jedes einzelnen Zellverschmelzungs- oder Zellporenbildungsexperiments gespeichert werden.
Ein zu starker Strom ist für die Zelle schädlich wegen der resultierenden thermischen Effekte und pH-Veränderungen. Um die Erzeugung zu starker Ströme und die resultierenden Effekte während des Anlegens des elektrischen Feldes zu vermeiden, hat das Suspensionsmedium der Zellen normalerweise eine niedrige Ionenstärke. Vorzugsweise enthält es sehr geringe Salzkonzentrationen. Ein übliches Suspensionsmedium kann 1 mM Elektrolyte enthalten, einschließlich 0,4 mM Mg-Acetat und 0,1 mM Ca-Actetat. Das Medium ist gepuffert, und der pH wird im physiologischen Bereich gehalten, z. B. pH 7,5. Jeder Puffer, der gemeinhin für biologische Zwecke verwendet wird, z. B. 1 mM HEPES (N-2-hydroxyethyl-piperazin-N'-2-ethan-Sulfonsäure) ist für die Zellporenbildung und/oder Zellverschmelzung geeignet. Nicht-Elektrolyte werden hinzugefügt, um die Osmolarität des Mediums zu erhalten, entsprechend etwa der Osmolarität der extrazellulären Flüssigkeit. In der bevorzugten Ausführungsform werden nicht-zellpermeable Kohlenhydrate mit relativ hohem molekularen Gewicht, wie Sacharose und Mannitol, verwendet, um die Osmolarität zu erhalten.
Für manche Zellen scheint eine etwas höhere Ionenstärke des Mediums die Ausbeute der Verschmelzung zu verbessern. Zum Beispiel verschmelzen humane Erythrozyten leicht in 30 mM Na-Phosphat. Daher kann im vorliegenden Verfahren zur Verschmelzung Suspensionsmedium mit einer Ionenstärke im Bereich von 0,1 mM bis 100 mM, abhängig vom Zelltyp, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung zur Zellporenbildung und Zellverschmelzung hat eine Vielzahl von Verwendungen. Viele biologisch aktive Substanzen, einschließlich DNA, RNA, organische Chemikalien, anorganische Chemikalien, Arzneimittel, Antikörper, Proteine, Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme und radioaktiv oder fluoreszent markierte molekulare Sonden können normalerweise nicht einfach durch die Zelle aufgenommen werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein effektives Verfahren bereit, um diese biologisch aktiven Substanzen in die Zelle zu transportieren. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung können Zellen temporär permeabilisiert werden, d. h. poriert werden, durch Anlegen von Hochleistungs-RF-Impulsen, und die biologisch aktiven Substanzen können dann während der Dauer dieser Porenbildung in die Zellen eindringen. Die porierten Zellen können biologische Zellen (einschließlich tierischer, humaner oder Pflanzenzellen), Protoplasten, Bakterien oder Hefen sein. In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung können biologisch aktive Substanzen in die Zellen eingebracht werden durch Fusion der Zielzelle mit anderen biologischen Partikeln, welche mit der aktiven Substanz vorbeladen wurden. Solche biologischen Partikel schließen Liposomen und Erythrozyten-Ghosts ein, welche einfach mit den gewünschten Substanzen durch Verwendung eines standardisierten osmotischen Schock- und Dialyseverfahrens vorbeladen werden können (Schlegen & Lieber, Cell Fusion, ed. by A. E. Sowers Plenum Press (1987)). Die Zielzellen können alle Zellen sein, welche die biologisch aktiven Substanzen erhalten und schließen ein isolierte Zellen, Eizellen, embryonische Zellen, alle primären oder transformierten kultivierten Zellen oder andere Zellen in-vitro.
Auf ähnliche Weise können biologische Substanzen aus biologischen Zellen extrahiert werden. Viele Moleküle z. B., wie Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Proteine und Nukleinsäuren könnten nicht in der Lage sein, die Barriere der Membran zu passieren. Durch Verwendung des Verfahrens zur Porenbildung der vorliegenden Erfindung können temporäre Poren in der Zellmembran induziert werden. Die nicht-permeablen Moleküle können anschließend die Zelle verlassen. Diese Anwendung könnte in einer Vielzahl von Gewerben nützlich sein, welche wachsende Zellen verwenden, um biologische Moleküle zu produzieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Extrahierung dieser Moleküle, ohne die Zellen umbringen zu müssen.

Beispiel I

Die Eignung und Effizienz der RF-Elektroporenbildungsmethode zur Insertion fremder Gene in Zielzellen wird unter Verwendung der kultivierten eukariotischen Fibroblasten-Zelllinie COS-M6 (M6) untersucht. Chloramphenicol- Acetyltransferase (CAT)-DNA wurde als Genmarker verwendet. Bakterielle CAT-DNA wurde in einen Plasmidvektor insertiert (pSV&sub2;-CAT). Das CAT-Enzym wird in Säugerzellen, wie M6, nicht-endogen produziert. Daher kann die Menge des CAT-Gens, welche in die Zielzellen eingebaut wurde, untersucht werden durch Messen der Menge von CAT-Enzym, welche nach der Transfektion produziert wurde.
Das Protokoll bestand aus Anwendung von drei Serien von Hochleistungs- RF-Impulsen mit 10s-Intervallen. Jede Serie bestand aus fünf Impulsen (Frequenz 100 kHz, Feldstärke 2,5 KV/cm, Impulsbreite 0,5 us).
Das RF-Protokoll zur Porenbildung der vorliegenden Erfindung ist eine hocheffektive Methode zur Gentransfektion. Konventionelle Verfahren zur Gentransfektion, z. B. das Calciumphosphat-Verfahren oder das DEAE-Dextran-Verfahren, benötigen mindestens 5 bis 10 ug Plasmid-DNA für jede Transfektion. In früheren Methoden zur Elektroporenbildung, welche Gleichstromimpulse verwenden, wurden sogar noch größere Mengen an DNA (üblicherweise 10 bis 40 ug) benötigt (Ansubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley b Sons, 1988). Durch Verwendung des RF-Porenbildungsverfahrens dieser Erfindung erhielten wir einen hohen Anteil an CAT-Aktivität (76% Acetylierung pro 25 ug Protein), wenn M6-Zellen transfiziert wurden unter Verwendung von nur 0,1 ug CAT-DNA. Außerdem wurden bis zu 10,6% Acetylierung pro 25 ug Protein beobachtet, wenn M6-Zellen mit so wenig wie 0,01 ug CAT-DNA transfiziert wurden. Daher ist es offensichtlich, dass das RF-Porenbildungsverfahren eine viel höhere Effizienz der Gentransfektion hat. Die verbesserte Effizienz hat nicht nur große Ersparnis an Arbeit und Material, welches zur Produktion von DNA benötigt wird, zur Folge, sondern wird auch die Transfektion von Zellen ermöglichen, die bisher schwierig zu transfizieren waren.
Ein weiterer Vorteil des RF-Porenbildungsverfahrens ist, dass es weit weniger Zellen für die Gentransfektion benötigt. Die konventionellen chemischen und Gleichstromporenbildungsverfahren benötigen üblicherweise 2 bis 10 Millionen Zellen, um eine Transfektion durchzuführen. Mit der RF-Methode wurden M6- Zellen mit dem CAT-Gen bei hoher Effizienz unter Verwendung von so wenig wie 0,1 Millionen Zellen transfiziert. Weitere Experimente deuteten darauf hin, dass noch niedrigere Zellzahlen (1 · 10&sup4;) verwendet werden können. Derzeit ist die minimale Zellzahl durch die Menge von Gesamtzellprotein limitiert, welches benötigt wird, um CAT-Versuche durchzuführen und nicht durch die Fähigkeit, Zellen zu transfizieren. (Üblicherweise wird 25 ug von gesamtzellulärem Protein für die CAT-Reaktion benötigt.)

Beispiel II

Wegen der einzigartigen Fähigkeit des RF-Porenbildungsverfahrens, Zellen in kleiner Zahl und mit hoher Effizienz zu transfizieren, wird das Verfahren in der Entwicklung der Gentherapie besonders nützlich sein. Es ist bekannt, dass viele Krankheiten durch genetische Defekte verursacht werden. Solche Krankheiten könnten behandelt werden durch Insertion des therapeutischen Gens in humane Zellen, wie Knochenmarkstammzellen, und anschließender Transplantation dieser Zellen in den menschlichen Körper.
Zum Beispiel haben Patienten mit Sichelzellanämie ein defektes Gen, welches krankhaftes Hämoglobin produziert. Um so eine genetische Krankheit zu behandeln, werden Knochenmarkstammzellen vom Patienten gewonnen und mit dem gesunden Hämoglobin-Gen transfiziert. Die transfizierten Stammzellen werden zurück in den Patienten transplantiert. Mit dem geeigneten Vektor wird das gesunde Gen stabil in das Genom integriert, und der Patient wird in der Lage sein, gesundes Hämoglobin zu produzieren.
Der Schlüsselschritt in dieser Behandlung ist die Transfektion der Knochenmarkstammzellen mit dem gesunden Gen. Da die Zahl der gewonnenen Stammzellen relativ klein ist, wird ein Verfahren zur Gentransfektion mit hoher Effizienz, welches für extrem niedrige Zellzahlen geeignet ist, benötigt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Porenbildung durch Verwendung von RF-Impulsen hat einzigartig diese Fähigkeit. Daher wird dieses Verfahren für die Gentherapie außerordentlich nützlich sein.
Der Nutzen dieses Verfahrens für die Gentherapie ist nicht auf Sichelzellenanämie beschränkt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um gesunde Gene in humane Zellen einzufügen, um viele genetische Erkrankungen zu heilen. Andere Beispiele schließen ein: Einführen des Gens für den Gerinnungsfaktor VIII in Knochenmarkzellen, um Bluter zu heilen; Insertieren des Insulingens in die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse oder in andere humane Zellen, um Diabetes zu behandeln; Einführen des Gens für den menschlichen LDL (low density lipoprotein)-Rezeptor in Leberzellen oder andere humane Zellen zur Absenkung des Cholisterinspiegels im Blut von hypercholisterämischen Patienten; und Einführen des Gens für humanes Wachstumshormon (human growth hormone) in humane Zellen, um Wachstumsdefekte zu korrigieren. Daher sind die Möglichkeiten, das Verfahren zur Insertion von Genen in humane Zellen zu verwenden, um genetische Erkrankungen zu behandeln, unbegrenzt.

Beispiel III

Morphologische Veränderungen der Zellmembran im Verlauf der elektrischen RF-Feld-Porenbildung

Ein Bruchteil einer Sekunde nachdem humane Erythrozyten RF-Impulsen ausgesetzt wurden, wurden sie in flüssigem Freon, welches durch flüssigen Stickstoff gekühlt wurde, schockgefroren. Die Struktur der Zellmembran wurde durch das Verfahren der Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie untersucht. Die elektronenmikroskopische Aufnahme in Fig. 14 zeigt die Oberflächenstruktur des Erythrozyten, nachdem drei RF-Impulse (400 kHz, 40 us breit, 5 KV/cm Feldstärke) angelegt wurden. Membranporen mit Durchmessern von 0,1 bis 0,3 um wurden deutlich gesehen. Diese Poren sind ausreichend groß, um großen DNA-Stücken die Diffusion aus dem extrazellulären Medium in die Zelle leicht zu ermöglichen. Daher gibt es direkte Beweise, dass die angelegten RF-Felder große Poren auf der Zelloberfläche induzieren können. Die morphologischen Hinweise zeigen deutlich, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung bei der Induktion von Membranporen, um die Transfektion von Fällen mit exogenen Genen zu ermöglichen, effektiv ist.

Beispiel IV

Ein Beispiel des Vorteils, welchen die vorliegende Erfindung gegenüber der konventionellen elektrischen Gleichstrom-Verschmelzungsmethode hat, wurde bei der Verschmelzung von humanen Erythrozyten beobachtet. Die Ereignisse der Verschmelzung wurden untersucht durch Markieren der Membran einer kleinen Anzahl von suspendierten Zellen mit einem lipophilen fluoreszenten Farbstoff, z. B. 1,1', -dihexadecyl-3,3,3",3'-Tetramethylendocarbacyaninperchlorat. Die Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Vor Anlegen der RF-Impulse geben nur die vorher markierten Zellen ein fluoreszentes Bild ab, und sie erschienen als vereinzelte Zellen (siehe Fig. 16A). Nachdem die Zellen gepulsten RF-Feldern ausgesetzt wurden, begannen unmarkierte Zellen mit markierten Zeilen zu verschmelzen, und generell wurde der Farbstoff von markierten auf unmarkierte Zellen übertragen. Schließlich wurden beide Zellen markiert (siehe Fig. 16B). Dieser Verlauf der Verschmelzung benötigte nur ein paar Minuten nach Anlegen der RF-Impulse.
Zwei Arten von Zellverschmelzung wurden in diesem Experiment beobachtet: (1) Membranverschmelzung, in welcher der fluoreszente Farbstoff von der markierten auf die unmarkierte Zelle übertragen wurde, aber die beiden Zellen nicht ihr Zytoplasma vereinigten; und (2) zytoplasmatische Verschmelzung, in welcher die verschmelzenden Zellen sich zu einer einzelnen großen Zelle vereinigten. Der Anteil von Zellen, welche zytoplasmatische Verschmelzung eingehen, hängt stark von der Schwingungsfrequenz des angelegten RF-Feldes ab. Die Ausbeute der Verschmelzung von Erythrozyten, nachdem RF-Impulse verschiedener Frequenzen angelegt werden, ist in Fig. 17 gezeigt. Die höchste Ausbeute an verschmolzenen Zellen ergab sich, wenn das angelegte RF-Feld bei 100 kHz oszillierte. Die Ausbeute der Verschmelzung sank auf ein sehr niedriges Niveau ab, wenn die Frequenz zu niedrig oder zu hoch wurde. Keine zytoplasmatische Verschmelzung wurde nachgewiesen, wenn das angelegte Feld aus Gleichstromimpulsen mit der gleichen Impulsamplitude und Impulsbreite wie die RF-Impulse bestand. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass das RF-Impulsverfahren dieser Erfindung sehr viel effektiver in der Induktion der Zellverschmelzung ist als das Gleichstrom-Impulsverfahren.
Ein weiteres Beispiel des Vorteils der vorliegenden Erfindung gegenüber dem elektrischen Gleichstrom-Verschmelzungsverfahren liegt in der Verschmelzung von humanen Erythrozyten mit der kultivierten humanen Leukämiezelllinie HL- 60. Verschmelzung dieser beiden Zelltypen war nicht erreichbar durch Anwendung der Gleichstrom-Impulsmethode. Das Versagen beruht wahrscheinlich auf dem Größenunterschied der Zellen; Erythrozyten sind signifikant kleiner als HL-60-Zellen. Durch Verwendung des fluoreszenten Farbstoffnachweises und des gepulsten RF-Feldes der vorliegenden Erfindung waren wir jedoch in der Lage, die Verschmelzung von Erythrozyten mit HL-60-Zellen zu erreichen.

Beispiel V

Das RF-Impulsverfahren kann verwendet werden, um Zellen zu verschmelzen, um Hybridome zu erzeugen. Pigmentzellen des Goldfischs (Xanthophore) wurden mit einer Tumorzelllinie verschmolzen, welche aus Fischhautzellen erhalten wurde. Da xanthophore Zellen einen eingebauten histochemischen Marker (die carotenoiden Tröpfchen) besitzen, ist es vergleichsweise leicht, ihre Verschmelzung mit nicht-pigmentierten Tumorzellen zu untersuchen. Fig. 18 zeigt die aufeinander folgenden Schritte in der Verschmelzung einer Xanthophoren- Zelle und einer Hauttumorzelle. In Fig. 18A wurden die Zellen durch die Elektrophorese in engen Kontakt gebracht. Anschließend wurden drei RF-Feldimpulse (40 us Breite, Frequenz 400 kHz, Feldstärke 3,3 KV/cm) angelegt. Innerhalb von zwei Minuten begannen die Zytoplasmata von zwei Zellen, sich zu vereinigen (siehe Fig. 18B). Nach vier Minuten haben sich die Zellen vollständig zu einer einzigen Riesenzelle verbunden (siehe Fig. 18C).
Eine wichtige Anwendung der Bildung von Hybridomen durch Verwendung des RF-Impulsverfahrens ist es, Antikörper zu erzeugen, vor allem humane monoklonale Antikörper. In diesem Fall können die biologischen Partikel, die fusioniert werden sollen, Antikörper produzierende Zellen (z. B. Lymphozyten-B- Zellen) und sich kontinuierlich teilende Zellen (z. B. Krebszellen). Durch ein Selektionsverfahren können die erhaltenen Hybridomzellen kultiviert werden, um spezifische monoklonale Antikörper zu produzieren.
Der Fachmann wird leicht einsehen, dass die vorliegende Erfindung gut geeignet ist, die Ziele durchzuführen und die erwähnten Resultate und Vorteile zu erhalten, wie auch die darin inhärent Enthaltenen. Die hier beschriebenen Vorrichtungen, Verfahren, Vorgehensweisen und Techniken sind zur Zeit repräsentativ für die bevorzugten Ausführungsformen, sind beabsichtigt, exemplarisch zu sein und sind nicht als Begrenzung des Umfangs beabsichtigt. Fachleute werden auf Veränderungen und andere Anwendungen kommen, welche im Wesen der Erfindung enthalten sind oder durch den Umfang der angefügten Ansprüche definiert sind.

Claims

1. Vorrichtung zur Porenbildung in und Verschmelzung von biologischen Teilchen, aufweisend:

einen ein nicht leitfähiges Material aufweisenden Behälter, der in der Lage ist, Flüssigkeit und die biologischen Teilchen zu enthalten,

Elektroden, die in dem Behälter äquidistant voneinander angeordnet sind, und

einen an die Elektroden angeschlossenen Hochleistungsfunktionsgenerator, der dazu geeignet ist, ein intensitätsstarkes elektrisches Feld zu erzeugen, das ein mit gepulster Radiofrequenz oszillierendes Feld mit einem Frequenzbereich von 10 kHz bis 100 MHz, einem Impulsdauerbereich von 1 us bis 10 ms und einem Impulsamplitudenbereich von 1 kV/cm bis 20 kV/cm ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die biologischen Teilchen ausgewählt sind aus menschlichen Zellen, tierischen Zellen, Pflanzenzellen, Bakterien, Hefen, Protozoen, Protoplasma, Liposomen und Erythrozytenghosts.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der das intensitätsstarke elektrische Feld ein mit gepulster Radiofrequenz oszillierendes Feld mit einem Frequenzbereich von 0,02 MHz bis 10 MHz, einem Impulsdauerbereich von 20 bis 2000 us und einer Impulsamplitude von 2 kV/cm bis 10 kV/em ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der der Funktionsgenerator außerdem dazu geeignet ist, ein ungedämpftes leistungsschwaches elektrisches Wechselstromfeld zu erzeugen, um die biologischen Teilchen zur Verschmelzung in enge Nähe zu bringen.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, bei der das leistungsschwache elektrische Wechselstromfeld einen Frequenzbereich von 60 Hz bis 10 MHz und eine Feldstärke von 100 V/cm bis 800 V/cm aufweist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, außerdem aufweisend ein mechanisches Relais oder einen elektronischen Schalter zum Umschalten ihrer Ausgabe zwischen dem gepulsten intensitätsstarken elektrischen Feld und dem ungedämpften leistungsschwachen elektrischen Wechselstromfeld.

7, Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei der:

eine Wellenform des intensitätsstarken elektrischen Feldes ausgewählt ist aus Einzelimpulsen symmetrischer oszillierender Felder, Mehrfachimpulsen symmetrischer oszillierender Felder, Einzelimpulsen versetzter oszillierender Gleichstromfelder und Mehrfachimpulsen versetzter oszillierender Gleichstromfelder, und

die Form der oszillierenden Felder ausgewählt ist aus sinusförmig, rechteckig, quadratisch, dreieckig, sägezahnförmig und Kombinationen davon.

8. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei der der Funktionsgenerator aufweist:

einen Radiofrequenzimpulsgenerator mit einer Torschaltung zum Durchschalten des Ausgangssignals eines Radiofrequenzoszillators und einen Leistungsverstärker zum Erzeugen des leistungsstarken Radiofrequenzimpulses aus dem durchgeschalteten Ausgangssignal des Radiofrequenzoszillators,

einen Wechselstromfeldgenerator, und

ein mechanisches oder elektronisches Relais zum Umschalten zwischen dem Radiofrequenzimpuls- und dem Wechselstrom-Feld.

9. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Anspruche, außerdem aufweisend eine digitale Schaltungsanordnung zum Hervorbringen der Wellenformen für das intensitätsstarke elektrische Feld und das leistungsschwache Wechselstromfeld, und einen Leistungsverstärker zum Verstärken der hervorgebrachten elektrischen Signale.

10. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur lichtmikroskopischen Beobachtung der Porenbildung in und Verschmelzung von biologischen Teilchen, außerdem aufweisend:

den Behälter mit einem durchsichtigen Boden, wobei der Behälter gebildet wird von zwei durchsichtigen, durch Abstandhalter getrennten Flächen, und die in den Behälter eingesetzten Elektroden, wobei die Elektroden äquidistant voneinander und in einem Muster angeordnet sind, das es erlaubt, dass mindestens 10 Mikroliter Zellen die Elektroden eng berühren.

11. Vorrichtung zur Zellporenbildung und Zellverschmelzung, aufweisend:

einen digitalen Mikroprozessor zum Hervorbringen und Erzeugen einer Radiofrequenzwellenform und einer Wechselstromwellenform,

einen Verstärker zum Umwandeln der von dem digitalen Computer erzeugten Wellenform in leistungsstarke Wellenformen,

einen ein nicht leitfähiges Material aufweisenden Behälter, der in der Lage ist Flüssigkeit und die Zellen zu enthalten,

Elektroden, die in jedem Behälter äquidistant voneinander angeordnet sind und die in Verbindung stehen mit dem Verstärker zum Anlegen des elektrischen Feldes an die Zellen, wobei das elektrische Feld ein mit gepulster Radiofrequenz oszillierendes Feld mit einem Frequenzbereich von 10 kHz bis 100 MHz, einem Impulsdauerbereich von 1 us bis 10 ms und einem Impulsamplitudenbereich von 1 kV/em bis 20 kV/cm ist.

12. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, außerdem aufweisend eine Informationsspeichervorrichtung.

13. Vorrichtung zur Porenbildung in und Verschmelzung von biologischen Teilchen, aufweisend:

einen ein nicht leitfähiges Material aufweisenden Behälter, der zum Enthalten von Flüssigkeit in der Lage ist, wobei der Behälter eine Einlassöffnung zum Empfangen der biologischen Teilchen aufweist,

Elektroden, die äquidistant voneinander in dem Behälter angeordnet sind, und

einen an die Elektroden angeschlossenen Hochleistungsfunktionsgenerator zum Anlegen eines elektrischen Feldes, das ein gepulstes elektrisches Radiofrequenzfeld mit einem Frequenzbereich von 10 kHz bis 100 MHz, einem Impulsdauerbereich von 1 us bis 10 ms und einem Impulsamplitudenbereich von 1 kV/cm bis 20 kV/cm ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, bei der der Behälter eine Form hat, die es erlaubt dass sich die biologischen Teilchen schwerkraftbedingt sammeln.

15. Vorrichtung nach Anspruch 13, bei der der Impulsamplitudenbereich des oszillierenden Radiofrequenzfeldes von 1 kV/cm bis 20 kV/cm beträgt.

16. Vorrichtung nach Anspruch 13, bei der der Funktionsgenerator außerdem die Fähigkeit aufweist einen ungedämpften leistungsschwachen Wechselstrom anzulegen, um die biologischen Teilchen zur Verschmelzung in enge Nähe zu bringen.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, bei der der leistungsschwache Wechselstrom einen Frequenzbereich von 60 Hz bis in den 10 MHz-Bereich und eine Feldstärke von 100 V/cm bis 800 V/cm aufweist.

18. Vorrichtung zur lichtmikroskopischen Beobachtung von Porenbildung in und Verschmelzung von biologischen Teilchen, aufweisend:

einen Behälter mit durchsichtigem Boden,

in den Behälter eingesetzte Elektroden, wobei die Elektroden äquidistant voneinander und in einem Muster angeordnet sind, das es erlaubt, dass mindestens 10 Mikroliter Zellen die Elektroden eng berühren, und

einen an die Elektroden angeschlossenen Hochleistungsfunktionsgenerator zum Anlegen eines elektrischen Feldes, wobei das elektrische Feld ein mit gepulster Radiofrequenz oszillierendes Feld mit einem Frequenzbereich von 10 kHz bis 100 MHz, einem Impulsdauerbereich von 1 us bis 10 ms und einem Impulsamplitudenbereich von 1 kV/cm bis 20 kV/cm ist.

19. Vorrichtung zur Zellporenbildung und Verschmelzung biologischer Teilchen, aufweisend:

einen Griff aus nicht leitfähigem Material zur Handhabung der Vorrichtung, Elektroden, die äquidistant voneinander angeordnet und an dem Griff angebracht sind, und

eine Verbindungseinrichtung zum Anschließen der Elektroden an einen Hochleistungsfunktionsgenerator zum Anlegen eines elektrischen Feldes, wobei das elektrische Feld ein mit gepulster Radiofrequenz oszillierendes Feld mit einem Frequenzbereich von 10 kHz bis 100 kHz, einem Impulsdauerbereich von 1 us bis 10 ms und einem Impulsamplitudenbereich von 1 kV/cm bis 20 kV/cm ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, bei der die Elektroden in der Gestalt einer Doppelhelix um einen nicht leitfähigen Kern gewickelt sind.

21. Vorrichtung nach Anspruch 19, bei der die Elektroden aufweisen:

segmentierte Formteile, und

isolierende Abstandhalter zur Trennung der segmentierten Formteile.

22. Vorrichtung nach Anspruch 19, bei der die Elektroden Boden-Kontaktelektroden sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Spiralen, konzentrischen Ringen, konzentrischen Quadraten, parallelen Platten und ineinander greifenden Anordnungen.

23. Vorrichtung nach Anspruch 19, bei der die Elektroden koaxial sind und etwa 0,5 bis 2,0 mm beabstandet sind, eine Länge von etwa 0,5 bis 3 cm und einen ausreichend kleinen Durchmesser haben, um in eine Vertiefung einer Kulturplatte mit vielen Vertiefungen zu passen.

24. Hochleistungsfunktionesgenerator aufweisend:

einen RF-Impulsgenerator, mit einer Torschaltung zum Durchschalten des Ausgangssignals eines Radiofrequenzoszillators und einen Leistungsverstärker zum Erzeugen des leistungsstarken RF-Impulses aus dem durchgeschalteten Ausgangssignal des Radiofrequenzoszillators,

einen Wechselstromfeldgenerator, und

ein quecksilberbenetztes Relais zum Umschalten zwischen dem RF-Impuls-und dem Wechselstrom-Feld, wobei die Radiofrequenz ein mit gepulster Radiofrequenz oszillierendes Feld mit einem Frequenzbereich von 10 kHz bis 100 MHz, einem Impulsdauerbereich von 1 us bis 10 ms und einem Impulsamplitudenbereich von 1 kV/cm bis 20 kV/cm ist.

25. Vorrichtung zur Zellporenbildung und Zellverschmelzung aufweisend:

einen digitalen Computer zum Hervorbringen und Erzeugen einer RF- Wellenform und einer Wechselstrom-Wellenform,

einen Verstärker zum Umwandeln der von dem digitalen Computer erzeugten Wellenform in leistungsstarke Wellenformen, und

eine Elektrode, die in Verbindung steht mit dem Verstärker zum Anlegen des elektrischen Feldes an biologische Zellen, wobei das elektrische Feld ein mit gepulster Radiofrequenz oszillierendes Feld mit einem Frequenzbereich von 10 kHz bis 100 MHz, einem Impulsdauerbereich von 1 us bis 10 ms, und einem Impulsamplitudenbereich von 1 kV/cm bis 20 kV/cm ist.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, außerdem aufweisend eine Informationsspeichervorrichtung.