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CN114127312A - 用于测定共济蛋白替代疗法的疗效的共济蛋白敏感性标志物 - Google Patents

用于测定共济蛋白替代疗法的疗效的共济蛋白敏感性标志物 Download PDF

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CN114127312A
CN114127312A CN202080048095.8A CN202080048095A CN114127312A CN 114127312 A CN114127312 A CN 114127312A CN 202080048095 A CN202080048095 A CN 202080048095A CN 114127312 A CN114127312 A CN 114127312A
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fsgms
fsgm
protein
replacement therapy
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Lalima Biomedical Co
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Abstract

本公开(至少部分)基于提供一组标志物，本文中也称为FXN‑敏感性基因组标志物(或FSGM)，其各自的表达水平与细胞中的共济蛋白(FXN)水平呈现正相关或负相关。因此，这些FSGM可用于确定、评估和/或监测受试者中FXN替代疗法的疗效。

Description

用于测定共济蛋白替代疗法的疗效的共济蛋白敏感性标志物
相关申请
本申请要求2019年4月30日提交的美国临时申请No.62/840,878的优先权，其全文通过引用明确地并入本文。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交并在此通过引用全文并入本文的序列表。创建于2020年4月30日的所述ASCII副本被命名为130197-00320_SL.txt，其大小为8,701字节。
背景技术
线粒体疾病是一组由功能失调的线粒体引起的病症，所述线粒体是以三磷酸腺苷(ATP)分子的形式储存潜在能量并存在于除成熟红细胞以外的人体的每种细胞中的细胞器。
弗里德赖希共济失调(FRDA)是人类中最常见的遗传性共济失调，其是由线粒体蛋白共济蛋白(frataxin)(FXN)(特别是人类共济失调蛋白(hFXN))的缺乏引起的。FRDA是一种预估发病率为1:29,000、携带频率约为1:85的罕见疾病，并且美国报告的病例约4,000-5,000。FRDA是一种进行性多系统疾病，其通常起始于儿童期中期。患者患有多种症状，其中包括进行性神经功能障碍和心功能障碍。其他临床表现可包括脊柱侧凸、疲劳、糖尿病、视力损伤和听力丧失。遗传是常染色体隐性遗传且主要由hFXN基因的两个等位基因的第一内含子中的遗传性GAA三联体扩增引起。这种三联体扩增引起FRDA基因的转录抑制，从而导致患者体内hFXN的非常少量的产生。hFXN杂合子通常具有正常的约50％的hFXN水平，但表型上是正常的。杂合子和患有FRDA的患者的全血中～45-70pg/μl和～5-25pg/μl的hFXN水平已被分别证明随时间推移是稳定的(Plasterer等，2013)。
目前，没有FDA批准的FRDA治疗方法。抗氧化剂和铁螯合并不是非常有效，而且，尽管进行了治疗，但是患者通常经历运动控制的进行性丧失和死亡，心肌病是死亡的主要原因。
蛋白替代疗法是代谢疾病(例如糖尿病、溶酶体贮积症和血友病)的公认方法。在源自患者的细胞模型和动物模型中的工作已经证实功能性FXN的替代可以纠正或改善FRDA疾病表型。但是，本领域需要可靠和有效的试验来测量FXN替代的临床反应和疗效。
发明内容
在一个方面，本公开(至少部分)基于提供一组标志物，本文中也称为FXN-敏感性基因组标志物(或FSGM)，其各自的水平与细胞中的共济蛋白(FXN)水平呈现正相关或负相关。在一些实施方案中，本公开的FSGM通过FXN基因消融随后FXN蛋白替代来进行相反地调节。因此，本公开的所述FSGM均与FXN替代反向相关的受试者中的FXN缺乏相关。本文公开的FSGM被发现对FXN敏感并被认为是FXN替代的标志物。
因此，如本文所述，这些FSGM可被用于确定、评估和/或监测受试者中FXN替代疗法的疗效。在一些实施方案中，基于受试者中FXN替代疗法的施用或开始之前和之后的一种或多种FSGM表达谱的分析可确定、评估和/或监测受试者中FXN替代疗法的疗效。基于FSGM表达谱分析的结果，可对受试者中的FXN替代疗法进行调整以例如开始、增加、减少或终止受试者中的FXN替代疗法。
本公开提供了一种用于评估FXN替代疗法的方法，其通过测定来自用FXN替代疗法治疗之前的FXN缺乏的患者的样品中的一种或多种FSGM的表达谱(“基线FXN(-)谱”)；测定来自用FXN替代疗法治疗之后的FXN缺乏的患者的样品中一种或多种FSGM的表达谱(“FXN替代谱”)；比较基线FXN(-)谱和FXN替代谱，并使用该比较确定FXN替代疗法的疗效。
在本公开的一个方面，测定FSGM的FXN表达谱包括确定指示FXN敏感性基因组标志物表达的值的FXN特征向量。无论样品是来自FXN健康受试者、来自FXN缺乏的患者或来自FXN替代疗法后的FXN缺乏的患者，FXN特征向量均可反映样品的FXN表达谱状态。
在另一个方面，本发明提供了一种用于评估共济蛋白(FXN)替代疗法的疗效的方法，所述方法包括：(a)测定来自用FXN替代疗法治疗后的FXN缺乏的患者的样品中的一种或多种FSGM的FXN替代表达谱；(b)比较所述患者FXN替代表达谱和基线FXN(-)表达谱；以及(c)使用所述比较确定所述FXN替代疗法的疗效；其中所述一种或多种FSGM是表2、表4和/或图3中定义的任何一种或多种标志物。
在一个实施方案中，该方法进一步包括测定来自FXN替代疗法之前的表现出FXN缺乏的患者的样品中一种或多种FXN-敏感性基因组标志物(FSGM)的基线FXN(-)表达谱。
在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括线粒体基因、EGR家族基因、胰岛素样基因、核糖体耗尽应答基因、线粒体能量产生基因、蛋白酶体调控基因、核糖体功能基因、呼吸链基因、心肌发育基因、大分子分解代谢基因、翻译起始基因、线粒体组分基因、氧化磷酸化基因、大分子分解代谢过程的负调控基因或凋亡过程的调控基因中的至少一种或多于一种的任何组合。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括编码分泌蛋白的基因或分泌蛋白(例如表2中定义的分泌蛋白)。在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括NR4A1、PTP4A1、ATF3、BTG2、EGR1、EGR2、EGR3、CYR61和ABCE1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括EGR1、EGR2、EGR3和IGF1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8和CYCS中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括OPS2、VBP1、PSMA3、SLIRP、CUL2、DCUN1D1、UBE2D3、ZNRF1、RNF2和LAMP2中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39、RPL38、RPS27L和ABCE1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3和CYCS中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括NR4A1、EGR1、EGR3、ADAMTS1、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2和CYR61中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括PSMA3、CUL2、UBE2D3、ZNRF1、RPS15A、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括ABCE1、RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8、CYCS、TMEM-126A、MAOA和ABCE1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6和MT-ATP8中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包含ABCE1、RPL26、RPL38、RPL10、RPL32、RPS15A、RPL24、RPL39、SLIRP、COPS2、DCUN1D1、RNF2、EGR1、BTG2、ATF3、PTGS2、IGF1、SERPINE1和THBS1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括RPL26、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2、RPL10、RPS27L、CYCS、ATF3、BTG2、EGR1、EGR3和CYR61中的一种或多种。
在一个实施方案中，一种或多种FSGM在用FXN替代疗法治疗后上调。
在一个实施方案中，在用FXN替代疗法治疗后上调的一种或多种FSGM是mt-RNR1、mt-RNR2、ADNP、AI480526、C230034O21RIK、CCDC85B、CCDC85C、CTCFL、NRTN、PDE4A、PHF1、RPL37RT、SLC26A10、SNORD17、SUV420H2、WNK2、YAM1或ZNRF1。
在一个实施方案中，一种或多种FSGM在用FXN替代疗法治疗后下调。
在一个实施方案中，在用FXN替代疗法治疗后下调的一种或多种FSGM是CYR61、mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CO2、mt-CO3、mt-ND1、mt-ND2、mt-ND3和mt-ND4、EGR1、EGR2、EGR3、IGF1、LAMP2或SLIRP。
在另一个实施方案中，测定FSGM的FXN表达谱包括确定指示FSGM表达的值的FXN特征向量。在一个实施方案中，所述方法包括使用比较确定FXN替代疗法的疗效，其中包括分别确定患者FXN替代表达谱和基线FXN(-)表达谱的第一和第二FXN特征向量，和确定特征向量之间的距离。
在一个实施方案中，确定特征向量之间的距离包括确定第一和第二特征向量的标积。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括确定健康受试者的FSGM的正常FXN表达谱的第三特征向量。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括确定第二和第三特征向量之间的距离。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括确定第一和第三特征向量之间的距离，和将所述第一和第三特征向量之间的距离针对所述第二和第三特征向量之间的距离标准化。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括使用标准化的距离确定FXN替代疗法的疗效。
在一个实施方案中，表达谱由样品RNA的测序、杂交或扩增中的任何一种测定。
在一个实施方案中，表达谱由HPLC/UV-Vis光谱、酶法分析、质谱法、NMR、免疫测定法、ELISA或其任何组合测定。
在另一个实施方案中，本发明的方法进一步包括当FXN替代疗法被指示为无效时，调整用FXN替代疗法的治疗。
在一个实施方案中，患者患有弗里德赖希共济失调(FRDA)。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括从表现出FXN缺乏的患者处获得生物样品。
在一个方面，本发明提供了一种用于测定FSGM表达谱的组合物，所述组合物包含用于表2、表4和/或图3中所述的至少一种或多种FSGM的检测的试剂。
在另一个方面，本发明提供了一种用于线粒体疾病的治疗方法，所述方法包括提供来自患有FXN缺乏的受试者的样品，测定所述样品中一种或多种FXN敏感性基因组标志物(FSGM)的FXN表达谱，比较样品的FXN表达谱和选自由一种或多种FSGM的正常FXN表达谱、一种或多种FSGM的基线FXN(-)表达谱和一种或多种FSGM的FXN替代表达谱组成的组中的至少一种其它表达谱，将样品FXN表达谱分类为对应于正常FXN表达谱、基线FXN(-)表达谱或FXN替代表达谱，和基于样品FXN表达谱的分类开始、增加或减少施用于受试者的FXN替代疗法的剂量。
在另一个方面，本发明提供了一种线粒体疾病的治疗方法，所述方法包括测定来自患有FXN缺乏的样品中一种或多种FXN敏感性基因组标志物(FSGM)的表达，其中所述一种或多种FSGM是表2、表4和/或图3中定义的任何一种或多种标志物，和基于所述一种或多种FSGM的表达开始、增加或减少施用于受试者的FXN替代疗法的剂量。
在一个实施方案中，所述方法包括提供或获得来自患有FXN缺乏的受试者的样品。
在一个实施方案中，线粒体疾病是弗里德赖希共济失调(FRDA)。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白。在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61。
在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括NR4A1、PTP4A1、ATF3、BTG2、EGR1、EGR2、EGR3、CYR61和ABCE1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括EGR1、EGR2、EGR3和IGF1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8和CYCS中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括OPS2、VBP1、PSMA3、SLIRP、CUL2、DCUN1D1、UBE2D3、ZNRF1、RNF2和LAMP2中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39、RPL38、RPS27L和ABCE1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3和CYCS中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括NR4A1、EGR1、EGR3、ADAMTS1、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2和CYR61中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括PSMA3、CUL2、UBE2D3、ZNRF1、RPS15A、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括ABCE1、RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8、CYCS、TMEM-126A、MAOA和ABCE1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6和MT-ATP8中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括ABCE1、RPL26、RPL38、RPL10、RPL32、RPS15A、RPL24、RPL39、SLIRP、COPS2、DCUN1D1、RNF2、EGR1、BTG2、ATF3、PTGS2、IGF1、SERPINE1和THBS1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括RPL26、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2、RPL10、RPS27L、CYCS、ATF3、BTG2、EGR1、EGR3和CYR61中的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测来自表现出共济蛋白(FXN)缺乏或正在接受FXN缺乏治疗的受试者的生物样品中的一种或多种共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)的试剂盒，其包含用于测量来自所述受试者的生物样品中的一种或多种FSGM的水平的一种或多种试剂，其中所述一种或多种FSGM包括选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM，和用于测量所述FSGM的水平的一组说明。
在一个实施方案中，试剂是与一种或多种共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)结合的抗体或与一种或多种FSGM的相应mRNA互补的寡核苷酸。
在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白。在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61。
在另一个方面，本发明提供了一种用于监测或评估共济蛋白(FXN)替代疗法的功效的方法的检测板(panel)，所述检测板包含一种或多种检测试剂，其中每种检测试剂对一种或多种共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)的检测具有特异性，其中所述一种或多种FSGM包括选自表2、表4和/或图3的一种或多种标志物。
在一个实施方案中，共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)包括至少两种或更多种FSGM。
在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白。在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的检测板和用于基于一种或多种共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)的水平获得与共济蛋白(FXN)替代疗法相关的信息的一组说明。
在另一个方面，本发明提供了一种通过使来自患有共济蛋白(FXN)缺乏的患者的生物样品或其部分与对一种或多种FSGM的检测具有特异性的一种或多种检测试剂接触来检测生物样品中的一种或多种共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)的方法，任选地其中所述患者正在接受FXN替代疗法治疗，其中所述一种或多种FSGM包括选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM。在一个实施方案中，样品与对一种或多种FSGM的检测具有特异性的一种或多种检测试剂接触。在另一个实施方案中，样品的一部分(例如分离的或纯化的核酸或蛋白质)可以与对一种或多种FSGM的检测具有特异性的一种或多种检测试剂接触。
在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白。在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61。
在讨论中，除非另有说明，否则修饰本公开的一个实施方案的一个或多个特征的条件或关系特征的形容词(例如“基本上”和“约”)应被理解为是指在对其预期的应用的实施方案的操作可接受的范围内对条件或特征的限定。除非另外指明，否则说明书和权利要求书中的词语“或”被认为是包含性的“或”(具有和/或的含义)，而不是排他性的或，并且表示其所连接的事项中的至少一个或任何组合。
提供本概要目的在于以简化形式介绍概念的选择，所述概念将在以下详细描述中进一步描述。本概要不旨在表明要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制要求保护的主题的范围。
附图说明
通过参考在本段之后列出的附图描述本公开的实施方案的非限制性示例。在多于一个附图中出现的相同的特征通常用与它们出现的所有附图中相同的标记来标注。
图1显示了根据本公开的实施方案，通过对来自表2的85个FXN-敏感性基因组标志物(FSGM)的蛋白质产物的预测相互作用的进行串分析(string analysis)产生的簇。
图2是显示正常真皮成纤维细胞(Norm_#23971)和FDRA患者来源的成纤维细胞(FA_#03816和FA_#68)中FXN水平的代表性的蛋白质印迹的照片。
图3是显示根据本公开的实施方案，用载体处理的FDRA-来源的成纤维细胞FA-GM03816、FA-GM04078、FA-4654和FA-4675中的基线FXN(-)表达谱和与正常成纤维细胞对照N-GM07522和N-GM23971比较的图表。
图4A是显示FRDA患者来源的成纤维细胞中基因表达分析的图表，其表明相比于正常成纤维细胞，FRDA患者来源的成纤维细胞中EGR1、EGR2、EGR3和IGF1整体上调。图4B是显示根据本公开的实施方案，相比于载体处理的细胞，实施例1中描述的FXN融合蛋白对FDRA来源的成纤维细胞FA-68中hFXN、EGR1、EGR2、EGR3和IGF1的表达的影响的图表。
图5是根据本公开的实施方案，用于评估FXN诱导的签名的过程的示意图。
图6是显示FXN敲低(KD)HK293克隆A2和A6以及乱序对照克隆中FXN蛋白量的蛋白质印迹的照片。图6还显示了表示蛋白质印迹中FXN蛋白量的定量结果的表格。
图7是显示来自用载体(黑色条)或FXN融合蛋白(灰色条)处理的FXN-KD和乱序对照HEK293细胞的培养基中CYR61蛋白量的柱状图。
图8是显示来自用空载体转染的乱序对照细胞(KD-SRBL+V)；用hFXN转染的乱序对照细胞(SRBL5+hFXN)；用空载体转染的hFXN-KD细胞(KD-FXN+V)；和用hFXN转染的hFXN-KD细胞(KD-FXN+hFXN)的培养基中的CYR61蛋白量的柱状图。
图9是显示WT小鼠ES克隆和用对照或诱导FXN敲除的试剂(敲除剂)处理的纯合小鼠ES克隆B9-46中按照总细胞蛋白的FXN蛋白量的柱状图。
图10A是显示用对照试剂或诱导FXN基因敲低的试剂处理的小鼠ES B9细胞中表达的CYR61量的柱状图。图10B是显示来自用对照试剂或诱导FXN基因敲低的试剂处理的小鼠ES B9细胞的培养基中分泌的CYR61蛋白的量的柱状图。
具体实施方式
A.概述
在一个方面，本公开(至少部分)基于提供一组标志物，本文中也称为FXN-敏感性基因组标志物(或FSGM)，其各自的水平与细胞中的共济蛋白(FXN)水平呈现正相关或负相关。在一些实施方案中，本公开的FSGM通过FXN基因消融随后FXN蛋白替代来进行相反地调节。因此，本公开的所述FSGM均受试者中的FXN缺乏相关且与FXN替代反向相关。本文公开的FSGM被发现对FXN敏感并被认为是FXN替代的标志物。因此，如本文所述，这些FSGM可用于确定和/或监测受试者中FXN替代疗法的疗效。在一个实施方案中，FSGM包括选自表2、表4和/或图3的一个或多个标志物。在一个实施方案中，FSGM包括分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白。在一个实施方案中，FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。在另一个实施方案中，FSGM包括CYR61。
在一些实施方案中，基于受试者中FXN替代疗法的施用或开始之前和之后的一种或多种FSGM表达谱的分析可确定、评估和/或监测受试者中FXN替代疗法的疗效。基于FSGM表达谱分析的结果，可对受试者中的FXN替代疗法进行调整以例如开始、增加、减少或终止受试者中的FXN替代疗法。。
B.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。以下参考文献(其通过全文引用方式并入本文)为本领域技术人员提供本发明所用的许多术语的一般定义(除非本文另外定义)：Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary ofScience and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger等(eds.),Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham,the Harper CollinsDictionary of Biology(1991)。通常，本文所描述或固有的分子生物学方法的步骤等是本领域内的常用方法。这样的标准技术可以在参考手册中找到，例如Sambrook等，(2000,Molecular Cloning--A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring HarborLaboratories)；和Ausubel等，(1994,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,New-York)。
除非另外定义，否则以下术语可具有下文赋予其的含义。但是，应当理解，本领域内技术人员已知或理解的其它含义也是可能的，并且在本发明的范围内。
如本文所用，除非上下文另有明确说明，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。本文使用的所有技术和科学术语具有相同的含义。
除非具体说明或从上下文明显看出，如本文所用，术语“约”应被理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可被理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非上下文另有说明，本文提供的所有数值可以被该术语约修饰。
如本文所用，术语“扩增”是指用于获得靶核酸序列或其互补序列或其片段的多个拷贝(“扩增子”)的任何已知体外过程。体外扩增是指可包含少于完整靶区域序列或其互补序列的扩增的核酸的产生。已知的体外扩增方法包括：例如，转录介导的扩增、复制酶介导的扩增、聚合酶链式反应(PCR)扩增、连接酶链反应(LCR)扩增和链替代扩增(SDA，包括多链替代扩增方法(MSDA)。复制酶介导的扩增使用自我复制RNA分子和复制酶(例如Q-β-复制酶)(例如Kramer等，美国专利No.4,786,600)。PCR扩增是众所周知的，其使用DNA聚合酶、引物和热循环来合成DNA或cDNA的两条互补链的多个拷贝(例如，Mullis等，美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159)。LCR扩增使用至少四种单独的寡核苷酸以通过使用杂交、连接和变性的多个循环来扩增靶标和其互补链(例如，EP专利申请公布号0320308)。SDA是一种其中引物包含限制性核酸内切酶的识别位点的方法，所述识别位点允许核酸内切酶切割包括靶序列的半修饰DNA双链体的一条链，随后在一系列引物延伸和链置换步骤中进行扩增(例如Walker等，美国专利No.5,422,252)。其它两种已知的链替代扩增方法不需要核酸内切酶切割(Dattagupta等，美国专利No.6,087,133号和美国专利No.6,124,120(MSDA))。本领域技术人员将理解，本发明的寡核苷酸引物序列可容易地用于基于通过聚合酶进行引物延伸的任何体外扩增方法。(一般参见Kwoh等，1990,Am.Biotechnol.Lab.8:14-25和Kwoh等，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173-1177；Lizardi等，1988,BioTechnology 6:1197-1202；Malek等，1994,Methods Mol.Biol.,28:253-260；和Sambrook等，2000,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Third Edition,CSHLaboratories)。如本领域众所周知的，寡核苷酸被设计为在选定条件下结合互补序列。
如本文所用，术语“标志物”或“生物标志物”是生物分子或生物分子组，其表达水平与FXN水平相关，例如正相关或负相关。
如本文所用，各自水平与细胞中的共济蛋白(FXN)水平正相关或负相关的本发明的标志物或生物标志物被称为“共济蛋白敏感性基因组标志物”或“FSGM”。在一些实施方案中，本公开的FSGM是通过FXN基因消融随后FXN蛋白替代来进行相反地调节。因此，在一些实施方案中，本公开的所述FSGM与受试者中的FXN缺乏相关和与FXN替代反向相关。本发明的FSGM可用于检测和/或监测样品(例如细胞或组织样品)中的FXN水平。在优选的实施方案中，FSGM选自表2、表4或图3中所列的那些，表2中的人基因和蛋白质以及表2中的基因和蛋白质的人同源物。如本文所用，对的表2、表4和图3中的FSGM的引用应理解为包括对其任何突变体、变体、衍生物或其直系同源物的引用。
如本文所用，术语“对照样品”或“对照”是指任何临床相关的比较样品，包括例如来自FXN健康受试者(即具有正常FXN水平的受试者)的样品、正常FXN表达谱、来自FXN缺乏受试者(即完全或部分缺乏FXN表达的受试者)的样品、基线FXN(-)表达谱、或来自FXN替代疗法之后的受试者的样品或FXN替代表达谱。对照样品也可以是来自较早时间点(例如在用FXN替代疗法治疗之前)的受试者的样品。对照样品可以是通过试剂盒提供的纯化的样品、蛋白质和/或核酸。这样的对照样品可例如以系列稀释被稀释，以允许测试样品中的分析物(例如标志物)的水平的定量测量。对照样品可包括源自一个或多个受试者的样品。对照样品也可以是在较早时间点从待评估的受试者中制备的样品。例如，对照样品可以是在用FXN替代疗法治疗之前从待评估的受试者处获取的样品。对照样品也可以是来自动物模型、或来自源自线粒体疾病(例如FRDA)的动物模型的组织或细胞系的样品。对照样品中一种或多种FSGM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9种或更多种FSGM)的活性或表达的水平由一组可被测定的测量值组成，如基于任何合适的统计测量，例如，包括平均值、中位值或众数值的集中趋势的测量。在一个实施方案中，“与对照不同”优选统计学上与对照显著不同。
如本文所用，“变化的、改变的、增加的或减少的”应理解为相比于对照样品或阈值(例如来自FXN健康受试者(即具有正常FXN水平的受试者)，或来自FXN缺乏受试者(即缺乏FXN表达的受试者)的样品)，具有在统计学上不同(例如增加的或减少的)的水平的可被检测的一种或多种FSGM的水平。与对照或阈值相比，变化的、改变的、增加的或减少的还可包括随时间获得的一系列至少两个受试者样品中获得的一种或多种FSGM的水平的变化率的差异。统计显著性的确定在本领域技术人员的能力范围内，并且可包括用于确定和/或测量统计显著性的任何可接受的方式，例如构成阳性或阴性结果的平均值的标准差的数目，样品中FSGM的检测水平相对于对照的提高，其中所述提高高于某个阈值，或样品中FSGM的检测水平相对于对照的降低，其中所述降低低于某个阈值。
如本文所用，“检测(detecting)”、“侦测(detection)”、“测定”等应理解为是指对选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM的存在和/或水平的鉴定。
如本文所用，术语“DNA”或“RNA”分子或序列(以及有时术语“寡核苷酸”)是指通常由脱氧核糖核苷酸腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和/或胞嘧啶(C)组成的分子。在“RNA”中，T被尿嘧啶(U)取代。
本文所用的术语“FXN缺乏患者”和“FXN缺乏受试者”是指与正常对照受试者相比，FXN表达或活性的水平降低的受试者。某些疾病导致患者缺乏FXN，包括线粒体疾病，例如弗里德赖希共济失调(FRDA)。
如本文所用，术语“FXN替代疗法”是指受试者中共济蛋白的替代，其导致受试者中的共济蛋白的表达或活性升高。FXN替代疗法可通过FXN蛋白递送或通过将编码FXN的核酸递送至受试者进行。向受试者递送FXN蛋白可包括FXN蛋白的递送或FXN融合蛋白的递送。如本文所用，术语“FXN融合蛋白”是指与不同蛋白质的全长或片段或与肽融合的全长FXN或FXN片段。在一些实施方案中，如本文所述，FXN融合蛋白包含全长hFXN(SEQ ID NO：1)或成熟hFXN(SEQ ID NO：2)。在一些实施方案中，FXN蛋白或其片段与细胞穿透肽(CPP)融合。在一些实施方案中，CPP是HIV-TAT多肽。
如本文所用，术语“病症”、“疾病”和“异常状态”被包含地使用并指与身体的任何部分、器官或系统(或其任何组合)的正常结构或功能的任何偏离。具体的疾病表现为特征性症状和体征，其中包括生物、化学和物理变化，并且通常与各种其它因素相关，所述因素包括但不限于人口统计学、环境、就业、遗传和医学史因素。早期疾病状态包括其中一种或多种身体症状尚未检测到的状态。某些特征性体征、症状和相关因素可通过各种方法定量以产生重要的诊断信息。
如本文所用，术语“线粒体疾病”是指由mtDNA或nDNA中的遗传性或自发性突变引起的疾病，其导致通常存在于线粒体中的蛋白质或RNA分子的功能改变，其减弱线粒体的功能以诱导例如中枢神经系统、骨骼肌、心脏、眼睛、肝脏、肾脏、大肠(结肠)、小肠、内耳和胰腺，以及血液、皮肤和内分泌腺中的各种类型的疾病。在一个非限制性实施方案中，线粒体疾病是弗里德赖希共济失调(FRDA)。
如本文所用，在“较早时间点”获得的样品是在过去足够的时间获得的样品，可在从较早时间点的样品中获得相比于较晚时间点的临床相关信息。在某些实施方案中，较早时间点是早至少1、2，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时，或1、2、3、4、5、6或7天。在一些实施方案中，较早时间点是早至少一周、两周、三周或四周。在某些实施方案中，较早时间点是早至少六周。在某些实施方案中，较早时间点是早至少两个月。在某些实施方案中，较早时间点是早至少三个月。在某些实施方案中，较早时间点是早至少六个月。在某些实施方案中，较早时间点是早至少九个月。在某些实施方案中，较早时间点是早至少一年。可随时间以规律的或无规律的间隔获得多个受试者样品(例如，3、4、5、6、7或更多)，并分析FSGM水平变化的趋势。本领域技术人员基于常规考虑可确定用于特定受试者测试的适当间隔。
本文所用术语“表达”是指从DNA产生多肽的过程。该过程涉及基因转录为mRNA和该mRNA翻译为多肽。根据上下文，所使用的“表达”可指RNA或蛋白质或两者的产生。
术语“表达谱”被用于包括基因组表达谱，其指RNAs的表达谱，或特别是mRNAs或转录物的表达谱，或蛋白表达谱。如本文所用，表达谱可指针对mRNA表达获得的一组数据。它可指从例如PCR装置的读数中的原始数据，或指标准化的表达值。表达谱可通过用于测量核酸序列水平的任何方便的手段来测定，例如mRNA、标记的mRNA、扩增的mRNA、cDNA等的定量杂交，定量PCR，以及本领域技术人员已知的或本文描述的其他技术。表达谱使得能够进行两种或多种样品之间、样品和对照之间以及样品和阈值之间的差异基因表达的分析。表达谱也可以通过本领域技术人员已知的或本文描述的用于测量蛋白质或多肽水平的任何手段来测定，例如质谱法、免疫检测分析(例如ELISA)等。
如本文所指，术语“FXN表达谱”包括以下三种FXN表达谱中的任何一种：正常FXN表达谱、基线FXN(-)表达谱或FXN替代表达谱。如本文所用，基线FXN(-)表达谱也可称为FSGM表达的“阈值水平”。基线FXN(-)表达谱也可用作对照。
如本文所指，术语“正常FXN谱”是指来自正常患者(即非FXN缺乏患者)的样品中一种或多种FSGM的表达谱。
如本文所指，术语“基线FXN(-)谱”是指来自用FXN替代疗法治疗之前的FXN缺乏患者的样品中一种或多种FSGM的表达谱。
如本文所指，术语“FXN替代谱”是指来自用FXN替代疗法治疗后的FXN缺乏患者的样品中一种或多种FSGM的表达谱。
FSGM的“更高表达水平”、“更高水平”、“提高的水平”等是指测试样品的表达水平高于用于评估表达的试验的标准误差，并且优选地比对照样品(例如，来自健康受试者的样品，来自FXN缺乏受试者的样品，或来自FXN替代疗法后的受试者的样品)中FSGM表达水平以及优选的一些对照样品中的FSGM或FSGMs的平均表达水平高至少25％、高至少50％、高至少75％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
如本文所用，如在“核酸杂交”中的术语“杂交”一般是指具有互补碱基序列的两个单链核酸分子的杂交，其在适当条件下将形成热力学上有利的双链结构。杂交条件的实例可以在上述两个实验室手册中找到(Sambrook等，2000，同上；和Ausubel等，1994，同上；或进一步在Higgins和Hames(Eds.)"Nucleic acid hybridization,a practical approach"IRL Press Oxford,Washington D.C.,(1985)中)，并且是本领域众所周知的。在与硝化纤维素滤膜(或其他这种支持物，例如尼龙)杂交的情况下，如例如在众所周知的DNA印迹过程中，硝化纤维素滤膜可在所需要的严格条件典型的温度下(对于高严格条件为60-65℃，对于中等严格条件为50-60℃并且对于低严格条件为40-45℃)与含有高盐(6xSSC或5xSSPE)、5xDenhardt’s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA(例如鲑鱼精子DNA)的溶液中标记的探针孵育过夜。然后在考虑到所需要的严格程度选择的温度下：室温(低严格程度)、42℃(中等严格程度)或65℃(高严格程度)，在0.2xSSC/0.1％SDS中通过多次洗涤将非特异性结合的探针从滤膜上被洗掉。洗涤溶液中盐和SDS的浓度也可调节以适应所需要的严格程度。选择的温度和盐浓度基于DNA杂交体的解链温度(Tm)。当然，RNA-DNA杂合体也可形成且被检测。在这种情况下，杂交和洗涤的条件可根据本领域内技术人员众所周知的方法进行调整。优选地使用严格条件(Sambrook等，2000，同上)。如本领域众所周知的，也可以使用采用不同退火和洗涤溶液的其他方案或可商购的杂交试剂盒(例如，来自BD BiosciencesClonetech的
Figure BDA0003444474690000191
)。众所周知，探针的长度和待测定核酸的组成构成杂交条件的其它参数。值得注意的是，上述条件的变化可通过杂交实验中包括和/或替换用于抑制背景的替代封闭剂来实现。典型的封闭剂包括Denhardt’s试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑鱼精子DNA和可商购的专用制剂。由于相容性的问题，包含特定封闭剂可能需要上述杂交条件的改变。杂交核酸分子也包括上述分子的片段。而且，与任何上述核酸分子杂交的核酸分子也包括这些分子的互补片段、衍生物和等位基因变体。此外，杂交复合物是指通过在互补的G和C碱基之间以及在互补的A和T碱基之间的氢键的形成在两个核酸序列之间形成的复合物；这些氢键可以通过碱基堆积相互作用进一步稳定。两个互补核酸序列以反平行构型氢键结合。杂交复合物可以在溶液中形成(例如Cot或Rot分析)或在溶液中存在的一个核酸序列和固定在固体支持物(例如膜、滤膜、芯片，针或载玻片，例如细胞已经固定其上)上的另一种核酸序列之间形成。
如本文所用，在两个或更多个核酸或氨基酸序列的背景下，术语“同一的”或“百分比同一性”是指当在比较的窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应性时，相同的或具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列(例如，60％或65％同一性，优选70-95％同一性，更优选至少95％同一性)，如使用本领域内已知的序列比较算法测量，或通过人工比对和目测检查。具有例如60％至95％或更高的序列同一性的序列被认为是基本上相同的。这种定义也适用于测试序列的互补序列。优选地，所述同一性存在于长度为至少约15至25个氨基酸或核苷酸的区域上，更优选地，存在于长度为约50至100个氨基酸或核苷酸的区域上。如本领域内众所周知的，本领域技术人员将知道如何使用例如算法(例如基于CLUSTALW计算机程序(Thompson Nucl.Acids Res.2(1994),4673-4680)或FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990),237-245)的那些)确定序列之间/之中的百分比同一性。尽管FASTDB算法在其计算中通常不考虑序列中的内部非匹配缺失或添加(即缺口)，但这可手动校正以避免％同一性的过高估计。但是，CLUSTALW在其同一性计算中确实考虑了序列缺口。本领域技术人员也可使用BLAST和BLAST 2.0算法(Altschul Nucl.AcidsRes.25(1977),3389-3402)。用于核酸序列的BLASTN程序默认使用11的字长(W)，10的期望值(E)，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用3的字长(W)，10的期望值(E)。BLOSUM62打分矩阵(Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89,(1989),10915)使用50的比对(B)，10的期望值(E)，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。此外，本发明还涉及核酸分子，其序列与上述杂交分子的序列的比较是简并的。当根据本发明使用术语“因遗传密码的结果而简并”时，是指由于遗传密码的冗余，不同的核苷酸序列编码相同的氨基酸。本发明还涉及包含一个或多个突变或缺失的核酸分子，和与本文所述核酸分子中的一个杂交的核酸分子，所述核酸分子显示突变或缺失。
本文所用术语“包括”是指短语“包括但不限于”，并可与其互换使用。
如本文所用，“标记”是指可被检测或可导致可检测信号的分子部分或化合物。标记被直接或间接地连接至分子(例如抗体)、核酸探针或待检测的蛋白质/抗原或核酸(例如，扩增的序列)。直接标记可通过将标记连接至核酸的键或相互作用(例如，共价键或非共价相互作用)发生，而间接标记可以通过使用“接头”或桥接部分(例如寡核苷酸或小分子碳链)发生，其被直接或间接标记。桥接部分可放大可检测信号。标记可包括任何可检测的部分(例如，放射性核素，配体如生物素或抗生物素蛋白，酶或酶底物，反应基团，发色团如染色的或有色颗粒，包括生物发光、磷光或化学发光化合物的发光化合物、和荧光化合物)。优选地，标记的探针上的标记在均相测定系统中(即在混合物中)是可检测的，相比于未结合的标记，结合的标记表现出可检测的变化。
术语“基因的表达水平”、“基因表达水平”、“FSGM水平”等是指细胞中该基因编码的mRNA以及前mRNA新生转录物、转录加工中间体、成熟mRNA和降解产物的水平，或蛋白质的水平。一种或多种FSGM的“水平”是指样品中FSGM的绝对或相对数量或浓度。
FSGM的“较低表达水平”或“较低水平”或“降低的水平”等是指测试样品中的表达水平低于对照样品(例如，来自健康受试者的样品，来自FXN缺乏受试者的样品或来自FXN替代疗法后的受试者的样品)中FSGM的表达水平，并且优选多个对照样品中FSGM的平均表达水平的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％。
如本文所用，“核酸分子”或“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物，包括FSGM。其非限制性示例包括DNA(例如基因组DNA、cDNA)，RNA分子(例如mRNA)及其嵌合体。核酸分子可通过克隆技术或合成获得。DNA可以是双链或单链的(编码链或非编码链[反义])。常规的核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)被包括在术语“核酸”和多核苷酸中，其类似物也是如此。核酸骨架可包含本领域已知的各种连接键，其中包括糖-磷酸二酯连接、肽-核酸键(称为“肽核酸”(PNA)；Hydig-hielsen等，PCT国际公开号WO95/32305)、硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接或其组合中的一种或多种。核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代的类似化合物，例如2’甲氧基取代(含有2’-O-甲基呋喃核糖基部分；参见PCT No.WO98/02582)和/或2’卤化物取代。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)、其已知的类似物(例如肌苷或其他；参见The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36,Adams等，ed.,11thed.,1992)、或嘌呤或嘧啶碱基的已知衍生物(参见Cook，PCT国际公开号WO93/13121)或“无碱基”残基，其主链不包含一个或多个残基的含氮碱基(Arnold等，美国专利No.5,585,481)。核酸可仅包含常规糖、碱基和连接键，如在RNA和DNA中发现的，或可包括常规的组分和取代(例如，通过甲氧基主链连接的常规碱基，或包含常规碱基和一种或多种碱基类似物的核酸)。通常理解和本文使用的“分离的核酸分子”是指核苷酸的聚合物，且其包括但不限于DNA和RNA。“分离的”核酸分子自其天然体内状态纯化，通过克隆或化学合成获得。
如本文所用，“寡核苷酸”或“寡聚体(oligos)”定义了一种具有两个或更多个核苷酸(核糖或脱氧核糖核苷酸)的分子。寡核苷酸的大小将由特定的情况和最终地其特定用途决定，并可由本领域内技术人员相应地调整。根据众所周知的方法，寡核苷酸可以通过化学合成或通过克隆衍生获得。尽管它们通常是单链形式，但它们也可以是双链形式，甚至包含“调控区”。它们可以包含天然稀有的或合成的核苷酸。它们可被设计为增强选定的标准，例如稳定性。脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合体也在本发明的范围内。
如本文所用，“一种或多种”应理解为涵盖1、2，3、4、5、6、7、8、9、10和大于10的任何值的每个值。
除非上下文明确指出，本文所用术语“或”包含性地用于表示术语“和/或”，并且与其互换使用。
如本文所用，“患者”或“受试者”可以指人或非人动物，优选哺乳动物。“受试者”是指任何动物，其中包括马、狗、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼和鸟。人类受试者可称为患者。
如本文所用，“探针”是指包括核酸寡聚物或寡核苷酸，其在促进杂交的条件下与核酸或其互补链中的靶序列特异性杂交，从而允许靶序列或其扩增核酸的检测。检测可以是直接的(即，由探针与靶标或扩增序列直接杂交产生)或间接的(即，由探针与将探针连接至靶标或扩增序列的中间分子结构杂交产生)。探针的“靶标”通常是指通过标准氢键或“碱基配对”与探针序列的至少一部分特异性杂交的扩增的核酸序列(即，扩增序列的子集)内的序列。“充分互补”的序列允许探针序列与靶序列稳定杂交，即使这两个序列不完全互补。探针可以是标记的或未标记的。探针可通过特定DNA序列的分子克隆产生，或者它也可以合成。在本发明的背景下可设计和使用的多种引物和探针可以由本发明所属领域的本领域内技术人员容易地确定。
如本文所用，FSGM的“参考水平”可以是FSGM的绝对或相对量或浓度、FSGM的存在或不存在、FSGM的量或浓度的范围、FSGM的最小和/或最大量或浓度，FSGM的平均量或浓度和/或FSGM的中值量或浓度；且此外，FSGM的组合的“参考水平”也可以是两种或更多种FSGM相对于彼此的绝对或相对量或浓度的比率。用于特定疾病状态、表型或其缺乏的FSGM的适合的阳性和阴性参考水平可通过测量一个或多个适合的受试者中所需的FSGM的水平来测定，并且这样的参考水平可以针对受试者的特定群体来定制(例如，参考水平可以是年龄匹配的，以便可以在来自特定年龄的受试者的样品中的FSGM水平与特定年龄组中的特定疾病状态、表型或其缺乏的参考水平之间进行比较)。这样的参考水平也可以针对用于测量生物样品中FSGM的水平的特定技术(例如，LC-MS、GC-MS等)来定制，其中FSGM的水平可以基于所使用的特定技术而不同。
如本文所用，“样品”或“生物样品”包括从任何来源获得的样本或培养物。在一些实施方案中，样品包括包含可分析FXN表达谱的细胞的任何样本或培养物。在一些实施方案中，样品包括来自缺乏FXN的受试者或正在接受FXN替代疗法治疗的受试者的任何样本或培养物。例如，生物样品可以获自体液样品，例如血液(包括任何血液制品，例如全血、血浆、血清或血液的特定类型的细胞)、尿、唾液或精液，或固体组织样品，例如皮肤活检样品、皮肤带、毛囊、肌肉活检样品，或者可替代样品可以是口腔样品。或者，样品可包含为测试FSGM转录物而收获的外泌体。
如本文所用，当短语“特异性结合”或“特异性地结合”用于指抗体与蛋白质或肽的相互作用时，是指该相互作用依赖于蛋白质上特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在；换句话说，该抗体识别并结合于特定的蛋白结构而不是一般地蛋白质。例如，如果抗体对表位“A”具有特异性，在包含标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的，未标记的A)的蛋白质的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
术语“例如”在本文中用于表示短语“例如但不限于”，并可与其互换使用。
“转录的多核苷酸”或“核苷酸转录物”是与成熟mRNA的全部或部分互补或具有高百分比同一性(例如，至少80％同一性)的多核苷酸(例如，mRNA、hnRNA、cDNA，或此类RNA或cDNA的类似物)，所述成熟mRNA通过本发明的FSGM的转录和RNA转录物的正常转录后加工(例如，剪接)(如果有的话)以及RNA转录物的反转录产生。
本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其它组合物和方法中的一种或多种结合。
本文提供的范围应理解为该范围内的所有值的简写。例如，1至50的范围应理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50组成的组中的任何数字、数字的组合或子范围。
现在将详细说明本发明的示例性实施方案。虽然将结合示例性实施方案描述本发明，但是应当理解，这并不旨在将本发明限制于这些实施方案。相反，它旨在覆盖如所附权利要求所述的本发明的本质和范围可能包括的备选方案、更改和等同物。
C.本发明的FSGM
在一个方面，本发明提供了用于确定、评估和/或监测FXN替代疗法的疗效的方法，其包括测定：(i)来自用FXN替代疗法治疗之前的FXN缺乏患者的样品中一种或多种FSGM的基线FXN(-)表达谱；和(ii)测定来自用FXN替代疗法治疗后的FXN缺乏的患者的样品中FSGM的患者FXN替代表达谱；比较患者FXN替代表达谱和基线FXN(-)表达谱；以及使用所述比较来确定所述FXN替代疗法的疗效。基于FSGM表达谱分析的结果，可对受试者中的FXN替代疗法进行调整以例如开始、增加、减少或终止受试者中的FXN替代疗法。
本公开的另一方面涉及提供一种用于鉴定一种或多种FSGM的方法，所述FSGM是其表达对细胞中FXN水平敏感的标志物。该方法包括测定来自具有正常FXN水平的健康受试者的样品中的表达谱，本文称为正常FXN表达谱；测定来自具有缺乏的FXN水平的受试者的样品中的表达谱，本文称为基线FXN(-)表达谱；和比较正常FXN表达谱和基线FXN(-)表达谱；其中基线FXN(-)表达谱中相比于正常FXN表达谱其表达改变的标志物是FSGM。此外，或可选地，用于测定FSGM的方法可包括从来自在FXN替代疗法之前和之后的FXN缺乏的受试者的样品中获得的表达谱的比较。FXN替代疗法后的FXN缺陷受试者的样品的基因表达谱在本文中也称为FXN替代表达谱。举例来说，本文的表2、表4和图3示出了通过本公开的实施方案的方法测定的FSGM。
本发明的FSGM包括但不限于表2、表4和/或图3的FSGM中的任何一种或多于一种的任何组合。在本发明的一些实施方案中，本领域已知的测量FXN表达或FXN替代疗法的其它标志物可与本发明的方法结合使用。
如本文所用，术语“一种或多种FSGM”旨在表示例如选自表2、表4和/或图3中的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种)FSGM。本文提供的方法、试剂盒和检测板包括例如选自表2、表4和/或图3的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种FSGM中的一种或任何组合。
在一些实施方案中，本发明的一种或多种FSGM包括选自表2、表4和/或图3的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)分泌蛋白，即表2中列出的能够由细胞分泌的蛋白。例如，FSGM CYR61是一种分泌蛋白。作为分泌蛋白的其它FSGM包括例如ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE、STC1和THBS1。从细胞分泌的FSGM的表达水平可以使用例如用于检测本发明的多肽FSGM的任何合适的方法或本文所述的任何蛋白质检测方法来测量。在某些实施方案中，检测方法是免疫检测方法，例如ELISA，其涉及特异性结合一种或多种分泌蛋白(例如表2中定义的分泌蛋白)的抗体。
在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括表2中定义的分泌蛋白，其单独或与选自表2、表4和/或图3的一种或多种其他FSGM的组合。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61，其单独或与选自表2、表4和/或图3的一种或多种其他FSGM的组合。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1中的一种或多种，其单独或与选自表2、表4和/或图3的一种或多种其他FSGM的组合。
CYR61也称为细胞通讯网络因子1(CCN1)、胰岛素样生长因子结合蛋白10、富半胱氨酸血管生成诱导因子61、IGF结合蛋白10、CCN家族成员1、蛋白CYR61、IGFBP-10、IGFBP10、IBP-10、GIG1、富半胱氨酸肝素结合蛋白61、富半胱氨酸血管生成诱导物61、富半胱氨酸丰血管生成诱导剂61和蛋白GIG1。通过CYR61基因编码的分泌蛋白是生长因子诱导的且促进内皮细胞的粘附。该蛋白与几种整联蛋白和与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用。它还作为SERPINE1、EGR2、NR4A1和THBS之间的连接发挥作用，并在这些基因的途径中发挥功能。该蛋白还在细胞增殖、趋化性、血管生成、细胞粘附、分化、血管生成、细胞凋亡和细胞外基质形成中起作用。与CYR61相关的疾病包括Wilms肿瘤5和横纹肌肉瘤。CYR61可与α6和β1整联蛋白异二聚体(其已被证明调节雪旺细胞与轴突的相互作用并在周围神经损伤后促进轴突再生)结合，因此潜在地抑制该过程(Chang等，Neuroscience2018，371:4-59)。
表2所列的每一种FSGM(或其人类同源物)的核苷酸和氨基酸序列的示例性GenBank登录号被列于下表4中。这些GenBank登录号通过引用方式以在本申请的最早有效申请日可获得的版本并入。AI480526、C230034O21Rik、D130020L05Rik和Rp137rt为没有人类同源物的小鼠基因，因此这些基因未出现在表4中。
应当理解，本发明的FSGM包括表2中所列的基因和蛋白质的人同源物。
Figure BDA0003444474690000281
Figure BDA0003444474690000291
在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括NR4A1、PTP4A1、ATF3、BTG2、EGR1、EGR2、EGR3、CYR61和ABCE1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括EGR1、EGR2、EGR3和IGF1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8和CYCS中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括OPS2、VBP1、PSMA3、SLIRP、CUL2、DCUN1D1、UBE2D3、ZNRF1、RNF2和LAMP2中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述一种或多种FSGM包括RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39、RPL38、RPS27L和ABCE1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3和CYCS中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括NR4A1、EGR1、EGR3、ADAMTS1、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2和CYR61中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括PSMA3、CUL2、UBE2D3、ZNRF1、RPS15A、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述一种或多种FSGM包括ABCE1、RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8、CYCS、TMEM-126A、MAOA和ABCE1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6和MT-ATP8中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述一种或多种FSGM包括ABCE1、RPL26、RPL38、RPL10、RPL32、RPS15A、RPL24、RPL39、SLIRP、COPS2、DCUN1D1、RNF2、EGR1、BTG2、ATF3、PTGS2、IGF1、SERPINE1和THBS1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括RPL26、THBS1，SERPINE1、IGF1、PTGS2、RPL10、RPS27L、CYCS、ATF3、BTG2、EGR1、EGR3和CYR61中的一种或多种。
举例来说，FXN表达谱可通过至少一种FSGM或多于一种FSGM的任何组合的表达水平的测量来测定。如本文所用，FSGM包括表2、表4和/或图3中列出的FSGM中的任何一种或多种。FSGM还包括编码分泌蛋白(例如表2中定义的分泌蛋白)的基因(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1或THBS1)、线粒体基因、EGR家族基因、胰岛素样基因、核糖体耗尽应答基因、线粒体能量产生基因、蛋白酶体调控基因、核糖体功能基因、呼吸链基因、心肌发育基因、大分子分解代谢基因、翻译起始基因、线粒体组分基因、氧化磷酸化基因、大分子代谢过程的负调控基因和凋亡过程的调控基因或由这些基因中的任何一个编码的蛋白质中的任何一种或多种。
在下文中，表达谱也可以被称为签名。
在本公开的一个实施方案中，基线FXN(-)表达谱可包括如表2中通过“KO(敲除)vs.WT(野生型)”中的倍数调整所示的和/或图3中的表达模式。
在本公开的一个实施方案中，基线FXN(-)表达谱包括至少一种或多于一种FSGM(例如表2、表4和/或图3中所列的FSGM中的任一种或多种)的任何组合，或编码分泌蛋白(例如表2中定义的分泌蛋白)的基因(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1或THBS1)、线粒体基因、EGR家族基因、胰岛素样基因、核糖体耗尽应答基因、线粒体能量产生基因、蛋白酶体调控基因、核糖体功能基因、呼吸链基因、心肌发育基因、大分子分解代谢基因、翻译起始基因、线粒体组分基因、氧化磷酸化基因、大分子代谢过程的负调控基因和凋亡过程的调控基因或由这些基因中的任何一个编码的蛋白质中的任何一种或多种的改变的表达。
在本公开的另一个实施方案中，基线FXN(-)表达谱可包括ADNP、AI480526、C230034O21RIK、CCDC85B、CCDC85C、CTCFL、D130020L05RIK、mt-RNR1、mt-RNR2、NRTN、PDE4A、PHF1、RPL37RT、SLC26A10、SNORD17、SUV420H2、WNK2、YAM1和/或ZNRF1或其任何组合中的至少一种的下调的表达水平。FXN替代疗法的疗效的测量可通过这些FSGM中的任何一种或多种的上调模式来指示。
在本公开的另一个实施方案中，基线FXN(-)表达谱可包括CYR61的上调的表达水平。FXN替代疗法的疗效的测量可通过CYR61的下调模式来指示。
在一个实施方案中，FXN替代表达谱包括基线FXN(-)表达谱的逆转表达。
在另一个实施方案中，用作FXN替代治疗疗效的指示剂的FXN替代表达谱可包括表2、表4和/或图3中所示的FSGM中的一种或两种或更多种的任何组合，其中包括例如来自用FXN替代疗法治疗的患者的样品中检测到的分泌蛋白(例如CYR61)，例如表2中定义的分泌蛋白，或CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。
在另一个实施方案中，FXN替代表达谱可包括如表2中通过“药物vs.载体”的倍数调节所示的表达模式。
在一些实施方案中，FXN替代表达谱的特征在于FSGM的相反调控，其通过在FXN耗尽条件下下调的任何FSGM定义，所述FSGM在FXN替代治疗后变得上调；相反也是有效的，使得在FXN耗尽条件下上调的任何FSGM在FXN替代疗法后变得下调。因此，FXN替代疗法后的样品中一种或多种FSGM的改变表达的检测允许监测受试者中FXN替代疗法的功效。例如，在一个实施方案中，FXN替代疗法后的样品中一种或多种FSGM的改变表达的缺失表明FXN替代疗法可能不成功和/或可能需要增强FXN替代疗法。同样，在另一个实施方案中，FXN替代疗法后样品中一种或多种FSGM的改变表达表明FXN替代疗法是成功的。
在一些实施方案中，改变的表达是调节的或改变的基因表达，其在本文示例的方法中本身呈现为差异基因表达，也称为差异mRNA表达。改变的或调节的表达可包括提高的表达，也称为过表达或上调，或降低的或抑制的表达，也称为下调。
如本文所述，特征向量是表征表达谱的一组值。特征向量可以包括一组n个FSGM，n是在样品中测量其表达水平的不同基因的数目。举例来说，n可以是表2，表4和图3中提供的所有FSGM。或者，n可以是表2、表4和图3中所示的FSGM的至少1、2、3、4、5、6个或任何数量的任何组合。
在一个实施方案中，一组FSGM可包括至少一种或多于一种FSGM的任何组合，例如表2、表4和/或图3中所列的FSGM中的任何一种或多种，或编码分泌蛋白的基因中的任何一种或多种，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1或THBS1、线粒体基因、EGR家族基因、胰岛素样基因、核糖体耗尽应答基因、线粒体能量产生基因、蛋白酶体调控基因、核糖体功能基因、呼吸链基因、心肌发育基因、大分子分解代谢基因、翻译起始基因、线粒体组分基因、氧化磷酸化基因、大分子代谢过程的负调控基因和凋亡过程的调控基因或由这些基因中的任何一个编码的蛋白质。
在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括NR4A1、PTP4A1、ATF3、BTG2、EGR1、EGR2、EGR3、CYR61和ABCE1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括EGR1、EGR2、EGR3和IGF1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO2、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8和CYCS中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括OPS2、VBP1、PSMA3、SLIRP、CUL2、DCUN1D1、UBE2D3、ZNRF1、RNF2和LAMP2中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述一种或多种FSGM包括RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39、RPL38、RPS27L和ABCE1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3和CYCS中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括NR4A1、EGR1、EGR3、ADAMTS1、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2和CYR61中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括PSMA3、CUL2、UBE2D3、ZNRF1、RPS15A、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述一种或多种FSGM包括ABCE1、RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8、CYCS、TMEM-126A、MAOA和ABCE1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6和MT-ATP8中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述一种或多种FSGM包括ABCE1、RPL26、RPL38、RPL10、RPL32、RPS15A、RPL24、RPL39、SLIRP、COPS2、DCUN1D1、RNF2、EGR1、BTG2、ATF3、PTGS2、IGF1、SERPINE1和THBS1中的一种或多种。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括RPL26、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2、RPL10、RPS27L、CYCS、ATF3、BTG2、EGR1、EGR3和CYR61中的一种或多种。
举例来说，从健康受试者的样品获得的正常FXN表达谱可由一组FSGM的表达水平组成，并且可由正常FXN特征向量表示并称为正常FXN特征向量。如以下实施例所述，当在FXN缺乏的样品中测量时，FSGM可呈现与健康受试者中FSGM的表达水平不同的表达水平，因此可由缺乏FXN特征向量表示并称为缺乏FXN特征向量。在一个实施方案中，可以通过两个特征向量之间的距离来检测和定量缺乏FXN特征向量和正常FXN特征向量之间的差异。在另一种情况下，来自FXN替代治疗后的FXN缺乏患者的样品的FSGM的表达水平可能存在不同的表达水平，并且可由FXN替代特征向量表示并称为FXN替代特征向量。对于前两个特征向量，可以通过替代FXN特征向量与正常FXN特征向量或缺乏FXN特征向量之间的距离来检测和定量FXN替代特征向量与正常FXN特征向量或缺乏FXN特征向量之间的差异。
因此，具有在治疗前获得的FXN缺乏患者的样品和FXN替代疗法治疗后获得的样品，可以确定FXN替代表达谱的第一FXN特征向量，并且可以确定基线FXN(-)表达谱的第二FXN特征向量；其中确定第一和第二特征向量之间的距离或标积可用于确定FXN替代疗法的疗效。在本公开的一个实施方案中，可以确定正常FXN表达谱的第三特征向量，针对来自健康受试者的样品中的FSGM建立正常表达谱。在一个实施方案中，可以确定第二(基线FXN(-)表达谱)和第三(正常FXN表达谱)FXN特征向量之间的距离。在另一个实施方案中，可以确定第一(FXN替代表达谱)和第三(正常FXN表达谱)FXN特征向量之间的距离，并可用于确定FXN替代疗法的疗效。在一个实施方案中，可将第一和第三特征向量之间的距离针对第二和第三特征向量之间的距离标准化，并且标准化的距离可用于确定FXN替代疗法的疗效。在一个实施方案中，得到的标准化的距离可以是从0(零)至1(一)的范围内的值，其中值越小(最接近零)，治疗越有效。
本发明的标志物，例如选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM与受试者中的FXN水平相关。因此，在一个方面，本发明提供了表2、表4和/或图3中的一种或多种FSGM(例如CYR61，或CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种)的使用、测量、检测、定量等的方法，其用于测定和/或监测受试者中的FXN状态或用于确定、评估和/或监测受试者中的FXN替代疗法。
在另一方面，本发明涉及表2、表4和/或图3中的一种或多种FSGM，例如CYR61、CYR61，或CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种，其单独或与一种或多种用于FXN表达水平的其他FSGM一起，的使用、测量、检测、定量等。
此外，在另一个实施方案中，FSGM可以与线粒体疾病(例如FRDA)的一种或多种其它标志物组合使用。可与表2、表4和/或图3中的一种或多种FSGM组合使用的其他标志物包括本文所述的任何可测量的特征，其可以定量或定性方式反映有机体的生理状态，例如有机体是否患有线粒体疾病(例如FRDA)。有机体的生理状态包括任何疾病或非疾病状态，例如患有线粒体疾病(例如FRDA)的受试者或其他方面健康的受试者。可以与表2、表4和/或图3中的FSGM组合使用的本发明的FSGM包括可被作为正常过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指标客观测量和评估的特征。这样的组合标志物可以是临床参数(例如年龄、体力状态)，实验室测量(例如分子标志物)，或遗传或其它分子决定因素。在其他实施方案中，本发明还涉及任何临床和/或患者相关健康数据的分析和考虑，例如，从电子医疗记录获得的数据(例如，与各种类型的数据相关的关于个体患者或群体的电子健康信息的集合，所述各种类型的数据诸如人口统计学、病史、药物治疗和过敏症、免疫状态、实验室测试结果、放射学图像、生命体征、个人数据如年龄和体重，以及账单信息)。
本发明还考虑了表2、表4和/或图3的FSGM的特定组合的用途，例如，包括CYR61的FSGM的组合或包括CYR61或CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1的一种或多种中的一种或多种的FSGM的组合。在一个实施方案中，本发明考虑具有至少两个(2)成员的FSGM集，其可包括表2、表4和/或图3中的任何两种FSGM。在另一个实施方案中，本发明考虑具有至少三个(3)成员的FSGM集，其可以包括表2、表4和/或图3中的任何三种FSGM。在另一个实施方案中，本发明考虑具有至少四个(4)成员的FSGM集，其可以包括表2、表4和/或图3中的任何四种FSGM。在另一个实施方案中，本发明考虑具有至少五个(5)成员的FSGM集，其可以包括表2、表4和/或图3中的任何五种FSGM。在另一个实施方案中，本发明考虑具有至少六个(6)个成员的FSGM集，其可以包括表2、表4和/或图3中的任何六种FSGM。在另一个实施方案中，本发明考虑具有至少七个(7)成员的FSGM集，其可以包括表2、表4和/或图3中的任何七种FSGM。在另一个实施方案中，本发明考虑具有至少八个(8)成员的FSGM集，其可以包括表2、表4和/或图3中的任何八种FSGM。在另一个实施方案中，本发明考虑具有至少九个(9)成员的FSGM集，其可以包括表2、表4和/或图3中的任何九种FSGM。在另一个实施方案中，本发明考虑具有至少十个(10)个成员的FSGM集，其可以包括表2、表4和/或图3中的任何十种FSGM。在另一个实施方案中，本发明考虑具有至少十一个(11)成员的FSGM集，其可以包括表2、表4和/或图3中的任何十种FSGM。在另一个实施方案中，本发明考虑具有至少十二个(12)成员的FSGM集，其可以包括表2、表4和/或图3中的任何十种FSGM。在其它实施方案中，本发明考虑了FSGM集，其包括表2、表4和/或图3中列出的FSGM中的至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、70、80、90、100或102种。在一个实施方案中，本发明考虑了FSGM集，其包括表2、表4和/或图3中列出的FSGM中的至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、70、80、90、100或102种。其中该集中FSGM的一种或多种是分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1。
在另一个实施方案中，本发明考虑了FSGM集，其包括表2、表4和/或图3中所列的FSGM中的至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、70、80、90、100或102种，其中该集中FSGM的一种是CYR61。
在某些实施方案中，FSGM的水平在用FXN替代治疗受试者(例如FXN缺乏的受试者)后增加。在一些实施方案中，FSGM选自由mt-RNR1、mt-RNR2、ADNP、AI480526、C230034O21RIK、CCDC85B、CCDC85C、CTCFL、NRTN、PDE4A、PHF1、RPL37RT、SLC26A10、SNORD17、SUV420H2、WNK2、YAM1和ZNRF1组成的组。
在其它实施方案中，FSGM的水平在用FXN替代物治疗受试者(例如FXN缺乏的受试者)后降低。在一些实施方案中，FSGM选自由CYR61、mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CO2、mt-CO3、mt-ND1、mt-ND2、mt-ND3和mt-ND4、EGR1、EGR2、EGR3、IGF1、LAMP2和SLIRP组成的组。
在另一个方面，本发明提供了基于生物样品中本发明的FSGM的水平的“诊断签名”或“诊断表达谱”的鉴定，其与样品中的FXN相关。“FSGM的水平”可指生物样品中FSGM的蛋白水平。“FSGM的水平”也可以指对应于蛋白的基因的表达水平，例如通过测量相应的FSGMmRNAs的表达水平。FSGM水平的集合或总体提供了与FXN水平相关的诊断签名。
在某些实施方案中，通过以下获得诊断签名：(1)在来自接受FXN替代疗法的受试者的生物样品中检测表2、表4和/或图3中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多FSGM(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的水平，(2)比较表2、表4和/或图3中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多FSGM(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的水平和来自对照样品的相同FSGM的水平，例如基线FXN(-)表达谱，和(3)测定在生物样品中检测的表2、表4和/或图3中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多FSGM(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)是否高于或低于对照中FSGM的水平(例如基线FXN(-)表达谱)。如果表2、表4和/或图3中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多FSGM(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)高于或低于对照(例如基线FXN(-)表达谱)，则诊断签名指示FXN替代疗法的疗效。
根据各种实施方案，算法可用于预测来自受试者的生物样品是否包括FXN，或评估或监测受试者是否已经有效地接受FXN替代疗法。本领域技术人员将理解，算法可以是任何计算、公式、统计调查、列线图、查找表、决策树方法或计算机程序，其通过多个明确定义的连续步骤处理一组输入变量(例如，在超过某个阈值水平的水平下检测到的标志物(n)的数量，或在低于某个阈值水平的水平下检测到的标志物(n)的数量)，从而最终产生分数或“输出”。本文考虑了任何合适的算法—无论是基于计算机的还是基于人工的(例如，查找表)。
在某些实施方案中，本发明的FSGM(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)可包括变体序列。更具体地，用于检测本发明的特定的FSGM的某些结合剂/试剂可以结合和/或鉴定本发明的这些特定的FSGM的变体。如本文所用，术语“变体”包括与具体鉴定的序列不同的核苷酸或氨基酸序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基缺失、取代或添加。变体可以是天然存在的等位基因变体，或非天然存在的变体。变体序列(多核苷酸或多肽)优选地表现出与本文公开的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。通过比对如下所述的待比较的两个序列，确定比对部分中相同残基的数目，将该数目除以本发明(查询)序列中残基的总数，并将结果乘以100来确定百分比同一性。
变体序列通常与具体鉴定的序列的区别仅在于保守置换、缺失或修饰。如本文所用，“保守置换”是其中一个氨基酸被另一个具有相似性质的氨基酸取代，使得肽化学领域的技术人员可预期多肽的二级结构和亲水性基本上不变。通常，下列氨基酸的组代表保守性改变：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。变体也可以或可选地包含其它修饰，其包括对多肽的抗原性特性、二级结构和亲水性具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以在蛋白质的N-末端与信号(或前导)序列缀合，所述信号(或前导)序列指导蛋白质的共翻译或翻译后转移。还可以将多肽缀合至接头或其他序列以便易于多肽的合成、纯化或鉴定(例如，聚-His)，或增强多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可以缀合至免疫球蛋白Fc区。
可以比对多肽和多核苷酸序列，并且可以使用公众可获得的计算机算法针对另一多肽或多核苷酸序列确定特定区域中相同氨基酸或核苷酸的百分比。多核苷酸或多肽序列的百分比同一性通过使用适当的算法(例如分别设置为默认参数的BLASTN或BLASTP)比对多核苷酸和多肽序列；鉴定比对部分上相同的核酸或氨基酸的数目；将相同的核酸或氨基酸的数目除以本发明的多核苷酸或多肽的核酸或氨基酸的总数；然后乘以100来确定百分比同一性。
用于比对和鉴定多核苷酸序列的同一性的两种示例性算法是BLASTN和FASTA算法。可以使用BLASTP算法检查多肽序列的比对和同一性。BLASTX和FASTX算法比较了所有阅读框中翻译的核苷酸查询序列和多肽序列。Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448,1988和Pearson,Methods in Enzymol.183:63-98,1990中描述了FASTA和FASTX算法。FASTA软件包可从University of Virginia,Charlottesville,Va.22906-9025获得。FASTA算法设置为文件中描述的默认参数并随算法一起分发，其可用于多核苷酸变体的确定。与算法一起分发的FASTA和FASTX版本2.0x的自述文件描述了算法的使用并描述了默认参数。
BLASTN软件可在NCBI匿名FTP服务器上获得，并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)，National Library of Medicine,Building 38A,Room 8N805,Bethesda,Md.20894获得。BLASTN算法版本2.0.6[1998年9月10日]和版本2.0.11[2000年1月20日]设置为文档中描述的默认参数并随算法一起分发，其优选用于根据本发明所述的变体的确定。包括BLASTN在内的BLAST算法家族的使用描述于NCBI网站和Altschul等“Gapped BLAST andPSI-BLAST:a new generation of protein database search programs”Nucleic AcidsRes.25:3389-3402,1997的出版物中。
在一个可选的实施方案中，变体多肽由在严格条件下与公开的多核苷酸杂交的多核苷酸序列编码。用于测定互补性的严格杂交条件包括小于约1μM，更通常小于约500mM，并且优选小于约200mM的盐条件。杂交温度可以低至5℃，但通常高于约22℃，更优选高于约30℃，最优选高于约37℃。较长的DNA片段可能需要用于特异性杂交的较高的杂交温度。由于杂交的严格程度可能受其它因素(例如探针组成、有机溶剂的存在和碱基错配的程度)影响，因此参数的组合比任何一个单独的绝对测量更重要。“严格条件”的示例是在6XSSC、0.2％SDS的溶液中预洗涤；在65℃，6XSSC，0.2％SDS下杂交过夜；随后在65℃下在1XSSC、0.1％SDS中各洗涤两次30分钟，并且在65℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中各洗涤两次30分钟。
本发明提供FSGM的各种组合和子组合的使用。例如，在本发明的方法中可以使用一种或多种分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白，其中包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1。应当理解，除非另外明确指出，否则本文提供的任何单个FSGM或FSGM的组合都可用于本发明。
D.组织样品
本发明可以用潜在地包含、表达、包括可检测的FSGM的任何合适的生物样品实施。例如，生物样品可以获自体液样品，例如血液(包括任何血液制品，例如全血、血浆、血清或血液的特定类型的细胞)、尿、唾液或精液，或固体组织样品，例如皮肤活检样品、肌肉活检样品，或者样品可以是口腔样品。或者，样品可包括为测试FSGM转录物而收获的外泌体。
本发明的方法可以在单细胞水平下进行。但是，本发明的方法也可以使用包括许多细胞的样品进行，其中试验是在样品中存在的细胞和组织的整个集合上的“平均化”表达。优选地，有足够的组织样品来准确和可靠地测定目标表达水平。
用于分离和/或获得组织和/或血液或其它生物产品，和/或用于在进行检测反应之前处理所述材料的任何商用设备或系统是可考虑的。
在某些实施方案中，本发明涉及检测FSGM核酸分子(例如，编码表2、表4和/或图3的蛋白质FSGM的mRNA，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)。在这样的实施方案中，可以在分析之前从生物样品中提取RNA。RNA提取的方法是本领域众所周知的(参见，例如，J.Sambrook等，“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”,1989,2ndEd.,Cold Spring Harbour Laboratory Press:New York)。从体液或组织中分离RNA的大部分方法是基于在蛋白质变性剂存在以快速且有效地使RNase失活的情况下的组织的破坏。通常，RNA分离试剂除其它组分外还包括硫氰酸胍和/或β-巯基乙醇，已知它们用作RNase抑制剂。分离的总RNA然后从蛋白质污染物进一步纯化，并通过选择性乙醇沉淀、苯酚/氯仿提取、然后异丙醇沉淀(参见，例如，P.Chomczynski和N.Sacchi,Anal.Biochem.,1987,162:156-159)或者氯化铯、氯化锂或三氟乙酸铯梯度离心进行浓缩。
许多不同和通用的试剂盒可用于从体液或组织中提取RNA(即总RNA或mRNA)，并且可从例如Ambion，Inc.(Austin，Tex.)，Amersham Biosciences(Piscataway，N.J.)，BDBiosciences Clontech(paloalto，Calif.)，BioRad Laboratories(Hercules，Calif.)，GIBCO BRL(Gaithersburg，Md.)和Giagen，Inc.(Valencia，Calif.)商购获得。在所有这些试剂盒中通常都包括详细说明所遵循方案的用户指南。每个试剂盒的灵敏度、处理时间和成本可能不同。本领域内技术人员可以容易地选择最适于特定情况的试剂盒。
在某些实施方案中，提取后，mRNA被扩增并被转录成cDNA，然后其可用作通过合适的RNA聚合酶进行多轮转录的模板。扩增方法是本领域众所周知的(参见例如，A.R.Kimmel和S.L.Berger,Methods Enzymol.1987,152:307-316；J.Sambrook等，“MolecularCloning:A Laboratory Manual”,1989,2nd Ed.,Cold Spring Harbour LaboratoryPress:New York；“Short Protocols in Molecular Biology”,F.M.Ausubel(Ed.),2002,5.sup.th Ed.,John Wiley&Sons；美国专利No.4,683,195、No.4,683,202和No.4,800,159)。逆转录反应可以使用非特异性引物(例如锚定的寡聚-dT引物)或随机序列引物，或使用与被监测的每个遗传探针的RNA互补的靶特异性引物，或使用热稳定的DNA聚合酶(例如禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶或莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶)进行。
在某些实施方案中，从组织样品中分离的RNA(例如，在扩增和/或转化成cDNA或cRNA之后)在分析之前用可检测试剂标记。可检测试剂的作用是促进RNA的检测或允许杂交核酸片段(例如，在基于阵列的测定中与遗传探针杂交的核酸片段)的可视化。优选地，选择可检测试剂使其产生可测量的信号并且其强度与存在于被分析样品中的标记核酸的量相关。在基于阵列的分析方法中，优选地，也选择可检测试剂C使其产生局部信号，从而允许来自阵列上每个点的信号的空间解析。
用于标记核酸分子的方法是本领域内众所周知的。关于标记方案、标记检测技术和该领域的最新进展的综述，参见例如,L.J.Kricka,Ann.Clin.Biochem.2002,39:114-129；R.P.van Gijlswijk等，Expert Rev.Mol.Diagn.2001,1:81-91；和S.Joos等，J.Biotechnol.1994,35:135-153。标准的核酸标记方法包括：放射性试剂的掺入、荧光染料(参见，例如，L.M.Smith等，Nucl.Acids Res.1985,13:2399-2412)或酶(参见，例如B.A.Connoly和P.Rider,Nucl.Acids.Res.1985,13:4485-4502)的直接连接；核酸片段的化学修饰使其可通过免疫化学或其它亲和反应检测(参见，例如，T.R.Broker等，Nucl.AcidsRes.1978,5:363-384；E.A.Bayer等，Methods of Biochem.Analysis,1980,26:1-45；R.Langer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1981,78:6633-6637；R.W.Richardson等，Nucl.Acids Res.1983,11:6167-6184；D.J.Brigati等，Virol.1983,126:32-50；P.Tchen等，Proc.Natl Acad.Sci.USA,1984,81:3466-3470；J.E.Landegent等，Exp.CellRes.1984,15:61-72；和A.H.Hopman等，Exp.Cell Res.1987,169:357-368)；以及酶介导的标记方法，例如随机引发、切口平移、PCR和用末端转移酶加尾(对于酶标记的综述，参见例如，J.Temsamani和S.Agrawal,Mol.Biotechnol.1996,5:223-232).
在本发明的实践中可以使用多种可检测试剂中的任何一种。合适的可检测试剂包括但不限于：各种配体、放射性核素、荧光染料、化学发光剂、微粒(例如量子点、纳米晶体、磷光剂等)、酶(例如ELISA中使用的那些，即辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记、磁性标记、和生物素、地高辛或者其抗血清或单克隆抗体可得的其它半抗原和蛋白质。
但是，在一些实施方案中，通过检测基因产物(例如蛋白质，诸如分泌蛋白)的表达测定表达水平，从而消除从样品获得遗传样品(例如RNA)的需要。
E.FSGM的检测和/或测量
各种方法可被用于测量特征向量之间的距离。一旦数据被标准化，该距离可以通过例如计算均方误差获得，其可从两个不同谱(例如基线FXN(-)和FXN替代)中测量的每个基因的表达模式的差异中提取。或者，可以通过计算相关性系数或应用t-检验来获得该距离。
如本文详细描述的，已经描述了许多用于RNA表达谱的测定的方法，其中包括样品RNA的测序、杂交或扩增。在本公开的特定实施方案中，所述患者样品的表达谱的测定包括从患者获得或提供生物样品，从样品提取RNA，产生相应的cDNA，和通过测序、杂交或扩增中的任何一种检测表达谱。
通过测序检测FXN-敏感性表达谱可以使用例如下一代测序(NGS)、RNASeq和本领域技术人员已知的任何测序技术。
通过杂交检测表达谱包括使患者样品或其部分接触与表2、表4和/或图3中公开的FSGM(或其转录物)特异性杂交的探针或一组探针。在本公开的一个实施方案中，编码至少一种分泌蛋白(例如表2中定义的分泌蛋白，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1、线粒体蛋白质、EGR家族蛋白质、胰岛素样蛋白质、核糖体耗尽应答蛋白质、线粒体能量产生蛋白质、蛋白酶体调控蛋白质、核糖体功能蛋白质、呼吸链蛋白质、心肌发育蛋白质、大分子分解代谢蛋白质、翻译起始蛋白质、线粒体组分蛋白质、氧化磷酸化蛋白质、大分子分解代谢过程的负调控蛋白质或凋亡过程的调控蛋白质或其任何组合)的基因的转录物的至少一种的特异性探针可与患者样品接触。举例来说，mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CO2、mt-CO3、mt-ND1、mt-ND2、mt-ND3、mt-ND4、mt-RNR1、mt-RNR2、EGR1、EGR2、EGR3、IGF1、LAMP2、APOLD1、MAOA、PDE4A、YARS、RnF13和RPL10、CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1中的至少一种或其任何组合的特异性探针可以与患者样品接触。因此，通过杂交测定用FXN替代疗法治疗的患者样品的表达谱可包括使样品或其部分与探针接触，所述探针与其靶核酸的至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％杂交，所述靶核酸是表2、表4和/或图3中提供的FSGM中的任何一种(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的转录物或相应cDNA。
通过扩增检测表达谱涉及，举例来说，聚合酶链式反应技术，例如实时聚合酶链式反应(RT-PCR)，其包括使样品与下文实施例中举例说明的每种目的转录物的正向和反向引物接触，并产生RT-PCR产物。任选地，用特异性或通用探针或其组合检测RT-PCR产物，以促进它们的定量。因此，可以通过检测样品中的FSGM转录物测定FXN-诱导的签名。在本公开的一个实施方案中，正向和反向引物被用于检测FSGM转录物。
在一个可选的实施方案中，可以通过FSGM蛋白质产物和蛋白质谱的分析来检测表达谱，这可以通过蛋白质检测方法，使用涉及特异性抗体的技术，或蛋白质定量/表征技术来进行，例如高效液相色谱法(HPLC)、基于质谱的技术、基于凝胶的技术例如差异凝胶电泳等。
在另一个方面，本公开提供了用于FXN表达谱的检测的组合物，所述组合物包含用于FSGM的检测的至少一种或多种核苷酸序列。在本公开的一个实施方案中，组合物可以用于FXN替代表达谱、基线FXN(-)表达谱和/或正常FXN表达谱中的任何一个的检测。组合物可包含用于表2、表4和/或图3中定义的基因的转录物的检测的至少一种核苷酸序列。组合物可包含用于表2、表4和图3中所示的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40种和/或高达所有FSGM的检测的核苷酸序列。举例来说，用于FXN签名的检测的组合物包括用于mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CO2、mt-CO3、mt-ND1、mt-ND2、mt-ND3、mt-ND4、mt-RnR1、mtRnR2、EGR1、EGR2、EGR3、IGF1、LAMP2、APOLD1、MAOA、PDE4A、YARS、RnF13、RPL10、SLIRP、CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1中的至少一种或其任何组合的检测的核苷酸。核苷酸序列可以是DNA或其类似物，或RNA或其类似物。核苷酸序列可以与FSGM的至少一部分互补。用于FSGM的检测的核苷酸序列的结合将取决于反应的严格程度的水平。核苷酸序列可以是寡核苷酸，其可以用作探针或引物，并且因此可包含与其功能相容的修饰。例如，用作探针的短寡核苷酸可以携带标记(例如荧光标记)，使其能够检测和定量。
本发明考虑了用于检测和/或测量本发明的FSGM的任何合适的手段、技术和/或过程。下面详细描述这些方法。
1.蛋白质FSGM的检测
本发明考虑用于检测本发明的多肽FSGM(即表2、表4和/或图3的蛋白，其中包括分泌蛋白CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1)的任何合适的方法。在某些实施方案中，检测方法是免疫检测方法，其涉及特异性结合表2、表4和/或图3的FSGM中的一种或多种(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1)的抗体。各种有用的免疫检测方法的步骤已经描述在科学文献中，例如Nakamura等((1987)，其通过引用并入本文。
一般而言，免疫结合方法包括获得怀疑含有FSGM蛋白、肽(例如FSGM分泌蛋白或肽)或抗体的样品，并在允许有效形成免疫复合物的条件下，将样品或其部分与根据本发明所述的抗体或蛋白或肽(视情况而定)接触。
免疫结合方法包括用于检测或定量样品中反应组分的量的方法，该方法需要结合过程中形成的任何免疫复合物的检测或定量。此处，可以获得怀疑含有FSGM蛋白、肽或相应抗体的样品，并将样品与抗体或编码的蛋白或肽(视情况而定)接触，然后检测或定量在特定条件下形成的免疫复合物的量。
使所选择的生物样品或其部分与蛋白质在有效条件下接触足以允许免疫复合物(初级免疫复合物)形成的一段时间。通常，复合物形成只是简单地将组合物加入生物样品中并将混合物孵育足够长以使抗体与任何存在的抗原形成免疫复合物(即与任何存在的抗原结合)的一段时间。此后，通常洗涤样品-抗体组合物，例如组织切片、ELISA板、斑点印迹或蛋白质印迹以除去任何非特异性结合的抗体种类，仅允许在初级免疫复合物内特异性结合的那些抗体被检测。
通常，免疫复合物形成的检测是本领域众所周知的，并且可以通过多种方法的应用来实现。这些方法通常基于标记或FSGM的检测，例如本领域标准使用的任何放射性、荧光、生物或酶标签或标记。涉及使用此类标签的美国专利包括美国专利No.3,817,837；No.3,850,752；No.3,939,350；No.3,996,345；No.4,277,437；No.4,275,149和No.4,366,241，每一个均通过引用并入本文。当然，如本领域已知的，通过第二结合配体(例如第二抗体或生物素/抗生物素蛋白配体结合配置)的使用可以发现的其它优点。
检测中应用的蛋白质本身可以与可检测的标记连接，其中可以然后简单地检测该标记，从而允许组合物中初级免疫复合物的量被测定。
或者，在初级免疫复合物内结合的第一添加组分可以通过对编码的蛋白质、肽或相应抗体具有结合亲和力的第二结合配体检测。在这些情况下，第二结合配体可以与可检测标记连接。第二结合配体本身通常是抗体，因此可称为“第二”抗体。初级免疫复合物与标记的第二结合配体或抗体在有效条件下接触足以允许次级免疫复合物的形成的时间。然后通常洗涤次级免疫复合物以除去任何非特异性结合的标记的二级抗体或配体，然后检测次级免疫复合物中的保留标记。
其它方法包括通过两步法检测初级免疫复合物。如上所述，对编码的蛋白质、肽或相应抗体具有结合亲和力的第二结合配体(例如抗体)被用于形成次级免疫复合物。洗涤后，使次级免疫复合物与对第二抗体具有结合亲和力的第三结合配体或抗体再次在有效条件下接触足以允许免疫复合物(第三免疫复合物)的形成的时间。第三配体或抗体与可检测标记连接，允许由此形成的第三免疫复合物的检测。如果需要，该系统可以提供信号放大。
本发明的免疫检测方法在监测FXN替代疗法(例如CTI-1601)的功效中具有明显的效用。本文中，使用怀疑含有编码的蛋白或肽或者相应抗体的生物或临床样品。但是，这些实施方案也可应用于非临床样品，例如抗原或抗体样品的滴定、杂交瘤的选择等。
特别地，本发明考虑了使用ELISA作为免疫检测测定法的一种类型。可以预期本发明的FSGM蛋白或肽(其中包括分泌蛋白或肽，例如表2中定义的分泌蛋白，如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)在监测FXN替代疗法的ELISA测定中用作免疫原。在其最简单和直接的意义上，免疫测定是结合测定。某些优选的免疫测定是本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别有用的。然而，容易理解的是，检测并不限于这些技术，也可以使用蛋白质印迹、斑点印迹、FACS分析等。
在一个示例性ELISA中，与本发明的FSGM(其中包括分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白，如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)结合的抗体被固定在展现蛋白亲和力的选定表面上，如聚苯乙烯微量滴定板中的孔。然后，向孔中加入怀疑含有FSGM抗原的测试组合物，例如临床样品。在结合和洗涤除去非特异性结合的免疫复合物后，可以检测结合的抗原。检测通常是通过加入与可检测标记连接的对靶蛋白特异的第二抗体来实现。这种类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测也可通过加入第二抗体，随后加入对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现，其中第三抗体与可检测标记连接。
在另一个示例性ELISA中，将怀疑含有FSGM抗原的样品固定在孔表面上，然后与本发明的抗生物标志物抗体接触。在结合和洗涤除去非特异性结合的免疫复合物后，检测结合的抗原。在初始抗体与可检测标记连接的情况中可直接检测免疫复合物。再次，可使用对第一抗体具有结合亲和力的第二抗体检测免疫复合物，其中第二抗体与可检测标记连接。
不考虑所采用的形式，ELISAs具有某些共同的特征，如包被、孵育或结合、洗涤以除去非特异性结合的种类和检测结合的免疫复合物。这些描述如下。
在用抗原或抗体包被平板中，通常将平板的孔与抗原或抗体溶液孵育过夜或特定的数小时时间。然后洗涤板的孔以除去未完全吸附的物质。然后用对测试抗血清呈抗原性中性的非特异性蛋白质“包被”孔的任何剩余可用表面。这些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。包被允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，并因此降低由表面上由抗血清的非特异性结合导致的背景。
在ELISA中，使用二级或三级检测手段而不是直接步骤可能更常见。因此，在蛋白质或抗体结合至孔后，用非反应性物质包被以降低背景，并洗涤以除去未结合的物质，在允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的有效条件下，使固定表面与待测试的对照和/或临床或生物样品接触。然后免疫复合物的检测需要标记的第二结合配体或抗体，或第二结合配体或抗体与标记的三级抗体或第三结合配体结合。
短语“在允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的有效条件下”是指所述条件优选包括用溶液(例如BSA、牛丙种球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Tween)稀释抗原和抗体。这些添加的试剂也有助于降低非特异性背景。
“合适的”条件还指在足以允许有效结合的温度和时间段下的孵育。孵育步骤通常为约1至2至4小时，在优选约25至27℃左右的温度下，或可在约4℃等下过夜。
在ELISA中所有孵育步骤之后，洗涤接触的表面以除去未复合的物质。优选的洗涤程序包括用溶液(例如PBS/Tween或硼酸盐缓冲液)洗涤。在测试样品和最初结合的物质间形成特异性免疫复合物，且随后洗涤后，可以测定甚至微量免疫复合物的存在。
为了提供检测手段，第二或第三抗体将具有相关标记以允许检测。优选地，这将是在与适当的显色底物孵育时产生显色的酶。因此，例如，希望使第一或第二免疫复合物与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触，并在有利于进一步免疫复合物形成的发展的条件下孵育一段时间(例如，在室温下，在含PBS的溶液如PBS-Tween中孵育2小时)。
在与标记的抗体孵育，且随后洗涤以除去未结合的物质后，定量标记的量，例如通过与显色底物(例如脲和溴甲酚紫)孵育。然后通过测量颜色产生的程度(例如使用可见光谱分光光度计)来实现定量。
本发明的蛋白质FSGM(其中包括分泌蛋白，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)也可使用蛋白质谱法和仪器进行测量、定量、检测和分析。蛋白质谱是指质谱在蛋白质研究中的应用。尽管不打算限制，但两种方法通常用于使用质谱法表征蛋白质。第一种，完整的蛋白质被电离，然后引入到质谱分析仪。这种方法被称为蛋白质分析的“自顶向下(top-down)”策略。用于完整蛋白质电离的两种主要方法是电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)。在第二种方法中，使用蛋白酶(例如胰蛋白酶)将蛋白质酶促消化成较小的肽。随后将这些肽引入到质谱仪中并通过肽质量指纹或串联质谱法鉴定。因此，后一种方法(也称为“自底向上(bottom-up)”蛋白质组学)使用肽水平的鉴定来推断蛋白质的存在。
本发明的FSGM(其中包括分泌蛋白，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的全蛋白质量分析可使用时间飞行(TOF)MS或傅立叶变换离子回旋共振(FT-ICR)进行。这两种类型的仪器是有用的，因为它们的宽质量范围，并且在FT-ICR的情况下，具有高的质量精度。用于肽质量分析的最广泛使用的仪器是MALDI时间飞行仪器，因为它们允许以高速采集肽质量指纹(PMF)(可以在约10秒内分析1PMF)。多级四极时间飞行(quadrupole-time-of-flight)和四极离子阱也可用于该应用中。
本发明的蛋白质FSGM(其中包括分泌蛋白，如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)也可在共同存在于生物培养基或样品中的蛋白质和分子的复杂混合物中测定，但是，样品的分级分离可能是需要的，并且在本文中加以考虑。应当理解，蛋白质的复杂混合物的电离可导致其中更丰富的蛋白质具有“淹没”的倾向或抑制来自相同样品中较不丰富的蛋白质的信号的情况。此外，因为混合物组分的数量巨大，来自复杂混合物的质谱可能难以解释。分级分离可用于在质谱分析前首先分离任何复杂的蛋白质混合物。两种方法广泛用于分级分离蛋白质或来自其酶消化的肽产物。第一种方法分级分离全蛋白并称为双向凝胶电泳。第二种方法，高效液相色谱(LC或HPLC)被用于分级分离酶消化后的肽。在一些情况下，可能希望组合这些技术。本文还考虑了本领域已知的用于分级分离蛋白质混合物的任何其它合适的方法。
在2D凝胶上鉴定的凝胶斑点通常归因于一种蛋白质。如果需要鉴定蛋白质，通常应用凝胶内消化的方法，其中目标蛋白质斑点被切除，并通过蛋白水解消化。消化产生的肽质量可通过使用肽质量指纹图谱的质谱分析测定。如果该信息不允许蛋白质的明确鉴定，则可对其肽进行串联质谱分析以进行从头测序。
使用HPLC/MS表征蛋白质混合物在本领域中也可称为“鸟枪法蛋白质组学”和MuDPIT(多维蛋白质鉴定技术)。通过液相色谱(LC)的一个或两个步骤分级分离由蛋白质混合物消化产生的肽混合物。来自色谱阶段的洗脱液可以通过电喷雾电离直接引入质谱仪，或放置在一系列小点上用于随后使用MALDI的质谱分析。
本发明的蛋白质FSGM(其中包括分泌蛋白，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)可使用多种技术用MS鉴定，本文考虑了所有这些技术。肽质量指纹分析使用蛋白水解肽的质量作为预测质量数据库的搜索的输入，所述预测质量由已知蛋白质列表的消化产生。如果参考列表中的蛋白质序列产生与实验值匹配的大量预测质量，则有一些证据表明该蛋白质存在于原始样品中。可以进一步理解的是，与微毛细管液相色谱(LC)和数据库搜索结合的用于自动、数据依赖的电喷雾电离(ESI)串联质谱(MS/MS)的方法和仪器的开发已经显著地增加了凝胶分离蛋白的鉴定的灵敏度和速度。微毛细管LC-MS/MS已经成功地用于直接从混合物中大规模鉴定单个蛋白质而无需凝胶电泳分离(Link等，1999；Opitek等，1997)。
几种最近的方法允许通过质谱法定量蛋白质。例如，碳(13C)或氮(15N)的稳定的(例如，非放射性的)较重同位素可掺入一个样品中，而另一个可以用相应的轻同位素(例如12C和14N)标记。在分析前混合两个样品。来源于不同样品的肽可因它们的质量差异而被区分。它们的峰强度的比率对应于肽(和蛋白质)的相对丰度比。最常用的同位素标记方法是SILAC(细胞培养物中通过氨基酸的稳定同位素标记)、胰蛋白酶催化的18O标记、ICAT(同位素编码的亲和标记)、iTRAQ(用于相对和绝对定量的同重标签)。“半定量”质谱可以在不标记样品的情况下进行。通常，这是通过MALDI分析(以线性模式)完成的。来自单个分子(通常为蛋白质)的峰强度或峰面积在此与样品中蛋白质的量相关。但是，个体信号取决于蛋白质的一级结构、样品的复杂性和仪器的设置。其它类型的“无标记”定量质谱法使用消化蛋白质的光谱计数(或肽计数)作为测定相对蛋白质量的手段。
2.对应于蛋白质FSGM的核酸的检测
在某些实施方案中，本发明涉及核酸FSGM的检测，例如本发明的蛋白质FSGM的相应的基因或mRNA，例如表2、表4和/或图3，包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1。
在各种实施方案中，本发明的方法通常涉及生物样品中一组基因的表达水平的测定。在本发明方法的实践中，基因表达水平的测定可以通过任何合适的方法进行。例如，可以通过检测由目的基因表达的mRNA的表达和/或通过检测由基因编码的多肽的表达来进行基因表达水平的测定。
为了检测编码本发明的FSGM(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1)的核酸，可以使用任何合适的方法，其包括但不限于DNA印迹析、RNA印迹分析、聚合酶链式反应(PCR)(参见例如美国专利号No.4,683,195；No.4,683,202和No.6,040,166；“PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications”,Innis等(Eds),1990,Academic Press:New York)、逆转录酶PCR(RT-PCT)、锚定PCR、竞争性PCR(参见，例如，美国专利No.5,747,251)、cDNA末端的快速扩增(RACE)(参见，例如，Gene Cloningand Analysis:Current Innovations,1997,pp.99-115)；连接酶链反应(LCR)(参见例如EP01320308)、单侧PCR(Ohara等，Proc.Natl.Acad.Sci.,1989,86:5673-5677)、原位杂交、基于Taqman的检测(Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.,1991,88:7276-7280)、差异显示(参见例如Liang等，Nucl.Acid.Res.,1993,21:3269-3275)和其它RNA指纹技术、基于核酸序列的扩增(NASBA)和其它基于转录的扩增系统(参见，例如，美国专利No.5,409,818和No.5,554,527)、Qbeta复制酶、链置换扩增(SDA)、修复链反应(RCR)、核酸酶保护测定、基于减法的方法、
Figure BDA0003444474690000541
等。
在其它实施方案中，目的FSGM(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1)的基因表达水平可以通过扩增由mRNA产生的互补DNA(cDNA)或互补RNA(cRNA)，并使用微阵列进行分析来测定。许多不同的阵列配置及其生产方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，美国专利No.5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,658,734和5,700,637)。微阵列技术允许同时测量大量基因的稳态mRNA水平。目前广泛使用的微阵列包括cDNA阵列和寡核苷酸阵列。使用微阵列的分析通常是基于自标记的探针接收的信号强度的测量，所述标记的探针用于检测与固定在微阵列上已知位置的核酸探针杂交的来自样品的cDNA序列(参见，例如，美国专利No.6,004,755；6,218,114；6,218,122和6,271,002)。基于阵列的基因表达方法是本领域已知的，并且已经在许多科学出版物以及专利中进行了描述(参见，例如，M.Schena等，Science,1995,270:467-470；M.Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996,93:10614-10619；J.J.Chen等，Genomics,1998,51:313-324；美国专利No.5,143,854；5,445,934；5,807,522；5,837,832；6,040,138；6,045,996；6,284,460和6,607,885)。
用作扩增模板的核酸可根据标准方法从生物样品中所含的细胞中分离(Sambrook等，1989)。核酸可以是基因组DNA或分级分离的或全细胞RNA。当使用RNA时，可能需要将RNA转化为互补cDNA。在一个实施方案中，RNA是全细胞RNA并直接用作扩增的模板。
在允许选择性杂交的条件下，与本文鉴定的任何FSGM核苷酸序列相对应的核酸选择性杂交的引物对与分离的核酸接触。一旦杂交，核酸：引物复合物与促进模板依赖性核酸合成的一种或多种酶接触。进行多轮扩增(也称为“循环”)，直到产生足够量的扩增产物。接着，检测扩增产物。在某些应用中，可以通过视觉方式进行检测。或者，检测可涉及通过化学发光、掺入的放射性标记或荧光标签的放射性显像或甚至通过使用电或热脉冲信号的系统(Affymax技术；Bellus，1994)的产物的间接鉴定。检测后，可以比较给定患者中观察到的结果和例如正常患者的统计学显著参照组。这样，可以将检测到的核酸量与各种临床状态相关联。
如本文所用，术语引物是指包括能够在模板依赖性过程中引发新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是长度为10至20个碱基对的寡核苷酸，但也可使用更长的序列。引物可以双链或单链形式提供，尽管优选单链形式。
许多模板依赖性方法可用于扩增给定模板样品中存在的核酸序列。最著名的扩增方法之一是聚合酶链式反应(称为PCR)，其详细描述于美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159以及Innis等，1990中，其中每一个均通过引用全文并入本文。
在PCR中，制备与靶核酸序列的相反互补链上的区域互补的两个引物序列。将过量的脱氧核苷三磷酸与DNA聚合酶例如Taq聚合酶一起加入到反应混合物中。如果样品中存在靶核酸序列，引物将与靶核酸结合，并且聚合酶将通过添加核苷酸使引物沿靶核酸序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度，延伸的引物将从靶核酸解离形成反应产物，过量的引物将与靶核酸和反应产物结合，并重复该过程。
为了定量扩增的mRNA的量，可以进行逆转录酶PCR扩增过程。将RNA逆转录成cDNA的方法是众所周知的，并被描述于Sambrook等，1989。逆转录的替代方法利用热稳定DNA聚合酶。这些方法描述于1990年12月21日提交的WO90/07641中。聚合酶链式反应方法是本领域众所周知的。
用于扩增的另一种方法是连接酶链反应(“LCR”)，其被公开于欧洲申请No.320308中，通过引入全文并入本文。在LCR中，制备了两个互补探针对，并且在靶序列的存在下，每一对将与靶的相反互补链结合，使得它们邻接。在连接酶的存在下，两个探针对将连接以形成单一单元。通过温度循环(如在PCR中)，结合的连接单元从靶标上解离，然后作为用于连接过量探针对的“靶序列”。美国专利No.4,883,750描述了用于将探针对结合至靶序列的类似于LCR的方法。
如PCT申请号PCT/US87/00880中所述，Qbeta复制酶也可用作本发明中的再另一种扩增方法。该方法中，在RNA聚合酶存在下，将具有与靶互补的区域的RNA复制序列加入样品中。聚合酶将复制随后可被检测的复制序列。
等温扩增方法也可用于本发明的核酸的扩增，其使用限制性内切核酸酶和连接酶来实现在限制性位点的一条链中含有核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸的靶分子的扩增。Walker等(1992)，其通过引用方式全文并入本文。
链置换扩增(SDA)是进行核酸的等温扩增的另一种方法，其涉及多轮链置换和合成，即切口平移。一种类似的方法，称为修复链反应(RCR)，涉及在靶向扩增的整个区域上几个探针的退火，随后是修复反应，其中仅存在四种碱基中的两种。其他两种碱基可以作为便于检测的生物素化衍生物添加。在SDA中使用类似的方法。也可使用循环探针反应(CPR)检测靶特异性序列。在CPR中，具有非特异性DNA的3’和5’序列和特异性RNA的中间序列的探针与样品中存在的DNA杂交。杂交后，用RNase H处理反应物，探针产物被鉴定为消化后释放的不同产物。原始模板与另一个循环探针退火并重复该反应。
根据本发明，可以使用其它扩增方法，其被描述于GB申请No.2202328和PCT申请No.PCT/US89/01025中，每个通过引用方式全文并入本文。在前一申请中，“修饰的”引物用于PCR，如模板和酶依赖性合成。可以通过用捕获部分(例如生物素)和/或检测部分(例如酶)标记来修饰引物。在后一申请中，向样品中加入过量的标记的探针。在靶序列的存在下，探针结合并被催化切割。切割后，靶序列完整释放以被过量探针结合。标记的探针的切割表示靶序列的存在。
其它考虑的核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)，其中包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR。Kwoh等，(1989)；Gingeras等，PCT申请WO88/10315，其通过引用方式全文并入本文。在NASBA中，可以通过标准的苯酚/氯仿提取、临床样品的热变性、用裂解缓冲液处理和用于分离DNA和RNA的微型离心柱或RNA的盐酸胍提取来制备用于扩增的核酸。这些扩增技术涉及具有靶特异性序列的引物的退火。聚合后，用RNase H消化DNA/RNA杂合体，而双链DNA分子再次热变性。在任一种情况下，通过第二靶特异性引物的添加随后聚合，使单链DNA完全双链化。然后通过聚合酶(如T7或SP6)对双链DNA分子进行多重转录。在等温循环反应中，RNA逆转录成双链DNA，并用聚合酶(如T7或SP6)再转录一次。所得产物，无论是截短的还是完整的，都指示靶特异性序列。
Davey等的欧洲申请No.329822(通过引用方式全文并入本文)公开了一种涉及循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)的核酸扩增方法，其可以根据本发明使用。ssRNA是第一引物寡核苷酸的第一模板，其通过逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)延伸。然后通过核糖核酸酶H(RNaseH，对具有DNA或RNA的双链体中的RNA特异性的RNA酶)的作用从所得RNA：RNA双链体中除去DNA。所得ssDNA是第二引物的第二模板，其还包括与其模板同源的5’侧的RNA聚合酶启动子(以T7 RNA聚合酶为例)的序列。然后通过DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶1的大“Klenow”片段)延伸该引物，从而产生双链DNA(“dsDNA”)分子，具有与在引物之间的原始RNA的序列相同的序列并且在一端还具有启动子序列。该启动子序列可被适合的RNA聚合酶使用以制备DNA的许多RNA拷贝。然后这些拷贝可以重新进入循环，导致非常迅速的扩增。通过酶的适当选择，该扩增可在每个循环不添加酶的情况下等温完成。由于该过程的循环性质，可以选择DNA或RNA形式的起始序列。
Miller等的PCT申请WO89/06700(其全文通过引用方式并入本文)公开了一种基于启动子/引物序列与靶单链DNA(“ssDNA”)的杂交，随后该序列的许多RNA拷贝转录的核酸序列扩增方案。该方案不是循环的，即不从所得的RNA转录物产生新模板。其它扩增方法包括“race”和“单侧PCR”。Frohman(1990)和Ohara(1989)等，其每个通过引用方式全文并入本文。
基于在具有产生的“双-寡核苷酸”序列的核酸存在下连接两个(或更多个)寡核苷酸从而扩增双-寡核苷酸的方法也可用于本发明的扩增步骤。Wu等(1989)，其全文通过引用方式并入本文。
本发明的寡核苷酸探针或引物可以是任何合适的长度，其取决于具体的测定形式和具体的需要以及所用的靶序列。在优选的实施方案中，寡核苷酸探针或引物的长度为至少10个核苷酸(优选10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31，32…)，并且它们可以被调整以特别适用于所选择的核酸扩增系统和/或所用的杂交系统。如本领域内众所周知的，较长的探针和引物也本发明的范围内。本发明也包括长度大于30、大于40、大于50个核苷酸的引物和长度大于100、大于200、大于300、大于500、大于800和大于1000个核苷酸的探针。当然，较长的引物具有更昂贵的缺点，因此，本领域通常设计和使用长度为具有12至30个核苷酸的引物。如本领域众所周知的，长度为10至大于2000个核苷酸的探针可用于本发明的方法。对于上述同一性％，非特定描述的探针和引物的大小(例如16、17、31、24、39、350、450、550、900、1240个核苷酸，…)也在本发明的范围内。
在其它实施方案中，检测手段可以利用杂交技术，例如，其中特异性引物或探针被选择以与目标靶FSGM退火，然后进行选择性杂交的检测。如本领域众所周知的，可通过考虑与其靶序列杂交的熔点来设计寡核苷酸探针和引物(参见下文和Sambrook等，1989,Molecular Cloning--A Laboratory Manual,2nd Edition,CSH Laboratories；Ausubel等，1994,in Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Inc.,N.Y)。
为了在本发明的测定条件下能够发生杂交，寡核苷酸引物和探针应包含与本发明的FSGM的一部分具有至少70％(至少71％、72％、73％、74％)，优选至少75％(75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％)，且更优选至少90％(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)同一性的寡核苷酸序列。本发明的探针和引物是在严格杂交条件下与本发明的FSGM同源物杂交的那些，以及在至少中等严格条件下与本发明的FSGM同源物杂交的那些。在某些实施方案中，本发明的探针和引物与本发明的FSGM(基因序列(例如cDNA或mRNA))具有完全的序列同一性。应当理解，基于本文公开的本发明的FSGM，通过使用本领域已知的计算机比对和序列分析方法可以容易地设计其它探针和引物并用于本发明(参见Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Third Edition,edited by Cold Spring Harbor Laboratory,2000)。
3.抗体和标记
在一些实施方案中，本发明提供了包括用于本发明的FSGM(例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1)的高灵敏度检测和定量的标记的方法和组合物。本领域技术人员将认识到，许多策略可用于标记靶分子以使得能够在颗粒混合物中检测或区分它们。标记可以通过任何已知的方法连接，其中包括利用标记和靶之间的非特异性或特异性相互作用的方法。标记可提供可检测的信号或影响颗粒在电场中的迁移率。此外，标记可以直接或通过结合配偶体完成。
在一些实施方案中，标记包括与目的FSGM结合的结合配偶体，其中所述结合配偶体连接于荧光部分。本发明的组合物和方法可以利用高度荧光的部分，例如，在通过发射所述部分的激发波长的光的激光器刺激时，能够发射至少约200个光子的部分，其中所述激光器聚焦在包含所述部分的直径不小于约5微米的点上，并且其中通过所述激光器指向所述点的总能量不超过约3微焦耳。下面更详细地描述适用于本发明的组合物和方法的部分。
在一些实施方案中，本发明提供了用于检测生物分子的标记，所述标记包含与荧光部分连接的生物分子的结合配偶体，其中所述荧光部分在激光器发射所述部分的激发波长的光刺激时能够发射至少约200个光子，其中所述激光器聚焦在包含所述部分的直径不小于约5微米的点上。并且其中通过所述激光器指向所述点的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方案中，所述部分包含多个荧光实体，例如约2至4个、2至5个、2至6个、2至7个、2至8个、2至9个、2至10个、或约3至5个、3至6个、3至7个、3至8个、3至9个、或3至10个荧光实体。在一些实施方案中，所述部分包括约2至4个荧光实体。在一些实施方案中，生物分子是蛋白质或小分子。在一些实施方案中，生物分子是蛋白质。荧光实体可以是荧光染料分子。在一些实施方案中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚环体系，其中吲哚环的3-碳上的取代基含有化学反应性基团或共轭物质。在一些实施方案中，染料分子是选自Alexa Flour488、Alexa Flour 532、Alexa Flour 647、Alexa Flour 680或Alexa Flour 700的AlexaFlour分子。在一些实施方案中，染料分子是选自Alexa Flour 488、Alexa Flour 532、Alexa Flour 680或Alexa Flour 700的Alexa Flour分子。在一些实施方案中，染料分子是Alexa Flour 647染料分子。在一些实施方案中，染料分子包括第一类型和第二类型的染料分子，例如两种不同的Alexa Flour分子，例如其中第一类型和第二类型的染料分子具有不同的发射光谱。第一类型染料分子与第二类型染料分子的比率可以是例如4比1、3比1、2比1、1比1、1比2、1比3或1比4。结合配偶体可以是例如抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了用于本发明的生物FSGM的检测的标记，其中所述标记包含FSGM的结合配偶体和荧光部分，其中所述荧光部分在激光器发射所述部分的激发波长的光刺激时能够发射至少约200个光子，其中该激光器聚焦在包含该部分的直径不小于约5微米的点上。并且其中通过所述激光器指向所述点的总能量不超过约3微焦耳。在一些实施方案中，荧光部分包含荧光分子。在一些实施方案中，荧光部分包含多个荧光分子，例如约2至10个、2至8个、2至6个、2至4个、3至10个、3至8个或3至6个荧光分子。在一些实施方案中，标记包含约2至4个荧光分子。在一些实施方案中，荧光染料分子包含至少一个取代的吲哚环体系，其中吲哚环的3-碳上的取代基含有化学反应性基团或共轭物质。在一些实施方案中，荧光分子选自Alexa Flour 488、Alexa Flour 532、Alexa Flour 647、AlexaFlour 680或Alexa Flour 700。在一些实施方案中，荧光分子选自Alexa Flour 488、AlexaFlour 532、Alexa Flour 680或Alexa Flour 700。在一些实施方案中，所述荧光分子是Alexa Flour 647分子。在一些实施方案中，结合配偶体包括抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在其它实施方案中，抗体是多克隆抗体。
如本文所用，术语“抗体”是广义的术语并以其普通意义使用，包括但不限于指天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，其中包括例如单链抗体、嵌合抗体、双功能抗体和人源化抗体，以及其抗原结合片段。抗体的“抗原结合片段”指参与抗原结合的抗体的部分。抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N-末端可变区(“V”)的氨基酸残基形成。应当理解，抗体针对其产生的分子的表位或区域的选择将决定其特异性，例如，对于各种形式的分子，如果存在的话，或对于全部(例如，全部或基本上全部的分子)。
制备抗体的方法是成熟的。本领域技术人员将认识到许多方法可用于生产抗体，例如，如Antibodies,A Laboratory Manual,Ed Harlow and David Lane,Cold SpringHarbor Laboratory(1988),Cold Spring Harbor,N.Y中所描述。本领域技术人员还将理解，模拟抗体的结合片段或Fab片段也可以通过各种方法从遗传信息制备(AntibodyEngineering:A Practical Approach(Borrebaeck,C.,ed.),1995,Oxford UniversityPress,Oxford；J.Immunol.149,3914-3920(1992))。针对分子(例如蛋白质)和标志物的单克隆和多克隆抗体也可商业购买(Rand D Systems,Minneapolis,Minn.；HyTest,HyTestLtd.,Turku Finland；Abeam Inc.,Cambridge,Mass.,USA,Life Diagnostics,Inc.,WestChester,Pa.,USA；Fitzgerald Industries International,Inc.,Concord,Mass.01742-3049USA；BiosPacific,Emeryville,Calif)。
在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在其它实施方案中，抗体是单克隆抗体。
抗体可通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任何一种制备(参见例如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。通常，抗体可通过细胞培养技术产生，其中包括如本文所述的单克隆抗体的产生，或通过将抗体基因转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中以允许重组抗体的产生。
单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，例如Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol.6:511-519,1976)的技术及其改进。这些方法涉及能够产生具有所需特异性的抗体的永生化细胞系的制备。单克隆抗体也可通过重组DNA方法制备，如美国专利No.4,816,567中描述的那些。公开的方法中使用的编码抗体的DNA可以使用常规方法分离和测序。重组抗体、抗体片段和/或其融合物可以在体外或在原核细胞(例如细菌)或真核细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中表达，并且根据需要使用已知的方法进一步纯化。
更具体地，单克隆抗体(MAbs)可以通过使用众所周知的技术容易地制备，例如在美国专利No.4,196,265中举例说明的那些，其通过引用并入本文。典型地，该技术涉及用选择的免疫原组合物(例如纯化的或部分纯化的表达蛋白、多肽或肽)免疫合适的动物。免疫组合物以有效刺激抗体产生细胞的方式施用。用于产生单克隆抗体(MAbs)的方法通常与制备多克隆抗体的那些方法相同。啮齿动物如小鼠和大鼠是优选的动物，但是，使用兔、绵羊或蛙细胞也是可能的。大鼠的使用可提供某些优点(Goding,1986,pp.60-61)，但优选小鼠，最优选BALB/c小鼠，因为这是最常使用的，并且通常给出更高百分比的稳定融合体。
抗体也可以源自基于已经在计算机上设计并由合成产生的多核苷酸编码的氨基酸序列的重组抗体文库。设计和获得在计算机上创建的序列的方法是本领域已知的(Knappik等，J.Mol.Biol.296:254:57-86,2000；Krebs等，J.Immunol.Methods 254:67-84,2001；美国专利No.6,300,064))。
使用本领域已知的技术进行抗体的消化以产生其抗原结合片段。例如，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中两个(“F(ab)”片段)各自包括含有完整的抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供几个片段，包括“F(ab’)2”片段，其包含两个抗原结合位点。“Fv”片段可通过IgM、IgG或IgA免疫球蛋白分子的优先蛋白水解裂解产生，但更通常使用本领域已知的重组技术衍生。Fv片段包括非共价VH::VL异源二聚体，其包含保留天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力的抗原结合位点(Inbar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2659-2662(1972)；Hochman等，Biochem.15:2706-2710(1976)；和Ehrlich等，Biochem.19:4091-4096(1980)).
也可以使用已知技术(例如美国专利No.5,885,793中描述的技术)从scFv文库中分离与本文公开的蛋白质FSGM特异性结合的抗体片段。
本领域内存在多种表达系统可用于生产包括Fab片段、scFv、VL和VH在内的抗体片段。例如，原核和真核来源的表达系统可用于抗体片段的大规模生产。特别有利的是允许将大量抗体片段分泌至培养基中的表达系统。已经描述了用于大规模生产抗体片段和抗体融合蛋白的真核表达系统，其基于哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物、转基因动物和低等真核生物。例如，可以在酵母发酵系统中实现抗体片段的经济的大规模生产。这些有机体的大规模发酵是本领域众所周知的，且目前用于大量生产几种重组蛋白。
在一些情况下，与本发明方法中使用的蛋白质FSGM结合的抗体是可商购的或无需过度实验即可获得。
在其它实施方案中，特别是将寡核苷酸用作检测mRNAN FSGM或其它基于FSGM的核酸并与之杂交的结合配偶体时，结合配偶体(例如寡核苷酸)可包括标记，例如荧光部分或染料。此外，本发明的任何结合配偶体(例如抗体)也可以用荧光部分标记。该部分的荧光将足以允许在单分子检测器(例如本文所述的单分子检测器)中的检测。本文所用术语“荧光部分”包括一个或多个荧光实体，其总荧光使得该部分可在本文所述的单分子检测器中被检测。因此，荧光部分可包括单个实体(例如，量子点或荧光分子)或多个实体(例如，多个荧光分子)。应当理解，当本文使用术语“部分”时，其是指一组荧光实体，例如多个荧光染料分子，每个单独的实体均可分别连接至结合配偶体，或者这些实体可一起连接，只要作为一组的实体提供足够的待检测荧光。
通常，所述部分的荧光涉及量子效率和光漂白缺乏的组合，其足以使所述部分在单分子检测器中在背景水平以上可检测到，具有与所需检测极限、准确度和测定精密度所必需的一致性。例如，在一些实施方案中，荧光部分的荧光使其允许在本文所述的仪器中以小于约10、5、4、3、2、1、0.1、0.01、0.001、0.00001或0.000001pg/ml的检测限和小于约20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小(例如约10％或更小)的变异系数检测和/或定量分子(例如FSGM)。在一些实施方案中，荧光部分的荧光使得其允许在本文所述的仪器中以小于约5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001pg/ml的检测限和小于约10％的变异系数检测和/或定量分子(例如FSGM)。如本文所用的那些术语，“检测限”或LoD包括可识别样品为包含目标物质的分子的最低浓度，例如第一非零值。它可以由零的可变性和标准曲线的斜率来定义。例如，试验的检测限可以通过运行标准曲线，确定标准曲线的零值，并将2个标准偏差加到该值上来确定。产生等于该值的信号的目标物质的浓度是“检测下限”浓度。
此外，所述部分具有与其在所选测定中的使用一致的性质。在一些实施方案中，所述测定是免疫测定，其中所述荧光部分连接至抗体；该部分必须具有使其不与其它抗体或蛋白质聚集，或经历不超过与测定要求的准确度和精密度一致的聚集的性质。在一些实施方案中，优选的荧光部分是具有1)高吸收系数；2)高量子产率；3)高光稳定性(低光漂白)；和4)与标记目标分子(例如，蛋白质)的相容性的组合的荧光部分，例如染料分子，使得其可以使用本发明的分析仪和系统来分析(例如，不引起目标蛋白质的沉淀，或已与所述部分连接的蛋白质的沉淀)。
可以使用任何合适的荧光部分。实例包括但不限于Alexa Flour染料(MolecularProbes,Eugene,Oreg.)。Alexa Flour染料公开于美国专利No.6,977,305；6,974,874；6,130,101和6,974,305，其通过引用方式全文并入本文。本发明的一些实施方案使用选自如下的染料：Alexa Flour 647、Alexa Flour 488、Alexa Flour 532、Alexa Flour 555，Alexa Flour 610、Alexa Flour 680、Alexa Flour 700和Alexa Flour 750。本发明的一些实施方案使用选自如下的染料：Alexa Flour 488、Alexa Flour 532、Alexa Flour 647、Alexa Flour 700和Alexa Flour 750。本发明的一些实施方案使用选自如下的染料：AlexaFlour 488、Alexa Flour 532、Alexa Flour 555、Alexa Flour 610，Alexa Flour 680、Alexa Flour 700和Alexa Flour 750。本发明的一些实施方式利用了Alexa Flour 647分子，其最大吸收在约650和660nm之间，最大发射在约660和670nm之间。Alexa Flour 647染料单独使用或与其它Alexa Flour染料组合使用。
在一些实施方案中，使用本发明的分析仪系统用于检测样品中的FSGM的荧光标记部分是量子点。量子点(QD)，也称为半导体纳米晶体或人造原子，是包含100-1000个之间的任何电子和2-10nm范围的半导体晶体。一些QD的直径可以在10-20nm之间。QD具有高量子产率，这使得它们特别适用于光学应用。QD是通过形成激子来发荧光的荧光团，其类似于传统荧光团的激发态，但具有长得多的高达200纳秒的寿命。该性质提供了具有低光漂白的QD。可以通过改变QD的尺寸和形状以及QD电位的深度来控制QD的能级。小激子QD的一个光学特征是着色，其由点的尺寸决定。点越大，荧光越红，或者越朝向光谱的红色端。点越小，越蓝或越朝向蓝色端。确定能量并因此确定荧光的颜色的带隙能量与QD尺寸的平方成反比。较大的QD具有更紧密间隔的更多能级，因此允许QD吸收含有较少能量的光子，即那些更接近光谱红色端的光子。因为点的发射频率取决于带隙，所以以极高精确度控制点的输出波长是可能的。在一些实施方案中，用单分子分析仪系统检测的蛋白质用QD标记。在一些实施方案中，单分子分析仪用于检测用一种QD标记的蛋白质并使用滤光片以允许在不同波长下检测不同蛋白质。
F.分离的FSGM
1.分离的多肽FSGM
本发明的一个方面涉及分离的FSGM蛋白及其生物活性部分，其中包括分泌蛋白如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1，以及适合用作产生针对FSGM蛋白或其片段的免疫原的多肽片段。在一个实施方案中，天然FSGM蛋白可通过使用标准蛋白纯化技术的适当纯化方案分离。在另一个实施方案中，通过重组DNA技术产生包括FSGM蛋白的全部或片段的蛋白质或肽。作为重组表达的替代，这种蛋白质或肽可使用标准肽合成技术化学合成。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自蛋白质所来源的细胞或组织源的细胞物质或其它污染性蛋白质，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学品。表述“基本上不含细胞物质”包括其中蛋白质与其从中分离或重组产生的细胞中的细胞组分分离的蛋白质制剂。因此，基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％或5％(干重)的异源蛋白质(本文中也称为“污染蛋白质”)的蛋白质制剂。当重组产生蛋白质或其生物活性部分时，其还优选地基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、10％或5％。当通过化学合成产生蛋白质时，其优选地基本上不含化学前体或其它化学物质，即其与蛋白质合成中涉及的化学前体或其它化学物质分离。因此，除目标多肽以外，这种蛋白质的制剂具有少于约30％、20％、10％、5％(干重)的化学前体或化合物。
FSGM蛋白的生物活性部分包括多肽，所述多肽包含与FSGM蛋白的氨基酸序列足够同一或衍生自FSGM蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列，其包括少于全长蛋白的氨基酸，并表现出相应全长蛋白的至少一种活性。通常，生物活性部分包括具有相应全长蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。本发明的FSGM蛋白的生物活性部分可以是例如长度为10、25、50、100或更多氨基酸的多肽。此外，可以通过重组技术制备FSGM蛋白的其它区域缺失的其它生物活性部分，并针对FSGM蛋白天然形式的一种或多种功能活性进行评估。
优选的FSGM蛋白列于表2、表4和/或图3。其它有用的蛋白质与这些序列中的一个基本上同一(例如，至少约40％、优选50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)，并保留相应天然存在的FSGM蛋白的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上不同。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的百分比同一性，出于最佳比较目的比对序列(例如，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空隙，以用于与第二氨基酸或核酸序列的最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在该位置是相同的。优选地，使用全局比对计算两个序列之间的百分比同一性。或者，使用局部比对计算两个序列之间的百分比同一性。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置的#/位置的总数#(例如，重叠位置)×100)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。在另一个实施方案中，两个序列的长度不同。
可以使用数学算法来完成两个序列之间的百分比同一性的确定。用于两个序列的比较的优选的非限制性的数学算法的实例是Karlin和Altschul(1990)的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,modified as in Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877)。这种算法被并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸检索可以用BLASTN程序进行，分值＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可用BLASTP程序进行BLAST蛋白质检索，分值＝50，字长＝3，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带空位比对，如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所描述，可以使用称为Gapped BLAST的BLAST算法的更新版本。其能够对程序BLASTN、BLASTP和BLASTX进行带空位的局部比对。或者，PSI-blast可用于进行检测分子间距离关系的迭代搜索。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-blast程序时，可以使用相应程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。参见NCBI网站。另一个用于序列比较的数学算法的优选的非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法。这种算法被并入ALIGN程序(2.0版)，其是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残差表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。另一种用于鉴定局部序列相似性和比对的区域的有用算法是如Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448中所描述的FASTA算法。当使用FASTA算法用于比较核苷酸或氨基酸序列时，PAM120权重残差表可例如与2的k元组值一起使用。
在允许或不允许空位隙的情况下，可以使用与上述技术类似的技术确定两个序列之间的百分比同一性。在计算同一性百分比时，仅计算精确匹配。
2.分离的核酸FSGM
本发明的一个方面涉及编码FSGM蛋白或其部分(例如分泌蛋白或其部分)的分离的核酸分子。本发明的分离的核酸还包括足以用作鉴定FSGM核酸分子的杂交探针的核酸分子，和FSGM核酸分子的片段，例如那些适合用作FSGM核酸分子的特定产物或突变的扩增的PCR引物。如本文所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选双链DNA。
“分离的”核酸分子是与存在于核酸分子天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。在一个实施方案中，“分离的”核酸分子(优选编码蛋白质的序列)不包含该核酸来源的有机体的基因组DNA中天然位于该核酸两侧的序列(即，位于该核酸的5’和3’端的序列)。例如，在各种实施方案中，分离的核酸分子可包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然位于该核酸来源的细胞中的基因组DNA中该核酸分子的两侧。在另一个实施方案中，当通过重组技术产生“分离的”核酸分子(如cDNA分子)时，其可以基本上不含其它细胞物质或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。基本上不含细胞物质的核酸分子包括具有少于约30％、20％、10％或5％异源核酸(本文也称为“污染核酸”)的制剂。
本发明的核酸分子可使用标准分子生物学技术和本文所述数据库记录中的序列信息分离。使用这些核酸序列的全部或一部分，本发明的核酸分子可使用标准杂交和克隆技术被分离(例如，如Sambrook等，ed.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中所描述的)。
本发明的核酸分子可根据标准PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物扩增。如此扩增的核酸可以被克隆至合适的载体中并通过DNA序列分析表征。此外，对应于本发明的核酸分子的全部或部分的核苷酸可以通过标准合成技术制备，例如使用自动DNA合成仪。
在另一个优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括具有与FSGM核酸的核苷酸序列或与编码FSGM蛋白的核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸分子。与给定的核苷酸序列互补的核酸分子是与给定的核苷酸序列充分互补的核酸分子，其可与给定核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双链体。
此外，本发明的核酸分子可以仅包括核酸序列的一部分，其中全长核酸序列包括FSGM核酸或编码FSGM蛋白。这样的核酸可用作例如探针或引物。探针/引物通常作为一种或多种基本上纯化的寡核苷酸使用。寡核苷酸通常包括在严格条件下与本发明核酸的至少约15，更优选至少约25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400或多个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
基于本发明的核酸分子序列的探针可用于检测对应于本发明的一种或多种FSGM的转录物或基因组序列。在某些实施方案中，探针与跨越剪接接合的核酸序列杂交。探针包含附接于其上的标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这样的探针可用作用于鉴定表达或错误表达该蛋白质的细胞或组织的诊断测试试剂盒或检测板的一部分，例如通过测量来自受试者的细胞样品中编码蛋白质的核酸分子的水平，例如检测mRNA水平或测定编码蛋白质的基因或其翻译控制序列是否已经突变或缺失。
本发明进一步包括由于遗传密码的简并性而不同于编码FSGM蛋白(例如，具有序列表中提供的序列的蛋白)的核酸的核苷酸序列并因此编码相同蛋白的核酸分子。
本领域技术人员将理解，导致氨基酸序列变化的DNA序列多态性可存在于群体(例如人类群体)中。由于天然等位基因变异，这种遗传多态性可存在于群体中的个体中。等位基因是在给定基因位点上交替出现的一组基因中的一个。此外，应当理解，影响RNA表达水平的DNA多态性也可以存在，其可以影响该基因的总体表达水平(例如，通过影响调控或退化)。
如本文所用，短语“等位基因变体”是指存在于给定基因位点的核苷酸序列或由所述核苷酸序列编码的多肽。
如本文所用，术语“基因”和“重组基因”是指包括编码对应于本发明FSGM的多肽的开放阅读框的核酸分子。这种天然等位基因变异通常可导致给定基因的核苷酸序列1-5％的变异。可以通过对许多不同个体中的目的基因测序来鉴定可选等位基因。这可以通过使用杂交探针很容易进行以在多种个体中鉴定相同的基因位点。作为天然等位基因变异的结果并且不改变功能活性的任何和所有这样的核苷酸变异和产生的氨基酸多态性或变异都在本发明的范围内。
在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子的长度为至少15、20、25、30、40、60、80，100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500个或更多核苷酸，并且在严格条件下与FSGM核酸或编码标志物蛋白的核酸杂交。如本文所用，术语“在严格条件下杂交”旨在描述用于杂交和洗涤的条件，在所述条件下彼此具有至少60％(65％、70％、优选75％)同一性的核苷酸序列通常保持彼此杂交。这样的严格条件是本领域技术人员已知的，并且可在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989)的第6.3.1－6.3.6节中找到。严格杂交条件的一个优选的非限制性实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃下杂交，随后在50-65℃下，在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。
G.共济蛋白替代疗法
本公开中提供的方法是指与FXN替代疗法相关的基因表达谱的测定。FXN替代疗法涉及向有需要的受试者施用FXN替代疗法。可以设想用于递送外源性FXN的多种替代方案。FXN替代疗法可通过FXN蛋白递送或通过递送编码FXN的核酸来提供。FXN蛋白递送可以是全长FXN的递送或FXN融合蛋白的递送。
如本文所用，术语“FXN融合蛋白”是指与不同蛋白质的全长或片段或与肽融合的FXN或FXN片段。在一些实施方案中，FXN融合蛋白包括含有FXN的多肽，例如全长hFXN(SEQID NO:1)或成熟hFXN(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，FXN融合蛋白还包含细胞穿透肽(CPP)。
如本文所用，术语“细胞穿透肽”或“CPP”是指短肽序列，通常长度为5-30个氨基酸，其可促进细胞摄入各种分子货物(例如蛋白质)。在本发明的背景下，存在于FXN融合蛋白中的CPP促进FXN融合蛋白向细胞(例如受体细胞)的递送。CPP可以是聚阳离子的，即具有含有带正电荷的氨基酸，例如赖氨酸或精氨酸的高相对丰度的氨基酸组成。CCP也可以是两亲性的，即具有包含极性/带电氨基酸和非极性、疏水性氨基酸的交替模式的序列。CPP也可以是疏水性的，即仅包含具有低净电荷的非极性残基，或具有对细胞摄取至关重要的疏水性氨基酸基团。
可以包含在FXN融合蛋白中的CPP可以是本领域技术人员已知的任何CPP。例如，CPP可以是在Database of Cell Penetrating Peptides CPPsite 2.0中列出的任何CPP，其全文通过引入并入本文。例如，在本发明背景下有用的CPP可以是衍生自蛋白质的细胞穿透肽，其选自HIV转录肽的反式激活因子(HIV-TAT)、甘丙肽、黄蜂毒素、transportan、渗透素、聚精氨酸、VP22、transportan、两亲性肽如MAP、KALA、ppTG20、富含脯氨酸的肽、MPG衍生的肽、pep-1、以及寡聚物、富含精氨酸的肽和降钙素衍生的肽。
在一些实施方案中，CPP包括TAT蛋白结构域，该TAT蛋白结构域包含86个氨基酸的全长HIV-TAT蛋白质的氨基酸47-57(该11个氨基酸的肽在本文中也可称为“HIV-TAT”；SEQID NO:4)。在一个实施方案中，CPP由HIV-TAT(SEQ ID NO:4)组成。在一些实施方案中，CPP包括86个氨基酸全长HIV-TAT蛋白质的氨基酸47-57，其中在氨基末端添加甲硫氨酸用于起始(12AA；“HIV-TAT+M”)：MYGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:5)。下表5列出了示例性CPP的氨基酸序列。
表5.示例性CPPs和相应序列
Figure BDA0003444474690000731
Figure BDA0003444474690000741
在一些实施方案中，包含在FXN融合蛋白中的CPP是HIV-TAT(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，FXN融合蛋白包括全长FXN(例如SEQ ID NO:1)和HIV-TAT(例如SEQ ID NO:4)作为CPP。
在一些实施方案中，本公开的FXN融合蛋白中，CPP可以通过接头与FXN(例如全长FXN)融合在一起以形成单一多肽链。FXN融合蛋白的示例包括TAT-FXN融合蛋白，其中TAT或TAT片段可直接或间接(通过接头)连接于FXN的N-或C-末端。在一个具体实例中，接头可包括氨基酸序列GG。
在一些方面，存在于本公开的FXN融合蛋白中的CPP(例如HIV-TAT)促进FXN融合蛋白向细胞(例如可存在于体外、离体或受试者中的细胞)的递送。一旦在细胞内，FXN融合蛋白可通过细胞机制加工以从FXN中去除CPP(例如HIV-TAT)。
TAT-FXN融合蛋白的一个具体示例称为CTI-1601。CTI-1601是24.9kDa融合蛋白，其目前作为恢复FRDA患者的线粒体中FXN的功能水平的FXN替代疗法正在被研究的。CTI-1601包括与全长hFXN蛋白的N-末端连接的HIV-TAT肽。CTI-1601的作用机制依赖于HIV-TAT肽的细胞穿透能力，以将CTI-1601递送到细胞中，并随后在易位到线粒体中后加工为成熟的hFXN。CTI-1601描述于美国临时专利申请No.62/880,073和No.62/891,029，其各自通过引用方式全文并入本文中。CTI-1601包括以下氨基酸序列(224位氨基酸)：MYGRKKRRQRRRGGMWTLGRRAVAGLLASPSPAQAQTLTRVPRPAELAPLCGRRGLRTDIDATCTPRRASSNQRGLNQIWNVKKQSVYLMNLRKSGTLGHPGSLDETTYERLAEETLDSLAEFFEDLADKPYTFEDYDVSFGSGVLTVKLGGDLGTYVINKQTPNKQIWLSSPSSGPKRYDWTGKNWVYSHDGVSLHELLAAELTKALKTKLDLSSLAYSGKDA(SEQ ID NO:12)。
FXN替代也可通过病毒基因替代来递送，其可利用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒载体以及腺病毒。或者，FXN替代疗法可通过内源性突变FXN基因的上调来实现，这取决于GAA重复的数目，其在突变FXN等位基因的携带者中以不同水平表达。
H.FSGM应用
在一些方面，本发明提供了用于评估和/或监测受试者中FXN替代疗法的功效的方法。本发明进一步提供了用于确定受试者是否需要FXN替代疗法或调整FXN替代疗法的方法，例如，确定受试者中FXN替代疗法是否应该开始、增加、减少或终止。在一些实施方案中，所述方法是由受试者使用从相同受试者获得的样品进行或作为护理点测试进行，并且可由受试者或医师评估结果。在一个方面，本发明构成了可通过本发明的方法获得的与分析、检测和/或测量本发明的一种或多种FSGM(即表2、表4和/或图3的FSGM)相关的信息的应用。在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白。例如，在一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61。在另一个实施方案中，一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。
例如，当执行用于检测和/或测量本发明的一种或多种蛋白质FSGM(如本文所述，即表2、表4和/或图3的FSGM，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的本发明的方法时，可以使生物样品与选择性地与目标FSGM结合的检测试剂(例如，单克隆抗体)接触，形成蛋白质-蛋白质复合物，其然后进一步直接(如果抗体包含标记)或间接(如果使用次级检测试剂，例如第二抗体，其又被标记)检测。因此，本发明的方法将本发明的多肽FSGM(即表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)转化为包含可检测的第一抗体或第一和进一步的第二抗体的蛋白质-蛋白质复合物。为了鉴定目标FSGM的存在，需要形成这样的蛋白质-蛋白质复合物，并且有必要由于实施本发明的方法而改变目标FSGM的物理特性和性质。
当进行本发明的方法用于检测对应于本发明的一种或多种FSGM(即表2、表4和/或图3的FSGM，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的核酸时，适用同样的原理。特别地，当使用扩增方法时，该方法导致新扩增子群体的形成，即新合成的且在原始生物样品中不存在的分子，从而物理转化生物样品。类似地，当杂交探针被用于检测靶FSGM时，通过探针(任选地包括标记)与靶生物标志物mRNA(或其它核酸)的杂交有效地产生物理上新的分子种类，其然后检测。这些多核苷酸产物是由于实施本发明的方法而有效地新产生或形成的。
还提供了用于监测或评估受试者中FXN替代疗法随时间的功效的方法。在这些方法中，评估了一对样品(在较早的时间点或在治疗方案之前从受试者处获得的第一样品和在较晚的时间点从受试者处获得的第二样品，例如当受试者已经历治疗方案的至少一部分的较晚时间点)中一种或多种FSGM(即表2、表4和/或图3的FSGM，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的量。应当理解，本发明的方法包括以规律的或无规律的间隔获得和分析多于两个样品(例如，3、4、5、6、7、8、9个或更多个样品)以评估FSGM水平。可以在连续或非连续受试者样本之间进行成对比较。FSGM水平的趋势和FSGM水平的变化率可以针对任何两个或更多个连续或非连续的受试者样品进行分析。
用于检测生物样品中FSGM蛋白或对应的核酸的表达水平的存在或缺乏或变化的示例性方法包括从受试者处获得生物样品，并将生物样品与能够检测多肽或核酸(例如mRNA、基因组DNA或cDNA)的化合物或试剂接触。在一些实施方案中，本发明的检测方法因此可用于检测例如体外以及体内生物样品中的mRNA、蛋白质、cDNA或基因组DNA。
本文提供的用于检测生物样品中FSGM蛋白(例如分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白，如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)或相应的核酸的表达水平的存在、缺乏、变化的方法包括从可能含有或不含有待检测的FSGM蛋白或核酸的受试者处获得生物样品，使所述样品与能够与待检测的FSGM蛋白或核酸形成复合物的FSGM特异性结合剂(即一种或多种FSGM特异性结合剂)接触，并使样品与用于检测FSGM-FSGM特异性结合剂复合物(如果形成的话)的检测试剂接触。应当理解，本文提供的用于检测生物样品中FSGM表达水平的方法包括进行测定的步骤。在检测方法的某些实施方案中，样品中FSGM蛋白或核酸的水平不存在或低于检测阈值。
所述方法包括在FSGM和FSGM特异性结合剂之间形成瞬时或稳定的复合物。所述方法需要所述复合物(如果形成)形成足够的时间以允许检测试剂结合至复合物并产生可检测的信号(例如荧光信号、来自酶反应(例如过氧化物酶反应、磷酸酶反应、β-半乳糖苷酶反应或聚合酶反应)的产物的信号)。
在某些实施方案中，使用相同的方法检测所有FSGM。在某些实施方案中，使用相同的生物样品(例如，相同的体液或组织)检测所有FSGM。在某些实施例中，使用各种方法检测不同的FSGM。在某些实施方案中，在不同的生物样品中检测FSGM。在一些实施方案中，生物样品是体液样品，例如血液(包括任何血液制品，例如全血、血浆、血清或血液的特定类型的细胞)、尿液、唾液或精液，或固体组织样品，例如皮肤活检样品、皮肤带、毛囊、肌肉活检样品或口腔样品。
FSGM水平可基于绝对表达水平或标准化或相对表达水平检测。当监测受试者的治疗或确定受试者的FXN状态是否有变化时，优选检测绝对FSGM水平。例如，可以在经历FXN替代疗法治疗的受试者中监测一种或多种FSGM的表达水平，例如以规律的间隔，如每月间隔。可以随时间监测一个或多个FSGM水平的调节，以观察FSGM水平变化的趋势。本发明的FSGM在受试者中的表达水平可以高于正常样品中那些FSGM的表达水平，但可以低于先前的表达水平，因此表明缺乏受试者FXN替代疗法的功效。相比于群体中存在的FSGM水平，FSGM水平的改变或不改变可能与受试者的治疗决定更相关。受试者中FSGM水平的快速变化可以是异常FXN水平的指示，即使FSGM在群体的正常范围内。
作为基于FSGM的绝对表达水平进行测定的替代方法，可以基于FSGM的标准化表达水平进行测定。通过比较FSGM的表达与不是FSGM的基因(例如组成型表达的管家基因)的表达来校正FSGM的绝对表达水平，从而使表达水平标准化。用于标准化的合适基因包括管家基因如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性基因。这种标准化允许比较一个样品(例如来自FXN缺乏受试者的样品)与另一个样品(例如正常样品)或来自不同来源的样品之间的表达水平。
本公开描述了一种用于对有需要的患者评估和/或监测用FXN替代疗法治疗的疗效的方法，其中分析来自患者的样品。如本文所用，样品可以是体液样品，例如血液样品，或固体组织样品，例如皮肤活检样品、肌肉活检样品，或者样品可以是口腔样品。基本上，包含可以分析其中的FXN表达谱的细胞的任何组织或体液的样品均可用于本文公开的任何方法。或者，可以收获外泌体以检测FSGM转录物。
如实施例中所述，使用基于细胞的系统来验证基线FXN(-)表达谱，其中FXN被下调，并且FXN替代疗法(例如FXN融合蛋白)的治疗证明FSGM的相反调节。
本文所述的FXN表达谱的任何一种可是一种或多种算法的部分，所述算法可用于分析样品的FXN表达谱并测定样品是否代表正常受试者的样品、来自FXN替代疗法前患者的样品或FXN替代治疗后患者的样品。一种或多种算法可用于分析来自用FXN替代药物治疗的患者的样品，并确定患者是否对治疗产生有效地反应，并因此是否表达FXN替代表达谱的特征性谱。因此，用于分析样品的表达谱的算法可以使用基线FXN(-)表达谱、FXN替代表达谱或正常FXN表达谱或谱的组合中的任何一种。其中具有与基线FXN(-)表达谱一致的FXN签名表达模式的样品代表缺乏FXN替代疗法的疗效；具有与FXN替代表达谱和/或正常FXN表达谱一致的FXN表达谱的样品代表FXN替代疗法的疗效。在一个实施方案中，可将分类器应用于从患者样品获得的FXN表达谱，以获得关于样品的信息，例如表征FXN表达谱的状态，或确定患者是否施用FXN替代疗法。或者或另外，可应用分类器来评估患者样品的FXN表达谱是否达到FXN替代疗法被认为有效所需的特定阈值。
本公开还提供了患有具有FXN缺乏的线粒体疾病的患者的治疗方法，所述方法包括测定来自患者的样品中的FXN表达谱，并比较从样品获得的FXN表达谱和正常FXN表达谱、基线FXN(-)表达谱或FXN替代表达谱中的至少一种。样品可进一步分类为具有正常FXN、基线FXN(-)或FXN替代谱。使用样品FXN谱和本文所述FXN谱的比较结果，可以开始、暂停或终止使用FXN替代疗法的治疗方案。或者，可以调整FXN替代治疗剂量方案，例如增加或减少。在一个实施方案中，所述方法进一步包括从受试者(例如患有FXN缺乏的受试者)处获得或提供样品。
在本文提供的方法的某些实施方案中，与对照样品(例如来自缺乏FXN的受试者的样品)中的一种或多种FSGM的水平相比，生物样品中选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM(例如分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白，如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的水平升高或降低表明FXN替代疗法有效。
在本文提供的方法的某些实施方案中，与对照样品(例如来自缺乏FXN的受试者的样品)中一种或多种FSGM的表达水平相比，生物样品中检测到的选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM(例如分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白，如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的表达水平没有升高或降低是FXN替代疗法(例如在当前剂量下)无效的指示，并且应该进行调整。
在某些实施方案中，所述方法还可以包括监测正在施用FXN替代疗法的受试者。在一些实施方案中，与对受试者施用FXN替代疗法之前从受试者获得的第一样品中一种或多种FSGM的水平相比，在向受试者施用FXN替代疗法后从受试者获得的第二样品中检测到的选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM(例如分泌性蛋白，例如表2中定义的分泌性蛋白，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的表达水平没有升高或降低，指示FXN替代疗法无效和/或受试者对FXN替代疗法无反应。该方法可进一步包括将FXN替代治疗调节至更高剂量的步骤。
在其它实施方案中，与在施用FXN替代疗法之前从受试者获得的第一样品中的一种或多种FSGM(例如分泌蛋白，如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的表达水平相比，在向受试者施用FXN替代疗法后从受试者获得的第二样品中一种或多种选自表2、表4和/或图3的FSGM(例如分泌蛋白，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1)的表达水平升高或降低指示FXN替代疗法有效和/或受试者对FXN替代疗法有反应。该方法可进一步包括将FXN替代治疗调节至较低剂量或终止治疗的步骤。
在某些实施方案中，FSGM水平在用FXN替代治疗受试者(例如FXN缺乏的受试者)后升高。在一些实施方案中，该FSGM选自由mt-RNR1，mt-RNR2，ADNP，AI480526，C230034O21RIK，CCDC85B，CCDC85C，CTCFL，NRTN，PDE4A，PHF1，RPL37RT，SLC26A10，SNORD17，SUV420H2，WNK2，YAM1或ZNRF1组成的组。
在其它实施方案中，FSGM水平在用FXN替代治疗受试者(例如FXN缺乏的受试者)后降低。在一些实施方案中，该FSGM选自由CYR61、mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CO2、mt-CO3、mt-ND1、mt-ND2、mt-ND3和mt-ND4、EGR1、EGR2、EGR3、IGF1、LAMP2或SLIRP组成的组。
在其他实施方案中，本发明还涉及对任何临床和/或患者相关健康数据的分析和考虑，例如，从电子医疗记录获得的数据(例如，与各种类型的数据相关的关于个体患者或群体的电子健康信息的收集，诸如人口统计学、病史、药物治疗和过敏症、免疫状态、实验室测试结果、放射学图像、生命体征、个人统计数据诸如年龄和体重，以及账单信息)。
在某些实施方案中，本文提供的方法进一步包括从怀疑患有线粒体疾病(例如FRDA)的受试者获得生物样品。
在某些实施方案中，本文提供的方法进一步包括基于选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM的水平为受试者选择治疗方案。在某些实施方案中，基于本发明方法的结果开始、改变、修订或维持治疗方法，例如当确定受试者对治疗方案有反应时，或当确定受试者对治疗方案无反应时，或当确定受试者对治疗方案反应不足时。在某些实施方案中，基于方法的结果改变治疗方法。
在本文提供的诊断和监测方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括分离生物样品的组分。
在本文提供的诊断和监测方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括标记生物样品的组分。
在本文提供的诊断和监测方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括扩增生物样品的组分。
在本文提供的方法的某些实施方案中，所述方法包括与探针和生物样品的组分形成复合物。在某些实施方案中，与探针形成复合物包括与至少一种非天然存在的试剂形成复合物。在本文提供的方法的某些实施方案中，所述方法包括处理生物样品。在本文提供的方法的某些实施方案中，检测至少两种FSGM的水平的方法包括FSGM的组。在本文提供的方法的某些实施方案中，检测水平的方法包括将待检测的FSGM附着于固体表面。
I.试剂盒/检测板
本发明还提供了用于评估和监测FXN替代疗法的疗效的组合物和试剂盒。在一些实施方案中，本公开的试剂盒可由受试者用于自我评估或可由受试者实施用于由医师评估，或作为护理点试剂盒。
这些试剂盒可以包含以下一种或多种：与本发明的FSGM特异性结合的试剂，和用于测量FSGM水平的一组说明。在一个实施方案中，FSGM包括分泌蛋白如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1或THBS1。在另一个实施方案中，FSGM包括CYR61。
本发明还包含用于检测生物样品中FSGM蛋白或核酸的存在的试剂盒。这些试剂盒可用于评估和/或监测FXN替代疗法的疗效。例如，所述试剂盒可包含能够检测生物样品中的FSGM蛋白或核酸的标记化合物或试剂和用于测定样品中的蛋白或mRNA的量的方式(例如，与蛋白或其片段结合的抗体，或与编码蛋白的DNA或mRNA结合的寡核苷酸探针)。试剂盒还可以包括试剂盒的使用说明书，其用于实践本文提供的任何方法或基于本文提供的教导解释使用试剂盒获得的结果。试剂盒还可以包含用于检测样品中对照蛋白(例如用于组织样品的肌动蛋白、血液或血液来源样品中的白蛋白)的试剂，用于样品中存在的FSGM的量的标准化。试剂盒还可包含纯化的FSGM，用于用作对照的检测或用于用试剂盒进行的测定的定量。在一些实施方案中，通过本公开的试剂盒或检测板评估的生物样品是体液样品，例如血液(包括任何血液制品，例如全血、血浆、血清或血液的特定类型的细胞)、尿液、唾液或精液，或固体组织样品，例如皮肤活检样品，皮肤带、毛囊、肌肉活检样品或口腔样品。
试剂盒包含用于评估和/或监测FXN替代疗法疗效的方法中的试剂检测板，该检测板包括至少两种检测试剂，其中每种检测试剂对一种FSGM具有特异性，其中所述FSGM选自本文提供的FSGM蛋白集。在一个实施方案中，FSGM包括分泌蛋白，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1或THBS1。在另一个实施方案中，FSGM包括CYR61。
对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可以包含，例如：(1)结合第一FSGM蛋白的第一抗体(例如，附着于固体支持物)；和任选地，(2)与第一FSGM蛋白或第一抗体结合并与可检测标记缀合的第二不同抗体。在某些实施方案中，所述试剂盒包含(1)结合第二FSGM蛋白的第二抗体(例如，附着于固体支持物)；和任选地，(2)与第二FSGM蛋白或第二抗体结合并与可检测标记缀合的第三不同的抗体。第一和第二FSGM蛋白是不同的。在一个实施方案中，第一和第二FSGM是本发明的FSGM，例如选自表2、表4和/或图3的一个或多个FSGM。在某些实施方案中，所述试剂盒包含与不同于第一和第二FSGM蛋白的第三FSGM蛋白结合的第三抗体，和与第三FSGM蛋白或结合第三FSGM蛋白的抗体结合的第四不同抗体，其中第三FSGM蛋白不同于第一和第二FSGM蛋白。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒可包含例如：(1)寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸，其与编码FSGM蛋白的核酸序列杂交，或(2)可用于扩增FSGM核酸分子的一对引物。在某些实施方案中，所述试剂盒可进一步包含，例如：(1)寡核苷酸，例如第二可检测标记的寡核苷酸，其与编码第二FSGM蛋白的核酸序列杂交，或(2)用于扩增第二FSGM核酸分子的一对引物。第一和第二FSGM是不同的。在一个实施方案中，第一和第二FSGM是本发明的FSGM，例如选自表2、表4和/或图3的一个或多个FSGM。在某些实施方案中，所述试剂盒可进一步包含，例如：(1)寡核苷酸，例如第三可检测标记的寡核苷酸，其与编码第三FSGM蛋白的核酸序列杂交，或(2)用于扩增第三FSGM核酸分子的一对引物，其中第三FSGM不同于第一和第二FSGM。在某些实施方案中，试剂盒包含对每种核酸FSGM特异性的第三引物，以允许使用定量PCR方法检测。
对于色谱方法，试剂盒可包含FSGM，其中包括标记的FSGM，以允许通过色谱法检测和鉴定本发明的一种或多种FSGM，例如选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM。在某些实施方案中，用于色谱方法的试剂盒包含用于本发明的一种或多种FSGM的衍生化的化合物。在某些实施方案中，用于色谱方法的试剂盒包含用于解析该方法的FSGM的柱。
对于检测本发明的FSGM(例如选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM)特异性的试剂，允许复杂混合物(例如细胞或组织样品)中的FSGM的检测和定量。在某些实施方案中，试剂是物种特异性的。在某些实施方案中，试剂不是物种特异性的。在某些实施方案中，试剂是同种型特异性的。在某些实施方案中，试剂不是同种型特异性的。
在某些实施方案中，用于评估和/或监测FXN替代疗法的疗效的试剂盒包含对选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM的水平的检测具有特异性的至少一种试剂。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于基于选自表2、表4和/或图3的至少一种FSGM的水平检测、评估和/或监测FXN替代疗法的疗效的说明书。
本发明提供了包含对选自表2、表4和/或图3的至少一种FSGM的水平检测具有特异性的至少一种试剂的试剂盒。在一个实施方案中，FSGM包括分泌蛋白例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1或THBS1。在另一个实施方案中，FSGM包括CYR61。
在某些实施方案中，试剂盒还可包含例如缓冲剂、防腐剂、蛋白质稳定剂、反应缓冲液。试剂盒可进一步包含用于检测可检测标记所需的组分(例如酶或底物)。试剂盒还可包含对照样品或一系列对照样品，其可以被测定并与测试样品比较。适当时，对照可以是对照血清样品或纯化蛋白质或核酸的对照样品，其具有已知的靶FSGM水平。试剂盒的每个组分可以被封装在单独的容器中，并且所有不同的容器可以在单个包装中，以及用于解释使用试剂盒进行测定的结果的说明书。
本发明的试剂盒可任选地包含用于实施本发明方法的其它组分。
本发明进一步提供了用于受试者样品中的一种或多种FSGM的检测的试剂检测板和至少一种对照试剂。在某些实施例中，FSGM包括至少两个或更多个FSGM，其中两个或更多个FSGM中的每一个选自表2、表4和/或图3。在一个实施方案中，所述一种或多种FSGM包括分泌蛋白，例如表2中定义的分泌蛋白，例如CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和/或THBS1。在另一个实施方案中，所述一种或多种FSGM包括CYR61。
在某些实施方案中，对照试剂是在生物样品中的检测中用于检测FSGM，其中所述检测板提供了一种含有FSGM的对照样品用作阳性对照，并且任选地用于定量存在于生物样品中的FSGM的量。所述检测板可提供用于检测对照蛋白(例如组织样品的肌动蛋白、血液或血液来源样品中的白蛋白)的试剂，以使样品中存在的FSGM量标准化。该检测板可提供用于检测的纯化的FSGM，其用作对照，或用于用该检测板进行的测定的量化。
在某些实施方案中，当与对照或施用FXN替代物后的受试者(例如FXN缺乏的受试者)比较时，检测板中的FSGM水平增加。在一些实施方案中，FSGM选自由mt-RNR1、mt-RNR2、ADNP、AI480526、C230034O21RIK、CCDC85B、CCDC85C、CTCFL、NRTN、PDE4A、PHF1，RPL37RT、SLC26A10、SNORD17、SUV420H2、WNK2、YAM1或ZNRF1组成的组。
在某些实施方案中，当与对照或施用FXN替代后的受试者(例如FXN缺乏的受试者)比较时，组中的FSGM水平降低。在一些实施方案中，FSGM选自由CYR61、mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CO2、mt-CO3、mt-ND1、mt-ND2、mt-ND3和mt-ND4、EGR1、EGR2、EGR3、IGF1、LAMP2或SLIRP组成的组。
在一些实施方案中，所述检测板包括一种或多种在用FXN替代物治疗受试者(例如FXN缺乏的受试者)后与对照相比时具有升高的水平的FSGM，和/或一种或多种在用FXN替代治疗受试者(例如FXN缺乏的受试者)后与对照相比时具有降低水平的FSGM。
在优选的实施方案中，所述检测板包括用于检测本发明的两种或更多种FSGM(例如，表2、表4和/或图3中列举的2、3、4、5、6、7、8、9种或高达所有FSGM)的试剂，优选与对照试剂结合。在一些实施方案中，该检测板包含用于检测CYR61的试剂；在一些实施方案中，所述检测板包含用于检测CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种的试剂；在一些实施方案中，所述检测板包含用于检测NR4A1、PTP4A1、ATF3、BTG2、EGR1、EGR2、EGR3、CYR61和ABCE1中的一种或多种；EGR1、EGR2、EGR3和IGF1中的一个或多个；MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8和CYCS中的一种或多种；OPS2、VBP1、PSMA3、SLIRP、CUL2、DCUN1D1、UBE2D3、ZNRF1、RNF2和LAMP2中的一种或多种；RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39、RPL38、RPS27L和ABCE1中的一个或多个；MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3和CYCS中的一种或多种；NR4A1、EGR1、EGR3、ADAMTS1、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2和CYR61中的一种或多种；PSMA3、CUL2、UBE2D3、ZNRF1、RPS15A、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一个或多个；ABCE1、RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一个或多个；MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8、CYCS、TMEM-126A、MAOA和ABCE1中的一种或多种；MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6和MT-ATP8中的一种或多种；ABCE1、RPL26、RPL38、RPL10、RPL32、RPS15A、RPL24、RPL39、SLIRP、COPS2、DCUN1D1、RNF2、EGR1、BTG2、ATF3、PTGS2、IGF1、SERPINE1和THBS1中的一种或多种；或RPL26、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2、RPL10、RPS27L、CYCS、ATF3、BTG2、EGR1、EGR3和CYR61中的一种或多种的试剂。
在该检测板中，每个FSGM通过对该FSGM具有特异性的试剂检测。在某些实施方案中，所述检测板包括重复孔、点或部分以允许生物样品和对照样品的各种稀释液(例如，系列稀释液)的分析。在优选的实施方案中，所述检测板允许定量检测本发明的一种或多种FSGM。
在某些实施方案中，所述检测板是用于检测一种或多种FSGM的蛋白质芯片。在某些实施方案中，所述检测板是用于检测一种或多种FSGM的ELISA板。在某些实施方案中，所述检测板是用于定量PCR以检测一种或多种FSGM的检测板。
在某些实施方案中，检测试剂检测板提供在单一装置上，包括用于本发明的一种或多种FSGM的检测试剂和至少一种对照样品。在某些实施方案中，检测试剂检测板被提供于包含本发明的两种或更多种FSGM的检测试剂和至少一种对照样品的单一装置上。在某些实施方案中，用于检测本发明的不同FSGM的多个检测板具有至少一个均匀的对照样品，以便于比较检测板之间的结果。
实施例
实施例1：FXN诱导签名的生成
FXN融合蛋白
在本实施例中使用的FXN融合蛋白是包含通过在hFXN的N-末端的接头连接的TAT-cpp和hFXN的融合蛋白(Vyas等，(2012)Hum.Mol.Genet.21,1230-1247)，本文称为CTI-1601。融合蛋白中的hFXN是全长210aa共济蛋白长前体形式，其在N-末端含有80aa线粒体靶向序列(MTS)。全长hFXN蛋白(氨基酸1-210)包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
Figure BDA0003444474690000871
Figure BDA0003444474690000881
当蛋白质被导入线粒体基质中时，其在氨基酸81处被切割，产生FXN的成熟形式，得到成熟的130个氨基酸的活性FXN，具有14.2kDa的预测分子量(SEQ ID NO:1)。
Figure BDA0003444474690000882
全长hFXN(SEQ ID NO:1)包括成熟hFXN(SEQ ID NO:2)和具有以下氨基酸序列的线粒体靶向序列(MTS)：MWTLGRRAVAGLLASPSPAQAQTLTRVPRPAELAPLCGRRGLRTDIDATCTPRRASSNQRGLNQIWNVKKQSVYLMNLRK(SEQ ID NO:3)
融合蛋白包含通过接头与全长hFXN蛋白的N-末端连接的HIV-TAT肽(YGRKKRRQRRR)。融合蛋白的作用机制依赖于HIV-TAT肽的细胞穿透能力，以将融合蛋白递送至细胞中，并随后在易位至线粒体中后加工为成熟的hFXN。具体的融合蛋白CTI-1601描述于美国临时专利申请No.62/880,073和62/891,029中，其各自通过引用方式全文并入本文。
CTI-1601包括以下氨基酸序列(224个氨基酸)：
MYGRKKRRQRRRGGMWTLGRRAVAGLLASPSPAQAQTLTRVPRPAELAPLCGRRGLRTDIDATCTPRRASSNQRGLNQIWNVKKQSVYLMNLRKSGTLGHPGSLDETTYERLAEETLDSLAEFFEDLADKPYTFEDYDVSFGSGVLTVKLGGDLGTYVINKQTPNKQIWLSSPSSGPKRYDWTGKNWVYSHDGVSLHELLAAELTKALKTKLDLSSLAYSGKDA(SEQ ID NO:12)。
FXN条件性敲除(KO)动物
使用由Jackson实验室建立的FRDA小鼠模型(FXN-KO:MCK-Cre)。在该模型中，Fxnflox/null::MCK-Cre小鼠携带Cre-条件性共济蛋白等位基因、共济蛋白全局敲除等位基因和心肌/骨骼肌特异性Cre重组酶转基因。Fxnflox/null::MCK-Cre小鼠(货物No.029720)由于心脏和骨骼肌中的共济蛋白缺乏而发展进行性心肌病。突变体在9周龄时表现出峰值体重并具有86+/-5天龄的平均存活。心肌病表型的特征在于心率和射血分数降低，以及与约7周龄的非突变同窝出生仔畜相区别的缩短分数。在9周龄时，与非突变型同窝出生仔畜相比，左心室质量显著增加。
FXN融合蛋白的体内施用
在本研究中使用三组动物(每组八只动物)，一个对照和两个敲除FXN-KO:MCK-Cre。在5周龄时，将10mg/kg的FXN融合蛋白或载体(50mM NaOAc，0.1PEG)分别施用于各组的动物。以10mL/kg的量通过皮下注射施用药物。动物每48小时接受测试药物或载体，直到它们达到77天龄。最后一个剂量(11周时)后24小时，处死所有动物，用PBS灌注以清理组织。切除心脏并保存在与组织保存相容的无RNAse的试剂中用于进一步的RNA分析。一种这样的试剂使RNAse失活并稳定组织内的RNA，例如RNA LaterTM。
心脏性能
由于条件性敲除小鼠在心脏中丧失FXN，在4周龄的FXN融合蛋白施用之前，以及在8和10周龄的FXN融合蛋白施用之后，来自每组的所有8只动物中通过有意识的ECG和麻醉超声心动图评估心脏性能。
RNA测序(RNASeq)
从所有组(一个用载体处理的对照动物，两个载体处理的敲除动物，和两个用FXN融合蛋白处理的敲除动物)的代表中分离并制备RNA以用于测序。使用KAPA Stranded RNA-seq试剂盒与RiboErase(HMR)
Figure BDA0003444474690000901
平台KR1151－v4.16的进行RNA测序。从每个样品测序大约1亿个配对末端Illumina阅读，长度151nt(修剪前)。使用cutadapt v1.2.1从FastQ文件中修剪接头序列。从阅读的3’末端去除低质量碱基(Q<30)，并且滤出具有超过30％的低质量碱基(Q<30)的阅读。使用指定STAR v2.5.3作为比对器的RSEM v1.3.0将剩余阅读与小鼠参考基因组的2018年4月Ensembl发布(GRCm38 v92初级集)比对。使用RSEM生成每个样品的*.genes.results文件。
弗里德赖希共济失调(FDRA)来源的患者成纤维细胞
FDRA患者的成纤维细胞在结果和附图中称为FA GM03816和FA 68。将细胞维持在补充有10％FBS的高葡萄糖DMEM培养基中并生长至汇合。一旦实现汇合，在RNA分离前，在不更换培养基的情况下保持细胞24小时。
RNA提取
在达到汇合时，用PBS缓冲液冲洗细胞。根据制造商提供的方案，使用包括任选的基因组DNA去除步骤的RNeasy Mini试剂盒(Qiagen目录号74104)进行总RNA提取。使用Beckman Coulter DU730 UV/Vis分光光度计测量溶液中的总RNA浓度。
逆转录(RT)-cDNA合成
根据制造商提供的方案，使用Superscript IV VILO Master Mix with ezDNase试剂盒(Invitrogen目录号766500)，在30uL反应中使用4ug总RNA进行逆转录。
定量实时聚合酶链式反应(PCR)
本文可互换使用的定量PCR或实时(RT)PCR，使用Quant Studio 5自动化系统(Applied Biosystems)进行。反应主混合物是TaqMan Fast Advanced Master mix(ThermoFisher 4444557)，板是MicroAmp快速96孔反应板(ThermoFisher 4346907)。通常，每个反应(每个孔)由以下组成：10uL Master Mix(20X)+0.33uL管家基因引物/探针(60X)+1uL靶基因引物/探针(20X)+6.67uL无核酸酶H2O+2uL cDNA(约25ng)。PCR循环包括在50℃2分钟UNG(来自尿嘧啶-DNA糖基化酶家族，用于除去尿嘧啶)孵育，在95℃孵育2分钟用于聚合酶活化，和在95℃孵育1秒和在60℃孵育20秒的40个PCR循环。
PCR反应包括正向和反向引物。举例来说，正向引物的长度为18至22个核苷酸，并且可以包括与靶核酸同一的15、16、17、18、19、20或21个核苷酸，所述靶核酸是表2、表4和/或图3中所示的任何一种FSGM的序列。反向引物可以与靶核酸互补。反向引物也可以包括与接头序列互补的序列。
管家基因的定量PCR(qPCR)
β-肌动蛋白转录物用作管家基因，因为其表达水平在FA患者来源的成纤维细胞中呈现恒定(Disease Models&Mechanisms(2017)10,1353-1369doi:10.1242/dmm.030536)。引物-探针组(Hs01060665_g1)购自ThermoFisher。用荧光染料(例如VIC染料，具有538nm的最大吸收和554nm的最大发射，因此在可见光谱的绿-黄色部分中发射，或者HEX染料)和非荧光猝灭剂(NFQ-MGB猝灭剂)标记探针寡核苷酸。
FXN-敏感性基因组标志物的定量PCR(FXN签名)
为了本文公开的方法的开发，基于来自用FXN融合蛋白处理或未处理的FXN条件性敲除小鼠心脏的RNA的RNASeq分析选择靶基因，本文称为FXN-敏感性基因组标志物(FSGM)。所选靶的ThermoFisherq PCR引物-探针组如表1所述。用荧光染料(Fluorescein amidite,FAM)连同猝灭剂(NFQ-MGB)标记靶基因探针。
表1.引物-探针组
ABCE1-Hs00759267_s1 Lars2-Hs01118920_m1 RAP2c-Hs00221801_m1
ADAMTS1-Hs00199608_m1 MAOA-Hs00165140_m1 RnF13-Hs00961508_g1
ALAS1-Hs00167441_m1 MKI67-Hs00606991_m1 RPL10-Hs01095478_g1
APOLD1-Hs00707371_S1 MPC1-Hs00211484_m1 RPL24-Hs02338570_gH
ATF3-Hs00231069_m1 mt-ATP6-Hs02596862_g1 RPL26-Hs00864008_m1
CH25H-Hs02379634_s1 mt-ATP8-H202596863_g1 RPL32-Hs00851655_g1
CYR61-Hs00155479_m1 mt-CO2-Hs02596865_g1 RPL38-Hs01019601_g1
CUL2-Hs00180203_m1 mt-CO3-Hs02596866_g1 RPL39-Hs04194816_g1
CYCS-Hs01588974_g1 mt-ND1-Hs02596873_s1 RPS15A-Hs03043791_m1
EGR1-Hs00152928_m1 mt-ND2-Hs02596874_g1 RPS23-Hs01922548_s1
EGR2-Hs00166165_M1 mt-ND3-Hs02596875_s1 RPS27L-Hs00955038_g1
EGR3-Hs00231780_m1 mt-ND4-Hs02596876_g1 SLC25A25-Hs01595834_g1
EIF1AX-Hs00796778_s1 mt-RnR1-Hs02596859_g1 SLIRP-Hs00364015_m1
hFXN-Hs00175940_m1 mt-RnR2-Hs02596860_s1 SMTN-Hs01022255_g1
HIF1a-Hs00153153_m1 NR4A1-Hs00374226_m1 UBE2D3-Hs00704312_s1
IGF1-Hs01547656_m1 PDE4a-Hs00183479_m1 YARS-Hs00169373_m1
LAMP2-Hs00903587_m1 PICALM-Hs00200318_m1 ZNRF1-Hs00936381_m1
为了验证PCR结果的有效性，两个测试被作为质量控制：(1)信号的线性，其通过使用正常HEK293 RNA滴定作为cDNA浓度的函数的dCT(差异循环阈值)来对于每个引物/探针建立；和(2)在逆转录酶(RT)-对照样品中无可定量的CT，以证实信号不是由于RNA制备物中的污染基因组DNA(gDNA)。
通过PCR装置产生循环阈值(CT)值。每孔分配两个CT值，一个用于β-肌动蛋白，一个用于靶基因。通过从每个孔的靶基因CT中减去β-肌动蛋白CT来计算ΔCT值(靶CT—β-肌动蛋白CT)。计算基线样品(即未处理的)ΔCT的平均值并用作“正常”或“未处理的”基线样品。从“处理的”样品ΔCT中减去基线样品。(处理样品ΔCT[减去]基线样品ΔCT)，得到每个“处理”样品的ΔΔCT。使用式2ΔΔCT计算每单个样品的倍数变化。然后取重复值的平均数，并将标准偏差计算为误差。
体内处理后的基因组表达
收集FXN融合蛋白处理的敲除(KO)小鼠或对照小鼠的心脏，并提取RNA用于分析。如上所述的RNA测序用于获得经过或未经过FXN融合蛋白处理触发的转录表达谱。如下所述进行FXN融合蛋白处理后基因差异表达的分析。
用R3.44版和3.7版Bioconductor文库进行RNASeq结果的差异表达(DE)分析。来自rsem的未调整的“预期计数”列以tximport输入，并用作DEseq2的输入。Tximport和DESeq2以所有默认设置使用，除了在运行DESeq2之前将表观长度为0的基因重新认定为具有长度0.1。根据DESeq2分析汇编了两份初始报告(数据未显示)：“所有共济蛋白敲除样品对比所有野生型样品”，和“所有药物处理的样品对比所有载体对照样品”。根据调整的p值(padj)对“药物处理的样品对比所有载体对照样品”报告中的数据进行分类。padj<0.005的基因被考虑用于进一步评估。
在“共济蛋白敲除(KO)样品vs.所有野生型(WT)样品”报告中应用320的基本平均值(RNASeq分析的读出)的截止值，并且如果在“药物处理的样品vs.所有载体处理的对照样品”中下调，则低于该阈值的基因不进一步考虑。
满足这些标准的基因，即其表达(i)在“共济蛋白敲除vs.WT样品”中高于320且(ii)在“药物处理vs.载体处理的敲除动物”中上调或下调的基因；或其表达(i)在“共济蛋白敲除vs.WT样品”中低于320和(ii)仅在“药物处理vs.载体处理的敲除动物”中上调的基因进一步限制为log2倍数变化大于0.584或低于-0.584的基因，分别对应于约2倍的诱导或抑制。
将满足所有上述标准的基因作为共济蛋白-敏感性基因组标志物(FXN-诱导的签名)并用于产生FXN表达谱，并检查不同处理之间的相反调控。略低于上述标准，但在进一步仔细检查后，存在强的合理性的其它基因被包括在潜在的FSGM列表中，作为在其它模型中测试的基因。例如，包括mt-CO2，相比于WT动物，其在FXN KO中上调3.21倍，并且在CTI-1601处理的KO中与载体处理的KO相比下调0.57倍，因为其仅刚刚错过显著性截止值，其他mt-DNA编码复合物IV亚单元确实显示出受到影响(mt-Co2预期被类似地调节，因为基因是多顺反子的)，并且由LRPPRC调节的主要蛋白质水平之一(显著命中)是mt-Co2。这种渐进性选择方法允许鉴定受FXN基因消融之后FXN蛋白替代相反调节的基因，定义替代FXN表达谱。这些基因反应为对FXN敏感，可能是FXN靶基因，并且被认为是FXN替代的真正标志物，与其他基因相反，不受相反调节，其可能仅仅是组织重塑或炎症变化的标志物(数据未显示)。
用FXN融合蛋白体内处理小鼠后，一百零二(102)个基因呈现显著差异表达，当与对照相比时上调或下调(“KO vs.WT”中的倍数调节＝基线共济蛋白(-)签名)，并且这些在表2中详述。最重要的是，这些基因被发现在用FXN融合蛋白处理时在共济蛋白缺乏小鼠模型中受到相反调节(“药物(FXN融合蛋白)vs.载体(Veh)”中的倍数调节＝替代共济蛋白签名)。换句话说，在不存在共济蛋白时表现出表达上调的某些基因在用FXN融合蛋白处理后表达下调。相反，反之亦然，即在不存在共济蛋白时表现出表达下调的某些基因在用FXN融合蛋白处理后表达上调。该结果是特别令人惊讶的，因为共济蛋白从未被描述为转录调节子，因此不预期下游基因的调节。
表2中所示的共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)可以例如根据同源性和/或功能分组。例如，在敲除动物中被诱导或抑制的几种线粒体基因在用FXN融合蛋白处理后表现出其表达模式逆转。线粒体基因转录物CYR61、mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CO2、mt-CO3、mt-ND1、mt-ND2、mt-ND3和mt-ND4在用FXN融合蛋白处理后显示下调，而线粒体基因转录物mt-RNR1和mt-RNR2上调，可如表2中“FXN融合蛋白vs.Veh”所示。在用FXN融合蛋白处理后，来自EGR家族的转录物，EGR1、EGR2和EGR3，或来自胰岛素生长因子家族的转录物，IGF1和LAMP2的表达也被下调。类似地，用FXN融合蛋白处理时，SLIRP表达下调。呈现改变的表达的另一组标志物包括ADNP、AI480526、C230034O21RIK、CCDC85B、CCDC85C、CTCFL、NRTN、PDE4A、PHF1、RPL37RT、SLC26A10、SNORD17、SUV420H2、WNK2、YAM1和ZNRF1；这组标志物在用FXN融合蛋白处理后显示上调。
表2中所示的FSGM也可以例如依据它们是否分泌蛋白分组。例如，如表2所示，CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1都是分泌蛋白。
表2.用FXN融合蛋白治疗后基因的差异表达(FXN-诱导签名)
Figure BDA0003444474690000951
Figure BDA0003444474690000961
在表2中，标识为“敲除(KO)vs.野生型(WT)”(列1)和“FXN-融合vs.载体”(列2)的列中包含的值表明FSGM是否随有效的FXN替代疗法增加或减少。
更具体地，对于给定的FSGM，如果列2(FXN-融合物vs.载体)中的值小于1.0且列1(KO vs.WT)中的值大于1.0，则FSGM水平在FXN耗尽的条件下都增加(与野生型相比)，并且当施用有效的FXN替代疗法时降低，并因此被相反地调节(例如CYR61)。
相反地，对于给定的FSGM，如果列2(FXN-融合物vs.载体)中的值大于1.0且列1(KOvs.WT)中的值小于1.0，则FSGM水平在FXN耗尽的条件下(与野生型相比)均降低，并且当施用有效的FXN替代疗法时增加，并因此被相反地调节(例如，YAM1)。
实施例2：FSGM的串分析
该实施例描述了表2中所示FSGM的串分析，显示FSGM的蛋白质产物至少部分地生物学连接为一组。
使用串数据库(string-db.org；Szklarczyk等(2015)DOI:10.1093/nar/gkv1277和其中的参考文献)，使用表2中描述的FXN-敏感性基因组标志物的85种蛋白质产物进行串分析。串分析如图1所示。串分析表示根据其功能的已知和/或预测的蛋白质相互作用的实例。串分析中用于生成簇的参数为：节点＝85；边缘＝97；平均节点度＝2.28；平均局部聚类系数＝0.345；预期边缘数＝35；PPI富集p-值<1.0e-16。最低要求相互作用评分为0.700(高置信度)。网络中的断开节点被隐藏。以下参数用作主动相互作用源：文本挖掘、实验、数据库、共表达、邻域、基因融合和共现。所使用的分区允许一个标志物作为一个以上簇的部分。出于简化的目的，从图1中只能清楚地看到一些簇，而在图中看不到其它簇，但是这些在本文中也在下面列出。
在上述参数下，以下是通过串分析获得的一些簇和它们各自的标志物的实例：
－对核糖体耗尽或内质网(ER)应激的反应－NR4A1、PTP4A1、ATF3、BTG2、EGR1、EGR2、EGR3、CYR61，ABCE1；
－线粒体能量产生－MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8，CYCS；
－蛋白酶体和未折叠蛋白质反应的调控－COPS2、VBP1、PSMA3、SLIRP、CUL2、DCUN1D1、UBE2D3、ZNRF1、RNF2，LAMP2；
－核糖体功能－RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39、RPL38、RPS27L；ABCE1，
－呼吸链－MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、CYCS；
－心肌发育－NR4A1、EGR1、EGR3、ADAMTS1、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2，CYR61；
－大分子分解代谢－PSMA3、CUL2、UBE2D3、ZNRF1、RPS15A、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39、RPL38；
－翻译起始－ABCE1、RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39、RPL38；
－线粒体组分－MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8、CYCS、TMEM-126A、MAOA、ABCE1；
－氧化磷酸化－MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8；
－大分子分解代谢过程的负调控－ABCE1、RPL26、RPL38、RPL10、RPL32、RPS15A、RPL24、RPL39、SLIRP、COPS2、DCUN1D1、RNF2、EGR1、BTG2、ATF3、PTGS2、IGF1、SERPINE1、THBS1；
－凋亡过程的调控－RPL26、THBS1，SERPINE1、IGF1、PTGS2、RPL10、RPS27L、CYCS、ATF3、BTG2、EGR1、EGR3，CYR61。
由串分析得出的错误发现率最高0.003的其他簇为：靶向膜的蛋白质、靶向膜的SRP依赖性共翻译蛋白质、翻译、核转录mRNA分解代谢过程、初级代谢过程、细胞代谢过程、蛋白质靶向、肽代谢过程、细胞过程负调控、细胞大分子代谢过程、有机物质代谢过程，细胞蛋白质代谢过程调控、蛋白质代谢过程调控、骨骼肌细胞分化、呼吸电子传递链、代谢过程、细胞质翻译、细胞周期调控、生物发生的细胞组分组织、线粒体电子传递、NADH至泛醌、血管生成、大分子代谢过程调控、含核碱基的化合物分解代谢过程、蛋白质定位于细胞器的确立、细胞过程、细胞大分子分解代谢过程、嘌呤核糖核苷一磷酸代谢过程、大分子分解代谢过程、对应激的反应和对氧的反应。
基于串分析的蛋白质簇表明FSGM蛋白质产物在它们自身之间具有比从基因组中取出的相似大小的随机蛋白质集所预期的更多的潜在相互作用。这种富集表明FSGM的蛋白质产物至少部分地生物学连接为组。
实施例3：体外处理后潜在FXN靶基因的选择
通过FXN基因消融和随后的体内FXN蛋白替代相反地调控的基因的鉴定表明通过FXN替代疗法诱导的基因表达变化可用作在用FXN替代疗法治疗的患者中治疗疗效的指示。基于该前提，在两种体外人细胞模型中测试基线FXN诱导的签名：弗里德赖希共济失调(FDRA)来源的成纤维细胞和在
人细胞模型中的共济蛋白蛋白质和mRNA表达
在FDRA来源的成纤维细胞中检测共济蛋白的蛋白质和mRNA表达。蛋白质印迹凝胶显示并定量了共济蛋白蛋白质表达，而共济蛋白mRNA表达通过qRT-PCR定量。结果示于图2和表3中。
图2显示了在对照GM23971细胞和FDRA来源的成纤维细胞FAGM03816和FA 68中的共济蛋白检测。当进行蛋白表达定量时，β-肌动蛋白信号被用于共济蛋白信号标准化。对照GM23971细胞中的共济蛋白水平被认为是100％，相对于FDRA来源的成纤维细胞FAGM03816和FA 68中的共济蛋白，其分别为对照的64％和31％。当与对照细胞比较时，共济蛋白mRNA定量显示类似的结果，FAGM 03816和FA 68具有约66％和32％的mRNA表达(表3)。
表3.与正常成纤维细胞相比FRDA-来源成纤维细胞(FA)中共济蛋白蛋白质和mRNA的表达
Figure BDA0003444474690001001
细胞模型中的共济蛋白诱导的遗传签名的发展
基线FXN(-)表达谱的发展：在正常细胞(N-GM07522和N-GM23971)与来自FDRA衍生的成纤维细胞的共济蛋白耗尽的细胞(FA-GM 03816、FA-GM 04078、FA-4654、FA-68(未显示)、FA-4675和FA-4194(未显示))之间的比较中，基线FXN缺乏(FXN(-))表达谱的一个实例被鉴定并如图3所示。鉴定了ABCE1、APOLD1、ATF3、CYR61、CUL2、CYCs、EGR1、EGR2、EGR3、EiFIAX、IGF1、LAMP2、MAOA、NR4a1、PDE4A、RnF13、RPL10、RPL24、RPL26、RPL32、RPL38、RPL39、RPS15A、RPS23、RPS27L、SLIRP、UBE2D3、YARS、ZNRF1和线粒体转录物mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CO2、mt-CO3、mt-ND1、mt-ND2、mt-ND3、mt-ND4、mt-RNR1和mt-RNR2的改变的表达。
在FDRA来源的成纤维细胞中施用共济蛋白的效果：
FRDA患者来源的成纤维细胞的基因表达分析显示，与正常成纤维细胞相比，患者来源的成纤维细胞中的几种转录因子和分泌蛋白总体上调(图3和图4A)。为了评估共济蛋白替代在FDRA中的作用，用FXN融合蛋白或载体处理FA来源的成纤维细胞(谱系FA-68)，收集RNA并处理用于PCR分析。结果示于图4B中，并代表用FXN融合蛋白处理的细胞中相对于载体处理的细胞的基因表达的倍数。hFXN表达显示为内部对照。图4B提供了示例性的FXN替代表达谱，表示为在经过FXN融合蛋白处理后，在共济蛋白耗尽的细胞系中检测的EGR1、EGR2、EGR3和IGF1表达的下调。图5示出了该过程的示意图。
实施例4：FXN融合蛋白治疗的患者样品中FXN签名的检测
从用共济蛋白替代疗法(例如FXN融合蛋白)治疗之前和之后的FDRA患者处收集血液、口腔或肌肉细胞样品。处理两个样品(治疗前和治疗后)用于RNA提取，并对表2、表4和/或图3中所示的FSGM进行RT-PCR。对两种样品的RT-PCR结果的分析将显示治疗后哪些转录物被改变、上调或下调，并且将提供FXN替代疗法的疗效的指示。当与FXN替代治疗前后FSGM的表达比较时，FSGM的相反调节的存在将是有效治疗的指示。例如，检测到治疗后CYR61、EGR1、EGR2、EGR3和/或IGF1中至少一种的下调表明FXN替代疗法是有效的。相反，如果比较治疗前和后没有在至少一个FSGM中检测到相反的调节，则指示治疗失败。类似地，获取治疗前和治疗后样品中的FXN表达谱的特征向量，并将其与上文所述的缺乏FXN特征向量和FXN替代特征向量进行比较将提供关于FXN替代疗法的疗效的指示。作为患者样品获得的FXN签名的结果，可以通过增加或减少给予患者的FXN替代疗法的剂量来采用新的FXN替代疗法剂量方案。
实施例5：产生共济蛋白(FXN)敲减(KD)的体外细胞模型
用KD-hFXNshRNA构建体转染HEK293细胞以抑制细胞中的共济蛋白mRNA和蛋白质表达。将非FXN特异性的乱序对照shRNA构建体用作对照。如图6所示，当与乱序对照相比时，FXN蛋白在KD-FXN克隆A2和A6中的表达显著降低。图6中的表显示了蛋白质印迹中蛋白质定量的结果，表示为FXN KD细胞中FXN的量相对于乱序对照细胞中FXN的量。图6的表中所示结果表明，与乱序对照相比，KD-FXN克隆A2和A6中FXN蛋白的量分别降低82％和72％。
实施例6：用FXN融合蛋白处理对hFXN-KD细胞中CYR61蛋白表达的影响
本实验的目的是测定在如实施例5所述产生的乱序对照和hFXN-KD细胞系中响应于FXN融合蛋白CTI-1601处理的CYR61水平的变化。为此，将乱序对照和hFXN-KD(克隆A6)细胞以150,000个细胞/孔的密度在1mL处理培养基(DMEM，5％热灭活FBS，20mM甘油和20mMHEPES)中接种在用1％纤连蛋白溶液预包被的6孔组织培养板上。1小时后，用不同浓度的CTI-1601处理每个孔中的细胞。具体地，将在制剂缓冲液(20mM组氨酸、250mM蔗糖、0.05％聚山梨酯20、pH5.8)中的50μL连续稀释的CTI-1601(20μM、10μM、5μM、2.5μM和1.25μM，以及0μM对照)加入到各个孔中，并将平板在培养箱中孵育3小时。随后，将1mL完全培养基(10％FBS、含有抗生素的DMEM)加入到各个孔，并将板孵育21小时。在第1、2和3天重复该循环3次，然后再孵育平板1天。在第5天，对平板拍照，收获1mL培养基，补充10μL HALT蛋白酶抑制剂并在-80℃冷冻用于进一步分析。
根据制造商的方案，使用CYR61 ELISA(R&D Biosystems-CDYR10)测量分泌到细胞培养基中的CYR61蛋白的量。在分析前将来自乱序对照和hFXN-KD细胞的培养基1:2稀释。
hFXN-KD细胞的ELISA分析结果如图7所示。结果表明在来自乱序对照细胞的培养基中存在相对低水平的CYR61蛋白(约63.3pg/mL)，并且该水平不受用10μM CTI-1601处理的影响。相反，与mRNA数据一致，相比于乱序对照细胞的培养基中的CYR61蛋白水平，来自hFXN-KD细胞的培养基中分泌的CYR61蛋白水平明显更高(约1,198.5pg/mL)。此外，图7还表明，用10μM CTI-1601处理后，hFXN-KD细胞分泌的CYR61蛋白的水平明显降低至对照水平(约87.6pg/mL)。
这些结果再次表明，CYR61受到FXN敲低之后FXN蛋白替代的相反调节，并且除了基因表达水平的变化之外，分泌的CYR61蛋白的检测可用作FXN蛋白替代的标志物。
实施例7：hFXN向hFXN-KD细胞的转染导致分泌的CYR61蛋白的量减少
本实验的目的是测定用hFXN转染hFXN-KD细胞是否可以逆转这些细胞中的线粒体损伤，如通过分泌的CYR61蛋白的量所测量的。为此，根据制造商的说明书，用Fugene-6试剂，用空pCDNA3载体(+V)或用全长hFXN的表达载体：pCDNA3-hFXN(+hFXN)转染实施例5中描述的hFXN-KD和乱序对照HEK293细胞，并孵育48小时。将转染的细胞再孵育48小时。第二个48小时孵育后，去除1mL培养基，向等分试样中加入10μL的HALT蛋白酶抑制剂。根据制造商的方案，使用来自ABCAMTM(ab238267)的Simple Step CYR61Elisa测量培养基中CYR61蛋白的量。为了测量，将来自乱序对照和hFXN-KD细胞的培养基稀释1/10。数据使用GraphpadPrism Bar图绘制，具有标准偏差作为误差条。
该实验的结果如图8所示，该图是显示来自用空载体转染乱序对照细胞(KD-SRBL+V)；用hFXN转染的乱序对照细胞(SRBL5+hFXN)；用空载体转染的hFXN-KD细胞(KD-FXN+V)；和用hFXN转染的hFXN-KD细胞(KD-FXN+hFXN)的培养基中CYR61蛋白的量的柱状图。图8表明在外源表达的hFXN存在或不存在的情况下，乱序对照细胞不分泌可检测水平的CYR61蛋白。用空载体转染的hFXN－KD细胞分泌大量CYR61蛋白，这些细胞中hFXN的瞬时表达降低了分泌的CYR61蛋白的量。
这些结果证明，CYR61受到通过FXN敲低随后由核酸介导的表达驱动的替代FXN蛋白表达的相反调节，并进一步证实分泌的CYR61蛋白的检测可用作FXN蛋白替代的标志物。
实施例8：在FXN敲除小鼠胚胎干细胞中CYR61水平升高
本实验的目的是测定在FXN基因缺失(敲除)的小鼠胚胎干(ES)B9细胞中分泌的CYR61蛋白的水平是否改变。
FNX-敲除小鼠细胞系的产生
产生FXN缺陷的小鼠胚胎干细胞系。具体而言，作为该实验的结果，产生纯合小鼠ES克隆B9-46，其可被诱导敲除FXN基因的两个等位基因。图9是显示用对照或诱导FXN敲除的试剂(敲除剂)处理的WT小鼠ES克隆和纯合小鼠ES克隆B9-46中按照总细胞蛋白的FXN蛋白量的柱状图。使用小鼠FXN Elisa试剂盒(Abcam ab199078)根据制造商的方案测量小鼠FXN蛋白的量。图9表明用试剂处理以诱导FXN敲除导致B9-46细胞中FXN蛋白的消除。在WT细胞或对照处理的B9-46细胞中没有观察到FXN蛋白水平的降低。
CYR61基因表达(mRNA和蛋白质)的测量
用对照试剂或诱导FXN基因敲低的试剂处理小鼠B9细胞。为了测量CYR61基因表达的量，从B9小鼠细胞中提取RNA，并如前所述使用qPCR测量CYR61 mRNA的量。用于qPCR分析的TaqMan PrimerTM购自ThermoFisher，并且β-肌动蛋白用作管家基因(β-肌动蛋白VIC PL：Hs01060665_g1；CYR61：Hs00155479_m1)。针对试剂和对照处理各自分析两个生物学重复。为了测量细胞培养基中分泌的CYR61的量，收获1mL细胞培养基，补充10μL HALT蛋白酶抑制剂，并在-80℃下冷冻以用于进一步分析。如前所述，用ELISA测定分泌的CYR61蛋白的量。
CYR61基因表达分析的结果如图10，图A所示。结果表明B9细胞中FXN基因的敲除导致CYR61 mRNA表达增加约2倍。分泌的CYR61蛋白水平的测定结果如图10，图B所示。结果表明B9细胞中FXN基因的敲除导致细胞培养基中CYR61蛋白水平的量增加约2倍。
本申请中对本公开的实施方案的描述是以示例的方式提供的，并不旨在限制本公开的范围。所描述的实施方案包括不同的特征，并非所有这些特征在所有实施方案中都是必需的。一些实施方案仅利用一些特征或特征的可能组合。本领域技术人员将想到所描述的本公开的实施方案的变型，以及包括所描述的实施方案中提到的特征的不同组合的实施方案。本公开的实施方案的范围仅由权利要求限定。
本文中引用或参考的所有文献和本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，以及本文或任何文件提及的任何产品的任何制造商的使用说明、说明书、产品规格和产品说明书均以引用方式并入本文，并且可用于实施本发明。
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Claims (83)

1.一种用于评估共济蛋白(FXN)替代疗法的疗效的方法，所述方法包括：
(a)测定来自用FXN替代疗法治疗后的FXN缺乏患者的样品中的一种或多种FXN敏感性基因组标志物(FSGM)的FXN替代表达谱；
(b)比较所述患者FXN替代表达谱和基线FXN(-)表达谱；以及
(c)使用所述比较确定所述FXN替代疗法的疗效；
其中所述一种或多种FSGM是表2、表4和/或图3中定义的任何一种或多种标志物。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括测定来自FXN替代疗法之前的表现出FXN缺乏的患者的样品中的一种或多种FXN-敏感性基因组标志物(FSGM)的基线FXN(-)表达谱。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括编码分泌蛋白的基因、线粒体基因、EGR家族基因、胰岛素样基因、核糖体耗尽应答基因、线粒体能量产生基因、蛋白酶体调控基因、核糖体功能基因、呼吸链基因、心肌发育基因、大分子分解代谢基因、翻译起始基因、线粒体组分基因、氧化磷酸化基因、大分子分解代谢过程的负调控基因、或凋亡过程的调控基因、或由这些基因中的任何一种编码的蛋白质中的至少一种或多于一种的任何组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括分泌蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括NR4A1、PTP4A1、ATF3、BTG2、EGR1、EGR2、EGR3、CYR61和ABCE1中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括EGR1、EGR2、EGR3和IGF1中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8和CYCS中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括OPS2、VBP1、PSMA3、SLIRP、CUL2、DCUN1D1、UBE2D3、ZNRF1、RNF2和LAMP2中的一种或多种。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39、RPL38、RPS27L和ABCE1中的一种或多种。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3和CYCS中的一种或多种。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括NR4A1、EGR1、EGR3、ADAMTS1、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2和CYR61中的一种或多种。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括PSMA3、CUL2、UBE2D3、ZNRF1、RPS15A、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括ABCE1、RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8、CYCS、TMEM-126A、MAOA和ABCE1中的一种或多种。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6和MT-ATP8中的一种或多种。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括ABCE1、RPL26、RPL38、RPL10、RPL32、RPS15A、RPL24、RPL39、SLIRP、COPS2、DCUN1D1、RNF2、EGR1、BTG2、ATF3、PTGS2、IGF1、SERPINE1和THBS1中的一种或多种。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括RPL26、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2、RPL10、RPS27L、CYCS、ATF3、BTG2、EGR1、EGR3和CYR61中的一种或多种。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM在用FXN替代疗法治疗后上调。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述在用FXN替代疗法治疗后上调的一种或多种FSGM是mt-RNR1、mt-RNR2、ADNP、AI480526、C230034O21RIK、CCDC85B、CCDC85C、CTCFL、NRTN、PDE4A、PHF1、RPL37RT、SLC26A10、SNORD17、SUV420H2、WNK2、YAM1或ZNRF1。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种FSGM在用FXN替代疗法治疗后下调。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述在用FXN替代疗法治疗后下调的一种或多种FSGM是CYR61、mt-ATP6、mt-ATP8、mt-CO2、mt-CO3、mt-ND1、mt-ND2、mt-ND3和mt-ND4、EGR1、EGR2、EGR3、IGF1、LAMP2或SLIRP。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测定FSGM的FXN表达谱包括确定指示FSGM表达的值的FXN特征向量。
25.根据权利要求24所述的方法，其中使用所述比较确定所述FXN替代疗法的疗效包括分别确定所述患者FXN替代表达谱和基线FXN(-)表达谱的第一和第二FXN特征向量，和确定所述特征向量之间的距离。
26.根据权利要求25所述的方法，其中确定所述特征向量之间的距离包括确定所述第一和第二特征向量的标积。
27.根据权利要求25或26中任一项所述的方法，其进一步包括确定健康受试者的FSGM的正常FXN表达谱的第三特征向量。
28.根据权利要求27所述的方法，其进一步包括确定所述第二和第三特征向量之间的距离。
29.根据权利要求28所述的方法，其进一步包括确定所述第一和第三特征向量之间的距离，和将所述第一和第三特征向量之间的距离针对所述第二和第三特征向量之间的距离标准化。
30.根据权利要求29所述的方法，其进一步包括使用所述标准化的距离确定所述FXN替代疗法的疗效。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达谱由所述样品RNA的测序、杂交或扩增中的任何一种测定。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达谱由HPLC/UV-Vis光谱、酶法分析、质谱法、NMR、免疫测定法、ELISA或其任何组合测定。
33.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括当所述FXN替代疗法被指示为无效时，调整用FXN替代疗法的治疗。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有弗里德赖希共济失调(FRDA)。
35.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括从表现出FXN缺乏的患者处获得生物样品。
36.一种用于评估共济蛋白(FXN)替代疗法的疗效的方法，所述方法包括：
(a)测定来自用FXN替代疗法治疗后的FXN缺乏患者的样品中的一种或多种FXN敏感性基因组标志物(FSGM)的FXN替代表达谱，其中所述一种或多种FSGM包括选自表2、表4和/或图3的分泌蛋白；
(b)比较所述患者FXN替代表达谱和基线FXN(-)表达谱；以及
(c)使用所述比较确定所述FXN替代疗法的疗效。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述FXN替代疗法包括用FXN融合蛋白治疗。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述FXN替代疗法包括用CTI-1601治疗。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述表达谱由所述样品RNA的测序、杂交或扩增中的任何一种测定。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述表达谱由HPLC/UV-Vis光谱、酶法分析、质谱法、NMR、免疫测定法、ELISA或其任何组合测定。
41.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括当所述FXN替代疗法被指示为无效时，调整用FXN替代疗法的治疗。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述患者患有弗里德赖希共济失调(FRDA)。
43.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括从表现出FXN缺乏的患者处获得生物样品。
44.一种通过使来自患有共济蛋白(FXN)缺乏的患者的生物样品或其部分与一种或多种特异性检测一种或多种FSGM的检测试剂接触来检测所述生物样品中的一种或多种共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)的方法，其中所述一种或多种FSGM包括选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述患者正在接受FXN替代疗法治疗。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述FXN替代疗法包括用FXN融合蛋白治疗。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述FXN替代疗法包括用CTI-1601治疗。
48.根据权利要求44所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括分泌蛋白。
49.根据权利要求44所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。
50.根据权利要求44所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61。
51.一种线粒体疾病的治疗方法，所述方法包括：
提供来自患有FXN缺乏的受试者的样品，
测定所述样品中的一种或多种FXN敏感性基因组标志物(FSGM)的FXN表达谱，
比较所述样品的所述FXN表达谱和选自由一种或多种FSGM的正常FXN表达谱、一种或多种FSGM的基线FXN(-)表达谱和一种或多种FSGM的FXN替代表达谱组成的组中的至少一种其它表达谱，
将所述样品FXN表达谱分类为对应于正常FXN表达谱、基线FXN(-)表达谱或FXN替代表达谱，
基于所述样品FXN表达谱的分类开始、增加或减少施用于所述受试者的FXN替代疗法的剂量。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述线粒体疾病是弗里德赖希共济失调(FRDA)。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括分泌蛋白。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61。
56.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括NR4A1、PTP4A1、ATF3、BTG2、EGR1、EGR2、EGR3、CYR61和ABCE1中的一种或多种。
57.根据权利要求51的方法，其中所述一种或多种FSGM包括EGR1、EGR2、EGR3和IGF1中的一种或多种。
58.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8和CYCS中的一种或多种。
59.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括OPS2、VBP1、PSMA3、SLIRP、CUL2、DCUN1D1、UBE2D3、ZNRF1、RNF2和LAMP2中的一种或多种。
60.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39、RPL38、RPS27L和ABCE1中的一种或多种。
61.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3和CYCS中的一种或多种。
62.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括NR4A1、EGR1、EGR3、ADAMTS1、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2和CYR61中的一种或多种。
63.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括PSMA3、CUL2、UBE2D3、ZNRF1、RPS15A、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。
64.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括ABCE1、RPS15A、EIF1AX、RPL24、RPL32、RPL26、RPL10、RPL39和RPL38中的一种或多种。
65.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6、MT-ATP8、CYCS、TMEM-126A、MAOA和ABCE1中的一种或多种。
66.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-CO3、MT-ATP6和MT-ATP8中的一种或多种。
67.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括ABCE1、RPL26、RPL38、RPL10、RPL32、RPS15A、RPL24、RPL39、SLIRP、COPS2、DCUN1D1、RNF2、EGR1、BTG2、ATF3、PTGS2、IGF1、SERPINE1和THBS1中的一种或多种。
68.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种FSGM包括RPL26、THBS1、SERPINE1、IGF1、PTGS2、RPL10、RPS27L、CYCS、ATF3、BTG2、EGR1、EGR3和CYR61中的一种或多种。
69.一种用于测定FSGM的表达谱的组合物，所述组合物包含用于表2、表4和/或图3中所述的至少一种或多种FSGM的检测的试剂。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述一种或多种FSGM包括分泌蛋白。
71.根据权利要求69所述的组合物，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。
72.根据权利要求69所述的组合物，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61。
73.一种用于检测来自表现出共济蛋白(FXN)缺乏或正在接受FXN缺乏治疗的受试者的生物样品中的一种或多种共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)的试剂盒，其包含用于测量来自所述受试者的所述生物样品中的所述一种或多种FSGM的水平的一种或多种试剂，其中所述一种或多种FSGM包括选自表2、表4和/或图3的一种或多种FSGM，和用于测量所述FSGM的水平的一组说明。
74.根据权利要求73所述的试剂盒，其中所述试剂是与所述一种或多种共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)结合的抗体或与所述一种或多种FSGM的相应的mRNA互补的寡核苷酸。
75.根据权利要求73所述的试剂盒，其中所述一种或多种FSGM包括分泌蛋白。
76.根据权利要求73所述的试剂盒，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。
77.根据权利要求73所述的试剂盒，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61。
78.一种用于监测或评估共济蛋白(FXN)替代疗法的功效的方法的检测板，所述检测板包含一种或多种检测试剂，其中每种检测试剂对一种或多种共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)的检测具有特异性，其中所述一种或多种FSGM包括选自表2、表4和/或图3的一种或多种标志物。
79.根据权利要求78所述的检测板，其中所述共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)包括至少两种或更多种FSGM。
80.根据权利要求78所述的检测板，其中所述一种或多种FSGM包括分泌蛋白。
81.根据权利要求78所述的检测板，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61、ADAMTS1、ASPN、FAM177A、IGF1、LOX、NRTN、SERPINE1、STC1和THBS1中的一种或多种。
82.根据权利要求78所述的检测板，其中所述一种或多种FSGM包括CYR61。
83.一种试剂盒，其包含根据权利要求78所述的检测板和用于基于所述一种或多种共济蛋白敏感性基因组标志物(FSGM)的水平获得与共济蛋白(FXN)替代疗法相关的信息的一组说明。
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