DE69928778T2

DE69928778T2 - Anwendung von Komplexen von kationischen Liposomen und Polydeoxyribonukleotiden wie Arzneimitteln

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Publication number: DE69928778T2
Application number: DE69928778T
Authority: DE
Inventors: Roberto Porta; Laura Ferro; Fabio Trento; Claudio Nastruzzi; Elisabetta Esposito; Enea Menegatti
Original assignee: Gentium SRL
Current assignee: Gentium SRL
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: DE69928778D1; EP1059092B1; JP2001002565A; EP1059092A1; ES2251134T3; DK1059092T3; KR20010002244A; CA2274419A1; US20020142029A1; KR100676492B1; JP4598908B2; US6767554B2; ATE311907T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Komplexen, gebildet durch kationische Liposomen und Polydeoxyribonukleotide als Medikamente. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der oben erwähnten Komplexe, die eine bemerkenswerte Stabilität über die Zeit als Medikamente mit antientzündlicher Aktivität besitzen.
Es ist wohlbekannt, dass Liposomen als Träger für eine systemische Arzneimittelverabreichung verwendet werden können. Sie werden auf dem intravenösen, subkutanen, intramuskulären Injektionsweg oder durch Infusion verabreicht.
Soweit die Struktur der Komplexe zwischen Liposomen und DNAs betroffen ist, ist bekannt, dass Oligodeoxyribonukleotide und Plasmid-DNAs durch Ionenbindung an die externe Oberfläche kationischer Liposomen binden können (C.F. Bennet et Al., Mol. Pharmacol. 41, 1023-1033, 1992; Xiang Gao et Al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280-285, 1991). Es wird jedoch kein Hinweis auf die Stabilität dieser Komplexe über die Zeit und ihre Verwendung als antientzündliche Arzneimittel gegeben. Es ist auch aus der Patentanmeldung WO 97/04787 bekannt, dass Oligonukleotide in Liposomen gefangen werden können, wenn sie eine Kettenlänge zwischen 8 und 50 Nukleotiden aufweisen. Auch in dieser Referenz gibt es keine Information im Hinblick auf die Stabilität der Komplexe über die Zeit.
Komplexe mit Liposomen und Polydeoxyribonukleotiden mit einem Molekulargewicht von 16.000 Da, erhalten durch Depolymerisation von Nukleinsäuren, wobei diese Polymere innerhalb der Lipidvesikel enthalten sind (Gursoy et alii, Pharmazie 48, (1993)H. 7, 559-560), wurden beschrieben. Dasselbe wie das oben für WO 97/04787 Gesagte kann wiederholt werden.
Es ist auch bekannt, dass Liposomenkomplexe mit Oligonukleotiden und Polydeoxyribonukleotiden die Eigenschaft zur bemerkenswerten Anhebung der pharmakologischen Aktivitäten der letzteren Substanzen haben (Bennet et al, Gursoy et al., siehe oben, A. Colige, Biochemistry 1993, 32, 7-11). Tests, die von der Anmelderin durchgeführt wurden, haben jedoch gezeigt, dass diese Komplexe aus dem Stand der Technik nicht als Therapeutika verwendbar sind, da sie sehr schnell ihre Aktivität über die Zeit verlieren, wenn sie in wässrigen Medien suspendiert werden, wie es für ihre Verabreichung not wendig ist. Daneben können die kationischen Komponenten des Liposoms in diesen Komplexen, wie z.B. Stearylamin und quaternäre Ammoniumtenside potenziell toxische Mittel sein und können zu toxischen Nebenwirkungen führen. Der Komplexabbau ist auch offensichtlich, da das physikalische Auftreten der wässrigen Phase sich über die Zeit verändert und sich von opaleszierend (anfängliche Emulsion) zu schließlich trüb mit Bildung eines Präzipitats verändert.
Die WO-A-96/18372 (GENZYME CORP) offenbart kationische Amphiphile und Plasmide für eine intrazelluläre Zufuhr therapeutischer Moleküle. Diese kationischen Ampiphile enthalten eine lipophile Gruppe, direkt oder über eine Bindungsgruppe an zwei kationische Gruppen gebunden, wobei die letztere Amino-, Alkylamin- oder Polyalkylamingruppen umfassen, so dass sich eine T-förmige Struktur ergibt. Durch Verwendung der kationischen Amphiphilen wird die Wechselwirkung des Amphiphils mit den therapeutischen Molekülen wie Nukleinsäuren oder mit Zellstrukturen wie Plasmamembranglykoproteinen verstärkt. Eine Art der Struktur, die durch diese Amphiphile gebildet werden kann, ist das Liposom, ein Vesikel, das in eine mehr oder weniger kugelförmige Doppelschicht geformt wird, die gegenüber biologischen Flüssigkeiten stabil ist und biologische Moleküle einfangen kann.
ZELPHATI et al. "Cationic liposomes as an oligonucleotide carrier: mechanism of action" J. Lipos. Res., Band 7, n. 1. Januar 1997, offenbart die Anwendung von kationischen Liposomen von Anti-Sinn-Oligonukleotiden (ODN) in vitro. In dem Absatz "Introduction" wird festgehalten, dass ODN, bevor sie ihr intrazelluläres Ziel erreichen, etliche Hindernisse überwinden müssen, einschließlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Nukleasen, ihrer schlechten zellulären Aufnahme und ihrer Fähigkeit, an ihr DNA- oder RNA-Ziel zu hybridisieren, das im Zytoplasma vorliegt und/oder im Kern von Zellen. Eine alternative Strategie, um Stabilitäts- und Permeabilitätsprobleme zu überwinden, ist die Verwendung von Liposomen als Träger für ODN. Liposomen können ODNs vor einem externen Medium schützen und können die Moleküle direkt in die Zellen führen. Unter dem Absatz "Physicochemical characteristics of ODN/cationic lipid complexes" wird festgehalten, dass der Transport von Oligonukleotiden durch kationische Lipide auf der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen negativen Ladungen der Oligonukleotide und positiven Ladungen der Lipide basiert. Daher benötigen diese kationischen Liposomen keine Verkapselungsschritte, die die Anwendung dieser Träger begrettzen.
Die WO-A-90/10448 offenbart ein Konjugat, worin ein Lipid kovalent an ein Oligonukleotid gekoppelt ist.
Die EP-A-0 558 833 offenbart Oligodeoxyribonukleotide mit antiischämischer Aktivität und einem Molekulargewicht zwischen 4.000 und 10.000.
Die Polydeoxyribonukleotide und insbesondere dasjenige, das als Defibrotid bekannt ist, sind als Medikamente mit profibrinolytischer Aktivität, (R. Pescador et al., Thromb. Res. 30: 1-11, 1983), antithrombotischerthrombolytischer (R. Niada et Al., Pharmacol. Res. Commun. 14 (10), 949-957 1982), antihypertensiver (F. Trento et Al., XXVII Congr. Naz. Soc. It. Farmacol. Turin 25.-29. September 1994, Abstract Book Seite 703), antiischämischer, cytoprotektiver (G.Rossoni et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 27, 680-685, 1986) und antientzündlicher Aktivität (R. Scalia, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 18(10) 669-676, 1996) wohlbekannt. Die täglichen Dosierungen liegen in einem Bereich von 600 bis 1.200 mg. Alle diese pharmakologischen Aktivitäten der Substanz sind im wesentlichen auf ihre Eigenschaft zurückzubeziehen, lokal therapeutisch effektive Mengen des endogenen Prostacyclins aus dem vaskulären Endothel freizusetzen (ref. R. Niada et alii, oben, C. Thiemermann et alii, Am. J. Cardiol. 56 978-982 1985).
Es wurde nun überraschend und unerwartet von der gegenwärtigen Anmelderin festgestellt, dass es möglich ist, Komplexe aus Liposomen und Polydeoxyribonukleotiden herzustellen, die eine hohe Aktivität über den Zeitverlauf aufweisen und von toxischen Nebenwirkungen frei sind.
Dies stellt die Verwendung von wässrigen Emulsionen bereit, enthaltend die Komplexe der Erfindung für darauffolgende Behandlungen, für ein oder mehr Tage und auch für lang andauernde Verabreichungen, wie z.B. Infusionen.
Daher ist es eine Aufgabe der Erfindung, die Verwendung als Medikamente bereitzustellen, insbesondere als anti-entzündliche Medikamente, von Komplexen, gebildet aus kationischen Liposomen und Polydeoxyribonukleotiden mit einem Molekulargewicht im Bereich von 7.000-60.000, vorzugsweise 10.000-60.000, besonders bevorzugt 15.000-60.000 Da, erhältlich durch Depolymerisation von Nukleinsäuren, wobei die Polydeoxyribonukleotide auf der äußeren Oberfläche des Liposoms lokalisiert sind.
Diese Liposomenkomplexe sind dadurch gekennzeichnet, dass ihre Lösungen durch Zugabe von Aliquots einer Ceytlpyridiniumchloridlösung eine Quantität eines Präzipitats mit dem quaternären Ammoniumion bilden, unterscheidbar von dem, das durch Behandlung unter denselben Bedingungen von einer Lösung der Liposomenkomplexe derselben Polydeoxyribonukleotide und kationischen Liposomen erhältlich ist, worin die Polydeoxyribonukleotide statt dessen innerhalb des Liposoms lokalisiert sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polydeoxyribonukleotid Defibrotid.
Es ist daher gemäß der vorliegenden Erfindung auch möglich, die tägliche an den Patienten zu verabreichende Dosis ohne Beeinflussung der Wirksamkeit der Therapie zu reduzieren.
Die Liposomen sind Lipidvesikel, die in wässriger Phase gebildet werden und bestehen im allgemeinen aus Phospholipiden. Diese Verbindungen bilden in Gegenwart von Wasser und einem unlöslichen organischen Lösungsmittel eine kugelförmige Hülle, deren Wand eine Doppelschicht ist, worin der polare Molekülbereich (hydrophil) auf der Außenseite des Liposoms und der Lipidteil (hydrophob) auf der Innenseite der Doppelschicht angeordnet ist. Das Vesikel wird in diesem Fall monolaminar genannt. Es gibt auch multilaminare Liposomen, die aus mehreren Lipidschichten bestehen.
Die Polydeoxyribonukleotide mit einem Molekulargewicht im Bereich von 15.000-60.000 werden in den Komplexen mit Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet und werden durch Extraktion und darauffolgende Depolymerisation hochmolekularer Nukleinsäuren erhalten.
Die Extraktion der hochmolekularen Nukleinsäüren kann wie in der USP 3,770,720 offenbart, durchgeführt werden. Es ist möglich, Polydeoxyribonukleotide mit einem Molekulargewicht im Bereich von 15.000-30.000 zu erhalten, indem die Depolymerisation der Nukleinsäuren wie in USP 4,985,552 durchgeführt wird. Die Anmelderin hat sichergestellt, dass es möglich ist, auch Polymere mit einem Molekulargewicht im Bereich von 30.000-60.000 zu erhalten, wobei dieselben Bedingungen wie bei dem Verfahren der USP 4,985,552 verwendet werden und die Depolymerisation beendet wird, wenn der Wert der reversiblen Hyperchromizität, wie definiert in Methods in Enzymol., Band III, Seiten 708-712, zwischen 20 und 40% liegt (unter Bezugnahme auf den Absorptionswert der reversiblen Hyperchromizität der nicht denaturierten Probe) oder durch Beendigung der Depolymerisation, wenn der Wert der reversiblen Hyperchromizität 3 entspricht oder darüber liegt zum Erhalt von Polydeoxyribonukleotiden mit einem Molekulargewicht von 7.000 oder darüber. Die reversible Hyperchromizität ist der Parameter, durch den der Depolymerisationsverlauf verfolgt wird.
Die bevorzugten Polydeoxyribonukleotide zur Bildung des Komplexes mit den kationischen Lisomen sind die als Defibrotide (D.C.I.) bekannten, mit einem Molekulargewicht im Bereich von 15.000-30.000 (Informations Pharmaceutiques O.M.S. n. 4, Band 1/1987, Seite 272).
Die Hauptlipidkomponenten der Liposome der Erfindung sind Phosphatidylcolin oder Phosphatidylethanolamin, die in dem Liposom mit anderen Lipiden kombiniert werden können, wie offenbart in R.R.C. New volume "Liposomes, a practical approach" IRL Press 1994. Die bevorzugten assoziierten Lipide sind Ergosterol und Cholesterin.
Ein oder mehr Antioxidantien, gewählt aus den bekannten und in derselben Referenz wie vorher erwähnt aufgeführt, können der Zusammensetzung zugefügt werden. Das bevorzugte Antioxidanz ist α-Tocopherol.
Zu den erfindungsgemäßen Liposomen werden kationische Tenside zugefügt, enthaltend ein oder mehr mono-, di-substituierte Amingruppen oder quaternäre Ammoniumgruppen. Diese quaternären Ammoniumgruppen enthalten ein oder mehr aliphatische Ketten mit einer Zahl von Kohlenstoffatomen zwischen 8 und 22.
Die quaternären Ammoniumtenside mit aliphatischen Ketten mit 18 Kohlenstoffatomen werden bevorzugt.
Das molare Verhältnis zwischen Gesamtmenge der Liposomlipide (des Lipids) und kationischem Tensid liegt zwischen 10:0,05 und 10:3, vorzugsweise bei 10:1. Wenn es zusammen mit dem Phosphatidylcolin (oder Phosphatidylethanolamin) ein zweites und anderes Lipid gibt, liegt das interne molare Verhältnis zwischen jedem der beiden Lipide und dem Tensid (Phosphatidylcolin (oder Phosphatidylethanolamin): zweites Lipid: Tensid) im Bereich von 9:1:0.05 bis 7:3:3, vorzugsweise bei 8:2:1.
Das Gewichtsverhältnis zwischen Liposommenge und aktivem Wirkstoff (Polydeoxyribonukleotiden) liegt bei 10:2 bis 10:0,1, vorzugsweise bei 10:1.
Die Herstellung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten kationischen Liposomenkomplexe kann wie beschrieben von D.C. Litzinger, Biochim. Biophys. Acta 1281 139-149, 1996 oder in der oben erwähnten R.R.C. New's Band beschrieben, durchgeführt werden. Insbesondere umfasst ein Verfahren, das zur Herstellung des Komplexes der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, die folgenden Schritte:

a. Liposomenpräparation durch das Lösungsmittel-Umkehrphasenevaporationsverfahren, ref. Szoka P. et alii. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 4194 1978): 4 Teile der organischen Phase, die polar sein kann (Beispiel:. lineare oder verzweigte C₁-C₄-niederaliphatische Alkohole) oder auch apolar (Beispiel: lineare oder verzweigte C₁-C₄-Dialkylether, z.B. Diethylether, teilweise chlorierte C₁-C₂-Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise Chloroform), worin die Lipide, wie auch das kationische Tensid und das Antioxidans löslich gemacht sind, mit einem Teil Wasser; das so erhaltene zweiphasige System wird einer Ultraschallbehandlung bei 0°C für 5-20 Minuten unterzogen, woraufhin die organische Phase bei Raumtemperatur bei reduziertem Druck evaporiert wird, wodurch eine Emulsion erhalten wird,
b. Durchfließen der Emulsion gemäß der auf Seiten 52-54 des R.R.C. New volume beschriebenen Verfahrens durch eine Polycarbonatmembran mit einem Porendurchmesser im Bereich von 100 bis 600 nm, vorzugsweise 400 nm; dieser Schritt wird mindestens dreimal wiederholt, um einen durchschnittlichen Vesikeldurchmesser zu erhalten, der mit denjenigen der Membranporen vergleichbar ist,
c. Lyophilisieren der wässrigen Emulsion nach Zugabe einer wässrigen Lösung eines lyophilisierenden Coadjuvans, z.B. Monosacchariden wie Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Fructose oder Polysacchariden wie Dextranen, Maltodextrinen mit unterschiedlichem Molekulargewicht, so dass das Coadjuvans in einem Überschuss von mindestens 7mal im Hinblick auf die Lipide vorliegt. Vorzugsweise liegt der Überschuss zwischen 10- und 15mal.
d. Herstellung der Endemulsion für die pharmazeutische Verwendung durch Zugabe in steriler Umgebung und unter Rühren einer verdünnten sterilen isotonischen wässrigen Lösung der Polydeoxyribonukleotide zu dem Gefäß, das die lyophilisierte Emulsion enthält. Eine Emulsion wird gebildet, die einen Liposomenkomplex enthält, worin die Polydeoxyribonukleotide mit einer Ionenbindung an die Außenwand des Liposoms gebunden sind. Alternativ wird eine sterile isotonische Lösung dem Gefäß zugefügt, das die lyophilisierten Liposomen enthält und die so erhaltene Emulsion wird in steriler Umgebung mit der Lösung, enthaltend den Wirkstoff, vermischt.

Die Stabilität der erfindungsgemäßen Liposomen wurde durch einen Assay der pharmakologischen Aktivität direkt nach der Herstellung der Emulsion und dann am 30. Tag unter sterilen Bedingungen bei 25°C im Dunkeln überprüft.
Die Emulsion, die den gefangenen Polydeoxyribonukleotid-Liposomenkomplex enthält (Gursoy et al, siehe oben) wurde demselben Test unterzogen und wurde als Vergleichsformulierung verwendet.
Die Anmelderin hat auch festgestellt, dass die vorliegenden erfinderischen Komplexe als antihypertensive und antithrombotische Mittel mit hoher Aktivität über die Zeit verwendbar sind, und zwar ohne toxische Nebenwirkungen.
Die pharmakologische Aktivität wurde in den folgenden Versuchsmodellen bestimmt.

– Antientzündliche Aktivität (Miyasaka et al., Eur. J. Pharmacol. 77 229-236 1982).
– Arterieller Hochdruck (F. Trento et al., siehe oben).
– Antithrombotische Aktivität (R. Niada et alii, Thromb. Res. 23 233-246, 1981).

In dem Experiment, betreffend die antientzündliche Aktivität, wurde die Myeloperoxidasemenge, die in den erhaltenen Polymorphonukleären des tierischen Pleuralexsudats vorlagen, überprüft. Die Enzymmenge ist direkt proportional zu der erzeugten Entzündung. Die Ergebnisse werden als % Variation der Myeloperoxidase (MPO) -Menge im Hinblick auf diejenige der Kontrollen ausgedrückt, bestimmt durch die Formel:
Im arteriellen Hochdruckmodell war der zur Bestimmung der Aktivität verwendete Parameter der Blutdruck, der bis zu 30 Minuten nach Behandlung mit L-NAME, dem Inhibitor der Freisetzung von endogenem Stickstoffoxid überwacht wurde. In dem antithrombotischen Aktivitätsmodell wurde die Carotidtemperatur bis zu 60 Minuten nach Induktion der lokalen Endothelläsion überwacht. Die Ergebnisse werden als % Variation des Bereichs unter der Kurve (ΔAUC %) ausgedrückt, erhalten mit der überprüften Probe im Hinblick auf denjenigen der Kontrollen, durch das folgende Verhältnis:
Die erhaltenen Ergebnisse, die jeweils in den Tabellen I, II und III dargestellt werden zeigen, dass der Komplex zwischen Liposomen und Polydeoxyribonukleotiden gemäß der vorliegenden Erfindung über die Zeit stabil ist, anders als die Vergleichsformulierung.
Es ist daher gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, an einen Patienten eine niedrigere Menge des Wirkstoffs zu verabreichen, wobei der therapeutische Effekt unverändert bleibt.
Es ist auch möglich, dieselbe Komplexemulsion zu verwenden, in geeigneter Weise formuliert, und mit einer geeigneten Wirkstoffkonzentration, je nach Bedarf bei den oben erwähnten pathologischen Zuständen für einen gesamten Therapiezyklus.
Es ist auch bekannt, dass Polydeoxyribonukleotide, die als Defibrotid bekannt sind, eine antithrombotische Aktivität (R. Niada, Pharmacol. res. Comm., siehe oben), eine Antiischämie, cytoprotektive Aktivität (C. Thiermemann, siehe oben), eine antientzündliche Aktivität (G. Rossoni, J. Cardiovasc. Pharmacol., siehe oben) und eine Aktivität bei der Artheriosklerose (P. Lobel et al. Atherosclerosis 80, 69-79 1989) aufweisen. Diese Aktivitäten sind auf die lokale Freisetzung des Endothel-Prostacyclins in den Blutfluss in therapeutisch effektiven Mengen zurückzubeziehen.
Es wurde von der Anmelderin festgestellt, dass die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Liposomen-Polydeoxyribonukleotid-Komplexe für eine Therapie von pathologischen Zuständen verwendbar sind, deren Behandlung eine verzögerte Freisetzung von endothelialem Prostacyclin notwendig macht.
Die pharmazeutischen Formulierungen, die die kationischen Liposomen-Polydeoxyribonukleotide enthalten, beinhalten die üblichen Träger und Exzipienzien. Diese Formulierungen können in Form steriler und apyrogener Emulsionen oder von Lyophilisaten, gelagert in sterilen Behältern, um extemporanär in sterilen wässrigen Lösungsmitteln gelöst zu werden, vorliegen. Im letzteren Fall wird es bevorzugt, dass das Liposomen-Lyophilisat getrennt gelagert wird und dass die Polydeoxyribonukleotide bereits in dem wässrigen sterilen Lösungsmittel, das den Liposomen zugefügt werden soll, gelöst sind.
Als wässrige sterile Lösungsmittel können sterile isotonische Lösungen, enthaltend konventionelle Puffer (Citrate, Phosphate) zusammen mit bekannten Konservierungsmitteln verwendet werden.
Die Verabreichungswege für die Emulsion, enthaltend den Komplex der Erfindung, sind parenteral, d.h. durch intravenöse, intramuskuläre, subkutane Injektion und durch Infusion.
Die Wirkstoffmenge, enthalten in der Präparation, liegt in einem Bereich von 1 bis 20 mg/ml des Polydeoxyribonukleotids.
Die mit den Liposomenkomplexen verabreichten täglichen Dosierungen des Polydeoxyribonukleotids liegen bei 10 bis 200 mg, vorzugsweise 20 bis 120 mg.
Die folgenden Beispiele sollen den Inhalt der vorliegenden Erfindung deutlich machen und sollen nicht als Begrenzung des Umfangs derselben angesehen werden.
Beispiel 1
Herstellung der Polydeoxyriboaukleotid-Liposomen
Die Herstellung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Liposomen wird gemäß dem Lösungsmittel-Umkehrphasen-Evaporationsverfahren durchgeführt.
100 mg Sojaphosphatidylcolin (Phospholipon^® 90-Natterman Phospholipid GmbH), Dioctadecyldimethylammoniumbromid (Abkürzung, DIDAB -Fluka Chemie AG) und 0,1% G/G α-Tocopherol (Fluka Chemie AG) werden in Diethylether gelöst. Phosphatidylcolin und kationisches Tensid werden in einem 10:1 molaren Verhältnis vermischt.
Der organischen Phase wird zweifach destilliertes Wasser in einem Verhältnis von 4 Teilen organische Phase/1 Teil Wasser zugefügt, wodurch eine W/O-Emulsion erhalten wird.
Eine Ultraschallbehandlung wird bei 0°C für 10 Minuten an der Emulsion durch Verwendung einer Branson 2200 Sonicator-Charge durchgeführt. Dann wird der Ether durch Evaporation bei reduziertem Druck entfernt, bis ein wässriges Liposomensystem erhalten wird, das man dann durch Polycarbonatmembranen (Nucleopor) mit einem Porendurchmesser von 0,4 μm fließen läßt. Dieser Schritt durch die Membran wird drei weitere Male wiederholt.
Eine Mannitolmenge, die dem 10fachen Lipidgewicht entspricht wird zugefügt und die Suspension wird lyophilisiert.
50 mg eines Polydeoxyribonukleotids mit einem Molekulargewicht von 28.000, erhalten durch Depolymerisation gemäß USP 4,985,552, werden in 5 ml isotonischer physiologischer Lösung gelöst. Das oben erhaltene Lyophilisat wird in 5 ml zweifach destilliertem Wasser gelöst. Die zwei wässrigen Phasen werden vermischt und gerührt. In der so erhaltenen Emulsion liegt die Konzentration von Phosphatidylcolin bei 10 mg/ml und diejenige von Polydeoxyribonukleotid bei 5 mg/ml.
Beispiel 2 (vergleichsweise)
Herstellung von Polydeoxyribonukleotid-Liposomen gemäß dem Stand der Technik (Gursoy et alii, Pharmazie 48 (19-93) H 7 559-560) mit einem Polydeoxyribonukleotid, das im Liposom gefangen ist.
Dieselbe organische Phase wie in Beispiel 1, mit denselben Komponenten wie oben erwähnt, wird separat in einem Gefäß getrocknet. Eine wässrige Lösung eines Polydeoxyribonukleotids mit einem Molekulargewicht von 16.000, hergestellt wie die Polydeoxyribonukleotidlösung des vorherigen Beispiels, wird zugefügt. Die Liposomenvesikel, die den Wirkstoff umhüllen, werden durch Ultraschallbehandlung erhalten. Die Phosphatidylcholin- und Polydeoxyribonukleotid-Konzentrationen sind dieselben wie diejenigen in dem Komplex des Beispiels 1.
Beispiel 3
Demonstration der Bildung des Polydeoxyribonukleotid-Liposomenkomplexes gemäß Beispiel 1 durch ein Elektrophoreseverfahren.
Die Elektrophorese wird in einem 3%igen Agarosegel, enthaltend 0,5 μg/ml Ethidiumbromid als Fluoreszenzmittel durchgeführt. Das Elektrophoresesystem wird durch eine kleine elektrophoretische Kammer gebildet, enthaltend eine Schicht eines Gels mit einer Dicke zwischen 1 und 3 mm, woran ein 50 mV elektrisches Feld angelegt wird.
In das Gel werden jeweils in 6 getrennten Zonen nahe dem negativen Pol 20 μl der Lösung des Beispiels 1 (Polydeoxyribonukleotid-Konzentration von 5 mg/ml) und von Lösungen, enthaltend das Polydeoxyribonukleotid allein mit Konzentrationen von 4, 3, 2, 1, 0,5 mg/ml ausgesät.
Das elektrische Feld wird für 40 Minuten angelegt. Das Polydeoxyribonukleotid bewegt sich von der Aussaatzone zum positiven Pol hin. Nach Ende des elektrophoretischen Laufes wird das Agarosegel mit Ethidiumbromid gefärbt. Der Liposomenkomplex zeigt keinerlei Färbung. In dem Gel werden die Banden gezeigt, korrespondierend zu dem Aussäen der Polydeoxyribonukleotidlösungen, mit einer Intensität, die proportional zur ausgesäten Menge ist.
Beispiel 4
Vergleich der Stabilität des Liposomen-Polydeoxyribonukleotidkomplexes, erhalten gemäß Beispiel 1 mit derjenigen des Komplexes, worin das Polydeoxyribonukleotid innerhalb des Liposoms enthalten ist (Vergleichsbeispiel 2), durch Bewertung der Polydeoxyribonukleotid-antientzündlichen Aktivität bei Ratten, die mit Proben von Lösungen der Komplexe behandelt wurden, die frisch hergestellt wurden und mit Proben von Lösungen, die 30 Tage bei 25°C in geschlossenen Gefäßen im Dunkeln konditioniert wurden.
Männliche Sprague Dawley Ratten mit einem Gewicht von 250-270 g wurden verwendet.
3 Gruppen, wobei jede Gruppe 18 Tiere enthielt, wurden gebildet und jeder der Gruppen wurde jeweils intravenös eine der folgenden Lösungen mit den angegebenen Dosierungen verabreicht:

1. Kontrollgruppe: physiologische Lösung mit 2 ml/kg.
2. Gruppe, behandelt mit dem Liposom-Polydeoxyribonukleotid-Komplex (Referenzbeispiel 1): physiologische Lösung, enthaltend den Komplex in Mengen entsprechend einer Polydeoxyribonukleotid-Konzentration von 1 mg/ml mit 2 mg/kg.
3. Gruppe, behandelt mit dem Liposom-Polydeoxyribonukleotid-Komplex gemäß A. Gursoy et alii (siehe oben): physiologische Lösung, enthaltend den Komplex in Mengen entsprechend einer Polydeoxyribonukleotid-Konzentration von 1 mg/ml mit einer Dosis von 2 mg/kg.

30 Minuten nach der Behandlung wurde unter einer milden Etheranästhesie eine Pleuritis bei den Tieren durch Verabreichung auf intrapleuralem Weg von 0,5 ml einer 1%igen G/V Carragen-physiologischen Lösung und 5 ml Wasser per os ausgelöst.
Nach 6 Stunden wurden die Tiere geopfert. Durch eine Spritze wurde das Pleuralexsudat gewonnen und der Gehalt an polymorphonukleären neutrophilen Leukozyten (PMN) wurde durch Überprüfung des Myeloperoxidaseenzyms (MPO) bestimmt, das das charakteristische Enzym dieser Zellen ist.
Der Assay wurde wie von Schierwagen C. et al., J. Pharmacol. Methods 23, 179, 1990 beschrieben, durchgeführt.
Die Exsudatproben wurden gerührt und dann wurden 0,2 ml zu 4,8 ml einer 0,5% G/V HTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) gepufferten Lösung zugefügt. Die Proben wurden dann bei –80°C eingefroren, um einen Zellaufbruch auszulösen, aufgetaut und dann für 1 Minute einer 80 Watt-Beschallung unterzogen. Die Präparationen wurden dann auf 60°C für zwei Stunden erwärmt, um die Myeloperoxidaseinhibitoren abzubauen und darauffolgend bei 11.800 g 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Bevor man zum enzymspektrofotometrischen Assay (Wellenlänge 650 nm) fortschritt, wurden die Proben mit der HTAB-Lösung verdünnt, um die Ablesewerte in den Bereich der Standardkurve, erhalten durch Verwendung des reinen MPO-Enzyms, einzustellen.
Die Ergebnisse sind als Prozent Variation im Hinblick auf die MPO-Menge ausgedrückt, die in den Kontrollen angetroffen wird und sind in der folgenden Tabelle I dargestellt.
Die Tabelle zeigt, dass die antientzündliche Aktivität der zwei Präparationen zum Zeitpunkt null im wesentlichen dieselbe ist und dass nach 30 Tagen die Aktivität der Präparation gemäß der Erfindung sich nicht signifikant vom Anfangswert unterscheidet, während die Präparation, enthaltend die Liposomen gemäß dem Vergleichsbeispiel, eine 70%ige Aktivitätsabnahme im Hinblick auf den Anfangswert zeigt. Gleichzeitig wurde bemerkt, dass die letztere Präparation abgebaut wurde, da die wässrige Phase trüb erschien und ein Präzipitat vorlag, das nicht resuspendiert werden konnte.
Die mit dieser Präparation behandelten Tiere zeigten deutliche Zeichen von Schmerz und einer ausgeprägten Dyspnoe.
Beispiel 5
Vergleich der Stabilität des Liposomen-Polydeoxyribonukleotid-Komplexes, wie erhalten gemäß Beispiel 1 mit derjenigen des Komplexes, worin das Polydeoxyribonukleotid innerhalb des Liposoms enthalten ist (Vergleichsbeispiel 2), durch Bewertung der Polydeoxyribonukleotid-anti-Hochdruckaktivität bei Ratten, wobei der Hochdruck durch Inhibition der endogenen Stickstoffoxidfreisetzung (NO) induziert wird, verabreicht mit Proben der Lösungen, enthaltend die obigen Komplexe, frisch hergestellt und mit Proben derselben Lösungen, konditioniert bei 25°C für 30 Tage in geschlossenen Gefäßen im Dunkeln.
Männliche Sprague Dawley Ratten, die 250 ± 20 g wogen, und nicht gefastet hatten, wurden mit Ethylurethan anästhesiert. Es wurden zwei Katheter jeweils in die linke Karotidarterie inseriert, um den mittleren arteriellen Blutdruck (MABP) festzuhalten, wie auch in die rechte Jugularvene zur Verabreichung der getesteten Zusammensetzungen. Die Trachea wurde mit einer Kanüle versehen und die Körpertemperatur des Tiers wurde bei 37°C gehalten. Der MABP wurde kontinuierlich während des Experiments überwacht. Heparin (500 U.I./kg i.v.) wurde verabreicht, um eine Blutkoagulation in dem Aufzeichnungssystem zu vermeiden.
Nach 30 Minuten wurden die Ratten zufällig in homogene Gruppen unterteilt.
Die Behandlung mit den Zusammensetzungen oder Plazebo wurde durch Bolus, direkt gefolgt von Perfusion, durchgeführt. Eine Stunde nach Beginn der Perfusion erhielten alle Tiere einen intravenösen Bolus von L-NAME (10 mg/kg). Die Perfusion dauerte 30 Minuten nach Injektion von L-NAME. Die durch die Zusammensetzungen induzierten Druckmodifikationen werden als Bereich unter der Kurve (AUC) in dem 30 Minuten-Intervall, folgend auf die L-NAME-Behandlung ausgedrückt.
In dem experimentellen Modell unter Betrachtung wurden die Tiere in vier Gruppen (6 Tiere pro Gruppe) unterteilt, die jeweils intravenös mit einem Bolus von 1 ml/kg, direkt gefolgt von einer Perfusion von 2 ml/kg/h, wie hiernach erklärt, intravenös behandelt wurden:

1. Kontrollgruppe (CTR): physiologische Lösung 1 ml/kg Blus + 2 ml/kg/Stunde Perfusion.
2. Eine Gruppe, behandelt mit einem Bolus eines Polydeoxyribonukleotids, Molekulargewicht 28.000, in physiologischer Lösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml mit einer Dosis von 10 mg/kg (Bolus) + 20 mg/kg/h in Perfusion.
3. Eine Gruppe, behandelt mit einem Bolus des Liposomen-Polydeoxyribonukleotid-Komplexes der Erfindung in physiologischer Lösung bei einer Polydeoxyribonukleotid-Konzentration von 5 mg/ml, mit einer Dosis von 5 mg/kg (Bolus) + 10 mg/kg/h in Perfusion.
4. Eine Gruppe, behandelt mit einem Bolus des Liposomen-Polydeoxyribonukleotid-Komplexes gemäß dem Vergleichsbeispiel 2 in einer physiologischen Lösung in einer Polydeoxyribonukleotid-Konzentration von 5 mg/ml mit einer Dosis von 5 mg/kg (Bolus) + 10 mg/kg/h in Perfusion.

Die unter Verwendung der Proben der frisch hergestellten Lösungen, enthaltend die Liposomenkomplexe wie oben genannt, und der Proben derselben Lösungen, gelagert in geschlossenen Gefäßen bei 25°C im Dunkeln bestimmten pharmakologischen Aktivitäten, sind in Tabelle II aufgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, dass während zum Zeitpunkt null die beiden Präparationen fast dieselbe antihypertensive Aktivität aufweisen, die Aktivität der Präparation gemäß dem Stand der Technik nach 30 Tagen um ungefähr 70% gegenüber dem korrespondierenden Startwert erniedrigt ist.
Die mit der Präparation behandelten Tiere zeigten deutlich Zeichen von Schmerz mit deutlicher Dyspnoe.
Beispiel 6
Vergleich der Stabilität des Liposomen-Polydeoxyribonukleotidkomplexes, erhalten gemäß Beispiel 1 mit derjenigen des Komplexes, worin das Polydeoxyribonukleotid innerhalb des Liposoms enthalten ist (Vergleichsbeispiel 2) durch Bewertung der Polydeoxyribonukleotid-antithrombotischen Aktivität bei Ratten, die mit Proben von Lösungen behandelt wurden, enthaltend die obigen Komplexe, frisch hergestellt und mit Proben derselben Lösungen, konditioniert bei 25°C für 30 Tage in geschlossenen Gefäßen im Dunkeln.
Männliche Sprague-Dawley-Ratten, die 200-230 g wogen, und die 16 Stunden gefastet hatten, wrden mit Urethan (1,25 g/kg i.p.) anästhesiert.
Daraufhin wurden die rechte Karotidarterie und die linke Jugularvene der Tiere isoliert. Eine bipolare Elektrode (Lesion Producing Device 3500 Ugo Basile – Comerio, Varese) wurde in der rechten Arterie positioniert und in einem Abstand von 0,5 cm wurde eine thermosensitive Probe mit einem Po lygraphen verbunden. Ein Katheter wurde in die Vene zur Verabreichung der Präparationen inseriert.
Nach 15 Minuten Stabilisierung wurde die Karotidtemperatur kontinuierlich für 5 Minuten vor und 60 Minuten nach der Endothelläsions-Induktion durch die Elektrode überwacht. Dies ermöglichte die indirekte Bestimmung der Bildung von endoluminalen Thromben durch Korrelation zwischen der abnehmenden Temperatur des Gefäßes und der Blutflussreduktion. Die Endothelläsion wurde durch eine Reihe von fünf elektrischen Stimuli ausgelöst. Die Stimuli in Intervallen von einer Minute voneinander waren derartig, dass die an der läsionierten Arterie gemessene Impedanz 10 mA betrug. Die Impedanz wurde mit einer Testvorrichtung gemessen und wurde für jedes Tier während der ersten 30 Sekunden der Stimulierung reguliert und benötigte eine angelegte Spannung von ungefähr 30 Volt.
Die Karotidtemperatur wurde direkt vor der elektrischen Stimulierung (Basalwert) bestimmt und in konstanten Intervallen einer Zeit (5, 10, 15, 30, 45 und 60 Minuten) nach der Stimulierung.
Die Gruppen wurden jeweils durch 10 bis 12 Ratten gebildet.
Alle Behandlungen wurden als intravenöse Bolusbehandlungen durchgeführt, die 5 Minuten vor Beginn der elektrischen Stimulierung verabreicht wurden.
Die Gruppen waren die folgenden:

1. Kontrollgruppe SHAM, worin die Tiere, wie oben beschrieben, operiert und überwacht wurden, jedoch keiner elektrischen Stimulierung unterzogen wurden.
2. Kontrollgruppe, behandelt mit physiologischer Lösung (1,5 ml/kg i.v.).
3. Gruppe, behandelt mit dem Liposomen-Polydeoxyribonukleotid-Komplex (Referenzbeispiel 1): physiologische Lösung, enthaltend den Komplex in einer Menge entsprechend einer Polydeoxyribonukleotid-Konzentration von 5 mg/ml; verabreichte Dosis: 7,5 mg/kg.
4. Gruppe, behandelt mit dem Liposomen-Polydeoxyribonukleotid-Komplex gemäß A. Gursoy et alii (siehe oben): physiologische Lösung, enthaltend den Komplex in Mengen entsprechend einer Polydeoxyribonukleotid-Konzentration von 5 mg/ml; verabreichte Dosis: 7,5 mg/kg.

Die Aktivität wurde zum Zeitpunkt der Herstellung der Lösungen mit den zwei Komplexen bestimmt und nach 30 Tagen einer Konditionierung der Lösungen bei 25°C im Dunkeln.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt.
Aus der Tabelle kann abgelesen werden, dass während die antithrombotische Aktivität der zwei Präparationen zum Zeitpunkt null im wesentlichen vergleichbar ist, die Aktivität der Präparation gemäß dem Stand der Technik nach 30 Tagen auf ungefähr 70% im Vergleich mit dem korrespondierenden Ausgangswert erniedrigt ist.
Beispiel 7
Pharmazeutische Formulierung, enthaltend die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Liposomen für eine Einzeldosisverabreichung. 3 ml steriles Gefäß, enthaltend die lyophilisierten Liposomen:

– Phospholipon 90 100 mg

– DIDAB 10 mg

– α-Tocopherol 0,1 mg

– Saccharose 1 g.
Vor der Verwendung soll 1 ml Wasser für die Injektion zugefügt werden. Füge dann auf sterile Weise die folgende sterile Lösung zu, die vorher in einer sterilen 1 ml-Wegwerfspritze hergestellt wurde:

– Polydeoxyribonukleotid (Referenzbeispiel 1) 10 mg

– Dihydrat-Trinatriumcitrat 2,5 mg

– Wasser für Injektionen und

– Konservierungsmittel, genug für 1 ml.
Beispiel 8
Ex tempore pharmazeutische Formulierung zur Verwendung für einen gesamten therapeutischen Zyklus.

– 30 ml sterile Flasche, enthaltend die lyophilisierten Liposomen:

– Phospholipon 90 1 g

– DIDAB 100 mg

– α-Tocopherol 1 mg

– Saccharose 10 g.
Vor der Verwendung füge 10 ml Wasser für die Injektion auf sterile Weise der Flasche zu. Füge zu der so hergestellten Emulsion die folgende sterile Lösung zu, enthalten in einer 15 ml-Flasche oder in einer 10 ml vorher hergestellten Wegwerfspritze:

– Polydeoxyribonukleotid (Referenzbeispiel 1) 100 mg

– Dihydrat-Trinatriumcitrat 25 mg

– Wasser für Injektionen und

Konservierungsmittel, genug für 10 ml.
Die Präparation stellt eine Zahl von 20 mg/Tag Dosierungen für eine 5tägige Therapie bereit.
Tabelle I
Stabilität nach 30 Tagen des Komplexes gemäß Beispiel 1 (Gruppe 2 in der Tabelle) im Vergleich mit der des Liposomen-Polydeoxyribonukleotid-Komplexes gemäß Gursoy et al. (Gruppe 3 in der Tabelle), bewertet durch die Polydeoxyribonukleotid-antientzündliche Aktivität (Reduktion der Myeloperoxydaseaktivität im Pleuralexsudat von Ratten mit einer durch Karragen induzierten Pleuritis).
Tabelle II
Die Stabilität nach 30 Tagen des Komplexes gemäß Beispiel 1 (Gruppe 3 in der Tabelle) im Vergleich mit derjenigen des Liposomen-Polydeoxyribonukleotid-Komplexes gemäß Gursoy et al. (Gruppe 4 in der Tabelle), bewertet durch die Polydeoxyribonukleotid-anti-Hochdruckaktivität.

* Die verabreichte Dosis des Polydeoxyribonukleotids (10 mg/kg Bolus + 20 mg/kg/h) ist zu niedrig, um zu einer bedeutsamen Antihochdruckaktivität im Hinblick auf die Kontrollen zu führen.

Tabelle III
Stabilität nach 30 Tagen des Komplexes gemäß Beispiel 1 (Gruppe 3) im Vergleich mit derjenigen des Liposomen-Polydeoxyribonukleotid-Komplexes gemäß Gursoy et al. (Gruppe 4), bewertet durch die antithrombotische Aktivität der Polydeoxyribonukleotide.

Claims

Komplexe, gebildet durch kationische Liposomen und durch Polydeoxyribonukleotide mit einem Molekulargewicht im Bereich von 7000 bis 60000 Da, vorzugsweise 10000 bis 60000 Da, erhältlich durch Depolymerisation von Nukleinsäuren, wobei die Polydeoxyribonukleotide auf der äußeren Oberfläche des Liposoms lokalisiert sind, zur Verwendung als Medikament.
Komplexe gemäß Anspruch 1, wobei das Polydeoxyribonukleotid Defibrotid ist.
Komplexe gemäß Anspruch 2, wobei das Polydeoxyribonukleotid ein Molekulargewicht im Bereich von 15000 bis 30000 aufweist.
Komplexe gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei ein oder mehr Antioxidantien, vorzugsweise Alpha-Tocopherol, zugefügt werden.
Komplexe gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, wobei kationische Tenside, enthaltend ein oder mehr mono-, di-substituierte Amingruppen oder quaternäre Ammoniumgruppen, vorliegen, wobei die quaternären Ammoniumgruppen eine oder mehr aliphatische Ketten mit einer Kohlenstoffanzahl im Bereich von 8 bis 22 enthalten, vorzugsweise wobei diese kationischen Tenside quaternäre Ammoniumtenside sind mit aliphatischen Ketten mit 18 Kohlenstoffatomen.
Komplexe gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, wobei das molare Verhältnis zwischen der gesamten Menge des Liposomenlipids/de und dem kationischen Tensid im Bereich von 10:0,05 bis 10:3, vorzugsweise bei 10:1 liegt.
Komplexe gemäß Anspruch 6, worin zusammen mit dem Phosphatidylcholin (oder Phosphatidylethanolamin) ein zweites und unterschiedliches Lipid vorliegt und das molare Verhältnis von Phosphatidylcholin (oder Phosphatidylethanolamin) zu zweitem Lipid zu Tensid im Bereich von 9:1:0,05 bis 7:3:3, vorzugsweise bei 8:2:1 liegt.
Komplexe gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, wobei das Gewichtsverhältnis zwischen der Liposomenmenge und dem Wirkstoff bei 10:2 bis 10:0,1, vorzugsweise 10:1 liegt.
Komplexe gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte: a. Liposomenpräparation durch Vermischen von vier Teilen einer polaren oder apolaren organischen Phase, worin die Lipide, das kationische Tensid und das Antioxidans löslich gemacht sind mit einem Teil Wasser, woraufhin das erhaltene biphasische System einer Beschallung bei 0°C für 5 bis 20 min unterzogen wird und die organische Phase bei Raumtemperatur bei reduziertem Druck evaporiert wird, wobei eine Emulsion gebildet wird; b. Durchfließen der Emulsionen durch eine Polycarbonatmembran mit einem Porendurchmesser im Bereich von 100 bis 600 nm, vorzugsweise 400 nm, wobei dieser Schritt mindestens drei Mal wiederholt wird, c. Lyophilisieren der Emulsion nach Zugabe einer wässrigen Lösung eines lyophilisierenden Coadjuvans, so dass die Menge des Coadjuvans in einem Überschuss von mindestens dem siebenfachen im Hinblick auf die Lipide vorliegt, wobei der Überschuss vorzugsweise das 10- bis 15-fache beträgt, d. Herstellung der Emulsion zur pharmazeutischen Verwendung durch Zugabe einer verdünnten sterilen isotonischen wässrigen Lösung der Poldeoxyribonukleotide unter steriler Umgebung unter Rühren zu dem Gefäß, enthaltend das Lyophilisat, oder alternativ durch Zugabe einer sterilen isotonischen Lösung zu dem Gefäß, enthaltend das lyophilisierte Liposom und Vermischen der so erhaltenden Emulsion in steriler Umgebung mit der Lösung, enthaltend den Wirkstoff.
Komplexe gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, enthalten in pharmazeutischen Formulierungen für eine parenterale Verabreichung.
Verwendung der Komplexe gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 für die Herstellung eines Medikaments mit einer antientzündlichen Aktivität.
Verwendung der Komplexe gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 für die Herstellung eines Medikaments mit einer Antithromboseaktivität.
Verwendung der Komplexe gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 für die Herstellung eines Medikaments mit einer einem Bluthochdruck entgegen wirkenden Aktivität.
Verwendung der Komplexe gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 für die Herstellung eines Medikaments für die lokale Freisetzung von endothelialem Prostacyclin in den Blutfluss.