DE3437470A1

DE3437470A1 - Medium zur herstellung von lebensfaehigen, fusionierten zellen

Info

Publication number: DE3437470A1
Application number: DE19843437470
Authority: DE
Inventors: Ulrich Prof. Dr. 5165 Hürtgenwald Zimmermann
Original assignee: GCA Corp
Current assignee: B Braun Melsungen AG
Priority date: 1984-10-12
Filing date: 1984-10-12
Publication date: 1986-04-17
Also published as: WO1986002377A1; GB8613802D0; GB2182346A

Description

HOEGER₁ STELLRECHT & PARTNER 343747g

PATENTANWÄLTE UHLANDSTRASSE 14 c ■ D 7000 STUTTGART 1

A 46 329 b Anm. GCA Corporation

g - 211 209 Burlington Road

4. Oktober 1984 Bedford, Mass. 01730

USA

BESCHREIBUNG

Medium zur Herstellung von lebensfähigen, fusionierten Zellen

Die Erfindung betrifft ein Medium zur Herstellung von lebensfähigen, fusionierten Zellen mittels feldinduzierter, elektrischer Fusion, insbesondere zur Herstellung von Hybridomzelien, wobei das Medium eine ungefähr isotonische, wässrige Lösung von Elektrolyten und Nichtelektrolyten mit einer maximalen Ionenstärke von 0,1 umfasst, in der Calcium- und Magnesiumsalze enthalten sind.

Die Herstellung von fusionierten Zellen läßt sich in drei Phasen aufteilen, eine Orientierungsphase, den eigentlichen Fusionsvorgang und eine Ausheilphase der fusionierten Zellen.

In der Orientierungsphase werden die zu fusionierenden Zellen beispielsweise entlang von Feldlinien ausgerichtet. Dazu eignet sich insbesondere der dielektrophoretische Effekt, der auf Polarisationserscheinungen in den Zellen im elektrischen Feld beruht und die Zellen auf einen bestimmten Kontaktabstand zueinander bringt. Das elektrische Feld wird durch eine hochfrequente Wechselspannung im Bereich von ungefähr 1 MHz aufgebaut, um Elektrolyseerscheinungen im Medium auf ein

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Minimum zu begrenzen. Die Vermeidung von Elektrolyseerscheinungen im Vorfeld der Fusion ist extrem wichtig, da die Elektrolyseprodukte für die Zellen toxisch wirken, insbesondere im Zustand mit erhöhter Permeabilität der Zellmembranen.

Die eigentliche Fusion wird durch einen Feldpuls eingeleitet, der die Permeabilität der Zellmembranen im Kontaktbereich zweier Zellen so weit vergrößert, daß Poren oder Durchbrüche in den Membranen auftreten,, durch die ein Austausch des Zellplasmas der beiden Zellen erfolgen kann. Die Höhe des Feldpulses oder die benötigte Feldstärke hängt vom Radius der zu behandelnden Zellen nach der Laplace-Gleichung (siehe Biochimica et Biophysica Acta 694, 227 bis 277; Gleichung (5)) in reziproker Weise ab, so daß bei kleinen Zellen große und bei großen Zellen kleine Feldstärken zur Erzeugung der Durchbrüche oder Poren in den Membranen nötig sind. Direkt nach dem Feldpuls werden die die Zellen orientierenden Feldbedingungen für eine kurze Zeit weiter aufrechterhalten, um das Verschmelzen der Zellmembranen zu erleichtern. Wichtig ist in diesem Zusammenhang auch die Leitfähigkeit der Fusionslösung, die so begrenzt sein muß, daß keine störende Wärmeentwicklung auftritt, in deren Folge Konvektionsstromungen entstehen, die die Orientierung der fusionierenden Zellen zueinander beeinträchtigen.

Nach dem Abschalten des Wechselfeldes folgt eine Periode, die bis zu 30 nin und länger dauert, in der das Ausheilen der Zellmembranen in der Regel durch eine Temperaturerhöhung unterstützt wird. Während

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dieser Zeit ist die neufusionierte Zelle noch ziemlich empfindlich gegen Umgebungseinflüße, da die Permeabilität der Zellmembranen immer noch erhöht und deshalb der Selektionsmechanismus der Membranen zum Teil außer Kraft gesetzt ist.

Um die Fusionsausbeuten zu verbessern, wurde bisher eine Behandlung der Zellen mit dem Enzym Pronase' vorgeschlagen, das nach neuesten Erkenntnissen die Mobilität der Zellen herabsetzt (FEBS Letters 163, 54 bis 56 (1983)), so dass einmal entstandene Poren in den beiden Zellen eine konstante Orientierung zueinander haben, wodurch das Verschmelzen der Membranen der beiden Zellen wahrscheinlicher wird. Eine Behandlung der Oberfläche der Fusionskammer bzw. ein Aufbringen einer Schicht einer höhermolekularen Substanz, beispielsweise eines Proteins, kann Einfluß auf den Fusionsäblauf nehmen, weshalb diese Schicht ebenfalls zum Fusionsmedium zu rechnen ist. Die Verwendung des Enzyms Pronase bringt bedeutende Probleme für das überleben der fusionierten Zellen mit sich, da die enzymatische Aktivität der Pronase in dem Abbau von Proteinen liegt und dieser Abbau auch die Proteine der Membran betrifft. Für das Überleben der fusionierten Zellen ist es jedoch wichtig, die Proteine der Membranen zu erhalten, so daß das Enzym Pronase unter schwierigen Bedingungen ausgewaschen werden muß. Falls sich Pronase-Moleküle während der Fusion in der Kontaktzone der Zellen befinden und ins Zellinnere gelangen, ist das Absterben der neuen Zelle bereits vorprogrammiert, da sich die Pronaseaktivität natürlich auch auf zellinnere Proteine erstreckt. Ersatzweise wurde deshalb in der oben

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zitierten Literatur vorgeschlagen, das Enzym Pronase durch andere Proteine, die bezüglich der Mobilität der Zellen die gleiche Funktion erfüllen können, aber keine für die Lebensfähigkeit der Zellen nachteilige enzymatische Aktivität aufweisen, zu ersetzen. Selbst bei guten Fusionsausbeuten blieb jedoch die Zahl der lebens■ fähigen Zellen sehr gering.

Noch größere Probleme in bezug auf die Lebensfähigkeit der fusionierten Zellen treten bei der Fusion von unterschiedlich großen Zellen auf, da hierbei Feldpulse angewandt werden müssen, die so groß sind, daß sie auch Durchbrüche in der Membran der kleinen Zelle schaffen. Durch diese hohen Feldstärken werden in der großen Zelle jedoch Durchbrüche auch außerhalb der Kontakt·- zone der Zellen erzeugt, so daß diese eventuell so stark geschädigt wird, daß entweder überhaupt keine fusionierte Zelle entsteht, oder die neuentstandene Zelle ebenfalls stark geschädigt ist und folglich eine sehr geringe Überlebensrate besitzt.

Die Fusionstechnik ist heute auf einem Stand, bei dem Zellen mit großen Ausbeuten (z.B. 40 % und mehr) fusioniert werden können. Allerdings ist die Lebensfähigkeit der neuentstandenen Zellen bei allen bisher bekannten Verfahren bzw. Medien oder Lösungen extrem gering, d. h. den fusionierten Zellen fehlt in aller Regel die Fähigkeit zur Teilung, so daß ein Fusionsprozeß zwar eine Vielzahl verschmolzener Zellen, jedoch nur einzelne teilungsfähige Zellen liefert.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Medium zu schaffen, das die Fusionsbedingungen von unterschiedlich großen

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Zellen während des Feldpulses einander anpaßt und zusätzlich durch einen Eingriff in die Struktur des Mediums im Bereich der Zellmembranen einen engeren Zellmembran-Kontakt erlaubt, so daß die Fusion mit großer Ausbeute und unter milden Bedingungen durchgeführt werden kann und gleichzeitig die Überlebensrate der Zellen sehr hoch ist.

Diese Aufgabe wird bei einem Medium der eingangs beschriebenen Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Konzentrations-Verhältnis der Calcium- und Magnesium-Ionen im Bereich von 1 : 2 bis 1 : 10 liegt, und daß die Ionenstärke der Lösung durch eine Variation der Elektrolyt-Konzentration für einen optimalen Membrankontakt eingestellt ist, wobei einer Änderung der Elektrolyt-Konzentration eine komplementäre Änderung der Nichtelektrolyt-Konzentration entspricht, derart, daß die isotonische Eigenschaft der Lösung stets durch die Gesamtosmolarität von Elektrolyt- und Nichtelektrolyt-Gehalt gewährleistet ist.

Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mediums bei der Herstellung von fusionierten Zellen ist es möglich geworden, in hoher und reproduzierbarer Ausbeute beispielsweise Hybridomζeilen zu erhalten, deren Überlebensrate, d. h. Teilungsfähigkeit, gegenüber dem Stand der Technik um ein Mehrfaches erhöht ist.

Besonders gute Ergebnisse lassen sich mit einem Medium erzielen, dessen Calcium/Magnesium-Verhältnis im Bereich von 1 : 4 bis 1 : 6 liegt. Ein besonders

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bevorzugtes Calcium/Magnesium-Verhältnis beträgt ungefähr 1 : 5.

Bei relativ kleinen Ionenstärken des die Zellen umgebenden Mediums besitzen die Zellmembranen besondere Adhäsionseigenschaften (J. Cell Sei. 6_3, 113 bis 124 (1983)). Dieser Effekt wird hier erstmalig gezielt bei der Fusion von Zellen eingesetzt, um eine Verringerung des KontaktabStandes der Membranen zu begünstigen. Bei der Anwendung dieses Effekts zur Verbesserung der Gesamtausbeute an lebenden fusionierten Zellen eignen sich besonders Calcium- und Magnesium-Salze, die auch wichtige Funktionen im Zellinneren bei der Steuerung des Energieumsatzes und der Stoffwechselprozesse in der Zelle erfüllen. Zweckmäßig ist der Einsatz der entsprechenden Chloride, besonders vorteilhaft lassen sich jedoch Calcium- und Magnesium-Acetate einsetzen, da dadurch die in Gegenwart von Chloriden während der die Elektrophorese eventuell auftretenden toxischen Elektrolyseprodukte vermieden werden.

Ein besonders bevorzugter Konzentrationsbereich der Calcium-Ionen umfaßt Konzentrationen von 0,05 mM bis 0,2 mM. Als günstig hat sich bei den Magnesium-Konzentrationen der Bereich zwischen 0,05 mM und 0,6 mM und insbesondere zwischen 0,1 mM und 0,5 mM erwiesen.

Eine Pufferung des Fusionsmediums bei einem physiologischen pH-Wert wird zweckmäßigerweise durch einen Phosphatpuffer sichergestellt, wobei dessen Ionenstärke bei der Einstellung der Gesamtionenstärke des Fusionsmediums zu berücksichtigen ist. Besonders

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vorteilhafte Pufferkonzentrationen des Phosphatpuffers liegen im Bereich von 1 mM bis 30 mM.

Die Fusionsergebnisse werden durch den Austausch von physiologischen Kationen gegen biokompatible Kationen, die die negativen Oberflächenladungen der Membranen zumindest teilweise kompensieren/ positiv beeinflußt. Insbesondere solche biokonpatible Kationen, die eine kleine Ladungsdichte und eine elektrostatisch nur schwachgebundene Hydrathülle aufweisen, tragen zu einer verbesserten Annäherung der beiden Zellen dadurch bei, daß die Hydratstruktur an der Oberfläche der Zellmembranen weniger stark ausgeprägt und schwächer gebunden ist und damit beim Annähern der Zellen aneinander eine kleinere sterische Hinderung bewirkt.

Besonders bevorzugte Medien enthalten oligo- und/ oder polykationische Oligo- bzw. Polypeptide, die durch ihre mehrfache Ladung einen größeren Anteil der negativen Oberflächenladung der Membranen kompensieren und trotzdem eine elektrostatisch nur schwachgebundene Hydrathülle aufweisen. Besonders bevorzugt sind Oligo- bzw. Polypeptide, die einen isoelektrischen Punkt oberhalb von pH = 7 besitzen, da sie bei einem physiologischen pH-Wert eine positive Überschußladung tragen. Günstig ist es, Proteine, insbesondere Cytochrom und/oder Histone als Polypeptide einzusetzen. Vorteilhaft sind auch Oligo- und/oder 'Polylysin als biokompatible Kationen einzusetzen.

Vorteilhaft lassen sich die physiologischen Kationen

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auch durch einfachgeladene große organische Kationen, insbesondere solche des Typs £NR H "f ersetzen, wobei χ +.y = 4 mit χ = 1 bis 4 gilt und R = Alkylrest sind, da sich diese Verbindungen - falls nötig - relativ leicht nach Erfolg der Fusion aus dem Bereich der Membranoberflächen durch eine erhöhte Elektrolytkonzentration auswaschen lassen.

Der Nichtelektrolyt-Gehalt wird vorteilhaft durch Inosit und/oder Glucosamin gebildet.

Wird für die Orientierung oder das Sammeln der Zellen das dielektrophoretische Verfahren anwendet, können durch die angelegte Wechselspannung Probleme mit Elektrolyseprodukten auftreten, selbst wenn mit einem Wechselfeld von relativ hoher Frequenz (beispielsweise im MHz-Bereich) gearbeitet wird. Zum Abfangen von Elektrolyseprodukten empfiehlt es sich deshalb, weitere Nichtelektrolyte der Lösung zuzusetzen. Zur Zersetzung von entstehendem H_?O„ eignet sich insbesondere Katalase in kleinen Mengen. Vorteilhaft werden Radikalfänger, insbesondere Glutathion, Albumin, Cystein oder Tocopherol einzeln oder in Kombination dem Medium zugesetzt, wobei die Einzelkonzentrationen bei etwa 1 mM bzw. bei Katalase und Albumin bei 1 mg/ml liegen.

Diese Radikalfänger sind insbesondere dann zweckmäßig, wenn die Calcium- und Magnesiumsalze als Chloride eingesetzt werden. Ein Teil der Elektrolyseprobleme \ läßt sich durch die Verwendung der entsprechenden Acetate von vornherein ausschalten. \

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Eine Erhöhung der Frequenz des elektrischen Wechselfeldes kann zwar die Probleme der Elektrolyseerscheinungen drastisch zurückdrängen, ist aber selbst dadurch beschränkt, daß bei höheren Frequenzen des elektrischen Wechselfeldes die abschirmende Wirkung der Zellmembranen für das Zellinnere abnimmt, so daß das Wechselfeld ins Zellinnere eingreift und dort Veränderungen hervorrufen kann, die der Lebensfähigkeit der Zelle abträglich sind.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist deshalb die Verwendung eines erfindungsgemässen Mediums zur Herstellung lebensfähiger, fusionierter Zellen bei einem Verfahren zum schonenden Sammeln und Orientieren der Zellen vor und nach dem Applizieren der Feldpulse.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein elektrisches Wechselfeld mit einer Frequenz unterhalb von 100 kHz verwendet wird.

Im Frequenzbereich unterhalb von 100 kHz (Frequenzen bis in den Hz-Bereich sind möglich) ist die Abschirmung der Zellmembran für das Zellinnere praktisch vollständig. Die bei dieser relativ niederen Frequenz des elektrischen Wechselfeldes auftretenden Elektrolyseprodukte werden durch die dem Medium zugesetzten Radikalfänger abgefangen und abgebaut.

Besonders vorteilhaft ist es, die Frequenz des elektrischen Wechselfeldes so zu wählen, daß sie unterhalb von der Maxwell-Wagner-Rotationsfrequenz und außerhalb sonstiger Rotationsfrequenzbereiche der zu fusionierenden Zellen liegt.

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Dadurch werden die Zellen zum einen besonders schonend auf den zur Fusion benötigten Kontaktabstand gebracht - daneben kann durch die jetzt mögliche Verlängerung der Verweildauer der Zellen im elektrischen Feld eine bessere Orientierung der Zellen erreicht werden - und zum anderen werden die in unteren Frequenzbereichen auftretenden Rotationsbewegungen der Zellen vermieden, die den Orientierungseffekt der Dielektrophorese auf die Zellen teilweise wieder aufheben können.

Für jeden Zeiltyp existieren einer oder mehrere Frequenzbereiche, in denen eine maximale Rotationsbewegung der Zelle im Suspensionsmedium hervorgerufen wird (Biochimica et Biophysica Acta 694, 227 - 277 (1982), S. 239 ff). Die Lage dieser Frequenzbereiche ist hauptsächlich vom Zelltyp, der Zellgröße sowie der Leitfähigkeit des Suspensionsmediums abhängig.

Die durch die Anwendung dieses neuen und erfindungsgemäßen Verfahrens entstehenden Vorteile in bezug auf apparative Ausstattung und die Durchführung der Fusion im Zusammenhang mit den dabei verwendeten Medien sind so groß, daß dieses Verfahren als auch die hierzu verwendbaren Medien für sich selbst genommen alle Voraussetzungen der Patentierbarkeit erfüllen.

Diese und weitere Aspekte und Vorteile der Erfindung werden im folgenden anhand von Beispielen noch näher erläutert :

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Beispiel 1:

Fusion von SP 2/O-Myelomzellen mit Maus-Lymphozyten

Eine Zellsuspension von Myelomzellen (SP 2/0) und Lymphozyten im Verhältnis 1 : 10 und einer Gesamtsuspensionsdichte von 1,1 χ 10 Zellen/ml werden in einem Medium der weiter unten folgenden Zusammensetzung in eine Fusionskammer überführt. In der Fusionskammer sind die Elektroden (Platin-Drähte mit einem Durchmesser von 0,2 mm) im Abstand von 0,2 mm voneinander angeordnet. In diesem Beispiel sind die Myelomzellen die großen Zellen, für die eine niedrigere Feldstärke als die verwendete zum Erzeugen der Durchbrüche oder Poren ausreichen würde. Um eine Fusion von zwei oder mehreren Myelomzellen zu verhindern, und die Fusion in Richtung der Hybridomzellen zu steuern, werden die Lymphozytenζeilen in einem 10-fachen Überschuss vorgelegt. Dieses Verhältnis garantiert, dass im wesentlichen jede Myelomzelle mit einer Lymphozytenzelle Kontakt hat.

Die Fusion wird bei einer Temperatur von 20°C durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Medium, in dem die Zellen während der Fusion suspendiert sind, enthält 0,28 M Inosit, das als Nichtelektrolyt im wesentlichen die isotonische Eigenschaft des Fusionsmediums bewirkt. Dadurch kann der Elektrolytgehalt insgesamt sehr klein gehalten werden, so daß die Leitfähigkeit der Lösung sehr klein bleibt. Die geringe Leitfähigkeit der Lösung hat den Vorteil, daß während der Anwendung des elektrischen Wechselfeldes bei der

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Dielektrophorese nur eine sehr geringe Erwärmung der Lösung auftritt, wodurch Probleme mit thermischen Konvektionsströmungen in der Fusionskammer, die den Zusammenhalt der Zellketten beeinträchtigen, vermieden werden.

Mit Hilfe eines Phosphatpuffers (Konzentration 1 mM? KH₃PO₄/K₂HPO₄) wird ein physiologischer pH-Wert (ungefähr 7) des Fusionsmediums sichergestellt.

Eine optimale Ionenstärke der Lösung erreicht man mit den zusätzlichen Komponenten von 0,1 rtiM Calcium-Acetat und 0,5 mM Magnesium-Acetat.

Die elektrischen Fusionsbedingungen sind :

Sinusförmiges Wechselfeld für 30 s mit einer Feldstärke von 250 Vcm und einer Frequenz von 1,5 MHz.

Drei Gleichspannungspulse mit einer Feldstärke von 3,5 kVcm und 20 με Dauer werden im zeitlichen Abstand von 1 s appliziert.

Anschließend wird erneut ein sinusförmiges Wechselfeld für 30 s mit einer Frequenz von 1,5 MHz und einer Feldstärke von 250 Vcm an die Elektroden angelegt. Direkt anschließend werden die Zellen in dem Fusionsmedium für etwa 10 min bei 37⁰C gehalten.

Danach werden die fusionierten Zellen - die zu diesem

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Zeitpunkt eine erhöhte Permeabilität der Zellmembran aufweisen - bis zum vollständigen Ausheilen der Membrandurchbrüche in ein Nachbehandlungsmedium mit einer Temperatur von 37⁰C überführt und darin für ca. 30 min belassen.

Das Nachbehandlungsmedium ist auf das Fusionsmedium abgestimmt und setzt sich im wesentlichen aus einer wässrigen Lösung mit den folgenden Komponenten zusammen :

80 mM NaCl
60 mM KCl

8 mM Na₃HPO₄
1,5. mM KH₃PO₄
0,5 mM Mg-Acetat
0,1 mM Ca-Acetat.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Fusionsmediums sowie der Nachbehandlung der fusionierten Zellen konnte die Ausbeute von einzelnen lebensfähigen Zellen (Stand der Technik, z.B. FEBS Letters 137, 11 bis 13 (1982)) auf 140 lebensfähige, d.h. teilungsfähige, Hybridomzellen gesteigert werden.

Besonders hervorzuheben ist in diesem Zusammenhang die gute Reproduzierbarkeit der Ausbeuten an teilungsfähigen Zellen. Bisher war es nur möglich Zellen in guten Ausbeuten zu fusionieren ohne jedoch befriedigende und reproduzierbare Resultate bezüglich deren Überlebensrate zu erzielen.

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Beispiel 2 :

Fusion von SP 2/0-Myelomzellen mit.Maus-Lymphozyten

Bedingungen wie bei Beispiel 1, jedoch ist der Gehalt an Inosit in dem Fusionsmedium durch einen 0,28 M-Gehalt an Glucosamin ersetzt.

Auch dieses Fusionsmedium besitzt damit die erfindungsgemäßen Eigenschaften eines Fusionsmediums (Calcium/Magnesium-Verhältnis 1 : 5, sowie insgesamt ein niedriger , auf die Adhäsionseigenschaften der Zellen* abgestimmter Elektrolytgehalt)

■tr

Das Ergebnis der Fusion ist mit 128 lebensfähigen Hybridomzeilen ähnlich zufriedenstellend wie bei der inosithaltigen Lösung.

Beispiel 3 :

Fusion von SP 2/0-Myelomzellen mit Maus-Lymphozyten

Bedingungen wie in Beispiel 1, jedoch wurden in diesem Fall dem Fusionsmedium zusätzlich Komponenten zugegeben, die ein niederfrequentes Sammeln und Orientieren der Zellen erlauben :

1 mM Glutathion
1 mg/ml hochreines Albumin 0,1 mg/ml Katalase (mittels Dialyse gereinigt).

Die Frequenz des elektrischen Wechselfeldes konnte auf 20 kHz und die Feldstärke des Wechselfeldes auf 180 Vcm gesenkt werden.

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Gegenüber dem Verfahren mit einer Sammelfrequenz von 1,5 MHz (Beispiel 1) konnte eine nochmalige drastische Steigerung der Ausbeute auf 280 teilungsfähige Hybridomzellen erzielt werden.

Beispiel 4 :

Fusion von Tumorzellen des Stammes K 562 und Myelomzellen SP 2/0

Tauscht man physiologische Kationen gegen erfindungsgemässe biokompatible Kationen mit einer elektrostatisch nur schwach gebundenen Hydrathülle aus, so kann man damit hauptsächlich die Fusionsausbeuten selbst verbessern.

Die Fusionsbedingungen (Medium und Feldbedingungen) entsprechen denen von Beispiel 1. Tabelle 1 fasst die Ergebnisse für diese beiden Zelltypen in Abhängigkeit von dem Cytochromzusatz zusammen.

Tabelle 1

Zellstamm Fusionsausbeuten

ohne Cytochrom mit Cytochrom

K 562 35 % 90 %

SP 2/0 62 % 87 %

Hierbei ist zu betonen, dass sich die Fusionsausbeuten auf die Fusion von gleichartigen Zellen beziehen. Der Cytochromzusatz zum Fusionsmedium beträgt 5 μ g/ml.

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Diese Beispiele zeigen, dass durch den Cytochromzusatz selbst bei Systemen, bei denen ohne Cytochrom eine hohe Fusionsausbeute erzielbar ist, eine nochmalige Zunahme von fusionierten Zellen zu verzeichnen ist. An dieser Stelle sei jedoch nochmals betont, dass die Fusionsausbeuten nicht mit den Ausbeuten an lebensfähigen Zellhybriden, wie sie in den Beispielen 1 bis 3 angegeben wurden, gleichgesetzt werden dürfen.

Beispiel 5 :

Herstellung von. Hefezellen-Hybriden

Fusioniert werden in diesem Beispiel Zellen des Stammes Saccharomyces cerevisiae AH22pADH mit Zellen des Stammes Saccharomyces cerevisiae AH215 bei jeweils gleichen Feldbedingungen in sogenannten Helix-Kammern (siehe dazu FEMS Microbiol. Letters 24, 81 bis 85 (1984)).

Das Mischungsverhältnis der beiden Zelltypen belief sich

9 auf 1:1, die Gesamtzellsuspensionsdichte lag bei 1,5x10"

9
bis 2x10 Zellen/ml.

Die Feldbedingungen bei der Fusion waren: Wechselfeld mit einer Feldstärke von 250 bis 275 Vcm und einer Frequenz von 2 MHz jeweils für 1 bis 2 min vor und nach dem. Applizieren von zwei Rechteck-Gleichspannungspulsen (Feldstärke 10 kV/cm, Pulsdauer 10 [is) im zeitlichen Abstand von 0,5 s.

Die Zusammensetzungen der wässrigen Lösungen, in denen die Zellen für die Experimente 1 bis 4 suspendiert wurden, sind der Tabelle 2 zu entnehmen.

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Im Kontrollexperiment 4 wurde die Zellsuspension keinem elektrischen Feld ausgesetzt. Die beobachteten zwei Zellhybride sind auf eine spontane Fusion zurückzuführen.

Die Experimente 1 bis 3 zeigen zum einen die grosse Bedeutung des Zusatzes an Calcium- und Magnesiumionen. Die Verhältnisse im Experiment 3 sind bis auf die relativ unkritische Wechselfeldfrequenz identisch mit denen, die in der oben zitierten Literatur beschrieben sind. Als Ausbeute wurden 119 teilungsfähige Hybride gefunden, bei einer Wiederholung des Experiments waren es lediglich 42. In der zitierten Literatur wird als Ausbeute die Zahl 50 bis 60 angegeben. Die Streubreite bei Verwendung einer reinen Sorbitlösung ist also sehr gross.

Reproduzierbare und wesentlich höhere Ausbeuten an teilungsfähigen Hybriden erhält man nur mit dem erfindungsgemässen Calcium- und Magnesium-Ionen-Konzentrationen und Konzentrationsverhältnissen. Die Ausbeuten der Experimente 1 und 2 sind bis auf +- 20% reproduzierbar.

Der Vergleich der Ergebnisse von Experiment 1 und Experiment 2 zeigt zum anderen die Verbesserung des Fusionsmediums durch den Austausch der Chloride gegen Acetate, wodurch Elektrolyseprobleme, die selbst bei Wechselfeldern im MHz-Bereich noch vorhanden sind, drastisch zurückgedrängt werden können.

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Tabelle 2

Kontrolle Experiment 1 2 3

Calciumacetat	0,1	mM	0	mM	0	0,1	mM
Magnes xumacetat	0,5	iriM	0	mM	0	0,5	mM
CaCl₂	0		0,1	M	0	0
MgCl₂	0		0,5	M	0	0
Inosit	0,28	M	0,28		0	0,28	M
Sorbit	0,92	M	0,92	1,2 M	0,98	M

Zahl der teilungsfähigen 990 584 Hybride

Claims

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PATENTANWÄLTE

UHLANDSTRASSE 14 c · D 70OO STUTTGART 1

A 46 329 b Anm.: GCA Corporation

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g-35 Bedford, Mass. 01730

USA

Patentansprüche

1. Medium zur Herstellung von lebensfähigen-/ fusionierten Zellen mittels feldinduzierter, elektrischer Fusion, insbesondere zur Herstellung von Hybridomzellen, wobei das Medium eine ungefähr isotonische, wässrige Lösung von Elektrolyten und Nichtelektrolyten mit einer maximalen Ionenstärke von 0,1 umfasst, in der Calcium- und Magnesium-Salze enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, dass das Konzentrations-Verhältnis von Calcium- und Magnesitim-Ionen im Bereich von 1:2 bis 1:10 liegt und dass die Ionenstärke der Lösung durch Variation der Elektrolytkonzentration für einen optimalen Membrankontakt eingestellt, ist, wobei einer Änderung der Elektrolytkonzentration eine komplementäre Änderung der Nichtelektrolyt-Konzentration entspricht, derart, dass die isotonische Eigenschaft der Lösung stets durch die Gesamtosmolarität von Elektrolyt- und Nichtelektrolyt-Gehalt gewährleistet ist.

2. Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Konzentrationsverhältnis der Calcium- und Magnesium-Ionen im Bereich von 1:4 bis 1:6 liegt.

3. Medium nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Konzentrationsverhältnis der Calcium- und Magnesium-Ionen ungefähr 1:5 beträgt.

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4. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Calcium- und Magnesium-Ioneη der Lösung als Chloride zugesetzt sind.

5. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Calcium- und Magnesium-Ionen der Lösung als Acetate zugesetzt sind.

6. Medium nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Calcium-Ionen im Bereich von 0,05 mM bis 0,2 mM liegt.

7. Medium nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Magnesium-Ionen zwischen 0,05 mM und 0,6 mM liegt.

8. Medium nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnesium-Konzentration zwischen 0,1 mM und 0,5 raM liegt.

9. Medium nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenstärke zusätzlich durch einen Phosphatpuffer eingestellt ist.

10. Medium nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Phosphatpuffers im Bereich von 1 mM bis 30 mM liegt.

11. Medium nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektrolytgehalt biokompatible Kationen umfasst, die physiologische Kationen an negativgeladenen Membranoberflächen austauschen und die Wasserstruktur im Bereich der Membran verändern.

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12. Medium nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet/ dass die biokompatiblen Kationen eine kleine Ladungsdichte und eine elektrostatisch schwach gebundene Hydrathülle aufweisen.

13. Medium nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet,, dass die biokompatiblen Kationen oligo- und/oder polykationische Oligo- bzw. Polypeptide sind.

14. Medium nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligo- bzw. Polypeptide einen isoelektrischen Punkt oberhalb von pH = 7 aufweisen.

15. Fusionsmedium nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptide Proteine sind.

16. Medium nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Gytochrom und/oder Hlstone als Proteine enthalten sind.

17. Fusionsmedium nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Oligo- unJ/oder Polylysin als biokompatible Kationen fungieren.

18. Medium nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die physiologischen Kationen durch einfach geladene grosse organische Kationen ersetzt sind.

19. Medium nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als einfach geladene grosse organische Kationen Verbindungen des Typs JjMR_xH J enthalten sind, wobei x+y = 4 mit χ = Vbis 4 gilt und R = Alkylreste sind.

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20. Medium nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Inosit und/oder Glucosamin im wesentlichen den Nichtelektrolyt-Gehalt bilden.

21. Medium nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es als weiteren Nichtelektrolyten reine Katalase in kleinen Mengen zur Zersetzung von H₂O₂ enthält.

22. Medium nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es als zusätzliche Nichtelektrolyte Radikalfänger umfasst.

23. Medium nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass Glutathion und/oder Albumin als Radialfänger enthalten sind.

24. Medium nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass Glutathion mit einer Konzentration von etwa 1mM und/ oder Albumin mit einem Gehalt von ungefähr 1 mg/ml enthalten sind.

25. Medium nach einem der Ansprüche 22 bis 24/ dadurch gekennzeichnet, dass als Radikalfänger zusätzlich Cystein und/oder Tocopherol vorhanden sind.

26. Verwendung eines Mediums nach einem der Ansprüche

21 bis 25 und eines elektrischen Wechselfeldes zur Orientierung und zum Sammeln, von Zellen bei der Herstellung von lebensfähigen, fusionierten Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Wechselfeld mit einer Frequenz unterhalb von 100 kHz verwendet wird.

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27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet/ dass die Frequenz des elektrischen Wechselfeldes unterhalb der Maxwell-Wagner-· Rotations frequenz und ausserhalb von sonstigen Rotationsfrequenzbereichen der zu fusionierenden Zellen gewählt wird ο