DE19752961C1 - Verfahren und Vorrichtung zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum Aufschluß von biologischen Zellen zur Extraktion und Analyse ihrer Zellinhalte, insbesondere der Nukleinsäuren.

Für die Untersuchung biologischer Zellen und insbesondere der Analyse der Zellin­ halte, insbesondere Proteine und Nukleinsäuren (DNA und RNA), beispielweise zu Zwecken medizinischer Diagnostik, müssen die Zellwände und Membranen aufge­ schlossen werden, um das Zellinnere in einer geeigneten Form aus den Zellen ex­ trahieren zu können.

Hierzu sind eine Reihe bekannter Verfahren geeignet, die in dem Beitrag von Carl A. Schnaitman, "Cell Fractionation" in Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Mikrobiology, Washington, DC 20006, 1981, Chapter 5, Seite 52-61, in einer Übersichtsdarstellung beschrieben sind. Die in diesem Beitrag be­ schriebenen Methoden lassen sich in unterschiedliche Gruppen einteilen, die sich nach ihrer Art der Zellwandzerstörung bzw. -auflösung unterscheiden:

Mechanische Verfahren beruhen auf der Erzeugung lokaler Druckschwankungen am Ort der aufzuschließenden Zellen, wodurch Zellwände und Membranen regelrecht aufgebrochen werden. Aufgrund der für die Zellwandzerstörung notwendigen starken Druckschwankungen bedarf es jedoch entsprechend stabil ausgebildeter Vorrichtun­ gen, wie sie beispielsweise in dem Artikel von J. R. Raper und E. A. Hyatt, "Modified Press For Disruption Of Microorganisms", J. of Bacteriology, V. 85, S. 712-713, be­ schrieben sind. Weitere Vorrichtungen zur Erzeugung derartig großer Druck- oder Scherkräfte sind sogenannte Kugelmühlen oder die sogenannte French press, die in "Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology", American Society for Micro­ biology, Washington, D. C. 1986 in Kapitel 9.3.6. auf Seiten 103-104 dargestellt sind.

Die vorstehend genannten Vorrichtungen bedürfen neben einem sehr großen techni­ schen und mechanischen Aufwand, der betrieben werden muß, um derartig große Druckkräfte zu erzeugen und sicher zu beherrschen, viel Platz und lassen sich über­ dies schwer automatisieren. Ein weiterer Nachteil der bekannten Druckbehandlung biologischer Zellen besteht überdies auch darin, daß die Zellinhalte, hierbei sind ins­ besondere die langkettigen DNA-Moleküle gemeint, stark fragmentiert werden, so daß eine vollständige DNA-Analyse erschwert ist.

Auch sind Ultraschall-Aufschlußmethoden bekannt, bei denen die Zellwände und Membranen durch Kavitationseffekte regelrecht aufgerissen wird, so daß das Zellin­ nere nach außen gelangen kann. Beim Ultraschallaufschluß wird jedoch eine erheb­ liche Schall-Leistung in der zu untersuchenden Probe dissipiert, wodurch die Probe unnötigerweise erwärmt wird. Kühlvorkehrungen sind daher nötig. Durch die auftre­ tenden Temperaturschwankungen ist jedoch eine einigermaßen genaue Prozeßfüh­ rung erschwert. Überdies sind die bekannten Apparaturen zur Anwendung des Hochleistungsultraschalls schwierig zu reinigen, wodurch die Gefahr der Querkonta­ mination nicht ausgeschlossen werden kann.

Der Aufschluß von biologischen Zellen auf ausschließlich chemischem Wege bedarf individuell auf die Zellen angepaßten Chemikalien, wodurch bei der Untersuchung unbekannter Zelltypen, wie es beispielsweise bei der Diagnose unbekannter Krank­ heitserreger der Fall ist, die Schwierigkeit der Wahl der jeweils richtigen Chemikalie besteht. Ein Beispiel für ein Zellaufschlußverfahren unter ausschließlicher Verwen­ dung rein chemisch ablaufender Aufschlußreaktionen ist in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 1.25-1.31 beschrieben. Die für den Aufschluß von Zellen erforderlichen Reak­ tionszeiten bei ausschließlicher Verwendung von Chemikalien betragen mehrere Stunden trotz hohen Konzentrationen der dabei verwendeten Chemikalien, die zu­ dem bei anschließenden Analyseschritten, wie beispielsweise PCR-Reaktionen, stö­ rende Einflüsse haben können. Auch ist die Aufschlußrate bei einigen Mikroorganis­ men nicht ausreichend; es ist beispielweise extrem schwierig bei Micrococcus luteus auf dem chemischen Wege eine Rate höher als 20% zu erreichen.

Schließlich sind Verfahren bekannt, bei denen in flüssigen Medien suspendierte bio­ logische Zellen, wie beispielsweise Bakterien oder Pilze, einem starken elektrischen Feld ausgesetzt werden. So werden mittels elektrischer Felder biologische Zellen im Wege der Pasteurisierung und Sterilisation abgetötet, wie es beispielsweise in der Druckschrift US 5 235 905 beschrieben ist. Hierbei wird, um einen zu großen Ener­ gieeintrag in die Probe und dessen Überhitzung zu vermeiden, die Probe mit gepul­ sten elektrischen Feldern beaufschlagt mit jeweils Impulsdauern von einigen Mikro­ sekunden. Da eine biologische Zelle elektrisch betrachtet aus einem elektrolytischen und deshalb elektrisch leitenden Inhalt besteht, der von einer elektrisch isolierenden Membran umschlossen ist, verschieben sich die elektrischen Ladungsträger im Inne­ ren beim Anlegen eines elektrischen Feldes von außen. Auf diese Weise entstehen lokale Potentialdifferenzen zwischen dem Zellinneren und Zelläußeren, die dazu füh­ ren, daß die Zellmembran einen elektrischen Durchbruch erfährt, wodurch sie ihre semipermeablen Eigenschaften verliert und an elektrischer Leitfähigkeit zunimmt. Bei geringen äußeren Feldstärken sowie kurzen Impulsdauern ist die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit der Zellmembran reversibel, eine Erscheinung, die bei der Elektroporation (siehe hierzu E. Neumann, A. E. Sowers, C. A. Jordan, "Electroporati­ on and Electrofusion in Cell Biology", Plenum Press, New York, 1989) eine zentrale Rolle spielt. Die wird beispielweise benutzt, um genetisches Material in die Zellen zu bringen. Nachteilig bei dieser Anwendung der Elektroporation ist, daß typischerweise die Effizienz im Bereich von 0,01% liegt, d. h. nur in eine Zelle aus 10000 das Materi­ al auch tatsächlich hineingebracht wird.

Bei stärkeren Feldern und ausreichender Impulsdauer, insbesondere bei einer wie­ derholten Behandlung der biologischen Zellen, sind diese Änderungen permanent und führen letztendlich zum Zelltod. Diese Vorgehensweise wird standardmäßig zur Abtötung von Mikroorganismen in Lebensmitteln eingesetzt.

In der DE 35 37 261 A1 ist ein Verfahren zum feldinduzierten Einschleusen von Ma­ kromolekülen in lebenden Zellen beschrieben, das einen zum gezielten Ausschleu­ sen von Zellinhalte reziproken Vorgang darstellt und somit anderen Prozeßbedingen unterworfen ist. So können das Ein- und Ausschleusen von Teilchen in Zellen nicht als äquivalente Vorgänge angesehen werden, zumal die Natur des Transportes asymetrisch ist.

Der asymmetrische bzw. gerichtete Transport von verschiedenen Stoffen durch die Zellwand gehört vielmehr zu den wichtigsten Funktionen der Zellmembran. So weist zum einen die Zellmembran einen asymmetrischen Aufbau auf, zum anderen unter­ scheidet sich der Zellinhalt wesentlich von der äußeren Umgebung der Zelle. Die Größe der transportierten Molekülen ist oftmals mit der Zellgröße selbst ver­ gleichbar, wodurch nicht zuletzt auch dadurch die unterschiedlichen Transportme­ chanismen, die dem Ein- und Ausschleusen zugrunde liegen, nicht durch einfache Diffusionsmodelle beschrieben werden können - wobei auch die einfache Diffusion kein rein symmetrischer Prozeß ist. Die Transportmechanismen sind kompliziert, be­ inhalten mehrere Schritte und sind für die jeweilige Transportrichtung sehr spezifisch.

Gleiches gilt auch für das aus der JP 04173093 A hervorgehende Transformations­ verfahren von Bacillus stearothermophilus mit einem Plasmid.

Allen bekannten Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen haftet neben dem zum Teil sehr großen apparativen und technischen Aufwand der Nachteil an, daß die Verfahren nicht vollautomatisch durchzuführen sind. Zudem kommt, daß die Zellauf­ schlußrate nicht immer ausreichend groß ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte derart weiterzubilden, daß das Verfahren vollautomatisch und ohne großen apparativen und technischen Aufwand ablaufen kann. Insbesondere soll der extrahierte Anteil der zu analysierenden Zellin­ halte unabhängig vom Zelltyp hoch sein, wobei die Verfahrenszeitdauer zur Extrakti­ on und Isolation der Zellinhalte deutlich reduziert werden soll. Überdies soll eine Vor­ richtung angegeben werden, mit der eine kostengünstige, schnelle und sichere Durchführung des Verfahrens möglich ist.

Erfindungsgemäß ist erkannt worden, daß die Nachteile, die bei den bekannten Ver­ fahren des ausschließlichen chemischen Aufschlußes von biologischen Zellen auf­ treten, durch eine gezielte Abfolge bzw. Überlagerung von elektrischer und chemi­ scher Behandlung von biologischen Zellen vermieden werden können.

Erfindungsgemäß zeichnet sich das Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte dadurch aus, daß die Zellen einem elektri­ schen Feld ausgesetzt werden und daß die Zellen vor oder nach dem Anlegen des elektrischen Feldes mit einer Substanz in Kontakt gebracht werden, die den Zellauf­ schluß unterstützt.

Die für gewöhnlich in einem flüssigen Medium suspendierten biologischen Zellen werden einem gepulst betriebenen elektrischen Feld mit typischen Feldstärken zwi­ schen 5 und 100 kV/cm und einer Pulslänge von ca. 0,5 bis 50 Mikrosekunden aus­ gesetzt. Ebenso können die Zellen auch in Zellverbänden, wie etwa Gewebestücken vorliegen oder auf einem Träger immobilisiert aufgebracht sein, bspw. auf einem Fil­ ter.

Durch die Einwirkung des elektrischen Feldes und den elektrischen Durchbruch ent­ stehen in den Lypidschichten, aus den die Zellmembran besteht, Poren. Da sie aber sehr klein sind, und da bei bestimmten Zelltypen neben der Zellmembran auch die Zellwand die Diffusion von großen Molekülen wie beispielweise Nukleinsäure hindern kann, reicht die Behandlung der Zellen mit elektrischem Feld alleine für die Freisetzung der Zellinhalte in vielen Fällen nicht aus.

Es wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, das Entstehen der Poren in der Zellmem­ bran auszunutzen, um die Wirkung von Chemikalien zum Zellaufschluß zu unterstüt­ zen und zu beschleunigen.

In einer Variante werden Chemikalien verwendet, die auf den Zellinhalt und insbe­ sondere auf die zu analysierende Moleküle so einwirken, daß sie leichter und schnelle freigesetzt werden. Diese Chemikalien diffundieren durch die durch elektri­ sche Behandlung entstandene Poren in das Zellinnere, und bauen beispielweise Proteine ab und schneiden gezielt DNA-Moleküle in kleinere Fragmente, die aber für nachfolgende DNA-Analyse geeignet sind. Die entstandene DNA-Fragmente können dann ungehindert durch die Poren nach außen diffundieren. Diese Prozesse werden durch Zugabe einer oberflächenaktiven Substanz (Detergenz), wie beispielweise Natriumdodecylsulfat (SDS), unterstützt.

In einer anderen Variante wird die Tatsache ausgenutzt, daß die durch elektrische Behandlung entstandene Poren schwache Stellen darstellen, die den Angriff der Chemikalien auf die Membran wesentlich erleichtern und beschleunigen. Chemikali­ en, die zum vollständigen Abbau der Zellwände eingesetzt werden können, sind bei­ spielweise chaotrope Reagenzien wie Harnstoff, Guanidiniumhydrochlorid oder - thiocyanat und andere. Es kann auch Dimethylsulfoxid eingesetzt werden.

Da die in einem Medium suspendierten biologischen Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt sind, bedarf es bei der Beimengung der zusätzlich chemischen Substanz keiner allzu hohen Konzentration, wodurch negative Auswirkungen, bedingt durch die Gegenwart der chemischen Substanz, bei nachfolgenden Analyseschritten ausge­ schlossen werden können.

Um die angestrebte chemische Wirkung zu optimieren und zu beschleunigen, wer­ den die in Kontakt mit den Chemikalien gebrachte Zellen, beispielweise in Form einer Zellsuspension, auf ein Temperaturniveau zwischen 35 und 100°C gebracht.

Zur Durchführung des Verfahrens ist erfindungsgemäß eine Vorrichtung dadurch ausgebildet, daß ein, die in einem Medium suspendierten Zellen oder Zellverbände aufnehmendes Probenvolumen mit zwei flächig ausgebildeten, sich gegenüberlie­ genden Elektroden vorgesehen ist, das durch ein Deckelelement, dessen dem Pro­ benvolumen zugewandte Seite konvex ausgebildet ist, an der Oberseite des Proben­ volumens abschließbar ist. Durch das konvex ausgebildete Deckelelement kann vorteilhafterweise vermieden werden, daß bei einem Einschluß des flüssigen Medi­ ums innerhalb des Probenvolumens keine Luftblasen eingeschlossen werden, die zur ungleichmäßigen Verteilung des elektrischen Feldes und daher möglicherweise zu unerwünschten elektrischen Durchbrüchen in der Behandlungsvorrichtung führen würden.

Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsge­ dankens anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen exemplarisch beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zum Aufschluß biologischer Zellen,

Fig. 2 alternative Vorrichtung mit metallischer Folie am Deckelelement,

Fig. 3 alternatives Ausführungsbeispiel mit metallischer Trennfolie innerhalb des Probenvolumens, sowie

Fig. 4 alternatives Ausführungsbeispiel mit Reibelementen zur Gewebezerkleinerung.

In Fig. 1 ist eine vorteilhafte Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zum Auf­ schluß biologischer Zellen dargestellt, die eine Behandlungszelle zeigt, die ein Kunststoffgehäuse 2 aufweist, in das eine untere Elektrode 3 eingegossen ist und eine obere Elektrode 4 vorsieht, die zugleich das Deckelelement darstellt. Zwischen den Elektroden befindet sich im Probenvolumen 1 die in einer Lösung suspendierten aufzuschließenden biologischen Zellen. Alternativ können sich die Zellen immobili­ siert auf einem Träger, beispielweise einem Filter, befinden, wobei das Restvolumen der Vorrichtung mit einer Elektrolytlösung aufgefüllt wird. Durch die konvex gewölbte Oberfläche des Deckelelementes 4 wird gewährleistet, daß beim Aufsetzen des Dec­ kelelementes keine Luftblasen im Probenvolumen 1 eingeschlossen werden. Der beim Aufsetzen des Deckelelementes auf das Probenvolumen 1 durch das Deckele­ lement 1 verdrängte Überschuß der Suspension 5 sammelt sich in einer zirkular um das Deckelelement 4 vorgesehenen Vertiefung 6 des Kunststoffgehäuses 2. Die dem Deckelelement 4 gegenüberliegende untere Elektrode 3 ist hingegen konkav ausge­ bildet, so daß der Abstand zwischen beiden Elektroden konstant gewählt ist. Zudem erleichtert die Ausgestaltung der Elektrodenform das Einfüllen einer Flüssigkeit in das Probenvolumen 1 ohne Luftblasen sowie eine weitgehend restlose Probenent­ nahme, nach Durchführung des Zellaufschlußverfahrens.

Um die Elektroden 4 und 3 zu kontaktieren sowie die Behandlungszellenteile insbe­ sondere in einer automatisierten Vorrichtung zu transportieren und zu fixieren, weist die untere Elektrode 3 einen Stecker 7 sowie die obere Elektrode 4 eine Vertiefung 8 auf.

Der in dem Ausführungsbeispiel vorzugsweise eingestellte Elektrodenabstand be­ trägt 2 bis 5 mm, der Elektrodendurchmesser ca. 1 cm. Bei diesen Abmessungen und bei einer noch relativ leicht handhabbaren Spannung von ca. 20 kV beträgt die Stärke des elektrischen Feldes zwischen 40 und 100 kV/cm, eine Feldstärke, die für einen Zellaufschluß durchaus geeignet ist.

Die Elektrodenoberflächen können vorzugsweise aus Aluminium gefertigt sein, da dieses Material biologisch inert und chemisch ausreichend beständig ist. Außerdem ist es leicht zu verarbeiten und billig, und daher insbesondere für Einwegartikel geeignet.

Nach der Behandlung mit elektrischem Feld kann die chemische Behandlung im gleichen Volumen durch hinzugabe der Chemikalien fortgesetzt werden, oder alter­ nativ kann die Zellsuspension in ein anderes Gefäß umpipettiert werden.

Die in Fig. 1 dargestellte Ausführungsform mag durch die konstruktive Auslegung des Deckelelementes für eine Probenentnahme umständlich sein, da das Deckele­ lement vor dem Entleeren des Probenvolumens 1 zu entfernen ist, an dem ein we­ sentlicher Teil der Lösung als Tropfen hängenbleiben kann. Dies wiederum könnte zu der Kontamination des Umfeldes und somit zur Querkontamination weiterer Pro­ ben führen, die es jedoch gilt, insbesondere bei der automatischen Handhabung der­ artiger Proben, zu vermeiden.

Um die Probenentnahme insbesondere in einer automatisierten Vorrichtung zu er­ leichtern und sicher gegenüber Querkontamination zu machen, sieht die Vorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel der Fig. 2 eine zweiteilige Ausgestaltung des Deckele­ lementes 4 vor. Das Deckelelement 4 verfügt über eine mittige Bohrung 9 und ist mit einer das Deckelelement 4 umhüllenden elektrisch leitenden, vorzugsweise aus Alu­ minium gefertigten Folie 10 umhüllt. Nach der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch den Kanal 9 eine Pipette eingeführt, die die Folie 10 durch­ stößt, so daß die im Probenvolumen 1 enthaltene Suspension abgesaugt werden kann. Zwar muß in diesem Ausführungsbeispiel die Folie jedes Mal ausgetauscht werden, doch erscheint dies vorteilhaft, zumal zur Vermeidung von Querkontamina­ tionen die gesamte Behandlungszelle als Einwegartikel ausgebildet werden kann.

In Fig. 3 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel dargestellt, das ein Deckelelement 4 vergleichbar zur Ausführungsform gemäß Fig. 1 aufweist. Jedoch sieht diese Ausge­ staltung eine das Probenvolumen 1 abtrennende Metallfolie 11 vor, die zugleich die untere Elektrode darstellt. Unter der Elektrode 11 befindet sich ein Hohlraum 12, der mit einem Kanal 7 verbunden ist. Wie im Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 wird die Behandlungszelle mit einer Suspension von biologischen Zellen aufgefüllt und eine Hochspannungsbehandlung mit chemischen Additiven zum Zellaufschluß durchge­ führt.

Nach Abschluß der elektrischen Feldapplikation wird durch den Kanal 7 der Hohl­ raum 12 evakuiert. Infolge der Druckdifferenz reißt die Folie 11 auf, so daß die be­ handelte Suspension zur weiteren Analyse durch den Kanal 7 abgesaugt werden kann.

Diese Ausführungsvariante eignet sich insbesondere für eine vollautomatische Ver­ fahrensdurchführung, bei der die Gefahr der Querkontaminationen vollständig aus­ geschlossen werden können.

In allen beschriebenen Fällen ist eine chemische Nachbehandlung notwendig, um effizient die Zellinhalte nach außen zu bringen. Die Chemikalien können der Lösung vor der elektrischen Feldapplikation zugesetzt werden; da sie aber in vielen Fällen Elektrolyten sind bzw. in elektrolytischen Puffern optimal wirken, sollen sie dann erst nach Abschluß der elektrischen Feldapplikation der Zellsuspension hinzugefügt wer­ den.

In einer Variante der chemischen Behandlung wird der Zellsuspension eine Mi­ schung aus 15 verschiedenen Restriktionsendonukleasen (je 3 U/ml) hinzugefügt, und bei 37°C ca. 10 bis 30 Minuten inkubiert. Die Reagenzien diffundieren durch die bei der elektrischen Feldapplikation entstandenen Membranporen in das Zellinnere und zerschneiden gezielt die DNA-Stränge auf Stücke mit einigen Tausend Basen­ paaren, die später für PCR-Reaktion verwendet werden können. Nach der Behand­ lung wird der Suspension Proteinase K in einer Konzentration von 1 µg/ml hinzuge­ fügt, und das Temperaturniveau wird auf 60°C eingestellt. Proteinase K diffundiert gleichfalls durch die Poren und bewirkt die Lyse sowohl von Zellproteinen als auch der im vorherigen Schritt hinzugefügten Enzymen, so daß störende Einflüsse auf die nachfolgenden PCR-Reaktionen ausgeschlossen werden. Nach Inkubation von 10 bis 30 Min. bei 60°C wird die Temperatur auf 95°C gebracht. Dabei denaturiert die Proteinase K, und die DNA diffundiert durch die Poren in der Membran nach außen. Durch derartige Behandlung werden die PCR-Inhibitoren, sowohl hinzugefügte als auch zelleigene, weitgehend abgebaut.

In einer anderen Variante der chemischen Behandlung wird nach Abschluß der elek­ trischen Feldapplikation der Zellsuspension Guanidiniumhydrochlorid bzw. - thiocyanat (GdnHCl bzw. GdnSH) hinzugefügt, so daß eine 0,3 bis 3 M Konzentra­ tion eingestellt wird. Die Suspension wird auf eine Temperatur von 60 bis 100°C ge­ bracht und 10 bis 30 Min inkubiert. Dadurch werden die Zellwände und Membranen zerstört, wodurch die DNA freigesetzt wird. Diese Methode ist einfacher als die oben beschriebene, hat aber den Nachteil, daß Guanidiniumverbindungen, die zwar in ei­ ner geringeren Konzentration als sonst für rein chemischen Zellaufschluß verwendet werden, die nachfolgende PCR-Reaktion inhibieren können und deswegen aus der Lösung entfernt werden müssen.

In der Ausführungsform gemäß Fig. 4 sind an den Oberseiten der Elektroden 13 und 3 Oberflächenrauhigkeiten vorgesehen, durch die in das Probenvolumen 1 einge­ brachte Gewebestücke 16 zerkleinert werden können.

Die obere Elektrode 13 und das Gehäuse 2 sind gemäß Ausführungsbeispiel der Fig. 4 derart ausgeführt, daß die Elektrode 13 axial und rotationsbeweglich geführt ist. Das Restvolumen des Probenvolumens 1 wird mit einer Flüssigkeit 17 aufgefüllt und die Gewebeprobe 16 durch einen Druck auf die obere Elektrode 13 zwischen den Elektroden zusammengepreßt. In diesem Fall ist die Flüssigkeit nur notwendig, um elektrische Entladungen zwischen den Elektroden auszuschließen, da die Probe selbst die Elektroden direkt kontaktiert. Die zwischen die Elektrode eingebrachte Flüssigkeit ist daher nicht unbedingt elektrisch leitend, so daß reines Wasser oder auch Öl verwendet werden kann.

Nach der Hochspannungsbehandlung und der Zugabe entsprechender chemischer Additive wird die Gewebeprobe 16 durch Anlegen eines starken Druckes an die obe­ re Elektrode 13, eventuell kombiniert mit Rotationsbewegungen zerquetscht. Die obere Elektrode 13 und das Gehäuse 2 mit der unteren Elektrode 3 spielen also die Rolle eines Stempels und einer Matrize. Vorzugsweise weisen die Elektrodenober­ flächen ein rauhes Profil 17 auf, um die Desintegration des Gewebes effizienter zu machen.

Die dabei freigesetzte Flüssigkeit bzw. der sich bildende Brei, der die Nukleinsäuren enthält, steigt in den Spalt 14 zwischen der oberen Elektrode 13 und dem Gehäuse 2 auf und kann durch den Kanal 15 zur weiteren Analyse abgesaugt werden.

Bezugszeichenliste

1

Behandlungsraum (wird mit dem zu behandelnden biologischen Material im entsprechenden Medium (Elektrolytlösung) befüllt)

2

Gehäuse / Kapsel

3

Untere Elektrode

4

Deckel

5

Mediumüberschuß

6

Vertiefung / Rinne dafür

7

Stecker

8

Bohrung für Elektrodenanschluß

9

Kanal im Deckel

10

Metallfolie auf dem Deckel

11

Untere Elektrode aus Metallfolie

12

Hohlraum

13

Obere Elektrode

14

Spalt

15

Kanal im Gehäuse

16

Gewebeprobe

17

Flüssigkeit

Claims (22)

1. Verfahren zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte,
dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt wer­ den und
daß vor oder nach dem Anlegen des elektrischen Feldes die Zellen mit Substanzen in Kontakt gebracht werden, die den Zellaufschluß unterstützen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das elektrische Feld ein gepulstes Feld mit einer Feldstärke über 5 kV/cm, bevorzugt über 20 kV/cm und mit einer Pulsdauer etwa 0,5 bis 50 Mikrosekunde ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß etwa 1 bis 100 Feldpulse an die Zellen angelegt wer­ den.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen im Gewebeverband oder auf einem Träger, bevorzugt einem Filter, vorliegen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einem elektrisch leitenden Medium suspendiert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium, in dem die Zellen suspendiert sind ei­ nen spezifischen elektrischen Widerstand von 20 bis 200 Ohm . m aufweist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Detergenz, eine Nuklease oder eine Protease ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat) ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease Proteinase K ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Dimethylsulfoxid (DMSO) ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Guanidiumthiocyanat oder -hydrochlorid (GdnSCN oder GdnHCl) ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Guanidinium-Verbindung eine Konzentration von über 0,2 M aufweist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium einer Temperatur zwischen 35 und 100°C ausgesetzt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die aufzuschließenden Zellinhalte Nukleinsäuren sind.

15. Vorrichtung zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte, zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein, die in einem Medium suspendierten Zellen, Zell­ verbände in Form eines Gewebeverbandes oder auf einem Träger aufgebrachte Zellen aufnehmendes Probenvolumen mit zwei flächig ausgebildeten, sich gegen­ überliegenden Elektroden vorgesehen ist, das durch ein Deckelelement, dessen dem Probenvolumen zugewandte Seite konvex ausgebildet ist, an der Oberseite des Probenvolumens abschließbar ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Deckelelement als Elektrode ausgebildet ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Deckelelement gegenüberliegende Elektrode eine dem Probenvolumen zugewandte konkav ausgebildete Seite aufweist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Deckelement eine Durchgangsöffnung zum Pro­ benvolumen aufweist und an der dem Probenvolumen zugewandten Seite mit einer elektrisch leitenden Folie überzogen ist.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Deckelelement gegenüberliegende untere Elektrode als Folie ausgebildet ist, die das Probenvolumen von einem unter der Folie befindlichen Abflußkanal trennt.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Deckelelement als Stempel ausgebildet ist, der axial und rotatorisch beweglich innerhalb des Probenvolumens führbar ist.

21. Vorrichtung nach einem der Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Probenvolumen zugewandten Flächen der Elektroden aufgerauht sind.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden etwa 1 bis 5 mm voneinander beab­ standet sind.