DE102018103215B3 - Verfahren und Vorrichtung zur Extraktion einer Nukleinsäure aus einer Probenflüssigkeit - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren einer Nukleinsäure (22) aus einer Probenflüssigkeit (26). Das Verfahren umfasst ein Bereitstellen eines Heizelements (10), sowie ein Bereitstellen einer Extraktionsnukleinsäure (14), welche an das Heizelement (10) gebunden ist und/oder Bereitstellen der Extraktionsnukleinsäure (14) derart, dass die Extraktionsnukleinsäure (14) an das Heizelement (10) bindet, wobei die Extraktionsnukleinsäure (14) zumindest teilweise komplementär zu der aus der Probenflüssigkeit (26) zu extrahierenden Nukleinsäure (22) ist. Ferner umfasst das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen des Heizelements (10) mit der Probenflüssigkeit (26) derart, dass die aus der Probenflüssigkeit (26) zu extrahierende Nukleinsäure (22) zumindest teilweise an die Extraktionsnukleinsäure (14) bindet, sowie ein Separieren des Heizelements (10) von der Probenflüssigkeit (26) derart, dass die an die Extraktionsnukleinsäure (14) gebundene Nukleinsäure (22) am Heizelement (10) verbleibt. Zudem umfasst das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen des Heizelements (10) mit einer Reaktionslösung, sowie ein Beheizen des Heizelements (10) auf eine Temperatur, welche gleich oder größer einer Denaturierungstemperatur der an die Extraktionsnukleinsäure (14) gebundenen Nukleinsäure (22) ist. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung (24) zum Extrahieren einer Nukleinsäure (22) aus der Probenflüssigkeit (26).

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Extrahieren und optional zum Amplifizieren einer Nukleinsäure aus einer Probenflüssigkeit. Die Erfindung liegt somit insbesondere auf dem Gebiet der Extraktion und/oder Aufreinigung und/oder Amplifikation von Nukleinsäuren, letzteres beispielsweise mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
• Stand der Technik
• Die US2002/0127569A1 offenbart ein Verfahren zum Binden von Target-Polynukleotiden in einer Probe mittels eines festen Trägers, an welchem Probe-Moleküle angebracht sind. Über Capture-Probe-Moleküle können sodann die Target-Polynukleotide mit den Probe-Molekülen an den festen Träger gebunden werden. Der feste Träger besteht dabei vorzugsweise aus magnetischen Partikeln, welche mittels Magnetkräften aus der Lösung entfernt werden können.
• Die US6090592A offenbart Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung einer Hybridisierung und Vervielfältigung einer Nukleinsäure auf einem Träger. Die Hybridisierungsbedingungen werden dabei vorzugsweise durch eine Arbeitsstation bereitgestellt, bei welcher vorzugsweise über eine Öffnung Reagenzien oder Heizelemente eingeführt werden können.
• Die WO91/14788 offenbart Verfahren und Reagenzien zur Amplifizierung von Polynukleotiden. Dabei wird die Target-Sequenz aufgereinigt und ein PCR Produkt detektiert. Die Target-Nukleinsäure wird über andere Moleküle an einen festen Träger gebunden. Zur Amplifizierung wird die Lösung für mehrere Minuten auf eine Temperatur zwischen 90° C und 100° C geheizt.
• Die WO93/09250 offenbart ein Assay und ein Verfahren zur Amplifikation und Detektion von Target-Nukleinsäuren in Patientenproben. Dabei wird ein Amplifikationsverfahren in Kombination mit Primern, welche entweder an einem Behälter oder an einem Messstäbchen immobilisiert sind, verwendet.
• Ferner offenbart die EP1466018B1 ein Verfahren zur Aufreinigung und Amplifikation einer Target-Nukleinsäure, bei welchem die Target-Nukleinsäure an magnetische Glaspartikel gebunden wird.
• Die EP0415978A1 offenbart ein Verfahren zur Untersuchung von Genen, bei welchem Primer an superparamagnetische Partikel gebunden werden. Die Temperatur des Mediums wird dabei mittels eines Metallblocks verändert.
• Die WO9010716A1 offenbart ein Verfahren zur Isolation und Bestimmung einer Target-Nukleinsäure in einer Probe, bei welchem die Probe mit einem festen Träger verbunden wird, an welches ein Substrat hybridisiert ist. Das Beheizen erfolgt durch die Zugabe von beheizter Pufferlösung.
• Den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren haftet der Nachteil an, dass das Extrahieren einer zu vervielfältigenden Nukleinsäure zumeist sehr aufwendig ist und einen erheblichen Zeitaufwand erfordert, bevor die extrahierte Nukleinsäure amplifiziert werden kann.
• Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen, mittels welcher ein Extrahieren und optional ein Amplifizieren einer Nukleinsäure mit geringem Zeitaufwand und/oder Arbeitsaufwand erzielt werden kann.
• Offenbarung der Erfindung
• Die Aufgabe wird durch ein Verfahren und eine Vorrichtung mit den Merkmalen der jeweiligen unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
• In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren einer Nukleinsäure aus einer Probenflüssigkeit. Das Verfahren umfasst ein Bereitstellen eines Heizelements, sowie ein Bereitstellen einer Extraktionsnukleinsäure, welche an das Heizelement gebunden ist und/oder ein Bereitstellen der Extraktionsnukleinsäure derart, dass die Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement bindet, wobei die Extraktionsnukleinsäure zumindest teilweise komplementär zu der aus der Probenflüssigkeit zu extrahierenden Nukleinsäure ist. Ferner umfasst das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen des Heizelements mit der Probenflüssigkeit derart, dass die aus der Probenflüssigkeit zu extrahierende Nukleinsäure zumindest teilweise an die Extraktionsnukleinsäure bindet und ein Separieren des Heizelements von der Probenflüssigkeit derart, dass die an die Extraktionsnukleinsäure gebundene Nukleinsäure am Heizelement verbleibt. Zudem umfasst das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen des Heizelements mit einer Reaktionslösung und ein Beheizen des Heizelements auf eine Temperatur, welche gleich oder größer einer Denaturierungstemperatur der an die Extraktionsnukleinsäure gebundenen Nukleinsäure ist.
• In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Extrahieren einer Nukleinsäure aus einer Probenflüssigkeit. Die Vorrichtung weist ein Heizelement auf, welches mit einer Extraktionsnukleinsäure verbunden ist und/oder dazu ausgelegt ist, mit der Extraktionsnukleinsäure derart verbunden zu werden, wobei die Extraktionsnukleinsäure zumindest teilweise komplementär zu der aus der Probenflüssigkeit zu extrahierenden Nukleinsäure ist. Das Heizelement ist dabei auf eine Temperatur beheizbar, welche gleich oder größer einer Denaturierungstemperatur der an die Extraktionsnukleinsäure gebundenen Nukleinsäure in der vorherrschenden Umgebung, also beispielsweise in der Reaktionslösung, ist. Die Denaturierungstemperatur in der Probenflüssigkeit kann von der Denaturierungstemperatur in der Reaktionslösung abweichen, wobei es nicht zwingend erforderlich ist, dass das Heizelement auf oder über die Denaturierungstemperatur in der Probenflüssigkeit beheizbar ist.
• In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Extrahieren einer Nukleinsäure aus einer Probenflüssigkeit.
• Die Bezeichnungen „Nukleinsäure“ und „Oligonukleotid“ umfassen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nicht nur (Desoxy)-Ribonukleinsäuren bzw. (Desoxy)-Oligo-Ribonukleotide, auch wenn vorgenannte bevorzugt sind, sondern auch Nukleinsäuren und Oligonukleotide, die ein oder mehrere Nukleotid-Analoga mit Modifikationen an ihrem Backbone (zum Beispiel Methylphosphonate, Phosphothioate oder Peptide Nucleic Acids (PNA), insbesondere an einem Zucker des Backbone (zum Beispiel 2'-O-Alkylderivate, 3'- und/oder 5'-Aminoribosen, Locked Nucleic Acids [LNA], Hexitol Nucleic Acids, Morpholinos, Glycol Nucleic Acid (GNA), Threose Nucleic Acid (TNA) oder Tricyclo-DNA, vergleiche hierzu den Aufsatz von D. Renneberg und C.J. Leumann, „Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA“, J. Am. Chem. Soc., 2002, Bd. 124, Seiten 5993-6002, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist) enthalten oder die Basen-Analoga enthalten, zum Beispiel 7-Deazapurine oder Universalbasen wie Nitroindol oder modifizierte natürliche Basen wie N4-Ethyl-Cytosin. In einer Ausführung der Erfindung sind die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide Konjugate oder Chimären mit nichtnukleosidischen Analoga, zum Beispiel PNA. Die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide enthalten in einer Ausführung der Erfindung an einer oder mehreren Positionen nicht-nukleosidische und/oder nichtnukleotidische Einheiten wie Spacer, zum Beispiel Hexaethylenglycol oder Cn-Spacer mit n zwischen 3 und 6. Soweit die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide Modifikationen enthalten, sind diese so gewählt, dass auch mit der Modifikation eine Hybridisierung mit natürlichen DNA/RNA-Analyten möglich ist. Bevorzugte Modifikationen beeinflussen das Schmelzverhalten, vorzugsweise die Schmelztemperatur, insbesondere um Hybride mit unterschiedlichen Graden der Komplementarität ihrer Basen unterscheiden zu können (Mismatch-Diskriminierung). Bevorzugte Modifikationen umfassen LNA, 8-Aza-7-Deaza- Purine, 5-Propinyl-Uracil und -Cytosin und/oder abasische Unterbrechungen oder Modifikationen in der Nukleinsäure oder in dem Oligonukleotid. Weitere Modifikationen im Sinne der Erfindung sind zum Beispiel Modifikationen mit Biotin und/oder Thiol und/oder Schwefel und/oder Fluoreszenzdonor- und Fluoreszenzakzeptormolekülen.
• Dass die Nukleinsäure aus der Probenflüssigkeit extrahiert wird, bedeutet dabei, dass die Nukleinsäure zumindest teilweise von der Probenflüssigkeit isoliert wird und vorzugsweise von der Probenflüssigkeit getrennt werden kann. Die aus der Probenflüssigkeit zu extrahierende Nukleinsäure kann auch als Zielnukleinsäure bezeichnet werden. Insbesondere kann somit das Extrahieren einer Nukleinsäure ein Separieren der Nukleinsäure von der Probenflüssigkeit umfassen oder einem solchen Separieren dienen. Dabei kann das Extrahieren der Nukleinsäure derart ausgestaltet sein, dass lediglich die zu extrahierende Nukleinsäure von der Probenflüssigkeit extrahiert wird oder auch noch andere Bestandteile der Probenflüssigkeit mit extrahiert werden, wie beispielsweise andere Nukleinsäuren. Besonders bevorzugt wird jedoch nur die zu extrahierende Nukleinsäure aus der Probenflüssigkeit extrahiert, sodass insbesondere andere Nukleinsäuren und andere Bestandteile der Probenflüssigkeit nicht mit extrahiert werden, sondern in der Probenflüssigkeit verbleiben. Vorzugsweise ist nach dem Extrahieren der Nukleinsäure die Konzentration und/oder die Anzahl von Exemplaren der extrahierten Nukleinsäure in der Probenflüssigkeit geringer, als vor dem Extrahieren, sofern überhaupt vor dem Extrahieren die zu extrahierende Nukleinsäure in der Probenflüssigkeit vorhanden war.
• Dass die Extraktionsnukleinsäure zumindest teilweise komplementär zur Zielnukleinsäure ist, bedeutet dabei, dass die Extraktionsnukleinsäure und die Zielnukleinsäure über zumindest ein Basenpaar miteinander hybridisieren bzw. aneinander binden können. Mit anderen Worten weist die Extraktionsnukleinsäure in ihrer Sequenz zumindest eine Base auf, welche komplementär zu zumindest einer Base der Zielnukleinsäure bzw. der zu extrahierenden Nukleinsäure ist. Vorzugsweise weist die Extraktionsnukleinsäure jedoch eine größere Komplementarität zur Zielnukleinsäure auf, d.h. dass vorzugsweise die Basensequenz der Extraktionsnukleinsäure nicht nur in einer Base, sondern in mehreren, vorzugsweise aufeinanderfolgenden, Basen komplementär zur einem oder mehreren Abschnitten der Basensequenz der Zielnukleinsäure ist. Mehr bevorzugt sind zumindest 5, noch mehr bevorzugt zumindest 10, viel mehr bevorzugt zumindest 15, am meisten bevorzugt zumindest 20 Basenpaare, welche besonders bevorzugt aufeinanderfolgend angeordnet sind ohne dass andere Basen dazwischenliegend angeordnet sind, komplementär zur einer entsprechenden Sequenz der Zielnukleinsäure. Vorzugsweise sind zumindest 1%, weiter bevorzugt zumindest 5%, noch weiter bevorzugt zumindest 10%, mehr bevorzugt zumindest 20%, noch mehr bevorzugt zumindest 30%, viel mehr bevorzugt zumindest 40%, sehr viel mehr bevorzugt zumindest 50%, besonders bevorzugt zumindest 60%, ganz besonders bevorzugt zumindest 70%, am meisten bevorzugt zumindest 80% und am allermeisten bevorzugt zumindest 90% der Basensequenz der Extraktionsnukleinsäure komplementär zu einer entsprechenden Sequenz der Zielnukleinsäure. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Extraktionsnukleinsäure im Wesentlichen vollständig komplementär zu einer entsprechenden Sequenz der Zielnukleinsäure sein, d.h. dass abgesehen von wenigen Fehlstellen die Basensequenz der Extraktionsnukleinsäure vollständig komplementär zu einem entsprechenden Sequenzabschnitt der Zielnukleinsäure ist. Sofern die Extraktionsnukleinsäure mehrere verschiedene Abschnitte von Basensequenzen aufweist, beispielsweise einen Extraktionsabschnitt, welcher zum Extrahieren der Zielnukleinsäure dienen soll und auch einen Verbindungsabschnitt, wie etwa einen Spacer bzw. eine Abstandshalter-Sequenz zum Beabstanden des Extraktionsabschnitts von dem Heizelement, beziehen sich die oben erläuterten Ausführungen zur Komplementarität zwischen der Extraktionsnukleinsäure und der Zielnukleinsäure vorzugsweise nur auf den Extraktionsabschnitt der Extraktionsnukleinsäure.
• Ein höheres Maß an Komplementarität zwischen der Extraktionsnukleinsäure und der Zielnukleinsäure, kann Vorteile hinsichtlich der Selektivität bei der Extraktion bieten. So kann ein hohes Maß an Komplementarität zwischen der Extraktionsnukleinsäure und der die Zielnukleinsäure ermöglichen, dass im Wesentlichen nur die Zielnukleinsäure an die Extraktionsnukleinsäure binden kann, während ein Binden anderer Nukleinsäuren aus der Probenflüssigkeit an die Extraktionsnukleinsäure eine Ausnahme darstellt. Andererseits kann ein geringes Maß an Komplementarität zwischen der Extraktionsnukleinsäure und der Zielnukleinsäure vorzugsweise ein Binden von unterschiedlichen Nukleinsäuren aus der Probenflüssigkeit an die Extraktionsnukleinsäure ermöglichen, so dass auch andere Nukleinsäuren aus der Probenflüssigkeit extrahiert werden kann und/oder die Zielnukleinsäure auch dann extrahiert werden kann, wenn die Extraktionsnukleinsäure ein nur geringes Maß an Komplementarität zu dieser aufweist, beispielsweise weil die Basensequenz der Zielnukleinsäure nicht in ausreichendem Maß bekannt ist und entsprechend die Extraktionsnukleinsäure nicht exakt auf die Zielnukleinsäure angepasst werden kann.
• Vorzugsweise kann zumindest ein Parameter der Probenflüssigkeit angepasst werden, um ein Hybridisieren der Zielnukleinsäure an die Extraktionsnukleinsäure angesichts des vorliegenden Maßes an Komplementarität zu ermöglichen. Beispielsweise kann eine Konzentration von MgCl₂ in der Probenflüssigkeit erhöht werden, um auch ein Hybridisieren bei geringer Komplementarität zu ermöglichen, wohingegen vorzugsweise die Konzentration von MgCl₂ in der Probenflüssigkeit verringert werden kann, um ein Hybridisieren erst ab einem bestimmten höheren Maß an Komplementarität zu ermöglichen.
• Die Probenflüssigkeit ist vorzugsweise eine Flüssigkeit, welche gegebenenfalls die zu extrahierende Nukleinsäure aufweist und auch noch andere Bestandteile umfasst. Insbesondere kann die Probenflüssigkeit noch weitere Bestandteile aufweisen, welche nicht mit extrahiert werden sollen. Diese anderen Bestandteile können andere Nukleinsäuren umfassen, also Nukleinsäuren, welche eine andere Nukleotidsequenz aufweisen. Auch können die anderen Bestandteile Verunreinigungen aufweisen, welche von nicht-nukleotidischer Art sind. Insbesondere kann es sich bei der Probenflüssigkeit um eine Flüssigkeit handeln, welche beispielsweise menschlichen und/oder tierischen und/oder pflanzlichen und/oder anderweitigem organischen Ursprungs ist. Beispielsweise kann die Probenflüssigkeit Blut und/oder Sekret und/oder Körperausscheidungen und/oder Absonderungen von Schleimhäuten und/oder Speichel und/oder Zellflüssigkeit enthalten oder daraus bestehen. Die Probenflüssigkeit kann vorzugsweise vor dem Extrahieren einer oder mehreren Behandlungen unterzogen worden sein, um etwa in der Probenflüssigkeit enthaltene Nukleinsäuren zumindest teilweise freizusetzen. Beispielsweise kann die Probenflüssigkeit einer Behandlung unterzogen worden sein, um etwa darin befindliche Zellen zu lysieren bzw. aufzuschließen, um die ggf. darin befindlichen Nukleinsäuren zumindest teilweise aus den Zellen herauszulösen, sodass die Nukleinsäuren vorzugsweise frei in der Probenflüssigkeit vorliegen und zumindest teilweise nicht oder nicht mehr in Zellkernen und/oder Zellen eingeschlossen sind. Das Lysieren erfolgt vorzugsweise derart, dass die freigesetzten Nukleinsäuren zumindest nicht vollständig zerstört werden und besonders bevorzugt vollständig erhalten bzw. unversehrt bleiben.
• Insbesondere kann die Probenflüssigkeit vorzugsweise derart vorliegen, dass ein Durchführen einer Amplifikationsreaktion zur Vervielfältigung der extrahierten Nukleinsäure in der Probenflüssigkeit nicht möglich ist. So kann die Probenflüssigkeit beispielsweise physikalische und/oder chemische und/oder biologische Eigenschaften aufweisen, welche einer Durchführung einer Amplifikationsreaktion, wie beispielsweise einer PCR, in der Probenflüssigkeit entgegenstehen. Beispielsweise kann die Probenflüssigkeit eine Viskosität und/oder einen pH-Wert und/oder eine Salzkonzentration und/oder Polarität und/oder Enzyme und/oder Proteasen aufweisen, welche die Durchführung einer Amplifikationsreaktion nicht ermöglichen, beispielsweise weil die Aktivität der hierzu notwendigen Polymerase-Enzyme inhibiert wird oder Enzyme wie Proteasen vorliegen, die die Polymerase-Enzyme abbauen können.
• Dass die Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement gebunden ist bedeutet dabei, dass die Extraktionsnukleinsäure mechanisch fest mit dem Heizelement verbunden ist, insbesondere durch eine chemische und/oder elektrostatische Bindung. Beispielsweise kann die Extraktionsnukleinsäure mittels einer oder mehrerer Thiol-Bindungen und/oder Schwefelbindungen an eine Oberfläche des Heizelements gebunden sein. Vorzugsweise ist dazu das Heizelement an seiner Oberfläche zumindest teilweise mit einem Material versehen, das die Anbindung von Nukleinsäuren erlaubt. Zum Beispiel kann eine vergoldete Oberfläche genutzt werden, um die Extraktionsnukleinsäure und optional andere Nukleinsäuren über eine oder mehrere Thiol- und/oder Schwefel-Bindung(en) an das Heizelement zu binden. Auch kann zum Beispiel eine Streptavidin-Biotin-Bindung zur Anbindung der Extraktionsnukleinsäure und/oder anderer Nukleinsäuren auf das Heizelement genutzt werden, wenn zum Beispiel, vorzugsweise vorher, einer der beiden Partner (Streptavidin oder Biotin) auf die Heizelemente gebunden wurde und die Extraktionsnukleinsäure (vorzugsweise am 5'-Ende) mit dem anderen der beiden Partner modifiziert ist und anschließend darüber an das Heizelement gebunden wird. Auch andere Modifikationen wie zum Beispiel Amino- oder Carboxy-Gruppen können zur Bindung der Extraktionsnukleinsäure auf das Heizelement genutzt werden, die Oberfläche des Heizelements kann hierfür zum Beispiel, vorzugsweise vorher, mit Epoxy und/oder einem Metall modifiziert werden. Vorzugsweise findet eine Bindung derart statt, dass das 5'-Ende der Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement gebunden ist, sodass das 3'-Ende frei ist. Dies kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn die Extraktionsnukleinsäure in einer nach der Extraktion durchzuführenden Amplifikationsreaktion als ein Primer dienen soll.
• Dass die Extraktionsnukleinsäure derart bereitgestellt wird, dass die Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement bindet, bedeutet dabei, dass die Extraktionsnukleinsäure derart unter physikalischen und/oder chemischen und/oder biologischen Bedingungen mit dem Heizelement in Kontakt gebracht wird, dass ein Binden, insbesondere ein direktes Binden, der Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement ermöglicht wird. Beispielsweise können dazu eine Temperatur und/oder ein pH-Wert in einem bestimmten Bereich erforderlich sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Extraktionsnukleinsäure derart in der Probenflüssigkeit bereitgestellt, dass die Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement bindet, wenn die Probenflüssigkeit mit dem Heizelement in Kontakt gebracht wird. Mit anderen Worten erfolgt das Bereitstellen der Extraktionsnukleinsäure vorzugsweise in der Probenflüssigkeit. Besonders bevorzugt weist dazu die Probenflüssigkeit eine physikalische und/oder chemische und/oder biologische Beschaffenheit auf, welche ein Binden der Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement ermöglicht. Vorzugsweise ist die Extraktionsnukleinsäure derart mit dem Heizelement verbunden und/oder mit dem Heizelement derart verbindbar, dass die mit dem Heizelement verbundene Extraktionsnukleinsäure in dem Reaktionsgefäß bzw. in der Reaktionslösung angeordnet ist.
• Dass die Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement bindet und/oder gebunden ist, kann dabei bedeuten, dass die Extraktionsnukleinsäure direkt oder indirekt an das Heizelement gebunden ist. Beim direkten Binden kann beispielsweise eine der oben genannten Bindungsarten die Extraktionsnukleinsäure direkt mit dem Heizelement verbunden. Beim indirekten Binden kann beispielsweise die Extraktionsnukleinsäure über eine Adapternukleinsäure an das Heizelement gebunden sein, wobei vorzugsweise die Adapternukleinsäure fest an das Heizelement gebunden ist, beispielsweise mittels einer Thiol-Bindung und/oder einer anderen der oben genannten Bindungsarten, während die Extraktionsnukleinsäure wiederum an die Adapternukleinsäure binden kann. Vorzugsweise kann die Extraktionsnukleinsäure mit der Adapternukleinsäure hybridisieren und auf diese Weise indirekt an das Heizelement binden. Dies kann den Vorteil bieten, dass das Heizelement mit einer oder mehreren Adapternukleinsäuren versehen werden kann und auf einfache Weise durch die Hinzugabe von einer oder mehreren Extraktionsnukleinsäuren, welche dazu ausgelegt sind, um an die Adapternukleinsäure zu binden, individualisiert bzw. auf die jeweiligen Erfordernisse angepasst werden kann. An jedes Heizelement können dabei vorzugsweise mehrere Extraktionsnukleinsäuren gebunden sein, wobei entweder alle Extraktionsnukleinsäure entweder direkt an das Heizelement gebunden sind oder indirekt über jeweils zumindest eine Adapternukleinsäure. Alternativ können vorzugsweise auch an ein Heizelement zumindest eine Extraktionsnukleinsäure direkt gebunden sein und zumindest eine Extraktionsnukleinsäure indirekt über eine Adapternukleinsäure gebunden oder bindbar sein.
• Dass das In-Kontakt-Bringen des Heizelements mit der Probenflüssigkeit derart erfolgt, dass die aus der Probenflüssigkeit zu extrahierende Nukleinsäure zumindest teilweise an die Extraktionsnukleinsäure bindet, kann umfassen, dass zumindest an der Kontaktfläche zwischen dem Heizelement und der Probenflüssigkeit, also an der Oberfläche des Heizelements und/oder in der unmittelbaren Umgebung, zumindest teilweise Hybridisierungsbedingen vorherrschen, welche ein Hybridisieren der zu extrahierenden Nukleinsäure mit der Extraktionsnukleinsäure begünstigen und/oder ermöglichen. Beispielsweise können die Hybridisierungsbedingungen eine Temperatur und/oder einen pH-Wert und/oder eine Salzkonzentration in einem bestimmten Bereich umfassen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann das Heizelement dabei derart beheizt werden, um in der unmittelbaren Umgebung zumindest zeitweise die erforderliche Temperatur bereitzustellen, um die Hybridisierung der zu extrahierenden Nukleinsäure mit der Extraktionsnukleinsäure zu ermöglichen. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, kann das Heizelement und die Probenflüssigkeit vorzugsweise auch möglichst homogen beheizt werden, d.h. derart, dass die Heizelemente die gleiche oder nahezu die gleiche Temperatur aufweisen wie die Reaktionslösung, um eine effektive Hybridisierung der zu extrahierenden Nukleinsäure an die Extraktionsnukleinsäure zu ermöglichen. Dies kann vorzugsweise durch das Heizelement und/oder durch eine optionale weitere, vorzugsweise außerhalb der Probenflüssigkeit angeordneten Heizvorrichtung, realisiert werden. Hierzu kann beispielsweise die gesamte Vorrichtung, die die Heizelemente sowie die Probeflüssigkeit enthält, auf eine Basistemperatur von beispielsweise zwischen 35°C und 80° und besonders vorzugsweise zwischen 40°C und 70°C aufgeheizt werden. Eine derartige Basistemperatur kann vorzugsweise zumindest zeitweise während der Extraktion eingestellt werden. Während einer optionalen Amplifikation nach der Extraktion kann optional vom Einstellen derselben Basistemperatur abgesehen werden und/oder eine andere Basistemperatur bzw. globale Temperatur der Reaktionslösung eingestellt werden.
• Die Denaturierungstemperatur entspricht dabei einer Temperatur, bei welcher ein Nukleinsäure-Doppelstrang denaturiert wird, d.h. bei welcher der Nukleinsäure-Doppelstrang in seine beiden Einzelstränge aufgetrennt wird. So kann in dem Denaturierungsschritt zum Beispiel die Extraktionsnukleinsäure von der daran hybridisierten Nukleinsäure getrennt werden. Die erfindungsgemäß bevorzugte Art der Denaturierung ist eine thermische Denaturierung (auch als „Schmelzen“ bezeichnet). Dazu wird zumindest ein Teil des Nukleinsäure-Doppelstrangs oder der ganze Doppelstrang einer Temperatur, welche gleich oder höher als die Denaturierungstemperatur ist, ausgesetzt, die ein Trennen der Nukleinsäure-Doppelstränge hervorruft oder zumindest begünstigt. Die bevorzugte Denaturierungstemperatur ist einerseits so hoch gewählt, dass Nukleinsäure-Doppelstränge aufgetrennt werden können. Andererseits ist die bevorzugte Denaturierungstemperatur so niedrig gewählt, dass eine DNA-Polymerase, die sich möglicherweise ebenfalls in der Reaktionslösung befindet, nicht wesentlich geschädigt wird. Ein typischer Wert für die Denaturierungstemperatur kann beispielsweise bei 95 °C liegen. Das Beheizen des Heizelements auf eine Temperatur, welche gleich oder größer der Denaturierungstemperatur ist, kann vorzugsweise den Vorteil bieten, dass sich die extrahierte Nukleinsäure zumindest teilweise von der Extraktionsnukleinsäure löst und frei in die Reaktionslösung übergeht. Dies kann beispielsweise für eine anschließend durchzuführende Amplifikation der extrahierten Nukleinsäure vorteilhaft sein und/oder wenn die extrahierte Nukleinsäure von dem Heizelement entfernt bzw. getrennt werden soll.
• Die Reaktionslösung ist dabei vorzugsweise eine Flüssigkeit, in welcher die extrahierte Nukleinsäure als solche einzelsträngig und/oder doppelsträngig vorliegend überdauern kann und oder stabilisiert wird. Jedoch unterscheidet sich die Reaktionslösung von der Probenflüssigkeit. Mit anderen Worten ist die Reaktionslösung vorzugsweise derart ausgestaltet, dass die extrahierte Nukleinsäure durch die Wechselwirkung mit der Reaktionslösung keinen Schaden nimmt. Beispielsweise kann die Reaktionslösung als eine wässrige Lösung und/oder als eine Pufferlösung vorliegen. Sofern nach dem Extrahieren der Nukleinsäure eine Amplifikation der extrahierten Nukleinsäure beabsichtigt ist, kann die Reaktionslösung vorzugsweise derart ausgestaltet sein, dass die Reaktionslösung die Durchführung einer solchen Amplifikationslösung ermöglicht. Beispielsweise kann die Reaktionslösung als eine Pufferlösung ausgebildet sein, in welcher die Durchführung einer PCR möglich ist, um die extrahierte Nukleinsäure zumindest teilweise zu vervielfältigen. Die Reaktionslösung wird vorzugsweise in einem Reaktionsgefäß bereitgestellt. Die bereitgestellte Reaktionslösung weist vorzugsweise ein Volumen von zumindest 1 µl und nicht mehr als 10 ml, mehr bevorzugt von zumindest 5 µl und nicht mehr als 1 ml, am meisten bevorzugt von zumindest 10 µl und nicht mehr als 100 µl auf.
• Die Erfindung bietet den Vorteil, dass das Heizelement direkt zur Extraktion der aus der Probenflüssigkeit zu extrahierenden Nukleinsäure genutzt werden kann, indem das Heizelement mit der zumindest einen Extraktionsnukleinsäure versehen wird. Mit anderen Worten findet erfindungsgemäß die Extraktion der Nukleinsäure aus der Probenflüssigkeit vorzugsweise direkt an dem Heizelement, insbesondere an dessen Oberfläche und in dessen unmittelbaren Umgebung, statt. Somit kann vorzugsweise das Heizelement zur Bereitstellung von Hybridisierungsbedingungen, insbesondere einer geeigneten Hybridisierungstemperatur, in der unmittelbaren Umgebung des Heizelements, verwendet werden.
• Ferner bietet die Erfindung den Vorteil, dass die extrahierte(n) Nukleinsäure(n) nach der Extraktion bereits an das Heizelement gebunden ist/sind. Dies bietet die Möglichkeit, nach dem Extrahieren eine Amplifikationsreaktion, wie etwa eine PCR, unter Verwendung des Heizelements, durchzuführen. Dadurch kann die erforderliche Zeitdauer zur Extraktion und Amplifikation der extrahierten Nukleinsäure reduziert werden. Insbesondere ist es erfindungsgemäß nicht zwingend erforderlich, die extrahierte Nukleinsäure vor dem Durchführen einer Amplifikationsreaktion zunächst wieder von dem Extraktionssubstrat, d.h. erfindungsgemäß vom Heizelement, zu trennen bzw. zu entfernen, sondern vielmehr kann erfindungsgemäß die extrahierte Nukleinsäure an dem Heizelement verbleiben. Dadurch kann beispielsweise der Beginn und/oder der Ablauf einer darauffolgenden Amplifikationsreaktion unter Verwendung des Heizelements deutlich beschleunigt werden, da die extrahierte Nukleinsäure bereits in dem von dem Heizelement lokal beheizbaren Volumen der Reaktionslösung bzw. Raumbereich angeordnet ist. Es sei darauf hingewiesen, dass es erfindungsgemäß nicht zwingend erforderlich ist, dass nach dem Extrahieren die Nukleinsäure an dem Heizelement verbleibt, jedoch kann es aus den soeben erläuterten Gründen besonders vorteilhaft sein.
• Ferner bietet die Erfindung den Vorteil, dass das Heizelement, welches auch zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion geeignet und/oder ausgelegt sein kann, auch zur Extraktion der Nukleinsäure aus einer Probenflüssigkeit und somit zu einer Aufkonzentration der zu extrahierenden und optional zu amplifizierenden Nukleinsäure verwendet werden kann. Besonders bevorzugt ist die Vorrichtung dazu ausgelegt, eine Amplifikationsreaktion zur Vervielfältigung der aus der Probenflüssigkeit extrahierten Nukleinsäure durchzuführen, wobei vorzugsweise das Beheizen des Heizelements derart erfolgt, dass lediglich ein lokales Erwärmen einer unmittelbaren Umgebung des Heizelements zumindest auf die Denaturierungstemperatur erfolgt. Vorteile des lokalen Erwärmens von Teilen einer Reaktionslösung bei der Durchführung einer Amplifikationsreaktionsreaktion sind beispielsweise in der Druckschrift DE102012201475A1 erläutert. Dadurch, dass beim In-Kontakt-Bringen des Heizelements mit der Probenflüssigkeit die zu extrahierende Nukleinsäure über die Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement binden kann, kann nach erfolgter Extraktion die verbleibende Probenflüssigkeit von dem Heizelement separiert werden, wobei die Nukleinsäure an das Heizelement gebunden bleibt. Somit kann das Heizelement und die daran gebundene Extraktionsnukleinsäure zur Aufreinigung bzw. Aufkonzentration der zu extrahierenden Nukleinsäure, welche auch als Target-Nukleinsäure bezeichnet werden kann, dienen. Folglich ermöglicht die Erfindung, sowohl einerseits die Aufkonzentration bzw. Aufreinigung bzw. Extraktion der Nukleinsäure, als auch andererseits die Amplifikation der extrahierten Nukleinsäure. Auf diese Weise kann auf die Bereitstellung von separaten Vorrichtungen zum Aufreinigen und zum Amplifizieren verzichtet werden, da erfindungsgemäß für beide Verfahrensschritte die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet werden kann.
• Anders ausgedrückt kann die Erfindung den Vorteil bieten, dass eine eigentlich zur Amplifikation ausgelegte Vorrichtung unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder unter Ausgestaltung als eine erfindungsgemäße Vorrichtung auch zur Aufreinigung bzw. Aufkonzentration der zu amplifizierenden Nukleinsäure dienen kann.
• Ferner bietet die Erfindung den Vorteil, dass die Probenflüssigkeit, in welcher die zu extrahierende Nukleinsäure bereitgestellt wird, vorzugsweise auch solche Substanzen enthalten kann, welche einer Amplifikation der zu extrahierenden Nukleinsäure abträglich sind. Dadurch, dass die Probenflüssigkeit nach dem Extrahieren der Nukleinsäure wieder von dem Heizelement separiert wird, bleibt vorzugsweise nur die etwaig daraus extrahierte Nukleinsäure an dem Heizelement zurück, sodass die ggf. für die Amplifikation hinderlichen Substanzen auch wieder von dem Heizelement extrahiert werden. Somit muss bei der Bereitstellung der Probenflüssigkeit nicht auf die Anforderungen und/oder Erfordernisse einer etwaigen anschließenden Amplifikationsreaktion Rücksicht genommen werden. Vielmehr kann beispielsweise die zu extrahierende (und zu amplifizierende) Nukleinsäure in Form einer nichtaufgereinigten Probe bereitgestellt werden, beispielsweise als Blut und/oder Schleim und/oder Körpersekret, wodurch die erforderliche Zeitdauer zur Aufreinigung und Amplifikation und der erforderliche Aufwand reduziert werden können.
• Auch kann die Erfindung den Vorteil bieten, dass ein Verdünnen der Probenflüssigkeit zur Extraktion und/oder zu einer optional anschließend durchzuführenden Amplifikation der Nukleinsäure aus der Probenflüssigkeit nicht zwingend erforderlich ist und somit keine abträgliche Reduktion der Konzentration in Kauf genommen werden muss. Dadurch, dass die Extraktion an einer unverdünnten Probenflüssigkeit erfolgen kann, kann die Sensitivität des Nukleinsäurenachweises signifikant erhöht werden.
• Alternativ oder zusätzlich kann die Erfindung den Vorteil bieten, dass der Probenflüssigkeit eine oder mehrere Substanzen hinzugefügt werden können und/oder eine oder mehrere Substanzen bereits in der Probenflüssigkeit enthalten sein können, welche der Extraktion dienlich sein können aber optional einer späteren Amplifikation abträglich sein können. Beispielsweise können der Probenflüssigkeit solche Substanzen hinzugefügt werden, welche ein Binden bzw. Hybridisieren der zu extrahierenden Nukleinsäure aus der Probenflüssigkeit an die Extraktionsnukleinsäuren begünstigen, um etwa die Ausbeute der extrahierten Nukleinsäure zu vergrößern, wenngleich die Anwesenheit derartiger Substanzen während einer Amplifikationsreaktion nachteilhaft wäre, zum Beispiel die Anwesenheit hoher Natriumchlorid- oder Magnesiumchlorid-Konzentrationen und/oder von Lysepuffern, die beispielsweise Lyseenzyme und/oder chaotrope Salze umfassen können. Da die Probenflüssigkeit abgesehen von der daraus extrahierten Nukleinsäure wieder von dem Heizelement separiert wird, sind bei einer darauffolgenden Verwendung des Heizelements in einer Amplifikationsreaktion die für die Amplifikation nachteilhaften Substanzen nicht mehr in der Reaktionslösung zugegen und können somit die Amplifikationsreaktion nicht mehr stören. Somit ermöglicht die Erfindung eine Optimierung der Probenflüssigkeit zur Extraktion und unabhängig davon eine Optimierung der Reaktionslösung für eine Amplifikation der extrahierten Nukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nach Entfernung der Probeflüssigkeit die Heizelemente ein oder mehrmals mit einer Waschlösung gewaschen, die zum Entfernen solcher Stoffe, die einer PCR-Reaktion abträglich sein können, geeignet ist und gleichzeitig die Bindung zwischen der Extraktionsnukleinsäure und der zu extrahierenden Nukleinsäure nicht beeinflusst. Eine solche Waschlösung kann z.B. eine MgCl₂- und/oder NaCl- haltige Pufferlösung umfassen oder daraus bestehen.
• Ferner bietet die Erfindung den Vorteil, dass insbesondere während des Extrahierens und/oder während eines optionalen Amplifizierens der Nukleinsäure die Probenflüssigkeit und/oder die Reaktionslösung bei Bedarf auch global, d.h. die gesamte Probenflüssigkeit bzw. Reaktionslösung, mittels des Heizelements erwärmt bzw. erhitzt werden kann. Dadurch kann beispielsweise eine zumindest teilweise Hybridisierung der zu extrahierenden Nukleinsäure mit der Extraktionsnukleinsäure begünstigt werden. Alternativ oder zusätzlich kann solch ein globales Heizen der Probenflüssigkeit und/oder der Reaktionslösung zur zumindest teilweisen Denaturierung der zu extrahierenden Nukleinsäure dienen, was insbesondere dann vorteilhaft sein kann, wenn die zu extrahierende Nukleinsäure nicht oder nicht nur in einzelsträngiger Form vorliegt. Auch kann optional eine Aufheizung der Probenflüssigkeit mittels des Heizelements bei Bedarf vorgenommen werden, um Mikroorganismen in der Probenflüssigkeit zu lysieren bzw. aufzuschließen und/oder abzutöten bzw. zu inaktivieren und eine etwaige darin enthaltene Nukleinsäure, welche beispielsweise extrahiert werden soll, zugänglich zu machen.
• Vorzugsweise weist die Vorrichtung zum Extrahieren der Nukleinsäure ferner ein Reaktionsgefäß auf. Besonders bevorzugt ist das Heizelement mit dem Reaktionsgefäß verbunden und/oder als ein Teil des Reaktionsgefäßes ausgebildet. Weiter bevorzugt ist das Heizelement derart in dem Reaktionsgefäß angeordnet, dass sich das Heizelement bevorzugt vollständig oder nahezu vollständig, zumindest jedoch teilweise durch ein von dem Reaktionsgefäß zumindest teilweise umschlossenes Reaktionsvolumen erstreckt. Dies bietet den Vorteil, dass die Probenflüssigkeit, aus welcher die Nukleinsäure extrahiert werden soll, und/oder die Reaktionslösung auf besonders einfache Weise dadurch mit dem Heizelement in Kontakt gebracht werden können, dass die Probenflüssigkeit bzw. die Reaktionslösung in das Reaktionsgefäß eingefüllt wird.
• Vorzugsweise erfolgt das Beheizen des Heizelements derart, dass nur das Heizelement und eine unmittelbare Umgebung des Heizelements auf die Denaturierungstemperatur oder eine höhere Temperatur erwärmt werden, bei welcher vorzugsweise die an die Extraktionsnukleinsäure gebundene Nukleinsäure zumindest teilweise abschmilzt und/oder denaturiert. Besonders bevorzugt wird nur die unmittelbare Umgebung des oder der Heizelemente für kurze Zeit lokal auf die Denaturierungstemperatur oder eine höhere Temperatur erwärmt, während der Großteil des Reaktionsvolumens auf einer (in diesem Sinne „globalen“) Basistemperatur verbleibt. Beispielsweise kann die Basistemperatur auch während einer optionalen, anschließenden Amplifikation eingestellt werden und derart bemessen sein, dass bei der Basistemperatur vorzugsweise eine Elongation und/oder eine Hybridisierung (d.h. „Annealing“), stattfinden kann. Dabei kann optional eine Basistemperatur vorzugsweise auch durch eine separate Heizvorrichtung eingestellt werden, wobei die Basistemperatur eine Temperatur der Reaktionslösung festlegt, welche die Reaktionslösung zumindest dann aufweist, wenn kein Wärmeeintrag in die Reaktionslösung mittels des Heizelements erfolgt. Die Heizvorrichtung zur Temperierung der Reaktionslösung auf die Basistemperatur kann sich beispielsweise außerhalb des Reaktionsvolumens befinden und dazu ausgelegt sein, die Temperatur der Reaktionslösung möglichst konstant auf der Basistemperatur zu halten. Beispielsweise kann die Basistemperatur mindestens 55°C und/oder höchstens 70°C betragen. Alternativ oder zusätzlich kann auch eine Kühlvorrichtung bereitgestellt werden, welche der Reaktionslösung Wärme entziehen kann, sofern dies zum Erreichen der Basistemperatur erforderlich sein sollten. Während gemäß bevorzugten Ausführungsformen die Temperatur der Reaktionslösung durch eine (externe) Heizvorrichtung, wie etwa einen Heizblock auf die Basistemperatur gebracht wird, kann beispielsweise lediglich das Aufheizen zumindest eines Teils der Reaktionslösung auf die Denaturierungsschritt durch das bzw. die Heizelement(e) realisiert werden, die sich zumindest teilweise, vorzugsweise jedoch zu einem großen Teil oder ganz, in der Reaktionslösung befinden.
• Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen können jedoch das Heizelement bzw. die Heizelemente zum Temperieren der Reaktionslösung auf die Basistemperatur verwendet werden und/oder die Erwärmung der Reaktionslösung auf die Basistemperatur zumindest teilweise und/oder zumindest zeitweise unterstützen. Gemäß wieder anderen bevorzugten Ausführungsformen kann das Temperieren der Reaktionslösung auf die Basistemperatur vollständig bzw. ausschließlich durch das bzw. die Heizelement(e) erfolgen, so dass optional auf die Bereitstellung einer (externen) Heizvorrichtung verzichtet werden kann.
• Ferner kann eine Vorrichtung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform einen beheizbaren Deckel aufweisen, mit welchem beispielsweise ein Reaktionsgefäß, in dem sich die Reaktionslösung befindet, verschlossen werden kann. Der Deckel kann dabei auf eine Temperatur aufgeheizt werden, welche vorzugsweise wenige Grad Celsius über der Temperatur der Reaktionslösung liegt, um ein zumindest teilweises Kondensieren eines dampfförmigen Anteils der Reaktionslösung an dem Deckel zumindest teilweise zu verhindern.
• Ein derartiges Beheizen des Heizelements, dass nur das Heizelement und eine unmittelbare Umgebung des Heizelements auf die Denaturierungstemperatur oder eine höhere Temperatur erwärmt werden, bei welcher vorzugsweise die an die Extraktionsnukleinsäure gebundene Nukleinsäure zumindest teilweise abschmilzt und/oder denaturiert, kann beispielsweise durch ein Anlegen kurzer elektrischer Impulse an das Heizelement erreicht werden, welches beispielsweise als resistives Heizelement ausgebildet ist. Insbesondere kann dies vorzugsweise dadurch erreicht werden, dass die Dauer der Erwärmung durch das Heizelement so kurz ist, dass sich das in dem umgebenden Reaktionsvolumen, d.h. in der unmittelbaren Umgebung, entstehende Wärmefeld nur wenige Mikrometer ausbreiten kann und auf diese Weise eine Aufheizzone schafft, die vorzugsweise nur einen winzigen Bruchteil des Reaktionsvolumens umfasst. Mit anderen Worten erfolgt das Aufheizen der Heizelemente und ihrer unmittelbaren Umgebung vorzugsweise so schnell, dass sich die Wärme nicht in der gesamten Lösung ausbreiten kann und die Lösung daher abgesehen von der unmittelbaren Umgebung der Heizelemente im Wesentlichen auf der Basistemperatur verbleibt.
• Besonders bevorzugt wird das Heizelement hierzu weniger als 100 ms lang, ganz besonders vorzugsweise weniger als 10 ms lang und ganz besonders vorzugsweise weniger als 1 ms lang beheizt, um zu erreichen, dass sich während dieser Heizdauern, die Temperaturfelder um weniger als vorzugsweise 100 µm besonders vorzugsweise weniger als 35 µm und ganz besonders vorzugsweise weniger als 10 µm weit durch Diffusion von den Heizelementen in die Reaktionslösung ausbreiten können. Die Diffusionsweite x(t) der Wärme in Wasser kann als Funktion der Zeit (t) mit der folgenden Beziehung abgeschätzt werden: $$x\left(t\right)\approx \sqrt{{10}^{-7}\frac{m^2}{s}\cdot t}$$

  
• Da das bzw. die Heizelement(e) vorzugsweise durch ihre Wärmeleiteigenschaften und ein möglichst hohes Oberflächenvolumenverhältnis sehr wirksam die Wärme an Ihre Umgebung abgeben können, kann erreicht werden, dass die auf ihre Oberfläche gebundene Nukleinsäuren vorzugsweise nur für eine kurze Denaturierungsdauer von vorzugsweise weniger als 100ms, ganz besonders vorzugsweise weniger als 10ms und ganz besonders vorzugsweise weniger als 1ms einem Temperaturfeld ausgesetzt ist, das mehr als 5°C wärmer ist, als die zuvor eingestellte und sich nach dem Denaturierungsschritt wieder einstellende, kombinierte Annealing- und Elongationstemperatur. Besonders bevorzugt tritt bei solch einem lokalen Heizen der unmittelbaren Umgebung der Heizelemente keine substanzielle globale Erwärmung der gesamten Reaktionslösung auf, d.h. die Durchschnittstemperatur der Reaktionslösung erfährt vorzugsweise keinen substantiellen Temperaturhub. Vorzugsweise ist der Temperaturhub der Durchschnittstemperatur der Reaktionslösung pro Heizvorgang mittels des Heizelements bzw. der Heizelemente nicht größer als 5°C, weiter bevorzugt nicht größer als 3°C, noch weiter bevorzugt nicht größer als 1°C, mehr bevorzugt nicht größer als 0,5°C, viel mehr bevorzugt nicht größer als 0,25°C, am meisten bevorzugt nicht größer als 0,1 °C. Optional ist der Temperaturhub der Durchschnittstemperatur der Reaktionslösung pro Heizvorgang mittels des Heizelements bzw. der Heizelemente nicht größer als 0,05°C oder nicht größer als 0,01°C. Besonders bevorzugt umfasst das Beheizen des Heizelements zumindest einen Heizvorgang und erfolgt vorzugsweise derart, dass das Beheizen des Heizelements pro Heizvorgang und/oder über alle Heizvorgänge eine Durchschnittstemperatur der Reaktionslösung um nicht mehr als 5°C, bevorzugt um nicht mehr als 3°C, weiter bevorzugt um nicht mehr als 1°C, mehr bevorzugt um nicht mehr als 0,5°C, viel mehr bevorzugt um nicht mehr als 0,25°C, am meisten bevorzugt um nicht mehr als 0,1°C erhöht. Ein Heizvorgang umfasst dabei das Beheizen des Heizelements auf eine Temperatur, welche gleich oder größer einer Denaturierungstemperatur der an die Extraktionsnukleinsäure gebundenen Nukleinsäure ist.
• Dies bietet den Vorteil, dass das Beheizen der unmittelbaren Umgebung des Heizelements mit besonders geringem Energieaufwand und Wärmeeintrag erfolgen kann und/oder dass die Temperaturänderungen in der unmittelbaren Umgebung des Heizelements besonders schnell erfolgen und/oder besonders schnell wieder abklingen können. Insbesondere können durch eine rasche Thermalisierung der Reaktionslösung nach dem Beheizen die während des Beheizens ausgebildeten Temperaturgradienten sehr schnell wieder abgebaut werden, was eine sehr kurze Zeitdauer eines thermischen Zyklus ermöglicht.
• Insbesondere kann somit die eingebrachte Wärmemenge so gering sein, dass keine substantielle globale Erwärmung des Reaktionsvolumens, d.h. der gesamten Reaktionslösung, stattfindet. Die „globale Temperatur“ im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die auf den Rauminhalt bzw. die gesamte Reaktionslösung bezogen durchschnittliche Temperatur des Reaktionsvolumens bzw. der Reaktionslösung, also die Temperatur, die sich nach einer Thermalisierung des Reaktionsvolumens in diesem einstellt oder einstellen würde. Die „globale Erwärmung“ ist die Zunahme der so definierten globalen Temperatur. Somit wird dadurch ermöglicht, dass die der Reaktionslösung zuzuführende Energiemenge, um in der unmittelbaren Umgebung des Heizelements die Denaturierungstemperatur zu erreichen, reduziert wird, wodurch der Energiebedarf und auch der Zeitaufwand minimiert werden können.
• Weiter bietet dies den Vorteil, dass sich nach dem Erwärmen der unmittelbaren Umgebung des Heizelements die eingebrachte Wärme, die sich aus der Aufheizzone in den Rest des Reaktionsvolumens ausbreitet, dort nur eine vernachlässigbare globale Temperaturerhöhung hervorruft. „Vernachlässigbar“ bedeutet hier insbesondere, dass die Temperaturerhöhung vorzugsweise zu gering für eine Denaturierung der Nukleinsäuremoleküle ist und besonders vorzugsweise, dass die Temperaturerhöhung zu gering ist, um die Hybridisierung und die Elongation zu stören. Die Denaturierung und optional auch weitere Schritte einer etwaigen Nukleinsäure-Vervielfältigung unter Verwendung des Heizelements, an welches die extrahierte Nukleinsäure gebunden ist, können somit lokal in der direkten Umgebung der Heizelemente stattfinden. Ferner kann dadurch ein optional gewünschtes Abschmelzen und/oder Denaturieren der über die Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement gebundenen (extrahierten) Nukleinsäure(n) besonders schnell und/oder mit besonders niedrigem Energieeintrag und/oder unter besonders geringer globaler Erwärmung der Reaktionslösung erfolgen.
• Da beim lokalen Heizen durch die oben-spezifizierten kurze Heizpulse die eingebrachte thermische Energie sich zunächst nur auf die Heizelemente verteilt und zunächst nur wenige Mikrometer weit in die Reaktionslösung hineindiffundieren kann, verteilt sich die eingebrachte Wärmemenge auf einen sehr geringen Bruchteil der gesamten Reaktionslösung. Da sich in dieser initialen Aufheizzone die Nukleinsäuren befinden, die thermisch denaturiert werden sollen und insbesondere zumindest zum Teil an die Oberfläche der Heizelemente gebunden sind, kann mit einer geringen Energiemenge in dem vergleichsweise kleinen Volumen der Aufheizzone eine ausreichende Erwärmung zur Denaturierung erreicht werden. Sobald sich diese eingebrachte Energiemenge jedoch auf den weitaus größeren Rest der Reaktionslösung verteilt, kühlt die Aufheizzone ab und die gesamte Reaktionslösung erwärmt sich in einem äußerst geringfügigen Maße, vorzugsweise in einem vernachlässigbaren Maße.
• Besonders bevorzugt ist die Energie, die über die Heizelemente in einem Denaturierungsschritt in die Reaktionslösung eingebracht wird, kleiner ist als die Energie, die erforderlich ist, um die gesamte Reaktionslösung um vorzugsweise 5°C bzw. besonders bevorzugt 3°C und ganz besonders bevorzugt 2°C zu erwärmen.
• Mit anderen Worten wird durch das Lokale Heizen eine Denaturierung der extrahierten Nukleinsäure, die sich in der Nähe der Heizelemente befindet, erreicht und gleichzeitig die globale Erwärmung der Reaktionslösung auf ein geringes und/oder vernachlässigbares Maß gegenüber der Temperatur vor Beginn des Dehybridisierungsschritts beschränkt. Dies ist ein weiterer Vorteil gegenüber konventionellen PCRs, bei denen in jedem Denaturierungsschritt eine Energiemenge eingebracht werden muss, die typischerweise eine (globale) Temperaturerhöhung in der Reaktionslösung von >20°C bewirkt (beispielsweise um die Reaktionslösung von 72°C Elongationstemperatur auf 95°C Dehybridisierungstemperatur zu bringen). Die Energie, die erforderlich ist um eine gewisse Temperaturerhöhung in der Reaktionslösung zu verursachen, kann aus der Wärmekapazität der Reaktionslösung (und der Wärmekapazität der Heizelemente, sofern diese nicht vernachlässigbar klein sein sollte) berechnet werden, da die spezifische Wärmekapazität der, vorzugsweise wässrigen, Reaktionslösung ebenso wie ihre Masse dem Experimentator bekannt sind. Dabei ist die Energie zu berücksichtigen, die tatsächlich in der Reaktionslösung dissipiert wird (und nicht etwa in den Zuleitungen und/oder im Reaktionsgefäß).
• Vorzugsweise ist die Reaktionslösung dazu ausgelegt, eine Amplifikationsreaktion zur Vervielfältigung zumindest eines Teils der extrahierten Nukleinsäure in der Reaktionslösung durchzuführen. Dies bietet den Vorteil, dass das Heizelement zur Extraktion der Nukleinsäure und auch zur Amplifikation der Nukleinsäure verwendet werden kann. Somit sind nicht zwingend zwei separate Vorrichtungen nötig, in welchen getrennt voneinander zunächst die Nukleinsäure extrahiert bzw. aufkonzentriert werden muss und erst im Anschluss daran in einer anderen Vorrichtung die Nukleinsäure amplifiziert werden kann. Insbesondere wird dadurch ermöglicht, zu den an das Heizelement gebundene extrahierte Nukleinsäure die Reaktionslösung für die Amplifikationsreaktion hinzuzugeben und eine Amplifikationsreaktion durchzuführen. Dies kann besonders bevorzugt erfolgen, ohne dass die Reaktionslösung von der Probenflüssigkeit verunreinigt und/oder kontaminiert wird. Insbesondere ist es nicht erforderlich, (abgesehen von der an das Heizelement gebundenen Nukleinsäure) einen Teil der Probenflüssigkeit in die Reaktionslösung zu mischen. Vielmehr wird dadurch ermöglicht, die an das Heizelement gebundene Nukleinsäure in extrahierter Form, d.h. vorzugsweise ohne Rückstände anderer Komponenten der Probenflüssigkeit, mittels des Heizelements in die Reaktionslösung zu übertragen. Ferner bietet dies den Vorteil, dass die extrahierte und zu amplifizierende Nukleinsäure bereits an das Heizelement gebunden ist und somit direkt mittels lokalem Heizen auf die Denaturierungstemperatur erwärmt werden kann. Mit anderen Worten kann die Amplifikation direkt mit dem Erwärmen der zu amplifizierenden Nukleinsäure auf die Denaturierungstemperatur als Teil des Amplifikationsprozesses fortgeführt werden.
• Vorzugsweise erfolgt das Beheizen des Heizelements im Rahmen der Amplifikationsreaktion zur Vervielfältigung zumindest eines Teils der extrahierten Nukleinsäure und wird vorzugsweise zumindest einmal wiederholt. Insbesondere kann die Amplifikationsreaktion vorzugsweise eine Polymerase-Kettenreaktion umfassen oder als solche ausgestaltet sein. Die Amplifikationsreaktion kann mehrere Zyklen umfassen, welche zur Amplifikation der Nukleinsäure durchlaufen werden und vorzugsweise mehrere Heizschritte umfassen, in welchen die Reaktionslösung zumindest teilweise und zeitweise, insbesondere lokal, durch das Heizelement auf eine vorbestimmte Temperatur erwärmt wird. Dabei ist besonders vorteilhaft, wenn die zu amplifizierende Nukleinsäure bereits an das Heizelement gebunden bereitgestellt wird, da somit die vom Heizelement bereitgestellte Wärme direkt und unmittelbar auf die zu amplifizierende Nukleinsäure wirken kann, vorzugsweise nachdem die Extraktionsnukleinsäure (die hier als Primer dient) durch eine Polymerase elongiert wurde.
• Vorzugsweise ist zumindest ein Primer für die Amplifikationsreaktion an das Heizelement gebunden. Alternativ oder zusätzlich wird der zumindest eine Primer derart bereitgestellt, dass der zumindest eine Primer an das Heizelement bindet. Mit anderen Worten ist mindestens einer der benötigten Primer an dem Heizelement befestigt (nachfolgend als „funktionalisiert“ bezeichnet). Dies bietet den Vorteil, dass auch das Amplikon dort entstehen kann und somit eine Denaturierung bei lokaler Erwärmung ermöglicht wird. Mit anderen Worten, dadurch, dass aufgrund des Funktionalisierens der Heizeinrichtung eine Lokalisierung von Schritten der PCR, insbesondere der Hybridisierung, Elongation und/oder Denaturierung, sowie vorzugsweise auch die Erzeugung eines Signals zum Beobachten des Fortschritts der PCR in unmittelbarer Nähe der Heizeinrichtung erreicht wird, kann das Erwärmen des Reaktionsvolumens auf einen Bruchteil des Reaktionsvolumens beschränkt werden.
• Dies bietet insbesondere den Vorteil, dass Nukleinsäuren schneller vervielfältigt werden können, als mit herkömmlichen Verfahren, bei welchen die gesamte Reaktionslösung erwärmt werden muss, also ein globales Heizen erfolgen muss. Insbesondere im Gegensatz zu herkömmlichen Thermocyclern, in denen die Heiz- und Kühlprozesse viele Sekunden dauern, ist mit der Erfindung erreichbar, dass die Dauer der Amplifikationsreaktion nicht mehr durch technische Limitationen wie die Heiz- und Kühlraten bestimmt wird. Auch können Thermalisierungszeiten im Reaktionsgefäß entfallen, da die Wärme stets in der Umgebung der Heizeinrichtung erzeugt wird. Selbst bei 40 Durchläufen des Vervielfältigungszyklus einer PCR nehmen die Denaturierung der Nukleinsäuremoleküle und ihr Abkühlen auf eine Elongations- und Hybridisierungstemperatur insgesamt weniger als eine Sekunde in Anspruch. Somit ist dadurch erreichbar, dass die Dauer der PCR vorwiegend durch die Dauer zwischen den Denaturierungsschritten, die für Diffusions- und Reaktionsprozesse und die biochemischen Prozesse wie Elongation durch die Polymerase benötigt wird, bestimmt wird. Ferner bietet dies den Vorteil, dass Nukleinsäuren mit geringerem Energieeinsatz vervielfältigt werden, als dies bei herkömmlichen Verfahren der Fall ist. Des Weiteren kann der Vervielfältigungsprozess effektiver gesteuert werden und beispielsweise die in herkömmlichen Verfahren bei der Temperierung oftmals auftretenden Über- und Unterschwinger der Temperatur des Reaktionsvolumens weitgehend vermieden werden.
• Zudem wird dadurch ermöglicht, preiswerte und kompakte Vorrichtungen bereitzustellen, welche sowohl zur Extraktion bzw. Aufreinigung der Nukleinsäure, als auch zur Vervielfältigung der Nukleinsäure genutzt werden können. Zum Beispiel ist es vorzugsweise erreichbar, eine derartige Vorrichtung zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren in Form eines Universal Serial Bus (USB)-Sticks bereitzustellen.
• Vorzugsweise ist die Extraktionsnukleinsäure als Primer für die Amplifikationsreaktion ausgebildet. Dies bietet den Vorteil, dass die gleiche Nukleinsäure, welche beispielsweise als ein Oligonukleotid ausgebildet sein kann, sowohl zur Extraktion als auch zur Amplifikation der Nukleinsäure genutzt werden kann. Ferner bietet dies den Vorteil, dass die Funktionalisierung des Heizelements mit nur einer Art von Extraktionsnukleinsäuren ausreichend sein kann, welche sodann als Extraktionsnukleinsäure und als Primer dienen kann. Zudem bietet dies den Vorteil, das beim Beheizen des Heizelements, welches bereits dem ersten Zyklus der Amplifikationsreaktion angehören kann, die zu amplifizierende Nukleinsäure bereits mit dem Primer verbunden ist und in der unmittelbaren Umgebung des Heizelements, welche lokal erwärmt wird, angeordnet ist. Somit kann die Amplifikationsreaktion besonders schnell beginnen und/oder durchgeführt werden.
• Vorzugsweise werden mehrere Heizelemente bereitgestellt. Mit anderen Worten werden zumindest zwei Heizelemente bereitgestellt, wobei vorzugweise jedes der mehreren Heizelemente die beschriebenen Eigenschaften und/oder Funktionen aufweist. Vorzugsweise werden mehrere Extraktionsnukleinsäuren bereitgestellt, wobei das Heizelement oder die mehreren Heizelemente vorzugsweise jeweils mit mehreren Extraktionsnukleinsäuren verbunden sind und/oder wobei die eine oder die mehreren Extraktionsnukleinsäuren derart bereitgestellt werden, um an das Heizelement oder die mehreren Heizelemente zu binden. Dabei können die mehreren Heizelemente mit unterschiedlichen Extraktionsnukleinsäuren bereitgestellt werden, wobei jedes Heizelement mit gleichartigen Extraktionsnukleinsäuren versehen sein kann und sich die Extraktionsnukleinsäuren zwischen den verschiedenen Heizelementen unterscheiden und/oder wobei zumindest eines oder manche der Heizelemente jeweils mit verschiedenartigen Extraktionsnukleinsäuren versehen sind. Besonders bevorzugt werden mehrere Heizelemente bereitgestellt, welche jeweils mit einer Vielzahl von Extraktionsnukleinsäuren funktionalisiert sind. Vorzugsweise ist ein Heizelement mit zumindest 10, mehr bevorzugt zumindest 1000, noch mehr bevorzugt zumindest 100.000, am meisten bevorzugt zumindest 1.000.000 Extraktionsnukleinsäuren funktionalisiert. Vorzugsweise ist eines oder sind mehrere oder alle der mehreren Heizelemente derart mit Extraktionsnukleinsäuren funktionalisiert, dass diese eine Oberflächendichte von zumindest 0,001 Extraktionsnukleinsäure-Molekülen pro Quadratnanometer, besonders bevorzugt von zumindest 0,01 Extraktionsnukleinsäure-Molekülen pro Quadratnanometer und ganz besonders bevorzugt von zumindest 0,1 Extraktionsnukleinsäure-Molekülen pro Quadratnanometer haben. Dies kann den Vorteil bieten, dass eine effiziente Reaktionskinetik ermöglicht wird. Zugleich beträgt die Oberflächendichte auf der Oberfläche des Heizelements vorzugsweise weniger als 100 Extraktionsnukleinsäuren-Molekülen pro Quadratnanometer, besonders vorzugsweise weniger als 10 Extraktionsnukleinsäuren-Molekülen pro Quadratnanometer und ganz besonders weniger als 1 Extraktionsnukleinsäuren-Molekülen pro Quadratnanometer. Dies kann den Vorteil bieten, das eine gute Zugänglichkeit und/oder geringe sterische Hinderung bei der Hybridisierung der zu extrahierenden Nukleinsäure ermöglicht wird.
• Bevorzugt ist das Heizelement in einem Reaktionsgefäß angeordnet und vorzugsweise mit dem Reaktionsgefäß mechanisch verbunden. Alternativ oder zusätzlich ist das Heizelement als ein Teil des Reaktionsgefäßes ausgebildet. Dies bietet den Vorteil, dass das In-Kontakt-Bringen des Heizelements mit der Probenflüssigkeit und/oder mit der Reaktionslösung dadurch erfolgen kann, dass das Reaktionsgefäß mit der Probenflüssigkeit bzw. mit der Reaktionslösung zumindest teilweise befüllt wird, sodass das Heizelement zumindest teilweise von der Probenflüssigkeit bzw. von der Reaktionslösung bedeckt wird. Zudem kann das Separieren des Heizelements von der Probenflüssigkeit ein Entfernen der Probenflüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß umfassen. Vorzugsweise weist das Reaktionsgefäß zumindest eine Öffnung zum Befüllen der Probenflüssigkeit in das Reaktionsgefäß und/oder zum Entfernen der Reaktionslösung aus dem Reaktionsgefäß auf. Beispielsweise kann die Probenflüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß abgesaugt werden. Mit anderen Worten umfasst das In-Kontakt-Bringen des Heizelements mit der Probenflüssigkeit ein zumindest teilweises Befüllen des Reaktionsgefäßes mit der Probenflüssigkeit und/oder umfasst das Separieren des Heizelements von der Probenflüssigkeit ein zumindest teilweises Entfernen der Probenflüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß. Insbesondere kann das Reaktionsgefäß mit einem Zulauf und/oder einem Ablauf ausgestattet sein, über welche die Probenflüssigkeit und/oder die Reaktionslösung und/oder etwaige andere Flüssigkeiten oder Reagenzien in das Reaktionsgefäß eingefüllt oder aus dem Reaktionsgefäß abgelassen werden können. Somit bietet dies den Vorteil, dass das Heizelement auf besonders einfache Weise mit der Probenflüssigkeit und/oder mit der Reaktionslösung in Kontakt gebracht und/oder davon separiert werden kann. Ferner bietet dies den Vorteil, dass das Heizelement in einem Reaktionsvolumen, d.h. in dem Volumen, welches sodann die Reaktionslösung zumindest teilweise einnimmt, angeordnet ist und das Heizelement auch nach der Extraktion der Nukleinsäure mit der Reaktionslösung in Kontakt ist und wechselwirken kann.
• Beispielsweise kann das Verfahren zum Extrahieren der Nukleinsäure aus der Probenflüssigkeit sodann das Bereitstellen eines Reaktionsgefäßes umfassen, mit welchem eine in dem Reaktionsgefäß angeordnete Extraktionsnukleinsäure verbunden ist, wobei die Extraktionsnukleinsäure zumindest teilweise komplementär zu der aus der Probenflüssigkeit zu extrahierenden Nukleinsäure ist. Ferner kann das Verfahren ein Befüllen des Reaktionsgefäßes mit der Probenflüssigkeit derart umfassen, dass die Extraktionsnukleinsäure mit der Probenflüssigkeit bedeckt ist und die aus der Probenflüssigkeit zu extrahierende Nukleinsäure an die Extraktionsnukleinsäure binden kann, sowie ein Entfernen der Probenflüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß derart, dass die an die Extraktionsnukleinsäure gebundene Nukleinsäure zumindest teilweise in dem Reaktionsgefäß verbleibt.
• Mit anderen Worten umfasst das In-Kontakt-Bringen des Heizelements mit der Probenflüssigkeit vorzugsweise ein Benetzen des Heizelements mit der Probenflüssigkeit und/oder ein Eintauchen des Heizelements in die Probenflüssigkeit und/oder ein zumindest teilweises Befüllen des Reaktionsgefäßes mit der Probenflüssigkeit.
• Vorzugsweise umfasst das Verfahren ferner ein Reinigen des Reaktionsgefäßes nach dem Separieren des Heizelements von der Probenflüssigkeit, wobei das Reinigen des Reaktionsgefäßes ein Entfernen von Rückständen der Probenflüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß umfasst. Beispielsweise kann dazu eine Waschlösung verwendet werden, welche mit dem Heizelement und/oder mit dem Reaktionsgefäß in Kontakt gebracht wird, um etwaige Rückstände von Probenflüssigkeit vom Heizelement und/oder vom Reaktionsgefäß zu entfernen. Das Reinigen kann einen oder mehrere Waschgänge umfassen, d.h. das Heizelement kann einmalig oder mehrmalig mit einer oder mit mehreren Waschlösungen in Kontakt gebracht werden. Beispielsweise kann/können die Waschlösung(en) über den Zulauf und/oder Ablauf in das Reaktionsgefäß gefüllt werden bzw. daraus abgelassen werden, sofern das Reaktionsgefäß über solche verfügt. Alternativ oder zusätzlich kann das Heizelement in eine oder mehrere Waschlösungen eingetaucht werden und/oder damit abgesprüht und/oder abgespritzt werden. Dies bietet den Vorteil, dass etwaige Rückstände von Probenflüssigkeit, welche eine etwaige Amplifikationsreaktion in der Reaktionslösung stören könnten, zuverlässig entfernt werden können.
• Vorzugsweise weist das Heizelement einen elektrisch leitfähigen Körper auf, der senkrecht zur Richtung des Stromflusses, vorzugsweise in eine Raumrichtung und besonders bevorzugt in jede Raumrichtung senkrecht zur Richtung des Stromflusses, eine Ausdehnung R aufweist, die vorzugsweise mindestens 0,2 µm und höchstens 0,5 mm beträgt. Weiter bevorzugt beträgt die Ausdehnung R mindestens 0,2 µm und höchstens 0,3 mm, mehr bevorzugt mindestens 0,5 µm und höchstens 200 µm, viel mehr bevorzugt mindestens 1 µm und höchstens 100 µm, besonders bevorzugt mindestens 2µm und höchstens 50 µm und ganz besonders bevorzugt mindestens 5 µm und höchstens 30 µm. Dies bietet den Vorteil, dass mittels eines oder mehrerer derart dimensionierter Heizelemente ein geeigneter Wärmeeintrag in die Reaktionslösung erzielt werden kann und andererseits das oder die Heizelement(e) eine ausreichende Stabilität und/oder Robustheit aufweisen, um der Verarbeitung und/oder der Verwendung als Heizelement standhalten zu können.
• Werden hingegen für die Ausdehnung R senkrecht zur Richtung des Stromflusses kleinere Werte als die angegebenen Mindestwerte gewählt, kann dies dazu führen, dass dabei Strukturen entstehen, die zu filigran für deren Verarbeitung bzw. Herstellung sind. Werden hingegen zu große Werte gewählt, kann dies dazu führen, dass die Heizelemente bei Bestromung zu viel Wärme in die Lösung einbringen, da sie ein für die vorgesehene Verwendung nachteilhaftes Oberflächen-Volumenverhältnis aufweisen. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen können dabei das bzw. die Heizelement(e) als Heizdraht bzw. Heizdrähte ausgeführt sein und vorzugsweise runde und/oder mehreckige und/oder ovale Querschnittsformen aufweisen. Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen können jedoch anderweitig geformte Heizdrähte verwendet werden, die in Längsrichtung bestromt werden und deren Durchmesser bzw. Umkreisdurchmesser der Abmessung R entspricht. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Heizelement bzw. können die mehreren Heizelemente eine Wabenstruktur aufweisen. Beispielsweise kann zur Herstellung eins derartigen Heizelements bzw. derartiger Heizelemente ein metallische Folie verwendet werden, in welche die gewünschte Wabenstruktur(en) geätzt werden. Auch mit Drucktechniken (u.a. Siebdruck von leitenden Strukturen) und Dickschicht-Verfahren lassen sich auf geeignete Substrate Heizelemente mit großem Oberflächenvolumenverhältnis aufbringen.
• Dies bietet den Vorteil, dass der Heizdraht eine besonders große Oberfläche im Verhältnis zu seinem Volumen aufweist. Durch eine möglichst große Oberfläche im Verhältnis zum Volumen kann die Kontaktfläche mit der Probenflüssigkeit besonders groß ausgebildet werden, sodass ein effizientes Heizen der Reaktionslösung ermöglicht wird. Ferner ermöglicht die große Oberfläche eine große Beladung mit Extraktionsnukleinsäuren und/oder anderen Nukleinsäuren, wie etwa Oligonukleotiden und/oder Primern, um ein zuverlässiges Extrahieren von Nukleinsäure aus der Probenflüssigkeit zu ermöglichen und/oder ein zuverlässiges Amplifizieren der Nukleinsäure am Heizelement zu ermöglichen. Außerdem wird dadurch die Wärmekapazität des Heizelements bei möglichst großer Oberfläche minimiert, um die Trägheit beim Heizen und Abkühlen des Heizelements zu minimieren, sodass sehr schnelle und ausgeprägte Temperaturgradienten erzielt werden können, was insbesondere für das lokale Heizen der unmittelbaren Umgebung des Heizelements von großem Vorteil ist.
• Vorzugweise weist die Vorrichtung nicht nur ein Heizelement, sondern mehrere Heizelemente auf. Diese können gleichartig und/oder verschiedenartig ausgebildet sein. Ferner können diese separat oder zusammenhängend ausgebildet sein. Insbesondere können die Heizelemente derart angeordnet sein, dass diese gemeinsam mit elektrischer Spannung und/oder Strom beaufschlagt werden können und/oder separat mit elektrischer Spannung und/oder Strom beaufschlagt werden können. Beispielsweise können die mehreren Heizelemente zumindest teilweise eine Heizeinrichtung bilden. Beispielsweise können die mehreren Heizelemente als eine Anordnung und/oder ein Geflecht und/oder Gewebe aus Drähten ausgebildet sein. Dies bietet den Vorteil, dass die Extraktion der Nukleinsäure aus der Probenflüssigkeit und/oder das Beheizen bzw. (lokale) Erwärmen der Reaktionslösung verbessert werden kann, da die Kontaktfläche zwischen der Probenflüssigkeit bzw. der Reaktionslösung mit den mehreren Heizelementen größer ausgestaltet sein kann, als mit nur einem Heizelement.
• Es ist bevorzugt, dass die Heizelemente ein möglichst hohes Oberflächen-VolumenVerhältnis (OVV) aufweisen, um eine möglichst effektive Abgabe der Wärme an die (unmittelbare) Umgebung zu ermöglichen, und gleichzeitig ein möglichst geringes Volumen haben, um eine geringe Wärmekapazität des Heizelements sicherzustellen. Bevorzugte Ausführungsformen weisen ein OVV für die Heizelemente auf, das mehr als 10³ m^-1 (pro Meter), vorzugsweise mehr als 10⁴ m^-1 und besonders vorzugsweise mehr als 5*10⁴ m^-1 beträgt. Ein zu großes OW kann jedoch in manchen Fällen zu sehr filigranen und somit mechanisch instabilen Strukturen führen, sodass es vorteilhaft sein kann, das OVV vorzugsweise kleiner als 10⁹ m^-1 zu halten, besonders bevorzugt kleiner als 10⁸ m^-1 und am meisten bevorzugt sogar kleiner als 10⁷ m^-1 zu halten.
• Beispielsweise kann das Heizelement einen langen Draht und/oder einen dünnen Film und/oder eine Folie aufweisen, welche vorzugsweise ein geeignetes OVV aufweisen. Für einen langen Draht (Länge viel größer als Durchmesser) berechnet sich beispielsweise das OVV mit 2/r, wobei r der Radius des Drahtes ist. Für einen dünnen Film oder eine Folie (Dicke sehr viel kleiner als Länge und laterale Ausdehnung) berechnet sich das OVV mit 1/d, wobei d die Dicke des Films bzw. der Folie ist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist für obige Ausführungsformen dabei lediglich die Oberfläche zu betrachten, die im Kontakt mit dem Reaktionsvolumen steht; auch ist vorzugsweise nur das Volumen zu betrachten, dessen Oberfläche(n) im Kontakt mit dem Reaktionsvolumen steht (das heißt beispielsweise, Zuleitungen, die nicht durch die Lösung verlaufen, sind erfindungsgemäß nicht als relevante Volumina und Oberflächen zu berücksichtigen). Gleiches gilt auch entsprechend für die nachfolgende Betrachtung von Volumenfüllfaktor und Wärmekapazität.
• In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Verhältnis zwischen der Oberfläche der Heizelemente, die sich in Kontakt mit dem Reaktionsvolumen befindet, und dem Reaktionsvolumen größer als 0,1 m^-1, besonders vorzugsweise größer als 1 m^-1, besonders vorzugsweise größer als 5 m^-1, besonders vorzugsweise größer als 10 m^-1, besonders vorzugsweise größer als 20 m^-1, besonders vorzugsweise größer als 50 m^-1, besonders vorzugsweise größer als 100 m^-1. Mit dieser Ausführung der Erfindung kann vorteilhafterweise dadurch eine günstige Reaktionskinetik erreicht werden, dass in einem großen Teil des Reaktionsvolumens Bestandteile des Reaktionsvolumens durch Diffusion schnell die Oberfläche eines Heizelements erreichen können, um an den dort stattfindenden Schritten des Nukleinsäure-Vervielfältigungsverfahrens teilzunehmen. Auch kann in dem an anderer Stelle beschriebenen Fall von Heizelementen, die zumindest teilweise auf ihrer Oberfläche mit einem der Primer funktionalisiert sind, ausgenutzt werden, dass durch eine größere Oberfläche auch mehr Reaktionspartner zur Verfügung stehen.
• Um zu verhindern, dass die Heizelement-Struktur zu filigran wird, bzw. dass die Bewegung der Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuremoleküle und/oder anderer im Reaktionsvolumen befindlicher Reaktanden durch zu viele Oberflächen behindert wird, ist vorzugsweise das Verhältnis der Oberfläche des Heizelements oder der Heizelemente im Verhältnis zur Größe des Reaktionsvolumens vorzugsweise kleiner als 10⁶ m^-1, mehr bevorzugt kleiner als 10⁵ m^-1, viel mehr bevorzugt kleiner als 10⁴ m^-1 und ganz besonders vorzugsweise kleiner als 10³ m^-1.
• Um die dem Reaktionsvolumen von dem Heizelement im Denaturierungsschritt zugeführte Wärme möglichst gering zu halten, kann es vorteilhaft sein, auch die Wärmekapazität der Heizelemente gering zu halten, da zur Erreichung einer gewissen Temperaturerhöhung auf der Oberfläche der Heizelemente eine umso größere Energiemenge benötigt wird, je größer die Wärmekapazität der Heizelement ist. Die im Denaturierungsschritt von den Heizelementen dem Reaktionsvolumen zugeführte Energiemenge breitet sich anschließend auf das gesamte Reaktionsvolumen aus. Die Wärmekapazität des Heizelements ergibt sich dabei aus dem Produkt des jeweiligen Volumens und der spezifischen volumetrischen Wärmekapazität des jeweiligen Materials, aus dem das jeweilige Volumen besteht. Ein wesentlicher Freiheitsgrad bei der Auslegung der Heizelement ist ihre Dimensionierung. Deshalb kann es vorteilhaft sein, das Volumen der Heizelement, insbesondere die Materialstärke, so gering wie möglich zu halten. Hierbei ist bemerkenswert, dass die Wärmediffusionsweite nicht von der Größe der Heizelement, sondern lediglich von der Heizdauer abhängt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt das Volumen aller Heizelemente oder des Heizelements weniger als 10 %, vorzugsweise weniger als 5 %, besonders vorzugsweise weniger als 3 % und ganz besonders vorzugsweise weniger als 1 % des Reaktionsvolumens. Mit dieser Ausführung der Erfindung kann vorteilhafterweise durch einen geringen Volumenfüllfaktor eine geringe Wärmekapazität der Heizelemente erreicht werden.
• Vorzugsweise ist die zumindest eine Extraktionsnukleinsäure direkt an das Heizelement gebunden und/oder indirekt über eine Adapternukleinsäure an das Heizelement gebunden. Alternativ oder zusätzlich weist das Heizelement zumindest eine Adapternukleinsäure auf, über welche die Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement bindet, wenn die Extraktionsnukleinsäure derart bereitgestellt wird, dass die Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement bindet. Mit anderen Worten kann das Binden der Extraktionsnukleinsäure an das Heizelement direkt erfolgen oder indirekt über eine Adapternukleinsäure. Beispielsweise kann dazu die Adapternukleinsäure fest an das Heizelement gebunden sein, und derart ausgestaltet sein, dass die Extraktionsnukleinsäure zumindest teilweise, beispielsweise mittels eines Verbindungs-Abschnitts der Nukleotidsequenz, der sich vorzugsweise von einem anderen Extraktions-Abschnitt unterscheidet, mit der Adapternukleinsäure hybridisieren kann. Dies bietet den Vorteil, dass das Adapterelement mit universellen Adapternukleinsäuren ausgestaltet werden kann und für den gewünschten Zweck auf einfache Weise durch die Zugabe entsprechend ausgebildeter Extraktionsnukleinsäuren in die Probenflüssigkeit individualisiert werden kann.
• Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung.
• Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
• Die Erfindung ist anhand von Ausführungsbeispielen in den Zeichnungen schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
• Figurenliste
• Die 1A bis 1D zeigen in schematischen Darstellungen Heizelemente gemäß zwei bevorzugter Ausführungsformen.
• 2A und 2B zeigen in schematischen Darstellungen eine Vorrichtung gemäß bevorzugten Ausführungsformen zum Extrahieren einer Nukleinsäure aus einer Probenflüssigkeit.
• 3A zeigt ein Beispiel für eine geeignete elektrische Schaltung als Steuereinrichtung und/oder Spannungsversorgung zum Erzeugen elektrischer Impulse für das Heizelement.
• Die 3B und 3C zeigen schematisch und vereinfacht Querschnitte von bevorzugten Ausführungsformen einer Vorrichtung zum Extrahieren einer Nukleinsäure.
• 3D zeigt in einer schematischen Explosionsdarstellung einen Aufbau einer Vorrichtung zum Extrahieren einer Nukleinsäure gemäß einer bevorzugten Ausführungsform.
• Die 4A und 4B zeigen schematisch ein Heizelement mit einer Wabenstruktur.
• Die 5 bis 8 zeigen Graphen mit Fluoreszenzsignalen, welche mit PCR Amplifikations-Reaktionen auf Basis verschiedener Probenflüssigkeiten gemessen wurden.
• Detaillierte Beschreibung der Figuren
• 1A zeigt in einer schematischen Darstellung ein Heizelement 10 gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform. Das Heizelement 10 ist als Draht bzw. Heizdraht 12 ausgebildet, der an seiner Oberfläche mit mehreren Extraktionsnukleinsäuren 14 funktionalisiert ist. Dabei sei erwähnt, dass das Heizelement 10 lediglich schematisch dargestellt ist und ein tatsächlich verwendetes Heizelement 10 andere Abmessungen und insbesondere ein anderes Verhältnis aus Länge zu Durchmesser aufweisen kann. Die Extraktionsnukleinsäuren 14 sind als Oligonukleotide ausgebildet und weisen zumindest teilweise eine Nukleotidsequenz auf, welche zumindest teilweise komplementär zur Nukleotidsequenz zumindest eines Teils der aus einer Probenflüssigkeit zu extrahierenden Nukleinsäure 22 ist. Beispielsweise können die Extraktionsnukleinsäuren 14 mittels einer Thiol- und/oder Schwefel-Bindung an die Oberfläche des Heizelements 10 gebunden sein. Bevorzugt weist das Heizelement 10 eine Oberfläche auf, welche das Binden der Extraktionsnukleinsäuren 14 an das Heizelement 10 bzw. an den Draht 12 begünstigt. Beispielsweise kann das Heizelement 10 bzw. der Draht 12 aus einem Edelmetall, wie etwa aus Gold, gefertigt sein und/oder an der Oberfläche zumindest teilweise mit Gold beschichtet sein, um ein zuverlässiges Binden der Extraktionsnukleinsäuren 14 an das Heizelement 10 zu begünstigen.
• Das Heizelement 10 weist eine Spannungsversorgung 16 auf, mittels welcher das Heizelement 10 mit elektrischer Spannung und/oder elektrischem Strom versorgt werden kann, um das Heizelement 10 zu beheizen und die unmittelbare Umgebung des Heizelements 10, d.h. des beheizten Drahtes 12, lokal zu erwärmen. Ferner kann bei Bedarf optional mittels des Heizelements 10 auch die gesamte Reaktionslösung, die das Heizelement 10 umgibt, global, d.h. vollständig, erwärmt werden. Beispielsweise kann durch Schließen des Schalters 18 eine von der Spannungsquelle 20 bereitgestellte elektrische Spannung an das Heizelement 10 angelegt werden, sodass ein elektrischer Strom in kontrollierbarer Weise durch das Heizelement 10 fließt und dieses resistiv beheizt. Beispielsweise kann der Strom in gepulster Form bereitgestellt werden, um zeitlich und/oder räumlich einen möglichst scharfen Temperaturgradienten in einer Reaktionslösung in der unmittelbaren Umgebung des Heizelements zu erzielen.
• Zur Extraktion der aus einer Probenflüssigkeit zu extrahierenden Nukleinsäure 22 kann das Heizelement 10 zumindest teilweise mit der Probenflüssigkeit bedeckt werden. Beispielsweise kann das Heizelement 10 zumindest teilweise in die Probenflüssigkeit eingetaucht werden und/oder mit der Probenflüssigkeit übergossen werden. Sofern in der Probenflüssigkeit die zu extrahierende Nukleinsäure 22 vorhanden ist und vorzugsweise frei, d.h. ungebunden, vorliegt, kann sich ein Einzelstrang der Nukleinsäure 22 an eine Extraktionsnukleinsäure 14 anlegen und mit dieser hybridisieren, sofern diese noch nicht von einer anderen Nukleinsäure belegt ist. 1B zeigt das Heizelement aus 1A mit daran gebundenen Nukleinsäuren 22, welche aus einer Probenflüssigkeit extrahiert wurden. Die Nukleinsäuren 22 bilden mit den Extraktionsnukleinsäuren 14 zumindest teilweise Doppelstränge. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann das Heizelement 10 dazu verwendet werden, eine für die Hybridisierung der Nukleinsäure 22 mit der Extraktionsnukleinsäure 14 geeignete Temperatur in der unmittelbaren Umgebung des Heizelements 10 bereitzustellen, um etwa die Hybridisierung zu verbessern und/oder zu beschleunigen.
• Wenn die Nukleinsäure 22 über die Extraktionsnukleinsäuren 14 an das Heizelement 10 gebunden bzw. hybridisiert sind, kann das Heizelement 10 mitsamt den Nukleinsäuren 22 wieder von der Probenflüssigkeit separiert werden, wobei die Nukleinsäuren 22 an dem Heizelement 10 verbleiben. Beispielsweise kann das Heizelement 10 aus der Probenflüssigkeit entfernt werden, wenn das Heizelement 10 darin eingetaucht wurde, und/oder die Probenflüssigkeit kann abgegossen und/oder abgesaugt werden. Auch können ein oder mehrere Waschgänge durchgeführt werden, um etwaige Rückstände von der Probenflüssigkeit, welche sich an dem Heizelement 10 abgesetzt haben können, möglichst restlos zu entfernen. Die Waschgänge sind jedoch hinsichtlich der Wasch-Reagenzien bzw. Waschlösungen und/oder hinsichtlich der Durchführung derart zu wählen, dass die Nukleinsäuren 22 auch nach den Waschgängen zumindest teileweise noch mit den Extraktionsnukleinsäuren 14 an das Heizelement 10 gebunden sind.
• Die 1C und 1D zeigen in schematischen Darstellungen ein Heizelement 10 gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, welche weitestgehend der Ausführungsform aus den 1A und 1B entspricht, jedoch hinsichtlich der Funktionalisierung mit Extraktionsnukleinsäuren 14 von dieser abweicht. Während in der in 1A und 1B gezeigten Ausführungsform die Extraktionsnukleinsäuren 14 direkt, bspw. mittels einer Thiol-Bindung, an das Heizelement 10 gebunden sind, sind gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform, welche in den 1C und 1D gezeigt ist, die Extraktionsnukleinsäuren 14 indirekt über Adapternukleinsäuren 15 an das Heizelement 10 gebunden. Beispielsweise können dabei die Adapternukleinsäuren 15 mittels einer Thiol-Bindung an das Heizelement 10 gebunden sein. Die Extraktionsnukleinsäuren 14 können sodann mit einer Adapternukleinsäure 15 hybridisieren und somit indirekt an das Heizelement 10 binden. Dazu können vorzugsweise die Extraktionsnukleinsäuren 14 einen Verbindungsabschnitt aufweisen, über welchen die Extraktionsnukleinsäuren 14 mit einer Adapternukleinsäure 15 hybridisieren können, und einen Extraktionsabschnitt, mittels welchem die Extraktionsnukleinsäuren 14 an die zu extrahierende Nukleinsäure binden können.
• 2A zeigt in einer schematischen Darstellung eine Vorrichtung 24 zum Extrahieren einer Nukleinsäure 22 aus einer Probenflüssigkeit 26. Die Vorrichtung 24 weist ein Reaktionsgefäß 28 auf, welches ein Reaktionsvolumen umschließt, in welchem die Probenflüssigkeit 26 und/oder die Reaktionslösung angeordnet werden kann. Gemäß der Darstellung in 2 ist das Reaktionsgefäß 28 derart mit der Probenflüssigkeit 26 befüllt, dass die in dem Reaktionsgefäß 28 angeordneten Heizelemente 10 mit der Probenflüssigkeit 26 bedeckt sind.
• Die Heizelemente 10 sind dabei fest mit dem Reaktionsgefäß 28 verbunden, d.h. dass die Heizelemente 10 beim Separieren von der Probenflüssigkeit in dem Reaktionsgefäß verbleiben. Insbesondere können die Heizelemente 10 fest mit dem Reaktionsgefäß 28 verbunden sein, sodass diese vorzugsweise eine einstückige Einheit mit dem Reaktionsgefäß 28 bilden. Alternativ können die Heizelemente 10 separat von dem Reaktionsgefäß 28 ausgebildet sein und lediglich in diesem anordenbar und optional befestigbar und/oder verankerbar sein. Die Befestigung und/oder Verankerung kann dabei permanent, also unlösbar, oder lösbar ausgebildet sein. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen kann die elektrische Kontaktierung der Heizelemente 10 über eine Gefäßwand des Reaktionsgefäßes 28 erfolgen. Alternativ oder zusätzlich kann eine elektrische Kontaktierung der Heizelemente 10 über eine Öffnung 30 des Reaktionsgefäßes 28 erfolgen, welche gemäß der gezeigten Ausführungsform mit einem Deckel 32 verschlossen ist. Beispielsweise können Durchführungen bereitgestellt werden, um Anschlussleitungen zur Kontaktierung der Heizelemente 10 in dem Reaktionsgefäß 28 auch bei geschlossenem Deckel 32 zu ermöglichen. Jedes Heizelement 10 kann beispielsweise separat mittels einer eigenen Spannungsquelle (nicht gezeigt) mit elektrischer Energie versorgt werden und/oder alle Heizelemente 10 können über eine gemeinsame Spannungsquelle (10) mit elektrischer Energie versorgt werden.
• Die zu extrahierenden Nukleinsäuren 22 befinden sich zumindest teilweise frei in der Probenflüssigkeit 26. Die Bedingungen, insbesondere die Temperatur zumindest eines Teils der Probenflüssigkeit 26 ist dabei derart gewählt, dass zumindest ein Teil der Nukleinsäuren 22 in der Probenflüssigkeit 26 an die Extraktionsnukleinsäuren 14 zumindest teilweise hybridisieren und somit an jeweils ein Heizelement 10 binden kann. Nach erfolgter Hybridisierung kann die Probenflüssigkeit 26 wieder von den Heizelementen 10 und/oder vom Reaktionsgefäß 28 getrennt bzw. separiert werden. Das Separieren kann beispielsweise durch ein Abgießen und/oder ein Absaugen der Probenflüssigkeit 26 aus dem Reaktionsgefäß 28 erfolgen, wenn die Nukleinsäuren 22 ausreichend Zeit zum Hybridisieren mit den Extraktionsnukleinsäuren 14 hatten. Beispielsweise können dafür wenige Sekunden ausreichend sein. Dadurch, dass die Nukleinsäuren 22 an die Extraktionsnukleinsäuren hybridisiert sind, verbleiben diese beim und nach dem Separieren der Probenflüssigkeit 26 an den Heizelementen 10 und somit in dem Reaktionsgefäß 28.
• Im Anschluss an das Separieren der Probenflüssigkeit 26 von den Heizelementen 10, d.h. beispielsweise nach dem Abgießen und/oder dem Absaugen der Probenflüssigkeit 26, können ein oder mehrere Waschschritte durchgeführt werden, wozu beispielsweise eine oder mehrere Waschreagenzien bzw. Waschlösungen in das Reaktionsgefäß 28 eingefüllt werden, um etwaige Rückstände der Probenflüssigkeit zu entfernen. Die Waschreagenzien und Waschschritte müssen jedoch derart ausgestaltet sein, dass nicht alle Nukleinsäuren 22, welche an die Heizelemente 10 gebunden sind, beschädigt und/oder entfernt werden, sondern zumindest ein Teil der Nukleinsäuren 22, bevorzugt jedoch alle Nukleinsäuren 22, intakt bleibt und an die Heizelemente gebunden bleibt. Dies ist insbesondere deshalb wichtig, um sicherzustellen, dass beim Separieren der einen oder mehreren Reinigungsreagenzien von den Heizelementen 10 die Nukleinsäuren 22 zumindest teilweise an den Heizelementen 10 verbleiben.
• Nach erfolgtem Separieren der Nukleinsäuren 22 von den Heizelementen 10 und dem optionalen einen oder den mehreren Waschgängen können die Heizelemente 10 mit der Reaktionslösung in Kontakt gebracht werden, indem die Reaktionslösung derart in das Reaktionsgefäß 28 gefüllt wird, dass die Heizelemente 10 zumindest teilweise, bevorzugt jedoch vollständig, mit der Reaktionslösung bedeckt sind. Sodann kann durch ein Beheizen zumindest eines Teils der Heizelemente 10, bevorzugt jedoch aller Heizelemente 10, die Reaktionslösung in der unmittelbaren Umgebung der Heizelemente 10 auf eine Temperatur gleich oder größer der Denaturierungstemperatur erwärmt werden, sodass sich die Nukleinsäure 22 von der Extraktionsnukleinsäure 14 löst und frei in die Reaktionslösung übergeht. Dies kann insbesondere der Amplifikation der Nukleinsäure 22 dienen. Die Bindungen der Extraktionsnukleinsäuren 14 an das Heizelement sind jedoch gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform derart gewählt, dass sich die Extraktionsnukleinsäuren 14 vorzugsweise auch beim Beheizen der Heizelemente 10 auf die Denaturierungstemperatur oder in gewissem Maße darüber hinaus nicht von den Heizelementen 10 lösen
• Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen können jedoch die Bindungen der Extraktionsnukleinsäuren 14 an das Heizelement 10 auch derart ausgestaltet sein, dass diese beispielsweise über eine Adapternukleinsäure, also indirekt, an das Heizelement 10 gebunden sind. Insbesondere können die Extraktionsnukleinsäuren 14 zum Binden an das Heizelement 10 mit einer oder mit mehreren Adapternukleinsäuren hybridisieren, um sodann über die eine oder die mehreren Adapternukleinsäuren an das Heizelement zu binden. Die Adapternukleinsäuren sind vorzugsweise fest an das Heizelement 10 gebunden, beispielsweise mittels einer Thiol-Bindung, und verbleiben vorzugsweise auch während und/oder nach dem Beheizen des Heizelements 10 fest an das Heizelement 10 gebunden. Gemäß diesen bevorzugten Ausführungsformen können sich zumindest manche der Extraktionsnukleinsäuren 14, die indirekt an ein Heizelement 10 gebunden sind, während des Beheizens des Heizelements 10 zumindest teilweise von der Adapternukleinsäure und somit von dem Heizelement 10 lösen. Beispielsweise kann dies aufgrund einer zumindest teilweisen Dehybridisierung der Extraktionsnukleinsäuren 14 von der daran gebundenen Adapternukleinsäure erfolgen. Wenngleich sich die Extraktionsnukleinsäuren 14 zumindest teilweise von dem Heizelement 10 lösen, d.h. sich zumindest manche von den Extraktionsnukleinsäuren 14 von dem Heizelement 10 lösen und/oder nur ein Teil der jeweiligen Extraktionsnukleinsäuren 14 von der Adapternukleinsäure dehybridisieren, können die Extraktionsnukleinsäuren 14, die sich von dem Heizelement 10 gelöst haben, dennoch bei Beginn des nächsten darauffolgenden Heizschritts, in dem das Heizelement 10 wieder beheizt wird, in räumlicher Nähe zum Heizelement 10 befinden und/oder wieder an die Adapternukleinsäure gebunden sein, an welche die Extraktionsnukleinsäuren 14 zuvor gebunden war, oder an eine andere Extraktionsnukleinsäuren 14 gebunden sein. Dies kann insbesondere dadurch begünstigt werden, dass in der Reaktionslösung keine Strömung aktiv verursacht wird und/oder dass die aufeinanderfolgenden Heizschritte nur einen geringen zeitlichen Abstand zueinander aufweisen, wie etwa wenige Sekunden. Dadurch kann beispielsweise erreicht werden, dass trotz eines zumindest teilweisen Lösens der Extraktionsnukleinsäuren 14 von dem Heizelement 10 die sich davon gelösten Extraktionsnukleinsäuren 14 zumindest teilweise in der räumlichen Umgebung des Heizelements 10 befinden, welche von dem Heizelement 10 beheizt wird.
• Zur Durchführung der Amplifikation der Nukleinsäure 22 bzw. Nukleinsäuren 22 ist die Reaktionslösung vorzugsweise derart ausgestaltet, dass diese geeignet ist, um darin die Amplifikationsreaktion durchführen zu können. Beispielsweise kann die Amplifikationsreaktion eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) umfassen oder als solche ausgebildet sein. Die Reaktionslösung kann in diesem Fall besonders vorteilhaft als eine Pufferlösung für eine PCR ausgestaltet sein. Das Durchführen der mehreren thermischen Zyklen im Rahmen der PCR, welche ein Aufheizen (zumindest eines Teils) der Reaktionslösung auf eine Denaturierungstemperatur und ein Abkühlen auf eine Hybridisierungstemperatur umfassen, kann dabei lokal in der unmittelbaren Umgebung der Heizelemente 10 durch ein entsprechendes Beheizen der Heizelemente 10 erzielt werden. Bevorzugt ist dazu zumindest auch eine Art von Primern für die PCR an die Heizelemente 10 funktionalisiert und/oder über eine oder mehrere Adapternukleinsäuren an das Heizelement 10 bzw. die Heizelemente 10 gebunden. Besonders bevorzugt sind zumindest ein Teil der Extraktionsnukleinsäuren 14 als Primer für die PCR ausgebildet und haben somit die Funktion als Extraktionsnukleinsäure und die Funktion als Primer inne. Zusätzlich können noch gleiche und/oder andere Primer frei in der Reaktionslösung vorhanden sein und/oder an das bzw. die Heizelement(e) 10 funktionalisiert sein und/oder über eine oder mehrere Adapternukleinsäuren indirekt an das Heizelement 10 bzw. die Heizelemente 10 gebunden sein.
• Beispielsweise kann der erste Durchlauf des Vervielfältigungszyklus der PCR wie folgt durchgeführt werden: Die an die Primer (vorzugsweise als Vorwärtsprimer) bzw. Extraktionsnukleinsäuren 14 hybridisierten Nukleinsäuren werden mittels einer in der Reaktionslösung bereitgestellten Polymerase elongiert, wodurch zu der Nukleinsäure 22, welche die Target-Nukleinsäure darstellt, durch die Verlängerung der Primer am Heizelement 10 zur Target-Nukleinsäure 22 komplementäre Stränge gebildet werden. Die Denaturierung, das heißt das Trennen der Moleküle der Target-Nukleinsäure 22 von den nun elongierten Primern erfolgt nicht durch globales Erwärmen des gesamten Reaktionsvolumens bzw. der gesamten Reaktionslösung, sondern durch einen Heizimpuls der durch einen Stromimpulspuls durch die Heizelemente hervorgerufen wird. Der folgende Durchlauf des Vervielfältigungszyklus der PCR kann in ähnlicher Weise erfolgen: die Moleküle der Original-Target-Nukleinsäure 22 hybridisieren erneut auf an ein oder mehrere Heizelemente gebundene Primer, und die Polymerase elongiert die Primer an den Heizelementen 10 und erzeugt hierbei komplementäre Stränge zur Target-Nukleinsäure 22 (oder zumindest zu einem Teilstück der Target-Nukleinsäure 22). Parallel hierzu können nun andere Primer, beispielsweise Rückwärtsprimer (die entweder frei suspendiert oder ebenfalls Heizelement-gebunden sind), an die elongierten Teile der im ersten Durchlauf des Vervielfältigungszyklus der PCR entstandenen elongierten Heizelement-gebundenen Vorwärtsprimer binden (die nun komplementären Stränge zu zumindest einem Teil der Target-Nukleinsäure 22 darstellen) und die Rückwärtsprimer werden im Folgenden durch die Polymerase entsprechend elongiert. Hierdurch entstehen erstmals echte Kopien zumindest eines Teils der Original Target-Nukleinsäure 22. Das Denaturieren, das heißt das Trennen der durch Elongation durch die Polymerase erzeugten Doppelstränge (die in jedem Fall wieder an die Heizeinrichtung 10 gebunden sind) erfolgt nun wieder durch einen Heizimpuls der durch einen Strompuls durch die Heizelemente 10 hervorgerufen wird. Ab dem dritten Durchlauf des Vervielfältigungszyklus der PCR dienen nun sowohl Original Target-Nukleinsäure 22 als auch die durch Elongation der Primersequenzen durch die Polymerase erzeugten Nukleinsäurestränge (je nach Ausführungsform frei im Reaktionsvolumen suspendiert oder Heizelement-gebunden) als Vorlage für die weitere Vervielfältigung. Sie werden durch Hybridisierung an entsprechende Primer (je nach Ausführungsform frei in Lösung oder gebunden an ein Heizelement), anschließende Elongation durch die Polymerase und darauf folgendes Denaturieren mittels eines lokalen Heizimpulses, der durch einen Stromimpuls durch die Heizelemente 10 hervorgerufen wird, amplifiziert. Der zuletzt beschriebene Durchlauf des Vervielfältigungszyklus der PCR wird vorzugsweise mehrfach wiederholt, um in jedem weiteren Durchlauf weitere Kopien zumindest von Teilen der Target-Nukleinsäure 22 zu erzeugen. Die Wiederholung der Durchläufe erfolgt zum Beispiel so oft, bis ausreichend viele Kopien zumindest von Teilen der Target-Nukleinsäure 22 vorliegen, um einen Nachweis der erfolgten Vervielfältigung bzw. des ursprünglichen Vorhandenseins der Target-Nukleinsäure 22 in der Probe durchführen zu können. Mit einem der weiter oben beschriebenen Verfahren, zum Beispiel mit Fluoreszenzverfahren, welche sich beispielsweise einer TaqMan-Chemie, einem Molecular Beacon und/oder interkalierender Farbstoffe, wie etwa SybrGreen, bedienen, können die so erzeugten Amplikons vorzugsweise detektiert werden.
• 2B zeigt in einer schematischen Darstellung eine Vorrichtung 24 zum Extrahieren einer Nukleinsäure 22 aus einer Probenflüssigkeit 26 gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform. Diese entspricht weitgehend der in 2A gezeigten Ausführungsform, verfügt jedoch abweichend von dieser zusätzlich über eine externe Heizvorrichtung 33. Die Heizvorrichtung 33 ist dabei als ein Heizblock ausgebildet, in welchem das Reaktionsgefäß 28 angeordnet werden kann, sodass ein thermischer Kontakt zwischen dem Reaktionsgefäß 28 und der Heizvorrichtung 33 besteht. Mittels der Heizvorrichtung 33 kann sodann beispielsweise die Reaktionslösung 26 auf eine Basistemperaturgebracht werden und/oder auf der Basistemperatur gehalten werden.
• Somit kann die Heizvorrichtung 33 insbesondere dazu dienen, die Reaktionslösung 26 im Reaktionsgefäß 28 global zu temperieren, was während der Extraktion der Nukleinsäure 22 und/oder bei einer nachfolgenden Amplifikation bzw. PCR vorteilhaft sein kann, beispielsweise um eine effiziente Hybridisierung zu erzielen.
• 3A zeigt ein Beispiel für eine geeignete elektrische Schaltung 100 als Steuereinrichtung und/oder Spannungsversorgung 11 zum Erzeugen elektrischer Impulse, um das oder die Heizelemente 10 mit elektrischem Strom zu beaufschlagen. Die Schaltung ist so aufgebaut, dass zwischen Masse (GND) und U+ eine Spannung (in dieser Schrift immer als „U“ bezeichnet) angelegt wird (zum Beispiel zwischen 5 und 50V), mit der die Heizeinrichtung geheizt werden soll. An die Stelle R3 „Load“ wird die Heizeinrichtung angeordnet, sodass R3 der Widerstand der Heizeinrichtung ist. Der beispielsweise verwendete Leistungs-MOSFET Q1 (IRFP4468, International Rectifyer) stellt im durchgeschalteten Zustand eine niederohmige Verbindung zwischen Kontakt T2 und Kontakt T3 her, sodass ein Strom durch die Heizeinrichtung R3 fließt. Zwischen Masse und dem Gate (Kontakt T1) des MOSFETs wird über den Steueranschluss FET GND rt/ge eine Steuerspannung, die beispielsweise von einem Puls- oder Frequenzgenerator oder einem Digital-Analogwandler bereitgestellt wird, angelegt. Besonders geeignet sind Impulse mit einer Höhe von 5V und einer Dauer von zum Beispiel zwischen 50 und 500 µs, die ein sauberes Durchschalten des MOSFETS erlauben. An der Stelle C1 ist ein Kondensator mit ausreichender Kapazität, zum Beispiel >4 mF, und möglichst niedrigem ESR-Wert vorgesehen, der es ermöglicht, auch bei niederohmigen Heizelementen 10 - Widerstand aller Heizelemente zusammen typischerweise kleiner als 0,5 Ω (Ohm) - die angelegte Spannung für die Dauer des Heizimpulses aufrecht zu erhalten. Die Widerstände R1, R2, R7 und R9 haben zum Beispiel Widerstandswerte von 1, 100 und 24 kΩ (Kiloohm).
• 3B zeigt schematisch und vereinfacht den Querschnitt einer Ausführungsform einer Vorrichtung 24 zum Extrahieren einer Nukleinsäure 22, welche mehrere Reaktionsgefäße 28 aufweist und bei der die Heizelemente 10 von Abschnitten eines durch die mehreren Reaktionsgefäße 28 durchgehenden Drahtes 12 gebildet werden, der an eine Spannungsquelle 20 angeschlossen ist. Der Draht ist dabei mit Oligonukleotiden funktionalisiert, welche jeweils sowohl als Extraktionsnukleinsäure 14 als auch als Primer für eine Amplifikationsreaktion dienen. Zur Vereinfachung der Darstellung wurde auf die Darstellung der Vorrichtung zur Erzeugung von elektrischen Impulsen verzichtet; außerdem wurde auf eine maßstabsgetreue Figur verzichtet. Der Draht 12 durchläuft mehrere voneinander getrennte Reaktionsgefäße 28 in Form von Probenflüssigkeitskammern (auch als „Wells“ bezeichnet) in einer Probenplatte 34, die sich zwischen einem zweiteiligen Temperierblock 36 befindet, der als externe Heizvorrichtung dient. Der Temperierblock 36 hat die Funktion, die Reaktionsvolumina in den Reaktionsgefäßen 28 auf Hybridisierungs-/Elongationstemperatur zu bringen und zu halten. Beispielsweise kann der Temperierblock 36 als ein Heizblock und/oder als ein Kühlblock ausgebildet sein. Zum In-Kontakt-Bringen und/oder Separieren der Heizelemente 10 mit der Probenflüssigkeit und/oder mit der Reaktionslösung kann die Probenflüssigkeit 26 bzw. die Reaktionslösung in die Reaktionsgefäße 28 gefüllt werden bzw. daraus abgesaugt werden.
• In der hier gezeigten Ausführung befinden sich im unteren Teil des Temperierblocks 36 unter jedem Reaktionsgefäß 28 eine Anregungslichtquelle (in diesem Fall in Form einer Leuchtdiode 38 mit einem optischen Tiefpass-Filter) zum Anregen eines Farbstoffes im jeweiligen Reaktionsvolumen und im oberen Teil des Temperierblocks 14 über jeder Probenflüssigkeitskammer eine Fotodiode 40 als Lichtsensor zum Detektieren der Fluoreszenz des angeregten Farbstoffes im jeweiligen Reaktionsvolumen (mit einem optischen Hochpassfilter, der das Fluoreszenzlicht durchlässt). Diese lassen sich beispielsweise zur Detektion der amplifizierten Nukleinsäure 22 unter Verwendung von geeigneten Farbstoffen, wie etwa interkalierender Farbstoffe und/oder TaqMan-Sonden, nutzen. Die Signale der Lichtsensoren lassen sich z.B. mit einem Analog-Digitalwandler auslesen und so der zeitliche Verlauf des Fluoreszenzsignals beobachten. Insbesondere kann vorzugsweise in Echtzeit während der Durchführung der PCR das Fluoreszenzlicht als Funktion der PCR-Zyklen aufgenommen werden, um auf diese Weise eine Echtzeit-PCR („Real-Time PCR“) zu ermöglichen.
• 3C zeigt schematisch und vereinfacht den Querschnitt einer Vorrichtung 24 zum Extrahieren einer Nukleinsäure 22 gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, die sich von dem Ausführungsbeispiel der 3B dadurch unterscheidet, dass die Heizelemente 10 als Spulen aus Abschnitten eines an eine Spannungsquelle 20 angeschlossen Drahts 12 ausgeführt sind. Zur Vereinfachung der Darstellung wurde auch hier auf die Darstellung der Vorrichtung zur Erzeugung von Pulsen verzichtet. Die Heizelemente 10 in Form von zu Spulen aufgewickelten Drahts 12 stehen mit dem Reaktionsvolumen in dem jeweiligen Reaktionsgefäß 28 in Kontakt. Anders als in der Figur dargestellt, sind sie vorzugsweise vollständig von der Reaktionslösung umgeben. Die Reaktionsgefäße 28 sind in diesem Ausführungsbeispiel als mehrere voneinander getrennte Probenflüssigkeitskammern in Form von Reaktionstubes ausgebildet, die sich in einem Temperierblock 36 befinden, um die Reaktionsvolumina auf Hybridisierung/-Elongationstemperatur zu bringen und zu halten. In der hier gezeigten Ausführung befindet sich im unteren Teil des Temperierblocks 36 unter jeder Probenflüssigkeitskammer eine Leuchtdiode 38 als Anregungslichtquelle zum Anregen eines Farbstoffes im Reaktionsvolumen und über jeder Probenflüssigkeitskammer eine Fotodiode 40 als Lichtsensor zum Detektieren der Fluoreszenz des angeregten Farbstoffes im Reaktionsvolumen.
• 3D zeigt schematisch Komponenten, aus denen eine Probenplatte einer Vorrichtung zum Extrahieren einer Nukleinsäure 22 gemäß einer bevorzugten Ausführungsform mit Draht-Heizelementen 10 geschaffen werden kann. Als Heizelemente 10 dienen hier Abschnitte eines vergoldeten Mantel-Drahts 12 von 25 µm Durchmesser (24,8 µm Wolfram-Kern mit ca. 100 nm Gold-Mantel, LUMA-METALL AB, Kalmar, Schweden). Dieser wird um eine Acrylglasplatte 42 mit einer Dicke von 0,5 mm gewickelt (mittlere, hell dargestellte Platte). In der Acrylglasplatte 42 sind sieben Öffnungen (6 mm x 6 mm) vorhanden, durch welche die Reaktionsgefäße 28 bzw. Probenflüssigkeitskammern (Wells) gebildet werden. Durch die Wicklung des Drahtes 12 entstehen in jedem Reaktionsgefäß 28 (diese sind nur bei zusammengesetzter Vorrichtung erkennbar) zwei parallele Schichten aus je 25 parallelen Heizelementen 10 (auch eine andere Zahl an Heizelementen zwischen typischerweise 10 und 75 Heizelementen je Lage können vorteilhaft sein). Die beiden Lagen von Heizelementen 10 haben durch die Platte einen Abstand von 0,7 mm voneinander, die Heizelemente 10 innerhalb einer Schicht haben einen Abstand von ca. 0,24 mm voneinander. Von beiden Seiten wird beispielsweise mithilfe von beidseitig klebenden Folien 44 (dunkel dargestellt, 100-250 µm starkes VHB Klebeband von 3M) mit entsprechenden Aussparungen für die Probenflüssigkeitskammern auf die umwickelte Platte 42 je eine weitere Acrylglasplatte 46 (Dicke der unteren Platte 0,5 mm und Dicke der oberen Platte 3 mm) mit gleichen Öffnungen aufgeklebt und gemäß den Herstellerangaben des Klebebands 44 verpresst. Von unten sind die Wells bzw. Reaktionsgefäße z.B. mit einer dünnen Folie 48 (hell dargestellt, Adhesive PCR Foil Seal, 4titute) verschlossen, die auf die untere Acrylglasplatte 46 aufgeklebt ist. Auf diese Weise entsteht eine Probenplatte mit sieben Wells, die von parallelen Drähten 12 als Heizelemente 10 durchzogen werden. Die Drähte 12 werden an den beiden außenliegenden Enden der Probenplatte miteinander verbunden (das heißt alle Drähte/Heizelement sind parallel geschaltet) und elektrisch kontaktiert. Dadurch wird ermöglicht, dass Stromimpulse seriell durch alle Wells bzw. Reaktionsgefäße 28 geschickt werden können. Die Öffnungen der Probenplatte (hier oben) können anschließend mit einer dünnen Folie 50 (hell dargestellt) verschlossen werden. Die Probenplatten haben gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform eine Breite von 20 mm und eine Länge von 90 mm (so dass die Spannung der Heizpulse im Wesentlichen über eine Länge von ca. 96 mm abfällt, wenn man die 3 mm Überstand der Drähte 12 an den Enden der Probenplatte berücksichtigt, die für eine Kontaktierung erforderlich sind). Typischerweise ergibt sich ein elektrischer Widerstand von insgesamt ca. 250 Milliohm über die Länge der Probenplatte (mit 50 parallel geschalteten Drähten).
• In den 4A und 4B ist eine bevorzugte Ausführungsform eine Anordnung von Heizelementen 10 schematisch dargestellt, wobei die Heizelemente 10 zusammenhängend, einstückig ausgebildet sind und zusammen eine Heizeinrichtung 52 bilden. Die Heizelemente 10 bzw. die Heizeinrichtung 52 weisen eine Wabenstruktur auf. Zur Herstellung wird durch fotochemische Feinätzverfahren aus einer Edelstahl-Folie eine Wabenstruktur erzeugt und anschließend mit Gold beschichtet. In dem Ausführungsbeispiel handelt es sich um ein hexagonales Gitter, aber natürlich sind auch andere Gitter bzw. Muster denkbar. Der Strom durchfließt die Struktur der Länge nach, wobei, wie in 4A dargestellt, nur im Bereich der Reaktionsgefäße (in dieser Figur nicht gezeigt), also dort, wo die Folie die wabenförmigen Heizelemente 10 bildet, die in einem Reaktionsgefäß 28 angeordnet werden sollen, eine Wabenstruktur geätzt wurde. Die Länge f eines Heizelements 10 beträgt zum Beispiel 8,2 mm, der Abstand g zwischen den Heizelementen 10 beträgt zum Beispiel 3,8 mm. Die Probenkammern bzw. Reaktionsgefäße 28 sind vorzugsweise mittig über den Heizelementen 10 angeordnet und haben vorzugsweise kleinere Abmessungen (zum Beispiel 6 mm × 6 mm) als die Heizelemente 10, um nur den Bereich der Heizelemente 10 zu nutzen, der möglichst gleichmäßig temperiert wird. Die gesamte Länge h der Folie beträgt zum Beispiel 100 mm; das heißt, die elektrische Kontaktierung findet an den kurzen Seiten statt, so dass die Spannung über eine Länge von ca. 100 mm abfällt. Die Stege der Wabenstruktur erwärmen sich aufgrund des durchgeleiteten Stroms und können die auf sie gebundene doppelsträngige Nukleinsäure denaturieren.
• 4B ist eine vergrößerte Darstellung der Wabenstruktur eines Heizelements 10 der 4A mit angrenzendem Rand. In der beispielhaft dargestellten Wabenstruktur sind die Stegbreiten derart ausgelegt, dass überall in der Wabenstruktur eine möglichst gleichmäßige Stromdichte und somit volumetrische Heizdichte erreicht wird. Im Ausführungsbeispiel wird dies dadurch erreicht, dass die Breite d der Längsstege gerade das doppelte der Breite b der Querstege beträgt. Beispiele für die Bemaßungen sind 0,87 mm für den Wabendurchmesser a, 0,065 mm für die Breite b der Querstege, 0,5 mm für die Steglänge c, 0,13 mm für die Breite der Längsstege d und 0,57 mm für die Breite eines langen Randes e. Der lange Rand e dient vor allem der mechanischen Stabilität und erfährt eine andere Stromdichte als die Wabenstruktur.
• Im Folgenden wird die Erfindung anhand von technischem Hintergrund und von Beispielen näher erläutert, ohne dass die Erfindung jedoch auf diese Beispiele beschränkt ist. Bei den Beispielen handelt es sich vielmehr um mögliche, bevorzugte Ausführungsformen anhand welcher die Funktion der Erfindung näher erläutert wird.
• Beispiele
• Enzymatische Lyse
• Die folgenden Erläuterungen betreffen die Herstellung einer Probenflüssigkeit. Eine Rinder-Vollblutprobe mit 0,4mM Tris-EDTA wird mit einer definierten Menge an MRSA Bakterien versetzt und als Probenflüssigkeit bereitgestellt. Zum Lysieren der MRSA Bakterien werden anschließend die Enzyme Lysozym und Lysostaphin zur Probenflüssigkeit hinzugefügt, damit eine Endkonzentration von 0.1U/µl von Lysostaphin und 2ng/µl von Lysozym erreicht wird. Diese mit Enzymen versetzte Zell-Suspension, welche die Probenflüssigkeit bildet, wird für 5min bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Zell-Suspension mit gelöster ProteinaseK (Menge: 15% vom Probenvolumen) gemischt. Des Weiteren wird ein AL Puffer von Qiagen hinzugefügt (Menge: 51% von mit ProteinaseK versetztem Probenvolumen). Diese Suspension wird für 5 min bei 550 rpm (Umdrehungen pro Minute) und 56°C in einem Thermoschüttier inkubiert. Abschließend wird das Lysat für 10 Minuten bei 99°C inaktiviert, wobei auch die genomische DNA denaturiert und fragmentiert wird.
• Vorab-Funktionalisierung der Heizelemente mit Extraktionsnukleinsäuren und Primern
• Die in Reaktionsgefäßen einer Reaktionsplatte vorhandenen Heizelemente, welche als Gold-beschichtete Drähte ausgebildet sind, werden für manche bevorzugte Ausführungsformen vorab, d.h. vor Zugabe der Probenflüssigkeit, mit einer Funktionalisierungslösung (siehe Tabelle 2) für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Für die anschließende Verwendung zum Extrahieren von Nukleinsäuren wird jedes Reaktionsgefäß zunächst fünfmal mit deionisiertem Wasser gewaschen, wobei nach jedem Waschen das Wasser aus der Reaktionskammer entfernt wird.
• Extraktion der Nukleinsäure mit vorab-funktionalisierten Heizelementen
• Die Extraktion der Nukleinsäure aus der Probenflüssigkeit unter Verwendung der wie oben beschrieben vorab mit Extraktionsnukleinsäuren funktionalisierten Heizelementen erfolgt im Wesentlichen im Rahmen einer Vorhybridisierung der Nukleinsäuren mit den Extraktionsnukleinsäuren, welche an die Heizelemente gebunden sind. Die Extraktion umfasst zumindest einen Hybridisierungsschritt und einen oder mehrere Waschschritte. Der Hybridisierungsschritt wird in zwei Schritte aufgeteilt. Bei dem ersten Hybridisierungsschritt wird die Probenflüssigkeit, welche als enzymatisches Lysat vorliegt, in das Reaktionsgefäß mit den funktionalisierten Heizelementen pipettiert. Das Reaktionsgefäß wird anschließend mit einer selbstklebenden Folie versiegelt und dann für 5 min bei 45°C inkubiert, wobei die Erwärmung durch eine externe Heizvorrichtung realisiert wird (d.h. nicht über die als Heizelemente dienenden Drähte, sondern durch einen unter und über dem Probenträger befindlichen Heizblock). Bei dem zweiten Hybridisierungsschritt wird das mit dem Lysat befüllte Reaktionsgefäß nach einer zweiminütigen Ruhephase bei Raumtemperatur entsiegelt. Bei einem Waschschritt wird jedes Reaktionsgefäß mit einer speziellen Waschlösung (siehe Tabelle 4) zweimal gewaschen und dabei die Waschlösung nach jedem Waschen wieder entfernt. Nach der Extraktion der Nukleinsäure wird die für die PCR benötigte Reaktionslösung zum Nachweis des im MRSA-Genom vorkommenden Resistenzgens MecA (siehe Tabelle 1) in jedes der Reaktionsgefäße pipettiert, welches anschließend wieder versiegelt wird. Die für die Amplifikation benötigten Temperaturen werden gemäß diesem Beispiel durch eine Vorrichtung zum Amplifizieren einer Nukleinsäure mit den Einstellungen aus Tabelle 3 bereitgestellt, wobei die Vorrichtung über eine als Heizblock ausgebildete externe Heizvorrichtung 33 aufweist, deren Blocktemperatur beispielsweise auf die gewünschte Basistemperatur eingestellt werden kann, um dadurch die Reaktionslösung 26 auf die Basistemperatur zu temperieren. Ferner weist die Vorrichtung einen beheizbaren Deckel 32 auf, welcher das Reaktionsgefäß 28 verschließt und derart temperiert werden kann, dass eine Kondensation des dampfförmigen Anteils der Reaktionslösung 26 am Deckel 32 zu vermeiden oder zu reduzieren. Besonders bevorzugt wird dazu die Temperatur des Deckels 32 auf eine Temperatur gebracht, die die Basistemperatur um wenige Grad Celsius übersteigt. Der Deckel 32 kann beispielsweise auch als Heizblock ausgebildet sein und derart ausgestaltet sein, dass dieser mehrere Reaktionsgefäße 28 gleichzeitig abdecken kann.
• Nukleinsäu revervielfältig ung
• Alle im Folgenden genannten Sequenzen sind im Anhang am Ende der Beschreibung aufgelistet. Tabelle 1: Auflistung der Bestandteile für die Reaktionslösung zur Durchführung der Amplifikationsreaktion:

  Substanz	Konzentration
  H2O	-
  Tris pH 9	20 mM
  MgCl2	3 mM
  Apta Taq Genotyping Master (Roche)	1 x
  Reverse-Primer mit Sequenz 1 (siehe Anhang):	500 nM
  TaqMan-Probe mit Sequenz	50 nM
  5'FAM-[Sequenz 2]-3'BHQ1
  Uracil-DNA glycosylase UDG (PEQLAB)	2.4 U/µl

  Tabelle 2: Bestandteile der Funktionalisierungslösung:

  Substanz	Konzentration
  Phosphatpuffer pH 7	5 mM
  NaCI	10 mM
  MgCl2	100 mM
  Thiol-modifizierter Forward-Primer mit Sequenz	100 mM
  5'Thiol - [Sequenz 3] /iSp9/ [Sequenz 4]

• Die Bezeichnung /iSP9/ indiziert dabei eine abasische Modifikation „Spacer 9“, welche dazu dient, ein Überschreiben bzw. Komplementieren der Multi-A Abstandshalter-Sequenz (Sequenz 3) durch die Polymerase zu verhindern. Dabei handelt es sich um einen internen Spacer, d.h. dass der Spacer nicht an einem Ende der Oligonukleotide eingebaut ist, sondern intern die Nukleotidkette integriert ist. Die Abstandshalter-Sequenz bzw. Spacer-Sequenz, die zwischen der 5'Thiol Bindestelle und der Extraktionssequenz (Sequenz 4) angeordnet ist, kann den Vorteil bieten, dass aufgrund des größeren Abstands der Extraktionssequenz von dem Heizelement diese räumlich besser zugänglich ist. Vorzugsweise wird für die Amplifikationsreaktion die Reaktionslösung mit einem Volumen von zumindest 10 µl und höchstens 100 µl bereitgestellt. Tabelle 3: Physikalische Parameter zur Durchführung einer anschließenden PCR-Amplifikationsreaktion mittels lokalen Heizens der Heizelemente der Vorrichtung bzw. im Probenträger:

  Parameter	Wert
  Spannung	-38 V
  Gesamt-Heizwiderstand der Heizelemente (49 Drähte mit 25 µm Durchmesser)	~ 250 mΩ
  Pulsdauer	150 µs
  Zyklusdauer	1.5 s
  Blocktemperatur = Basistemperatur (externer Heizblock unterhalb des Probenträgers)	66 °C
  Deckeltemperatur (externer Heizblock als beheizbarer Deckel, der zur Vermeidung von Kondensation auf dem Probenträger bzw. auf den Reaktionsgefäßen aufliegt)	73 °C
  Vorheizdauer auf die Basistemperatur (Gewährleistet durch externe Heiz-Blöcke der externen Heizvorrichtung)	120 s

• Bei den gewählten physikalischen Parametern wird pro Denaturierungsschritt in jedem PCR Zyklus etwa eine Energie von W ≈ 150µs • (38V)²/250mΩ ≈ 0,9 J eingebracht. Diese Energie verteilt sich auf die gesamten Probenplatte und die PCR-Reaktionslösung, die in der gesamten Probenplatte ein Volumen von etwa 0,5ml aufweist (z.B. wenn in 8 Kammern jeweils ca. 62µl PCR Volumen verwendet wird). Selbst wenn man davon ausgeht, dass die Wärmekapazität der Probenplatte, und der Heizelemente vollständig vernachlässigbar sind und die gesamte Energie nur in die Reaktionslösung eingebracht wird, beträgt die globale Temperaturerhöhung in der Reaktionslösung maximal $\mathrm{\Delta }\text{T}=\frac{\text{W}}{\text{m}\cdot \text{c}}=\frac{\mathrm{0,9}\text{J}}{\mathrm{0,5}\text{3ml}\cdot \text{1}\frac{\text{g}}{\text{ml}}\cdot \mathrm{4,2}\frac{\text{J}}{\text{g}\cdot °\text{C}}}=\mathrm{0,43}°\text{C},$

  

  wobei hier für die Wärmekapazität c der Reaktionslösung der Wert für Wasser (c=4,2 J/(g°C)) angenommen wurde.
• Um hingegen einen Temperaturanstieg von min. 20°C in solch einer PCR-Lösung während des Denaturierungsschritts in einer herkömmlichen PCR zu erreichen, müsste man hingegen folglich eine Energie von min. $\text{W}=\text{m}\cdot \text{c}\cdot \mathrm{\Delta }\text{T}=\mathrm{0,5}\text{ml}\cdot \text{1}\frac{\text{g}}{\text{ml}}\cdot \mathrm{4,2}\frac{\text{J}}{\text{g}\cdot °\text{C}}\cdot 20°\text{C}=42\text{J}$

  

  einbringen.
• Während der gesamten PCR-Dauer wird für jede der Probenkammern die Fluoreszenz einer TaqMAN-Sonde aufgenommen, die einen FAM-Farbstoff als Emitter verwendet. Hierzu wird jede Probenkammer während der PCR mit Anregungslicht beleuchtet und das Emissionslicht aufgezeichnet, um auf diese Weise Echtzeit-Daten aufzunehmen. Tabelle 4: Bestandteile der Waschlösung für die Reinigung der Heizelemente zum Entfernen von Rückständen der Probenflüssigkeit:

  Substanz	Konzentration
  H2O	-
  MgCl2	9 mM
  Tris pH 8	10 mM

• Amplifikation der Nukleinsäuren ohne vorherige Extraktion
• Als Referenzversuch wurde eine PCR Reaktion mit der gleichen Vorrichtung ohne vorherige Extraktion durchgeführt. Dabei waren die Heizelemente mit Primern für die PCR funktionalisiert, jedoch werden die Heizelemente nicht vor der Amplifikation mit einer Probenflüssigkeit in Kontakt gebracht. Anstatt dessen wurden die Heizelemente gleich zu Beginn mit einer Reaktionslösung für die PCR in Kontakt gebracht, in welche sodann eine vorbestimmte (geringe) Menge von Probenflüssigkeit mit der Zielnukleinsäure als Target in die Reaktionslösung eingebracht wurde. Insbesondere ist dabei die Menge der Probenflüssigkeit, welche in die Reaktionslösung eingebracht wird, so gering, dass diese die Durchführung der PCR in der Reaktionslösung nicht behindert und/oder verhindert. Dabei wurde für verschiedene Messungen unterschiedlich viel des Blut-Lysats bzw. der Probenflüssigkeit direkt in die Reaktionslösung eingesetzt. Bei einem Blut-Lysat, das 100 ColonieFormingUnits (CFUs) MRSA Bakterien pro Mikroliter (CFU)/µl enthielt (und deren DNA während der enzymatischen Lyse freigesetzt wurde) konnte ein positives TaqMan-Fluoreszenz-Signal nach ca. 8 Minuten detektiert werden, wenn das Blut-Lysat direkt der Reaktionslösung beigemischt wurde und nur 1% des finalen PCR-Reaktionsvolumens ausmacht (0,6µl Blut-Lysat bei 60µl PCR-Gesamtvolumen). Erhöht man jedoch die beigemischte Menge des Blut-Lysats auf 3% des finalen PCR-Reaktionsvolumens so ist kein positives TaqMan-Fluoreszenz-Signal mehr detektierbar. In diesem Fall wären zwar aufgrund der höheren eingesetzten Probenmenge auch mehr DNA-Kopien in die Reaktionslösung eingesetzt, jedoch sind diese nicht mehr amplifizierbar bzw. detektierbar, da zu viel störende Bestandteile bzw. Substanzen aus dem Blut-Lysat in die PCR-Reaktion bzw. in die Reaktionslösung gelangt sind und die Reaktionslösung dadurch zu stark verunreinigt wurde.
• Die Ergebnisse dieser Messungen sind in dem Graphen in 5 dargestellt, bei welchem auf der horizontalen Achse die Zeit in Minuten und auf der vertikalen Achse das gemessene Fluoreszenzsignal in willkürlichen Einheiten aufgetragen sind. Die dargestellten Graphen stellen die Amplifikationskurven der PCR-Reaktionen dar, wobei die durchgezogene Linie die Messung darstellt, bei welcher 1% Blut-Lysat in die Reaktionslösung gemischt wurde und die gestrichelte Linie die Messung, bei welcher 3% Blut-Lysat in die Reaktionslösung gemischt wurde. Das Blut-Lysat enthielt dabei jeweils 100 CFU/µl. Beim Vergleich der beiden Amplifikationskurven ist deutlich erkennbar, dass die PCR Reaktion mit 3% Blut-Lysat in der Reaktionslösung kein positives Amplifikationsergebnis erzielte, obwohl die Anzahl bzw. Konzentration der CFUs bzw. der daraus freigesetzten Nukleinsäuren dreimal so groß ist, als im Fall der anderen Amplifikationskurve. Die Amplifikationskurve der Messung mit 1% Blut-Lysat in der Reaktionslösung (durchgezogene Linie) zeigt jedoch nach ca. 8 Minuten einen starken Anstieg des Amplifikationssignals und indiziert somit ein positives Amplifikationsergebnis. Daran lässt sich erkennen, dass eine Verbesserung der Sensitivität der Amplifikationsreaktion nicht lediglich durch eine Erhöhung der Konzentration eines der Reaktionslösung beigemischten Blut-Lysats bzw. einer der Reaktionslösung beigemischten Probenflüssigkeit erreicht werden kann, da in diesem Fall die in der Probenflüssigkeit bzw. in Blut-Lysat enthaltenen Substanzen die Amplifikationsreaktion stören und/oder einen Nachweis verhindern.
• Reduziert man die ursprünglich zugefügte Menge an Bakterien bzw. CFUs im Blut-Lysat, so dass das Blut-Lysat nur noch 1 CFU/µl enthält, können weder bei 1% noch bei 3% Blut-Lysat-Anteil in der PCR-Reaktion die Nukleinsäuren positiv nachgewiesen werden. Im Fall von 1% Probenanteil ist zwar angesichts der in 5 dargestellten Ergebnisse keine starke Inhibierung bzw. Beeinträchtigung der Amplifikationsreaktion zu erwarten, aber statistisch gelangen nur noch Nukleinsäuren aus sechs CFUs in die Amplifikationsreaktion, was unter den gegebenen Umständen nicht mehr zuverlässig nachweisbar ist. Die Ergebnisse dieser Vergleichsmessung sind in 6 dargestellt, in welcher ebenfalls auf der horizontalen Achse die Zeitdauer in Minuten und auf der vertikalen Achse das Fluoreszenzsignal in willkürlichen Einheiten aufgetragen ist. Beide Amplifikationsreaktionen, bei welchen das Blut-Lysat vor der Beimischung lediglich eine Bakterien-Konzentration von 1 CFU/µl aufwies, liefern kein detektierbares Amplifikationssignal, weder mit 1% (durchgezogene Linie) noch mit 3% Anteil von beigemischtem Blut-Lysat in der Reaktionslösung.
• Extraktion und anschließende Amplifikation der Nukleinsäuren
• In weiteren Experimenten wurden jeweils 80 µl Blut-Lysat als Probenflüssigkeit mit einer Bakterien-Konzentration von 100 CFU/µl bzw. 1CFU/µl mit einem Extraktionsverfahren gemäß einer bevorzugten Ausführungsform behandelt, um die zu amplifizierende Nukleinsäure vor der Amplifikation zumindest teilweise aus der Probenflüssigkeit zu extrahieren. Dazu wurden die als Heizelemente verwendeten Drähte in den Reaktionskammern nach Vorab-Funktionalisierung mit Extraktionsnukleinsäuren, die in der Amplifikation auch als Forward-Primer dienen mit dem jeweiligen Blut-Lysat, d.h. mit der Probenflüssigkeit, in Kontakt gebracht, indem die jeweilige Probenflüssigkeit in die Reaktionsgefäße eingefüllt wurde. Die Nukleinsäure aus der Probenflüssigkeit konnte sodann mit den als Oligonukleotide an den Heizelementen gebundenen Extraktionsnukleinsäuren, die vorab an die Drähte funktionalisiert wurden, hybridisieren. Hierzu wurde der gesamte Probenträger und somit auch die Probenlösung und die Heizelemente in den Probenkammern bzw. Reaktionsgefäße von einem externen Heizblock unterhalb des Probenträgers auf 45°C temperiert und 5 Minuten zum Ermöglichen der Hybridisierung auf dieser Temperatur, gefolgt von einer zweiminütigen Ruhephase bei Raumtemperatur. Das Entfernen der Probenflüssigkeit und die daran anschließenden Waschschritte entfernten die für die Amplifikationsreaktion schädlichen Bestandteile bzw. Substanzen aus der Probenflüssigkeit und hinterlassen die an den Draht hybridisierten, extrahierten Nukleinsäuren. Anschließend wurde jedes Reaktionsgefäß mit 60 µl Reaktionslösung, welche als PCR-Mastermix gemäß Tabelle 1 bereitgestellt wurde, befüllt und die PCR wurde unter Verwendung von lokalem Heizen mittels der Heizelemente durchgeführt.
• Die Ergebnisse dieser PCR-Reaktionen sind in einem Graphen in 7 dargestellt, bei welchem abermals die Zeitdauer in Minuten auf der horizontalen Achse und das Fluoreszenzsignal auf der vertikalen Achse aufgetragen sind. Die PCR, bei welcher die Probenflüssigkeit eine Bakterienkonzentration von 100 CFU/µl aufwies (durchgezogene Linie), zeigt nun schon nach ca. 3 Minuten ein positives Amplifikationsergebnis bzw. Fluoreszenzsignal und selbst die PCR, bei welcher die Probenflüssigkeit eine Bakterienkonzentration von nur 1 CFU/µl aufwies (gestrichelte Linie), liefert ein eindeutiges Fluoreszenzsignal, welches nach ca. 8 Minuten ansteigt, und ein eindeutiges Amplifikationsergebnis liefert. Wurde hingegen ein Blut-Lysat eingesetzt, das zuvor nicht mit MRSA-Bakterien versetzt wurde, so blieb die entsprechende Messung negativ (Daten hier nicht gezeigt) und lieferte daher kein positives Amplifikationsergebnis. Dies verdeutlicht daher, dass mit einem erfindungsgemäßen Verfahren die Extraktion von Nukleinsäuren aus einer Probenflüssigkeit, welche für die Amplifikation schädliche Substanzen enthält und daher der Reaktionslösung nicht direkt mit großer Konzentration beigemischt werden kann, die Sensitivität von Amplifikationsreaktionen deutlich verbessert werden kann. Das Lysat ist dabei nicht auf eine bestimmte Ausgangssubstanz oder Art von Lysat beschränkt. Beispielsweise kann es als Blut-Lysat vorliegen. Das Blut-Lysat kann auf unterschiedlichen Arten lysiert worden sein, wie etwa chemisch und/oder mechanisch, beispielsweise mittels Ultraschall-Einwirkung, weshalb das Verfahren flexibel für verschiedenste Ausgangsformen des Lysats anwendbar ist. Vergleichbare Ergebnisse konnten auch entsprechend mit Plasma-, Serum- und Nasentupfer-Lysaten erreicht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich daher auch für eine große Bandbreite an unterschiedlichen Probenflüssigkeiten.
• Extraktion der Nukleinsäuren mit nicht-vorab-funktionalisierten Heizelementen
• Zum Vergleich mit dem oben-beschriebenen Verfahren wurde nun ein Verfahren angewandt, welches abweichend vom oben-beschriebenen Verfahren nicht-vorabfunktionalisierte Drähte als Heizelemente in den Reaktionsgefäßen verwendet, d.h. bei welchem die Heizelemente nicht vorab mit Extraktionsnukleinsäuren funktionalisiert waren. Das Blut-Lysat bzw. die Probenflüssigkeit wurde hingegen vor der Kontaktierung mit den Drähten mit Extraktionsnukleinsäuren, welche als Oligonukleotide ausgebildet sind und eine Thiol-Gruppe besitzen mit der sie an eine Goldoberfläche binden können, versetzt (100 mM Endkonzentration) und gemeinsam mit den anderen Bestandteilen der Probenflüssigkeit in das Reaktionsgefäß mit den unfunktionalisierten Golddrähten gegeben. Das Reaktionsgefäß wurde anschließend versiegelt und für 10 min bei 45°C inkubiert. Nach einer zweiminütigen Ruhephase bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgefäß wieder entsiegelt. Es folgten Waschgänge und die Durchführung einer PCR, jeweils genauso wie oben beschreiben.
• Wie die Erfinder feststellten, konnte auch in diesem Fall ein positives Amplifikationssignal detektiert werden. Dies ist überraschend, da bei dem verwendeten Überschuss an Extraktionsnukleinsäuren, die frei in Lösung sind, eine Hybridisierung zwischen nicht-Draht-gebundenen Extraktionsnukleinsäuren und Target-Nukleinsäuren bevorzugt erscheint, da gemäß dieser Ausführungsform sowohl die überschüssigen, nicht-Draht-gebundenen Extraktionsnukleinsäuren als auch die Target-Nukleinsäuren homogen in der Lösung verteilt vorliegen. Die während des In-Kontakt-Bringens der Heizelemente mit der Probenflüssigkeit auf die Heizelemente bindenden Extraktionsnukleinsäuren sollten erwartungsgemäß zum einen in Unterzahl sein und aufgrund der Immobilisierung für die frei in der Lösung vorliegende, zu extrahierende Nukleinsäure schlechter erreichbar sein, als die überschüssigen, nicht-Draht-gebundenen, d.h. nicht an ein Heizelement gebundenen, Extraktionsnukleinsäuren, die frei in der Probenflüssigkeit vorliegen. Der Fachmann würde demnach wenige Target-Nukleinsäuren an die Drähte gebunden erwarten und somit eine deutlich schlechtere oder keine Extraktion und Amplifikation erwarten. Zudem haben die Erfinder herausgefunden, dass anders als die Erwartung suggeriert, unter den chemischen Bedingungen im Blut-Lysat bzw. in der Probenflüssigkeit eine Funktionalisierung der Drähte mit Funktionalisierungsoligomeren, wie etwa mit der Extraktionsnukleinsäure, stattfindet, da die Funktionalisierung typischerweise unter deutlich abweichenden chemischen Bedingungen (siehe Tabelle 2) zu erfolgen hat.
• Diese Ausführungsform erlaubt es dennoch in überraschend zuverlässiger Weise, unter Verwendung von nicht-vorab-funktionalisierten Drähte, d.h. mit Heizelementen, welche vorab nicht mit Extraktionsnukleinsäuren funktionalisiert wurden, erfolgreich eine Extraktion und Amplifikation der Nukleinsäuren herbeizuführen. Die Tatsache, dass die Extraktionsnukleinsäuren sich erst während des In-Kontakt-Bringens der Heizelemente mit der Probenflüssigkeit an die Heizelemente anlegen können und die Heizelemente funktionalisieren können, steht der Funktionalität des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß dieser Ausführungsform nicht entgegen. Dadurch kann nicht nur das Verfahren zum Extrahieren der Nukleinsäure vereinfacht werden, sondern auch die Herstellung und/oder Lagerung und/oder der Versand der Vorrichtung und/oder der erforderlichen Komponenten erleichtert werden und/oder die kundenspezifische Individualisierbarkeit von Vorrichtungen zum Extrahieren von Nukleinsäuren bzw. von Heizelementen verbessert werden.
• Die Ergebnisse dieser soeben geschilderten Experimente sind im Graphen in 8 dargestellt, bei welchem abermals die Zeitdauer in Minuten auf der horizontalen Achse und das Fluoreszenzsignal auf der vertikalen Achse aufgetragen sind. Beide Graphen wurden unter Verwendung eines Blut-Lysats mit 100 CFU/µl erzielt. Die durchgezogene Amplifikationskurve entspricht der Amplifikation unter Verwendung von vorab funktionalisierten Gold-Drähten als Heizelementen. Die gestrichelte Amplifikationskurve entspricht der Amplifikation unter Verwendung von nicht-vorabfunktionalisiertem Gold-Drähten als Heizelemente.
• Bezugszeichenliste

10

Heizelement

12

Draht bzw. Heizdraht

14

Extraktionsnukleinsäure

15

Adapternukleinsäure

16

Spannungsversorgung

18

Schalter

20

Spannungsquelle

22

(zu extrahierende) Nukleinsäure

24

Vorrichtung zum Extrahieren einer Nukleinsäure

26

Probenflüssigkeit

28

Reaktionsgefäß

30

Öffnung (des Reaktionsgefäßes)

32

Deckel

34

Probenplatte

36

Temperierblock

38

Leuchtdiode

40

Fotodiode

42

Acrylglasplatte

44

Klebeband

46

Acrylglasplatte

48

Folie

50

Folie

52

Heizeinrichtung

100

elektrische Schaltung für Spannungsversorgung

• Anhang
• Sequenzliste (Sequenz-Abfolge je von 5` nach 3'):

Sequenz 1:

TGAAGATGTGCTTACAAGTGCTA (SEQ ID No. 1)

Sequenz 2:

TCCACCCTCAAACAGGTGAATTAT (SEQ ID No. 2)

Sequenz 3:

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID No. 3)

Sequenz 4:

AAATGATTATGGCTCAGGTACTGC (SEQ ID No. 4)

Claims (23)

1. Verfahren zum Extrahieren einer Nukleinsäure (22) aus einer Probenflüssigkeit (26), umfassend die Schritte: - Bereitstellen eines Heizelements (10); - Bereitstellen einer Extraktionsnukleinsäure (14), welche an das Heizelement (10) gebunden ist und/oder Bereitstellen der Extraktionsnukleinsäure (14) derart, dass die Extraktionsnukleinsäure (14) an das Heizelement (10) bindet, wobei die Extraktionsnukleinsäure (14) zumindest teilweise komplementär zu der aus der Probenflüssigkeit (26) zu extrahierenden Nukleinsäure (22) ist; - In-Kontakt-Bringen des Heizelements (10) mit der Probenflüssigkeit (26) derart, dass die aus der Probenflüssigkeit (26) zu extrahierende Nukleinsäure (22) zumindest teilweise an die Extraktionsnukleinsäure (14) bindet; - Separieren des Heizelements (10) von der Probenflüssigkeit (26) derart, dass die an die Extraktionsnukleinsäure (14) gebundene Nukleinsäure (22) am Heizelement (10) verbleibt; - In-Kontakt-Bringen des Heizelements (10) mit einer Reaktionslösung; - Beheizen des Heizelements (10) auf eine Temperatur, welche gleich oder größer einer Denaturierungstemperatur der an die Extraktionsnukleinsäure (14) gebundenen Nukleinsäure (22) ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Beheizen des Heizelements (10) derart erfolgt, dass nur das Heizelement (10) und eine unmittelbare Umgebung des Heizelements (10) auf die Denaturierungstemperatur oder eine höhere Temperatur erwärmt wird, bei welcher vorzugsweise die an die Extraktionsnukleinsäure (14) gebundene Nukleinsäure (22) zumindest teilweise abschmilzt und/oder denaturiert.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Beheizen des Heizelements (10) zumindest einen Heizvorgang umfasst und derart erfolgt, dass das Beheizen des Heizelements (10) pro Heizvorgang und/oder über alle Heizvorgänge jeweils eine Durchschnittstemperatur der Reaktionslösung um nicht mehr als 5°C erhöht.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reaktionslösung dazu ausgelegt ist, eine Amplifikationsreaktion zur Vervielfältigung zumindest eines Teils der extrahierten Nukleinsäure (22) in der Reaktionslösung durchzuführen.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Beheizen des Heizelements (10) im Rahmen der Amplifikationsreaktion zur Vervielfältigung zumindest eines Teils der extrahierten Nukleinsäure (22) erfolgt und vorzugsweise zumindest einmal wiederholt wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei zumindest ein Primer für die Amplifikationsreaktion an das Heizelement (10) gebunden ist und/oder wobei der zumindest eine Primer derart bereitgestellt wird, dass der zumindest eine Primer an das Heizelement (10) bindet.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Extraktionsnukleinsäure (14) als Primer für die Amplifikationsreaktion ausgebildet ist.
8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mehrere Heizelemente (10) bereitgestellt werden und/oder wobei mehrere Extraktionsnukleinsäuren (14) bereitgestellt werden, wobei das Heizelement (10) oder die mehreren Heizelemente (10) jeweils mit mehreren Extraktionsnukleinsäuren (14) verbunden sind und/oder wobei die eine oder die mehreren Extraktionsnukleinsäuren (14) derart bereitgestellt werden, um an das Heizelement (10) oder die mehreren Heizelemente (10) zu binden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Bereitstellen der Extraktionsnukleinsäure (14) derart, dass die Extraktionsnukleinsäure (14) an das Heizelement (10) bindet, ein Bereitstellen der Extraktionsnukleinsäure (14) in der Probenflüssigkeit (26) umfasst.
10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zumindest eine Extraktionsnukleinsäure (14) direkt an das Heizelement (10) gebunden ist und/oder indirekt über zumindest eine Adapternukleinsäure (15) an das Heizelement gebunden ist; und/oder wobei das Heizelement (10) zumindest eine Adapternukleinsäure (15) aufweist, über welche die bereitgestellte Extraktionsnukleinsäure (14) an das Heizelement bindet.
11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Heizelement (10) in einem Reaktionsgefäß (28) angeordnet ist und vorzugsweise mit dem Reaktionsgefäß (28) mechanisch verbunden ist und/oder als ein Teil des Reaktionsgefäßes (28) ausgebildet ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das In-Kontakt-Bringen des Heizelements (10) mit der Probenflüssigkeit (26) ein zumindest teilweises Befüllen des Reaktionsgefäßes (28) mit der Probenflüssigkeit (26) umfasst und/oder wobei das Separieren des Heizelements (10) von der Probenflüssigkeit (26) ein zumindest teilweises Entfernen der Probenflüssigkeit (26) aus dem Reaktionsgefäß (28) umfasst.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, ferner umfassend ein Reinigen des Reaktionsgefäßes (28) nach dem Separieren des Heizelements (10) von der Probenflüssigkeit (26), wobei das Reinigen des Reaktionsgefäßes (28) ein Entfernen von Rückständen der Probenflüssigkeit (26) aus dem Reaktionsgefäß (28) umfasst.
14. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das In-Kontakt-Bringen des Heizelements (10) mit der Probenflüssigkeit (26) ein Benetzen des Heizelements (10) mit der Probenflüssigkeit (26) und/oder ein Eintauchen des Heizelements (10) in die Probenflüssigkeit (26) umfasst und/oder, sofern in Abhängigkeit von einem der Ansprüche 9 bis 11, ein zumindest teilweises Befüllen des Reaktionsgefäßes (28) mit der Probenflüssigkeit (26) umfasst.
15. Vorrichtung (24) zum Extrahieren einer Nukleinsäure (22) aus einer Probenflüssigkeit (26), die Vorrichtung aufweisend ein Heizelement (10), welches mit einer Extraktionsnukleinsäure (14) verbunden ist und/oder dazu ausgelegt ist, mit der Extraktionsnukleinsäure (14) derart verbunden zu werden, wobei die Extraktionsnukleinsäure (14) zumindest teilweise komplementär zu der aus der Probenflüssigkeit (26) zu extrahierenden Nukleinsäure (22) ist, und wobei das Heizelement (10) auf eine Temperatur beheizbar ist, welche gleich oder größer einer Denaturierungstemperatur der an die Extraktionsnukleinsäure (14) gebundenen Nukleinsäure (22) ist.
16. Vorrichtung (24) gemäß Anspruch 15, wobei die zumindest eine Extraktionsnukleinsäure (14) direkt an das Heizelement (10) gebunden ist und/oder indirekt über eine Adapternukleinsäure (15) an das Heizelement gebunden ist; und/oder wobei das Heizelement (10) zumindest eine Adapternukleinsäure (15) aufweist, mittels welcher die Extraktionsnukleinsäure (14) indirekt an das Heizelement (10) bindbar ist.
17. Vorrichtung (24) gemäß Anspruch 15 oder 16, ferner umfassend ein Reaktionsgefäß (28), wobei das Heizelement (10) mit dem Reaktionsgefäß (28) verbunden ist und/oder als ein Teil des Reaktionsgefäßes (28) ausgebildet ist, wobei das Heizelement (10), und wobei das Reaktionsgefäß (28) zumindest eine Öffnung zum Befüllen der Probenflüssigkeit (26) in das Reaktionsgefäß (28) und/oder zum Entfernen der Reaktionslösung aus dem Reaktionsgefäß (28) aufweist.
18. Vorrichtung (24) gemäß Anspruch 17, wobei das Heizelement (10) einen elektrisch leitfähigen Körper aufweist, der senkrecht zur Richtung des Stromflusses, vorzugsweise in eine Raumrichtung und besonders bevorzugt in jede Raumrichtung senkrecht zur Richtung des Stromflusses, eine Ausdehnung R aufweist, die vorzugsweise mindestens 0,2 µm und höchstens 0,5 mm beträgt.
19. Vorrichtung (24) gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die Vorrichtung mehrere Heizelemente (10) aufweist.
20. Vorrichtung (24) gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die Vorrichtung (24) dazu ausgelegt ist, eine Amplifikationsreaktion zur Vervielfältigung der aus der Probenflüssigkeit (26) extrahierten Nukleinsäure (22) durchzuführen, wobei vorzugsweise das Beheizen des Heizelements (10) derart erfolgt, dass lediglich ein lokales Erwärmen einer unmittelbaren Umgebung des Heizelements (10) zumindest auf die Denaturierungstemperatur erfolgt.
21. Vorrichtung (24) gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, ferner umfassend zumindest einen Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion zur Vervielfältigung der aus der Probenflüssigkeit (26) extrahierten Nukleinsäure (22), welcher an das zumindest eine Heizelement gebunden ist.
22. Vorrichtung (24) gemäß einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei die Extraktionsnukleinsäure (14) als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion zur Vervielfältigung der aus der Probenflüssigkeit (26) extrahierten Nukleinsäure (22) ausgebildet ist.
23. Verwendung einer Vorrichtung (24) gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22 zum Extrahieren einer Nukleinsäure (22) aus einer Probenflüssigkeit (26).

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