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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein hochortsaufgelöstes Verfahren
zur Elektroporation und parallelen Abgabe von einer oder mehreren
verschiedenen Verbindungen in Zellstrukturen wie Zellen, zellähnliche
Strukturen oder eine Population von Zellen. Vorzugsweise werden
mindestens zwei Elektrolyt-gefüllte
Kapillaren (EGKs), ein lineares Array von EGKs oder ein zweidimensionales
Matrix-Array von EGKs, die an einen Spannungsgenerator angeschlossen
sind, als ein kombiniertes Elektroporations- und Abgabeinstrument
von z. B. verschiedenen Farbstoffen, Wirkstoffen, DNA, RNA, Antisens-Oligonukleotiden
und Biomolekülen
in das Zellplasma einer Einzelzelle oder von Populationen von Zellen – auf sequentielle
oder parallele Weise – oder
Kombinationen davon verwendet. Die Erfindung betrifft ebenso die
Anwendung dieser Verfahren. Im Besonderen betrifft sie Verfahren
zum schnellen Screening von Wirkstoffen, die die intrazelluläre Chemie
beeinflussen, und zur Identifikation und dem Nachweis von intrazellulären Proteinen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Schnelle
und zuverlässige
Verfahren zur Untersuchung der Wirkung von Wirkstoffen auf die intrazelluläre Chemie
sind heutzutage stark gefragt. Solche Protokolle könnten das
Screening nach Liganden und Substraten umfassen, die mit an Organellen
gebundene Rezeptoren bzw. cytosolischen Enzymen zusammenwirken.
Es wären
auch solche Verfahren sehr wertvoll, die eine Charakterisierung
und einen Nachweis aller Proteine in den Zellen ermöglichen,
nicht zuletzt im Bereich der Proteomik. Es gibt hochspezifische Enzymsubstrate
und Testproteine, die es ermöglichen,
bestimmte Bestandteile in Zellen aufzufinden. (Tsien RY, Annu. Rev.
Biochem. 1998, 67, 509–44).
Es gibt zum Beispiel eine Vielzahl von Substraten, die als Lichtschalter
im Substrat-Produkt-Umwandlungsschritt verwendet werden können. Auch
bestimmte Protein-Protein-Wechselwirkungen
können
durch die Verwendung eines Fluoreszenz-Indikators, der mit einer
Proteinverbindung gekoppelt ist, identifiziert werden (Ozawa T,
Nogami S, Sato M, Ohya Y, Umezawa Y, Anal. Chem. 2000, 72, 5151–57). Obwohl
diese Testsubstanzen und Indikatoren verfügbar sind, ist bis jetzt die
größte Herausforderung
beim Anwenden der Testsubstanzen und Indikatoren ihre Einschleusung
in das Innere der Zelle. Viele dieser Testsubstanzen und Indikatoren
sowie viele andere Komponenten für
die biologische und medizinische Verwendung – einschließlich der Wirkstoffe und Biomoleküle, die
für die
Einschleusung in Zellen von Bedeutung sind – sind polar. Polare gelöste Substanzen
sind zell-impermeabel und unfähig,
biologische Membranen zu passieren.
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Außerdem wären Verfahren,
die den Nachweis von DNA-Proteinen, Protein-Proteinen und vielen
anderen Wechselwirkungen in Zellen ermöglichen, in vielen Bereichen
ein wertvolles Instrument. Auch die Fähigkeit, Viren, Bakterien,
Antikörper
und kolloidale Partikel in Zellen einzuschleusen, wird in vielen
Bereichen der Biowissenschaften als wichtig erachtet. Dennoch ist
es schwierig, alle diese Verbindungen und Partikel in das Cytosol
einer Zelle zu übertragen,
aufgrund des Vorhandenseins einer Zellplasmamembran-Barriere, die als
räumliche
Abgrenzung gegenüber
der externen Lösung
fungiert, die das Eindringen von exogenen Verbindungen und Partikeln
verhindert. Seit langer Zeit ist bekannt, dass Zellmembranen mit
Hilfe gepulster elektrischer Felder permeabilisiert werden können (siehe
z. B. Zimmermann, U. Biochim. Biophys Acta, 694, 227–277 (1982)).
Dieses Verfahren wird Elektroporation genannt. Aus den Studien zu
dem elektrochemischen Nachweis in der Kapillarelektrophorese (CE)
ist bekannt, dass die Spannung, die an eine Elektrolyt-gefüllte Kapillare
(EGK) angelegt wird, ein elektrisches Feld am Kapillarauslass erzeugt
(Lu, W.; Cassidy, M. Anal. Chem. 1994, 66, 200–204). Dieses elektrische Feld
an der Spitze einer EGK, das entgegen dem Bezugspotential wirkt,
kann zur Elektroporation verwendet werden. Die gleiche EGK, die
die Elektroporation ausführt,
gibt auch die relevanten Agentien an die Zelle ab. Es kann gezeigt
werden, dass die Größe des elektrischen
Feldes entlang der Symmetrieachse des EGK-Lumens, das sich in die
Lösung
erstreckt, gegeben ist durch:
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Dabei
ist Z die dimensionslose Entfernung von der Spitze der EGK, und
z/a ergibt sich aus z, der Entfernung von der EGK-Spitze, und a,
dem EGK-Lumenradius. Y ist die angelegte Spannung in Volt und Lc ist die Länge der EGK. Diese Gleichung
kann einbezogen werden, um den Spannungsabfall entlang der zylindrischen
Achse außerhalb
der Kapillare festzustellen.
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Die
Transmembran-Spannung kann somit von diesem Feld angenähert werden,
indem die Gleichung (2) wie oben beschrieben angewendet wird.
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Die
Erfinder haben kürzlich
das Konzept der Elektroporation demonstriert, indem sie eine einzelne EGK
verwendet haben, die eine homogene Elektrolytlösung enthielt (K. Nolkrantz,
R. I. D. Karlsson, C. Farre, A. Brederlau, C. Brennan, P. S. Eriksson,
S. G. Weber, M. Sandberg, O. Orwar Anal. Chem., (2001) 73, 4469–4477; WO
9 924 110).
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KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG:
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Was
in dieser Offenbarung beschrieben ist, sind wesentliche technologische
Verbesserungen, die eine schnelle parallele Abgabe – mit der
Möglichkeit
der Kombination mit der sequentiellen Abgabe – von einem oder mehreren Agentien,
wie zum Beispiel internalisierende Agentien, an oder in eine oder
mehrere Zellstrukturen unter Verwendung von zwei oder vorzugsweise
mehreren EGKs ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso mehrere Anwendungen der
Technologie.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein hochortsaufgelöstes Verfahren,
das ein schnelles Screening von Wirkstoffen, die die intrazelluläre Chemie
beeinflussen, und die Identifikation und den Nachweis von intrazellulären Proteinen
ermöglicht
und auf der Permeabilisation von Phospholipid-Doppelschicht-Membranen durch elektrische
Felder basiert, d. h., die sogenannte Elektroporation.
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Die
schnelle intrazelluläre
Abgabe von mehreren Zell-impermeablen Agentien erfolgt auf der Grundlage
der Verwendung von mindestens zwei EGKs, die mit Zell-Beladungsagentien
ergänzt
wurden. Eine Spannung oder ein Strom, wie beispielweise ein Spannungs-
oder Strompuls, die/der an einer EGK angelegt wird, erzeugt ein
elektrisches Feld außerhalb
des EGK-Endpunktes, das die Bildung von Poren in Zellmembranen bewirkt.
Außerdem
kann diese Spannung oder dieser Strom zum Beispiel einen elektroosmotischen
Fluss des Elektrolyts induzieren, das in der EGK enthalten ist.
Da die EGK mit einem Zell-Beladungsagens ergänzt wurde, gibt der elektroosmotische
Fluss diese Agentien am Ort der Porenbildung ab. Die Kombination
aus Porenbildung und der Abgabe von Agentien, mit denen das EGK-Elektrolyt
ergänzt
wurde, ermöglicht
das Einschleusen von Materialien zum Beispiel in das Cytoplasma
oder in Organellen. Hier wird ein Verfahren zur parallelen Abgabe – mit der
Möglichkeit
der Kombination mit der sequentiellen Abgabe – von einem oder mehreren Zell-Beladungsagentien
in eine Zellstruktur, wie beispielweise in das Cytosol einer Zelle
oder einer Population von Zellen oder einer ähnlichen Struktur, auf der
Grundlage des EGK-Elektroporations-Protokolls beschrieben.
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung kann als Screening-Technik für intrazelluläre Wirkstoffwirkungen
und als Technik zur Identifikation von intrazellulären Proteinen
in Zellen angewendet werden. Beispiele für solche Proteine können Enzyme,
Rezeptoren oder Strukturproteine sein. In diesen Fällen wird das
Elektroporationsverfahren für
das Einschleusen von einem oder mehreren Testproteinen (z. B. fluorogene Liganden
oder Substrate) in Einzelzellen oder Populationen von Zellen verwendet.
Diese Marker können
in Kombination mit Wirkstoffen, Substraten oder Liganden eingeschleust
werden, die direkt mit dem/den Zielprotein oder -proteinen im selben
Signalweg interagieren. Somit kann das Vorhandensein von verschiedenen
Proteinen und ihre Funktion auf Einzelzellebene erkannt werden.
Instrumente mit solchen Fähigkeiten
könnten sich
für die
Proteomik und die Phänotypenerstellung
sowie für
die Charakterisierung der Wirkung von Wirkstoffen auf intrazelluläre Signalsysteme
oder Stoffwechselwege eignen. Außerdem kann das Verfahren gemäß der Erfindung
dazu verwendet werden, Rezeptor-Liganden und Enzymsubstrate in biosensor-chemischen
Trennformaten zu identifizieren. Um die Erfindung für die Profilerstellung,
das Screening und die Untersuchung z. B. von intrazellulären Proteinen
oder die Wirkung von Wirkstoffen in lebenden Zellen zu verwenden,
ist es erforderlich, dass Vorgänge
bezüglich
dieser Wechselwirkungen aufgedeckt werden können. Dies kann z. B. durch die
Verwendung von selektiven fluoreszierenden Proteinmarkern in Kombination
mit Fluoreszenz-Mikroskopie erreicht
werden. Als ein Beispiel für
die Bestätigung
des Vorhandenseins eines bestimmten Enzyms in einer Zelle wird ein
polares Zellmembranimpermeables Substrat, dass bis nach der enzymatischen
Umwandlung nicht-fluoreszierend ist, in ein fluoreszierendes Produkt
umgewandelt. Danach würde
eine Erhöhung
der Fluoreszenz das Vorhandensein des Enzyms in der Zelle sowie
die enzymatische Wirkung widerspiegeln. Der Proteinmarker (fluorogenes
Substrat) wird mit Hilfe des beschriebenen Elektroporationsverfahrens
in das Cytosol einer lebenden Zelle eingeschleust. Der Marker kann
auch zusammen mit einem Wirkstoff oder einem Inhibitor eingeschleust
werden.
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Somit
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Veränderung
eines biochemischen Inhalts einer Zellstruktur. Genauer gesagt betrifft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur parallelen Abgabe von Agentien
an eine Oberfläche
einer Zellstruktur und in das Cytoplasma der Zellstruktur, das die
folgenden Schritte umfasst:
- (a) mindestens
zwei Elektrolyt-gefüllte
Röhrchen
werden zusammen mit einer geerdeten oder Gegenelektrode bereitgestellt
- (b) die Elektrolyt-gefüllten
Röhrchen
werden mit einem Spannungs- oder Stromgenerator verbunden;
- (c) mindestens ein Agens wird in die Elektrolytlösung eingeführt, die
in jedem Elektrolyt-gefüllten
Röhrchen enthalten
ist;
- (d) die Elektrolyt-gefüllten
Röhrchen
werden im engen Abstand zu der Oberfläche einer Zellstruktur platziert;
- (e) das Agens/die Agentien wird/werden durch die Elektrolyt-gefüllten Röhrchen zu
der Oberfläche
der Zellstruktur transportiert;
- (f) ein elektrisches Feld einer Stärke, die ausreicht, um eine
Elektroporation an der Oberfläche
der Zellstruktur zu erhalten, wird auf die Zellstruktur fokussiert,
was in der Bildung von Poren in der Membranoberfläche der
Zellstruktur resultiert; und
- (g) das Agens/die Agentien wird/werden durch die in Schritt
(f) gebildeten Poren und in das Cytoplasma der Zellstruktur transportiert,
wobei
die Schritte (a) bis (g) in fortlaufender Reihenfolge durchgeführt werden,
mit der Ausnahme, dass die Reihenfolge der Schritte (b), (c) und
(d) verändert
werden kann und dass die Reihenfolge der Schritte (e) und (f) verändert werden
kann.
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Gemäß Schritt
(a) wird eine geerdete oder Gegenelektrode verwendet. Es ist möglich, nur
eine solche geerdete oder Gegenelektrode oder mehr als eine geerdete
oder Gegenelektrode zu verwenden, wie zum Beispiel eine geerdete
oder Gegenelektrode für
jedes Elektrolyt-gefüllte
Röhrchen.
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Gemäß vorstehendem
Schritt (b) wird ein Spannungs- oder Stromgenerator verwendet. Es
ist möglich, nur
einen solchen Spannungs- oder Stromgenerator oder mehr als einen
Spannungs- oder Stromgenerator zu verwenden.
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Der
Ausdruck "im engen
Abstand", der in
vorstehendem Schritt (d) verwendet wird, bedeutet, dass das Auslassende
der Kapillare in Kontakt mit oder sehr nah an der Zellstruktur platziert
wird. Vorzugsweise beträgt dieser
enge Abstand weniger als 500 μm.
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Der
Ausdruck "ein elektrisches
Feld einer Stärke,
die ausreicht, um eine Elektroporation zu erhalten, wird auf die
Zellstruktur fokussiert",
der in vorstehendem Schritt (f) verwendet wird, bedeutet, dass ein
elektrisches Feld auf oder über
der Zellstruktur oder dem zu elektroporierenden Teil der Zellstruktur
fokussiert wird, und dass dieses elektrische Feld im Wesentlichen
exakt dem entspricht, das für
die Elektroporation benötigt wird.
Vorzugsweise erzeugt der Spannungsgenerator eine Spannung zwischen
10 mV und 100 V an der Oberfläche
der zu elektroporierenden Zellstruktur, insbesondere zwischen 100
mV und 2 V an dieser Oberfläche. Der
Spannungspuls liegt vorzugsweise zwischen 0,1 μs und mehreren Minuten. „Mehrere
Minuten" steht hier z.
B. für
1 bis 10 Minuten. Insbesondere soll ein Spannungspuls zwischen 1 μs und 5 s
gegeben sein, und am meisten bevorzugt wird ein Spannungspuls von
weniger als 100 ms.
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In
Schritt (g) wird das Agens in die Zellstruktur transportiert. Entweder
wird die Gesamtmenge des Agens, das vom Elektrolyt-gefüllten Röhrchen an
die Oberfläche
der Zellstruktur abgegeben wird, weiter in die Zellstruktur transportiert,
oder nur ein Teil dieser Menge wird weiter in die Zellstruktur transportiert,
wobei der übrige
Teil außerhalb
der Zelloberfläche
verbleibt.
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Die
Zellstruktur kann jede Art von Zelle oder zellähnlicher Struktur darstellen,
wie zum Beispiel eine Zelle in einer primären Zellkultur, eine Zelle
in einem Gewebeabschnitt oder einem Gewebe, eine In-vivo-Zelle, ein Liposom
oder eine intrazelluläre
Zellstruktur wie eine Organelle, wie weiter unten beschrieben wird.
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Die
Elektrolyt-gefüllten
Röhrchen
können
Elektrolyt-gefüllte
Kapillaren (EGKs), Elektrolytgefüllte
konisch zulaufende Röhrchen
und/oder Elektrolyt-gefüllte
Elektroden sein. Diese Ausdrücke
werden innerhalb dieser Spezifikation synonym verwendet.
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Durch
die Verwendung von paralleler Abgabe ist es möglich, Agentien entweder durch
Poren, die in einer Zellstruktur gebildet werden, oder durch Poren,
die in zwei oder mehreren verschiedenen Zellstrukturen gebildet
werden, abzugeben.
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Weiterhin
ist es möglich,
mehr als ein Agens in jedem Elektrolyt-gefüllten Röhrchen zu platzieren. Dies ermöglicht die
kombinierte Verwendung der parallelen und sequentiellen Abgabe von
Agentien in die Zellstruktur.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
kann verwendet werden, um mehrere gelöste Substanzen, Agentien und
Partikel in eine permeabilisierte Zellstruktur zu übertragen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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In
der Beschreibung und den unten aufgeführten Beispielen wird auf die
beiliegenden Zeichnungen verwiesen, wobei:
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1 einen geeigneten Apparat zur Elektroporation
von Zellen und zellulären
Strukturen unter Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung
darstellt. Eine Ausführungsform
wird in 1a dargestellt, die eine EGK 1 umfasst,
die über
eine erste Elektrode 3 und ein Vial 4, das mit
einer Elektrolytlösung
der gleichen Zusammensetzung wie der in dieser EGK gefüllt ist,
mit einem Spannungsgenerator 2 verbunden ist. Diese Elektrolytlösung wird
mit einem Agens 5 ergänzt,
das in die zelluläre
Struktur eingeschleust werden soll. Die Zellstruktur 6 wird
in einem physiologischen Puffer gehalten, z. B. in einer Petrischale 7,
die vorzugsweise mit einer geerdeten badartigen Gegenelektrode 8 ausgestattet
ist. In der hier gezeigten bevorzugten Ausführungsform befindet sich die
Petrischale auf einem inverten Mikroskoptisch 9 und wird
durch ein Mikroskopobjektiv 10 betrachtet, um die Positionierung
der EGK-Spitzen in Bezug auf die Zellstruktur zu vereinfachen. Die
EGK wird mit Hilfe eines dreidimensionalen Mikropositionierers 11 nah
an der Zellstruktur positioniert. Dies wird derart ausgeführt, dass
das elektrische Feld, das zwischen den Elektroden erzeugt wird,
in hohem Maße über der
zu elektroporierenden Struktur fokussiert wird. Die 1b und 1c zeigen,
wie die Ausführungsform
von 1a zum Beladen eine Zellstruktur 6 mit
einem Zell-impermeablen Agens 5 verwendet werden kann.
In 1b wird die EGK 1, die ein Zell-impermeables
Agens 5 enthält,
mit Hilfe eines Mikropositionierers 11 nah der Oberfläche der
Zielzellstruktur 6 positioniert. In 1c wird
ein Spannungspuls an die EGK angelegt, der durch den Spannungsgenerator 2 erzeugt
wurde. Somit wird ein elektrisches Feld über der zellulären Struktur
aufgebaut, das aufgrund des dielektrischen Zusammenbruchs der zellulären Membran die
Bildung von Poren bewirkt. Das angelegte Spannungspotential bewirkt
auch die elektroosmotische oder elektrophoretische Abgabe der in
der EGK enthaltenen Lösung.
Dadurch wird das in der EGK enthaltene Zell-impermeable Agens 5 am
Ort der Porenbildung abgegeben, wo das Zell-Beladungsagens durch die erzeugten Poren 19 frei
in das Innere des zellulären
Ziels gelangen kann. Sobald das elektrische Feld entfernt wird,
schließen
sich die gebildeten Poren und die zelluläre Membran verheilt.
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2 zeigt Elektrolyt-gefüllte Kapillaren mit verschiedenen
Spitzenformen. Wie in 2a dargestellt, kann die EGK 1 eine
perfekt zylindrische Form haben. Manchmal ist es von Vorteil, Kapillaren 1 mit
zulaufenden spitzen Enden zu verwenden, wie sie in 2b und 2c dargestellt
werden. Dies ist besonders bei der Einzelzell-Elektroporation der
Fall. In 2b wird eine zulaufende EGK 1 dargestellt,
die durch Ziehen einer Glas- oder Quarzkapillare in einer mechanischen
Zugvorrichtung mit einem Heizfaden hergestellt wird. Die Spitze
einer solchen Kapillare kann sehr klein sein, bis zu einigen Nanometern,
und der äußere Durchmesser sowie
der Röhrendurchmesser
sind verringert. Eine zulaufende Kapillare kann auch durch Ätzen in
Fluorwasserstoffsäure
oder durch Schleifen vorbereitend bearbeitet werden. Der Vorteil
dieser Technik ist es, dass nur der äußere Durchmesser der Kapillare
verringert wird, wogegen der innere Durchmesser gleich bleibt. Diese Art
von Kapillare wird in 2c dargestellt. Kapillaren können mit
leitfähigen
Spitzen ausgestattet sein, wie in den 2d und 2e dargestellt.
Der Vorteil dieser hohlen Kapillaren mit leitfähigen Spitzen ist die Möglichkeit
der Anwendung kürzerer
Pulszeiten mit einer hohen Präzision
aufgrund der niedrigen RC-Zeitkonstanten. Die Kapillare in 2d besitzt
eine Elektrode 3 auf der Innenseite, und die Kapillare
in 2e besitzt die Elektrode 3 auf der Außenseite.
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3 zeigt die Abgabe von Zell-Beladungsagentien
unter Verwendung von mehreren EGKs 1, die in Arrays angeordnet
sind. Solche Anordnungen von Kapillaren 1 können lineare
Arrays 12 wie in 3a oder zweidimensionale
Arrays 14 wie in 3b sein.
Diese Arrays von Kapillaren können
von einem Halter 13 zusammengehalten werden. Für die Elektroporation
der Abgabe eines Zell-Beladungsagens an eine Einzelzelle in schneller
Abfolge wird ein Array von Kapillaren schnell über das zelluläre Ziel
bewegt, wie in den 3c-e gezeigt wird.
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4 zeigt
eine besondere Art eines EGK-Arrays, und zwar eine EGK mit mehreren
kammerartigen Abschnitten 15, wobei die EGK mehrere Kammern 5 oder
Kanäle 5 umfasst,
von denen jede/jeder mit einer individuell anwählbaren Elektrode 3 ausgestattet
ist und mit einem einzelnen oder mehreren Zell-Beladungsagentien 5,
wie in 3a dargestellt, gefüllt ist
(Die Seitenansicht wird auf der linken Seite und die Vorderansicht
auf der rechten Seite dargestellt). Durch das sequentielle Anlegen
der Spannung an die einzelnen Kammern ist es möglich, festgelegte Mengen von
Zell-Beladungsagentien mit Hilfe dieser Anordnung sequentiell abzugeben.
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5 veranschaulicht die Abgabe eines Zell-Beladungsagens mittels
mikrofluidischer Schalter zum sequentiellen Beladen einer EGK, um
getrennte Zonen von Zell-Beladungsagentien in dieser EGK zu erhalten. Dieses
Konzept wird in 5a dargestellt, wobei eine EGK 1 über einen
mikrofluidischen Schalter 16 und eine Feeder-EGK 17 mit
sechs verschiedenen Vials 4 verbunden ist, die unterschiedliche
Zell-Beladungsagentien enthalten. Die Vials sind mit einzeln anwählbaren
Elektroden 3 ausgestattet. Durch die sequentielle Anlegung eines
Spannungspulses an jedes Vial 4 werden die Zell-Beladungsagentien über die
Feeder-EGK in den mikrofluidischen Schalter gepumpt, von wo aus
sie sequentiell in die Haupt-EGK 1 gelangen. Es werden
somit getrennte Banden von Zell-Beladungsagentien in der Haupt-EGK
gebildet, die zum Elektroporations-Ziel 6 geschleust werden
können.
Diese Beladungsprozedur wird in den 5b-d dargestellt.
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6 veranschaulicht
ein Beispiel für
die parallele Elektraporation von Zellen, die auf Nanotüpfeln („Patterns") auf einer Oberfläche gewachsen
sind, oder von Zellen, die in mehreren Vertiefungen einer Multi-Well-Platte enthalten
sind. Zellen, die auf Nanotüpfeln
auf einer Oberfläche
gewachsen sind, oder Zellen, die in mehreren Vertiefungen einer
Multi-Well-Platte enthalten sind, sind bestens geeignet für das hier
dargestellte zweidimensionale (2D) EGK-Array-Format. In jedem Fall
erfasst eine einzelne Kapillarspitze eine bestimmte Zelle 6 oder
eine Population von Zellen 6 auf einer Oberfläche oder,
wie hier dargestellt, in einer vertieften Struktur 18.
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7 zeigt eine Ausführungsform für die parallele
Abgabe von Zell-Beladungsagentien mit der vorliegenden Erfindung.
Jede EGK 1 in einem Array ist hier mit einem mikrofluidischen
Schalter 16 verbunden, der das sequentielle Laden von mehreren
Zell-Beladungsagentien in die EGK ermöglicht, um getrennte Zonen
dieser Zell-Beladungsagentien
in dieser EGK zu erhalten. Da mehrere verschiedene Zell-Beladungsagentien,
die in unterschiedlichen Vials enthalten sind, ausgewählt werden
können,
kann jede EGK im Array in jeder möglichen Abfolge/Kombination
von Zell-Beladungsagentien beladen werden. In 7a sind
mehrere einzelne Zellen, die sich in verschiedenen Vertiefungen
in einer Multi-Well-Struktur 18 befinden, nach der sequentiellen
Abgabe der Zell-Beladungsagentien
der gleichzeitigen (parallelen) Elektroporation ausgesetzt. Dieser
Aufbau ermöglicht
auch die kombinierte Abgabe von Zell-Beladungsagentien wie in 7b,
wobei jede EGK im Array in einer anderen Abfolge von Zell-Beladungsagentien
beladen wird.
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8 ist
ein Schaubild der Fluoreszenz gegenüber der Zeit der Identifikation
des intrazellulären
Ryanodin II-Rezeptors in mit Fluo-3 gefärbten NG108-15-Zellen.
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9 zeigt
die Ergebnisse des Nachweises von intrazellulären Proteasen unter Verwendung
von Casein-BODIPY-FL.
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10 zeigt
die Ergebnisse der Identifikation von alkalischer Phosphatase in
NG108-15-Zellen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Wie
oben beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung ein hochortsaufgelöstes Verfahren
zur Elektroporation und parallelen Abgabe – mit der Möglichkeit der Kombination mit
der sequentiellen Abgabe – von einzelnen
oder mehreren Zell-Beladungsagentien an mindestens eine Zellstruktur,
wie beispielweise eine Zelle oder zelluläre Struktur, um diese Zell-Beladungsagentien
in diese Zellstruktur einzuschleusen. Genauer gesagt verwendet das
beschriebene Verfahren mindestens zwei Elektrolytgefüllte Kapillaren
(EGKs), die mit einem Spannungs- oder
Stromgenerator zur Elektroporation der Zellstruktur verbunden sind,
wobei die EGKs an der Zellstruktur anliegend platziert werden und
eine Spannung oder ein Strom, zum Beispiel mindestens ein Spannungspuls,
an die EGKs angelegt wird, die/der ein kleines elektrisches Feld
außerhalb
des Endpunktes jeder EGK erzeugt, wodurch die Bildung von Poren
in der Membran der anliegenden Zellstruktur ausgelöst wird.
Einzelne oder mehrere Zell-Beladungsagentien, die in den EGKs enthalten
sind, werden parallel an den Orten der Porenbildung abgegeben, zum
Beispiel durch ein Pumpverfahren, das es dem/den Zell-Beladungsagens/Zell-Beladungsagentien
ermöglicht,
die Membran zu verlagern und durch die Poren in das Innere der Zellstruktur
einzudringen. In einer Ausführungsform
können
die Agentien, die in die Zellen eingeschleust werden sollen, aus
einer Anzahl von Behältern
ausgewählt
werden, die diese Agentien auf kombinatorische Weise enthalten.
Die Kombination aus Porenbildung und der Abgabe von Agentien, die
der Elektrolytlösung
der EGKs hinzugefügt
werden, ermöglicht
das Beladen von Materialien zum Beispiel in das Cytoplasma der Zellstruktur. Dies
wird weiterführend
in 1 dargestellt.
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Es
wird vorstehend ausgeführt,
dass die Erfindung zur Abgabe von Membran-impermeablen Zell-Beladungsagentien
an und/oder in eine Zellstruktur verwendet werden kann. Die Zellstruktur
kann entweder eine oder mehrere Zellen oder eine oder mehrere zelluläre Strukturen
umfassen. Wenn es eine oder mehrere Zellen sind, können diese
jede Art von eukaryotischer oder prokaryotischer Zelle in einer
konfluenten Kultur, einem Gewebeschnitt oder einem Gewebe darstellen.
Die Zellstruktur kann vor der Elektroporation vorbehandelt werden.
Sie kann beispielsweise mit einem Farbstoff wie Fluo-3-AM-Ester
beladen werden für
den Nachweis von Bindungsvorgängen,
die zu einer erhöhten
Konzentration von Calciumionen im Cytosol führen können, oder sie kann mit einem
Reportergen oder anderen genetisch adressierbaren, molekularen Systemen
transfiziert werden. Die Zellstrukturen können auch mit anderen chemischen
oder physikalischen Mitteln behandelt werden, zum Beispiel in einer
Aufnahmekammer. Es können
beispielsweise relevante Wirkstoffe vor, während oder nach dem Elektroporationsvorgang
zu der Zellbadlösung
hinzugefügt
werden. Die Abgabe solcher Agentien kann durch eine zusätzliche
Kapillare oder Pipette in Verbindung mit der Aufnahmekammer erfolgen,
entweder abschnittsweise (an alle Zellen oder Zellstrukturen oder
einer Mehrheit der Zellen oder Zellstrukturen) oder lokal (an eine
Einzelzelle oder eine einzelne Zellstruktur). Es ist auch möglich, eine
Population von Zellen zu verwenden, vorzugsweise eine Population
von Zellen bzw. eine kleine Population von Zellen mit 2 bis 10.000.000
Zellen bzw. 2 bis 10.000 Zellen, in einer konfluenten Kultur, einem
Gewebeschnitt, einem Gewebe oder einem Organ, oder in Zellen, die
sich auf einer Oberfläche
von Nanotüpfeln
gebildet haben. Diese zelluläre
Struktur kann eine intrazelluläre
Struktur sein, eine Organelle (isoliert oder intrazellulär), ein
Membranvesikel, ein Bakterium oder ein Nanobakterium. Es ist auch
möglich,
das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung auf Zellstrukturen anzuwenden, die aus synthetischen Membranstrukturen
gebildet werden, wie Liposomen oder Emulsionströpfchen.
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Mit
dem Verfahren gemäß der Erfindung
ist es möglich,
im Wesentlichen jede Art von Substanz, Agens oder Zell-Beladungsagens
in eine elektroporierte Zellstruktur einzuschleusen. Mit einem Zell-Beladungsagens ist
ein Agens gemeint, das meistens polar ist und unfähig, biologische
Membranen spontan zu passieren. Beispiele für solche Substanzen oder Zell-Beladungsagentien
umfassen die folgenden Agentien, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Gene,
Gen-Analoga, RNA, RNA-Analoga, DNA, DNA-Analoga, kolloidale Partikel,
Rezeptoren, Rezeptorliganden, Rezeptorantagonisten, Rezeptoragonisten,
Rezeptorblocker, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, Enzymmodulatoren, einschließlich allosterischer
Enzymmodulatoren, Proteine, Protein-Analoga, Aminosäuren, Aminosäuren-Analoga, Peptide,
Peptid-Analoga, Metabolite, Metabolit-Analoga, Oligonukleotide,
Oligonukleotid-Analoga,
Antigene, Antigen-Analoga, Haptene, Hapten-Analoga, Antikörper, Antikörper-Analoga, Organellen, Organellen-Analoga,
Zellkerne, Bakterien, Viren, Gameten, anorganische Ionen, organische
Ionen, Metallionen, Metallcluster, Agentien, die die zelluläre Chemie
beeinflussen, Agentien, die die zellulären physikalischen Vorgänge beeinflussen,
Polymere sowie beliebige Kombinationen von zwei oder mehreren dieser
Agentien.
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Die
verwendeten Elektrolyt-gefüllten
Kapillaren (EGKs) bestehen vorzugsweise aus einem elektrischisolierenden
Material, um das aufgebaute elektrische Feld zu beschränken, und
können
aus Glas, Quarz, Plastik oder Polymer, beispielsweise Teflon, oder
jedem anderen geeigneten Material bestehen. Es ist auch möglich, Kapillaren
mit leitfähigen
Spitzen zu verwenden. Die Form der Kapillaren kann ein perfekter
Zylinder mit flachen Enden sein, wie in 2a dargestellt.
Es ist manchmal von Vorteil, eine zulaufende Kapillare zu verwenden,
wie in 2b dargestellt, besonders für die Einzelzell-
oder Organellen-Elektroporation. Solche zulaufenden Kapillaren können durch
Ziehen einer Glas- oder Quarzkapillare in einer mechanischen Zugvorrichtung
mit einem Heizfaden hergestellt werden (A. Lundgvist, J. Pihl, O.
Orwar. A Anal. Chem. (2000) 72 5740–5743). Zulaufende Spitzen
können
zusätzlich
durch Ätzen
in Fluorwasserstoffsäure
oder durch Schleifen hergestellt werden. Der Vorteil des Schleifens
ist, dass nur der äußere Durchmesser
der Kapillare verkleinert wird, wogegen der innere Durchmesser gleich
bleibt. Daher kommt es in dieser Art von Kapillare zu keinem zusätzlichen
Druckaufbau in der Spitzenregion. Diese Art von Kapillare wird in 2c dargestellt.
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Die
Länge der
Kapillaren kann in Abhängigkeit
von der Anwendung von 0,01 mm bis zu mehreren Metern betragen. Da
die Spannung kontinuierlich an der Kapillare abfällt, sollten entsprechende
Spannungsquellen gewählt
werden, um sicherzustellen, dass ausreichend hohe Spannungen angelegt
werden können,
um die Porenbildung in der Zielzelle oder zellulären Struktur auszulösen. Der äußere Durchmesser
und die Kanalmaße
der Kapillare hängen
von der Anwendung ab. Im Allgemeinen beträgt der Durchmesser des EGK-Endes, das
sich am nahsten an der Zellstruktur befindet, einige Nanometer bis
mehrere tausend Mikrometer, beispielsweise 50 nm bis 5.000 μm. Für die Einzelzell- oder Organellen-Elektroporation
ist es oft geeignet, Kapillaren mit einem äußeren Durchmesser von 0,03–50 μm und einem
Kanaldurchmesser von 0,025–49 μm zu verwenden,
wogegen für
die Elektroporation von kleinen Populationen von Zellen Kapillaren
mit einer Größe von mehr als
50 μm vorzugsweise
verwendet werden.
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Bei
der Verwendung von elektrisch-isolierenden Kapillaren wird der elektrische
Strom, der für
die Elektroporation einer Zellstruktur benötigt wird, durch die Elektrolyte
geleitet, die in der Lösung
in den inneren Kanälen
der Kapillaren enthalten sind. Die Elektroden, vorzugsweise Platinelektroden,
die den von einem Spannungsgenerator erzeugten Strom dem Kapillarsystem
zuführen,
können
direkt mit dem hinteren Ende der Elektrolyt-gefüllten Kapillare oder über ein
Vial mit der gleichen Elektrolytlösung wie die in der EGK verbunden
sein. Da das Vial, das die Elektrode und den Kapillareinlass enthält, typischerweise
mehrere Zentimeter von dem Kapillarauslass entfernt ist, gibt es
keine Probleme mit elektrisch erzeugten Spezies, die möglicherweise
die Zellen beschädigen
können.
Manchmal ist es vorzuziehen, dass das Vial auch die Agentien enthält, die
in die Zellstruktur eingeschleust werden sollen. Es ist auch möglich, die
Elektrode in der Elektrolyt-gefüllten
Kapillare zu platzieren. Dies wird bei der Verwendung von sehr kurzen
Kapillaren bevorzugt. In Abhängigkeit
von der Zusammensetzung des Puffers werden die Bedingungen an den
Elektroden verändert.
Elektrochemische Reaktionen an den Elektroden, z. B. die Reduktion
von Wasser und die Oxidation von Chlorid, führen zu einigem Verlust an
Spannung, und die effektive Spannung sollte für jede mögliche Zusammenstellung von
Elektrodenmaterialien und Puffersystemen berechnet werden.
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Die
Kapillaren können
auch mit Schichten von leitfähigem
Material an ihrer Spitze hergestellt werden, wie in den 2d-e
dargestellt wird. Der Vorteil solcher hohlen Kapillaren mit leitfähigen Spitzen
ist die Anwendung kürzerer
Pulszeiten mit hoher Präzision
aufgrund der niedrigen RC-Zeitkonstanten.
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Es
wird vorstehend beschrieben, dass die Flüssigkeit, die die Zell-Beladungsagentien
enthält,
durch einen Pumpvorgang an die Zellstruktur abgegeben wird. Dieser
Pumpvorgang kann zum Beispiel Elektroosmose, Elektrophorese, druckbetriebenes
Pumpen oder Gravitationsfluss oder Kombinationen davon darstellen.
Vorzugsweise wird der elektrophoretische oder elektroosmotische
Transport von Fluid für
die Reagenzabgabe verwendet. Als wichtige Anmerkung gilt, dass diese
Pumpverfahren die elektrische Aufladung der inneren Oberfläche der
Kapillaren erfordern. Wenn zum Pumpen nicht die Elektroosmose oder
Elektrophorese angewendet wird, muss eine geeignete Apparatur zum
Herstellen des Flusses an den Einlass der EGK vor, während oder
nach der Elektroporation angeschlossen werden, zum Beispiel eine
peristaltische Pumpe, ein Mikroinjektor/eine Mikropumpe oder ein
anderes Gerät
zum Weiterleiten von Fllüssigkeiten.
Es kann manchmal von Vorteil sein, Agentien an Zellen unter Verwendung
eines Pumpverfahrens abzugeben und elektrische Pulse zur Elektroporation
periodisch anzulegen. Eine Menge an Elektrolyt, das in einer EGK
enthalten ist, wird beispielsweise mit Hilfe einer peristaltischen
Pumpe zur Zelloberfläche
gepumpt, und die Elektroporationsspannung wird angelegt und anschließend weggenommen.
Dann wird eine neue Menge an Elektrolyt durch die gleiche EGK zu
der Zelloberfläche
gepumpt, und die Elektroporationsspannung wird wieder angelegt und
anschließend
weggenommen usw. Diese Art der Abgabe mit periodischer Elektroporation
kann besonders von Vorteil sein, wenn segmentierte Banden (getrennte
Zonen) von verschiedenen Zell-Beladungsagentien im EGK vorhanden
sind. Solche Banden können
unter Verwendung des unten beschriebenen mikrofluidischen Umschaltverfahrens
erzielt werden. Zusätzlich
zu dem obigen Beispiel können
viele verschiedene Anordnungen betrachtet werden, bei denen der
Spannungsgenerator programmiert oder manuell gesteuert wird, um
für optimale
Beladungsbedingungen für
verschiedene Arten von Zell-Beladungsagentien und Zellen zu sorgen. Somit
können
während
der Zell-Beladung unter Verwendung einer EGK die Pulslänge, Wellenform,
Pulsamplitude und andere relevante Parameter verändert werden. Folglich wird
die Verwendung eines programmierbaren Spannungsgenerators gemäß der vorliegenden
Erfindung bevorzugt.
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Eine
oder mehrere EGKs zur Elektroporation können zusammen mit einer einzelnen
Gegen- oder zweiten Elektrode mit einer anderen Größe und aus
einem anderen Material verwendet werden. Die Elek-troden können für die Elektroporation
der Zellmem-bran an einer Zelle anliegend platziert werden. Vorzugsweise wird
eine Gegenelektrode verwendet, die die Zellbadlösung auf einem Bezugspotential
hält.
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Wie
der Begriff besagt, ist die EGK mit einer Elektrolyt-enthaltenden
Lösung
gefüllt.
Es werden vorzugsweise physiologische Puffer verwendet. Die Zell-Beladungsagentien,
die in das Cytosol des zellulären Ziels
eingeschleust werden sollen, werden vorzugsweise dieser Elektrolyt-enthaltenden
Lösung
hinzugefügt. Außerdem kann
die EGK mit Wirkstoffen oder Agentien ergänzt werden, die mit den Zielen
interagieren; die sich in der Zellplasmamembran befinden. Solche
Ziele umfassen Plasmamembran-gebundene Rezeptoren und Enzyme. Die
Injektion oder Befüllung
einer EGK kann auf mehrere Arten unter Verwendung von Standardtechniken
zum Befüllen
von CE-Kapillaren erfolgen. Die Elektrolytlösung wird beispielsweise unter
Verwendung des Gravitationsflusses oder eines druckbetriebenen Pumpverfahrens
hydrodynamisch in die Kapillare injiziert.
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Es
wird manchmal vorzuziehen, Kapillaren vom Spitzenende aus unter
Verwendung der Kapillarkräfte oder
von Ansaugen/Unterdruck zu beladen. Dieser Prozess kann verwendet
werden, um mehrere EGK gleichzeitig zu beladen. Die Spitzen der
EGKs werden in einzelnen Vials positioniert, die Zell-Beladungsagentien
enthalten, und eine kleine Probe wird in die EGKs unter Verwendung
von einem der oben genannten Verfahren eingeführt.
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Der
Spannungspuls zum Erzeugen von Poren in Zellmembranen, der durch
einen Spannungsgenerator erzeugt wird, kann eine rechteckige, exponentielle
oder anders geformte Wellenform aufweisen. Es ist auch möglich, Gleichstrom
und Wechselstrom zu verwenden. Da die Spannung kontinuierlich an
der Kapillare abfällt,
sollten entsprechende Spannungsquellen gewählt werden, um sicherzustellen,
dass ausreichend hohe Spannungen angelegt werden können, um
die Porenbildung in der Ziel-Zelle oder zellulären Struktur auszulösen. Die
elektrischen Felder, die zum Auslösen der Elektroporation benötigt werden,
variieren stark in Abhängigkeit
von der Art und der Größe der behandelten
Zellstruktur. Wie oben beschrieben, ist es auch möglich, das
Potential und die Wellenform über
der EGK während
der Agentienabgabe an die Zellstruktur zu variieren, d.h. die Abgabe
und Elektroporation wird nicht bei einem konstanten elektrischen
Potential oder einer konstanten elektrischen Feldstärke ausgeführt. Solch
eine Spannungsprogrammierung wird vorzugsweise verwendet, wenn mehrere
Komponenten auf sequentielle Weise in eine Zellstruktur eingeschleust
werden. Die Dauer des Spannungspulses kann in Abhängigkeit
von der Art und Größe der behandelten
Zellstruktur und von der Art des Zell-Beladungsagens zwischen wenigen
Mikrosekunden und mehreren Minuten variieren.
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Während des
Anlegens des Spannungs- oder Strompulses wird die Zellstruktur durch
die Porenbildung permeabilisiert, wodurch es polaren gelösten Substanzen,
die sonst biologische Doppelschicht-Membranen nicht passieren können, ermöglicht wird,
durch Diffusion oder hydrodynamischen Fluss in das Innere der Zellstruktur
zu gelangen. Die örtliche
Auflösung
des Verfahrens gemäß der Erfindung
wird von der Spitzengröße der EGK
bestimmt, die derart gebaut sein kann, dass der Durchmesser nur
wenige Nanometer beträgt,
sowie von der angelegten Spannung und dem Spaltabstand zwischen
der EGK und dem Elektroporationsziel. Dieser Spaltabstand hängt hauptsächlich davon
ab, welche Art von zellulärer
Struktur elektroporiert werden soll und kann somit zwischen wenigen
Nanometern und einigen hundert Mikrometern variieren.
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Die
Positionierung der EGK erfolgt vorzugsweise unter Einwirkung von
manuell gesteuerten Mikropositionierern wie hydraulisch oder piezoelektrisch
gesteuerte Mikromanipulatoren. Zusätzlich zur Verwendung von manuell
gesteuerten Mikropositionierern ist es möglich, automatisch gesteuerte
oder robotergesteuerte Mikropositionierer zu verwenden. Eher als
die Bewegung der Kapillare über
der fixierten Zelle ist es auch möglich, an Mikroskopen angebrachte,
motorisierte Translationsgestelle oder andere ähnliche Geräte zum Bewegen der Zelle zu
verwenden, während
die Kapillare fixiert gehalten wird.
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Bei
der Verwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung für intrazelluläre Screening-Anwendungen wird
vorzugsweise eine große
Menge an verschiedenen Zell-Beladungsagentien
in das Cytosol von einer oder mehreren Zellen oder zellulären Strukturen
auf gesteuerte Weise eingeschleust. Das Screening erfolgt vorzugsweise
unter Verwendung der parallelen Abgabe – mit der Möglichkeit der Kombination mit
der sequentiellen Abgabe – von
Zell-Beladungsagentien an das zelluläre Ziel und kann beispielsweise
wie unten beschrieben ausgeführt
werden.
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Die
parallele Abgabe von mehreren Zell-Beladungsagentien kann durch
EGK-Arrays erfolgen. Arrays von EGKs können mittels Mikrofabrikationstechniken
erstellt werden und umfassen somit eine feste Struktur, oder sie
setzen sich aus mehreren herkömmlichen
EGKs zusammen, die durch eine Art von Halter oder Gerüst zusammengehalten
werden. Diese Anordnungen von Kapillaren können eindimensionale Arrays
(linear) oder zweidimensionale Arrays sein. Vorzugsweise werden
Arrays von 10–100.000
EGKs verwendet.
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Die
parallele Elektroporation und Abgabe ermöglicht das gleichzeitige Screening
von verschiedenen räumlich
getrennten Einzelzellen oder von Populationen von räumlich getrennten
Zellen auf parallele Weise.
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Gemäß einer
Ausführungsform
besteht die Zellstruktur aus Zellen, die auf Nanotüpfeln auf
einer Oberfläche
gewachsen sind, oder aus Zellen, die in mehreren Vertiefungen einer
Multi-Well-Platte enthalten sind, wie in 6 dargestellt.
Die Platte kann beispielsweise eine standardisierte industrielle
Platte sein, die zum Beispiel 96 Vertiefungen aufweist. Bei der
parallelen cytosolischen Abgabe von Zell- Beladungsagentien erfasst jeder einzelne
Kapillarauslass in einem Array aus Kapillaren eine bestimmte Zelle
oder eine Population von Zellen auf einer Oberfläche oder in einer vertieften
Struktur. Somit können
einzelne Zellen oder Populationen von Zellen individuell mit den
gleichen, oder unterschiedlichen, Verbindungen gezielt erfasst werden,
wobei diese gleichzeitig in das Cytoplasma eingeschleust werden.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
für das
parallele Screening mit der vorliegenden Erfindung wird in 7 dargestellt.
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Die
parallele Abgabe von Zell-Beladungsagentien kann mit der sequentiellen
Abgabe von Zell-Beladungsagentien kombiniert werden. Solch eine
kombinierte Abgabe kann durch die Auswahl von Zell-Beladungsagentien
für jedes
EGK aus mehreren Behältern
erfolgen, die diese Zell-Beladung sagentien enthalten, wie in 3b dargestellt.
Die Abgabe kann auch durch die Aktivierung von verschiedenen EGKs
in einem Array aus EGKs erfolgen, wobei jede EGK verschiedene Zell-Beladungsagentien
enthält.
Sie kann auch vorgenommen werden, indem Agentien mittels eines mikrofluidischen
Umschaltgeräts
in einer bestimmten Reihenfolge in eine einzelne EGK geladen werden,
wie in 7 dargestellt.
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Es
gibt mehrere Ausführungsformen
der sequentiellen Abgabe, die für
die Verwendung zusammen mit der parallelen Abgabe gemäß der Erfindung
geeignet sind. Im Folgenden werden einige Beispiele für geeignete
Ausführungsformen
beschrieben.
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Gemäß einer
Ausführungsform
erfolgt die sequentielle Abgabe von mehreren Zell-Beladungsagentien durch
EGK-Arrays. Arrays von EGKs können
durch Mikrofabrikationstechniken erstellt werden und somit eine feste
Struktur umfassen, oder sie setzen sich aus mehreren herkömmlichen
EGKs zusammen, die durch eine Art von Halter oder Gerüst zusammengehalten
werden. Diese Anordnungen von Kapillaren können eindimensionale Arrays
(linear) oder zweidimensionale Arrays sein. Vorzugsweise werden
Arrays von 10–100.000 EGKs
verwendet. Um die sequentielle Abgabe von Zell-Beladungsagentien in dieser Ausführungsform
der Verwendung von EGK-Arrays zu erreichen, enthält jede EGK eine Art von Zell-Beladungsagens
oder eine spezifische Mischung aus mehreren Zell-Beladungsagentien. Die sequentielle
Abgabe kann durch die schnelle Bewegung des Arrays aus EGKs über dem
zellulären
Ziel in schneller Abfolge erfolgen, wobei jede EGK die Elektroporation
und die nachfolgende Abgabe von einer Art von Zell-Beladungsagens
oder spezifischer Mischung von mehreren Zell-Beladungsagentien auslöst. Anstelle
der Bewegung des Arrays aus Kapillaren ist es auch möglich, die
Zellstrukturen in Bezug auf die örtlich
fixierten Kapillaren zu bewegen. Das fluidische Pumpen in diesen
Arrays kann durch jede Art von Pumpenverfahren, die oben beschrieben
sind, erzeugt werden. Beispiele für ein- und zweidimensionale
Arrays, die gemäß dieser
Ausführungsform
für die
sequentielle Abgabe von Zell-Beladungsagentien
verwendet werden können,
werden in 3 dargestellt. Eine besondere
Form von Array ist die Mehrkammer-EGK, die in 4 dargestellt
wird. Diese Kapillare ist dadurch gekennzeichnet, dass sie mehrere
innere Kanäle
aufweist. Um die cytosolische Abgabe von Zell-Beladungsagentien
oder spezifischen Mischungen von mehreren Zell-Beladungsagentien
zu erreichen, ist jede Kammer in der Kapillare mit einer einzelnen
Art von Zell-Beladungsagens oder einer spezifischen Mischung von
mehreren Zell-Beladungsagentien
gefüllt
und mit einer individuell anwählbaren
Elektrode ausgestattet. Durch die sequentielle Aktivierung der einzelnen
Kammern, d. h. durch die aufeinander folgende Anlegung von Spannungspulsen
in den einzelnen Kanälen,
ist es möglich,
kontrollierte Mengen an Zell-Beladungsagentien an die Zellen oder
zellulären Strukturen
sequentiell abzugeben. Diese Art von Mehrkammer-Elektrode kann auch
für die
parallele Abgabe von Agentien an eine Zellstruktur durch gleichzeitiges
Anlegen einer Spannung an mehr als einen Kanal verwendet werden.
Das Pumpen von Flüssigkeiten
in Mehrkammer-EGKs erfolgt vorzugsweise unter Verwendung eines elektroosmotisch
oder elektrophoretisch erzeugten Flusses. Die Anzahl der verschiedenen
Agentien, die mit diesem Verfahren abgegeben werden können, ist
jedoch durch die Anzahl der Kammern in der EGK begrenzt. Es ist
auch möglich,
Arrays aus Mehrkammer-EGKs wie vorstehend beschrieben, zu erstellen.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
erfolgt die sequentielle Abgabe von mehreren Zell-Beladungsagentien
durch die Verbindung einer herkömmlichen
EGK mit einem mikrofluidischen Schalter zum Probenstapeln. In dieser
Anordnung können
mehrere Zell-Beladungsagentien sequentiell in die EGK eingeschleust
werden und nacheinander an die einzelnen oder an mehrere zelluläre Ziele
abgegeben werden. Die Zell-Beladungsagentien
können
durch eines der oben beschriebenen Pumpverfahren in getrennte Zonen
in der EGK eingeschleust werden. Entweder die EGK wird vor den Elektroporationsversuchen
mit Zell-Beladungsagentien vorgeladen, oder sie wird „on-the-fly" geladen, d. h. während der
Elektroporationsversuche. Ein Beispiel für diese zweite Ausführungsform
wird in 5 dargestellt.
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Gemäß noch einer
weiteren Ausführungsform,
erfolgt die sequentielle Abgabe von mehreren Zell-Beladungsagentien
durch die Einführung
eines Trennungsschritts, während
das Fluid durch die EGK gepumpt wird. Wenn das elektrophoretische
Pumpverfahren für
die Abgabe der Reagenzen verwendet wird, werden alle Arten, die
sich in der Elektrolytlösung
befinden, auf der Grundlage ihres Verhältnisses zwischen Ladung und Reibungswiderstand
getrennt und sequentiell an das zelluläre Ziel abgegeben. Analog dazu
kann die sequentielle Abgabe von Reagenzen durch die Integration
jedes Trennungsverfahrens erfolgen, das auf das EGK-Format anwendbar
ist. Es ist beispielsweise möglich,
chromatographische Trennungsverfahren zu verwenden.
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Somit
kann die vorliegende Erfindung in schnellen intrazellulären Screening-Anwendungen
verwendet werden, die ein beliebiges der folgenden Verfahren umfassen:
- 1. Die intrazelluläre Abgabe von Membranimpermeablen
Zell-Beladungsagentien an eine Einzelzelle oder eine Population
von Zellen eines Zelltyps.
- 2. Die intrazelluläre
Abgabe von Membran-impermeablen Zell-Beladungsagentien an räumlich getrennte Einzelzellen
oder eine Population von Zellen des gleichen Zelltyps.
- 3. Die intrazelluläre
Abgabe von Membran-impermeablen Zell-Beladungsagentien an räumlich getrennte Einzelzellen
oder eine Population von Zellen verschiedener Zelltypen.
- 4. Die sequentielle intrazelluläre Abgabe von Membran-impermeablen
Zell-Beladungsagentien an eine Einzelzelle oder eine Population
von Zellen eines Zelltyps.
- 5. Die sequentielle intrazelluläre Abgabe von Membran-impermeablen
Zell-Beladungsagentien an räumlich getrennte
Einzelzellen oder eine Population von Zellen des gleichen Zelltyps.
- 6. Die sequentielle intrazelluläre Abgabe von Membran-impermeablen
Zell-Beladungsagentien an räumlich getrennte
Einzelzellen oder eine Population von Zellen verschiedener Zelltypen.
- 7. Die parallele intrazelluläre
Abgabe von Mem-branimpermeablen Zell-Beladungsagentien an eine Einzelzelle oder
eine Population von Zellen eines Zelltyps.
- 8. Die parallele intrazelluläre
Abgabe von Mem-branimpermeablen Zell-Beladungsagentien an räumlich getrennte
Einzelzellen oder eine Population von Zellen des gleichen Zelltyps.
- 9. Die parallele intrazelluläre
Abgabe von Membranimpermeablen Zell-Beladungsagentien an räumlich getrennte
Einzelzellen oder eine Population von Zellen verschiedener Zelltypen.
- 10. Eine Kombination aus paralleler und sequentieller intrazellulärer Abgabe
von Membran-impermeablen Zell-Beladungsagentien
an eine Einzelzelle oder eine Population von Zellen eines Zelltyps.
- 11. Eine Kombination aus paralleler und sequentieller intrazellulärer Abgabe
von Membran-impermeablen Zell-Beladungsagentien
an räumlich
getrennte Einzelzellen oder eine Population von Zellen des gleichen Zelltyps.
- 12. Eine Kombination aus paralleler und sequentieller intrazellulärer Abgabe
von Membran-impermeablen Zell-Beladungsagentien
an räumlich
getrennte Einzelzellen oder eine Population von Zellen verschiedener Zelltypen.
- 13. Jede Art von intrazellulärer
Abgabe von Zell-Beladungsagentien, die oben beschrieben wurde (1–12), die
auf kombinatorische Weise verwendet wird.
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Die
wichtigsten Anwendungen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung
liegen im Wirkstoff-Screening
und in der Proteinidentifikation. Insbesondere durch das Anlegen
eines permeabilisierenden elektrischen Feldes über Zellen oder zellulären Strukturen
können
spezifische Testsubstanzen (Marker), Substrate oder Liganden in
das Cytoplasma eingeschleust werden, um auf die intrazelluläre Chemie,
wie cytosolische Enzyme und Rezeptoren an Organellen, zu testen.
Genauer gesagt würde
dies das Screening der intrazellulären Wirkstoffwirkung sowie
die Analyse von intrazellulären
Proteinen, wie Enzyme, Rezeptoren oder Strukturproteine, ermöglichen.
Durch die Verwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung können diese
Marker in Kombination mit Wirkstoffen oder Liganden eingeschleust
werden, die direkt mit dem Zielprotein oder den Zielproteinen im
gleichen Signalweg interagieren. Somit ist es gemäß der vorliegenden
Erfindung möglich, das
Vorhandensein von verschiedenen Proteinen und ihre Funktion sogar
auf der Einzelzellebene zu charakterisieren. Die Blockierung bestimmter
Wege mit spezifischen Liganden, Antagonisten, Inhibitoren oder Modulatoren
könnte
die Kontrolle der zellulären
Prozesse ermöglichen
und Hinweise auf neuartige Systeme geben. Solche Verbindungen können in
eine Zelle entweder durch Co-Elektroporation mittels einer EGK mit
dem relevanten Liganden eingeschleust werden. Alternativ dazu können sie
in eine Zellstruktur durch andere Mittel eingeschleust werden, zum
Beispiel durch die Nutzung von Zell-permeablen Agentien.
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Im
Allgemeinen kann das Verfahren gemäß der Erfindung in den folgenden,
nicht einschränkenden Anwendungsgebieten
verwendet werden: Proteomik, Genomik, Phänotypenerstellung, Wirkstoffassays
und Screening, Pharmacokinetik, in-vitro-Befruchtung, Transgenetik,
Kern-Übertragung,
Organellen-Übertragung und
Diagnostik. Da die Technik auch verwendet werden kann, um die Eigenschaften
von Zellen zu verändern, d.
h. die Zellprogrammierung und die Ausführung dieser Programmierung
in Netzwerken von Zellen, ist die Erfindung auch beim Entwurf und
bei der Anwendung von biologischen und chemischen Computern sowie
Biosensoren von Nutzen. Ebenso kann die Erfindung in der Robotik
nützlich
sein, besonders um Zellkreisläufe
mit bestimmten Eigenschaften zu erzeugen, wie beispielsweise zelluläre Sensornetzwerke
und zelluläre
Steuerungsnetzwerke.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
kann auch mit Screening-Techniken für oberflächliche Plasmamembran-Epitope oder Rezeptoren
kombiniert werden. So kann zum Beispiel ein Rezeptorligand, der
auf einen Zellplasmamembran-Rezeptor einwirkt, im EGK-Elektrolyt
mit einem oder mehreren Wirkstoffen kombiniert werden, die die intrazelluläre Chemie
beeinflussen. Die Lösung
kann dann an die Zelloberfläche
in niedrigen nichtpermeabilisierenden oder nullelektrischen Feldern
abgegeben werden, und nachdem sich der Ligand, der auf einen Zellplasmamembran-Rezeptor
einwirkt, an den Rezeptor gekoppelt hat, gelangen die einzuschleusenden
Agentien durch Elektroporation in die Zelle. Solche Verfahren könnten besonders
für die
Beschreibung von Signalwegen geeignet sein.
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Noch
genauere, aber immer noch nicht einschränkende, Anwendungen, bei denen
das Verfahren gemäß der Erfindung
verwendet werden kann, sind Gen-Transfektion,
Gen-Identifikation, Enzym-Identifikation, Protein-Identifikation,
Rezeptor-Identifikation, Bindungsassays, Enzymassays, kompetitive
Enzymassays, Nicht-kompetitive Enzymassays, Enzymassays mit Modulatoren,
Enzymassays mit isosterischen Inhibitoren, Rezeptorassays, Rezeptorassays
mit Antagonisten, Rezeptorassays mit Modulatoren, virale Assays,
bakterielle Assays, Wirkstoffassays, kinetische Assays, Modifizierung
von Stoffwechselwegen und Signalwegen.
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Im
Besonderen ist das Verfahren gemäß der Erfindung
sehr gut geeignet zur Identifikation von intrazellulären Rezeptoren
und Rezeptorliganden.
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Die
intrazellulären
Rezeptoren und Ionenkanäle,
die die Freisetzung von Signalmolekülen wie Ca2+-, cAMP,
K+ usw. bewirken, können identifiziert und untersucht
werden mittels Ligandenbibliotheken, die in die Zellen elektroporiert
werden, vorzugsweise in Kombination mit ausgewählten Rezeptor-Antagonisten.
Zum Beispiel kann Ca2+, das nach der Aktivierung
eines intrazellulären
Rezeptors aus den intrazellulären
Speichern freigesetzt wird, mit Hilfe von fluorogenen Chelatbildnern
wie Mag fura-2 and Fluo-3 nachgewiesen werden. Als ein Beispiel zeigen
wir hier die Identifikation von Ryanodin-Rezeptoren des endoplasmatischen
Retikulums (8). Weiterhin kann zur Identifikation
des Rezeptors oder der Aufdeckung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen
ein ausgewählter
Rezeptor-Antagonist verwendet und in die Zelle elektroporiert werden,
um selektiv die Wirkung des Liganden zu blockieren. Zusätzlich zu
Fluoreszenz-Testsubstanzen
können
Radioliganden, Blotverfahren oder elektrophysiologische Verfahren
und fluorogene Substrate verwendet werden. Fluorogene Marker sind
oft Zellpermeante Ester, die dem Zellbadmedium zugefügt werden
können
und nicht in die Zellen elektroporiert werden müssen. Somit können Zellen
unter Verwendung solcher Ester vor den Elektroporationsversuchen
mit Markern beladen werden. Durch die Fähigkeit, einen Rezeptor-Agonisten zusätzlich zu
einem Marker für
die spezifische Rezeptoraktivierung einzuschleusen, ist es möglich, die
stärksten
Rezeptor-Agonisten aus einer Bibliothek von Agonisten zu identifizieren.
Es ist auch möglich,
Versuche zu entwickeln, um Dosis-Wirkungs-Kurven zu ermitteln. Mit
dem Verfahren gemäß der Erfindung
ist es beispielsweise möglich;
zusätzlich
zu einem Marker für
die spezifische Rezeptoraktivierung einen Rezeptor-Agonisten und
einen Rezeptor-Antagonisten mit unterschiedlichen Konzentrationen
der jeweiligen Komponente in das Zell-Cytosol einzuschleusen. Es
ist auch möglich,
einen Rezeptor-Agonisten und einen Rezeptorantagonisten mit unterschiedlichen
Konzentrationen der jeweiligen Komponente in das Zell-Cytosol einzuschleusen,
mit dem allgemeinen Ziel, die Art des Rezeptor-Agonisten und der
Rezeptor-Antagonist-Bindung
herauszufinden, d. h. ob sie konkurrierend oder nicht-konkurrierend
sind usw. Zusätzlich
zur Identifikation von Rezeptoren und Liganden kann auch das so
genannte „Ligand
Fishing" oder „De-Orphaning" auf diese Weise
durchgeführt
werden. Eine Zelle mit einem bekannten Set an Rezeptoren wird als
Detektor verwendet und eine Bibliothek von möglichen Ligandenproben wird
in das Zell-Cytosol eingeschleust, um die Wirkung dieser Liganden
zu testen.
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Außerdem ist
die Erfindung für
die Identifikation von intrazellulären Enzymen und Enzymsubstraten geeignet.
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Hochspezifische
Enzymsubstrate, die zu fluoreszierenden Produkten werden, können zur
Protein-/Enzym-Identifikation
zum Beispiel in der Proteomik und Phänotypenerstellung von einzelnen
intrazellulären
Systemen unter Verwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung verwendet werden.
Das synthetische Substrat, eventuell in Kombination mit einem Wirkstoff,
Inhibitor oder Modulator, kann durch Elektroporation gemäß der vorliegenden
Erfindung in die Zelle eingeschleust werden. Es gibt eine Vielzahl
von verfügbaren
Substraten, die als Lichtschalter im Substrat-Produkt-Umwandlungsschritt
verwendet werden können.
Solche Substrate umfassen Substrate für Esterasen, Sulfatasen, Phosphatasen
usw. Entweder das Substrat ist fluoreszierend und das Produkt ist
nicht-fluoreszierend oder umgekehrt.
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Für gekoppelte
Reaktionssysteme innerhalb von Zellen – zum Beispiel dem Abbau von
Alkohol durch die Alkohol-Dehydrogenase, die die Umwandlung von
NAD+ zu NADH nutzt – und
somit einen Fluoreszenzwechsel hervorrufen, muss das Zielmolekül nicht
fluoreszierend sein, solange es an eine Reaktion gekoppelt ist,
die ein nachweisbares Molekül
hervorbringt. Weitere Beispiele solcher nativer fluoreszierender
Verbindungen in Zellen sind NADPH und Flavine.
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Die
chemische Verstärkung
mit Enzymen kann auch verwendet werden, um die Empfindlichkeit des Systems
zu erhöhen
(W. J. Blaedel, R. C. Bougslaski, Anal Chem 1978, 50, 1026; H. U.
Bergmeyer in H.U. Bergmeyer (ed) Methods of Enzymatic Analysis,
Verlag Chemie/Academic Press, New York 1974, Bd. I, S. 131). Das
Prinzip dieses Verfahrens ist die Verwendung von Enzymen, die das
Substrat in Produkte umwandeln und somit einen starken Konzentrationswechsel
vom Substrat, das schwer zu messen sein kann, zum Produkt, das leicht
messbar ist, bewirken.
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Ein
Beispiel für
ein fluorogenes Substrat ist Fluorescein-diphosphat (FDP), das zu
dem Nachweis von Phosphatasen verwendet werden kann. Das Substrat
wird durch alkalische Phosphatase hydrolysiert und bringt das fluoreszierende
Produkt Fluorescein hervor. Ein anderes System ist Casein-BODIPY-FL,
ein Substrat für
Metallo-, Serin-, Säure-
und Sulfydryl-Proteasen, einschließlich Cathepsin, Chymotrypsin,
Elastase, Papain, Pepsin, Thermolysin und Trypsin. Ein weiteres
Systembeispiel ist β-Galactosidase,
wobei das Substrat Fluorescein-di-ß-D-galactopyranosid
(FDGP) ist, das sequentiell durch β-Galactosidase hydrolysiert
wird, zuerst zu Fluorescein-monogalactosid (FMG) und dann zu hochfluoreszierendem
Fluorescein.
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9 zeigt
das experimentelle Ergebnis der Verwendung von Fluorescein-diphosphat
(FDP), um das intrazelluläre
Enzym alkalische Phosphatase zu erfassen, das katalytisch die Phosphorester-Bindungen
am Substrat derart hydrolysiert, dass das hoch grün fluoreszierende
Produkt Fluorescein im Cytosol gebildet wird (9A-C).
Das Substrat Fluorescein-diphosphat (FDP) wurde zu dem Elektrolyt
der EGK in die Zelle hinzugefügt.
Das Substrat ist nicht-fluoreszierend und das Produkt ist fluoreszierend.
Die Fluoreszenz, die in der Zelle in 9B erreicht
wurde, zeigt das Vorhandensein des Produkts an und signalisiert
auch das Vorhandensein des Enzyms.
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Protein-Protein-Wechselwirkungen
sind komplex und umfassen viele Prozesse. Die Blockierung von bestimmten
Wegen mit spezifischen Liganden könnte die Steuerung der zellulären Prozesse
ermöglichen
und Hinweise für
neuartige Systeme liefern (Zutshi R, Brickner M, Chmielewski J,
Inhibiting the assembly of protein-protein interfaces, Curr. Opin.
Chem. Biol. 1998, 2, 62–66).
Die Wirkung der intrazellulären
Protease wurde beispielsweise untersucht unter Verwendung eines
Proteins, Casein, das stark mit dem grün fluoreszierenden Molekül BODIPY
FL als Enzymsubstrat beladen war. In einer Lösung wird das Casein-BODIPY-FL
derart gefaltet, dass die quaternäre Anordnung im Molekül die Fluoreszenz
unterdrückt.
Sobald die Peptidbindungen durch die Wirkung von cytosolischen Proteasen
aufgespaltet sind, beginnen die Segmente der freien Peptide, die
mit BODIPY FL markiert sind, zu fluoreszieren. Die Grafiken in der 10A-C zeigen die Identifikation von Proteasen
in einer einzelnen NG108-15-Zelle.
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Die
Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter veranschaulicht,
die in keiner Art und Weise den Geltungsbereich der Erfindung einschränken.
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BEISPIEL 1
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NACHWEIS DES INTRAZELLULÄREN REZEPTORS
RYANODIN II
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Der
Fluo-3-AM-Ester stammte von Molecular Probes (Leiden, Niederlande).
Zyklische ADP-Ribose und die Chemikalien, die für die Pufferlösung verwendet
wurden, waren alle von analytischer Qualität und wurden erworben von Sigma
(St. Louis, MO, USA). Alle Lösungen
wurden in destilliertem Wasser aus einem Milli-Q-System (Millipore)
hergestellt.
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Die
NG108-15-Zellen wurden auf Deckgläsern der Stärke 1 oder in einer Petrischale
plattiert und für 1–3 Tage
wachsen gelassen. Die Zellschalen wurden in einen kreisförmigen Polycarbonathalter
eingebaut und auf den Mikroskoptisch übertragen. Vor den Versuchen
wurde das Kulturmedium durch einen HEPES-Puffer (NaCl 140 mM, KCl
5,0 mM, MgCl2 1,0 mM, CaCl2 1,0
mM, D-Glukose 10 mM, HEPES 10 mM, der pH-Wert wurde auf 7,4 mit
NaOH eingestellt) ersetzt.
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Die
Zellen wurden mit Fluo-3-AM-Ester durch Inkubieren der Zellen für 30 Minuten
in einer Farbstofflösung
(10 μM Fluo-3-AM-ester
im HEPES-Puffer) bei Raumtemperatur eingefärbt. Um den überschüssigen, nicht
aufgenommenen Farbstoff zu entfernen, wurden die Zellen vor den
Versuchen dreimal im HEPES-Puffer gewaschen und für weitere
30 Minuten im HEPES-Puffer gelagert.
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Die
Anregung der Fluorophore erfolgte mit einem Ar+-Laser
(Spectra-Physics 2025–05,
Sunnyvale, CA). Der Laserstrahl wurde durch eine sich drehende Scheibe
(ein 488 nm Linieninterferenzfilter (Leica I-3 Filterwürfel)) gesendet,
um die Kohärenz
zu brechen, und auf die Deckgläser
unter Verwendung eines 40x-Objektivs
(Leica 0,9 N.A.), das in ein invertes Mikroskop (Leica DMIRB, Wetzlar,
Deutschland) eingebaut wurde, fokussiert; die Bilder-wurden mit
einer 3-Chip Farb-CCD-Kamera aufgenommen (Hamamatsu C6157, Kista, Schweden).
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Die
Elektroporation erfolgte mit einer Elektrolyt-gefüllten Kapillare
(30 cm lang, 50 μm
innerer Durchmesser, 375 μm äußerer Durchmesser),
die 20,35 μm über der
Zelle mit einem hochgenauen Mikromanipulator (Narishige, MWH-3,
Tokio, Japan) positioniert wurde. Um die EGK in einer bestimmten
Entfernung zu positionieren, wurde die Zelle erst durch Betrachten
der Zelle unter dem Mikroskop fokussiert. Dann wurde der Fokus mit
Hilfe des Mikrometer-Markers auf dem Fokussierknopf des Mikroskops
auf die gewünschte
Entfernung über
der Zelle eingestellt. Die EGK wurde abgesenkt bis das Lumen der
EGK in den Fokus gelangte. Nachdem die richtige Position eingestellt
wurde, wurde der Fokus wieder auf die Zelle gerichtet. Das Zellbadmedium
wurde mit einem Platindraht geerdet. Ein Puls wurde mit einer Gleichstrom-Hochspannungs-Stromversorgung (Modell
ARB 30, Bertan, Hicksville, NY, USA) für die Dauer von 5–20 Sekunden
angelegt.
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Der
Agonist zyklische-ADP-Ribose wurde verwendet, um den Ryanodin-Rezeptor
II in den NG108-15-Zellen
aufzuspüren.
Zyklisches ADPR (cADPR) (500 μM)
wurde zu dem Elektrolyt der EGK hinzugefügt. Als der Hochspannungspuls
angelegt wurde, bildeten sich in der Zellplasmamembran Poren, während die
Einschleusung des Agonisten in die Zelle durch die elektroosmotische
Leitung des Agonisten zur Zelloberfläche verbessert wurde. Sobald
sich der Agonist an den Ryanodin-Rezeptor am ER koppelt, wird Calcium
in das Cytosol freigesetzt. Der Ryanodin-Rezeptor II wurde durch
die Hinzugabe von cADPR (500 μM)
zum Elektrolyt einer EGK mit 50 μm
innerem Durchmesser und 30 cm Länge
aufgespürt.
10kV wurden für
10 Sekunden angelegt. Bei der Aktivierung löste der Ryanodin-Rezeptor die
Freisetzung von Calciumionen aus dem ER aus, die sich an das Fluo-3
heften, und eine Erhöhung
der Fluoreszenz-wurde gemessen (8). Verschiedene Zellen
reagierten leicht unterschiedlich auf die Stimulation, und daher
werden drei Reaktionskurven dargestellt (obere Kurven). Die Reaktionsrate
lag bei 60% (n = 17). Der Spannungspuls wurde nach 20 Sekunden angelegt.
Die untere Kurve ist ein so genannter "Blank Run", bei dem ein intrazellulärer Puffer
durch die EGK eingeschleust wurde. Ein geringer Abfall der Fluoreszenz
kann aufgrund des Verlustes an Farbstoff durch die gebildeten Poren
verzeichnet werden. Bei der Verwendung von Farbstoffen wie Fura-2,
das in das ER eindringt, werden solche Wirkungen weitestgehend vermieden.
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BEISPIEL 2
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NACHWEIS VON INTRAZELLULÄREN ENZYMEN
I. NACHWEIS VON PROTEASEN
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Das
Casein-BODIPY-FL stammte von Molecular Probes (Leiden, Niederlande).
Die Chemikalien, die für
die Pufferlösungen
verwendet wurden, waren alle von analytischer Qualität und wurden
erworben von Sigma (St. Louis, MO, USA). Alle Lösungen wurden in destilliertem
Wasser aus einem Milli-Q-System (Millipore) hergestellt.
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Das
Anlegen von Zellkulturen und die Vorbereitungen erfolgten gemäß dem Verfahren,
das in Beispiel 1 angewendet wurde, und die Apparatur und Ausrüstung waren
die gleichen wie in Beispiel 1.
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Die
Elektroporation erfolgte wie in Beispiel 1 und es wurde eine EGK
(30 cm lang, 50 μm
innerer Durchmesser, 375 μm äußerer Durchmesser)
verwendet. Das Casein-BODIPY-FL wurde in einer Konzentration von
100 μg/ml
verwendet und in die Zellen unter Verwendung eines Pulses von 10
Sekunden bei 10 kV elektroporiert.
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Die
Ergebnisse des Nachweises der intrazellulären Proteasen durch Casein-BODIPY-FL
werden in 9 dargestellt. Die intrazelluläre Wirkung
wurde mit Hilfe des Proteins Casein untersucht, das stark mit dem grün fluoreszierenden
Molekül
BODIPY-FL als Enzymsubstrat beladen war. In einer Lösung wird
das Casein-BODIPY-FL derart gefaltet, dass die quaternären Anordnungen
im Molekül
die Fluoreszenz unterdrücken. Sobald
die Peptidbindungen durch die Wirkung der cytosolischen Proteasen
aufgespaltet sind, beginnen die Segmente der freien Peptide, die
mit BODIPY FL markiert sind, zu fluoreszieren. Die Bilder in 9A-C zeigen die Identifikation von Proteasen
in einer einzelnen NG108-15-Zelle.
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Casein-BODIPY-FL
wurde eingeschleust und die Fluoreszenz-Intensität wurde 30 Sekunden nach der Elektroporation
beobachtet. Die Reaktionsrate lag bei 60%, n = 19. Die Enzymwirkung
kann mit der Erhöhung der
Fluoreszenz in Beziehung stehen, was bedeutet, das dieses Verfahren
für das
Screening und die Bestimmung der Enzymwirkung in Einzelzellen geeignet
ist. Dies kann für
Einzelzell-Proteomik von Nutzen sein, wobei die Unterschiede in
der enzymatischen Wirkung Phänotypen
in einer Zellpopulation aufdecken würden.
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BEISPIEL 3
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NACHWEIS DES
INTRAZELLULÄREN
ENZYMS ALKALISCHE PHOSPHATASE
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Das
Fluorescein-diphosphat stammte von Molecular Probes (Leiden, Niederlande).
Die Chemikalien, die für
die Pufferlösungen
verwendet wurden, waren alle von analytischer Qualität und wurden
erworben von Sigma (St. Louis, MO, USA). Alle Lösungen wurden in destilliertem
Wasser aus einem Milli-Q-System (Millipore) hergestellt.
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Die
Verfahren und Prozeduren zum Anlegen der Zellkulturen und der Vorbereitung
waren die gleichen, die in Beispiel 1 verwendet wurden.
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Die
Elektroporation erfolgte gemäß Beispiel
1. Das FDP wurde ergänzend
zu dem Elektrolyt bei einer Konzentration von 500 μM hinzugefügt. Teile
des Substrats Fluorescein-diphosphat waren bereits in Form von Fluorescein
vorhanden. Daher wurden die Zellen während des Elektroporationsvorgangs
gebleicht (Pulslänge 5
Sekunden, 10kV), plus 10 zusätzliche
Sekunden nach dem Puls, um das überschüssige Fluorescein
aus den Zellen zu entfernen. Die Zellen wurden 30 Sekunden lang
nach der Elektroporation und danach in 30-Sekunden-Intervallen beobachtet.
Die EGK (30 cm lang, 50 μm
innerer Durchmesser, 375 μm äußerer Durchmesser) wurde
vor der Beobachtung von den Zellen weg bewegt.
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Die
Apparatur und Ausrüstung
waren die gleichen, die in Beispiel 1 verwendet wurden.
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Die
Ergebnisse der Identifikation von alkalischem Phosphat in unbehandelten
NG108-15-Zellen werden in 10 dargestellt.
Fluorescein-diphosphat (FDP) wurde verwendet, um das intrazelluläre Enzym
alkalische Phosphatase zu erfassen, das die Phosphorester-Verbindungen auf
dem Substrat katalytisch hydrolysiert, so dass das in hohem Maße grün fluoreszierende
Produkt Fluorescein im Cytosol gebildet wird (10A-C).
Eine Zelle wurde ausgewählt
und das Substrat Fluorescein-diphosphat (FDP) wurde dem Elektrolyt
der EGK beigefügt.
In 10A wurde ein Hochspannungspuls
(5 Sekunden, 10 kV) angelegt. 30 Sekunden nach dem Elektroporationsvorgang
wurde die Fluoreszenz mit einer CCD-Kamera gemessen. Das Substrat
ist nichtfluoreszierend und das Produkt ist fluoreszierend. Die
Fluoreszenz, die in der Zelle in 10B erhalten
wurde, ist daher ein Beweis für
das Vorhandensein des Enzyms.
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Die
Reaktionsrate lag bei 70% (n = 8). Figur 10C zeigt die gleiche Zelle
nach dem Elektroporationsvorgang.
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ÜBERSETZUNG FIGUREN:
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8
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- EN: Fluorescent intensity (a.u.)
- DE: Fluoreszenz-Intensität
(willkürliche
Einheiten)
- EN: Time (seconds)
- DE: Zeit (Sekunden)
