DE3784768T2

DE3784768T2 - Verwendung von zusammensetzungen auf basis von crotoxin, zur herstellung von medikamenten zur behandlung von carcinomen.

Info

Publication number: DE3784768T2
Application number: DE8787304427T
Authority: DE
Inventors: Molina Carlos Maria Coni; Luis Alberto Costa; Plata Guillermo Jose Hernandez; Juan Carlos Vidal
Original assignee: Ventech Research Inc
Current assignee: Onco Venom Research Sa Ciudad De Panama Pa
Priority date: 1986-05-19
Filing date: 1987-05-19
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 2007-05-20
Also published as: EP0246861A3; DE3784768D1; JPH0720875B2; JPS6333334A; EP0246861A2; ES2054668T3; EP0246861B1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines im wesentlichen reinen Crotoxin-Komplexes aus Crotoxin A- und B-Untereinheiten zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von malignen Tumoren.

Beschreibung des Standes der Technik

Die analgetische Wirkung von Schlangengift ist seit dem Altertum bekannt und unzählige Autoren habe die Wirksamkeit der Verabreichung von rohen Kobra- und Klapperschlangengiften bei der Behandlung von Trigeminus-Neuralgien, tabetischen und tumorbedingten Schmerzen dargelegt. Im Fall von Tumorschmerzen konnten die Patienten in 70% der Fälle ohne das Verabreichen von Morphin und schmerzfrei gehalten werden.
Jedoch befaßten sich mit diesen Patienten nur wenige Autoren näher. Das Erscheinen neuer Analgetika führte dazu, daß die Forschung auf diesem Gebiet fallen gelassen wurde, und der Fortschritt der Chemotherapie führte zur Aufgabe der Forschung über die mögliche antineoplastische Wirkung von Giften. Zu jener Zeit wurden rohe Gifte offensichtlich ohne adäquate Klassifikation angewendet. Manchmal wurde Kobragift aus Indien oder Südafrika wahllos mit unvorhersagbaren Ergebnissen angewendet.
Unabhängig davon war der erste cytotoxische Bestandteil, der aus Schlangengift isoliert und zur Homogenität gereinigt wurde, ein Cytotoxin, das von BRAGANCA et al (1967) aus Naja naja-Gift erhalten wurde. Später isolierten TAKECHI et al (1971) zwei Cytotoxine aus dem gleichen Gift, die eine hohe cytotoxische Aktivität für Tumorzellen hatten. GILLO (1966), WIRTHEINER & GILLO (1966), BRISBOIS et al (1968) zeigten, daß das Naja naja-Gift das Wachstum von Tumoren in Tieren (Mäusen) inhibierte, da die Tumorzellen unfähig waren, zu proliferieren, obwohl sie nicht zerstört wurden.
Die Komplexität der Zusammensetzung von Giften und das Fehlen adäquater Kontrollen führte jedoch dazu, daß die Forscher annahmen, daß die cytotoxische Wirkung gegen Tumorzellen bei einer Gegenüberstellung mit normalen Zellen nicht selektiv sein würde.
Im Gegensatz zu Cytotoxinen aus Elapid-Giften (d.h., Kobragift), die Peptide von 59 bis 62 stark basischen Aminosäuren sind, enthalten die Crotalidgifte keine Cytotoxine und ihre cytotoxische Aktivität hängt mit anderen Bestandteilen zusammen.
Die Fraktion aus dem Gift von Crotalus durissus terrificus, die als "Crotoxin" identifiziert worden ist, wurde zuerst von SLOTTA und FRAENKEL-CONRAT (1938) durch thermische Behandlung des Giftes und Präzipitation mit Alkohol isoliert. Diese Fraktion, die mit Pyridin-Essigsäure von pH 4,7 kristallisiert werden konnte, und die Untersuchungen mit freier Elektrophorese (LI & FRAENKEL-CONRAT) und Ultrazentrifugation (GRALEN & SVEDBERG, 1938) zeigten keine größeren Inhomogenitäten und erlaubten, diese Fraktion als eine homogene chemische Einheit anzusehen.
1971 zeigten zwei Forschergruppen, daß "Crotoxin" tatsächlich ein aus zwei Hauptbestandteilen gebildeter Komplex ist (RUBSAMEN et al., 1971; HENDON & FRAENKEL-CONRAT, 1971). Einer dieser Bestandteile ist eine Phopholipase A&sub2; mit einem Molekulargewicht von 14500 und einem isoelektrischen Punkt von 9,7 und wird auch Crotoxin B (für basisch) genannt. Der andere Bestandteil ist ein Peptid mit einem Molekulargewicht von 9500 und einem isoelektrischen Punkt von 3,5 und ohne enzymatische Aktivität, genannt Crotoxin A (für sauer (acidic)).
Wir haben basische Phospholipase A&sub2; (Crotoxin B) und die saure Untereinheit (Crotoxin A) aus Crotalus durissus terrificus-Gift mit einem Verfahren abgetrennt, das besteht aus:
1) Chromatographie auf Sephadex G-75 bei pH 4,5, und
2) Ionenaustauscherchromatographie auf CM-Sephadex C-50 und Elution mit Ammoniumformiat mit einem konkaven Molaritätsgradienten von 0,1 bis 1,0 M (pH 3,5), gefolgt von einem linearen Gradienten (1,0 bis 3,0 M) des gleichen Puffers. In diesem Schritt wurden die folgenden Bestandteile getrennt:
1) Crotoxin A;
2) eine Phospholipase A&sub2; mit einem isoelektrischen Punkt von 4,1;
3) einen dritten Bestandteil, der als Crotamin (Verunreinigung) identifizierbar war, und
4) basische Phospholipase A&sub2; (Crotoxin B), die als letzte eluiert wird.
Crotoxin A wird weiter durch Chromatographie auf DEAE-Sephadex A-50 mit Kaliumphosphat (pH 6,5) als Elutionsmittel gereinigt. Crotoxin B wird ebenfalls weiter gereinigt, und zwar durch Chromatographie auf CM-Sephadex C-50 (pH 3,5).
Die gereinigten Fraktionen werden durch Ultrazentrifugation mit einer Diaflo UM-10-Membran (AMICON CO., Danvers, Ma., U.S.A.) konzentriert und durch ausgiebige Dialyse gegen 0,15 M NaCl equilibriert. Die gereinigten Bestandteile verhalten sich sowohl bei der Elektrophorese auf Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat als auch hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung als homogene Materialien. Im Interesse der Klarheit sei gesagt, daß bei Bezugnahme auf die Untereinheiten A und B diese Crotoxin A bzw. Crotoxin B (Phospholipase A&sub2;) entsprechen, getrennt oder in Komplexform.

Zusammenfassung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird die Verwendung eines im wesentlichen reinen Crotoxinkomplexes aus den Crotoxinuntereinheiten A und B für die Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von malignen Tumoren bereitgestellt.
Erfindungsgemäß wird weiter ein Verfahren zum Herstellen einer therapeutischen Zusammensetzung, enthaltend einen Crotoxinkomplex aus Crotoxin A- und B-Untereinheiten, für die Behandlung von malignen Tumoren bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: chromatographische Abtrennung des Crotoxinkomplexes aus rohem Crotalus-Gift, Konzentrieren der wiedervereinigten Fraktionen, die durch Eluieren des absorbierten Crotoxinkomplexes gebildet werden, Dispergieren eines in dem Konzentrationsschritt präzipitierten unlöslichen Produktes in einem wäßrigen Medium, Fraktionieren der Untereinheiten A und B durch Chromatographie der Dispersion auf einer Adsorptionssäule und Eluieren der Einheiten A und B mit einer Pufferlösung (z.B. Ammoniumformiat mit einem pH von ungefähr 3,5), und Reinigen der getrennten, eluierten Fraktionen, die die Untereinheiten A und B enthalten, und schließlich Mischen der Untereinheiten, um den Crotoxinkomplex zu bilden.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung gewisser Antitumor-Eigenschaften von Crotoxin A und Crotoxin B durch die Anmelder.

1. ENZYMATISCHE EIGENSCHAFTEN

A) Enzymatische Eigenschaften von Crotoxin B

Crotoxin B ist eine Phospholipase A&sub2; und katalysiert die Hydrolyse der Esterbindung zwischen der Fettsäure und der Hydroxylgruppe in Position 2 der Glyceringruppe in 1,2-Diacyl- (1-alkenyl-2-acyl oder 1-alkyl-2-acyl) -sn-glycero-3-phosphoglyceriden (Phospholipiden) gemäß dem folgenden Schema: (Phospholipide) (Lysoderivate) (Fettsäure)
wobei R&sub1; und R&sub2; Fettsäurereste sind und R&sub3; sein kann: H (Phosphatidsäure), ein Polyalkohol (Glycerin in Phosphatidylglycerin, Inositol in Phosphatidylinositol) oder ein nitrogenierter Alkohol (Cholin in Phosphatidylcholin, Ethanolamin in Phosphatidylethanolamin, Serin in Phosphatidylserin). Die Reaktionsprodukte sind eine freie Fettsäure (III) und das 1-Acylderivat (II), das im allgemeinen als Lysoderivat (Lysophosphatidinylcholin, Lysophosphatidylethanolamin) definiert wird. Die Hydrolysereaktion ist stereospezifisch, weist eine Positionsspezifität über die Esterbindung des C-2 von Glycerin auf und erfordert spezifisch Ca²&spplus;-Ionen als Co- Faktor.
Crotoxin B hydrolysiert Phospholipide in verschiedenen Aggregationszuständen, beispielsweise kurzkettige Lecithine, die durch chemische Synthese erhalten werden und in Wasser sehr gut löslich sind, als Micellen aggregiert sowie Phospholipide mit langkettigen Fettsäuren (C&sub1;&sub6;-C&sub2;&sub2;), die als Vesikel oder als Liposomen aggregiert sind, oder in biologisch bedeutsamen Strukturen, beispielsweise Lipoproteinen und biologischen Membranen. Seine spezifische Aktivität auf Eidotterlipoproteinen (pH 8,0, 40ºC) beträgt 700 uMol hydrolysiertes Substrat/min/mg Protein.
Eine bedeutsame funktionelle Eigenschaft, die es mit anderen lipolytischen Enzymen gemeinsam hat, ist, daß in Gegenwart von wasserlöslichen Phospholipiden das Substrat an die aktive Stelle gebunden wird und ein produktiver ternärer Komplex in Gegenwart von Ca²&spplus; gebildet wird. Dann geschieht die Katalyse und die Hydrolyseprodukte werden freigesetzt. Wenn das Phospholipid aggregiert ist (Micellen oder Vesikel), ist das Enzym an der Phospholipid-Wasser-Phasengrenze adsorbiert, wobei die aktive Seite zum geordneten Feld der Substratmoleküle orientiert ist; es wird ein Monomermolekül binden und in Gegenwart von Ca²&spplus;-Ionen wird ein ternärer Grenzphasenkomplex gebildet. Die Hydrolyse wird mittels des gleichen Reaktionsmechanismus, aber mit einer drastischen Erhöhung der Hydrolyserate (10000- bis 100000-fach) weitergehen.
Diese Erhöhung der Hydrolyserate, die aus der Wechselwirkung des Enzymes mit aggregiertem Substrat resultiert, wird "Grenzflächenaktivierung" genannt und ihr Mechanismus ist bisher nicht vollständig geklärt.
Crotoxin B ist das entscheidende pharmakologische Agens des Crotoxinkomplexes.

B) Crotoxin A

Seine den Crotoxinkomplex betreffenden Eigenschaften

Crotoxin A weist keine nachweisbare enzymatische oder toxische Aktivität auf, aber es hat zwei wichtige Eigenschaften, betreffend den Wirkungsmechanismus des Komplexes, nämlich a) wenn Crotoxin A einer Lösung von basischer Phospholipase A&sub2; (Crotoxin B) zugefügt wird, bildet sich spontan ein hochstabiler Komplex (Kd=2x10&supmin;&sup9;M) mit einem niedrigeren isoelektrischen Punkt (4,7) und einem Molekulargewicht ähnlich jenem des nativen Komplexes, und b) im Komplex mit Crotoxin A ist die enzymatische Aktivität der Phospholipase A&sub2; inhibiert, hauptsächlich dann, wenn das Substrat in einem aggregierten Zustand vorliegt.

2. Pharmakodynamik - Wirkungsmechanismus

Die Hydrolyse von Phospholipiden in Form von Aggregaten oder biologischen Membranen erfordert die Bindung der basischen Phospholipase A&sub2; an die Phospholipid-Wasser-Phasengrenzfläche, und diese Bindung geschieht nur nach Dissoziation des Komplexes. Wir haben doppelt markierten Crotoxinkomplex (¹²&sup5;J-Crotoxin B und ³H-Crotoxin A) verwendet, wodurch gezeigt wurde, daß nur Crotoxin B an Membranen bindet, während Crotoxin A im Überstand bleibt. Wir haben festgestellt, daß der mit Dimethylsuberimidat hergestellte Komplex seine Fähigkeit verliert, an Membranen zu binden, obwohl er noch Phospholipaseaktivität aufweist.
Wir haben gezeigt, daß die katalytische Stelle von Crotoxin B im Crotoxinkomplex für monomeres Substrat zugänglich ist und seine funktionelle Kapazität intakt bleibt.
Isoliertes Crotoxin B ist jedoch in der Lage, stark mit Phospholipid-Wasser-Phasengrenzflächen in Wechselwirkung zu treten, während der Komplex mit Crotoxin A unfähig zu sein scheint, mit der Phasengrenzfläche in Wechselwirkung zu treten.
Die folgenden Schlüsse können aus den oben angegebenen und anderen Ergebnissen gezogen werden:
a) Die Bildung des Komplexes zwischen Crotoxin B und Crotoxin A beeinflußt nicht die Struktur und Eigenschaften der aktiven Stelle von Crotoxin B, verhindert aber, daß das Enzym an die Phospholipid-Wasser- Phasengrenzfläche bindet und inhibiert folglich die enzymatische Hydrolyse von Substraten in Form von Aggregaten oder biologischen Membranen.
b) Die Wechselwirkung von Crotoxin B mit aggregierten Substraten hängt von der Exposition eines spezifischen Bereiches in der Oberfläche des Enzymes ab, der funktionell und topographisch von der aktiven Stelle verschieden ist. Nur das freie Enzym mit dieser exponierten Oberfläche ist in der Lage, an die Phasengrenzfläche zu binden und die Membranphospholipide zu hydrolysieren sowie das als "Grenzflächenaktivierung" bekannte Phänomen aufzuweisen.
c) Der spezifische Bereich der Enzymoberfläche ist der durch Bildung des Komplexes mit Crotoxin A versteckte Bereich, was impliziert, daß die Wechselwirkung zwischen Crotoxin B mit der Phasengrenzfläche und Crotoxin A sich gegenseitig ausschließen, d.h., die Bildung des Komplexes mit Crotoxin A verhindert die Wechselwirkung des Enzymes mit Membranen und die Wechselwirkung von Crotoxin B mit Membranen verhindert die Bildung des Komplexes mit Crotoxin A.
Die Beobachtung des cytopathischen Effektes des Crotoxinkomplexes auf Ehrlich Ascitis-Tumorzellen war zufällig, aber es wurde verifiziert, daß Konzentrationen im Bereich von 10&supmin;&sup9;M zur vollständigen Lyse einer Kultur führten, beginnend nach 60 Minuten. Seine cytopathische Wirkung auf Hepatocyten, Fibroblasten und Peritoneal-Kulturzellen war jedoch schwach.
Hinsichtlich des Wirkungsmechanismus sind die folgenden Beobachtungen bedeutsam:
a) Crotoxin B ist der einzige Bestandteil des Crotoxinkomplexes, der fähig ist, eine cytotoxische Aktivität auf Tumor- und normale Zellen auszuüben. In beiden Fällen führt der Zusatz von isoliertem Crotoxin B zu Beweisen für zelluläre Schäden.
b) Die cytotoxische Wirkung steht im Zusammenhang mit der enzymatischen Aktivität von Crotoxin B. Die selektive Blockierung der aktiven Stelle durch Behandlung mit p-Bromphenacylbromid (CANZIANI et al., 1982) beseitigt die cytotoxische Aktivität. Die diskreten Veränderungen, die beobachtet wurden, scheinen mit der Bindung des Enzymes an die Membran im Zusammenhang zu stehen, aber diese Veränderungen sind offensichtlich nicht ausreichend, die Lyse der Zellen zu verursachen.
c) Der Crotoxinkomplex zeigt jedoch eine selektivere cytotoxische Wirkung auf Tumorzellen.
d) Die Untersuchungen des Anmelders haben gezeigt, daß der Crotoxinkomplex in der Lage ist, an Tumorzellmembranen zu binden, so daß der limitierende Schritt für die Wirkung des Crotoxinkomplexes die Dissoziation der Untereinheiten A und B ist. Eine plausible Erklärung für diese differentielle Wirkung des Crotoxinkomplexes muß in der Existenz lokaler physikochemischer Bedingungen auf der Ebene der Tumorzellmembranen liegen, die die Dissoziation des Komplexes fördern. Diese Bedingungen, die in Tumorzellen vorherrschen, mögen nicht ausreichend sein, eine signifikante Dissoziation des Crotoxinkomplexes in der Nähe normaler Zellen zu verursachen.
e) Veränderungen in den plasmatischen Membranen von Tumorzellen sind seit 1958 bekannt und es gibt genügend Beweise, die nahelegen, daß onkogene Agenzien viele Funktionen plasmatischer Membranen verändern und infolge dessen die in den Membranen beobachteten pleomorphen Veränderungen erzeugen. 1967 beschrieb STOCKER Veränderungen der Haftfähigkeit und das Fehlen einer Kontaktinhibition, obwohl dies keine unveränderliche Eigenschaft in malignen Tumoren zu sein scheint (WALLACH, 1973). Ähnliche Phänomene treten bei der elektrischen Entkopplung auf (WALLACH, 1973). Die in Tumorzellen weniger prominente Wachstumsinhibition durch Kontakt (STOCKER, 1967) und die größeren Fusionsfähigkeiten (OKADA, 1969; POSTE, 1970) scheinen mit Malignität parallel zu laufen. Es sind Veränderungen im Oberflächenpotential neoplastischer Zellen (WALLACH, 1973) sowie der Permeabilität (SYLVEN et al., 1962) und immunologische Veränderungen beobachtet worden. Das Auftreten von neuen Antigenen, embryonalen Antigenen und die Deletion von bestimmten selektiven Antigenen in Organen sind in unzähligen experimentellen und spontanen Tumoren beobachtet worden. Die Dissoziation des Crotoxinkomplexes kann durch kooperative Titration des Crotoxin A Carboxylates gefördert werden. Obwohl pH-Werte von unter 3 zum Erzeugen der Dissoziation notwendig sind, muß bedacht werden, daß diese Ergebnisse im Gleichgewicht erhalten worden sind. Die vorherrschende Bedingung in einer Zelle ist das Gleichgewicht (steady state), und daher kann das Ausmaß der im Gleichgewicht berechneten Dissoziation beträchtlich verändert sein, insbesondere, wenn in beschränkten Volumina innerhalb von Diffusionsschranken Gradienten auftreten.
f) Das Endergebnis der Dissoziation des Crotoxinkomplexes in der Nähe von plasmatischen Tumorzellmembranen ist, daß Crotoxin B an die Membran bindet und die Hydrolyse der Membranphospholipide bewirkt. Die Hydrolyseprodukte durch Phospholipase A&sub2; und insbesondere Lysophosphatide (Struktur II, oben) haben Detergenzeigenschaften (in diesem Zusammenhang: die Benennung von Lysoderivaten beruht auf den lytischen Eigenschaften). Thermodynamische und geometrische Gründe verhindern, daß die Produkte in eine stabile lamellare Struktur gepackt werden. In Modellsystemen (Liposomen) führt der Zusatz von Lysoderivaten (1 bis 3 mMol pro 100 mMol Phospholipid) zu großen Störungen bei der Permeabilität (beispielsweise der Freigabe von Saccharose und eingekapselten Kationen, gewöhnlich impermeabel) und größere Konzentrationen von Lysoderivaten veranlassen das Zerreißen der laminaren Struktur und die Bildung eines gemischten micellären Aggregates.
Unter Beachtung der Tatsache, daß Membranphospholipide langkettige Fettsäuren (16 bis 24 Kohlenstoffatome) enthalten, verlassen die Hydrolyseprodukte (Strukturen II und III, oben) die Membran nicht notwendigerweise und die Zunahme ihrer relativen Konzentrationen führt zu Veränderungen, die die Freisetzung cytoplasmatischer Markerenzyme in das Medium und morphologische Veränderungen (Schwellen und Zerreißen von mitochondrialen und endoplasmatischem Reticulum) verursachen, was zu zellulärer Lyse führt.
Gegenwärtig ist nicht klar, ob diese Veränderungen aus der Internalisierung des Enzymes oder den abrupten Veränderungen der Zusammensetzung und der Ionenstärke, die eine Folge der Permeabilitätsveränderung sind, resultieren.

Schlußfolgerungen

Der Mechanismus, der zur Tumorzell-Lyse führt, kann als das Ergebnis der enzymatischen Aktivität von Crotoxin B erklärt werden. Jedoch liegt ein Punkt von großem Interesse im Mechanismus der Zielauswahl des Crotoxinkomplexes. Es wird angenommen, daß der Crotoxinkomplex als ein zirkulierendes Lager inerten Crotoxins B wirkt, das seine Aktivität nur bei Membranen mit physikochemikalischen Bedingungen, die die Dissoziation des Crotoxinkomplexes fördern, aufweist. Diese Zellen werden daher für einen Angriff durch Crotoxin B verwundbar. Unter diesen Bedingungen wären Tumorzellen ein effizienteres alternatives Ziel für die Bindung von Crotoxin B.
Zusätzlich mag es bedeutsam sein, darzulegen, daß Phosphatidylinositol eines der für einen Angriff durch das Enzym empfänglichen Phospholipide ist. Es ist derzeit bekannt, daß eines der kritischen Signale, die die zelluläre Proliferation induzieren, die Hydrolyse von Triphosphoinositid durch eine Membranphospholipase C ist. Hydrolyseprodukte sind Inositoltriphosphat, das als "second messenger" ("zweiter Bote") wirkt, und ein Diglycerid, das für die Aktivierung der Proteinkinase C verantwortlich ist, die die Phosphorylierung von Proteinen katalysiert. Das Hydrolyseprodukt von Phospholipase A&sub2; bei seiner Wirkung auf Phosphatidylinositol ist das korrespondierende Lysoderivat, das kein adäquates Substrat für endogene Phospholipase C ist, und daher die zellulären Proliferationsmechanismen stören könnte.
Zur Bewertung der Antitumoraktivität wurden im Einklang mit dem üblichen Protokoll des National Cancer Institute (NCI- USA) die Mäusetumoren Melanom B16, Colontumor 26, Ridgway's osteogenes Sarkom und Lewis Karzinom verwendet. In allen Fällen ist eine Zunahme der durchschnittlichen Lebenserwartung um mehr als 20% und/oder eine Inhibition des lokalen Wachstums von mehr als 50% im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen notwendig, um eine Aktivität zu demonstrieren. Dieses Erfordernis ist etwas niedriger als das gewöhnlich geforderte (durchschnittliche Lebenserwartung mehr als 25%, Wachstumsinhibition mehr als 60%) wegen der besonderen Sensibilität von Mäusen gegenüber der Wirkung dieses Toxins, wie im folgenden verständlich werden wird.
Die Zunahme der durchschnittlichen erwarteten Lebenszeit betrug zwischen 150 und 300% bei 55 bis 80% Überlebenden nach 90 Tagen mit Melanom B16; ungefähr 200% mit 60 bis 80% Überlebenden mit Colontumor 26; 170 bis 200% mit Osteosarkom und mit Lewis Tumor.
Der Crotoxinkomplex wurde alle 4 Tage intramuskulär verabreicht. Das Ergebnis hing von dem Stadium der Erkrankung ab. Die unmittelbar nach Implantation des Tumors behandelten Tiere reagierten sehr viel besser als jene, die behandelt wurden, als die Krankheit bereits fortgeschritten war.

PHARMAKOKINETIK

Pharmakokinetische Untersuchungen wurden unter Verwendung von mit ¹²&sup5;J markiertem Crotoxin B und in einigen Fällen mit doppelt markiertem Komplex mit ³H oder ¹&sup4;C in Crotoxin A durch Reaktion mit Essigsäureanhydrid durchgeführt.

6.1 Absorption

Eine orale Verabreichung erwies sich als unwirksam. Nach der Markierung von Crotoxin B mit ¹²&sup5;J und Bilden des Komplexes mit Crotoxin A wurde der Komplex in Sphingomyelinliposomen eingekapselt und verabreicht. Unter diesen Bedingungen konnten meßbare Crotoxinspiegel im Plasma nach oraler Verabreichung gemessen werden, aber die absorbierten Mengen variierten beträchtlich. Infolgedessen ist die orale Verabreichung bis jetzt verworfen worden.
Nach intravenöser Injektion in Mäuse und Kaninchen nimmt die plasmatische Konzentration rapide ab, und erreicht 2% der ursprünglichen Menge innerhalb von ungefähr 30 Minuten. Ungefähr 30% wird im Urin zurückgewonnen.
Nach intramuskulärer Verabreichung wird ein Gipfel der plasmatischen Konzentration ungefähr 30 min nach der Injektion beobachtet. Innerhalb der Stunde erniedrigt sich die plasmatische Konzentration auf ungefähr 10% der ursprünglichen Menge und im Urin werden nur Spuren davon beobachtet. Crotoxin B wird hauptsächlich in der Leber konzentriert (HABERMANN, 1972, FRAENKEL-CONRAT et al., 1976), wo es abgebaut wird und zum Aminosäurepool weitergeht. Die eingeführte Markierung verschwindet nahezu vollständig zwischen 6 und 8 Stunden nach der Inoculation.
Nach den Ergebnissen von HABERMANN et al., (1972) passieren Crotoxin B oder sein Komplex mit Crotoxin A nicht die Bluthirnschranke, da die Menge meßbaren Markers im Gehirn oder Rückenmark intravenös Inoculierter vernachlässigbar ist. HABERMANN und RAUDE haben gezeigt, daß die Injektion von Crotoxin in zerebrale Ventrikel zu Konvulsionen führt.
Die oben angegebenen Daten legen nahe, daß Crotoxin weit verteilt wird, obwohl es eine kurze Halbwertszeit hat und keine persistierenden Gewebekonzentrationen auftreten.
Infolge der hohen Geschwindigkeit, mit der der Organismus den Komplex katabolisiert, wurden Verteilungsstudien durchgeführt, bei denen hohen Dosen von markiertem Crotoxinkomplex (¹²&sup5;J Crotoxin B) an weiße (albicans) Nager verabreicht wurden. Zwei Gruppen von Tieren wurden 30 und 60 min nach der intravenösen Verabreichung von 220 ug Crotoxinkomplex getötet, um die Konzentration des Markers in verschiedenen Organen und Geweben festzustellen. Die Konzentrationen sind in Femtomolen (10&supmin;¹² Mol) ausgedrückt. GEWEBE ODER ORGAN ZEIT NACH IMPFUNG Milz Gehirn und Rückenmark Herz Magen lymphatische Ganglien mesenteriales Fett Leber Hypophyse Dünndarm Dickdarm Knochenmark Skelettmuskel Urin Pankreas Lungen Niere Nebenniere Schilddrüse Gallenblase wiedergewonnen insgesamt Prozentsatz des Gesamten
Anmerkung: Die getöteten Tiere litten ernsthaft unter einer unzureichenden Atmung und wurden durch künstliche Beatmung am Leben gehalten.
n.n.a: nicht nachweisbar (< 70)
bDE: Geschätzte Durchschnittsdaten
c: Auftreten im Urin infolge der gewählten hohen Dosierung. Da das Molekulargewicht des Komplexes 24000 beträgt, wird er durch die Niere filtriert.

6. 2 Biotransformation

Die Biotransformation fand in der Leber statt.

6.3 Exkretion und Endmetabolite

Die Biotransformationsprodukte sind Aminosäuren, die daher in den metabolischen Pool, der von dem Organismus verwendet wird, gehen.

An Zellkulturen durchgeführte Untersuchungen

Der Mechanismus, der in der Tumorzelle zur Lyse führt, kann als das Ergebnis der enzymatischen Aktivität von Crotoxin B erklärt werden; der interessanteste Punkt liegt jedoch im Mechanismus der Zielauswahl (der malignen Zelle) durch den Crotoxinkomplex.
Es wird angenommen, daß der Crotoxinkomplex als ein zirkulierendes Lager von inertem Crotoxin B agiert und Aktivität nur bei Zellen mit definierten physikochemikalischen Bedingungen manifestiert, was zur Dissoziation des Crotoxinkomplexes führt und dazu, daß die Zelle dem Angriff von Crotoxin B ausgesetzt ist. Unter diesen Bedingungen wäre eine neoplastische Zelle ein wirksameres alternatives "Ziel" zum Einfangen von Crotoxin B.
Die therapeutische Zusammensetzung kann unter Befolgung kommerzieller Verfahren realisiert werden, beispielsweise als flüssige Formulierung, z.B. in wäßrigen Vehikeln mit den üblichen Additiven (d.h., physiologischer Lösung), Lösung oder Emulsion, schließlich in Verbindung mit anderen Medikamenten, beispielsweise Lokalanästhetika, usw.
Die Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in dem folgenden Beispiel veranschaulicht, obwohl die dort angegebenen reaktiven Produkte und Mengen sowie die Bedingungen und andere Details der Durchführung nur als Beispiele genannt sind, wobei verstanden werden soll, daß das Beispiel den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränkt.

BEISPIEL

I. Erhalten des rohen Komplexes

500 mg lyophylisierten Materials werden in 5 ml 0,2 M Natriumchloridlösung, 1 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat und 20 mM Ammoniumformiatpuffer pH 4,0 suspendiert. Die Lösung wird 20 min bei 10000 g in einer gekühlten Sorvall RC 2-B Zentrifuge bei 4ºC zentrifugiert; der gelbliche und leicht trübe Überstand wird mit einer Kunststoffspritze, die mit einem Teflonrohr verbunden ist, abgesaugt und stellt das Ausgangsmaterial dar.
Die restlichen Schritte des Verfahrens werden in einem Kühlraum bei 2 bis 4ºC durchgeführt.

Schritt 1:

Das Ausgangsmaterial wird auf eine Sephadex G-75-Säule (Pharmacia Ltd. Uppsala, Schweden) von 85 x 2,5 cm (417 ml) aufgetragen, die für einen Aufwärtsfluß eingerichtet und mit 0,1 M Ammoniumformiatpuffer, pH 4,5, enthaltend 0,1 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat, vorequilibriert ist. Die Elution wird mit der gleichen Pufferlösung durchgeführt, wobei Fraktionen von 3,0 bis 3,2 ml bei einer Flußrate von 0,8 bis 1,0 ml/cm²/h gesammelt werden. Der rohe Komplex eluiert bei einem Kav-Wert (Kav = (Ve x Vo)/(Vo - Vt)) von 0,44.
Die den rohen Komplex enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und durch (a) Lyophylisierung oder (b) Ultrafiltration unter Stickstoffdruck in einer mit einer Diaflo UM-10-Membran (Amicon Co., Danvers, Ma. U.S.A.) ausgerüsteten Kammer auf ein Endvolumen von ungefähr 10 ml konzentriert.

II. Trennung der Untereinheiten A und B aus dem rohen Komplex

Schritt 2:

Die in Schritt 1 erhaltene Probe wird mit Essigsäure auf einen pH von 3,5 eingestellt und auf eine CM-Sephadex C-50- Säule (Pharmacia Ltd., Uppsala, Schweden) von 8 x 2 cm aufgetragen und mit 0,1 M Ammoniumformiatpuffer, pH 3,5, vorequilibriert. Die Elution beginnt mit 250 ml 0,1 M Ammoniumformiatpuffer, pH 3,5, um die Untereinheit A zu eluieren, die unter diesen Bedingungen von dem Austauscher nicht zurückgehalten wird. Die Elution wird mit 350 ml eines konkaven Molaritätsgradienten von 0,1 bis 1,0 M Ammoniumformiat, pH 3,5, und schließlich mit 220 ml eines linearen Gradienten von 1,0 bis 3,0 M Ammoniumformiat, pH 3,5, fortgesetzt. Fraktionen von 5 ml werden bei einer Flußrate von 34 ml/cm²/h gesammelt. Das Elutionsprofil wird durch Messen der Absorbtion des Eluates bei 280 nm verfolgt. Der letzte Proteingipfel, der unter diesen Bedingungen eluiert, entspricht der Untereinheit B.

III. Reinigung der Untereinheiten

Schritt 3:

Reinigung der Untereinheit A:

Die dem ersten in Schritt 2 eluiertem Gipfel entsprechende Fraktion enthält die Untereinheit A. Diese und andere die Untereinheit A enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und gegen 3 x 1000 ml 10 mM Kaliumphosphat, pH 6,9, dialysiert. Alternativ wurden die vereinigten Fraktionen durch Ultrafiltration unter Stickstoffdruck mit einer Diaflo UM-05 (Amicon Co., Danvers, Ma., U.S.A.) konzentriert und mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,9, durch Chromatographie auf Sephadex G-25 (Pharmacia Ltd., Uppsala, Schweden) equilibriert.
Die Probe wird auf eine DEAE-Sephadex A-50-Säule (10x1,5 cm) aufgetragen, die mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,9, vor-equilibriert worden war. Die Untereinheit A wird mit 200 ml eines linearen Gradienten (100 ml 10 mM Kaliumphosphat, pH 6,9 + 100 ml 0,1 mM Natriumphosphat, pH 6,9) eluiert.
Die die gereinigte Untereinheit A enthaltenden Fraktionen wurden ausgiebig gegen 3 x 100 ml 0,15 M NaCl dialysiert und durch Ultrafiltration, wie zuvor erwähnt, konzentriert.
Die Ausbeute an Untereinheit A beträgt 37,5 mg Protein. So, wie sie unter den oben angegebenen Bedingungen erhalten wird, weist die Untereinheit A bei Immunelektrophorese auf einem Agargel nur eine Präzipitationslinie auf.

Schritt 4:

Reinigung der Untereinheit B

Die die Untereinheit B enthaltenden Fraktionen (in Schritt 2 zuletzt eluiert) werden vereinigt und die Probe lyophilisiert oder gegen 2 x 1000 ml 0,1 M Ammoniumformiatpuffer, pH 3,5, dialysiert und auf einer CM-Sephadex C-50-Säule chromatographiert, die mit dem gleichen Puffer, wie in Schritt 2 beschrieben, vor-equilibriert worden war, mit der Ausnahme, daß, sobald der konkave Ammoniumformiatgradient bis 0,1 M beendet worden war, die Elution mit Ammoniumformiatpuffer (0,2 M, pH 3,5) fortgesetzt wurde, um so die aktive Fraktion zu konzentrieren.
Die die gereinigte Untereinheit B enthaltenden Fraktionen werden ausgiebig gegen 6 x 1000 ml 0,15 M NaCl dialysiert.
Die Ausbeute an Untereinheit B beträgt 75 mg Protein. So, wie sie unter den oben angegebenen Bedingungen erhalten wird, weist die Untereinheit nach Polyacrylamidgel-Elektrophorese mit Natriumdodecylsulfat 2 Banden mit Beweglichkeiten auf, die Molekulargewichten von 14500 (Monomer) und 29000 (Dimer) entsprechen.

Sterilisierung gereinigter Untereinheiten:

Die gereinigten Präparationen der Untereinheiten A und B in einer 0,15 M NaCl-Lösung werden mittels Filtration durch Millipore-Membranen in einer ultravioletten Kammer sterilisiert.

Rekonstitution des Komplexes, ausgehend von den gereinigten Untereinheiten:

Die Untereinheiten A und B bilden spontan einen Komplex mit einer Dissoziationskonstante in der Größenordnung von 10&supmin;¹&sup0; M; die Komplexbildung ist innerhalb der ersten Minute nach der Mischung vollständig.
Unter Berücksichtigung der bei der Verwendung des Crotoxinkomplexes für die Behandlung von fortgeschrittenem Krebs erhaltenen Ergebnisse ergeben sich die folgenden Schlußfolgerungen:

Aus der Sicht der Grundlagenforschung

Betreffend die cytotoxische Wirkung ist gezeigt worden, daß eine bevorzugte Cytotoxizität von Crotoxin bezüglich Tumorzellen auftritt.
Die Endmetaboliten des Crotoxinkomplexes sind Aminosäuren.
Bei der Verwendung des Crotoxinkomplexes ist weder in Tieren noch in Menschen eine signifikante Immunreaktion nachgewiesen worden.
Breites Spektrum von Antitumor-Aktivität.
Es wurden keine ernsthaften Toxizitätseffekte beobachtet, weder akute, subakute noch chronisch akkumulative.
Es ist keine psychoorganische Abhängigkeit nachgewiesen worden.
Nach den obigen klinischen Erfahrungen mit Patienten, die verschiedene Behandlungen bekommen, tritt der Komplex nicht in Wechselwirkung mit anderen Behandlungen.
Es gibt keine Kontraindikationen. Versuchstiere, die eine intravenöse Injektion erhielten, wiesen akute tubuläre Nephropathien auf, die in einigen Fällen zum Tod führten. Entsprechend der Pharmakokinetik könnte der Crotoxinkomplex, da er ein Protein mit niedrigem Molekulargewicht ist (P.M.) von den Renaltubulae absorbiert werden, was Nierenschäden verursachen könnte.
Bis jetzt sind die folgenden Verabreichungswege ausprobiert und als wirksam und sicher befunden worden: intramuskulär, intratumoral, peri-tumoral, intracavitär, durch fistulöse Abschnitte, intradermal, intrachirurgisch und intramucosal.
Nach Metabolisierung gibt es keine Akkumulation in irgend einem Organ.
Es sind keine Effekte beobachtet worden, die der Tumorlyse zuzuschreiben wären, wie beispielsweise Hyperurikämie, Hypercalcämie, usw.
Die Verabreichung kann täglich erfolgen und erfordert nicht eine spezielle Technik oder spezielle Applikationsverfahren.
Die Verabreichung kann unter ambulanten Bedingungen durchgeführt werden.
Crotoxin wird für den Transport nicht an plasmatische Proteine gebunden.
Es sind weder Hämolyse noch Veränderungen der Blutgerinnung beobachtet worden.
Es sind keine elektrokardiographischen Veränderungen oder hämodynamische Störungen festgestellt worden.

Claims

1. Verwendung eines im wesentlichen reinen Crotoxin-Komplexes aus Crotoxin A- und B-Untereinheiten zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von malignen Tumoren.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Komplex durch getrennte Gewinnung der Crotoxin-Untereinheiten A und B aus Crotalus-Gift, Reinigen der Untereinheiten und dann Verbinden der gereinigten Untereinheiten zur Bildung des Crotoxin- Komplexes hergestellt wird.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 in Verbindung mit Cobrame oder Melittin.

4. Verfahren zum Herstellen einer therapeutischen Zusammensetzung, enthaltend einen Crotoxin-Komplex aus Crotoxin A- und B-Untereinheiten für die Behandlung maligner Tumoren, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: chromatographische Abtrennung des Crotoxin-Komplexes aus rohem Crotalus-Gift, Konzentrieren der wiedervereinigten Fraktionen, die durch Eluieren des absorbierten Crotoxin-Komplexes gebildet werden, Dispergieren eines in dem Konzentrationsschritt präzipitierten unlöslichen Produktes in einem wäßrigen Medium, Fraktionieren der Untereinheiten A und B durch Chromatographie der Dispersion auf einer Adsorptionssäule und Eluieren der Untereinheiten A und B mit einer Pufferlösung, Reinigen der getrennten eluierten Fraktionen, die die Untereinheiten A und B enthalten, und schließlich Mischen der Einheiten zur Bildung des Crotoxin-Kompiexes.

5. Verfahren zum Herstellen einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von inalignen Tumoren, wobei das Verfahren den Schritt des Mischens einer therapeutisch wirksamen Menge eines im wesentlichen reinen Crotoxin-Komplexes aus Crotoxin A- und B-Untereinheiten mit einem pharmakologisch verträglichen Träger umfaßt.

6. Verwendung von gereinigten Crotoxin B für die Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von malignen Tumoren.