JPH08510004A

JPH08510004A - 直接溶解緩衝液およびｈｉｖ−１血漿ウィルス血症の検出

Info

Publication number: JPH08510004A
Application number: JP6525476A
Authority: JP
Inventors: ヘンラード，デニス・アール; フイリツプス，ジヤツク
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-05-06
Filing date: 1994-04-28
Publication date: 1996-10-22
Also published as: EP0698082A1; EP0698082A4; CA2161337A1; WO1994026867A1; AU6776994A

Abstract

(57)【要約】ビリオンの直接溶解ならびに逆転写およびＰＣＲによるＨＩＶ−１ｃＤＮＡの複製の簡略化した方法と組み合わせた血漿ＨＩＶ−１の免疫捕獲は、ＨＩＶ−１感染症の進行をモニターする迅速で高感度の方法である。また、この方法は、定量的培養法よりも時間が短く、作業があまり大変でない。さらに、免疫捕獲したビリオンを直接溶解する方法および簡略化された一段階の逆転写（ＲＴ）／ＰＣＲ法の開発により、有機溶媒抽出の必要がなくなり、工程数が減少した。直接溶解緩衝液は、ＲＴおよびＰＣＲ反応で直接使用するための血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡが単離されるように調製し、こうして、有機溶媒抽出びエタノール沈澱の必要がなくなった。この結果、アッセイの完了に必要な時間がかなり短縮され、ＰＣＲ反応に関連する汚染の可能性がかなり減少した。免疫捕獲−ＲＴ／ＰＣＲアッセイを使用して、ＨＩＶ−１の母親からその子供への垂直感染がウィルス負荷以外の因子にかなり依存することを示した。逆に、血漿ウィルス負荷は、輸血に関連したＨＩＶ−１感染において重要な役割を果たす。最後に、免疫捕獲−ＲＴ／ＰＣＲによる血漿関連ウィルス負荷の検出および定量は、病気の進行の別のマーカーとなり、種々のＨＩＶ治療の効力の測定に役立つと考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】直接溶解緩衝液およびＨＩＶ−１血漿ウィルス血症の検出発明の分野本発明は、ビリオンを崩壊し、ウィルスの核酸を単離する方法に関する。特に、本発明は、核酸を単離するための、洗剤およびプロテアーゼＫを含む直接溶解（direct lysis）緩衝液を提供する。発明の背景後天性免疫不全（ＡＩＤＳ）の最初の事例が１９８１年に記載されたとき、その病気の原因物質は未知であった。１９８３年に、モンタニエ（Luc Montagnier ）を長とするフランスの研究所は、ヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）として現在知られているその原因ウィルスを単離した。同じ頃、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のギャロ（Robert Gallo）は、その仲間と、ＡＩＤＳの原因物質を単離したことを報告した。２年以内に診断測定法が開発され、ＨＩＶ−１に感染した人の確認に使用された。感度および特異性の両方とも高く開発されたこれらの測定法は、血清または血漿中のＨＩＶ−１に対する抗体の有無を検出するものであった。疫学研究により、ＨＩＶ−１ウィルスは、同性愛者および血友病患者などの特定の集団ではほとんど検出され、主な感染ルートは、性接触または感染した血液製剤の使用によることが分かった。後に、ＩＶ薬物使用者は、針を使用して分け合う習慣のために（すなわち、血液のクロス汚染）、ＨＩＶ感染の危険性が高い集団であることが分かった。ＨＩＶの感染と感染した血液への接触または感染血液製剤の使用との間の相関関係は、ウィルス感染の拡大を減少・抑制するために、血液バンクの強制的なスクリーニングの開始を促した。年間２０００万単位の供血および血液製剤の全てのテストを実行するシステムが確立された。この日常的テストにより、輸血または血液製剤の使用によるＨＩＶ−１関連の感染の数はかなり減少した。現在、輸血によるＨＩＶ感染の危険は、約１：２５０，０００と推定される。ＨＩＶの輸血による感染の数は減少したが、ＡＩＤＳ関連の感染の数は世界中で増加が続いている。１９９２年の場合、米国および世界中でＨＩＶ−１ウィルスに感染した人の推定数は、各々、１００万および１０００万である。米国のみでは、毎年４０，０００人が新たにＨＩＶ−１に感染していると推定される（Centers for Disease Control．HIV Prevalence Estimates And AIDS Case Projections For The United States：Report Based Upon A Workshop．MMWR 39：（no.RR-16）No vember 30,1990）。このうち、女性および青少年は各々、１１．５％および１．７％である。女性のＨＩＶ感染の大部分は、ＩＶ薬物使用またはＨＩＶに感染したパートナーとの性接触の結果である。青少年ＨＩＶ−１感染の大部分は、母親からその子供へのＨＩＶ−１の垂直感染の結果である。世界全体で、ＨＩＶ−１の垂直感染の割合は、１０％〜４０％の間であると報告されている（The Europe an Collaborative Study．Children Born To Women With HIV-１ Infection：Na tural History And Risk of Transmission．Lancet 1991，337:253-260 および Ryder，R.W.，Nsa．W.N．Hassig，S.E.，Behets，F.，Rayfield，M．and Projec t SIDA，Perinatal Transmission Of The Human Immuno deficiency Virus Type １ Infection To Infants 0f Seropositive Women In Zaire（ザイールにおけるセロポジティブな女性の子供に対するＨＩＶ−１の周産期感染），N．Engl．J ．Med．1989，320:1637-1642）。米国で毎年新たにＨＩＶ−１に感染する推定数４０，０００のうち、１５００〜２０００件は、周産期ＨＩＶ− １感染の結果として新生児に発生している。ＡＩＤＳ関連の事例が毎年増加しているという事実は、一部は、感染の特徴によるものである。その拡大を減少させる手段を達成しようとする場合、その進行の制御を測定する方法が重要となる。ＨＩＶ−１遺伝子構造および複製ＨＩＶはレトロウィルス科に属する。レトロウィルスは、その遺伝物質としてＲＮＡを有し、ＲＮＡゲノムのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）への逆転写を触媒するユニークな酵素である逆転写酵素（ＲＴ）を含むことを特徴とする。レトロウィルスには３つの亜科がある。ＨＩＶは、その構造および遺伝特性に基づいてレンチウィルス亜科に属する。レトロウィルスゲノムは、典型的には９，０００〜１０，０００の塩基対から成り、全てのレトロウィルスに特徴的な３個の構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。また、調節タンパク質をコードするｐｏｌおよびｅｎｖの３’末端にはユニークな配列を含む。そのゲノムの５’および３’両末端には、ＬＴＲ（long terminal repeat）という２個の同一配列がある。５’ＬＴＲは、宿主細胞転写機構によるプロウィルスＤＮＡの発現に不可欠である。ＨＩＶ−１ＲＮＡゲノムは、９個の遺伝子を表す全部で９，７４９個のヌクレオチドから成る（Haseltine，W．A.，Wong-Stall，F．The Molecular Biology O f The AIDS Virus．Scientific American 1988，259:52-62）。そのゲノムは、３個の特徴的な構造遺伝子と別の６個の調節遺伝子（ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｎｅｆおよびｖｐｕ）を含む。ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質は、全長転写から翻訳され、ｅｎｖタンパク質は、スプライシングを受けた転写体から翻訳される。ｇａｇ遺伝子が転写されると全長ＲＮＡになり、翻訳されて前駆体ポリタンパク質となり、続いて、ウィルスコアの主な構造タンパク質を作る３個のカプシドタンパク質に切断される。ｐｏｌタンパク質は実際は、ｇａｇ−ｐｏｌ前駆体の一部である。遺伝子のｐｏｌ部分は、ウィルスコア内部のＲＮＡに関連する酵素（プロテアーゼ、逆転写酵素およびインテグラーゼ）をコードする。逆転写酵素は実際は、３つの酵素機能を有する。すなわち、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼ活性である。エンベロープ遺伝子（ｅｎｖ）は、プロテアーゼによって切断されて細胞外糖タンパク質ｇｐ１２０およびトランスメンブランタンパク質ｇｐ４１になる前駆体タンパク質ｇｐ１６０をコードする。ｇｐ１２０タンパク質は、ウィルスの細胞表面ＣＤ４受容体への結合に関与する。ｇｐ４１タンパク質は、シンシチウムの形成を媒介し、また、ウィルスコアの細胞内部への侵入を助ける（Sodrowski，J .，Goh，W.C.，Resen，S.，Campbell，K.，and Haseltine，W.A，Role Of The H TLV-III/LAV Envelope In Syncytium Formation And Cytopathicity（シンシチウム形成および細胞障害におけるＨＴＬＶ−III／ＬＡＶエンベロープの役割）．Nature 1986;322:470-474および McCune，J.M.，Rabin，L.B.，Feinburg，M. B.，Lieberman，M.，Kosek，J.C.，Reyes，G.R.，and Weissman，I，L．Endopro teolytic Cleavage Of gp160 Is Required For The Activation of Human Immun odeficiency Virus（ヒト免疫不全ウィルスの活性化には、エンド型タンパク質分解によるｇｐ１６０の切断が必要である）．Cell 1988;53:55-67）。６個の別の遺伝子は、ウィルスの複製および組み立てに必要なウィルスタンパク質の産生を調節する（Haseltine,前出）。ＨＩＶ−１の構造は、全てのレトロウィルスの構造と似ている。２個のｇａｇタンパク質から成る円柱形のコアを含む。コアの内部には、２本の同一の一本鎖ＲＮＡ分子が入っている。そのＲＮＡゲノムに関与するのは、逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼである。コアは宿主細胞の形質膜に由来するエンベロープによって囲まれている。その膜の表面には、ｇｐ４１トランスメンブランタンパク質と非共有的に結合しているＨＩＶ−１の特定タンク質ｇｐ１２０のコピーが点在している。ＨＩＶ感染サイクルは、ウィルスエンベロープタンパク質が宿主細胞表面上にあるＣＤ４＋分子に結合することから始まる。ＣＤ４＋分子は、典型的には、Ｔリンパ球およびマクロファージ／単球上に存在する。ウィルスおよび宿主細胞の膜が融合し、ウィルスのコアが宿主細胞に入り込む。コアが一旦宿主細胞内部に入ると、ウィルスＲＮＡゲノムがｃＤＮＡコピーに逆転写される。ＲＮＡゲノムは次いで、ＲＴ−関連酵素リボヌクレアーゼＨによって破壊され、ｃＤＮＡコピーを鋳型としてもう一本のＤＮＡコピーがポリメラーゼにより作られる。この二本鎖ウィルスＤＮＡは核に移動し、そこで、ウィルスタンパク質インテグラーゼによって宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたウィルスＤＮＡは、プロウィルスと言う。新しいウィルス粒子の産生、その細胞からの放出、および新しい細胞への感染によりＨＩＶ感染のサイクルは完了する。新しいウィルス粒子の産生は、最初、宿主細胞の転写因子の制御下にある。プロウィルスＤＮＡのＲＮＡへの転写は、ウィルスのＬＴＲ中の配列によって開始される（Tong-Starken，S.E.，Luciw，P .A.，and Peterlin，B.M．Human Immunodeficiency Virus Long Terminal Repea t Responds To T-cell Activation Signal（ヒト免疫不全ウィルスのＬＴＲはＴ −細胞の活性化シグナルに反応する）．Proc．Natl．Acad．Sci．1987;84:6845- 6849）。ＲＮＡ分子のいくつかは、他のＲＮＡ分子がｍＲＮＡとして使用されて新しいウィルスタンパク質に翻訳されている間、遺伝物質として使用される。ｅｎｖタンパク質は、翻訳後に細胞のゴルジ体で処理されて、宿主細胞膜に運搬される。ウィルスのコア構造に使用されるタンパク質は脂肪酸を含み、これらは細胞膜の内側に結合する。新しいウィルスの成分全部が集まると、それらは互いに結合して、細胞膜から外に膨れ出る球構造を形成する。２個のＲＮＡ分子が、成長しているウィルス粒子に入る。最後に、コアに関与する酵素（ＲＴ、インテグラーゼおよびプロテアーゼ）が翻訳後に処理され、コア前駆体タンパク質がプロテアーゼにより切断される。ウィルスコアタンパク質はウィルスＲＮＡゲノムを取り囲み、ほぼ完全なウィルスが宿主細胞膜の一部に自らを閉じ込め、最後には、ウィルスが細胞から出芽して放出される。ＨＩＶまたは他のレンチウィルスによる感染は持続的であり、通常、レベルは比較的低いが連続したウィルス産生を特徴とする。生産的なウィルスの複製がどんどん増加して、病気が進行していくと考えられる。このことから、研究者らは、ＨＩＶ−１感染症の進行に関与する生物学的マーカーの探索を行ってきた。ＨＩＶ−１の進行の予後および血清学的マーカー最近、多くの研究の関心は、ＨＩＶ−１感染者における病気の進行に関与する特定の生物学的マーカーの確認に集中している。ＨＩＶ−１感染症の進行と相関するマーカーの確認は、その病気の原因を決定し、理解するのに重要である。さらに、病気の進行と相関するマーカーの確認は、治療薬の開発およびモニターの助けになる。ＨＩＶ−１の病因に関する初期の研究で、ＨＩＶ−１の主な標的細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、病気が進行すると、その細胞の総数がかなり減少することが分かった（Schittmann，S.M.，Pallidopoulous，M.C.，Lane，H,C.，Thompson，L. ,Baseler，M.，Massari，F.，Fox，C,H.，Salzman，N,P.，and Fauci,A.S．The Reservoir For HIV-１ In Human Peripheral Blood In A T cell That Maintain s Expression Of CD4（ヒト末梢血中のＨＩＶ−１の受け皿はＣＤ４の発現を維持するＴ細胞である）．Science 1989;245:305-308および Klatzmann，D.，Cha mpagne，E.，Chamaret，S．T-lymphocyte T4 Molecule Behaves As The Recepto r For Human Retrovirus LAV（Ｔ−リンパ球Ｔ４分子は、ヒトレトロウィルスＬＡＶの受容体として挙動する）．Nature 1986;234:1120-1123）。他の研究では、病気の進行に関与すると考えられ、免疫細胞の活性化に対応するか、ウィルス産生の増加を反映する可能な血清マーカーの検討が行われた。これらのマーカーとして、β₂ミクログロブリン、ネオプテリンおよびｐ２４抗原血が挙げられた（Melmed，R.N.，Taylor，J.M.，Detels，R.，Bozorgmehri，M.，and Fahey，J. L．Serum Neopterin Changes In HIV Infected Subjects：Indicator Of Significant Pathology，CD4 T-Cell Changes，And Th e Development Of AIDS（血清ネオプテリンはＨＩＶ感染者において変化する：重要な病因、ＣＤ４Ｔ−細胞の変化およびエイズの発症の指標）．J．Acquired Immune Deficiency Syndrome 1989;2:7076）。 β₂ミクログロブリンは、組織適合性複合体（ＨＬＡ）の一部であり、免疫活性化および細胞の代謝回転の際にＴ細胞から放出される。健康な人の正常レベルは、１．９μｇ／μｌ未満である（Hofmann，B.，Wang，Y.，Cumberland，W.G. ，Detels，R.，Bozorgmehri，M.，and Fahey，J.L．Serum β₂-microglobulin L evel Increases In HIV Infection：Relation To Seroconversion，CD4 T-cell Fall and Prognosis（血清β₂ミクログロブリンレベルはＨＩＶ感染において増加する：セロコンバージョン、ＣＤ４Ｔ−細胞の減少および予後との関連）． AIDS 1990;4:207-214）。ネオプテリンは、これらの細胞がγ−インターフェロンによって刺激を受けるときのマクロファージ活性化産物であり、免疫の活性化を反映する。健康な人の正常レベルは、６．６２ナノモル／ｌ以下である（Fuch s，D.，Hausen，A.，Reibnegger，G.，Werner，E.R.， Dierich，M.P.，and Wachter，H．Neopterin As A Marker For Activated Cell- Mediated Immunlty：Application In HIV Infection（活性化細胞によって媒介される免疫のマーカーとしてのネオプテリン：ＨＩＶ感染における応用）．Immu no．Today 1988;9:150-154）。各マーカーの正常なレベル以上の増加は、リンパ球およびマクロファージの活性化を表す。ＨＩＶ−１ｐ２４が陽性である場合は、ウィルス活性および産生の増加を表し、予後がよくないことに関与することが示された（Allain，J.P.，Laurian，Y.，Paul，D.A.，Verroust，F.，Leuther ，M.，Gazengel，C.，Senn D.，Larrieu，M.J.，and Bosser，C．Long-Term Eva luation Of HIV Antigen And Antibodies To p24 And gp41 In Patients With H emophilia（血友病患者におけるｐ２４およびｇｐ４１に対する抗体およびＨＩＶ抗原の長期的評価）．N．Engl．J．Med．1987;317:1114-1121）。全体として、絶対値として表されるＣＤ４＋リンパ球の減少が、ＨＩＶ−１の進行を示す最良の予報値であることが分かった。ネオプテリンまたはβ₂ミクログロブリンのレベルがこの後に続き、最後がｐ２４抗原であった（Fahey，J.L. ，Taylor， L.M.，Detel，R.，Hofmann，B.，Melmed，R.，Nishanian，P.，and Giorgi，J． V．The Prognostic Value Of Cellular And Serological Markers In Infection With Human Immunodeficiency Virus Type１（ＨＩＶ−１感染における細胞および血清学的マーカーの予後評価）．N．Engl．J．Med．1990;322:166-172）。ごく最近、細胞および血漿のウィルス負荷の増加が、ＨＩＶ−１感染症の臨床上の発現と関連し、ＣＤ４＋細胞数の減少と相関があることが示された（Venet ，A.，Lu，W.，Beldjord，K.，and Andrieu，J.M．Correlation Between CD4 Ce ll Count And Cellular and Plasma Viral Load In HIV-１ Seropositive Indiv iduals（ＨＩＶ−１セロポジティブな人におけるＣＤ４細胞数と細胞および血漿のウィルス負荷との相関性）．AIDS 1991;5:283-288）。感染者から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または血漿を必要とする培養技術を使用してウィルス負荷が測定された（Ho，D．D.，Moudgil，T.，and Alam，M．Quantitation Of H uman Immunodeficiency Virus Type １ In The Blood Of Infected Persons（感染者の血液におけるＨＩＶ−１の定量）．N．Engl．J．Med．1989;321:1621-162 5； Coombs，R.W.，Collier，A.C.，Allain，J.P.，Nikora，B.，Leuther，M.，Gjer set，G.F.，and Corey，L．Plasam Viremia In Human Immunodeficiency Virus Infection（ＨＩＶ感染における血漿ウィルス血症）．N，Engl．J．Med．1989;3 21:1626-1631）。しかし、この方法を使用すると、作業がかなり大変であり、完了までにかなり時間を要することが分かった。後に、ウィルスＲＮＡの遠心分離法または直接抽出法を使用して血漿からウィルス粒子またはＲＮＡを直接単離する方法が使用された。ウィルス負荷の測定は、ウィルスＲＮＡをｃＤＮＡコピーに逆転写し、ｃＤＮＡをＰＣＲ法を使用して増幅することにより行った（Bagnar elli，P.，Memzo，S.，Manzin，A.，Giacca，M.，Emanuele，V.，and Clementi ，M．Detection of Human Immunodeficiency Virus Type １ Genomic RNA In Pl asma Samples By Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction（逆転写ＰＣＲによる血漿サンプル中のＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの検出）．J．Med．Viro logy 1991;34:89-95）。この結果、測定時間はかなり減少し、感度はかなり増加した。血漿中のＨＩＶ−１ウィルス負荷の測定は、病気の進行および治療効力のモニターにおいてかなり密接な関係を有する。血漿のウィルス負荷の直接測定は、活性ウィルス複製のレベルを示す。病気の進行に関する他のマーカーと組み合わせてウィルス複製をモニターすると、ＨＩＶ− １感染症の病因のより精確な指標となり、病気の進行のより良好な予報値になると考えられる。セロポジティブな患者に治療を施すのに最適な時期を決定するための手段としても役立つ可能性がある。発明の要旨血漿ＨＩＶ−１ウィルス血症のモニターを、逆転写および増幅工程を一本のチューブで行う免疫捕獲−ｃＤＮＡ／ＰＣＲにより行った。本発明の直接溶解緩衝液は、酵素反応を阻害することなく、ＲＴおよびＰＣＲ反応で直接使用するための血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡが単離されるように調製した。こうして核酸の単離に通常必要な有機溶媒抽出およびエタノール沈澱を省いた。この結果、測定の完了までに必要な時間がかなり短縮され（約１６時間の短縮）、処理工程の減少により汚染の可能性も減少したと考えられる。ＨＩＶ−１のｇｐ４１およびｇｐ１２０エンベロープタンパク質に特異的なモノクローナル抗体で被覆されたラテックス微粒子（０．１μｍ）を含むウィルス捕獲アッセイを使用して、血清／血漿から細胞遊離ビリオンを捕獲した。そのアッセイの標準的パラメータでは、血漿サンプルを微粒子の存在下で３時間インキュベートすることが必要である。この実験では、インキュベーションの時間がアッセイの感度を低下させることなく短縮できるかどうかを測定するために、インキュベーションの時間を変化させた。ＨＩＶ−１ＲＮＡをウィルスタンパク質から抽出・精製する通常の方法は、最後に一夜エタノール沈澱する工程を除くと、数時間を要する。その方法はまた、チューブを多数回変える必要があり、それは、比較的汚染を招きがちである。有機溶媒抽出およびエタノール沈澱の工程を省くために、本発明は、粒子に結合したＨＩＶ−１ビリオンを直接溶解するための一連の緩衝液および条件を含む。直接溶解緩衝液成分と逆転写酵素およびＰＣＲ酵素との相容性が主な問題点であり、この要件を満たす緩衝液の組成物に特に注意を払った。溶解緩衝液に、単一の洗剤を種々の濃度で含めた。イオン性および非イオン性洗剤を直接溶解緩衝液の成分として検討した。また、低濃度のプロテイナーゼＫを種々の洗剤と組み合わせて添加したときの有効性も調べた。直接溶解緩衝液の組成物がいったん決定されると、ウィルス膜の破壊に必要な時間および温度条件を測定した。ＨＩＶ−１ＲＮＡをｃＤＮＡコピーに逆転写するために使用される標準方法およびＰＣＲによるその増幅は、二つの別々の操作を必要とする。最大の感度は、二つの操作で使用されるアッセイ成分（すなわち、緩衝液、塩、プライマー、ｄＮＴＰおよび酵素の濃度）を最適化することにより得られた。しかし、二つの操作を一緒にすると、アッセイ感度および時間においてかなり有利になると考えられた。逆転写および増幅操作を一緒にして一つの操作にすることができるかどうかを調べるために、一連の実験を行った。直接溶解緩衝液とＲＴおよびＰＣＲアッセイ成分との相容性は保持した。アッセイ感度は、ＭｇＣｌ₂およびｄＮＴＰ濃度ならびに必要であれば他の成分を最適化することにより保持した。本文の内容は次のとおりである。Ｉ．背景歴史的バックグランドＨＩＶ−１の遺伝子構造および複製ＨＩＶ−１の進行に対する予後および血清学的マーカー II．要旨図面の簡単な説明 III．詳細な説明ＨＩＶ−１感染した妊婦の血漿ウィルス負荷ＨＩＶ−１感染した血液ドナーのウィルス負荷 II．材料および方法逆転写コントロール増幅コントロール免疫捕獲コントロールアッセイ間およびアッセイ内の汚染コントロールプライマーおよびプローブの調製粒子の調製ＳＫ１９プローブの標識化ウィルス捕獲逆転写ＰＣＲ液体ハイブリッド形成およびオートラジオグラフィーオートラジオグラフの定量 III．結果アッセイコントロールの解析直接溶解緩衝液直接溶解緩衝液のインキュベーション時間および温度ウィルス捕獲時間単独添加ＲＴ／ＰＣＲセロポジティブな妊婦における血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡの検出セロポジティブな血液ドナーにおける血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡの検出 IV．考察Ｖ．参考文献 VI．請求の範囲図面の簡単な説明図１は、アッセイコントロールを示し、Ａ）免疫捕獲コントロール、Ｂ）逆転写コントロール、およびＢ）増幅コントロールを示す。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った（Ｎｅｇ、ＲｎおよびＤｎは、各々、捕獲、ＲＮＡおよびＤＮＡの陰性コントロールを表す。）。図２は、種々の洗剤濃度の検出感度に対する影響を示す。各洗剤濃度の評価を、各々、ＲＮＡコントロールＲ−５およびＲ−６を使用して行った。評価には、標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用した。ＲＮＡコントロールは、標準抽出法を使用して処理した。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った。図３は、直接溶解緩衝液の免疫コントロールに対する影響を示し、Ａ）有機溶媒抽出、Ｂ）０．００５％のTriton Ｘ−１００を含む直接溶解緩衝液、Ｃ）０．００４５％のTween２０を含む直接溶解緩衝液、Ｄ）０．００１％のＳＤＳを含む直接溶解緩衝液を示す。プロテイナーゼＫを指示したように含めた。標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用した。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った。図４は、直接溶解時間および温度の最適化を示す。直接溶解緩衝液および標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用して血漿コントロールの評価を行った。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った。図５は、ウィルス捕獲時間の最適化を示す。捕獲時間を血漿コントロールを使用して測定し、直接溶解緩衝液および標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用して評価した。オートラジオグラフィーを−８０℃で４時間行った。図６は、ｄＮＴＰ濃度が５０ｍＭであるときの一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対するＭｇＣｌ₂濃度の影響を示す。標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用してコントロールのアッセイを行った。ＭｇＣｌ₂濃度の範囲は１．５〜２．０ｍＭであった。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った。図７は、ｄＮＴＰ濃度が１００μＭであるときの一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対するＭｇＣｌ₂濃度の影響を示す。標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用してコントロールのアッセイを行った。ＭｇＣｌ₂濃度の範囲は１．５〜２．０ｍＭであった。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った。図８は、ｄＮＴＰ濃度が２００μＭであるときの一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対するＭｇＣｌ₂濃度の影響を示し、Ａ）逆転写、Ｂ）増幅、Ｃ）免疫捕獲を示す。標準ＲＴ／ＰＣＲ法を使用してコントロールのアッセイを行った。テストしたＭｇＣｌ₂濃度は１．７５ｍＭであった。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った。図９は、一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対するアッセイ体積の影響を示し、Ａ）５０ μｌ法、Ｂ）１００μｌ法を示す。オートラジオグラフィーを−８０℃で３時間行った。発明の詳細な説明病気の感染および進行に関係する因子の決定が、ＨＩＶ−１研究における主な関心事である。最近、いくつかの研究が、ＨＩＶ−１の感染に対応すると考えられる因子の確認に集中して行われた。これに関しては、ＨＩＶ−１ウィルス負荷と感染との相関が重要であると考えられる。ＨＩＶ−１感染の二つの型として、母親から子供への感染（垂直）と血液ドナーから受血者への感染（水平）がある。ＨＩＶ−１の母親から子供への垂直感染による感染数は米国では比較的少ないが、毎年、新たな感染者の約２％が垂直感染によるものである。同様に、輸血に関連するＨＩＶ−１感染の現在の数は極めて少ない。しかし、これら二つのケースでＨＩＶ−１ウィルス負荷とＨＩＶ−１の感染の間に相関があるかどうかを調べることは、ＨＩＶ−１の原因の理解を深めることになるであろう。ＨＩＶ−１に感染した妊婦の血漿ウィルス負荷自分の乳児の１５か月後のＨＩＶ−１抗体の減少または存続により回顧的に測定した伝染および非伝染妊婦からサンプルを集めた（Case Western Reserve Uni versity and the University of Washington，Seattle提供）。各サンプルのウィルス捕獲およびＲＴ／ＰＣＲを、コード化したサンプルに対して二重に行った。認識された半定量的値（３＋、２＋、１＋、陰性）で評価した。半定量的血漿ＲＮＡウィルス負荷を伝染に対する他の可能なウィルス学的マーカー（ｐ２４抗原血、ＣＤ４＋の数およびβ₂ミクログロブリンレベル）と比較して、ＨＩＶ− １垂直感染の予知に対する臨床上の有用性を検討した。ＨＩＶ−１に感染した血液ドナーの血漿ウィルス負荷ＨＩＶ−１セロポジティブな血液ドナーの血漿サンプルを得て（Transfusion Safety Study Repository，San Francisco，CA）、ＨＩＶ−１血漿ウィルス負荷を回顧的に測定した。サンプルの選択は、受血者を感染させたことが分かっている７８個のサンプルおよび受血者を感染させなかった１２個のサンプルのプールから行った。全部で２２個のサンプルをテストし、受血者を感染させたドナーおよび受血者を感染させなかったドナーからのサンプル数を同じにした。各サンプルに対して、ウィルス捕獲およびＲＴ／ＰＣＲを二重に行った。認識された半定量的値で評価した。半定量的血漿ＲＮＡウィルス負荷を伝染に対する他の可能なウィルス学的マーカー（ｐ２４抗原血、ＣＤ４＋の数およびβ₂ミクログロブリンレベル）と比較して、ＨＩＶ−１の輸血関連感染におけるＨＩＶ−１ウィルス負荷の関与を検討した。材料および方法コントロールの調製逆転写コントロール：逆転写操作の効率をモニターするために、一組の検定したＲＮＡサンプルを、ＨＩＶ−１ IIIＢに慢性的に感染したＨ９細胞系から調製した（Abbott Laboratories）。細胞の全核酸をチオシアン酸グアニジンで抽出し、ＲＮＡを、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）クッションを通して遠心により精製した（Chirgwin，J.M.，Prsybla，G.，MacDonald，P.J.，and Rutter，W.J．Iso lation Of Total Cellular RNA（総細胞ＲＮＡの単離）．Biochem．1979;18:529 4-5299）。ＲＮＡペレットをｄｄＨ₂Ｏを用いて溶解して０．５μｇ／ｍｌにし、２０μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡを含むｄｄＨ₂Ｏで連続的に１０倍希釈を行った（GIBC0-BRL,Gaithersburg，MD）。１０⁵および１０⁶倍に希釈したサンプル（Ｒ^-5およびＲ^-6と言う。）が、逆転写および増幅後に一貫して陽性の結果を与えた二つの最も低い希釈であった。これらのサンプルをコントロールとして使用した。増幅コントロール：細胞１個につきプロウィルスＨＩＶ−１の一つのコピーを含むＨＩＶ−１ＬＡＶ感染細胞系８Ｅ５（Memorial Sloan Kettering Institute ，New York）を使用して増幅コントロールを調製した。１０⁶個の細胞の全ゲノムＤＮＡ（１０⁶ＨＩＶ−１コピーという。）を、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Promega，Madison，WI）および０．２５％のＳＤＳ（Sigma，St．Louis，MO）を含む５００μｌの溶液中、５６℃ で１時間抽出した。次いで、溶解産物を同量のフェノール（ｐＨ７．０）、次いでクロロホルム（０．３ＭのＮａＯＡｃに調整）で抽出した後、−２０℃で１６時間、２倍体積の無水エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心（Hill Scientific mv13）し、上清を除去し、ペレットを氷冷した７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレットを０．５ｍｌの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌに溶解した。約１０⁶ＨＩＶ−１プロウィルスコピーに対応する精製したＤＮＡを２０μｇ／ｍｌの鮭の精子ＤＮＡ（Sigm a，St．Louis，MO）を含むｄｄＨ₂Ｏで連続的に１０倍希釈した。５０μｌの１０^-3および１０^-4希釈（各々、１００および１０個のＨＩＶ−１プロウィルスコピーに対応する。）を増幅コントロールとして使用した。免疫捕獲コントロール：ウィルス捕獲操作により再現性のある結果が得られることを立証するために、一組の検定された血漿コントロールを調製した。慢性的にＨＩＶ−１ IIIＢに感染したＨ９細胞（Abbott Laboratories）の上清を得て、セロネガティブ血漿で連続的に１０倍希釈した。希釈物をウィルス捕獲、次いでＲＴ／ＰＣＲによりテストし、最も低い二つの陽性希釈物（ＭＫ^-4およびＭＫ^-5 という）を陽性コントロールとして使用した。測定間および測定内汚染コントロールＰＣＲ操作における擬陽性の最も普通の原因は、先に増幅されたＤＮＡの持ち込み（carryover）であるが、サンプル間の汚染もその問題の一因である。サンプル取扱い中およびＰＣＲ操作中の汚染可能性を最小にするために、一連の工程を型にはめて行った。試薬の調製には、プラスチック製で使い捨ての単独用途のビーカーを使用した。全ての試薬の調製は、ＲＮａｓｅを含まない瓶入りの蒸留水（Abbott Laborat ory，Catalog #NDC 0074- 7139-09）を使用して行った。全試薬を単独用途のチューブに分けて入れ、使用するまで−２０℃で保存した。サンプルの取扱い、増幅および検出は、３か所の別々の実験室で行った。サンプルの取扱いは、層流フード中で行った。常にラテックスの手袋をはめ、測定中に何度も取り替えた。各実験室には、独立した一組のピペットマンがあり、操作中はバリアピペットチップを使用した。増幅は、アクリル製の生物学的に安全なキャビネット中で行った。生物学的に安全なキャビネットには、ＰＣＲ実験室と同様に、紫外線源を備え、可能なＲＮＡ／ＤＮＡ汚染を制御するために、毎週、紫外線滅菌（American Ultraviolet Company，Murry Hills，NJ）を行った。各測定に、免疫捕獲、逆転写およびＰＣＲの陰性コントロールを含めた。３個の陰性コントロールのいずれか一つが陽性の結果になった場合は、測定を無効とした。プライマーおよびプローブのオリゴヌクレオチドの調製プライマーＳＫ３８／ＳＫ３９（各々、ヌクレオチド１５５１〜１５７８および１６３８〜１６６５を表す）およびＨＩＶ−１（ＨＩＶＳＦ２，Genebank Ｋ０２００７）ｇａｇ領域のヌクレオチド１５９７〜１６３５を表すプローブＳＫ１９を、Applied Biosciences，Inc．380 Synthesizer（Foster City，CA）を使用してAbbott Laboratoriesで合成し、Waters Photodioarray 990（Milford，MA ）によりＨＰＬＣ精製を行った。粒子の調製カルボキシ化されたラテックス微粒子（直径０．１〜０．３μｍ、Seradyn In c.，Indianapolis，IN）を、１−エチル−３，３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド化学（ＥＤＣ）（Sondergard-Anderson，J.，Lauritzen，E.，Li nd，K.，and Holm，A．Covalently Linked Peptides For Enzyme-Linked Immuno sorbent Assay．J．Immuno Methods 1990;131:99-104）を使用して、ＨＩＶ−１モノクローナル抗−ｇｐ１２０および抗−ｇｐ４１ＩｇＧ（Abbott Laborator ies）と共有的に結合させた。結合後、微粒子を１７，０００ｘｇ（Beckman J2- 21M）で３０分間遠心し、上清を捨てた。微粒子を同量の洗浄緩衝液（２％のTwe en20を含むＰＢＳ）で２回洗浄した後、被覆緩衝液（１５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％の豚皮ゼラチン、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、９．５％のショ糖および０．０２％のＮａＮ₃）により再懸濁した。被覆緩衝液中、４５℃で１６時間インキュベートした後、微粒子をペレット化し、上清を捨てた。微粒子を保存緩衝液（６５．５ｍＭのトリス、８４．５ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．４Ｍのショ糖、１％の豚皮ゼラチンおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０）により再懸濁して、最初の体積の５０％にし、固体の割合を、希釈画分のＡ₅₀₀を公知固体の標準曲線と比較することにより求めた。微粒子は、保存緩衝液により、予め決めた割合の固体になるように調整し、使用するまで２〜８℃で保存した。ＳＫ１９プローブの標識化ＳＫ１９オリゴヌクレオチド（５’−ＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣ）の５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して³²ＰＯ₄で標識化した。反応物は、５．０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ₂、５．０ｍＭのＮａＣｌ、１．０μｇのＳＫ１９、５０μＣｉのγ³²ＰＡＴＰ（Amersham，３０００Ｃｉ／ミリモル）および１０ＵのＴ４キナーゼ（New England BioLabs，Beverly，MA）で構成され、全体積は１０μｌであった。反応を３７℃で３０分行い、次いで、Ｔ４キナーゼの不活性化を９５℃で５分行った。標識したプローブを未混入の³² ＰＡＴＰから分離するために、反応混合物を、２００Ｖで１時間、１０％ポリアクリルアミドゲル（２９．２５ｍｌのＨ₂Ｏ、２．２５ｍｌの１０×ＴＢＥ〔S ondergard-Anderson，J，Lauritzen，E.，Lind，K.，and Holm，A．Covalently Linked Peptides For Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（酵素結合免疫測定法用の共有結合ペプチド）．J．Immuno．Methods 1990;131:99-104〕、１１．５ｍｌのポリアクリルアミド：ビス（１９：１）、３０μｌの１０％過硫酸アンモニウムおよび３０μｌのＴＥＭＥＤ）による電気泳動にかけた。ＤＮＡを０．５ μｇ／ｍｌの臭化エチジウム／ｄｄＨ₂Ｏで５分間染色し、長波長ＵＶ照射（LKB 2011 Macrovue）を使用して可視化した。標識化したプローブを表すバンドを切り取って、０．５ｍｌのＳＴＥ（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）および１ｍＭのＥＤＴＡ）を含む１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。ゲル画分からプローブを溶離するために、チューブを室温で１６時間回転させた（Labquake Shaker，Berkley，CA）。溶離された３μｌのプローブは約６．０ｎｇに対応し、これを使用して標識化効率を測定した。標識化ＳＫ１９プローブの特異的活性は、通常、１×１０⁷〜２×１０⁷ｃｐｍ／μｇであった。その標識化プローブを使用するまで−２０℃で保存した。ウィルス捕獲ＨＩＶ−１ビリオンの免疫捕獲をリン酸塩緩衝食塩水（１５０μｌ；ＰＢＳ，１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、１．７６ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄）、抗ＨＩＶ−１抗体を被覆した微粒子（５０μｌ）および血漿（５０μｌ）を含む１．５ｍｌのエッペンドルフチューブで行った。混合物を、揺れる台（２０ｒｐｍ，Thermolyne VariMix）の上で３時間、室温でインキュベートした後、５０００ｒｐｍで１０分遠心し、上清は取っておくか捨てるかした。プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ溶液（２００μｌ；１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、０．２５％ＳＤＳ）０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫおよび１０ｐｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ）の添加によりゲノムＨＩＶ−１ＲＮＡを抽出して、さらにインキュベートした（５６℃で１時間）。同量のフェノールで抽出した後、同量のクロロホルム（０．３ＭのＮａＡＯｃに調整）で抽出することによりＨＩＶ−１ＲＮＡを精製し、−２０℃で１６時間、２倍体積の無水エタノールで沈澱させた。ＲＮＡを１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心（Hill Scientific mv 13）によりペレット化し、上清を捨てた。ＲＮＡペレットを氷冷した７０％エタノールで洗浄し、前記と同様に遠心し、上清を捨てて、ＲＮＡを３０μｌのｄｄＨ₂Ｏに溶解した。逆転写ウィルスＲＮＡを、Avian Myeloblastosis Virus（AMV-RT，Gibco-BRL）由来の逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに逆転写した。単離したＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡのアリコート（１５μｌ）を５．０μｌのＲＴ混合物を含む０．５ｍｌ遠心チューブに入れたものを二つ用意した。最終のＲＴ反応物は、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、０．００１％のゼラチン、各２５μＭのｄＮＴＰ（Pharmacia，Piscataway，NJ）および２５ｎｇのＳＫ３８／ＳＫ３９プライマー（ＳＫ３８５’−ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴ、ＳＫ３９５’−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ）を含んでいた。チューブを５分間９５℃に加熱し、遠心して、８．０ＵのＲＮａｓｉｎ（Promega，Madis on，WI）を含む逆転写酵素（２．０Ｕ；Gibco-BRL）を添加した。ＲＴ反応は、４２℃で３０分行った。次いで、３０μｌの水および２滴の鉱物油（Sigma，St．Louis，MO）を添加し、逆転写酵素を９５℃で５分間加熱して不活性化した。ＰＣＲＨＩＶ−１ＤＮＡの増幅は、５０μｌのＰＣＲ混合物を各サンプルに添加することにより進行させた。最終のＰＣＲ反応物は、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＫＣｌ、０．００１％のゼラチン、各５０μＭのｄＮＴＰ、５０ｎｇのＳＫ３８／ＳＫ３９プライマーおよび１．０ＵのＴａｑポリメラーゼ（Cetus，Normalk，CT）を含んでいた。各測定には、既知量のＨＩＶ−１プロウィルスを表す一組のＤＮＡコントロールが含まれており、測定はそれと比較して定量化することができた。増幅は、９４℃で１分の変性および５６℃で２分のアニーリング／伸長の３５サイクル分をプログラムしたPerk in Elmer Cetus 480型Thermocyclerを用いて行った。増幅フラグメントの検出液体ハイブリッド形成およびオートラジオグラフィー：増幅したＨＩＶ−１ＤＮＡを、５μｌの³²ＰＳＫ１９プローブ（２．５μｌのプローブ＋２．５μｌのＲ３緩衝液〔５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１００ｍＭのＮａＣｌ〕）（１〜２×１０⁷ｃｐｍ／μｇ）を１５μｌの増幅物質にハイブリッド形成させることにより検出した。増幅した物質およびプローブを混合し、１００℃で１０分加熱し（二本鎖増幅フラグメントを分離するため）、遠心して濃縮物をチューブの底部に戻し、５６℃で３０分間アニーリングさせた。５μｌの充填染料（０．２５％のブロモフェニルブルー、４０％のショ糖）を各サンプルに添加し、その全量を１０％ポリアクリルアミドゲルに載せた。電気泳動を１５０Ｖで３０分、次いで２５０Ｖで１．５時間行った。ゲルをワットマンブロットペーパー上に置き、プラスチックのラップで覆い、増感板（DuPont Cronex）を使用して−８０℃で１時間および４時間オートラジオグラフィーにかけた。オートラジオグラフの現像は、Kodak M35A X-OMATプロセッサーを使用して行った。オートラジオグラフの定量：サンプル結果を血漿および既知ＤＮＡコピー数のコントロールと直接比較することにより、結果の定量化を行った。いくつかの場合は、デンシトメーターの読み取りの精確な比較を使用して結果を定量化した。結果アッセイコントロールの解析免疫捕獲、逆転写および増幅操作の効率を特定のコントロールを使用してモニターした。免疫捕獲コントロールは、ＨＩＶ−１ IIIＢ感染Ｈ９細胞系由来の組織培養上清を段階希釈して、できるだけ希釈した二つの陽性希釈物から構成した。逆転写コントロールは、ＨＩＶ−１ IIIＢ感染Ｈ９細胞系から抽出し、精製して調製したＲＮＡを段階希釈して得られた最も希釈された二つの陽性希釈物からなる。増幅コントロールは、細胞１個につきＨＩＶ−１コピーを一つ含むＨＩＶ−１ＬＡＶ感染８Ｅ５細胞系から得た精製ＤＮＡからなる。３種類のコントロールにより得られた特定の増幅産物を図１に示す。通常、各組のコントロールの検出は、アッセイ間で一致し、アッセイの感度が証明された。さらに、免疫捕獲、逆転写および増幅操作の陰性コントロールを各アッセイに含めて、特異性を証明した。アッセイパラメータの最適化ウィルス捕獲アッセイでは、ＨＩＶ−１のｇｐ４１およびｇｐ１２０エンベロープタンパク質に特異的なモノクローナル抗体と共有結合させた、血清／血漿中の細胞非含有のビリオンを捕獲するラテックス微粒子（０．１μｍ）を使用する。免疫捕獲の当初のプロトコールでは、３時間のインキュベーション、プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ消化、フェノール−クロロホルム抽出、ウィルスＲＮＡを精製するためのエタノール沈澱、逆転写およびＰＣＲによる増幅を含んでいた。アッセイのこの部分を完了するのに要する時間は合計５〜７時間であった。さらに、増幅した物質の検出には、液体ハイブリッド形成、ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーが必要であった。このプロトコールにおける工程の多くは経験的に決められたので、操作全体を簡潔にし、要する時間および汚染の可能性を少なくするために、検出前の工程の一部または全部の改善が求められた。直接溶解緩衝液：フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によるウィルスＲＮＡの精製は、作業が大変で、時間のかかるものである。しかし、この精製を行うと、ＰＣＲにおけるＳＤＳの阻害作用を克服し、アッセイを妨害する可能性がある過剰のプロテイナーゼＫを除去するのに都合がよい（Erlich，H.A，PCR Technology．Principles and Applications for DNA Amplification，Stockton Press，1989.new York．pp.17-22）。有機溶媒の使用およびエタノール沈澱の必要性を省くために、一連の直接溶解緩衝液を調べた。その目的は、標準的な消化／抽出操作に匹敵する結果が得られながら、逆転写および増幅操作に適合する緩衝液を作ることであった。細胞膜およびウィルス膜の破壊に最も一般的に使用される試薬は、イオン性洗剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）並びに非イオン性洗剤のTriton Ｘ−１００およびTween２０である。プロテイナーゼＫは、核酸と会合している可能性があるタンパク質を消化するために、これらの洗剤と一緒に使用された。 Trito n Ｘ−１００およびTween２０の濃度は０．１〜０．５％の範囲であった。これら二つの試薬を０．５％以下の濃度で使用すると、増幅操作の際にＴａｑポリメラーゼを妨害しない。他方、ＳＤＳは、０．１％および０．０１％の濃度で存在させると、ＰＣＲを各々９９％および９０％阻害する。ＳＤＳは、０．００１％以下の濃度で使用すると、Ｔａｑポリメラーゼを阻害しない（Erlich，H.A.，前出）。ウィルス膜の標準的溶解に使用される成分は、０．２５％のＳＤＳおよび５００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含んでいた。しかし、上述のように、直接溶解緩衝液中でウィルス膜を溶解し、かつ、逆転写／増幅において適合する濃度は、かなり低下させる必要があると考えられる。この点に関して、低濃度のTriton Ｘ−１００、Tween２０またはＳＤＳを含む溶解緩衝液を評価した。さらに、低濃度のプロテイナーゼＫを低濃度の洗剤を含む溶解緩衝液に添加した。この場合、ＲＴおよびＰＣＲ操作を開始する前に溶解緩衝液を９５℃で１０分加熱してプロテイナーゼＫを不活性化した。緩衝系を与えるために、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）を選択して、調べた全溶解緩衝液に含めた。検討した種々の直接溶解緩衝液の組成を表１に示す。最初にＲＮＡおよびＤＮＡコントロールを使用する標準的アッセイを使用して、５６℃、１時間のインキュベーション温度および時間で溶解緩衝液の評価を行った。１０ｍＭのトリスおよび種々の濃度のTriton Ｘ−１００を含む緩衝液は、標準的方法によって得られるシグナルと同様のシグナルを生じた。同様に、種々の濃度のTween２０を含む緩衝液も、標準的方法によって得られるシグナルと同様のシグナルを生じた。１０ｍＭのトリスおよび種々の濃度のＳＤＳを含む３種類の溶解緩衝液のうち、０．００１％のＳＤＳを含むものだけが、通常の方法と同じ結果になった。０．１％および０．０１％のＳＤＳを含む溶解緩衝液はシグナルを生じなかった。このことから、ＳＤＳがＴａｑポリメラーゼに対して阻害作用をすることが確認された。同様に、ＳＤＳおよび１μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶解緩衝液も、ＳＤＳ濃度が０．００１％以上に増加すると、感度が低下することが示された。０．００１％のＳＤＳを含む溶解緩衝液のみが、標準的方法に匹敵する結果を示した（図２）。種々の溶解緩衝液が免疫粒子の存在下でＨＩＶ−１ビリオンを破壊する効率およびＲＴ／ＰＣＲ反応における緩衝液の影響を、免疫捕獲コントロールを使用して測定した。分析は、酵素反応に対する可能な逆効果を最小にするために、洗剤濃度を最小にしたものに限定して行った。図３に示すように、３種類の洗剤のいずれかと１μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む直接溶解緩衝液は、コントロールと同じシグナルを生じた。直接溶解緩衝液からプロテイナーゼＫを除くと、シグナルはかなり減少した。３種類の洗剤のいずれかを使用すると、ＨＩＶ−１ビリオンが効率的に溶解され、いずれも酵素反応に対する影響はなかったと考えられる。一例として、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）、０．００１％のＳＤＳおよび１．０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶解緩衝液を使用してアッセイを行った。要約すると、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）、０．００１％のＳＤＳおよび１μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む緩衝液を使用して直接溶解を行うと、０．２５％のＳＤＳおよび５００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む標準的な消化緩衝液に匹敵する結果が得られた（図３と５Ｄ）。従来の消化緩衝液と違って、この組成物では、ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの全濃度が対数的に２倍減少（two log decrease）し、酵母ｔＲＮＡは除去された。直接溶解緩衝液のインキュベーション時間および温度：ウィルス膜の破壊およびゲノムＲＮＡの核タンパク質からの放出に要する最小の時間および温度を、直接溶解緩衝液を使用して測定した。標準的方法のパラメータである５６℃および１時間をコントロールとして使用した。二つの条件をテストした。すなわち、５６℃で３０分のインキュベーションおよび３７℃で３０分のインキュベーションである。直接溶解緩衝液の使用によるアッセイ感度に対する時間および温度の結合効果を図４に示す。３７℃で３０分間直接溶解緩衝液を使用して行ったＲＮＡ検出の感度は、標準的方法の場合と同じであった。バンドの強度におけるわずかな違いはよく見られることであり、酵素反応のアッセイ間での可変性を表す。すなわち、これらのパラメータを選択してその後の全てのアッセイに使用した。ウィルス捕獲時間：抗ＨＩＶ−１抗体で被覆した微粒子による血漿関連ビリオンの免疫捕獲に要する最小時間を測定した。室温で、３時間から２時間および１時間に短縮した場合の効果を評価した。１時間捕獲を行った後に得られた効果は、標準的方法によって得られる効果と同じであった（図５）。従って、続く全てのアッセイは、免疫捕獲を１時間にして行った。ＲＴ／ＰＣＲ緩衝液の単独添加：標準的な逆転写工程では、１５μｌのサンプルを５μｌのＲＴ緩衝液に添加した。熱変性の後、１μｌの逆転写酵素／ＲＮａｓｉｎを添加し、逆転写を４２℃で３０分行った。その後、３０μｌのｄｄＨ₂ Ｏおよび２滴の鉱物油を添加し、混合物を９５℃で５分加熱した。増幅のための全ての成分を含むＴａｑ混合物を添加し、増幅を開始した。各アッセイチューブに対するこれらの合わせて６回に及ぶ複数の添加は、操作全体を煩雑にし、隣のチューブからの持ち込みによる汚染の危険性を高めていた。最近、ゲノムＨＣＶＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲを、緩衝液および酵素の１回の添加により一本のチューブで行う方法が記載された（Lin，H.J.，Naiyi，S.， Mizokami，M.，and Hollinger，F.B．Polymerase Chain Reaction Assay for He patitis C Virus RNA Using A Single Tube For Reverse Transcription And Se rial Rounds Of Amplification With Nested Primer Pairs（逆転写およびネステッドプライマー対による連続ラウンドの増幅を１本のチューブを使用して行うＣ型肝炎ウィルスのＰＣＲアッセイ）．J．of Med．Virology 1992;38:220-225 ）。この種の方法がＨＩＶ−１ウィルスＲＮＡの逆転写および増幅に使用できるかどうかを調べるために、単独添加によるいくつかのＲＴ／ＰＣＲ法をテストした。ＨＩＶ−１単独添加ＲＴ／ＰＣＲ法の最終体積は１００μｌになるように選択した。これは、標準的方法で使用した体積である。アッセイで１５μｌのサンプルを使用したので、ＲＴおよびＰＣＲ操作に必要な全成分を含む８５μｌをさらに添加しなければならなかった。同一の一般的アッセイ様式を一段階ＲＴ／ＰＣＲ法で使用した。直接溶解の後、１５μｌのサンプルを０．５ｍｌの遠心チューブに入れ、５分間９５℃に加熱してプロテイナーゼＫの変性をその溶解緩衝液中で行い、遠心して、８５μｌの増幅混合物、次いで２滴の鉱物油を添加した。逆転写を４２℃で４５分間行い、次いで、逆転写酵素の変性を９５℃で３分間行った。増幅は、標準パラメータを使用して直接開始した。各サンプルのアッセイは二重に行い、ＲＴおよびＰＣＲ操作はともに熱サイクラーを使用して行った。標準的方法に匹敵する感度を達成するために、単独添加アッセイの成分濃度を最適化しなければならなかった。トリス、ＫＣｌ、ゼラチンおよびＤＴＴ濃度は、標準のＲＴおよびＰＣＲ法ともに同一であり、それらの濃度を単独添加法用に選択した。従って、それらは変更しなかった。逆転写および増幅操作の感度に影響を及ぼす最も決定的な二つのパラメータは、ＭｇＣｌ₂およびｄＮＴＰ濃度である（Yong，W.H.，Wyman，S.，and Levy，J,A．Optimal Condition For Synthe sizing Complementary DNA In The HIV-1 Endogenous Reverse Transcriptase r eaction（ＨＩＶ−１内因性逆転写酵素反応において相補的ＤＮＡを合成するための最適条件）．AIDS 1990;4:199-206）。標準的なＲＴおよびＰＣＲ工程の最適なＭｇＣｌ₂濃度は、各々、２．５ｍＭおよび１．５ｍＭであった。標準的なＲＴおよびＰＣＲ工程の最適なｄＮＴＰ濃度は、各々、２５μＭおよび５０μＭである。ＲＴおよびＰＣＲ工程はともに、試薬を単独添加して行うことになっていたので、これら二つの成分濃度は再び最適化しなければならなかった。最適の感度を調べるために使用したＭｇＣｌ₂濃度は、１．５、１．７５および２．０ｍＭであった。テストしたｄＮＴＰ濃度は、５０、１００および２００ μＭであった。５０μＭのｄＮＴＰ濃度でＭｇＣｌ₂濃度を変化させると、全てのシグナル強度はテストしたコントロールにおいてかなり減少した（図６）。さらに、ＭｇＣｌ₂濃度を上げると、シグナル強度は低下した。２．０ｍＭのＭｇＣｌ₂では、ＲＴおよび増幅コントロールは、弱いが検出可能なシグナルを生じた。これに対して、免疫捕獲コントロールの場合は、検出可能なシグナルを生じなかった。従って、５０μＭのｄＮＴＰ濃度は、一段階ＲＴ／ＰＣＲでの最適な検出には低すぎると考えられた。ｄＮＴＰ濃度を１００μＭに上げて、同じ濃度のＭｇＣｌ₂ で評価を行った。図７に示すように、ＭｇＣｌ₂濃度を上げると、ＲＴおよび増幅コントロールのシグナルはわずかに減少した。しかし、先の実験と同様に増幅コントロールシグナルがかなり減少したようには見えなかった。ＭｇＣｌ₂濃度を上げ、ｄＮＴＰ濃度を１００μＭにしたときに生じたＲＴおよび増幅コントロールシグナルの減少は、ｄＮＴＰ濃度がいくらか律速的である可能性があることを示す。ＭｇＣｌ₂を最低の最適濃度にし（１．７５ｍＭ）、ｄＮＴＰ濃度を上げて（２００μＭ）実験を行い、これらの濃度が標準方法に匹敵するシグナルを生じることを確かめた。図８に示すように、一段階ＲＴ／ＰＣＲ法（１．７５ｍＭのＭｇＣｌ₂および２００μＭのｄＮＴＰを含む）は、標準法と同様のコントロールシグナルを生じた。ｄＮＴＰ濃度が律速的でないことを確かめるために、その最終濃度を２００ μＭとし、ＭｇＣｌ₂濃度を１．７５ｍＭにセットした。１００μｌの最終体積における一段階ＲＴ／ＰＣＲ法を最適化した後は、試薬の使用を節約するために、最終体積を５０μｌに減少させることを目的とした。５０μｌ法は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方のコントロールをテストしたとき、優れた結果が得られた（図９）。しかし、血漿コントロールのテストでは、シグナルは得られなかった。３組の血漿コントロールを実際に評価した。６個のＭＫ^-4反応のうち、３個が極めて弱いシグナルてあり、残りの３個は陰性であった。ＭＫ^-5コントロールは、いずれもシグナルを生じなかった。従って、１００μｌの最終体積を一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対して選択した。要約すると、一段階ＲＴ／ＰＣＲ法に対する最終の増幅混合物は、１００μｌの最終体積中に１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、０．００１％のゼラチン、１．７５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２００ｎｇのプライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ＵのＲＮａｓｉｎ、２．５ＵのＡＭＶＲＴおよび１ＵのＴａｑポリメラーゼを含んでいた。この増幅混合物により、標準法に匹敵する結果が得られた。感度に対する影響はなく、混合物は実際には、標準法よりもわずかに強いコントロールシグナルを生じたように思われる。最終のアッセイ法は、次のように確立された。ａ）室温で１時間ウィルス捕獲；ｂ）５０００ｒｐｍで１０分の遠心、上清を捨てる、１５０μｌのＰＢＳで洗浄、前記と同様の遠心、および上清を捨てる；ｃ）３０μｌの直接溶解緩衝液の添加、簡単な攪拌、および３７℃で３０分間のインキュベーション；ｄ）２個の１５μｌのアリコートを別々の０．５ｍｌの遠心チューブに入れる、および９５℃で５分間加熱；ｅ）８５μｌの増幅緩衝液の添加、２滴の油、４２℃で４５分間の逆転写、熱変性、および増幅セロポジティブな妊婦における血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡの検出感染した母親からその子供へのＨＩＶ−１の垂直感染に影響を及ぼす因子は分かっていないが、予備的証拠はウィルス負荷が重要な役割を果たしている可能性があることを示唆している。母親のＨＩＶ−１血漿ウィルス負荷が高いことと垂直感染の可能性の増加とに相関関係があるかどうかを調べるために、下記実験を試みた。米国およびウガンダ（アフリカ）で開始された研究から選択した４９人のセロポジティブな妊婦の分娩時に、コード化された血漿サンプルを得た。血漿サンプルは、自分の子供へのＨＩＶ−１感染があったか否かが分かっている母親から選択した。全体的には、子供へのＨＩＶ−１感染があった母親が２１人で、感染がなかった母親が２８人であった。米国の集団は、感染組が４人で非感染組が１６人であった。ウガンダの集団は、ＨＩＶ−１の感染組が１７人で非感染組が１２人であった。さらに、米国およびウガンダの母親に対して利用できる血清学的データは、ＣＤ４の数およびβ₂ミクログロブリンのレベルであった。分娩時に、全ての母親は、臨床上、無症候であった。母親の血漿におけるＨＩＶ−１ＲＮＡの検出とＨＩＶの垂直感染との間にはあまり関連がなかった。全体的に、テストした２２個の感染組の母親サンプル中、４個がＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性であることがわかり、一方、２７個の非感染組の母親サンプル中、１１個がＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性であった（表２）。米国のグループ（表３Ａ）では、ＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性だった感染組と非感染組の母親の割合は同じであった（各々、４０および３８％）。予想されたように、ＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性は、ＣＤ４＋の数が低いことと相関性があった。検出可能なＨＩＶ−１ＲＮＡを有する女性のＣＤ４＋の中央値は２５７／ｍｍ³ （四部位数間領域：１６１〜４１８／ｍｍ³）であり、検出可能なＨＩＶ−１ＲＮＡがない女性のＣＤ４＋の中央値は９６６／ｍｍ³（四部位数間領域：５９１〜１１１３／ｍｍ³）であった。しかし、４人の女性は、ＣＤ４＋が５００／ｍｍ³より少なく、検出可能なＨＩＶ−１ＲＮＡを有していたが、自分の子供へのウィルスの感染はなかった。さらに、一人の女性はＣＤ４＋数が１１１３／ｍｍ³であり、検出可能な血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡを有していなかったが、連続した２回の妊娠の間にウィルスの感染があった。ウガンダの母親（表３Ｂ）の場合、感染組の１２％の母親は、検出可能なＨＩＶ−１ＲＮＡを有していた（非感染組は４２％）。β₂ミクログロブリンのレベルは、二つのグループ間であまり違いがなかった（感染組および非感染組で各々、１．６６および１．６０μｇ／μｌであった。）。セロポジティブな血液ドナーのＨＩＶ−１ＲＮＡの検出血液ドナーの血漿におけるＨＩＶ−１ウィルス負荷は、ＨＩＶ−１の輸血に関連した感染において重要な役割を果たすと考えられる。これを調べるために、Tr ansfusion Salety Study Repository（San Francisco，CA）から得た血漿サンプルのＨＩＶ−１ウィルス負荷を測定した。７８個の感染サンプルおよび１２個の非感染サンプルのプールから２２個のサンプルを選択した。選択した２２個のセロポジティブなサンプルのうち、１１個は輸血に関連した感染があり、１１個は非感染であった（表４）。ＣＤ４＋リンパ球の数は、最初のサンプルでは測定できなかったが、採取の約１年後の平均ＣＤ４＋リンパ球数は、感染組および非感染組のドナーに対して各々、４７０および７４６／μｌであった。全体的に、２２個の血漿サンプルのうち７個がＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性であることがわかった。１１個の感染性献血のうち、７個はＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性であったが、１１個の非感染性献血はいずれもＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性ではなかった。従って、感染性とドナーサンプル中のＨＩＶ−１ＲＮＡの有無の間には強い相関性があった。考察ＨＩＶ−１感染の検出は、ウィルス拡散の制御の大きな要因である。現在、ＨＩＶ−１感染を確認するために、抗体ＥＩＡおよびウェスタンブロット試験が使用されている。最近、ＨＩＶ感染の進行およびＨＩＶ感染者の治療に対する反応のモニターに関心が集まっている。ＨＩＶ−１疾患の進行をモニターするために、主にｐ２４抗原の検出、培養および核酸の増幅に基づく多くの方法が開発されている。定量的な細胞および血漿の培養により、末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）および血漿からＨＩＶ−１感染タイターを測定することができる。感染したＰＢＭＣの数は、個々の臨床段階に応じて変化し、無症候の１：５０，０００〜エイズ患者の１：４００（感染：正常）の範囲であることが研究により分かっている（Ho，C.D.，Moudhil，T.，and Alam，M．Quantitation Of Human Immunode ficiency Virus Type １ In The Blood of Infected Persons（感染者の血液中のＨＩＶ−１の定量）．N．Engl，J，Med．1989;321:1621-1625）。同様に、血漿中の細胞非含有ウィルスの検出も、感染の臨床段階を表すことが分かっている（Coombs，R.W.，Collier，A.C.，Allain，J.P.，Nikora，B.，Leuther，M.，Gj erset，G．F.，and Corey，L．Plasma Viremla In Human Immunodeficiency Vir us Infection（ＨＩＶ感染における血漿ウィルス血症）．N．Engl．J．Med．198 9;321:1626-1631）。しかし、どちらの方法も、特別な設備を必要とし、かなり高価で、時間もかかる。さらに、細胞培養は単離細胞のｉｎｖｉｔｒｏ活性化が必要であるが、これは、実際のｉｎｖｉｖｏの状況を表さない可能性がある。また、血漿培養の感度は、既知感染の大半を検出するのに充分ではなく、その再現性は、アッセイで使用する刺激したドナー細胞に依存する（Eschaich，S.， Rilter，J,，Rougler，P.，Lepot，D.，Lamelin，J.P.，Sepetjan，M.，and Tre po，C．Plasma Viremia As A Marker Of Viral Replication In HIV Infected I ndividuals（ＨＩＶ感染者におけるウィルス複製のマーカーとしての血漿ウィルス血症）．AIDS 1991;5:1189-1194）。感染したＰＢＭＣに存在するＨＩＶ−１ＤＮＡまたはウィルス関連ＨＩＶ− １ＲＮＡの検出にはＰＣＲが使用されている。ＰＢＭＣから単離されたプロウィルスＨＩＶ−１ＤＮＡの定量的検出は非常に感度が高い。しかし、測定したＨＩＶ−１ＤＮＡの全てが転写的に活性なＤＮＡに対応するかどうかは分かっていない。血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡウィルス負荷の増加が病気の進行の良好な予報値であることが研究により分かっている。すなわち、ウィルス関連ＨＩＶ−１ＲＮＡのＰＣＲによる測定は極めて感度が高く、有用であるはずである。しかし、血漿からのウィルスの単離は、遠心またはイソチオシアン酸グアニジン抽出のいずれかを必要とする（Aoki-Sei，S.，Yarchoan，R.，Kageyama，S.，Hoekze ma，D.T.，Pluda，J.M.，Wyvill，K.M.，Broder，S.，and Milsuya，H．Plasma HIV-１ Viremia In HIV-１ Infected Individuals Assessed By Polymerase Cha in Reaction（ＰＣＲにより評価されたＨＩＶ−１感染者の血漿ＨＩＶ−１ウィルス血症）．AIDS Res．and Human Retro．1992;8:1263-1270；Scadden，D.T.， Wang，Z.，and Groopman，J.E．Quantitation Of Plasma Human Immunodeficiency Virus Type １ RNA By Competitve Polymerase Chain Reaction（競合ＰＣＲによる血漿ＨＩＶ−１ＲＮＡの定量）．J，Inlect．Diseases 1992;165:1119-1123;Holodniy，M .，katzenstein，D．A.，Sengupta S.，Wang，A．M.，Casipit，C.，Schwartz， D．H.，Konrad，M.，Groves，E.，and Merigan，T.C．Detection And Quantific ation Of Human Immunodellciency Virus RNA In Patient Serum By Use Of The Polymerase Chain Reaction（ＰＣＲの使用による患者の血清のＨＩＶＲＮＡの検出および定量）．J．Infect．Diseases 1992;163:862 866）。培養技術と同様に、これらの方法は、作業が大変で、完了までにかなりの時間と専門的技術が必要である。本発明は、ＨＩＶ−１複製（ウィルス血症）の直接測定に対する血漿関連ＨＩＶ−１ビリオンの免疫捕獲を使用するアッセイに有用である。この種のアッセイは、培養技術や煩雑な化学抽出操作を必要とすることなく、血漿関連ＨＩＶ−１ウィルスを測定するための、高感度で特異的な方法である。直接溶解緩衝液は、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの簡素化された逆転写および増幅法に関して直接使用されるように作った。これらの変更により、ＨＩＶ−１ウィルス負荷をモニターするのに必要な時間がかなり短縮された。単位体積当たりに得られる全体的な表面積の増加のために、０．１〜０．３μ の粒子サイズを選択した。理論的には、これにより、粒子に結合する抗体の量が最大になり、その結果、免疫捕獲の感度が増加するはずである。感度を最大にするために、ポリクローナル抗体よりも高い親和性を有するモノクローナル抗体を使用してＨＩＶ−１ビリオンの捕獲を行った。ｇｐ１２０およびｇｐ４１タンパク質はともにウィルスの外膜の成分であり、全ての感染性ＨＩＶ−１ウィルス粒子に存在する。すなわち、抗ｇｐ１２０および抗ｇｐ４１特異的モノクローナル抗体を免疫捕獲用に選択した。抗体を粒子に結合させる方法は、アッセイの感度および特異性の両方に影響を及ぼすと考えられる。抗体を固体マトリックスに結合させるために使用される二つの決まりきった方法がある。第一の方法は、おそらく最も簡単な方法であるが、受動的な吸着であり、第二の方法は、共有結合である。抗体の特異的結合は、粒子の化学組成に依存する。受動的な吸着は、粒子と抗体の間のイオン的・疎水的相互作用によって達成される。共有結合は、粒子および抗体の間に共有結合が生じることに基づいている。モノクローナル抗体の共有結合にはカルボキシル化粒子を使用した。ＥＤＣの助けによって、粒子のカルボキシル基と抗体のアミノ基との間に共有結合が生じる。両方の方法とも、感度がかなり高いことが分かっている。粒子に結合した抗体の全てが共有結合的であるとは限らないが、この方法は安定性に優れており、このため、抗体の共有的結合法を使用した。アッセイ法をかなり簡素化するために、一連の最適化工程の探索を行った。これらの最適化には、直接溶解緩衝液の開発、免疫捕獲時間の短縮、直接溶解に要する時間および温度の減少（低下）ならびに試薬の単独添加による逆転写および増幅の実施が含まれた。ゲノムＲＮＡを単離するための当初の方法は、通常の分子生物学的技術を使用したので、煩雑であり、時間がかかった。免疫捕獲の後、比較的高濃度のＳＤＳを使用してウィルス膜を破壊した。ウィルスＲＮＡと会合したタンパク質の消化のために、プロテイナーゼＫを使用した。ＨＩＶ−１ＲＮＡの精製は、有機溶媒抽出、続く一夜のエタノール沈澱を組み合わせて行った。直接溶解緩衝液は、無傷のビリオンからゲノムＨＩＶ−１ＲＮＡを抽出し、それによって逆転写および増幅操作にゲノムＨＩＶ−１ＲＮＡが直接使用できるように調製した。これによって、通常の操作では必要な有機溶媒抽出およびエタノール沈澱の両方の操作が取り除かれた。有機溶媒抽出操作を使用しないことにより、アッセイ時間が少なくとも合わせて１６時間短縮された。直接溶解に必要な試薬の量を決定するために、等量の細胞およびウィルス物質を破壊するのに必要な適切な洗剤および／またはプロテイナーゼＫの濃度を測定した。典型的には、１０⁶個のヒトの細胞の破壊に、０．２５％のＳＤＳおよび０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶液１ｍｌが必要である（１９）。免疫粒子の理論的な結合容量は約１０，０００ビリオンであることが先の研究で測定された（Henrard，D,R.，Mehaffey，W.F.，and Allain，J.P．A Sensitive Viral Capture Assay For The Detection Of Plasma Viremaia In HIV Infected Individuals（ＨＩＶ感染者における血漿ウィルス血症の検出のための感度の高いウィルス捕獲アッセイ）．AIDS Res．Human Retro．1992;8:45-51）。すなわち、１０⁶個の細胞を溶解するのに必要なＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの濃度は、１０，０００個のビリオンを溶解するのに必要な濃度よりも少なくとも１００倍大きいはずである。さらに、細胞の体積は、ウィルスの約１０００倍大きい（すなわち、細胞およびウィルスのの平均直径は、各々３μおよび０．１μである。）。従って、等量のウィルス物質の溶解には、洗剤およびプロテイナーゼＫの量を合わせて１０⁵倍少なくした量で充分であるはずである。しかし、免疫捕獲されたビリオンに添加される直接溶解緩衝液の体積は３０μｌで、これは、細胞の溶解に必要な量と比較すると、洗剤およびプロテイナーゼＫの合計量を３３倍少なくした量に相当する。このことは、１０，０００個のビリオンを破壊するのに必要な洗剤および／またはプロテイナーゼＫの濃度の３０００倍の減少を示唆し（１０⁵÷３３）、これは、各々、約０．０００１％および０．１６７μｇ／ｍｌのＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの濃度に相当する。これらの濃度は、有機抽出法に匹敵する結果を与えた実際のテスト濃度より１０倍小さい。すなわち、ＨＩＶ−１ビリオンの破壊に使用したＳＤＳおよびプロテイナーゼＫの濃度は、これらの計算に基づいて必要とされる濃度より少なくとも１０倍大きかった。逆転写も増幅も、溶解緩衝液がTriton Ｘ−１００、Tween２０または低濃度のＳＤＳを含む場合は、阻害されなかった。０．５％のTriton Ｘ−１００または０．４５％のTween２０を含む溶解緩衝液では、阻害効果は見られなかった。興味深いことに、ＳＤＳは、０．００７％より大きい濃度の場合に逆転写反応を阻害すると考えられた。検討した直接溶解緩衝液の洗剤濃度が０．０１％である場合、逆転写反応中のその最終濃度は０．００７％であった。この濃度は、ＰＣＲ反応中にさらに０．００１４７％に減少した。上記で述べたように、ＳＤＳは、０．００１％以下の濃度ではＰＣＲを阻害しなかった。０．００１４７％のＳＤＳが反応を阻害するかどうかは測定しなかったが、この増加がＰＣＲ反応に驚くべき影響を及ぼすようには考えられない。その代わり、陽性結果の不足は、逆転写が阻害されたことを示唆する。これは、低濃度のＳＤＳが逆転写酵素に対して阻害効果を有するという報告がなかったので、予想していなかった。この濃度のＳＤＳがどういうわけかＲＴと錯体を形成し、それによってｃＤＮＡの完全または充分な産生を阻害することが考えられる。あるいは、ＳＤＳが、たぶん逆転写酵素の活性部位の構造に間接的に影響を及ぼすことにより、逆転写酵素自体を阻害する可能性がある。ＲＴ反応のいずれかの部分の阻害は、ｃＤＮＡ鋳型なしにはＰＣＲ産物が得られないので、ＨＩＶ−１ｃＤＮＡの最終増幅に大きな影響を及ぼすであろう。プロテイナーゼＫの直接溶解緩衝液への添加は、酵素反応のいずれかに逆効果を及ぼすことはなかった。事実、テストした各洗剤を含む緩衝液に１μｇ／ｍｌを添加しても、有機抽出法と同様の結果が得られた。直接溶解に必要な免疫捕獲時間および温度を下げても、アッセイの感度に対する逆効果はなかった。捕獲時間が３時間から１時間に短縮することができたので、使用するモノクローナル抗体は、ビリオンと会合したｇｐ１２０およびｇｐ４１に対して極めて高い親和性を有するのが好ましい。ＨＩＶビリオンの破壊およびＨＩＶ−１ＲＮＡの単離には、低温で短時間のインキュベーションで充分であった。これは、溶解が非常に速く、無傷のビリオンからＨＩＶＲＮＡを完全に解離するには、選択した洗剤およびプロテイナーゼＫの濃度で充分であることを示す。逆転写および増幅操作を一緒にして一つのアッセイにしても、アッセイの感度に対する逆効果はなかった。他の標的（すなわち、ＨＣＶ）の場合と同じように、試薬の単独添加によるＲＴおよびＰＣＲ反応の実施は、アッセイにおける成分濃度のいくつかを最適化することにより達成された。しかし、驚くべきことに、５０μｌの一段階ＲＴ／ＰＣＲ法は、サンプルをアッセイする際には作用しなかった。ＲＮＡおよびＤＮＡコントロールの測定の場合は、５０μ ｌの方法で、同等の測定シグナルが得られた。最終のＳＤＳおよびグリセロール濃度を除く全ての成分濃度は、両方の方法において同じままであった。ＳＤＳ濃度は、最終のアッセイ体積が５０μｌの場合は２倍にした（０．０００１５％から０．０００３％にした）。しかし、この濃度でＴａｑポリメラーゼ酵素が阻害を受けるという報告はされていない。さらに、ストック酵素の添加の結果生じるグリセロールの濃度は、５０μｌの方法の場合、１００μｌの方法の場合の２倍以上に増加した（２．２％対０．９７％）。製造者によれば、グリセロール濃度がこの範囲である場合、酵素に対する阻害の影響はあまりない。しかし、アッセイ体積が減少すると、免疫捕獲に関連する粒子の高濃度化が生じた。酵素反応は、どうも粒子によって妨害または阻害を受けたと考えられる。免疫捕獲法の最適化により得られる最も重要な二つの利点は、恐らく、関与する全工程数の減少およびアッセイの完了までに要する時間の短縮であった。アッセイ法におけるこれらの変化は、サンプルの持ち込みによる汚染の危険性をかなり少なくすると考えられる。表５に、通常の方法と本発明の操作の違いを詳しく記載する。直接溶解緩衝液の使用、有機溶媒抽出操作の削除および一段階ＲＴ／ＰＣＲ法の全てにより、各アッセイチューブを開けなければならない回数がかなり減少した。例えば、免疫捕獲工程後に各チューブを開けなければならなかった実際の回数は、標準法での１０回から改良法での３回になった。さらに、アッセイチューブから試薬を除去または試薬を添加する回数は、標準法での１５回から改良法での４回になった。標準アッセイ法および改良法（一段階ＲＴ／ＰＣＲ）の完了に必要な実際の実験時間の主な違いは、一夜行うＲＮＡ沈澱工程にある。この工程を改良法から除去すると、少なくとも１５時間の短縮になった。全体的に、改良法は、免疫捕獲時間を２時間、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの溶解および単離時間を１５時間、逆転写およびＰＣＲ混合物を作る時間をさらに１時間短縮した。標準法を使用すると、サンプルの結果を得るのに少なくとも２日間を要したが、改良法を使用すると同じ結果を得るのにほんの９時間であった。偽陽性反応の発生の抑制は、汚染コントロール操作に対する完全な固執が助けとなった。これは、３個の別々の実験室を使用してサンプルの調製、ＰＣＲおよび検出を行うことにより達成した。各実験室には、別々の装置セットがあった。増幅産物による汚染を少なくし、可能な限り除去するために、バリアピペットチップおよびＵＶ安定化の通常の使用も行った。汚染をコントロールするためにかなりの測定を行ったが、偽陽性反応は、約５００回のテストで１回の割合で生じた。これは、ＰＣＲアッセイの高い特異性を維持するめためには、汚染コントロール操作への固執が重要であることを示す。次いで、簡略化した免疫捕獲−ｃＤＮＡ／ＰＣＲを使用して、ＨＩＶ−１血漿ウィルス負荷と垂直または水平ＨＩＶ−１感染との間に関連があるかどうかを測定した。ＨＩＶ−１垂直感染の実験に含まれる女性は比較的健康で、病気の症状を示さなかった。彼女らの平均ＣＤ４＋値は高く（１７８〜１１１３ｍｍ³）、 β₂ミクログロブリンレベルは正常値内（平均１．６４μｇ／ｍｌ）であり、これは、その実験に含まれる女性が比較的健康であることを示唆した。ＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性（血漿ウィルス血症）は、ＣＤ４＋値が低いことと相関性があった。このことは、ＣＤ４＋値と血漿ウィルス血症の増加との間の相関性があることを示した初期の研究と一致した（Saag，M.S.，Crain，M．J.，Decker，W．D.，Camplell-Hi ll，S.，Robinson，S.，Brown，W．E.，Leuther，M.，Whitley，R．J.，Hahn，B ．H.，and Shaw．G.M．High-Level Viremia In Adulls And Children Infected With Human Immunodeficiency Virus：Relation To Disease Stage And CD4+ Ly mphocytes Levels（ＨＩＶに感染した大人と子供における高レベルなウィルス血症：病気の進行段階およびＣＤ４＋リンパ球レベルとの関係）．J．Infect．Dis ．1991;164:72-80）。反対に、血漿ＨＩＶ−１ウィルス負荷のレベルと垂直感染との間には相関性が見られなかった。他の報告では、垂直感染のある母親には血漿ウィルス血症がないことが示された（Ariyoshi，K.，Weber，J.，and Walters ，S．Contribution Of Maternal Viral Load TO HIV-１ Transmission（母親のウィルス負荷のＨＩＶ−１感染に対する寄与）．Lancet 1992;340;Puel，J,，Iz opet，J.，Lheritier，D.，Briant，I.，Guyader，M.，Tricoire，J．and Berre bi，A．Viral Load And Mother To Infant HIV Transmis sion（ウィルス負荷と母親から乳児へのＨＩＶ感染）．Lancet 1992;340:859-86 0）。母親における複製の速い有毒のＨＩＶ変異体の発生（Grunter，R.A.，Terp stra，F.G.，De Goede，R,，Mulder，J．W.，De Wolf，F.，Schellekens，P.，V an Lier，R.，Termette，M.，and Miedema，F．Immunological And Virologic M arkers In Individuals Progressing From Seroconversion To AIDS（セロコンバージョンからエイズに進行した患者の免疫学的およびウィルス学的マーカー）．AIDS 1991;5:837-844）、母親の変異体の選択的感染（Wolinsky，S．M,，Wike ，C，A.，Korber，B.，Hutto，C.，Pparks，W．P.，Rosenblum L．L.，Kunstman ，K．J.，Furtado，M．R.，and Munoz，J.L．Selective Transmission Of Human Immunodeficiency Virus Type-１ Variants From Mothers To Infants（ＨＩＶ −１変異体の母親から乳児への選択的感染）．Science 1992;255:1134-1137）、および他の微生物との共感染（Holme，W．Vertical Transmission Of HIV（ＨＩＶの垂直感染）．Lancet 1991;337:793-794）は、ＨＩＶ−１の母親からその子供への感染における重要な可変因子であると考えられる。本発明者らの結果はまた、ウィルス負荷以外の因子がＨＩＶ−１の垂直感染に寄与している可能性があることを示唆するものである。胎盤への外傷の結果、発達している胎児に細胞およびウィルスの両方が入り込む可能性がある。子供が産道を通る際の感染の可能性も、分娩中に存在する母親の血液量に依存して、もっともと思われる。ウィルスは、食物接種、涙液腺、または分娩中に生じた可能性がある小さな傷を通して子供に入り込むことができたかもしれない。そのような場合は、分娩中に失われた母親の血液量が実際のウィルス負荷よりも重要であると考えられる。ウィルス負荷は低いが、血液の損失は大きい女性の場合は、ウィルス負荷は高いが、分娩中の血液の損失は最小である女性よりも、ＨＩＶ感染の可能性が大きいかもしれない。このことは、本発明者らの実験において、末梢血に検出可能なＨＩＶＲＮＡが認められず、ＣＤ４＋は非常に高い無症候の母親がなぜその子供にＨＩＶ−１を感染することができたかの説明になると考えられる。ＨＩＶ−１の垂直感染とは違って、ＨＩＶ−１の血液ドナーから受血者への水平感染は、血漿ウィルス血症とかなり相関性があった。この実験では、２２人全ての受血者に、ＨＩＶ−１セロポジティブな血液が移された。受血者にＨＩＶ− １感染を招いたドナーサンプルのかなりの割合（６４％）において検出可能なＨＩＶ−１ウィルス血症が認められ、一方、受血者を感染させなかったドナーには検出可能なＨＩＶ−１ウィルス血症が認められなかった。これらの結果は、ＨＩＶ感染が、主に輸血前後における血漿ウィルス血症のレベルに依存することを示唆する。ＨＩＶ−１感染者の数が増加するにつれて、感染の経過中の症状のモニターがより重要になりつつある。病気の進行を迅速かつ効率的に確認することができるアッセイが開発されれば、感染および種々の治療の効果のモニターに役立つであろう。かなり高感度の免疫捕獲ｃＤＮＡ／ＰＣＲアッセイは、これらの目的に特に有用であると考えられる。本明細書に記載するアッセイは、血漿ＨＩＶ−１ウィルス負荷において対数的相違を生じさせることができ、現在は、血漿ＨＩＶ− １ウィルス血症のレベルを検出・定量するより精確な方法の開発に尽力している。これらには、ＰＣＲ以外の増幅系に基づく定量的検出系の開発が含まれる。ＰＣＲの他に、標的ＤＮＡの増幅に現在使用されている二つの方法が文献に記載されている。一つは、自立持続的配列複製（３ＳＲ）と言い、他方は、リガーゼ速鎖反応（ＬＣＲ）である（Bush，C.E.， Donovan，R.M.，Peterson，W.R.，Jennings，M.B.，Bolton，V.，Sherman，D.G, ，Vanden Brink，K.M.，Beninsig，L.A.，and Godsey，J.H．Detection Of Huma n Immunodeficiency Virus Type １ RNA In Plasma Samples From High Risk Pe diatric Patients By Using The Self Sustained Sequence Replication Reatio n（自立持続的配列複製（３ＳＲ）反応の使用による危険性の高い小児患者の血漿サンプルにおけるＨＩＶ−１ＲＮＡの検出）．J．Clin．Micro．1992;30:281- 286；Wu，D.Y．and Wallance，R.B．The Ligation Amplification Reaction（LA R）-AmPlification Of Specific DNA Sequences Using Sequential Rounds Of T emplate-Dependent Ligation（連結増幅反応（ＬＡＲ）−連続するラウンドの鋳型特異性連結による特定のＤＮＡ配列の増幅）．Genomics 1989;4:560-569;Barr inger，K.J.，Orgel，L.，Wahl，G.，and Gingeras，T.R，Blunt-end And Singl e Strand Ligations By Escherichia coli Ligase：Influence On An In Vitro Amplification Scheme（大腸菌リガーゼによる平滑末端と一本鎖の連結：ｉｎｖｉｔｒｏ増幅法に対する影響）．Gene 1990;89:117- 122）。ＬＣＲは、熱安定ＤＮＡリガーゼを使用して、標的ＤＮＡと相補的であるオリゴプライマーの隣接する３’ヒドロキシおよび５’ホスホリル末端を共有結合するものであり、Ｔａｑポリメラーゼは必要としない。ＬＣＲは、ＰＣＲのように、一連のアニーリングおよび変性工程により標的ＤＮＡを増幅させる。各ラウンドで得られたオリゴヌクレオチド産物は、続く各ラウンドの基質として作用する。こうして、ＤＮＡの標的分子の数を１０⁵倍以上増加させることができる。ＬＣＲの産物を検出するために、プライマーは、発蛍光剤を含むように改良する。次いで、２４個のサンプルが４５分で処理できる自動蛍光アッセイ系を使用する。下記の文献は明細書中に引用されたものである：

Claims

【特許請求の範囲】１．洗剤およびプロテイナーゼＫを逆転写および核酸増幅法で使用する酵素反応に適合する濃度で含み、該洗剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton Ｘ−１００およびTween２０から成る群から選択されることを特徴とする溶解試薬。２．該洗剤が、０．００１％以下の濃度のドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載の試薬。３．該洗剤が、０．１〜０．５％の範囲の濃度のTriton Ｘ−１００およびTwe en２０から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の試薬。４．核酸の単離における直接溶解緩衝液として使用するための、緩衝液、０．００１％のドデシル硫酸ナトリウムおよび１μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む組成物。５．該緩衝液が１０ｍＭトリス（ｐＨ７．０）であることを特徴とする請求項４に記載の組成物。