DE3852177T2

DE3852177T2 - Transkriptionsbasierte nukleinsäure-verstärkungs/nachweissysteme.

Info

Publication number: DE3852177T2
Application number: DE3852177T
Authority: DE
Inventors: Thomas Gingeras; Deborah Kwoh; Ulrich Merten
Original assignee: Siska Diagnostics Inc
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-17
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2008-06-18
Also published as: DE3852177D1; NO303068B1; BR8807097A; PT87769B; PT87769A; DK644489A; NO895090L; DE3856428T2; EP0623683A1; NZ225077A; FI93743C; ATE196657T1; WO1988010315A1; EP0623683B1; EP0368906B2; FI896077A0; KR890701741A; HU216317B; GR880100396A; IL86724A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Fortschritte in der Molekularbiologie und der Molekulargenetik.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung neue Verfahren und Kits, die die erforderlichen Reagenzien und Mittel zur Erhöhung der in vitro oder ex vivo Kopiezahl, das heißt Amplifizierung von zumindest einem ausgewählten Abschnitt (Sequenz) einer Nucleinsäure oder dessen komplementären Strangs oder eines hybridisierenden homologen Abschnitts in einer Probe, die eine oder mehrere Nucleinsäuren umfaßt, die RNA, DNA oder beide beinhalten können.
Unter den Anwendungen, für die die erfindungsgemäßen Verfahren und Kits brauchbar sind, befinden sich 1) Analysen von Körperfüssigkeiten und Geweben zur Detektion von bestimmten Nucleinsäuresequenzen, die für eine genetische oder pathogene Krankheit oder einen Zustand charakteristisch sind, durch in vitro oder ex vivo Nucleinsäuresondenhybridisierungsassays und 2) die selektive Klonierung von Einzelkopiegenen oder seltenen Genen oder niedrig exprimierten Genen.
Ein Großteil der Arbeit in der Molekularbiologie, der Molekulargenetik und den Anwendungen hiervon, beispielsweise die Nucleinsäuresondenhybridierungsassays für im Blut vorkommende pathogene Organismen oder defekte Gene, beinhalten die Detektion oder Isolierung einer bestimmten Nucleinsäuresequenz. Ein grundlegendes Problem bei dieser Arbeit ist, die interessierende Nucleinsäuresequenz zu detektieren oder zu isolieren und dann zu quantifizieren. Dieses Problem ist schwierig, da biologische Materialien, wie Zellkulturen, Gewebeproben und Blutproben sich typischerweise aus einem komplexen Gemisch aus RNA und DNA Anteilen zusammensetzen, von denen meistens nur ein geringer Teil die interessierende Sequenz aufweist.
Tatsächlich wurden praktische Anwendungen der Hybridisierungsassays mit Nucleinsäuresonden beschränkt, da die Sensitivität dieser Assays, wenn sie mit zum Routineeinsatz geeigneten Reagenzien und in annehmbar kurzen Zeitspannen durchgeführt wurden, zu gering zur Detektion der interessierenden Sequenzen bei den niedrigen Konzentrationen waren, in denen sie in realen Proben vorkommen. Zwei grundsätzlich unterschiedliche Ansätze wurden durchgeführt, um das Problem der Detektion einer interessierenden Nucleinsäuresequenz ("Zielabschnitt") anzugehen, die in einer geringen Menge in einem komplexen Gemisch aus Nucleinsäuren vorkommt.
Im ersten Ansatz wird die Menge an Nucleinsäure (einschließlich des Zielabschnitts) in einer Probe nicht verändert, stattdessen wird ein signalerzeugendes System mit dem Zielabschnitt zusammengebracht und bildet ein detektierbares Signal, das die Anzahl der Zielabschnittmoleküle anzeigt. Beispielsweise wird eine Nucleinsäuresonde mit einer Sequenz, die der eines Unterabschnitts des Zielabschnitts komplementär ist, an ein Enzym, wie alkalische Phosphatase gebunden und mit der Probe unter Hybridisierungsbedingungen gemischt, was zur Hybridisierung zwischen der Sonde und dem Zielabschnitt führt (aber wünschenswerterweise nicht zwischen der Sonde und anderen Nucleinsäuresequenzen in der Probe). Nach Entfernung der enzymgebundenen Sonde, die nicht hybridisiert hat, wird ein chromogenes Substrat für alkalische Phosphatase unter geeigneten Bedingungen zugegeben und dann wird im Prinzip sehr rasch eine große Anzahl an detektierbaren, gefärbten Molekülen für jedes Sondenmolekül erzeugt, das mit dem Zielabschnitt hybridisiert hat.
Im Fachgebiet sind viele andere Systeme zur Detektion von Nucleinsäuresequenzen ohne Veränderung der Menge an Zielnucleinsäure in der Probe bekannt. Ein anderes Beispiel ist die gewöhnliche Markierung einer Nucleinsäuresonde mit radioaktiven Atomen, wie ³²P und die anschließende Detektion der an das Ziel hybridisierten Sonde mittels eines verstärkten Signals, das vom Zerfall der radioaktiven Kerne ausgeht. Ein weiteres Beispiel beinhaltet die Bindung einer weiteren Nucleinsäure an die Sonde für den Zielabschnitt, die zur Replikation fähig ist, so daß sie leicht durch bekannte Techniken detektiert werden kann. Von bestimmten RNAs ist bekannt, daß sie für eine Replikase-induzierte Replikation durch eine bestimmte Polymerase zugänglich sind (autokatalytisch) wie der RNA-abhängigen Bakteriophagen RNA Polymerase, wie die Qβ Replikase oder die Replikase vom Brommosaikvirus (BMV). In einem solchen System sind sowohl eine RNA wie auch eine RNA mit komplementärer Sequenz Matrizen zur Replikation durch die RNA Polymerase und aus diesem Grund steigt die Menge an replizierter RNA exponentiell mit der Zeit (solange die Anzahl der RNA Matrizenmoleküle nicht die Anzahl der RNA Polymerasemoleküle in einem System überschreitet). Siehe Miele et al., J. Mol. Biol. 171, 281 (1983). Ein System, in dem die Sonde für einen Zielabschnitt an eine RNA gebunden wird, die durch die Qβ Replikase repliziert werden kann, ist von Chu et al., Nucl. Acids Res. 14, 5591 (1986) beschrieben und die durch die BMV Replikase repliziert werden kann ist von Marsh et al., Positive Strand RNA Viruses, Alan R. Liss (Herausgeber, New York) (1987, Proceedings of UCLA Symposium, 1986) beschrieben.
Der erste Ansatz weist zwei schwerwiegende Nachteile auf. Erstens ist in vielen Fällen die Kopiezahl eines Zielabschnitts in einer Probe praktikabler Größe so gering, daß sogar bei ziemlich schnellen Signalerzeugenden Systemen die zur Erzeugung eines detektierbaren, deutlich über dem Hintergrund liegenden Signals erforderliche Zeit undurchführbar lang ist. Zweitens erfolgt die Signalerzeugung im wesentlichen mit derselben Geschwindigkeit aus "Hintergrund"-Signal erzeugenden Molekülen, wie aus signalerzeugenden Molekülen, die mit dem Ziel assoziiert sind. In jedem Assay für einen Zielabschnitt ist ein Signal aufgrund des "Hintergrunds" unvermeidbar, da hier stets etwas Signal aufgrund der Sonde vorkommt, die unspezifisch an Filtern oder anderen festen Trägern haftet oder mit Abschnitten hybridisiert, die zu der des Zielabschnitts sehr ähnliche Sequenzen aufweisen. Falls die Kopiezahl des Ziels zu gering ist, ist das Zeitkonstantenverhältnis des Signals vom Zielabschnitt plus dem Hintergrund (das heißt das "Signal") zum Signal des Hintergrunds (das heißt das "Rauschen") zu gering, um signifikant über dem Hintergrund detektiert zu werden. Diese und andere Nachteile führten im Fachgebiet zu einem zweiten Ansatz, um das Problem der Detektion eines in geringer Menge in einem komplexen Gemisch von Nucleinsäuren vorkommenden Zielabschnitts anzugehen.
Dieser zweite Ansatz ist grundsätzlich unterschiedlich und beinhaltet die Erhöhung der Kopiezahl des Zielabschnitts selbst, vorzugsweise in einem größeren Ausmaß, als den vom anderen Sequenzen in einer Probe, insbesondere jenen, die aufgrund von Ahnlichkeiten in der Sequenz irrtümlicherweise als Zielabschnitt detektiert werden könnten. Beispiele dieses zweiten Ansatzes beinhalten verschiedene Kulturtechniken, bei denen die Zellen, die den Zielabschnitt tragen, veranlaßt werden, zahlenmäßig zuzunehmen, manchmal schneller, als mehrere andere Zellen, oder bei denen bestimmte Nucleinsäuren (beispielsweise Plasmide, RNAs), die hierin den Zielabschnitt tragen, zur zahlenmäßigen Zunahme veranlaßt werden.
Solche Kulturtechniken haben die Nachteile, daß sie aufwendig, problematisch und zeitraubend sind und das Unvermeidliche zeigen: Andere Nucleinsäuren, als die, welche den Zielabschnitt beinhalten, steigen gleichzeitig in der Kopiezahl, was potentiell den "Hintergrund" erhöht. Ein weiterer Nachteil ist das resultierende Wachstum von potentiell gefährlichen Organismen als notwendiger Schritt, um die Amplifizierung zu erreichen.
Ein weiteres Beispiel dieses zweiten Ansatzes ist die Amplifizierung eines DNA Zielabschnitts in einer sogenannten "Polymerase-Kettenreaktion" ("PCR") . Diese Technik ist eine entliehene Anpassung von bekannten, natürlich vorkommenden Prozessen, die im replikativen Verfahren von beispielsweise einzelsträngigen DNA Genomen von bestimmten Viruseinheiten vorkommen, und stellt in allen Fällen eine Anwendung dar, die mit der cDNA Präparation nach Hong, Bioscience Reports 1, 243 (1981), Cooke et al., J. Biol. Chem. 255, 6502 (1980) und Zoller et al., Methods in Enzymology 100, 468-500 (1983) verwandt ist. Durch diese Technik steigt die Kopiezahl eines bestimmten Abschnitts exponentiell mit der Anzahl an Zyklen, von denen jeder folgendes umfaßt (1) die Hybridisierung eines DNA Primers an einen 3'-terminalen Unterabschnitt sowohl des Zielabschnitts als auch dessen Komplementärs (das heißt der Sequenzabschnitt, der zu dem des Zielabschnitts komplementär ist), (2) Extension jedes der Primer mit einer DNA Polymerase und (3) Überführung der aus Schritt (2) entstandenen Doppelstränge in Einzelstränge durch thermische Denaturierung. Diese Technik ist in Saiki et al., Science 230, 1350 (1985) und Mullis et al., europäische Patentanmeldungen mit den Nummern 200 362 und 201 184 beschrieben. Siehe auch U.S Patente 4 683 195 und 4 683 202. Wie berichtet, kann durch Anwendung der Technik für 20 Zyklen während etwa 3 Stunden die Kopiezahl eines Zielabschnitts etwa um den Faktor 10- erhöht werden. Da nur solche Abschnitte durch Kettenextension einen Zielabschnitt ergeben, an die ein spezifischer Primer mit einer ausreichenden Stabilität hybridisiert, um eine Kettenextension durch die Polymerase unter Bildung des Komplementärs auszulösen, und die einen Komplementär aufweisen, an den ein anderer spezifischer Primer ähnlich hybridisiert, steigen diese exponentiell in der Kopiezahl, während andere Nicht-Zielabschnitte, die nicht irrtümlicherweise mit dem verwendeten Primer hybridisieren, falls überhaupt maximal linear in der Kopiezahl als Funktion der Zyklenzahl steigen. Die Technik der Polymerasekettenreaktion kann nicht nur die Kopiezahl des Zielabschnitts stark erhöhen, sondern auch das Verhältnis der Menge an Zielabschnitt zu der von Hintergrund-verursachenden Abschnitten in einer Probe.
Natürlich folgt daraus, daß dieser zweite Ansatz auf eine Probe zusammen mit der Verwendung des ersten Ansatzes mit dem amplifizierten Zielabschnitt unter Bildung eines sogar noch stärkeren Detektionssignals angewendet werden kann.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Probleme des Stands der Technik zu lösen und die Nachteile zu überwinden, die bei früheren Forschungsbemühungen aufgeführt wurden, um diese Probleme zu lösen. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung eine direkt zum Ziel führende Technik bereitzustellen, die in einer annehmbar kurzen Zeit unter der bequemen Verwendung bekannter Reagenzien verwendet werden kann, und die die Präzision aufweist, um folgerichtige wissenschaftliche Ergebnisse zu erreichen, eine, die in einer reproduzierbaren Testausstattung verwendet werden kann und die zur Verwendung in Kits für Labor/klinische Analysen zugeschnitten werden kann.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Detektierbarkeit von bestimmten Nucleinsäuresequenzen (Zielabschnitten) durch Amplifizierung dieser Zielsequenzen in einem in vitro oder ex vivo System zu steigern, dem die Nachteil fehlen, die bis jetzt durch Bemühungen des Stands der Technik aufgezeigt wurden.
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit einer neuen Technik zur Durchführung des zweiten Ansatzes zur Detektion eines Zielabschnitts, der in einer geringen Menge in einem komplexen Gemisch aus Nucleinsäuren vorkommt. Sie verwendet einen neuen Schritt der RNA Transkriptbildung zusammen mit und abgeleitet von einer synthetisierten doppelsträngigen cDNA Kopie der Zielsequenz als vollstandigen Zyklus. Es können mehrere Zyklen verwendet werden. Da der Transkriptionsschritt der dominante Neuheitsaspekt ist, wird sie hierin einfach als Transkriptions-basiertes Amplifizierungssystem (TAS) bezeichnet. Diese neue Technik der vorliegenden TAS Erfindung führt zu einem schnellen Anstieg der Kopiezahl eines ausgewählten Zielabschnitts, indem man von zwei Eigenschaften der DNA-abhängigen RNA Polymerase Gebrauch macht: (1) die anerkannte Transkriptionsinitiation nur von einer kleinen Anzahl an Sequenzen ausgehend, die für jede Polymerase spezifisch sind, siehe beispielsweise Brown et al., Nucl. Acids Res. 14, 3521 (1986) und (2) die schnelle Bildung einer großen Anzahl an Transkripten ausgehend von jeder Promotorkopie (typischerweise 10²-10&sup4; pro Stunde), die von einer RNA Polymerase erkannt werden. Siehe Milligan et al., Nucleic Acids Res. 15, 8783 (1987). Die erfindungsgemäße Technik kann auch die Fähigkeit von RNAs mit bestimmten Sequenzen verwenden, um diese schnell (autokatalytisch) durch die RNA-abhängige RNA Replikase zu replizieren. Siehe ebenfalls Miele et al., obige Literaturstelle. Zusätzlich liefert sie eine Standardisierungstechnik, die eine eindeutige Messung der Menge an Ziel-DNA ermöglicht, die in einer Probe vorkommt.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Amplifizieren einer Zielsequenz in einer Nucleinsäure enthaltenden Probe bereitgestellt, das folgende Schritte umfaßt:
(A) Bereitstellen eines ersten Nucleinsäureprimers, der eine Promotorsequenz enthält, die operativ mit einer Sequenz verknüpft ist, die einem ersten Abschnitt der Zielsequenz entspricht, wobei der erste Abschnitt das 3'-Ende der Zielsequenz umfaßt, und eines zweiten Nucleinsäureprimers, der mit einer Sequenz hybridisierbar ist, die zu einem zweiten Abschnitt der Zielsequenz komplementär ist, wobei der zweite Abschnitt das 5'-Ende der Zielsequenz umfaßt,
(B) Hybridisieren des ersten Nucleinsäureprimers mit der Zielsequenz unter geeigneten Bedingungen in einer Nucleinsäure enthaltenden Probe,
(C) Extendieren des hybridisierten ersten Nucleinsäureprimers in einer Polymeraseextensionsreaktion komplementär zur Zielsequenz, wobei ein erster Nucleinsäuredoppelstrang gebildet wird, (D) Überführen des in Schritt (C) gebildeten Doppelstrangs in Einzelstränge,
(E) Hybridisieren des zweiten Nucleinsäureprimers unter geeigneten Bedingungen mit dem entstandenen abgetrennten die Promotorsequenz enthaltenden Strang,
(F) Extendieren des hybridisierten zweiten Nucleinsäureprimers in einer Polymeraseextensionsreaktion komplementär zum die Promotorsequenz enthaltenden Strang, wobei ein zweiter Nucleinsäuredoppelstrang gebildet wird,
(G) Verwenden des zweiten Doppelstrangs als Matrize zur Herstellung einer Vielzahl von RNA-Transkripten davon, in einer Reaktion, die durch eine RNA-Polymerase katalysiert wird, welche den der Promotorsequenz des ersten Primers entsprechenden Promotor erkennt, wobei jedes der Transkripte eine der Zielsequenz entsprechende RNA-Sequenz beinhaltet,
(H) Hybridisieren der aus dem zweiten Doppelstrang hergestellten RNA-Transkripte mit dem zweiten Nucleinsäureprimer unter geeigneten Bedingungen,
(I) Extendieren des hybridisierten zweiten Nucleinsäureprimers in einer Polymeraseextensionsreaktion, die von einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase katalysiert wird, komplementär zu den RNA-Transkripten, wobei ein dritter Nucleinsäuredoppelstrang gebildet wird,
(J) Überführen des dritten Doppelstrangs in Einzelstränge,
(K) Hybridisieren von zweiten Primer enthaltenden Strängen aus der Strangtrennung des dritten Doppelstrangs, unter geeigneten Bedingungen mit dem ersten Primer,
(L) Extendieren von sowohl ersten als auch zweiten Primer enthaltenden Strängen in den Hybriden aus erstem Primer mit zweiten Primer enthaltenden Strängen aus einer Trennung der Stränge des dritten Doppelstrangs in einer Polymeraseextensionsreaktion, wobei ein vierter Nucleinsäuredoppelstrang gebildet wird, und
(M) Verwenden des vierten Doppelstrangs als Matrize zur Herstellung einer Vielzahl von RNA-Transkripten davon, in einer Reaktion, die durch eine RNA-Polymerase katalysiert wird, welche den der Promotorsequenz des ersten Primers entsprechenden Promotor erkennt, wobei jedes der Transkripte eine der Zielsequenz entsprechende RNA-Sequenz beinhaltet.
Wahlweise können die Schritte (H) - (M) zumindest einmal wiederholt werden, indem in Schritt (H), jedesmal wenn die Schritte (H) - (M) ausgeführt werden, die Hybridisierung eines zweiten Primers an das im unmittelbar vorhergehenden Schritt (M) hergestellte RNA Transkript verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung ergibt (bis eine induzierte (autokatalytische) Replikation verwendet wird) ein einzelsträngiges RNA Transkript oder einen RNA-DNA Doppelstrang, der hiervon gebildet wird, falls keine Maßnahmen unternommen werden, dessen Bildung zu verhindern, die einen Unterabschnitt aufweisen, der die Sequenz des Zielabschnitts oder die komplementäre Sequenz des Zielabschnitts hat und die in großem Überschuß relativ zur Nucleinsäure mit einem Unterabschnitt komplementärer Sequenz vorkommen. Dieser anfängliche Überschuß eines einzelsträngigen RNA Transkripts ist bei bestimmten Verfahren zur Detektion des amplifizierten Produkts mit einer markierten Nucleinsäuresonde vorteilhaft, da wenig Segment mit komplementärer Sequenz vorhanden ist, um mit der Sonde bei der Hybridisierung mit dem amplifizierten Produkt zu konkurrieren. Das einzelsträngige RNA Transkriptprodukt hiervon wird auch mehr oder weniger kontinuierlich abgezogen und sorgt für die direkte Detektion eines Zielabschnitts ohne die Notwendigkeit von aufwendigen, fehlerhaften wiederholten PCR Zyklen und Strangtrennung. Solche Vorteile werden durch die PCR Technik nicht bereitgestellt, die doppelsträngige DNA liefert (ein Strang umfaßt den Zielabschnitt und der andere Strang umfaßt den komplementären Strang des Zielabschnitts), welche vor der Detektion getrennt werden muß und nur nach einer großen Anzahl an notwendigen wiederholten Zyklen annehmbare Amplifizierungsmengen erreicht.
Die Techniken der vorliegenden Erfindung stellen eine Amplifizierung eines ausgewählten Zielabschnitts in einem Ausmaß bereit, das mindestens so groß ist, wie das der PCR Technik während etwa derselben Zeitspanne, aber in einer einfacheren und reproduzierbareren Weise und abweichend von natürlichen Prozessen oder anderer Verfahren.
Wir stellten fest, wie die Bakteriophagen DNA-abhängige RNA Polymerase zur schnellen Amplifizierung (das heißt Erhöhung der Kopiezahl) einer ausgewählten Zielnucleinsäuresequenz (Zielsequenz oder Zielabschnitt) verwendet werden kann, die in einer Nucleinsäureprobe vorkommt. Ferner haben wir festgestellt, wie die Bakteriophagen DNA-abhängige RNA Polymerase zusammen mit der Bakteriophagen RNA-abhängigen RNA Polymerase verwendet werden kann, um dasselbe Ergebnis zu erzielen. Bisher wurde nicht erkannt, daß eine solche RNA Polymerase für diesen Zweck verwendet werden könnte.
Die Erfindung enthält Verfahren, die auf diesen Feststellungen basieren und Kits zur Durchführung der Verfahren. Diese Verfahren und Kits sind insbesondere brauchbar, wenn sie in Zusammenhang mit einem Nucleinsäuresondenhybridisierungsassay für Nucleinsäuren verwendet werden, die einen erfindungsgemäß amplifizierten Zielabschnitt enthalten. Daher enthält die Erfindung auch Verfahren und Kits zur Durchführung der Verfahren, Detektion des Vorkommens oder des Fehlens eines Abschnitts in einer Nucleinsäureprobe, die einen bestimmten Abschnitt umfaßt, mittels einer an diesen Abschnitt nach einer erfindungsgemäßen Amplifizierung hybridisierten Sonde.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Neuheit von bestimmten RNA Transkripten, ihre Herstellung, wahlweise Replikation und Verwendung, um die gewünschte Amplifizierung und Detektion der entsprechenden (in der Sequenz) Zielnucleinsäure zu erreichen. Diese Erfindung wird in einem in vitro oder ex vivo Ansatz durchgeführt und wird zusammen mit der Synthese einer doppelsträngigen cDNA Kopie der Zielsequenz verwendet, um eine doppelsträngige Nucleinsäurematrize herzustellen, die wiederum zur Herstellung dieser RNA Transkripte verwendet wird. Dieses Verfahren der doppelsträngigen cDNA Synthese und RNA Transkription stellt einen einzigen Zyklus des vorliegenden Transkriptions-basierenden Amplifizierungssystems (TAS) dar. Dieser wird wiederholt, um noch höhere Amplifizierungsmengen zur erreichen. Aufgrund des Verfahrens, durch das sie gebildet (und reproduziert) werden, entsprechen die Transkripte (identisch oder komplementär) in der Sequenz einer Zielnucleinsäuresequenz, die in einer ursprünglichen Probe in einem Gemisch an Nucleinsäuren enthalten war, und daher sorgt das Vorkommen der Transkripte in amplifizierter Form für ihre Detektion und somit für die in vitro oder ex vivo Detektion des Vorkommens einer Zielnucleinsäuresequenz in dieser Probe.
Daher beinhaltet die vorliegende Erfindung die in vitro oder ex vivo Detektion von zumindest einer spezifischen Nucleinsäuresequenz (Zielsequenz oder Zielabschnitt) in einer Probe, die Nucleinsäure enthält. Die vorliegende Erfindung reduziert sich auf ein Verfahren, das umfaßt die Herstellung einer doppelsträngigen Nucleinsäure, die eine einer Zielsequenz entsprechende Sequenz operativ an einen Promotor hierfür gebunden enthält, Verwendung dieser doppelsträngigen Nucleinsäure als doppelsträngige Nucleinsäurematrize zur Herstellung einer Vielzahl an RNA Transkripten hiervon, wobei jedes eine RNA Sequenz trägt, die dieser Zielsequenz entspricht, und Detektion des Vorkommens dieser RNA Sequenz und somit des Vorkommens der Zielsequenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft alle Verfahren und Mittel, die mit der Herstellung und Verwendung solcher RNA Transkripte zusammenhängen. Daher betrifft die vorliegende Erfindung das repetitive Verfahren der Herstellung dieser oben definierten doppelsträngigen Nucleinsäurematrize, das umfaßt das Bereitstellen eines ersten Nucleinsäureprimers, der eine Promotorsequenz enthält, die operativ mit einer Sequenz verknüpft ist, die einem wie oben definierten Abschnitt der Zielsequenz entspricht, das Hybridisieren des ersten Nucleinsäureprimers mit der Zielsequenz unter geeigneten Bedingungen in einer Nucleinsäure enthaltenden Probe, das Extendieren des hybridisierten ersten Nucleinsäureprimers in einer Polymeraseextensionsreaktion komplementär zur Zielsequenz, wobei ein erster Nucleinsäuredoppelstrang gebildet wird, das Trennen der Stränge dieses Doppelstrangs, das Hybridisieren eines zweiten Nucleinsäureprimers unter geeigneten Bedingungen mit dem abgetrennten die Promotorsequenz enthaltenden Strang am der Promotorsequenz gegenüberliegenden Ende, und das Extendieren des hybridisierten zweiten Nucleinsäureprimers in einer Polymeraseextensionsreaktion komplementär zur Promotor enthaltenden Sequenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner und alternativ dazu Verfahren und Mittel zur Herstellung dieser doppelsträngigen Nucleinsäurematrize (siehe oben), beispielsweise eine im wesentlichen in einem Ansatz laufende Reaktion, die umfaßt das Bereitstellen eines ersten Nucleinsäureprimers, der eine Promotorsequenz enthält, die operativ an eine zu einem Abschnitt der Zielsequenz komplementäre Sequenz gebunden ist und eines zweiten Nucleinsäureprimers, der eine zu einem Abschnitt einer Zielsequenz identische Sequenz aufweist, wobei diese Primer verschiedenen Regionen dieser Zielsequenz entsprechen, aber nicht oder nicht wesentlich in ihrer Entsprechung zur Zielsequenz überlappen, und so ausgewählt sind, daß ein Extensionsprodukt von einem, wenn es von seinem komplementären Strang abgetrennt ist, als Matrize für ein Extensionsprodukt des anderen dienen kann, das Zusammenbringen einer einer Nucleinsäure enthaltenden Probe, die die Zielsequenz enthält, mit diesen Primern unter sequentiellen Hybridisierungs- und Strangtrennungsbedingungen, so daß dadurch Extensionsprodukte dieser Primer gebildet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren und Mittel zur Verwendung dieser oben genannten doppelsträngigen Nucleinsäure als Matrize für die Herstellung einer Vielzahl an RNA Transkripten hiervon in einer Reaktion, die durch eine DNA-abhängige RNA Polymerase katalysiert wird, die den Promotor hiervon erkennt, und die Detektion und Messung des Vorkommens dieser RNA Transkripte.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren und Mittel zur Standardisierung der Menge an detektierter Zielsequenz (durch Bezugnahme auf die detektierte RNA Menge) durch weitere Korrelation zum Vorkommen von bekannten Nucleinsäuren, die als interner Standard verwendet werden. Die Kopiezahl des Standards ist vorbestimmt, der Standard soll dieselben Bedingungen während der Ausführung dieser Erfindung erfahren, wie es die Zielsequenz tut und soll daher als Berechnungsgrundlage bei der Bestimmung der relativen Mengen von der parallel für ihn und für die Zielsequenz gebildeten Transkripte dienen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die weitere Replikation der wie oben definierten erhaltenen RNA Transkripte über das Vorkommen von Replikaseerkennungsstellen hierin. Dies wird bequem durch die Bereitstellung eines wie oben definierten ersten Nucleinsäureprimers erreicht, der zusätzlich eine Replikaseerkennungssequenz trägt, vorzugsweise zwischen der Promotorsequenz und der der Zielsequenz entsprechenden Sequenz, und/oder zusätzlich eine Replikaseerkennungsstelle auf dem oben definierten zweiten Nucleinsäureprimer enthält. Bei der anschließenden Transkription, tragen die entstehenden Transkripte die Replikaseerkennungstelle(n), so daß das Vorkommen einer Replikase (in der Reaktion oder im Kit bespielsweise) (autokatalytisch) die Replikation der Transkripte induziert, wobei zusätzliche Kopien zur erneuten Erleichterung der Detektion hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Kits, die die erforderlichen Reagenzien und damit verbundenen Mittel enthalten, die bei der in vitro oder ex vivo Detektion von zumindest einer spezifischen Nucleinsäuresequenz (Zielsequenz) in einer Nucleinsäure enthaltenden Probe unter Verwendung der oben definierten Verfahren und Mittel brauchbar sind.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

1. Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1A, 1B und 1C erläutern ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Amplifizierung eines Zielabschnitts einer Nucleinsäure (Nucleinsäure A), die DNA oder RNA ist, worin viele Kopien einer ersten RNA (RNA I) mit einem Abschnitt hergestellt werden, der eine zu der des Zielabschnitts komplementäre Sequenz aufweist.
Die Fig. 2A, 2B, 2C erläutern ferner gemäß einem Aspekt der Erfindung die Amplifizierung eines Abschnitts einer RNA I, die wie in den Fig. 1A, 1B und 1C erläutert, hergestellt wird, zur Herstellung vieler Kopien einer zweiten RNA (RNA II) mit einem Abschnitt, der eine zu der eines Unterabschnitts des Zielabschnitts identische Sequenz aufweist, der zur Herstellung der RNA I amplifiziert wurde.
Die Fig. 3 stellt Autoradiogramme dar, die verschiedene Konzentrationen HIV RNAs zeigen, die gleichzeitig mit einer festen Konzentration humaner ß-Globinnucleinsäure durch TAS amplifiziert wurden.
Die Fig. 4 stellt eine allgemeine Strategie dar, bei der durch eine DNA-abhängige RNA Polymerase gebildete RNA ein RNA Molekül ergibt, das als Matrize für eine RNA-abhängige Replikase dienen kann.

2. Allgemeine Verfahren und Definitionen

Es wird auf die Standardbücher der Molekularbiologie Bezug genommen, die Definitionen, Verfahren und Mittel zur Ausführung von grundlegenden Techniken der vorliegenden Erfindung enthalten, wie: DNA Sonden oder Primerherstellung, einschließlich DNA Synthese, Hybridisierungsmethoden, einschließlich Variationen in den Stringenzbedingungen zur Bildung von mehr oder weniger Hybridisierungssicherheit in Abhängigkeit von dem Grad der Homologie des Primers zu einer DNA Zielsequenz, Identifizierung, Isolierung oder Herstellung von Promotoren, oder spezifischeren Promotoren oder Stellen, die von Bakteriophagen DNA-abhängiger RNA Polymerase und Bakteriophagen RNA-abhängiger RNA Polymerase erkannt werden, oder bei der Verwendung von eukaryontischen Systemen virale DNA- und RNA- abhängige Polymerasen, beispielsweise Adenovirus kodierte RNA Polymerase und Brommosaikvirus RNA Polymerase, Bedingungen, die der Bildung von RNA Transkripten zuträglich sind, einschließlich sogenannter Transkriptionsenhancersequenzen, der Mechanismus und die Methode zur (induzierten) Replikation, Polymerasekettenreaktionsverfahren einschließlich der hierin verwendeten Reagenzien und so weiter. Siehe beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982) und die verschieden hierin zitierten Literaturangaben, US Patent 4 683 195, US Patent 4 683 202, Hong, Bioscience Reports l, 243 (1981), Cooke et al., J. Biol. Chem. 255 6502 (1980) und Zoller et al., Methods in Enzymology 100, 468-500 (1983), Crea et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980), Narang et al., Meth. Enzym. 68, 90 (1979), Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981), Brown et al., Meth. Enzym. 68, 109 (1979), Caruthers et al., Meth. Enzym. 154, 287 (1985), Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980), Lee et al., Science 239, 1288 (1988), Milligan et al., Nucleic Acids Res. 15, 8783 (1987), Mil- 1er et al., Virology 125, 236 (1983), Ahlquist et al., J. Mol. Biol. 153, 23 (1981), Miller et al., Nature 313, 68 (1985), Ahlquist et al., J. Mol. Biol. 172, 369 (1984), Ahlquistet al., Plant Mol. Biol. 3, 37 (1984), Ou et al., PNAS 79, 5235 (1982), Chu et al., Nucl. Acids Res. 14, 5591 (1986), europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer (EPA) 194 809, Marsh et al., Positive Strand RNA Viruses, Seiten 327-336, Alan R. Liss (Herausgeber, New York) (1987), Proceedings of UCLA Symposium, 1986), Miller et al., J. Mol. Biol. 187, 537 (1986), Stoflet et al., Science 239, 491 (1988) und Murakawa et al., DNA 7, 287 (1988).
Alle diese genannten Publikationen werden durch diese Angaben hiermit eingeführt.
Mit dem Ausdruck "Promotor" ist eine Nucleinsäuresequenz gemeint (natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt oder ein Produkt eines Restriktionsverdaus), die spezifisch von einer RNA Polymerase erkannt wird, die an eine Erkennungssequenz bindet und den Transkriptionsprozeß initiert, wobei ein RNA Transkript gebildet wird. Sie kann wahlweise Nucleotidbasen enthalten, die über die tatsächliche Erkennungsstelle hinausgehen, um zusätzliche Stabilität gegenüber den Abbauprozessen zu verleihen. Prinzipiell kann jede Promotorsequenz verwendet werden, für die eine bekannte und verfügbare Polymerase existiert, die zur Erkennung der Initiationssequenz fähig ist. Typische bekannte und brauchbare Promotoren sind jene, die durch bestimmte Bakteriophagenpolymerasen erkannt werden, wie vom Bakteriophagen T3, T7 oder SP6. Siehe Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980). Dies sind nur Beispiele für Polymerasen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung zusammen mit ihren zugehörigen Promotorsequenzen verwendet werden können.
Das "RNA Transkript" hiervon ist die Ribunucleinsäuresequenz, die nach der Transkriptionsinitiation anschließend an die RNA Polymeraseerkennung der Promotorsequenz (siehe oben) gebildet wird. Die Bildung solcher Transkripte ist mehr oder weniger kontinuierlich und teilweise von der vorkommenden Menge an Polymerase abhängig.
Mit dem Ausdruck "Primer" ist im vorliegenden Zusammenhang eine Nucleinsäuresequenz gemeint (natürlich auftretend oder synthetisch hergestellt oder ein Produkt eines Restriktionsverdaus), die eine ausreichende Homologie mit der Zielsequenz aufweist, so daß sie unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen zur Hybridisierung fähig ist, das heißt zur Bindung an die Zielsequenz. Ein typischer Primer ist mindestens etwa 10 Nucleotide lang und vor allem ist er etwa 35 oder mehr Nucleotidbasen lang und in den am meisten bevorzugten Ausführungsformen zeigt er eine Identität oder sehr hohe Homologie mit der Zielsequenz. Siehe beispielsweise EPA 128 042 (offengelegt am 12. Dezember 1984)
Der Ausdruck "operativ verbunden" bezieht sich insbesondere im Zusammenhang mit der Einbindung einer Promotorsequenz in eine Primersequenz auf die Funktionalität der grundlegenden "doppelsträngigen Nucleinsäurematrize" der vorliegenden Erfindung, so daß die Matrize zur Bildung der entsprechenden RNA Transkripte fähig ist, wenn der Promotor von der geeigneten Polymerase erkannt wird -- siehe oben.
Die Primerextensionsreaktion zur Bildung eines Doppelstrangs ist an sich bekannt. Siehe obige Literaturangaben. Die für diesen Zweck brauchbare Polymerase beinhaltet die E. coli DNA Polymerase I, das Klenowfragment der E. coli DNA Polymerase I, die T4 DNA Polymerase, die reverse Transkriptase und so weiter.
Die Techniken zur Bildung eines Detektionssignals, wie durch radioaktive Markierung oder chromogene Mittel unter Verwendung eines chromogenen empfindlichen Enzyms sind ebenfalls im Fachgebiet gut bekannt und dokumentiert. Siehe obige Diskussion.
Die Verwendung einer "Replikase" zur (autokatalytischen) Replikationsinduktion der erfindungsgemäßen RNA Transkripte sind allgemein im Fachgebiet bekannt. Geeignete Beispiele für solche Replikasen, die bei der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, beinhalten die sogenannte Qβ Virusreplikase, die bestimmte Nucleinsäuresequenzen sowohl an den 3'- als auch an den 5'-Enden des gegebenen RNA Transkripts erkennt und die sogenannte Brommosaikvirus (BMV) Replikase wie auch die Alphavirusreplikasen, die Nucleinsäuresequenzstellen am 3'-Ende eines gegebenen Transkripts erkennen dürften. Diese Replikasen dienen zur Replikation, das heißt zur Reproduktion der RNA Transkripte und komplementären Stränge, um so Kopien hiervon zu vervielfachen. Wenn das Enzym in der Reaktion während dem Transkriptionsprozeß in der Reaktion vorhanden ist, kann man voraussehen, daß die während der Transkription gebildeten häufigen Transkripte ihrerseits einer Replikation unterzogen werden, um die Menge an RNA Transkriptionsprodukt exponentiell zu erhöhen.
Die interne Standardisierung ist als Verfahren definiert, das verwendet wird für: a) Die Sicherstellung, daß das TAS Amplifizierungsverfahren nicht durch einen Verfahrensfehler fehlgeschlagen hat und b) die Messeung der Mengen an Zielnucleinsäure relativ zu einer vorherbestimmten Menge an Nucleinsäure, die immer mit der interessierenden Probe verbunden ist. Eine solche interne Standardisierung findet durch gemeinsame Amplifizierung eines Teils der Zielsequenz wie auch einer endogenen Sequenz in derselben Reaktion statt. Beispielsweise könnte bei bekannter in der biologischen Probe vorhandener Zellzahl, ein Gen mit einer Kopie (beispielsweise β-Globin) als interner Standard verwendet werden, und dessen anfängliche Kopiezahl entspricht dem Zweifachen der gesamten Zellzahl in der Probe, falls es nicht in Form von RNA exprimiert wird. Durch gemeinsame Amplifizierung von Teilen des β- Globins und der interessierenden Zielsequenzen können die Verhältnisse der amplifizierten Signale zur Quantifizierung der Menge an interessierender Zielsequenz verglichen werden. Da jede Zelle zwei Kopien dieses internen Standards aufweist (bei diploiden Zellen), unabhängig davon, ob die biologische Probe separate Zielsequenzen enthält (beispielsweise HIV), sollte jede Probe ein positives vom internen Standard resultierendes Amplifizierungssignal bilden. Siehe Groudine et al., Nucleic Acids Research 12, 1427 (1984) und McKnight, Cell 31, 355 (1982) . Siehe ebenfalls britische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 2 187 283 A (offengelegt am 3. September 1987).
In einem ihrer Aspekte ist die Erfindung ein Verfahren zum Amplifizieren eines Nucleinsäurezielabschnitts der Formel I
3'-(erster Unterabschnitt)t-(zweiter Unterabschnitt)t-(dritter Unterabschnitt)t-&sup5;'
I
wobei (erster Unterabschnitt)t ein Nucleinsäureabschnitt einer bekannten Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden ist, der am 3'-Ende von (zweiter Unterabschnitt)t angrenzt, (zweiter Unterabschnitt)t ein Nucleinsäureabschnitt von 0 oder mehr Nucleotiden ist, und (dritter Unterabschnitt)t ein Nucleinsäureabschnitt einer bekannten Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden ist, der am 5'-Ende von (zweiter Unterabschnitt)t angrenzt, wobei das Verfahren umfaßt:
(1) Hybridisieren von (erster Unterabschnitt)t der Zielsequenz mit einem ersten Primer, der eine einzelsträngige DNA ist, die einen 3'-terminalen Unterabschnitt der Formel II umfaßt
5'-(Promotor)&sub1;-(variabler Unterabschnitt)&sub1;-(3'-Primer-Unterabschnitt)1-3'
II
wobei (Promotor)&sub1; ein einzelsträngiger DNA Abschnitt mit der Sequenz des Plus-Strangs eines DNA-abhängigen RNA-Polymerase-spezifischen Bakteriophagenpromotors ist, (variabler Unterabschnitt) 1 ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt mit 0 bis 100 Nucleotiden ist, der an das 3'-terminale Nucleotid von (Promotor)&sub1; und an das 5'- terminale Nucleotid von (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; angrenzt, und (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt von mindestens 10 Nucleotiden ist, mit einer Sequenz, die komlementär zur Sequenz eines Unterabschnitts von (erster Unterabschnitt)t ist, die mit dem 3'-terminalen Nucleotid von (erster Unterabschnitt)t endet, wobei (Promotor)&sub1; an das 5'-Ende von (3'-Primer- Unterabschnitt)1 angrenzt, falls (variabler Unterabschnitt)&sub1; 0 Nucleotide hat,
(2) Extendieren des gemäß Schritt (1) hybridisierten ersten Primers in einer durch eine erste DNA-Polymerase katalysierten Reaktion, um einen ersten komplementären DNA Abschnitt herzustellen, der einen Unterabschnitt der Formel III umfaßt
5'-(Promotor)&sub1;-(variabler Unterabschnitt)&sub1;-(erster Unterabschnitt)tc-(zweiter Unterabschnitt)tc-(dritter Unterabschnitt)tc-3'
III
wobei (erster Unterabschnitt)tc der DNA-Abschnitt mit der zu erster Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, (zweiter Unterabschnitt)tc der DNA-Abschnitt mit der zu (zweiter Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, und (dritter Unterabschnitt)tc der DNA Abschnitt mit der zu (dritter Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, vorausgesetzt daß, falls der Zielabschnitt ein RNA-Abschnitt ist, die erste DNA-Polymerase eine reverse Transkriptase ist,
(3) Überführen des in der Reaktion von Schritt (2) gebildeten Doppelstrangs in Einzelstränge,
(4) Hybridisieren von (dritter Unterabschnitt)tc der ersten komplementären DNA der Formel III mit einem zweiten Primer, der eine einzelsträngige DNA von mindestens 10 Nucleotiden der Formel IV ist
3'-(5'-primer-Unterabschnitt)&sub2;-(variabler Unterabschnitt)&sub2;-5'
IV
wobei (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub2; die Sequenz eines Unterabschnitts von (dritter Unterabschnitt)t hat, die mit dem 5'-terminalen Nucleotid von (dritter Unterabschnitt)t endet und wobei (variabler Unterabschnitt)&sub2; ein Abschnitt von 0 bis 100 Nucleotiden ist, der an das 5'-Ende von (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub2; angrenzt,
(5) Extendieren des gemäß Schritt (4) hybridisierten zweiten Primerabschnitts in einer von einer zweiten DNA-Polymerase katalysierten Reaktion, um einen zweiten komplementären DNA-Abschnitt herzustellen, der einen Unterabschnitt der Formel V umfaßt
5'-(variabler Unterabschnitt)&sub2;-(dritter Unterabschnitt)t-(zweiter Unterabschnitt)t-(erster Unterabschnitt)t-(variabler Unterabschnitt)1c-(Promotor)1c-3'
V
wobei (variabler Unterabschnitt)1c der DNA-Abschnitt mit der zu (variabler Unterabschnitt)&sub1; komplementären Sequenz ist, (Promotor)1c der DNA-Abschnitt mit der zu (Promotor)&sub1; komplementären Sequenz ist, vorausgesetzt, daß die zweite DNA-Polymerase gleich oder unterschiedlich zur ersten DNA Polymerase ist, und
(6) Verwenden des doppelsträngigen Produkts aus Schritt (5) als Matrize in einer Reaktion, die durch eine erste DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase katalysiert wird, die den Promotor, dessen einer Strang (Promotor)&sub1; ist, erkennt, wobei ein erstes RNA-Produkt der Formel VI hergestellt wird
5'-(variabler Unterabschnitt)1r-(erster Unterabschnitt)tcr- (zweiter Unterabschnitt)tcr-(dritter Unterabschnitt)tcr-(variabler Unterabschnitt)2cr-3'
VI
wobei (variabler Unterabschnitt)1r der RNA-Abschnitt mit der Sequenz von (variabler Unterabschnitt)&sub1; ist, (erster Unterabschnitt)tcr der RNA-Abschnitt mit der zu (erster Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, (zweiter Unterabschnitt)tcr der RNA- Abschnitt mit der zu (zweiter Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, (dritter Unterabschnitt)tcr der RNA-Abschnitt mit der zu (dritter Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, und (variabler Unterabschnitt)2cr der RNA-Abschnitt der zu (variabler Unterabschnitt)&sub2; komplementären Sequenz ist, dadurch gekennzeichnet, daß nach den Verfahrensschritten 1 bis 6 weitere Amplifikation des Nucleinsäure-Zielabschnitts in einem Wiederholungszyklus durchgeführt wird, in dem (erster Unterabschnitt)t eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden hat und die Formel XIII aufweist
3'-(erster Unterabschnitt)t2-(erster Unterabschnitt)t1-5'
XIII
wobei (erster Unterabschnitt)t2 0 oder mehr Nucleotide hat und, falls mehr als 0, an das 3'-Ende von (erster Unterabschnitt)t1 angrenzt, und (erster Unterabschnitt)t1 eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden hat, wobei (dritter Unterabschnitt)t die Formel XIV aufweist
3'-(dritter Unterabschnitt)t1-(dritter Unterabschnitt)t2-5'
XIV
wobei (dritter Unterabschnitt)t2 0 oder mehr Nucleotide hat und, falls mehr als 0, an das 5'-Ende von (dritter Unterabschnitt)t1 angrenzt, und (dritter Unterabschnitt)t1 eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden hat, wobei (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz hat, die komplementär zu einem Unterabschnitt des Zielabschnitts ist, die aus dem gesamten (ersten Unterabschnitt)t2 und 0 oder mehr Nucleotiden von (erster Unterabschnitt)t2 besteht, wobei (5'- Primer-Unterabschnitt)&sub2; ein Unterabschnitt ist, der aus dem gesamten (dritten Unterabschnitt)t2 und 0 oder mehr Nucleotiden von (dritter Unterabschnitt)t1 besteht, und wobei nach Schritten 1 bis 6 ein RNA-Segment der Formel VII
5'-(erster Unterabschnitt)t1cr-(zweiter Unterabschnitt)tcr- (dritter Unterabschnitt)tlcr-3'
VII
wobei (erster Unterabschnitt)t1cr der RNA-Abschnitt mit der zu (erster Unterabschnitt)t1 komplementären Sequenz ist und (dritter Unterabschnitt)t1cr der RNA-Abschnitt mit der zu (dritter Unterabschnitt)t1 komplementären Sequenz ist, weiter amplifiziert wird durch ein Verfahren, welches umfaßt:
(7) Hybridisieren des ersten RNA-Produkts der Formel VI mit einem dritten Primer, der eine einzelsträngige DNA ist, die einen 3'- terminalen Unterabschnitt der Formel VIII umfaßt
5'-(Promotor)&sub3;-(variabler Unterabschnitt)&sub3;-(3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3;-3'
VIII
wobei (Promotor)&sub3; ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt mit der Sequenz des Plus-Strangs von einem DNA-abhängigen RNA-Polymerasespezifischen Bakteriophagenpromotors ist, wobei die Sequenz von (Promotor)&sub3; gleich oder unterschiedlich wie die von (Promotor)&sub1; ist, (variabler Unterabschnitt)&sub3; ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt von 0 bis 100 Nucleotiden ist, der an das 3'-terminale Nucleotid von (Promotor)&sub3; und an das 5'-terminale Nucleotid von (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; angrenzt, und (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt mit der gleichen Sequenz wie (dritter Unterabschnitt)t1 ist und, falls (variabler Unterabschnitt)&sub3; 0 Nucleotide hat, an das 3'-terminale Nucleotid von (Promotor)&sub3; angrenzt,
(8) Extendieren des gemäß Schritt (7) hybridisierten dritten Primers in einer von einer dritten DNA-Polymerase katalysierten Reaktion, welche eine reverse Transkriptase ist und gleich oder unterschiedlich wie die erste und zweite DNA-Polymerase ist, wobei ein dritter komplementärer DNA-Abschnitt hergestellt wird, der einen 3'-terminalen Unterabschnitt der Formel IX umfaßt
5'-(Promotor)&sub3;-(variabler Unterabschnitt)&sub3;-(dritter Unterabschnitt)t1-(zweiter Unterabschnitt)t-(erster Unterabschnitt)t1- (erster Unterabschnitt)t2-(variabler Unterabschnitt)1c-3'
IX
wobei (variabler Unterabschnitt)1c die DNA mit der zu (variabler Unterabschnitt)&sub1; komplementären Sequenz ist,
(9) Überführen des in der Reaktion von Schritt (8) gebildeten Doppelstrangs in Einzelstränge,
(10) Hybridisieren der in der Reaktion von Schritt (8) gebildeten komplementären DNA mit einem vierten Primer der Formel X
5'-(variabler Unterabschnitt)&sub4;-(5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4;
X
wobei (variabler Unterabschnitt)&sub4; ein Abschnitt von 0 bis 100 Nucleotiden ist und (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4; ein Unterabschnitt bekannter Sequenz ist, der an das 3'-Nucleotid von (variabler Unterabschnitt)&sub4; angrenzt, falls (variabler Unterabschnitt)&sub4; mehr als 0 Nucleotide hat, und der mindestens 10 Nucleotide des Abschnitts der Formel XX umfaßt
5'-(variabler Unterabschnitt)1-(erster Unterabschnitt)t2c-(erster Unterabschnitt)t1c-3'
XX
wobei (erster Unterabschnitt)t2c der DNA-Abschnitt mit der zu (erster Unterabschnitt)t2 komplementären Sequenz ist und (erster Unterabschnitt)t1c der DNA-Abschnitt mit der zu (erster Unterabschnitt)t1 komplementären Sequenz ist, vorausgesetzt, daß mindestens eines der mindestens 10 Nucleotide bei oder 5' vom 5'-terminalen Nucleotid von (erster Unterabschnitt)t1c ist,
(11) Extendieren des gemäß Schritt (10) hybridisierten vierten Primers in einer von einer vierten DNA-Polymerase katalysierten Reaktion, die gleich oder unterschiedlich wie die erste, zweite und dritte DNA-Polymerase ist, wobei ein vierter komplementärer DNA Strang hergestellt wird, der einen Abschnitt der Formel XI umfaßt
5'-(erster Unterabschnitt)t1c(zweiter Unterabschnitt)tc-(dritter Unterabschnitt)t1c-(variabler Unterabschnitt)3c-(Promotor)3c-3'
XI
wobei (zweiter Unterabschnitt)tc der DNA-Abschnitt mit der zu (zweiter Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, (dritter Unterabschnitt)t1c der DNA-Abschnitt mit der zu (dritter Unterabschnitt)t1 komplementären Sequenz ist (variabler Unterabschnitt)3c der DNA-Abschnitt mit der zu (variabler Unterabschnitt)&sub3; komplementären Sequenz ist und (Promotor)3c der DNA-Abschnitt mit der zu (Promotor)&sub3; komplementären Sequenz ist, und
(12) Verwenden des doppelsträngigen Produkts aus Schritt (11) als Matrize in einer Reaktion, die durch eine zweite DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase katalysiert wird, die gleich oder unterschiedlich der ersten DNA-abhängigen Bakteriophagen-RNA-Polymerase ist und die den Promotor, dessen einer Strang (Promotor)&sub3; ist, erkennt, wobei ein zweites RNA-Produkt mit einem 5'-terminalen Unterabschnitt der Formel XII hergestellt wird
5'-(variabler Unterabschnitt)3r-(dritter Unterabschnitt)t1r- (zweiter Unterabschnitt)tr-(erster Unterabschnitt)t1r-X&sub1;&sub2;- (variabler Unterabschnitt)4cr-3'
XII
wobei (variabler Unterabschnitt)3r der RNA-Abschnitt mit der Sequenz von (variabler Unterabschnitt)&sub3; ist, (dritter Unterabschnitt)t1r der RNA-Abschnitt mit der Sequenz von (dritter Unterabschnitt)t1 ist, (zweiter Unterabschnitt)tr der RNA-Abschnitt mit der Sequenz von (zweiter Unterabschnitt)t ist, (erster Unterabschnitt)t1r der RNA-Abschnitt mit der Sequenz von (erster Unterabschnitt)t1 ist, (variabler Unterabschnitt)4cr der RNA-Abschnitt mit der zu (variabler Unterabschnitt)&sub4; komplementären Sequenz ist und X&sub1;&sub2; der RNA-Abschnitt mit der zum Unterabschnitt von (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4; komplementären Sequenz ist, d. h. der 5' vom 5'-Ende von (erster Unterabschnitt)t1c.
Wie oben erwähnt betrifft die Erfindung auch Kits zur Ausführung der erfindungsgemäßen Amplifizierungsverfahren. Im Fall des erfindungsgemäßen Verfahrens, das die Herstellung eines ersten RNA Produkts betrifft, würde ein erfindungsgemäßer Kit die zwei Primer, die entsprechende Bakteriophagen DNA-abhängige RNA Polymerase und die DNA Polymerase umfassen. Ein Kit zur Ausführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, das die Herstellung sowohl eines ersten als auch eines zweiten RNA Produkts betrifft, würde vier geeignete Primer (zwei Sätze zu je zwei) mit den entsprechenden notwendigen Polymerasen umfassen.
Erfindungsgemäße Verfahren und Kits zur Ausführung von Nucleinsäurehybridisierungssondenassays, die die Amplifizierung eines erfindungsgemäßen Zielabschnitts betreffen, betreffen zusätzlich zu den jeweiligen Schritten und Komponenten der Verfahren und Kits zur Amplifizierung, Schritte und Komponenten, die zur Detektion des aus der erfindungsgemäßen Amplifizierung resultierenden RNA Produkts. Der Fachmann versteht die jeweiligen verschiedenen zusätzlichen Schritte und Komponenten, die zur Detektion von RNA aus einem Amplifizierungsverfahren durch eines der mehreren im Fachgebiet bekannten Nucleinsäuresondenhybridisierungsassayverfahren erforderlich sind. Ein bevorzugtes Nucleinsäuresondenhybridisierungsassayverfahren, das das Einfangen von Kügelchen mit markierter RNA Amplifizierung beinhaltet, ist im späteren Beispiel II erläutert.
Es ist bevorzugt, daß der (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1;, (5'- Primer-Unterabschnitt)&sub2;, (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; und (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4; zwischen 20 und 40 Nucleotide aufweisen, und insbesondere etwa 30 Nucleotide, um die Spezifität zu erhöhen, mit der die verschiedenen Primer an die Enden der Zielabschnitte binden, die amplifiziert werden sollen.
Es ist ebenfalls bevorzugt, daß der Zielabschnitt einer interessierenden Nucleinsäure, die zur Amplifizierung ausgewählt wird durch die Auswahl von (erster Unterabschnitt)t und (dritter Unterabschnitt)t so ausgewählt wird, daß der (zweite Unterabschnitt)tr mindestens 30 und insbesondere mindestens 50 Nucleotide aufweist. Dies erlaubt die Verwendung von (zweiter Unterabschnitt)tcr oder (zweiter Unterabschnitt)tr im amplifizierten RNA Produkt als Ziele für die Nucleinsäuresonden, die keine Sequenzen aufweisen, mit denen die Primerunterabschnitte überlappen.
Während die Bakteriophagen DNA-abhängige RNA Polymerase mehr als 1000 bp lange Matrizen verwenden kann, nimmt ihre Transkriptionseffizienz ab, wenn die Matrizen länger werden. Daher sind Zielabschnitte bevorzugt, die kleiner als 1000 Basen sind.
Es ist bevorzugt, einen identischen Primersatz zu dem bei der RNA Synthese verwendeten zur Herstellung von RNA in einem zweiten TAS Zyklus zu verwenden. Wie in dem Abschnitt erwähnt wurde, der die Herstellung von RNA beschreibt, sollte das Primerpaar nicht überlappen. Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der die Bildung von RNA gewünscht wird, ist es möglich, daß der Unterabschnitt des Zielabschnitts mit der zu der von (5'-Primer-Unterabschnitt) komplementären Sequenz in 5'-Richtung von und nicht überlappend mit dem Unterabschnitt des Zielabschnitts mit der zu (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; komplementären Sequenz liegt. Ähnlich ist es bevorzugt, daß der Unterabschnitt des Zielabschnitts mit derselben Sequenz wie die von (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; in 3'-Richtung von und nicht überlappend mit dem Unterabschnitt des Zielabschnitts mit derselben Sequenz wie der von (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub2; liegt. Diese Strategie ist bevorzugt, da sie die Konkurrenz der unterschiedlichen Primer für dieselben Stellen reduziert und dabei die Effizienz der erfindungsgemäßen Amplifizierung deutlich steigert. Wenn eine Überlappung zwischen genesteten Primersätzen besteht, ist es bevorzugt, jeden nicht verwendeten ersten Primersatz zu entfernen, bevor man den zweiten Satz verwendet.
Die vorliegende Erfindung konzentriert sich aufgrund ihrer hohen Spezifität für bestimmte Promotoren auf die Bakteriophagen DNA-abhängige RNA Polymerase. Andere Polymerasen, die eine ähnlich hohe Spezifität für bestimmte Promotoren aufweisen, könnten erfindungsgemäß anstelle der Bakteriophagenpolymerase verwendet werden und die Erfindung umfaßt auch solche anderen Polymerasen.
Die bevorzugten Bakteriophagen DNA-abhängigen RNA Polymerasen sind die von T7, T3 und SP6. Bevorzugte Promotoren, die mit diesen Polymerasen verwendet werden, sind in den Beispielen und Ansprüchen beschrieben, aber es sind viele andere Promotoren für diese Polymerasen im Fachgebiet bekannt und können ebenfalls verwendet werden.
Ferner können Polymerasen von anderen Bakteriophagen, als den drei bevorzugten, und Polymerasen, die von solchen anderen Polymerasen erkannt werden, erfindungsgemäß verwendet werden.
Es ist bevorzugt, in den erfindungsgemäßen Verfahren reverse Transkriptasen und DNA Polymerasen als DNA Polymerasen zu verwenden, denen eine 5' nach 3' Exonucleaseaktivität fehlt. Es ist am meisten bevorzugt, daß eine einzige DNA Polymerase für alle Schritte in den Verfahren verwendet wird. Am meisten sind von den DNA Polymerasen die AMV reverse Transkriptase und die rekombinante MMLV reverse Transkriptase bevorzugt. Andere Polymerasen sind jedoch auch annehmbar, wie die hitzestabile DNA Polymerase von Thermus aquaticus (siehe Chien et al., J. Bacteriol. 127, 1550 (1976)), die rekombinante T7 DNA Polymerase von der U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio, USA mit dem Handelsnamen Sequenase®, und das gut bekannte Klenowfragment der E. coli DNA Polymerase I und die DNA Polymerase alpha aus dem Kalbsthymus.
Die "variablen Unterabschnitte", die wahlweise in den verschiedenen Primern enthalten sind, haben drei Funktionen. Tatsächlich sollten sie passender "Mehrfachfunktionsunterabschnitte" genannt werden. Zuerst enthalten bei den ersten und dritten Primern, die Promotoren beinhalten, die Promotorunterabschnitte vorzugsweise Transkriptionsinitiationssequenzen, die von der RNA Polymerase bevorzugt werden, die dem Promotor entspricht. Zweitens kann für alle Primer ein variabler Unterabschnitt wahlweise ein bestimmtes Segment enthalten, wodurch das durch die Amplifizierung gebildete RNA Produkt in einem Nucleinsäuresondenhybridisierungsassay detektiert werden kann. Tatsächlich kann die Amplifizierung (und der Assay) für mehrere unterschiedliche Zielabschnitte gleichzeitig durch Verwendung von Primersätzen auftreten, die sich in ihren Erkennungsabschnitten unterscheiden (beispielsweise (3'- Primer-Unterabschnitt)&sub1;), aber einen gemeinsamen variablen Unterabschnitt beinhalten. Der variable Unterabschnitt kann auch eine Polylinkersequenz enthalten, die bequemerweise eine Vielzahl an Restriktionsstellen zur Erleichterung der anschließenden Klonierung enthält. Schließlich können die variablen Unterabschnitte zum Einbau von Sequenzen in das RNA Produkt aus der Amplifizierung verwendet werden, die es dem RNA Produkt ermöglichen, (autokatalytisch) von einer Bakteriophagen RNA-spezifischen RNA Polymerase repliziert zu werden, wie der Qβ Replikase, siehe Miele et al., obige Literaturstelle, und BMV Sequenzen vom RNA-3 Chromosom des Pflanzenvirus, die die Synthese von Hüll-mRNA veranlassen. Siehe Ahlquist et al., J. Mol. Biol. 172, 369 (1984), Anlquist et al., Plant Mol. Biol. 3, 37 (1984), Ahlquist et al., J. Mol. Biol. 153, 23 (1981), Miller et al., Nature 313, 68 (1985), Miller et al., Virology 125, 236 (1983) und Ou et al., PNAS 79, 5235 (1982).
Im Fall der Qβ Replikase, die im Fachgebiet bekannt ist, wird dies vorzugsweise ausgeführt durch Einbau der Sequenz
5,-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' in (variabler Unterabschnitt)&sub2; und der Sequenz
5'-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' in (variabler Unterabschnitt)&sub1; und dann durch (autokatalytische) Replikation des ersten RNA Produkts (das heißt RNA I in Fig. 1, siehe auch Fig. 4), oder Einbau der Sequenz
5'-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' in (variabler Unterabschnitt)&sub4; und der Sequenz
5'-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' in (variabler Unterabschnitt)&sub3; und dann (autokatalytische) Replikation des zweiten RNA Produkts (das heißt RNA II in Fig. 1, siehe auch Fig. 4).
Im Fall der Verwendung der ebenfalls bekannten BMV Replikase wird dies vorzugsweise ausgeführt durch Einbau der folgenden Sequenz für BMV in die variable Sequenz 2 (Basen 1-25) (bei der spezifischen Verwendung des späteren HIV Beispiels):
BMV Promotor TCS = 87-29 (HIV-spezifisch)
(54 Basen) als Kernsequenz, wobei zusätzlich AU reiche Sequenzen 5' hiervon verwendet werden können, um die Replikaseaktivität von BMV zu fördern. Dieses Oligo wird als zweiter Primer verwendet. Der erste Primer, der mit diesem zweiten Primer verwendet wird, ist ein T7-basierender, HIV-spezifischer Primer.
T7 Promotor TCS = 87-34
(52 Basen).
Zusätzlich werden zum leichteren Verständnis der Erfindung nicht-beschränkende Details in den folgenden Beispielen bereitgestellt.

4. Beispiele

BEISPIEL I

10 ml Blut von einem Patienten, der mit einem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) infiziert sein dürfte, wird mit einem Sepracell® Gerät (Sepratech Corp., Oklahoma City, Oklahoma, USA) oder alternativ dazu mit einem Ficollgradienten fraktioniert, um die Lymphozyten zu isolieren. Die Lymphozyten werden dann lysiert und die Nucleinsäure wird aus ihnen mit einem Extraktionsgerät (Molecular Biosystems, Inc. San Diego, California, USA) isoliert, oder die Lymphozyten werden alternativ dazu durch die Standardbehandlung mit Natriumdodecylsulfat (SDS)-Enzym lysiert und die Nucleinsäure wird durch Umkehrphasenchromatographie über DEAE Cellulose isoliert. Dies wird folgendermaßen durchgeführt:
Herunterzentrifugieren der Zellen: 5 000 U/min für 4 min aus 1 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), pH 7,5.
Abziehen des Überstands.
Resuspendieren des Pellets in:
500 ul 0,3 M NaCl/20 mM Tris pH 7,5 Gut Mischen und
100 ul 2% SDS dann zum Pellet
200 ul 5 mg/ml Proteinase K geben.
200 ul 0,25 M EDTA
Stark vortexen und bei 50ºC für 45 min inkubieren, für 10-15 Sekunden alle 10 min vortexen.
Auf eine trockene Extraktionssäule auftragen und einziehen lassen. Waschen der Säule mit 1 · 4 ml 0,3 M NaCl/20 mM Tris, pH 7,5 Eluieren der DNA/RNA mit 4 ml 0,5 M NaCl/20 mM Tris pH 7,5.
Zugabe zum Eluat: 5 ul Glykogen
400 ul 3 M NaOAc
9,0 ml eiskaltes EtOH gut mischen
Fällen bei -20ºC über Nacht. Es kann ein Trockeneis/Ethanol-Bad für eine Stunde verwendet werden.
Herunterzentrifugieren der DNA/RNA für 15 min bei 10 000 U/min in einem Rotor mit ausschwenkenden Einsätzen, Abgießen des EtOH und Trockenlaufenlassen auf einem Papiertuch für 2 min.
Lyophilisieren für 10 min.
Resuspendieren des Pellets in 170 ul TE.
Inkubieren bei 37ºC für 5 min.
Packen einer 1 ml Zentrifugationssäule wie folgt:
Verstopfen einer 1 ml Spritze mit einer kleinen Menge Glaswolle (autoklaviert).
Füllen der Spritze mit TE (Tris-EDTA), der mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt ist.
Schnelles Zugeben von Sephadex G-50 fine (in TE, autoklaviert).
Fortsetzen der Zugabe, bis die feste Matrix sich am Rand der Spritze abkugelt.
Zentrifugieren für 30 Sekunden bei 1 000 U/min in einer IEC Tischzentrifuge.
Waschen mit 100 ul TE, Zentrifugieren bei mittlerer Geschwindigkeit (etwa 1 000 U/min). Verwerfen der Waschlösung. Beladen der Säule mit dem Extrakt. Erneutes Zentrifugieren für 1 min.
Waschen mit 150 ul TE, Zentrifugieren bei 1 000 U/min für 1 min. Vereinigen der Waschlösung und der ersten Fraktion. Die Proben können bei diesem Schritt für mehrere Reaktionen aufgeteilt werden.
Zugabe von 1/10 Volumen 8 M LiCl. Gutes Mischen mit 2,5 Volumina 100% EtOH. Gutes Vortexen. Trockeneis/EtOH für 30 min. Herunterzentrifugieren für 15 min mit maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei 4ºC.

Trocknen des Pellets

Nach der Isolierung wird die gesamte Nucleinsäure aus der Probe in 100 ul TE Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) gelöst. 10 ul von den 100 ul Gesamtnucleinsäure werden auf ein Endvolumen von 100 ul verdünnt, worin enthalten sind:
40 mM Tris-HCl, pH 8
25 mM NaCl
10 mM MgCl&sub2;
10 mM Dithiotreit (DTT)
2 mM Spermidin
100 ug/ml Rinderserumalbumin
400 mM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP
30 nM der 101 Basen langen einzelsträngigen DNA mit der Sequenz 5'-GAACGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC ACATACGATT TAGGTGACAC TATA GAATAC TTTCGTAACA CTAGGCAAAG GTGGCTTTAT C-3', Primer A, wird zugegeben. 30 nM der 29 Basen langen DNA Sequenz 5'- ACACCATATG TATGTTTCAG GGAAAGCTA-3', Primer B, werden zugegeben. Der Primer B, der der zweite Primer ist, hat die Sequenz der Basen 5151-5179 des SOR Gens von MIV-1. Ein alternativer Abschnitt für den zweiten Primer entspricht den Basen 5357-5387 des SOR Gens von MIV-1, hat die Sequenz 5'-GCACACAAGT AGACCCTGAA CTAGCAGACC A-3' und ist, falls er verwendet wird, ebenfalls mit 30 nM enthalten. Der Primer A ist der erste Primer und seine 64 5'-Nucleotide bilden den Plus-Strang eines Promotors für die SP6 DNA-abhängige RNA Polymerase. Sein Abschnitt der Sequenz 5'-GAATAC-3' ist (alternativer Unterabschnitt)&sub1;, die die Transkriptionsstartstelle (das 5'-G) und andere Basen beinhaltet, die scheinbar von der SP6 RNA Polymerase am 5'-Ende von Sequenzen bevorzugt werden, die durch sie transkribiert werden. Schließlich bilden die 3'-terminalen 31 Nucleotide den (Primer-Unterabschnitt)&sub1; und haben eine Sequenz, die zu der der Basen 5577-5547 im SOR Gen eines MIV-1 Isolats komplementär ist (siehe Ratner et al., Nature 313, 277 (1985) für die vollständige Sequenz). (Das MIV Isolat wird in diesen Beispielen als "das MIV-1" bezeichnet).
Es sei erwähnt, daß alle in diesen Beispielen verwendeten Oligonucleotide durch Festphasensynthese auf einem automatisierten Synthesegerät (Modell Nr. 380A) von Applied Biosytems, Inc (Foster City, California, USA) hergestellt werden und im wesentlichen durch MPLC mittels einer C8 Umkehrphasensäule chromatographisch zur Momogenität gereinigt werden. Alternativ dazu könnten andere im Mandel erhältliche Synthesegeräte und Standardreinigungsverfahren zur Herstellung der Oligonucleotide verwendet werden.
Die 100 ul Lösung werden auf 65ºC für 2 Minuten aufgeheizt und dann während einer Minute auf 42ºC abgekühlt. Dieses Aufheizen und die anschließende Maltetemperatur bei 42ºC oder darüber sorgt zusammen mit der Zusammensetzung der Lösung für Bedingungen, die ausreichend stringent sind, um die Hybridisierung des (3'-Primer- Unterabschnitt)&sub1; mit hoher Spezifität an die komplementäre Sequenz zu der von (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; mit ausreichender Stabilität zur Vorbereitung der DNA Synthese bereitzustellen.
Dann werden 10 Einheiten der reversen Transkriptase des Vogelmyblastosevirus (AMV) oder 500 Einheiten der rekombinanten reversen Transkriptase des Moloney-Mausleukämievirus (MMLV), wie sie von Life Sciences, Inc. St. Petersburg, Florida, USA bezogen werden, zur Lösung gegeben und die Lösung wird für 10 Minuten bei 42ºC inkubiert. (Eine Einheit baut 1 nmol TTP in eine säurepräzipitierbare Form in 10 Minuten bei 37ºC mittels Poly(A)- Oligo(T)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Matrizenprimer ein, wie dies von Houts et al., J. Virol. 29, 517 (1979)) definiert wurde. Nach einer zehnminütigen Inkubation wird die Lösung für 1 Minute in ein kochendes Wasserbad gestellt. Dieses Aufheizen verursacht die Strangtrennung des durch die reverse Transkriptase gebildeten Doppelstrangs.
Dann wird die Lösung während einer Minute auf 42ºC gekühlt. Während diesem Kühlen hybridisiert der zweite Primer an den 3'- terminalen Abschnitt des komplementären Zielabschnitts, der in der durch die reverse Transkriptase katalysierten Reaktion gebildet wurde. Erneut sind die Hybridisierungsbedingungen für eine ausreichend spezifische Hybridisierung zwischen dem zweiten Primer und der zu diesem Primer komplementären Sequenz ausreichend stringent.
Nach dem Abkühlen werden 10 zusätzliche Einheiten reverse AMV Transkriptase oder 500 zusätzliche Einheiten klonierter reverser MMLV Transkriptase zugegeben und es wird eine weitere Inkubation für 10 Minuten bei 42ºC durchgeführt.
Dann wird der Ribunucleaseinhibitor mit dem Handelsnamen RNAsin® von Promega Biotech, Madison, Wisconsin, USA (wahlweise) in einer Konzentration von 1 Einheit pro ml zugegeben. (1 Einheit ist die Inhibitormenge, die für 50% Hemmung der Aktivität von 5 ng Ribonuclease A erforderlich ist. Roth, Meth. Cancer Res. 3, 151 (1976)). Ferner werden jedes der Ribonucleosid-5'-triphosphate, ATP, GTP, CTP und UTP in 400 mM zugegeben. Schließlich werden zwischen 10 und 20 Einheiten SP6 DNA-abhängige RNA Polymerase zugegeben, die von Promega Biotech bezogen wird, und die entstehende Lösung wird bei 42ºC für 30 bis 60 Minuten inkubiert. (1 Einheit ist die Menge an RNA Polymerase, die zur Katalyse des Einbaus von 1 nmol Ribonucleosidtriphospaht in ein säureunlösliches Produkt in 60 Minuten bei 37ºC unter Standardreaktionsbedingungen erforderlich ist (40 mM Tris-HCl, pH 7,9, 6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM Spermidin, 0,5 mM jeweils von ATP, GTP, CTP und UTP, 0,5 Ci ³H- CTP, 1 g SP6 DNA und das Enzym in einem Gesamtvolumen von 50 ul)).
Dann wird jedes der folgenden Oligonucleotide bis zu einer Konzentration von 30 nM zugegeben:
Dritter Primer:
5'-GAACGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC ACATACGATT TAGGTGA- CAC TATA GAATAC ACTAATTCAT CTGTATTACT TTGACTGTTT TTC-3'
Vierter Primer:
5' -TTTTTTGGTG TTATTAATGC TGCTAGTGCC-3'
Im dritten Primer, wie auch im ersten, sind die 5'-terminalen 64 Basen der Promotorabschnitt und die nächsten 6 Basen sind der variable Abschnitt. Der variable Abschnitt sind die ersten sechs Basen, die vom Promotor durch die SP6 RNA Polymerase transkribiert werden, und diese Basen werden ausgewählt, um die Stärke einer solchen Transkription zu steigern. Schließlich besteht der (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; Teil des dritten Primers aus den 3'- terminalen 33 Basen mit derselben Sequenz, wie die Basen 5388-5420 im Gen mit dem kurzen offenen Leserahmen (SOR) von HIV-1. Der vierte Primer hat die Sequenz, die komplementär zu den Basen 5546- 5517 des SOR Gens von HIV-1 ist.
Nach Zugabe der dritten und vierten Primer wird die Reaktion bei 42ºC für 1 Minute inkubiert. Während dieser Zeispanne tritt die Hybridisierung zwischen (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; des dritten Primers und der ersten RNA auf, die in der durch die SP6 RNA Polymerase katalysierten Reaktion gebildet wurde. Aufgrund der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen hybridisiert der (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; mit einer ausreichenden Stabilität, die zur Vorbereitung der DNA Synthese ausreicht, und mit einer hohen Spezifität an den Abschnitt mit komplementärer Sequenz in der ersten RNA.
Nach der Inkubation werden 10 Einheiten der AMV reversen Transkriptase oder 500 Einheiten der klonierten MMLV reversen Transkriptase zugegeben und die Lösung wird für 10 Minuten bei 42ºC unter Bildung der dritten komplementären DNA inkubiert.
Die Lösung wird dann in einem kochenden Wasserbad für 1 Minute inkubiert und während einer Minute auf 42ºC abgekühlt, um erstens den Doppelstrang zwischen der dritten komplementären DNA und der ersten RNA in Einzelstränge zu überführen, und zweitens die Hybridisierung zwischen dem vierten Primer und der dritten komplementären DNA zu erlauben. Wie bei den anderen Hybridisierungen sind die Bedingungen ausreichend stringent, so daß die Hybridisierung des vierten Primers mit einer hohen Spezifität an den Abschnitt der dritten komplementären DNA an eine Sequenz eintreten kann, die zu der des vierten Primers komplementär ist, mit einer zur Vorbereitung der DNA Synthese ausreichenden Stabilität.
Dann werden erneut 10 Einheiten AMV reverse Transkriptase oder 500 Einheiten klonierte MMLV reverse Transkriptase zugegeben und die Lösung wird für 10 Minuten bei 42ºC inkubiert.
Dann wird der Ribunucleaseinhibitor mit dem Handelsnamen RNASin® (wahlweise) in einer Konzentration von 1 Einheit pro ml, gefolgt von 10-20 Einheiten SP6 RNA Polymerase zugegeben, und die Lösung wird für 30 Minuten bis 1 Stunde bei 42ºC inkubiert.
Die entstehende zweite RNA kann dann durch eine Nucleinsäuresondenhybridisierungstechnik detektiert werden.

BEISPIEL II

Das Verfahren von Beispiel I wird mit einer unten erwähnten Modifizierung mit drei Proben befolgt: (A) eine von 10 ml Humanblut, das bekanntermaßen HIV frei ist, (B) eine von 10 ml Kultur, die bekanntermaßen 103 HIV-1 infizierte Zellen pro ml enthält, und (C) eine von 10 ml Blut von einer Person, die mit HIV-1 infiziert sein dürfte. Die Modifizierung des Verfahrens besteht darin, daß ein alpha-³²P-markiertes Ribonucleosidtriphosphat als Substrat in die Reaktion miteinbezogen wird, die von der SP6 RNA Polymerase unter Bildung der zweiten RNA katalysiert wird. Die zweite RNA ist daher ³²P-markiert.
Sephacryl-S500R großporige Kügelchen werden mit einem Linker mit terminaler Carboxylgruppe derivatisiert (der Formel -C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub5;CO&sub2;-) und dann mit dem 5'-(6-Aminohexylphosphoramidat)-derivatisierten Oligonucleotid der Sequenz 5'-TGGTCTGCTA GTT- CAGGGTC TACTTGTGTG C-3' derivatisiert, das die zu der der Basen 5357-5387 im SOR Gen von HIV-1 komplementäre Sequenz ist. (Die Sequenz der Basen 4901-4932 des SOR Gens tritt in jeder zweiten RNA auf, die während der Amplifizierung von Nucleinsäure aus einer Probe gebildet wird.) Die Herstellung der Kügelchen erfolgte gemäß Verfahren, die in der herkömmlich erteilten amerikanischen Patentanmeldung mit der Nummer 895 756 vom 11. August 1986 beschrieben wurden und die hiermit eingeführt werden. Kurz gesagt sind die Trägermaterialien poröses Silicatglas oder großporiges quervernetztes Dextran, die mit einem Linker derivatisiert sind, der mit einer Aminogruppe endet, wobei im wesentlichen alle Aminogruppen, die nicht kovalent durch eine Phosphoramidatgruppe an das terminale Nucleosid der herausfischenden Sonde gebunden sind, vor der unspezifischen Wechselwirkung mit Nucleinsäure geblockt werden, die eine aliphatische Acylgruppe aufweist, großporiges quervernetztes Dextran, das mit Cyanogenbromid aktiviert ist, und mit Aminen unter Bindung an Aminoalkylphosphoramidat derivatisierte Oligonucleotide reagiert, und poröses Silicatglas, großporiges quervernetztes Dextran oder Divinylbenzol-quervernetztes Polystyrol, das mit einem Linker derivatisiert ist, der mit einem Carboxyl oder Succinimidester endet, und welches mit einer Amidbindung an eine Aminogruppe eines Diaminoalkan gebunden ist, wobei die andere Aminosäure hiervon Teil eines Phosphoramidats ist, das wiederum direkt an das terminale Nucleosid der herausfischenden Sonde gebunden ist. Bevorzugtes Trägermaterial ist Glas mit kontrollierter Porengröße, das mit langkettigem Alkylamin oder Carboxyl derivatisiert ist, wie es von Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA unter den jeweiligen Produktnummern 24875 und 23735 in Form von Kügelchen verkauft wird, die einen nominalen Porendurchmesser von 500 Angström und Partikeldurchmesser zwischen etwa 125 und 177 um aufweisen, und Sephacryl S-500, das von Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey, USA unter der Bestellnummer 17-0475- 01 in Form von Kügelchen mit einem Durchmesser in nassem Zustand von etwa 40 bis etwa 105 um und einem Ausschlußvolumen für Dextrane mit einem Molekulargewicht über etwa 2 · 10&sup7; Dalton, wobei dieses Sephacryl mit Cyanogenbromid oder mit einem Linker derivatisiert wird, der mit einer Amino- oder Carboxylgruppe endet. In einem Aspekt ist der feste Träger einer von:
(A) Porösem Silicatglas, das an den Siliconen derivatisiert ist mit:
(1) Gruppen der Formeln
-(CH&sub2;)n(NH) (CO) (CH&sub2;)cCH&sub3; und
- (CH&sub2;)n(NH) (PO&sub2;)O- (Oligo),
wobei im wesentlichen kein Silicon mit einer Gruppe derivatisiert ist, die mit einer Aminogruppe endet, worin c für 0 bis 5 steht, n für 2 bis 8 steht, -0-(Oligo) die Oligonucleotidsonde ist, und das an (Oligo) gebundene Sauerstoffatom die Oligonucleotidsonde ist, und das an (Oligo) gebundene Sauerstoffatom der 5'-Sauerstoff des 5'-Nucleosids oder der 3'-Sauerstoff des 3'-Nucleosids der Sonde ist, oder
(2) Gruppen der Formeln
-(CH&sub2;)n(NH) (CO) (CH&sub2;)mCO&sub2;H und
-(CH&sub2;)n(NH) (CO) (CH&sub2;)m(CO) (NH) (CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo)-
worin m, n und p gleich oder verschieden sind und jeweils für 2 bis 8 stehen, oder
(B) ein großporiges quervernetztes Dextranmaterial, das mit Hydroxylsauerstoffen derivatisiert ist, die sich auf Kohlenstoffen der Zuckerreste befinden, die zumindest ein benachbartes Kohlenstoffatom mit einem underivatisierten Hydroxyl aufweisen, mit
(1) Gruppen der Formeln
-C(=NH)NH(CH&sub2;)q(NH) (CO) (CH&sub2;)cCH&sub3; und
-C(=NH)NH(CH&sub2;)p(NH) (PO&sub2;)O-(Oligo),
im wesentlichen ohne Hydroxylsauerstoff, der mit einer Gruppe derivatisiert ist, welche mit einer Aminogruppe endet, oder
(2) Gruppen der Formeln
-C(=NH)NH(CH&sub2;)qCO&sub2;H und
-C(=NH)NH(CH&sub2;)q(CO) (NH) (CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
worin c, q und p gleich oder verschieden sind und q für 2 bis 10 steht, und
(C) Divinylbenzol-quervernetztes Polystyrol, das an den Phenylgruppen mit Gruppen folgender Formeln derivatisiert ist
-(CH&sub2;)&sub5;CO&sub2;H und
-(CH&sub2;)&sub5;(CO) (NH) (CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
worin s und p gleich oder verschieden sind und s für 2 bis 10 steht. Siehe Ghosh et al., Nucleic Acids Research 15, 5353 (1987).
Jeder der drei Ansätze mit 50 mg Sephacrylkügelchen, die wie oben beschrieben derivatisiert sind, saugen sich für 15 Minuten bei 37ºC in 250 ul einer Prähybridisierungslösung voll, die 0,1% SDS, 10% Dextransulfat, 1 mg/ml Lachsspermien-DNA und 5 · SSPE (0,75 M NaCl, 50 mM NaH&sub2;PO&sub4; pH 7,4 und 5 mM EDTA) enthält. Nach dem Vollsaugen wird das Kügelchenmaterial durch Zentrifugation pelletiert und die Prähybridisierungslösung wird durch Absaugen entfernt.
Die Nucleinsäure aus dem Amplifizierungsverfahren wird aus jeder der drei Proben durch Ethanolfällung isoliert und dann in 250 ul Lösung gelöst, die dieselbe ist, wie die Prähybrisierungslösung, der aber die Lachspermien-DNA fehlt. Jede der entstehenden Nucleinsäurelösungen wird dann mit einem Ansatz der prähybridisierten Oligonucleotid-derivatisierten Sephacrylkügelchen vereinigt und das entstehende Gemisch wird unter langsamem Schütteln bei 42ºC für 90 Minuten inkubiert.
Die Sephacrylkügelchen werden dann durch Zentrifugation pelletiert, die Hybridisierungslösung wird durch Absaugen entfernt und die Kügelchen werden dann dreimal jeweils für 10 Minuten bei 37ºC in 1 ml einer 2 · SSC Lösung (0,30 M NaCl, 0,03 M Na-Citrat pH 7,0) gewaschen. Nach jedem Waschschritt werden die Kügelchen durch Zentrifugation pelletiert und die Lösung wird durch Absaugen entfernt.
Unmittelbar nach dem dritten Waschschritt werden die Kügelchen einer Cerenkov-Zählung unterzogen.
Die Kügelchen mit der amplifizierten Nucleinsäure aus Probe A liefern eine niedrige Zählrate, die nur wenig über der Hintergrundzählrate der Scintillationsflüssigkeit alleine liegt. Die Kügelchen mit der amplifizierten Nucleinsäure aus Probe B liefern eine viel höhere Zählrate als die, die zusammen mit der Probe A beobachtet wird. Die Kügelchen mit der amplifizierten Nucleinsäure von Probe C zeigen, wenn sie eine Zählrate erzeugen, die signifikant über der Zählrate liegt, die zusammen mit der Probe A gebildet wird, daß die Person, deren Blut für die Probe C entnommen wurde, mit HIV-1 infiziert ist.

BEISPIEL III

Die Verfahren der Beispiele I und II werden mit T7 RNA Polymerase (Promega Biotech) anstelle der SP6 RNA Polymerase ausgeführt, wobei jeder Unterabschnitt 5'-(Promotor)&sub1;-(variabler Unterabschnitt)&sub1;-3' des ersten Primers und der Unterabschnitt 5'- (Promotor)&sub3;-(variabler Unterabschnitt)&sub3;-3' des dritten Primers die Sequenz 5'-TAATACGACT CACTATA GGGA-3' aufweisen, worin die 17 5'- terminalen Basen der Promotorunterabschnitt sind und die 4 3'-terminalen Basen der variable Unterabschnitt sind. Der variable Unterabschnitt entspricht den 4 5'-terminalen Basen des Transkripts vom Promotor. In diesem Verfahren wird bei keinem Schritt ein Ribonucleaseinhibitor verwendet, zumindest nur der aus der Polymerasepräparation von Promega Biotech.

BEISPIEL IV

Die Verfahren der Beispiele I und II werden durchgeführt mit T3 RNA Polymerase (von Stratagene, San Diego, California) anstelle der SP6 RNA Polymerase und mit dem folgenden Abschnitt als (Promotor)&sub1;-(variabler Unterabschnitt)&sub1; Unterabschnitt des ersten Primers und (Promotor)&sub3;-(variabler Unterabschnitt)&sub3; Unterabschnitt des dritten Primers: 5'-TATTAACCCT CACTAAA GGGA-3', wobei die 17 5'-terminalen Basen der Promotorabschnitt sind und die 4 3'-terminalen Basen der variable Abschnitt sind, einschließlich der 5'- terminalen 4 Basen in Transkripten vom Promotor.

BEISPIEL V

Unter Verwendung der T7 RNA Polymerase wie in Beispiel III, wird der Zielabschnitt im Genom von HIV aus humanen Blutproben mittels der folgenden Primer anstelle der in Beispiel I beschriebenen Primer amplifiziert:
Erster Primer: 5'-TAATACGACT CACTATA GGGA TCTAATTACT ACCTCTTCTT CTGCTAGACT-3', worin die 30 3'-terminalen Basen in der Sequenz zu den Basen 7076-7047 des ENV Gens von HIV-1 komplementär sind.
Zweiter Primer: 5'-ACAAGTTGTA ACACCTCAGT CATTACACAG-3' mit der Basensequenz 6838-6866 im ENV Gen von HIV-1.
Dritter Primer: Dieselben 21 5'-terminalen Basen, wie im ersten Primer dieses Beispiels angrenzend an die folgenden 27 3'- terminalen Basen: 5'-AAAGGTATCC TTTGAGCCAA TTCCCATA-3', die die Sequenz der Basen 6875-6902 im ENV Gen von HIV-1 aufweisen.
Vierter Primer: 5'-AGTTGATACTACTGGCCTAATT-3' mit der komplementären Sequenz zu der der Basen 7033-7007 im ENV Gen von HIV-1.

BEISPIEL VI

Unter Verwendung der T7 RNA Polymerase wie in Beispiel III wird der Zielabschnitt im Genom von HIV aus humanen Blutproben mittels der folgenden Primer anstelle der in Beispiel I gezeigten Primer amplifiziert:
Erster Primer: Die gleichen 21 5'-terminalen Nucleotide, wie die ersten und dritten Primer von Beispiel V angrenzend an die folgenden 31 3'-terminalen Nucleotide: 5'-CACCTAGGGC TAACTATGTG TCCTAATAAG G-3', die die zu den Basen 5471-5441 des SOR Gens von HIV-1 komplementäre Sequenz aufweisen.
Zweiter Primer: 5'-ACACCATATG TATGTTTCAG GGAAAGCTA-3' mit derselben Sequenz, wie die Basen 5151-5179 des SOR Gens von HIV-1.
Dritter Primer: Dieselben 21 5'-terminalen Nucleotide, wie die ersten und dritten Primer von Beispiel V angrenzend an die folgenden 31 3'-terminalen Nucleotide:
5'-AAGAATAAGTTCAGAAGTACACATCCCACT-3', die dieselbe Sequenz wie die Basen 5220-5249 des SOR Gens von HIV aufweisen.
Viert er Primer: 5'-TGGTCTGCTAGTTCAGGGTCTACTTGTGTC-3', der die zu den Basen 5387-5357 im SOR Gen von HIV-1 komplementäre Sequenz aufweist.

BEISPIEL VII

Das Verfahren von Beispiel I wird befolgt zur Isolierung der Nucleinsäure von: 1) einer Probe, die 10³ HIV-infizierte CEM Zellen gemischt mit 10&sup6; nicht infizierten CEM Zellen (Cancer Center Research Foundation, CCRF-CEM, ATCC Nr. CCL 119) und 2) einer Probe, die 106 nicht infizierte CEM Zellen enthält. Diese Proben werden nach der Ethanolfällung in 100 ul 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA (TE) gelöst, um die aus der Extractor® Säule (MBI) erhaltenen Probe zu konzentrieren. Die resuspendierten Proben werden auf einer Sephadex G-50 fine Zentrifugationssäule (Maniatis, obige Literaturstelle) fraktioniert und mit TE eluiert. Die eluierten Proben werden durch Ethanolfällung konzentriert (in 0,8 M LiCl, 3 Volumina Ethanol, im Trockeneis/Ethanol-Bad für 15 Minuten). Die gefällte Probe wird durch Zentrifugation pelletiert. Das Pellet wird trockengelegt, getrocknet und dann in 100 ul resuspendiert, worin enthalten sind 40 mM Tris-HCl, pH 8,1, 8 mM MgCl&sub2;, 25 mM NaCl, 2 mM Spermidin, 5 mM Dithiotreit, jeweils 100 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, jeweils 1 mM rATP, rCTP, rGTP und rUTP, 100 ug/ml BSA (nucleasefrei) und jeweils 250 nM des DNA Oligonucleotidprimers A
(5'-TTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTCCTAATAAGG-3') und des Primers B (5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGGAAAGCTA-3').
Als Kontrollen werden zweifache Proben gereinigter HIV RNA in einer Konzentration von 0,01 fm in 100 ul des oben beschriebenen Puffers resuspendiert. Schließlich werden 10 fm β-Globinsequenz, die in Plasmid Hβ19A enthalten ist [Wallace et al., Nucl. Acids Res. 9, 3647 (1981)], welches durch HindIII linearisiert wurde, in 100 ul des oben beschriebenen Puffers ohne den Oligonucleotidprimern resuspendiert. Der Oligonucleotidprimer D (5'- ACATTGCTTCTGACACAACTGTGTTCA-3') und der Primer C (5'-TAATACGACT- CACTATAGGGACAAAGGACTCAAA-3'), die für die β-Globinsequenz spezifisch sind, werden dann zur β-Globinreaktion jeweils in 250 nM zugegeben.
Bis auf die β-Globinprobe werden die Reaktionen auf 65ºC für 1 min aufgeheizt. Die β-Globinprobe wird für 1 min gekocht. Alle Proben werden für 1 Minute auf 42ºC abgekühlt, und dann werden 10 Einheiten AMV reverse Transkriptase zugegeben. Die Reaktionen werden für 15 Minuten bei 42ºC inkubiert, für eine Minute gekocht und dann für eine Minute auf 42ºC abgekühlt. Zehn zusätzliche Einheiten AMV reverse Transkriptase werden zugegeben und es wird bei 42ºC für 15 Minuten inkubiert. Einhundert Einheiten T7 RNA Polymerase werden zu den Reaktionen gegeben und die Reaktionen werden bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert.
Die Proben werden für 1 Minute gekocht und auf 42ºC für 1 Minute abgekühlt, gefolgt von der Zugabe von 10 Einheiten AMV reverse Transkriptase. Die Reaktionen werden bei 42ºC für 15 Minuten inkubiert, für 1 Minute gekocht und auf 42ºC für 1 Minute abgekühlt. Weitere 10 Einheiten rerverse Transkriptase werden zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 42ºC für 15 Minuten. Einhundert Einheiten T7 RNA Polymerase werden bei einer 30 minütigen Inkubation bei 37ºC zugegeben. Dieser Zyklus wird weitere zwei Mal wiederholt.
Das amplifizierte Ziel wird dann mittels OligoBeads®, wie unten beschrieben, detektiert.
Es werden Sephacrylkügelchen wie oben beschrieben präpariert, die HIV-1 spezifische Oligonucleotide enthalten und in TE bei 4ºC in einer Konzentration so gelagert, daß 250 ul der Suspension 50 mg Sephacrylkügelchen enthalten. Die Oligonucleotide werden synthetisiert und wie beschrieben HPLC gereinigt.
Die Oligonucleotide, die sowohl für die Anlagerung an die Kügelchen als auch für die Detektion verwendet werden, sind zu der SOR Region des HIV-1 Genoms homolog. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Oligonucleotide waren 86-31 (Detektionsoligonucleotid) (5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3') und 87-83 (herausfischendes Oligonucleotid auf dem Kügelchen: 5'-ATGCTAGATTGGTAATAACAACATATT-3'), die zum Unsinnstrang der SOR Region homolog sind und durch etwa 100 Nucleotide getrennt sind. Zur Detektion wurden die Oligonucleotide gemäß einem Standardprotokoll an den Enden mit ³²P markiert. Die nicht eingebaute Markierung wurde durch Gelfiltration auf einer Sephadex G-50 fine Säule entfernt und das Oligonucleotid wurde bei -20ºC gelagert.
In einem typischen auf Kügelchen basierenden Sandwichhybridisierungssystemexperiment (BBSHS) werden das Ziel und das ³²P- markierte Detektionsoligonucleotid in 10 ul 0,2% SDS enthaltendem TE bei 65ºC für 5 Minuten in einem Eppendorfreaktionsgefäß denaturiert. Dazu werden 10 ul 2fach Hybridisierungsmischung (10fach SSPE/10% Dextransulfat) gegeben. Die Lösung wird gemischt, 2 Sekunden zentrifugiert und bei 42ºC für 1 Stunde inkubiert.
Während dieser Zeit werden die Sephacrylkügelchen prähybridisiert. Die Stammsuspension der Kügelchen wird gut gemischt und 250 ul Aliquots (50 mg Kügelchen) werden in Eppendorfreaktionsgefäßen unter Mischen zwischen jeder Entnahme zur Sicherstellung einer einheitlichen Suspension überführt. Die Aliquots werden dann für 10 Sekunden zentrifugiert und der TE wird mit einer ausgezogenen Pasteurpipette entfernt. Nachdem 250 ul Hybridisierungslösung (5fach SSPE [0,9 M NaCl, 50 mM NaH&sub2;PO&sub4; pH 7,4, 1 mM EDTA] 10% Dextransulfat/0,1% SDS) zugegeben wurden, werden die Kügelchen durch sanftes Schütteln suspendiert und bei 37ºC für 30-60 Minuten unter zeitweiligem Schütteln inkubiert. Unmittelbar vor dem Schritt des Herausfischens werden die Kügelchen für 10 Sekunden zentrifugiert, die Prähybridisierungslösung wird entfernt, 80 ul Hybridisierungslösung werden bei 37ºC zugegeben und die Kügelchen werden auf 37ºC zurückgestellt.
Die Lösungshybridisierung wird für 2 Sekunden zentrifugiert und zu den Kügelchen und zur Hybridisierungslösung überführt. Die Kügelchen werden suspendiert und bei 37ºC für 1 Stunde unter häufigem Schütteln unter Beibehaltung der Suspension inkubiert.
Nach dem Herausfischen werden die Kügelchen 10 Sekunden zentrifugiert und die Hybridisierungslösung, die nicht herausgefischtes Ziel und Detektionsoligonucleotid enthält, wird in ein Scintillationszählröhrchen überführt. Die Kügelchen werden dann fünfmal mit 2fach SSC bei 37ºC gewaschen. Die ersten 3 Waschschritte sind schnell, 1 ml Waschlösung wird zugegeben, die Kügelchen werden gut gemischt und 10 Sekunden zentrifugiert, und die Waschlösung wird in ein Zählröhrchen überführt. Für die letzten zwei Waschschritte wird 1 ml Waschlösung zugegeben und die Kügelchen werden gemischt und bei 37ºC für 5 Minuten vor dem Zentrifugieren inkubiert. Jede Waschlösung wird einzeln zur Verfolgung des Verfahrens ausgezählt.
Die Cerenkowzählraten der Hybridisierungslösung, der 5 Waschlösungen und der Kügelchen werden für 5-10 Minuten gemessen. Der Zählratenhintergrund wird von allen Proben abgezogen. Die fm an detektiertem Ziel werden folgendermaßen berechnet:
(CPM auf den Kügelchen/ Gesamt CPM) · fm Oligonucleotid wobei Gesamt CPM die Summe der CPM für die Hybridisierungslösung, die 5 Waschlösungen und die Kügelchen ist. DETEKTION VON AMPLIFIZIERTEN ZIELEN DURCH BBSHS Ziel verwendete ul (FM) Detektierte 10³ HIV infizierte Zellen 10&sup6; nicht infizierte Zellen 10&sup6; nicht infizierte CEM Zellen 0,01 fm HIV DNA 10 fm β-Globin DNA

BEISPIEL VIII

Das Verfahren von Beispiel I wird befolgt zur Isolierung von Nucleinsäuren aus zwei Proben: a) 10³ HIV-infizierte CEM Zellen mit 10&sup6; nicht infizierten CEM Zellen und b) 10&sup6; nicht infizierte kultivierte CEM Zellen, zu welchen 0,01 fmol gereinigter HIV nach der Extraktion gegeben werden. Das Verfahren wird dann nach dem Extraktionsschritt durch eine weitere Reinigung mittels einer Sephadex G-50 (fine) Zentrifugationssäule (Maniatis, obige Literaturstelle) modifiziert, wobei mit TE eluiert wird. Danach folgt eine Ethanolfällung der Nucleinsäure (in 0,8 M LiCl, 2,5 Volumina Ethanol). Die Nucleinsäure wird dann in 100 ml resuspendiert, worin enthalten sind:
40 mM Tris-HCl, pH 8,1
8 mM MgCl&sub2;
25 mM NaCl
2 mM Spermidin
5 mM DTT (Dithiotreit)
100 uM dATP, dTTP, dCTP und dGTP (jeweils)
1 mM rATP, rCTP, rGTP und rUTP
100 ug/ml BSA nucleasefrei
250 nM des 29 bp langen DNA Oligonucleotids mit der Sequenz 5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3' (Primer B)
250 nm des 56 bp langen DNA Oligonucleotids mit der Sequenz 5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG-3' (Primer A)
Die 100 ul Lösung werden auf 65ºC für 1 Minute aufgeheizt und dann während einer Minute auf 42ºC abgekühlt. Dieses Aufheizen und die anschließende Haltetemperatur von 42ºC oder darüber liefert zusammen mit der Zusammensetzung der Lösung Stringenzbedingungen, die für die Hybridisierung von (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1;, (siehe Fig. 1) mit ausreichender Stabilität an die komplementäre Sequenz von (3'-Primer Unterabschnitt)&sub1; in der Ziel HIV RNA mit hoher Spezifität ausreicht.
Dann werden 10 Einheiten Vogelmyoblastosevirus (AMV) reverse Transkriptase (Life Sciences, Inc.) zur Lösung gegeben und die Lösung wird für 10 Minuten bei 42ºC inkubiert. [Eine Einheit baut 1 nmol TTP in eine säurepräzipitierbare Form in 10 Minuten bei 37ºC mittels Poly(A)-Oligo (T) 12-18 als Matrizenprimer ein, wie dies von Houts et al., J. Virol. 29, 517 (1979) definiert ist]. Nach einer zehnminütigen Inkubation wird die Lösung für eine Minute in ein kochendes Wasserbad gestellt. Dieses Aufheizen verursacht die Strangtrennung des durch die reverse Transkriptase gebildeten Doppelstrangs und die Inaktivierung der reversen Transkriptase.
Dann wird die Lösung über eine Minute auf 42ºC abgekühlt. Während diesem Abkühlen hybridisiert der zweite Primer, Primer B, an das 3'-terminale Ende von (dritter Unterabschnitt)t2c, siehe Fig. 1, des komplementären Ziels des DNA Strangs, der in der durch die reverse Transkriptase katalysierten Reaktion im vorigen Schritt gebildet wurde. Erneut sind die Hybridisierungsbedingungen für die spezifische Hybridisierung zwischen dem zweiten Primer und der zum zweiten Primer komplementären Sequenz ausreichend stringent.
Nach dem Abkühlen werden 10 zusätzliche Einheiten AMV reverse Transkriptase zugegeben und es wird eine weitere Inkubation für 10 Minuten bei 42ºC durchgeführt.
Einhundert Einheiten T7 Polymerase werden zur Reaktion gegeben. Die Reaktion wird dann bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Es wird ein RNA Transkript synthetisiert, das komplementär ist zur ursprünglichen HIV Ziel RNA, ausgehend vom T7 Promotor, der am 5' Ende des neu durch die reverse Transkriptase synthetisierten DNA Zieldoppelstrangs vorkommt. Das Transkript hat die Sequenz 5'-GGGA und fährt mit einer Sequenz fort, die zum zweiten Unterabschnitt der Zielsequenz komplementär ist (das heißt dem zweiten Unterabschnitt tcr, siehe Fig. 1). Da die reverse Transkriptase vor diesem Schritt nicht inaktiviert wurde und da Primer B wie auch die Desoxynucleotidtriphosphate enthalten sind, findet bei diesem Schritt eine zweite Synthese statt. Der Primer B hybridisiert an die 3' Region des neu synthetisierten RNA Transkripts (dritter Unterabschnitt)t2cr, siehe Fig. 1, die zum Primer B komplementär ist. Die reverse Transkriptase (die beim vorherigen Schritt zugegeben wurde) synthetisiert unter Verwendung des neu synthetisierten RNA Transkripts (durch die T7 Polymerase hergestellt) als Matrize und unter Verwendung des Oligonucleotids B als Primer am 5'- Ende einen DNA Strang.
Die Reaktion wird dann für eine Minute gekocht, um den RNA:DNA Doppelstrang zu denaturieren. Die Reaktion wird dann während einer Minute auf 42ºC abgekühlt. Während dieses Abkühlungsschritts hybridisiert der komplementäre Zielabschnitt von Primer A an den während des vorangehenden Schritts synthetisierten DNA Strang. Zur selben Zeit hybridisiert Primer B an seine komplementäre Sequenz auf dem RNA Transkript, das im vorangehenden Schritt synthetisiert wurde.
Nach dem Abkühlen werden 10 zusätzliche Einheiten AMV reverse Transkriptase zugegeben und es wird eine weitere Inkubation für 10 Minuten bei 42ºC ausgeführt. Die reverse Transkriptase synthetisiert mittels Oligonucleotid A als Primer am 5'-Ende und der im vorhergehenden Schritt gebildeten DNA als Matrize eine DNA, die zum HIV Ziel komplementär ist. Ein zweiter DNA Strang wird mittels Oligonucleotid B als Primer und dem im vorhergehenden Schritt hergestellten RNA Transkript als Matrize synthetisiert.
Die Reaktion wird für eine Minute gekocht, um den DNA Doppelstrang und den RNA:DNA Doppelstrang zu denaturieren. Die Reaktion wird während einer Minute auf 42ºC abgekühlt. Der Primer A hybridisiert an die cDNA, die mittels des RNA Transkripts als Matrize im vorhergehenden Schritt hergestellt wurde. (falls das 3' Ende des Matrizenstrangs ebenfalls als Primer für die reverse Transkriptase verwendet wird, wird ein zum Endprodukt der nächsten Reaktion identisches Produkt gebildet.) Der Primer B hybridisiert an den DNA Strang, der zur HIV Ziel-RNA komplementär ist. Diese zweite Synthese bildet ein Produkt, das eine doppelsträngige DNA ist, die eine T7 Promotorsequenz an ihrem 5'-Ende , wie auch einen 4 bp langen "variablen" Abschnitt, 5'-GGGA-3' enthält.
Einhundert Einheiten T7 Polymerase werden zur Reaktion gegeben. Die Reaktion wird für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die T7 RNA Polymerase verwendet die doppelsträngige DNA, die einen doppelten T7 Promotor als Matrize enthält, um eine RNA zu transkribieren, die zum zweiten Zielabschnitt komplementär ist, der die zusätzliche Sequenz 5'-GGGA-3' an seinem 5'-Ende aufweist.
Dieser Zyklus (kochen 1 min, 1 min bei 42ºC, RT 10 min bei 42ºC, RT 10 min bei 42ºC, T7 Polymerase 37ºC 30 min) kann so oft wiederholt werden, wie es erforderlich ist, um die gewünschte Amplifizierung der Zielsequenz zu erreichen. Das entstehende Produkt kann dann durch eine Nucleinsäuresondenhybridisierungstechnik detektiert werden.

BEISPIEL IX

Gereinigte MIV RNA wurde in einer Konzentration von 1 fmol resuspendiert in:
40 mM Tris-MCl, pH 8,1
8 mM MgCl&sub2;
25 mM NaCl
2 mM Spermidin
5 mM Dithiotreit
100 uM dATP, dTTP, dCTP und dGTP (jeweils)
1 mM rATP, rCTP, rGTP und rUTP
100 ug/ml BSA nucleasefrei
250 nM des 29 bp langen DNA Oligonucleotids mit der Sequenz 5' - ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA- 3' (Primer B)
250 nM des 56 bp langen DNA Oligonucleotids mit der Sequenz 5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG-3' (Primer A)
Die 100 ul Lösung werden auf 65ºC für 1 Minute aufgeheizt und dann während einer Minute auf 42ºC abgekühlt. Dieses Aufheizen und der Abkühlungsschritt liefern zusammen mit der Zusammensetzung der Lösung Stringenzbedingungen, die für die Hybridisierung von Primer A mit ausreichender Stabilität an die komplementäre Sequenz der Primer A Region in der HIV Ziel-RNA [(erster Unterabschnitt)t2 in Fig. 1] mit hoher Spezifität ausreichen.
Dann werden 10 Einheiten Vogelmyoblastosevirus (AMV) reverse Transkriptase (Life Sciences, Inc.) zur Lösung gegeben und die Lösung wird für 10 Minuten bei 42ºC inkubiert. Nach einer zehnminütigen Inkubation wird die Lösung für eine Minute in ein kochendes Wasserbad gestellt. Dieses Aufheizen verursacht die Strangtrennung des durch die reverse Transkriptase gebildeten Doppelstrangs und die Inaktivierung der reversen Transkriptase.
Dann wird die Lösung über eine Minute auf 42ºC abgekühlt. Während diesem Abkühlen hybridisiert der zweite Primer B, an das 3'-terminale ende des neu synthetisierten zum Ziel komplementären Strangs [oder (dritter Unterabschnitt)t2c in Fig. 1). Erneut sind die Hybridisierungsbedingungen für die spezifische Hybridisierung zwischen dem zweiten Primer und der zum zweiten Primer komplementären Sequenz ausreichend stringent.
Nach dem Abkühlen werden 10 zusätzliche Einheiten AMV reverse Transkriptase zugegeben und es wird eine weitere Inkubation für 10 Minuten bei 42ºC durchgeführt.
Einhundert Einheiten T7 RNA Polymerase (New England Biolabs) werden zur Reaktion gegeben. Die Reaktion wird dann bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Es wird ein RNA Transkript synthetisiert, das komplementär ist zur ursprünglichen HIV Ziel-RNA, ausgehend vom T7 Promotor, der am 5' Ende der durch die reverse Transkriptase synthetisierten DNA Doppelstrangmatrize vorkommt. Das RNA Transkript hat die Sequenz 5'-GGGA und fährt mit einer Sequenz fort, die zum zweiten Unterabschnitt der Zielsequenz komplementär ist (das heißt dem zweiten Unterabschnitt tcr' siehe Fig. 1). Da die reverse Transkriptase vor diesem Schritt nicht inaktiviert wurde und da Primer B wie auch die Desoxynucleotidtriphosphate enthalten sind, findet bei diesem Schritt eine zweite Synthese statt. Der Primer B hybridisiert an die 3' Region des neu synthetisierten RNA Transkripts [(dritter Unterabschnitt)t2cr, siehe Fig. 1], die zum Primer B komplementär ist. Die reverse Transkriptase (die beim vorherigen Schritt zugegeben wurde) synthetisiert unter Verwendung des neu synthetisierten RNA Transkripts (durch die T7 RNA Polymerase hergestellt) als Matrize und unter Verwendung des Oligonucleotids B als Primer am 5'-Ende einen DNA Strang.
Die Reaktion wird dann für eine Minute gekocht, um den RNA:DNA Doppelstrang zu denaturieren. Die Reaktion wird dann während einer Minute auf 42ºC abgekühlt. Während dieses Abkühlungsschritts hybridisiert der komplementäre Zielabschnitt von Primer A an den während des vorangehenden Schritts synthetisierten DNA Strang. Zur selben Zeit hybridisiert Primer B an seine komplementäre Sequenz auf dem RNA Transkript, das im vorangehenden Schritt synthetisiert wurde.
Nach dem Abkühlen werden 10 Einheiten AMV reverse Transkriptase zugegeben und es wird eine weitere Inkubation für 10 Minuten bei 42ºC ausgeführt. Die reverse Transkriptase synthetisiert mittels Oligonucleotid A als Primer am 5'-Ende und der im vorhergehenden Schritt gebildeten DNA als Matrize eine DNA, die zum HIV Ziel komplementär ist. Das 3'-Ende des Matrizenstrangs wird als Primer verwendet, um schließlich eine doppelsträngige DNA mit einer doppelsträngigen T7 Promotorstelle an deren 5'-Ende zu bilden. Ein zweiter DNA Strang wird mittels Oligonucleotid B als Primer und dem im vorhergehenden Schritt hergestellten RNA Transkript als Matrize synthetisiert.
Einhundert Einheiten T7 Polymerase werden zur Reaktion gegeben. Die Reaktion wird für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die T7 RNA Polymerase synthetisiert unter Verwendung der doppelsträngigen DNA als Matrize, die die Polymerasebindungstelle (T7 Promotor) an ihrem 5'-Ende aufweist, ein RNA Transkript. Das RNA Transkript ist
zum zweiten Zielunterabschnitt komplementär, siehe Fig. 1, der die zusätzliche Sequenz 5'-GGGA-3' an seinem 5'-Ende aufweist. Es können weitere Zyklen zur Erhöhung der Amplifizierung durchgeführt werden. Das entstehende Produkt kann durch eine Nucleinsäurehybridisierungsvorschrift detektiert werden.

BEISPIEL X

Protokoll für die Markierung des TAS amplifizierten Produkts im letzten Durchgang

A. Säule, um nicht eingebaute kalte Nucleotide zu entfernen

1. Die TAS Reaktion (100 u) wird nach der cDNA Synthese im letzten Zyklus von TAS entnommen. Zugeben von 400 ul des Reagenz A (0,1 M Tris-HCl pH 7,7, 10 mM Triethylamin, 1 mM Dinatrium-EDTA) zur Reaktion.
2. Equilibrieren einer vorgepackten NENSORB&sub2;&sub0;® (Dupont) Säule durch Befeuchten des Säulenmaterials in 100% Methanol (HPLC Reinheitsgrad), dann Equilibrieren mit 2 ml Reagenz A.
3. Beladen der Säule mit der Probe.
4. Dreimaliges Waschen der Säule mit 1 ml Reagenz A.
5. Dreimaliges Waschen der Säule mit 1 ml Wasser.
6. Elution der Nucleinsäuren mit 50% Methanol, Sammeln von 250-300 111 Fraktionen bis zu einem Gesamtvolumen von 1 ml. (Die ersten zwei Fraktionen werden den Hauptteil der Nucleinsäure enthalten.)
7. Trocknen der Fraktionen in der Speed-Vac oder im Lyophilisiergerät.

B. Protokoll zur Markierung des Amplifizierten Produkts

1. Resuspendieren der Fraktionen der NENSORB&sub2;&sub0;® Säule (die ersten zwei Fraktionen können vereinigt werden) in 40 mM Tris-HCl pH 8,1, 8 mM MgCl&sub2;, 25 mM NaCl, 2 mM Spermidin (HCl)&sub3;, 5 mM Dithiotreit, jeweils 400 uM rATP, rCTP und rGTP, 12 uM rUTP und 25 uCi eines ³²P-rUTP (800 Ci/mmol)
2. Zugeben von 50 Einheiten T7 RNA Polymerase (New England Biolabs) für jede 50 ul Probe. Inkubieren bei 37ºC für 30 Minuten.
3. Die nicht eingebaute Markierung kann durch eine G-50 Zentrifugationssäule (Maniatis, obige Literaturstelle) entfernt werden.
4. Die markierte Probe kann auf ein Polyacrylamidsequenzgel aufgetragen werden, um die Größe des amplifizierten Produkts zu bestimmen. Das markierte Produkt kann auch mittels Oligo-Beads® detektiert werden.

BEISPIEL XI

Verwendung eines internen Standards während der TAS Amplifizierung

Es wurden Proben hergestellt, die enthalten: 1) 0,1 fm HIV RNA und 0,1 fm β-Globin DNA-Sequenzen (Hβ19A geschnitten mit PstI), 2) 0,01 fm HIV RNA und 0,1 fm β-Globin DNA (Hβ19A, geschnitten mit PstI), 3) 0,1 fm HIV RNA oder 4) 0,1 fm β-Globin DNA (Hβ19A, geschnitten mit PstI) in 100 111, worin enthalten sind 40 mM Tris-HCl, pH 8,1, 8 mM MgCl&sub2;, 25 mM NaCl, 2 mM Spermidin- (HCl)&sub3;, 5 mM Dithiotreit, jeweils 100 ul dATP, dGTP, dCTP und dUTP, jeweils 1 mM rATP, rUTP rCTP und rGTP, 100 ug/ml BSA (nucleasefrei) und 250 nM Primer A
(5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG-3'),
250 nM Primer B (5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3'), 250 nM Primer C (5'-TAATACGACTCACTATAGGGAACTAAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCC-3') und
250 nM Primer D (5'-ACATTGCTTCTGACACAACTGTGTTCA-3'). Eine Probe, die 1/20 der Ausgangsnucleinsäuren enthält, wurde in die denaturierende Lösung 7,4% Formaldehyd, 10fach SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M Na-Citrat, pH 7,4) für die Proben zum Zeitpunkt Null gegeben.
Die Proben wurden für 1 Minute gekocht und für 1 Minute auf 42ºC abgekühlt, gefolgt von der Zugabe von 10 Einheiten AMV reverser Transkriptase. Die Reaktionen werden bei 42ºC für 15 Minuten inkubiert, für 1 Minute gekocht und bei 42ºC für 1 Minute abgekühlt. Zusätzliche 10 Einheiten der AMV reversen Transkriptase werden zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 42ºC für 15 Minuten. Einhundert Einheiten T7 RNA Polymerase werden zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37ºC für 30 Minuten. Dieser Zyklus wird ein zweites Mal wiederholt. (In Abhängigkeit von der benötigten Amplifizierung können mehrere Zyklen ausgeführt werden.) Zwei Proben, die 1/20 der Ausgangsnucleinsäuren enthalten, werden als Proben für den zweiten Transkriptionszeitpunkt in die Denaturierungslösung gegeben.
Alle Proben wurden auf 55ºC für 30 Minuten vor dem Filtrieren auf zwei Nitrocellulosemembranen aufgeheizt. Die Nucleinsäuren wurden auf der Membran durch Bestrahlung mit 254 nm UV Licht für 4 Minuten fixiert. Als Kontrollen wurden 1, 0,1 und 0,001 fm von Plasmid pARV7/2 [Luciw et al., Nature 312, 760 (1984)] das die cDNA des gesamten HIV-Genoms enthält, wie auch von Plasmid Hβ19A [Wallace et al., Nucl. Acids Res. 9, 3647 (1981), in 0,2 N NaOH denaturiert, mit einem gleichen Volumen 2 M Ammoniumacetat neutralisiert und dann auf die Nitrocellulosemembran filtriert. Eine Membran wurde mit ³²-P markiertem Oligonucleotid 86-31¹ hybridisiert, das für das amplifizierte Produkt von HIV spezifisch ist. Die andere Membran wurde mit ³²P-markiertem Oligonucleotid 87-459² hybridisiert, das an das amplifizierte ß-Globinprodukt, wie auch an das β-Globin Zielplasmid hybridisieren wird.
Die Hybridisierungen wurden in 1% SDS, 0,9 M NaCl, 50 nM NaH&sub2;PO&sub4; (pH 7,4), 5 mM EDTA (pH 7,4) und 10&sup6; cpm/min ³²P-markiertem Oligonucleotid für 1 Stunde bei 55ºC ausgeführt. Die Membranen wurden dreimal in 1% SDS, 0,18 M NaCl, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4; (pH 7,4) und 1 mM EDTA bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einem Waschschritt im selben Puffer bei 55ºC.
Die Membranen wurden für 16 Stunden auf einem Kodak XAR Film bei -70ºC mit einer Verstärkerfolie autoradiographiert.

Anmerkungen

1. 86 - 31 : 5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3'
2. 87-459 : 5'-AGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACT-3'
Die Autoradiographie in Fig. 3 zeigt die Menge an HIV und ß-Globinsequenzen, die nach zwei gleichzeitig mit HIV und β-Globin Nucleinsäure ausgeführten TAS Zyklen detektiert wurde. Die Ausgangsmenge von β-Globin wurde konstantgehalten, während die Menge an HIV Ziel variiert wurde.

Claims

1. Verfahren zum Amplifizieren einer Zielsequenz in einer Nucleinsäure enthaltenden Probe, umfassend die Schritte:

(A) Bereitstellen eines ersten Nucleinsäureprimers, der eine Promotersequenz enthält, die operativ mit einer Sequenz verknüpft ist, die einem ersten Abschnitt der Zielsequenz entspricht, wobei der erste Abschnitt das 3'-Ende der Zielsequenz umfaßt, und eines zweiten Nucleinsäureprimers, der mit einer Sequenz hybridisierbar ist, die zu einem zweiten Abschnitt der Zielsequenz komlementär ist, wobei der zweite Abschnitt das 5'-Ende der Zielsequenz umfaßt;

(B) Hybridisieren des ersten Nucleinsäureprimers mit der Zielsequenz unter geeigneten Bedingungen in einer Nucleinsäure enthaltenden Probe;

(C) Extendieren des ersten Nucleinsäureprimers in einer Polymeraseextensionsreaktion komplementär zur Zielsequenz, wobei ein erster Nucleinsäuredoppelstrang gebildet wird;

(D) Überführen des in Schritt (C) gebildeten Doppelstrangs in Einzelstränge;

(E) Hybridisieren des zweiten Nucleinsäureprimers unter geeigneten Bedingungen mit dem entstandenen die Promotersequenz enthaltenden Strang;

(F) Extendieren des hybridisierten zweiten Nucleinsäureprimers in einer Polymeraseextensionsreaktion komplementär zum die Promotersequenz enthaltenden Strang, wobei ein zweiter Nucleinsäuredoppelstrang gebildet wird;

(G) verwenden des zweiten Doppelstrangs als Matrize zur Herstellung einer Vielzahl von RNA-Transkripten davon, in wird, welche den der Promotersequenz des ersten Primers entsprechenden Promoter erkennt, wobei jedes der Transkripte eine der Zielsequenz entsprechende RNA-Sequenz beinhaltet;

(H) Hybridisieren der aus dem zweiten Doppelstrang hergestellten RNA-Transkripte mit dem zweiten Nucleinsäureprimer;

(I) Extendieren des hybridisierten zweiten Nucleinsäureprimers in einer Polymeraseextensionsreaktion, die von einer RNA- abhängigen DNA-Polymerase katalysiert wird, komplementär zu den RNA-Transkripten, wobei ein dritter Nucleinsäuredoppelstrang gebildet wird;

(J) Überführen des dritten Doppelstrangs in Einzelstränge;

(K) Hybridisieren von zweiten Primer enthaltenden Strängen aus dem dritten Doppelstrang, unter geeigneten Bedingungen mit erstem Primer;

(L) Extendieren von sowohl ersten als auch zweiten Primer enthaltenden Strängen in den Hybriden aus erstem Primer mit zweiten Primer enthaltenden Strängen aus einer Trennung der Stränge des dritten Doppelstrangs in Polymeraseextensionsreaktionen, wobei ein vierter Nucleinsäuredoppelstrang gebildet wird; und

(M) Verwenden des vierten Doppelstrangs als Matrize zur Herstellung einer Vielzahl von RNA-Transkripten davon, in einer Reaktion, die durch eine RNA-Polymerase katalysiert wird, welche den der Promotersequenz des ersten Primers entsprechenden Promoter erkennt, wobei jedes der Transkripte eine der Zielsequenz entsprechende RNA-Sequenz beinhaltet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin umfaßt mindestens einmaliges Wiederholen der Schritte (H) bis (M), wobei in Schritt (H) zur Hybridisierung des direkt davor in Schritt (M) hergestellten RNA-Transkripts der zweite Primer verwendet wird.

3. Verfahren, geeignet zum Nachweisen mindestens einer spezifischen Nucleinsäurezielsequenz in einer Nucleinsäureenthaltenden Probe, umfassend das Herstellen von RNA- Transkripten, die eine der Zielsequenz entsprechende Sequenz enthalten nach Anspruch 1 oder 2, und Nachweisen der Anwesenheit der RNA-Sequenz.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im ersten Primer die einem ersten Abschnitt der Zielsequenz entsprechende Sequenz zu dem ersten Abschnitt komplementär ist, der zweite Primer eine mit einem zweiten Abschnitt der Zielsequenz identische Sequenz hat, die ersten und zweiten Abschnitte der Zielsequenz nicht überlappen, und alle Polymeraseextensionsreaktionen durch die gleiche reverse Transkriptase katalysiert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin umfassend das Nachweisen von nach Anspruch 4 hergestellten RNA-Transkripten.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 5, wobei die Transkripte Replicase-Erkennungsstellen zur Replikation der Transkripte durch Replicase-Induktion enthalten.

7. Verfahren nach Anspruch 3, 5 oder 6, wobei die nachgewiesene RNA-Sequenz der RNA-Transkripte in einer standardisierten Weise bestimmt wird, um die Menge an Zielsequenz, die in einer zur Herstellung der doppelsträngigen Nucleinsäurematrize verwendeten Nucleinsäureprobe enthalten ist, zu bestimmen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die nachgewiesene RNA-Sequenz der RNA-Transkripte in einer intern standardisierten Weise durch die Anwesenheit einer in der Probe ebenfalls enthaltenen Nucleinsäure in bekannter Kopienzahl gemessen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 3 oder 5, wobei die Zielsequenz innerhalb einer Nucleinsäuresequenz angeordnet ist, die in Zusammenhang mit den Merkmalen einer genetischen oder pathogenen Krankheit oder Verfassung steht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Nucleinsäuresequenz ein Abschnitt eines Human-Immundefizienz-Virus ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Nucleinsäuresequenz ein Abschnitt eines fehlerhaften Gens ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, wobei der der Promotersequenz des ersten Primers entsprechende Promoter ein Bakteriophage T7 Promoter ist und die RNA-Transkripte unter Verwendung von T7 RNA-Polymerase hergestellt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, wobei der der Promotersequenz des ersten Primers entsprechende Promoter ein Bakteriophage SP6 Promoter ist und die RNA-Transkripte unter Verwendung von SP6 RNA-Polymerase hergestellt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielsequenz eine DNA- Sequenz ist und die Polymeraseextensionsreaktion durch E.Coli DNA-Polymerase I katalysiert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielsequenz eine DNA- Sequenz ist und die Polymeraseextensionsreaktion durch das Klenow Fragment von E.Coli DNA-Polymerase I katalysiert wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielsequenz eine DNA- Sequenz ist und die Polymeraseextensionsreaktion von T4 DNA- Polymerase katalysiert wird.

17. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei alle Polymeraseextensionsreaktion von einer reversen Transkriptase katalysiert werden.

18. Verfahren nach Anspruch 3 oder 5, wobei die RNA-Transkripte vor dem Nachweis markiert werden.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die RNA-Transkripte radioaktiv markiert werden.

20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die RNA-Transkripte mit einem Chromophor markiert werden.

21. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die reverse Transkriptase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus AMV reverse Transkriptase und MMLV reverse Transkriptase.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Zielsequenz 1000 oder weniger Nucleotide hat, der erste Abschnitt der Zielsequenz 15 bis 45 Nucleotide hat und der zweite Abschnitt der Zielsequenz 15 bis 45 Nucleotide hat.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Stränge durch thermische Denaturierung getrennt werden.

24. Kit, geeignet zum Nachweis mindestens einer spezifischen Nucleinsäurezielsequenz in einer Nucleinsäure enthaltenden Probe, umfassend einen ersten Nucleinsäureprimer, der eine Promotersequenz enthält, die operativ mit einer Sequenz verknüpft ist, die mit einem Abschnitt einer Zielsequenz komplementär ist, und einen zweiten Nucleinsäureprimer mit einer Sequenz, die zu einem zweiten Abschnitt der Zielsequenz identisch ist, wobei die Primer verschiedenen Bereichen der Zielsequenz entsprechen, aber nicht, oder nicht wesentlich, entsprechend dem Ziel überlappen, und so ausgewählt sind, daß ein Extensionsprodukt eines Primers, wenn es von seinem Komplement getrennt wird, als Matrize für ein Extensionsprodukt des anderen Primers dienen kann, und umfassend Mittel zum Hybridisieren des ersten Primers mit der Zielsequenz, zum Kettenextendieren des hybridisierten Primers, zum Überführen des entstandenen Doppelstrangs in Einzelstränge, zum Hybridisieren des zweiten Nucleinsäureprimers mit dem den Promoter enthaltenden aufgetrennten Strang, zum Kettenextendieren des hybridisierten Primers, zum Verursachen, daß der so hergestellte eine Promotersequenz enthaltende Nucleinsäuredoppelstrang Transkripte herstellt, und zum Nachweisen der Transkripte.

25. Kit nach Anspruch 24, wobei das Mittel zum Kettenextendieren von Primern eine reverse Transkriptase ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus AMV reverse Transkriptase und MMLV reverse Transkriptase, der der Promotersequenz des ersten Primers entsprechende Promoter zur Transkription von einer RNA-Polymerase erkannt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus T7 RNA-Polymerase und SP6 RNA-Polymerase, und das Mittel zum Verursachen, daß eine einen derartigen Promoter enthaltende doppelsträngige Nucleinsäure Transkripte herstellt, T7 RNA-Polymerase ist, falls der Promoter zur Transkription von T7 RNA-Polymerase erkannt wird, oder SP6 RNA-Polymerase, falls der Promoter zur Transkription von SP6 RNA-Polymerase erkannt wird.

26. Kit nach Anspruch 24 oder 25, wobei die nachzuweisende Zielsequenz 1000 oder weniger Nucleotide hat, die Sequenz des zu einem Abschnitt der Zielsequenz komplementären ersten Primers 15 bis 45 Nucleotide hat und die Sequenz des mit einem Abschnitt der Zielsequenz identischen zweiten Primers 15 bis 45 Nucleotide hat.

27. Verfahren zum Amplifizieren eines Nucleinsäurezielabschnitts der Formel I

3'-(erster Unterabschnitt)t-(zweiter Unterabschnitt)t-(dritter Unterabschnitt)t-5'

I

wobei (erster Unterabschnitt)t ein Nucleinsäureabschnitt einer bekannten Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden ist, der am 3'-Ende von (zweiter Unterabschnitt)t angrenzt, (zweiter Unterabschnitt)t ein Nucleinsäureabschnitt von 0 oder mehr Nucleotiden ist, und (dritter Unterabschnitt)t ein Nucleinsäureabschnitt einer bekannten Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden ist, der am 5'-Ende von (zweiter Unterabschnitt)t angrenzt, wobei das Verfahren umfaßt:

(1) Hybridisieren von (erster Unterabschnitt)t der Zielsequenz mit einem ersten Primer, der eine einzelsträngige DNA ist, die einen 3'-terminalen Unterabschnitt der Formel II umfaßt

5'-(Promoter)&sub1;-(variabler Unterabschnitt)&sub1;-(3'-Primer- Unterabschnitt)&sub1;-3'

II

wobei (Promoter)&sub1; ein einzelsträngiger RNA-Abschnitt mit der Sequenz des Plus-Strangs eines DNA-abhängigen RNA-Polymerasespezifischen Bakteriophagenpromoters ist, (variabler Unterabschnitt)&sub1; ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt mit 0 bis 100 Nucleotiden ist, der an das 3'-terminale Nucleotid von (Promoter)&sub1; und an das 5'-terminale Nucleotid von (3'-Primer- Unterabschnitt)&sub1; angrenzt, und (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt von mindestens 10 Nucleotiden ist, mit einer Sequenz, die komplementär zur Sequenz eines Unterabschnitts von (erster Unterabschnitt)t ist, die mit dem 3'-terminalen Nucleotid von (erster Unterabschnitt)t endet, wobei (Promoter)&sub1; an das 5'-Ende von (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; angrenzt, falls (variabler Unterabschnitt)&sub1; 0 Nucleotide hat;

(2) Extendieren des gemäß Schritt (1) hybridisierten ersten Primers in einer durch eine erste DNA-Polymerase katalysierten Reaktion, um einen ersten komplementären DNA- Abschnitt herzustellen, der einen Unterabschnitt der Formel III umfaßt

5'-(Promoter)&sub1;-(variabler Unterabschnitt)&sub1;-(erster Unterabschnitt)tc-(zweiter Unterabschnitt)tc-(dritter Unterabschnitt)tc-3'

III

wobei (erster Unterabschnitt)tc der DNA-Abschnitt mit der zu (erster Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, (zweiter Unterabschnitt)tc der DNA-Abschnitt mit der zu (zweiter Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, und (dritter Unterabschnitt)tc der DNA-Abschnitt mit der zu (dritter Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, vorausgesetzt daß, falls der Zielabschnitt ein RNA-Abschnitt ist, die erste DNA-Polymerase eine reverse Transkriptase ist;

(3) Überführen des in der Reaktion von Schritt (2) gebildeten Doppelstrangs in Einzelstränge;

(4) Hybridisieren von (dritter Unterabschnitt)tc der ersten komplementären DNA der Formel III mit einem zweiten Primer, der eine einzelsträngige DNA ist von mindestens 10 Nucleotiden der Formel IV ist

3'-(5'-Primer-Unterabschnitt)&sub2;-(variabler Unterabschnitt)&sub2;-5' wobei (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub2; die Sequenz eines Unterabschnitts von (dritter Unterabschnitt)t hat, die mit dem 5'-terminalen Nucleotid von (dritter Unterabschnitt)t endet und wobei (variabler Unterabschnitt)&sub2; ein Abschnitt von 0 bis 100 Nucleotiden ist, der an das 5'-Ende von (5'-Primer- Unterabschnitt) 2 angrenzt;

(5) Extendieren des gemäß Schritt (4) hybridisierten zweiten Primerabschnitts in einer von einer zweiten DNA-Polymerase katalysierten Reaktion, um einen zweiten komplementären DNA- Abschnitt herzustellen' der einen Unterabschnitt der Formel V umfaßt

5'-(variabler Unterabschnitt)&sub2;-(dritter Unterabschnitt)t- (zweiter Unterabschnitt)t-(erster Unterabschnitt)t-(variabler Unterabschnitt)1c-(Promoter)1c-3'

V

wobei (variabler Unterabschnitt)1c der DNA-Abschnitt mit der zu (variabler Unterabschnitt)&sub1; komplementären Sequenz ist, (Promoter)1c der DNA-Abschnitt mit der zu (Promoter)&sub1; komplementären Sequenz ist, vorausgesetzt daß die zweite DNA- Polymerase gleich oder unterschiedlich zur ersten DNA- Polymerase ist;

(6) Verwenden des doppelsträngigen Produkts aus Schritt (5) als Matrize in einer Reaktion, die durch DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase katalysiert wird, die den Promoter, dessen einer Strang (Promoter)&sub1; ist, erkennt, wobei ein erstes RNA-Produkt der Formel VI hergestellt wird

5'-(variabler Unterabschnitt)1r-(erster Unterabschnitt)tcr- (zweiter Unterabschnitt)tcr-(dritter Unterabschnitt)tcr- (variabler Unterabschnitt)2cr-3'

VI

wobei (variabler Unterabschnitt)1r der RNA-Abschnitt mit der Sequenz von (variabler Unterabschnitt)&sub1; ist, (erster Unterabschnitt)tcr der RNA-Abschnitt mit der zu (erster Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, (zweiter Unterabschnitt)tcr der RNA-Abschnitt mit der zu (zweiter Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, (dritter Unterabschnitt)tcr der RNA-Abschnitt mit der zu (dritter Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, und (variabler Unterabschnitt)2cr der RNA-Abschnitt mit der zu (variabler Unterabschnitt)&sub2; komplementären Sequenz ist, dadurch gekennzeichnet, daß nach den Verfahrensschritten 1 bis 6 weitere Amplifikation des Nucleinsäure-Zielabschnitts in einem Wiederholungszyklus durchgeführt wird, in dem (erster Unterabschnitt)t eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden hat und die Formel XIII aufweist

3'-(erster Unterabschnitt)t2-(erster Unterabschnitt)t1-5'

XIII

wobei (erster Unterabschnitt)t2 0 oder mehr Nucleotide hat und, falls mehr als 0, an das 3'-Ende von (erster Unterabschnitt)t1 angrenzt, und (erster Unterabschnitt)t1 eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden hat; wobei (dritter Unterabschnitt)t die Formel XIV aufweist

3'-(dritter Unterabschnitt)t1-(dritter Unterabschnitt)t2-5'

XIV

wobei (dritter Unterabschnitt)t2 0 oder mehr Nucleotide hat und, falls mehr als 0, an das 5'-Ende von (dritter Unterabschnitt)t1 angrenzt, und (dritter Unterabschnitt)t1 eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden hat; wobei (3'- Primer-Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz hat, die komplementär zu einem Unterabschnitt des Zielabschnitts ist, die aus dem gesamten (ersten Unterabschnitt)t2 und 0 oder mehr Nucleotiden von (erster Unterabschnitt)t1 besteht; wobei (5'- Primer-Unterabschnitt)&sub2; ein Unterabschnitt ist, der aus dem gesamten (dritten Unterabschnitt)t2 und 0 oder mehr Nucleotiden von (dritter Unterabschnitt)t1 besteht; wobei (variabler Unterabschnitt)&sub2; 0 oder mehr Nuclotide hat; und wobei nach Schritten 1 bis 6 ein RNA-Segment der Formel VII

5'-(erster Unterabschnitt)t1cr-(zweiter Unterabschnitt)tcr- (dritter Unterabschnitt)t1cr-3'

VII

wobei (erster Unterabschnitt)t1cr der RNA-Abschnitt mit der zu (erster Unterabschnitt)t1 komplementären Sequenz ist und (dritter Unterabschnitt)t1cr der RNA-Abschnitt mit der zu (dritter Unterabschnitt)t1 komplementären Sequenz ist, weiter amplifiziert wird durch ein Verfahren, welches umfaßt:

(7) Hybridisieren des ersten RNA-Produkts der Formel VI mit einem dritten Primer, der eine einzelsträngige DNA ist, die einen 3'-terminalen Unterabschnitt der Formel VIII umfaßt

5'-(Promoter)&sub3;-(variabler Unterabschnitt)&sub3;-(3'-Primer- Unterabschnitt)&sub3;-3'

VIII

wobei (Promoter)&sub3; ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt mit der Sequenz des Plus-Strangs von einem DNA-abhängigen RNA- Polymerase-spezifischen Bakteriophagenpromoter ist, wobei die Sequenz von (Promoter)&sub3; gleich oder unterschiedlich wie die von (Promoter)&sub1; ist, (variabler Unterabschnitt)&sub3; ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt von 0 bis 100 Nucleotiden ist, der an das 3'-terminale Nucleotid von (Promoter)&sub3; und an das 5'-terminale Nucleotid von (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; angrenzt, und (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt mit der gleichen Sequenz wie (dritter Unterabschnitt)t1 ist und, falls (variabler Unterabschnitt)&sub3; 0 Nucleotide hat, an das 3'-terminale Nucleotid von (Promoter)&sub3; angrenzt;

(8) Extendieren des gemäß Schritt (7) hybridisierten Primers in einer von einer dritten DNA-Polymerase katalysierten Reaktion, welche eine reverse Transkriptase ist und gleich oder unterschiedlich wie die erste und zweite DNA-Polymerase ist, wobei ein dritter komplementärer DNA-Abschnitt hergestellt wird, der einen 3'-terminalen Unterabschnitt der Formel IX umfaßt

5'-(Promoter)&sub3;-(variabler Unterabschnitt)&sub2;-(dritter Unterabschnitt)t1-(zweiter Unterabschnitt)t-(erster Unterabschnitt)t1-(erster Unterabschnitt)t2-(variabler Unterabschnitt)1c-3'

IX

wobei (variabler Unterabschnitt)1c die DNA mit der zu (variabler Unterabschnitt)&sub1; komplementären Sequenz ist;

(9) Überführen des in der Reaktion von Schritt (8) gebildeten Doppelstrangs in Einzelstränge;

(10) Hybridisieren der in der Reaktion von Schritt (8) gebildeten komplementären DNA mit einem vierten Primer der Formel X

5'-(variabler Unterabschnitt)&sub4;-(5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4;-3'

X

wobei (variabler Unterabschnitt)&sub4; ein Abschnitt von 0 bis 100 Nucleotiden ist und (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4; ein Unterabschnitt bekannter Sequenz ist, der an das 3'-Nucleotid von (variabler Unterabschnitt)&sub4; angrenzt, falls (variabler Unterabschnitt)&sub4; mehr als 0 Nucleotide hat, und der mindestens 10 Nucleotide des Abschnitts der Formel XX umfaßt

5'-(variabler Unterabschnitt)&sub1;-(erster Unterabschnitt)t2c- (erster Unterabschnitt)t1c-3'

XX

wobei (erster Unterabschnitt)t2c der DNA-Abschnitt mit der zu (erster Unterabschnitt)t2 komplementären Sequenz ist und (erster Unterabschnitt)t1c der DNA-Abschnitt mit der zu (erster Unterabschnitt)t1 komplementären Sequenz ist, vorausgesetzt, daß mindestens eines der mindestens 10 Nucleotide bei oder 5' vom 5'-terminalen Nucleotid von erster Unterabschnitt)t1c ist;

(11) Extendieren des gemäß Schritt (10) hybridisierten vierten Primers in einer von einer vierten DNA-Polymerase katalysierten Reaktion, die gleich oder unterschiedlich wie die erstem zweite und dritte DNA-Polymerase ist, wobei ein vierter komplementärer DNA-Strang hergestellt wird, der einen Abschnitt der Formel XI umfaßt

5'-(erster Unterabschnitt)t1c-(zweiter Unterabschnitt)tc- (dritter Unterabschnitt)t1c-(variabler Unterabschnitt)3c- (Promoter)3c-3'

XI

wobei (zweiter Unterabschnitt)tc der DNA-Abschnitt mit der zu (zweiter Unterabschnitt)t komplementären Sequenz ist, (dritter Unterabschnitt)t1c der DNA-Abschnitt mit der zu (dritter Unterabschnitt)t1 komplementären Sequenz ist (variabler Unterabschnitt)3c der DNA-Abschnitt mit der zu (variabler Unterabschnitt)&sub3; komplementären Sequenz ist und (Promoter)3c der DNA-Abschnitt mit der zu (Promoter)3c komplementären Sequenz ist; und

(12) Verwenden des doppelsträngigen Produkts aus Schritt (11) als Matrize in einer Reaktion, die durch eine zweite DNA- abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase katalysiert wird, die gleich oder unterschiedlich der ersten DNA-abhängigen Bakteriophagen-RNA-Polymerase ist und die den Promoter, dessen einer Strang (Promoter)&sub3; ist, erkennt, wobei ein zweites RNA-Produkt mit einem 5'-terminalen Unterabschnitt der Formel XII hergestellt wird

5'-(variabler Unterabschnitt)3r-(dritter Unterabschnitt)t1r- (zweiter Unterabschnitt)tr-(erster Unterabschnitt)t1r-X&sub1;&sub2;- (variabler Unterabschnitt)4cr-3'

XII

wobei (variabler Unterabschnitt)3r der RNA-Abschnitt mit der Sequenz von (variabler Unterabschnitt)&sub3; ist, (dritter Unterabschnitt)t1r der RNA-Abschnitt mit der Sequenz von (dritter Unterabschnitt)t1 ist, (zweiter Unterabschnitt)tr der RNA-Abschnitt mit der Sequenz von (zweiter Unterabschnitt)t ist, (erster Unterabschnitt)t1r der RNA- Abschnitt mit der Sequenz von (erster Unterabschnitt)t1 ist, (variabler Unterabschnitt)4cr der RNA-Abschnitt mit der zu (variabler Unterabschnitt)&sub4; komplementären Sequenz ist und X&sub1;&sub2; der RNA-Abschnitt mit der zum Unterabschnitt von (5'- primer-Unterabschnitt)4 komplementären Sequenz ist, d. h. der 5' vom 5'-Ende von (erster Unterabschnitt)t1c.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei (variabler Unterabschnitt)l und (variabler Unterabschnitt)&sub2; jeweils 0 bis 60 Nucleotide haben, sowohl (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; wie (5'-Primer- Unterabschnitt)&sub2; 15 bis 45 Nucleotide hat, (zweiter Unterabschnitt)t mindestens 30 Nucleotide hat und der Zielabschnitt 1000 oder weniger Nucleotide hat.

29. Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Zielabschnitt ein DNA- Abschnitt ist, wobei das Produkt aus Schritt (2) durch thermische Denaturierung in Einzelstränge überführt wird, wobei (variabler Unterabschnitt)&sub2; 0 Nucleotide hat, wobei sowohl die erste als auch zweite DNA-Polymerase ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus dem Klenow Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, AMV reverser Transkriptase, klonierter MMLV reverser Transkriptase, Kalbsthymus-DNA-Polymerase alpha, hitzestabiler Thermus aquaticus DNA-Polymerase und klonierter T7 DNA-Polymerase mit der Markenbezeichnung SequenaseTM, und wobei die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus T7 RNA- Polymerase, T3 RNA-Polymerase und SP6 RNA-Polymerase.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei sowohl die erste als auch zweite DNA-Polymerase ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Klenow Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, AMV reverser Transkriptase und klonierter MMLV reverser Transkriptase.

31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei (1) die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase T7 RNA-Polymerase ist, (Promoter)&sub1; 5'-TAATACGACTCACTATA-3' ist und (variabler Unterabschnitt)&sub1; an seinem 5'-Ende ein Dinucleotid der Sequenz 5'-GG-3' hat; oder (2) die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA- Polymerase T3 RNA-Polymerase ist, (Promoter)&sub1; 5'- TATTAACCCTCACTAAA-3' ist und (variabler Unterabschnitt)&sub1; an seinem 5'-Ende ein Tetranucleotid der Sequenz 5'-GGGA-3' hat; oder (3) die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase SP6 RNA-Polymerase ist, (Promoter) 1 S'-GAACGCGGCTACAATTAATACATAA- CCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA-3' ist und (variabler Unterabschnitt)&sub1; an seinem 5'-Ende ein Hexanucleotid der Sequenz 5'-GAATAC-3' hat.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das 5'-Ende des ersten Primers das 5'-Nucleotid von (Promoter)&sub1; ist.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei falls die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase die T7 oder T3 RNA-Polymerase ist (variabler Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz 5'- GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' hat, und falls die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase die SP6 RNA- Polymerase ist (variabler Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz 5'- GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' hat.

34. Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Zielabschnitt ein RNA- Abschnitt ist, wobei das Produkt aus Schritt (2) durch thermische Denaturierung in Einzelstränge überführt wird, wobei variabler Unterabschnitt)&sub2; 0 Nucleotide hat, wobei die erste DNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus AMV reverser Transkriptase und klonierter MMLV reverser Transkriptase, wobei die zweite DNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Klenow Fragment von E. coli DNA- Polymerase I, AMV reverser Transkriptase, klonierter MMLV reverser Transkriptase, Kalbsthyrnus-DNA-Polymerase alpha, hitzestabiler Thermus aquaticus DNA-Polymerase und klonierter T7 DNA-Polymerase mit der Markenbezeichnung SequenaseTM, und wobei die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus T7 RNA- Polymerase, T3 RNA-Polymerase und SP6 RNA-Polymerase.

35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die zweite DNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Klenow Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, AMV reverser Transkriptase und klonierter MMLV reverser Transkriptase.

36. Verfahren nach Anspruch 35, wobei (1) die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase T7 RNA-Polymerase ist, (Promoter)&sub1; 5'-TAATACGACTCACTATA-3' ist und (variabler Unterabschnitt)&sub1; an seinem 5'-Ende ein Dinucleotid der Sequenz 5'-GG-3' hat; oder (2) die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA Polymerase T3 RNA-Polymerase ist, (Promoter)1t 5'- TATTAACCCTCACTAAA-3' ist und (variabler Unterabschnitt)&sub1; an seinem 5'-Ende ein Tetranucleotid der Sequenz 5'-GGGA-3' hat; oder (3) die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase SP6 RNA-Polymerase ist, (Promoter)&sub1; 5'-GAACGCGGCTACAATTAATACATAA- CCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA-3' ist und (variabler Unterabschnitt)&sub1; an seinem 5'-Ende ein Hexanucleotid der Sequenz 5'-GAATAC-3' hat.

37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei das 5'-Ende des ersten Primers das 5'-Nucleotid von (Promoter)&sub1; ist.

38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei sowohl die erste als auch die zweite DNA-Polymerase ausgewählt werden aus AMV reverser Transkriptase und klonierter MMLV reverser Transkriptase.

39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei falls die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase die T7 oder T3 RNA-Polymerase ist (variabler Unterabschnitt)l die Sequenz 5'- GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' hat, und falls die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase die SP6 RNA- Polymerase ist (variabler Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz 5'- GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' hat.

40. Verfahren nach Anspruch 34, 35, 36, 37, 38 oder 39, wobei der Zielabschnitt ein Abschnitt des Genoms eines Human- Immundefizienz-Virus ist, das ein HIV-1 Virus ist, und wobei

(1) (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz 5'- TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT-3' hat und (5'-Primer- Unterabschnitt)2 die Sequenz 5'- TTTCGTAACACTAGGCAAAGGTGGCTTTATC-3' hat oder (2) (3'-Primer- Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz 5'- ACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAG-3' hat und (5'-Primer- Unterabschnitt)&sub2; eine Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3' und 5'- ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3'.

41. Verfahren nach Anspruch 27, wobei sowohl (variabler Unterabschnitt)&sub1; wie (variabler Unterabschni)&sub3; 0 bis 60 Nucleotide haben, wobei (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1;, (5'- Primer-Unterabschnitt)&sub2;, (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; und (5'- Primer-Unterabschnitt)&sub4; jeweils 15 bis 45 Nucleotide haben, (zweiter Unterabschnitt)t mindestens 30 Nucleotide hat und der zielabschnitt 1000 oder weniger Nucleotide hat.

42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei (A) falls der zielabschnitt ein DNA-Abschnitt ist, das Produkt aus Schritt (2) durch thermische Denaturierung in Einzelstränge überführt wird und das Produkt aus Schritt (8) durch thermische Denaturierung in Einzelstränge überführt wird; die erste, zweite und vierte DNA-Polymerase jeweils ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Klenow Fragment von E. coli DNA-Polymerase 1, AMV reverser Transkriptase, klonierter MMLV reverser Transkriptase, Kalbsthymus-DNA-Polymerase alpha, hitzestabiler Thermus aquaticus DNA-Polymerase und klonierter T7 DNA- Polymerase mit der Markenbezeichnung SequenaseTM, die dritte DNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus AMV reverser Transkriptase und klonierter MMLV reverser Transkriptase, und dann sowohl die erste als auch die zweite DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus T7 RNA-Polymerase, T3 RNA- Polymerase und SP6 RNA-Polymerase; und (B) falls der zielabschnitt ein RNA-Abschnitt ist, sowohl das Produkt aus Schritt (2) als auch das Produkt aus Schritt (8) durch thermische Denaturierung in Einzelstränge überführt wird, sowohl die zweite als auch vierte DNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Klenow Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, AMV reverser Transkriptase, klonierter MMLV reverser Transkriptase, Kalbsthymus-DNA-Polymerase alpha, hitzestabiler Thermus aquaticus DNA-Polymerase und klonierter T7 DNA-Polymerase mit der Markenbezeichnung SequenaseTM sowohl die erste als auch dritte DNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus AMV reverser Transkriptase und klonierter MMLV reverser Transkriptase, und dann sowohl die erste als auch zweite DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA- Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus T7 RNA-Polymerase, T3 RNA-Polymerase und SP6 RNA-Polymerase.

43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei der Zielabschnitt ein RNA- Abschnitt ist und wobei sowohl die zweite als auch vierte DNA- polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Klenow Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, AMV reverser Transkriptase und klonierter MMLV reverser Transkriptase, und wobei sowohl die erste als auch dritte DNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus AMV reverser Transkriptase und klonierter MMLV reverser Transkriptase.

44. Verfahren nach Anspruch 42, wobei der Unterabschnitt des Zielabschnitts, der die zu (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; komplementäre Sequenz hat, in 3'-Richtung des Unterabschnitts des Zielabschnitts ist, der die zu (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4; komplementäre Sequenz hat, und damit nicht überlappt und wobei der Unterabschnitt des Zielabschnitts, der die Sequenz von (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub2; hat, den Unterabschnitt des Zielabschnitts, der die Sequenz von (3'-Primer- Unterabschnitt)&sub3; hat, nicht überlappt.

45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei der Unterabschnitt der dritten komplementären DNA mit der zu (3'-Primer- Unterabschnitt)&sub1; komplementären Sequenz in 5'-Richtung des Unterabschnitts der dritten komplementären DNA liegt, der die zu (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4; komplementäre Sequenz hat, und ihn nicht überlappt, und wobei der Unterabschnitt des Zielabschnitts, der die Sequenz von (5'-Primer- Unterabschnitt)&sub2; hat, den Unterabschnitt des Zielabschnitts, der die Sequenz von (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; hat, nicht überlappt.

46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei (variabler Unterabschnitt)1c in der dritten komplementären DNA mehr als 0 Nucleotide hat, und wobei im Doppelstrang zwischen (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4; und dritter komplementärer DNA mindestens ein Unterabschnitt von (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4; an (variabler Unterabschnitt)1c hybridisiert wird.

47. Verfahren nach Anspruch 45, wobei der Unterabschnitt des Zielabschnitts der die zu (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; komplementäre Sequenz hat in 3'-Richtung des Unterabschnitts des Zielabschnitts liegt, der die zu (5'-Primer- Unterabschnitt) 4 komplementäre Sequenz hat, und ihn nicht überlappt, und wobei der Unterabschnitt des Zielabschnitts, der die Sequenz von (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub2; hat, den Unterabschnitt des Zielabschnitts, der die Sequenz von (3'- Primer-Unterabschnitt)&sub3; hat, nicht überlappt.

48. Verfahren nach Anspruch 45, wobei der Unterabschnitt der dritten komplementären DNA mit der zu (3'-Primer- Unterabschnitt)&sub1; komplementären Sequenz in der 5'-Richtung des Unterabschnitts der dritten komplementären DNA liegt, der die zu (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4; komplementäre Sequenz hat, und ihn nicht überlappt, und wobei der Unterabschnitt des Zielabschnitts, der die Sequenz von (5'-Primer- Unterabschnitt)&sub2; hat, den Unterabschnitt des Zielabschnitts, der die Sequenz von (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub3; hat, nicht überlappt.

49. Verfahren nach Anspruch 48, wobei (variabler Unterabschnitt)1c in der dritten komplementären DNA mehr als 0 Nucleotide hat, und wobei im Doppelstrang zwischen (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4;z und dritter komplementärer DNA mindestens ein Unterabschnitt von (5'-Primer-Unterabschnitt)&sub4; an (variabler Unterabschnitt)1c hybridisiert wird.

50. Verfahren nach Anspruch 44, 45, 46, 47, 48 oder 49, wobei (1) falls T7 RNA-Polymerase in Schritt (6) oder Schritt (12) verwendet wird, (Promoter)&sub1;, falls der Schritt Schritt (6) ist, oder (Promoter)&sub3; falls der Schritt Schritt (12) ist, die Sequenz 5'-TAATACGACTCACTATA-3' hat, und (variabler Unterabschnitt)&sub1;, falls der Schritt Schritt (6) ist, oder (variabler Unterabschnitt)&sub3;, falls der Schritt Schritt (12) ist, an seinem 5'-Ende ein Dinucleotid der Sequenz 5'-GG-3' hat; oder (2) falls T3 RNA-Polymerase in Schritt (6) oder Schritt (12) verwendet wird, (Promoter)&sub1;, falls der Schritt Schritt (6) ist, oder (Promoter)&sub3;, falls der Schritt Schritt (12) ist, die Sequenz 5'-TATTAACCCTCACTAAA-3' hat, und (variabler Unterabschnitt)&sub1;, falls der Schritt Schritt (6) ist, oder (variabler Unterabschnitt)&sub3;, falls der Schritt Schritt (12) ist, an seinem 5'-Ende ein Tetranucleotid der Sequenz 5'-GGGA-3' hat; oder (3) falls SP6 RNA-Polymerase in Schritt (6) oder Schritt (12) verwendet wird, (Promoter)&sub1;, falls der Schritt Schritt (6) ist, oder (Promoter)&sub3;, falls der Schritt Schritt (12) ist, die Sequenz 5'- GAACGCGGCTACAATTAATACATAA- CCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA-3' hat, und (variabler Unterabschnitt)&sub1;, falls der Schritt Schritt (6) ist, oder (variabler Unterabschnitt)&sub3;, falls der Schritt Schritt (12) ist, an seinem 5'-Ende ein Hexanucleotid der Sequenz 5'- GAATAC-3' hat; und wobei das s'-Ende des ersten Primers das 5'-Nucleotid von (Promoter)&sub1; ist und das 5'-Ende des dritten Primers das 5'-Nucleotid von (Promoter)&sub3; ist.

51. Verfahren nach Anspruch 44, 45, 46, 47, 48 oder 49, wobei (A) (i) falls die erste DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA Polymerase die T7 oder T3 RNA-Polymerase ist, (variabler Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz 5'- GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' hat, und (variabler Unterabschnitt)&sub2; des zweiten Primers die Sequenz 5' CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' hat, oder (ii) falls die erste DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA Polymerase die SP6 DNA-Polymerase ist, (variabler Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz 5'- GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' hat und (variabler Unterabschnitt)&sub2; des zweiten Primers die Sequenz 5'- CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' hat; wobei (B) (i) falls die zweite DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA- Polymerase die T7 oder T3 RNA-Polymerase ist, (variabler Unterabschnitt)&sub3; die Sequenz 5'- GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' hat, (ii) falls die zweite DNA-abhängige Bakreriophagen-RNA-Polymerase die SP6 RNA-Polymerase ist, (variabler Unterabschnitt)&sub3; die Sequenz 5-GAATACGGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' hat, und der vierte Primer die 40 5'-terminalen Nucleotide 5'- CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' hat; und wobei (C) nach Schritt (12) die zweite RNA autokatalytisch mit Qβ Replicase repliziert wird.

52. Verfahren nach Anspruch 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 oder 49, wobei der Zielabschnitt ein Abschnitt des Genoms eines Human-Immundefizienz-Virus ist, das ein HIV-1 Virus ist, und wobei (1) (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz 5'- TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT-3' hat, (5'-Primer- Unterabschnitt)&sub2; die Sequenz 5'- ACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAG-3' hat, (3'-Primer- Unterabschnitt)&sub3; die Sequenz 5'-AAAGGTATCCTTTGAGCCAATTCCCATA- 3' hat und der vierte Primer die Sequenz 5'- AGTTGATACTACTGGCCTAATT-3' hat; oder (2) (3'-Primer- Unterabschnitt)&sub1; die Sequenz 5'- TTTCGTAACACTAGGCAAAGGTGGCTTTATC-3' hat, (5'-Primer- Unterabschnitt)&sub2; eine Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3' und 5'- ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3' (3'-Primer-Unterabschnitt)&sub2; die Sequenz 5'-ACTAATTCATCTGTATTACTTTGACTGTTTTTC-3' hat und der vierte Primer die Sequenz 5'- TTTTTTGGTGTTATTAATGCTGCTAGTGCC-3' hat.

53. Verfahren nach Anspruch 28, wobei (A) falls der Zielabschnitt ein DNA-Abschnitt ist, das Produkt aus Schritt (2) durch thermische Denaturierung in Einzelstränge überführt wird, sowohl die erste als auch zweite DNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Klenow Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, AMV reverser Transkriptase, klonierter MMLV reverser Transkriptase, Kalbsthymus-DNA-Polymerase alpha, hitzestabiler Thermus aquaticus DNA-Polymerase und klonierter T7 DNA-Polymerase mit der Markenbezeichnung SequenaseTM, und die erste DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus T7 RNA- Polymerase, T3 RNA-Polymerase und SP6 RNA-Polymerase; und (B) falls der Zielabschnitt ein RNA-Abschnitt ist, das Produkt aus Schritt (2) durch thermische Denaturierung in Einzelstränge überführt wird, die zweite DNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Klenow Fragment von E. coli DNA- Polymerase I, AMV reverser Transkriptase, klonierter MMLV reverser Transkriptase, Kalbsthymus-DNA-Polymerase alpha, hitzestabiler Thermus aquaticus DNA-Polymerase und klonierter T7 DNA-Polymerase mit der Markenbezeichnung SequenaseTM, die erste DNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus AMV reverser Transkriptase und klonierter MMLV reverser Transkriptase; und die erste DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA- Polymerase ausgewählt wird aus der T7 RNA-Polymerase, der T3 RNA-Polymerase und der SP6 RNA-Polymerase.

54. Verfahren nach Anspruch 53, wobei sowohl die erste als auch die zweite DNA-Polymerase ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus AMV reverser Transkriptase und klonierter MMLV reverser Transkriptase.

55. Verfahren nach Anspruch 54, wobei das 5'-Ende des ersten Primers das 5'-Nucleotid von (Promoter)&sub1; ist, wobei falls die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase die T7 RNA- Polymerase ist, der Unterabschnitt (Promoter)&sub1;-(variabler Unterabschnitt)&sub1; des ersten Primers die Sequenz 5'- TAATACGACTC- ACTATAGGGACGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' hat, wobei falls die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA- Polymerase die T3 RNA-Polymerase ist, der Unterabschnitt (Promoter)&sub1;-(variabler Unterabschnitt)&sub1; des ersten Primers die Sequenz 5'-TATTAACCCTCACTAAAGGGACGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGA- AGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' hat, wobei falls die DNA-abhängige Bakteriophagen-RNA-Polymerase die SP6 RNA-Polymerase ist, der Unterabschnitt (Promoter)&sub1;-(variabler Unterabschnitt)&sub1; des ersten Primers die Sequenz 5'- GAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATG- TATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATAGAATACCGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCG -AGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' hat, wobei (variabler Unterabschnitt)&sub2; die Sequenz 5'- TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGAGC-3' hat, und wobei nach Schritt (6) die erste RNA autokatalytisch mit Qβ Replicase repliziert wird.