DE69104362T2 - Autobiotika sowie deren verwendung bei der in vivo eliminierung körperfremder zellen. - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung
• Alle Vertebrate haben ein Immunsystem. Ein Vertebrat mit einem schwer geschädigten Immunsystem wird früh sterben, es sei denn daß besondere Maßnahmen getroffen werden zur Isolierung des Vertebrats von einer Vielzahl von infektiösen Agenzien (z.P. Bakterien, Viren, Pilzen und Parasiten). Ein funktionsgerecht arbeitendes Immunsystem ist in der Lage, zwischen körpereigenen und körperfremden Zellen zu unterscheiden, und es zerstört daher selektiv und eleminiert körperfremde Zellen wie eindringende Organismen, während es körpereigene Zellen intakt läßt.
• Einige körperfremde Zellen dringen jedoch in das Immunsystem des Wirtsorganismus ein durch Tarnung ihrer äußeren Oberfläche mit Protein des Wirtsorganismus. Diese getarnten körperfremden Zellen verbleiben im Wirtsorganismus und gedeihen unentdeckt. Unentdeckte körperfremde Zellen sind der Grund für viele Krankheiten, welche Mensch und Tier heimsuchen. So sind z.B. Zellen, welche mit viralen Krankheiten infiziert sind (z.B. AIDS, Grippe, Masern, Mumps, Windpocken, Zoster, Hepatitis, Diabetes), bakterielle Krankheiten (z.B. Lungenentzündung, Bronchitis, Meningitis, Kardititis, Periodontitis, Rindermastitis) und Pilzkrankheiten (z.B. Histoplasmose, Blastomykosis, Candidiasis), alle sind durch Infektion und Proliferation von körperfremden Zellen in einem Wirtvertebrat verursacht.
• Weiterhin wird Krebs dadurch verursacht, daß körpereigene Zellen eines Vertebrats körperfremde Zellen werden. Gesunde Individuen weisen zu jedem gegebenen Augenblick etwa 50.000 bis 100.000 körperfremde und potentiell bösartige Zellen in ihrem Körper auf. Diese körperfremden Zellen werden im allgemeinen erkannt und durch das Immunsystem des Individuums abgetötet. Wenn jedoch einige der körperfremden Zellen getarnt werden, wuchern sie als Krebs.
• Gegenwärtig gibt es keine adäquaten und spezifischen Therapien für die meisten Krankheiten, welche bedingt sind durch die Anwesenheit von körperfremden Zellen in einem Wirtsorganismus. Krebs z.B. wird derzeit behandelt entweder durch chirurgische Exzision von Tumoren oder durch Therapien unter Anwendung von Bestrahlung oder hochtoxischen Chemikalien. Chirugische Exzision ist jedoch dann nicht eine effektive Behandlungsmethode, wenn der Krebs bereits Metastasen gebildet hat. Weiterhin sind Bestrahlung und Chemotherapie nichtspezifische Behandlungsmethoden. Aus diesem Grunde werden oft neben Krebszellen auch normale Zellen abgetötet.
• Eine weiteres Problem liegt darin, daß die Zellabtötung durch chemotherapeutische Agenzien einer Kinetik erster Ordnung folgt. Aus diesem Grund wird eher ein konstanter Prozentgehalt als eine konstante Anzahl von Zellen durch eine bestimmte Behandlung eines chemotherapeutischen Mittels abgetötet. Wird z.B. eine Droge verabreicht, die in der Lage ist, 99,99 % bösartiger Zellen eines Patienten abzutöten, der 10¹² bösartige Zellen hat, verbleiben 10&sup8; bösartige Zellen. Wenn auch diagnostiziert wurde, daß der Patient eine vollständige klinische Remission hat, können beliebige der übriggebliebenen 10&sup8; bösartigen Zellen einen Rückfall in die Krankheit bringen.
• Ein weiteres Problem bei der Krebsbehandlung und bei Behandlungen anderer Krankheiten, welche auf der Anwesenheit von körperfremden Zellen in einem Wirtsorganismus zurückzuführen sind, liegt darin, daß die körperfremden Zellen regelmäßig im Laufe der Zeit resistent auf ein spezielles therapeutisches Mittel werden. Versuche, mit diesem Problem fertig zu werden, führten zu Protokollen, wonach verschiedene therapeutische Mittel gleichzeitig oder in endlichen Sequenzen eingesetzt werden. Andere Protokolle sind so angelegt, daß die eingesetzten Mittel spezifischer auf die körperfremden Zellen ausgerichtet sind.
• Ein chemotherapeutisches Mittel, das zur spezifischen Eliminierung körperfremder Zellen, nicht aber körpereigener Zellen, in vivo eingesetzt werden könnte, wäre sehr geeignet zur Behandlung von Krebs und einer Reihe von anderen Krankheiten, welche durch die Anwesenheit von körperfremden Zellen in einem Wirtsorganismus verursacht werden.
• α-Ketoaldehyde, eine Reihe von Chemikalien, die das α- Ketoaldehyd-Radikal enthalten, sind als wirksame Inhibitoren der Proliferation von körperfremden Zellen bekannt. Die antiviralen Eigenschaften von α-Ketoaldehyden wurden intensiv und systematisch untersucht und die Ergebnisse in einer Reihe von Aufsätzen veröffentlicht (Underwood, G.E. und S.D. Weed, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 93:421- 424 (1956); Tiffany, B.D. et al. J. Am. Chem. Soc., 79: 1682 (1957); Underwood, G.E. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 100: 312 (1959)). α-Ketoaldehyde haben sich auch als bakteriostatisch erwiesen (Freedberg, W.B. et al., J. Bacteriol., 108: 137 (1971); Barrett, P.A. et al. Nature, 206: 1340 (1965); Egyud, L.G. und A. Szent- Gyorgy. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 55: 388-393 (1966)). Weiterhin kuriert die örtliche Behandlung von Tumorwachstum min α-Ketoaldehyden den Wirtsorganismus (Apple, M.A. und D.M. Greenberg, Can. Chem. Ther. Rep., 51:455-464 (1967) ; Egyud, L. und A. Szent-Gyorgy, Science, 160: 1140 (1968);Jerzykowski, T. et al., Neoplasma, 17:25-35 (1970)).
• α-Ketoaldehyde weisen jedoch gleichzeitig auch eine relative hohe Toxizität in Lebewesen auf. Weiterhin werden sie leicht metabolisiert zu den entsprechenden β-Hydroxysäuren durch Glyoxalase-Enzyme, welche in allen lebenden Zellen anwesend sind iind speziell in den roten Blutzellen. Aus diesem Grund werden systemische Dosen von α-Ketoaldehyden therapeutisch nicht eingesetzt, obgleich freie α-Ketoaldehyde die Proliferation von körperfremden Zellen inhibieren.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Klasse von modifizierten Chemikalien, die als latent gemachte α- Ketoaldehyde bekannt sind, welche zur spezifischen Eliminierung von körperfremden Zellen in vivo einem Vertebrat verabreicht werden können, während körpereigene Zellen intakt bleiben. α-Ketoaldehyde können durch chemische Verfahren, physikalische Verfahren sowie durch chemische und physikalische Verfahren latent gemacht werden. Im Gegensatz zu freien α-Ketoaldehyden behalten latent gemachte α-Ketoaldehyde ihre biologische Aktivität in vivo und können in Dosen verabreicht werden, welche für den Vertebrats-Wirtsorganismus nicht toxisch sind.
• Nach einer Ausführungsform werden α-Ketoaldehyde physikalisch dadurch latent gemacht, daß sie mit einem Einkapselungsmittel, z.B. einem Liposom, eingeschlossen werden. Ein Vorteil der Verabreichung physikalisch latent gemachter α-Ketoaldehyde liegt darin, daß sie einen hohen therapeutischen Index aufweisen. Bei der Verabreichung in vivo bilden physikalisch latent gemachte α-Ketoaldehyde spezifische Aggregate mit körperfremden Zellen. Weiterhin vermögen die physikalisch latent gemachten α-Ketoaldehyde die Blut-/Gehirn-Barriere zu durchdringen. Sie können daher zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die auf die Anwesenheit von körperfremden Zellen im Gehirn eines Wirtsorganismus zurückzuführen sind.
• Sind sie einmal bei den körperfremden Zellen lokalisiert, gibt es zwei Verfahrensweisen, durch welche latent gemachte α-Ketoaldehyde in vivo aktiv werden. Nach dem einen Verfahren entfernen latent gemachte α-Ketoaldehyde die "Tarnung" der körperfremden Zellen durch Proteinbeschichtung und verhindern eine Neubildung der Proteinbeschichtung. Ist die Abschirmung erst einmal entfernt, wird die körperfremde Zelle als Fremdzelle erkannt und wird dem Abbau durch natürliche Killerzellen des Wirtsorganismus ausgesetzt. Nach einem anderen Verfahren inhibieren die latent gemachten α-Ketoaldehyde die Proteinsynthese und verhindern dadurch Proliferation und Wucherung der körperfremden Zelle.
• Ein wichtiger Vorteil liegt in der Anwendung von α-Ketoaldehyden zur Krebskontrolle oder zur Begrenzung der Proliferation von körperfremden Zellen und besteht darin, daß diese Chemikalien die körperfremden Zellen nicht direkt töten, noch haben sie einen direkten Einfluß auf das Immunsystem des Wirtsorganismus. Hieraus resultiert, daß die Therapie durch Einsatz von latent gemachten α-Ketoaldehyden spezifisch ist (d.h. daß sie den Wirtsorganismus (d.h. die körpereigenen Zellen) nicht beeinträchtigt). Weiterhin ist diese Behandlungsweise resistent gegen Mutationen. Daher können potentiell alle körperfremden Zellen abgetötet werden.
• Latent gemachte α-Ketoaldehyde sind weiterhin geeignet als Strahlungssensibilisatoren. Latent gemachte α-Ketoaldehyde können auch zur Unterdrückung der Immunabstoßungsprozesse bei der Gewebetransplantation und auch als Antikoagulanz eingesetzt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Figur 1 ist ein Diagramm, das die Anlagerung des Wirtsproteins an das Transplantationsantigen einer körperfremden Zelle darstellt.
• Figur 2 ist ein Diagramm, das die Tarnung einer körperfremden Zelle mit Wirtsprotein und die Entfernung der Tarnung nach Reaktion mit einem α-Ketoaldehyd darstellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung basiert auf den Erkenntnissen, daß latent gemachte α-Ketoaldehyde, welche in vivo verabreicht werden, spezifische Reaktionen mit getarnten körperfremden Zellen eingehen. Für den Zweck dieser Anmeldung ist eine körperfremde Zelle als eine Zelle definiert, die in einem Vertebrat-Wirtsorganismus anwesend ist und welche von der körpereigenen Zelle des Wirtsorganismus verschieden ist. Dieser Unterschied kann auf dem Äußeren der Zelle via Transplantationsantigene exprimiert werden. Damit unterscheiden sich die Transplantationsantigene von körperfremden Zellen von den Transplantationsantigenen von körpereigenen Zellen. Beispiele von körperfremden Zellen umfassen Krebszellen, mit Bakterien oder Viren infizierte Zellen, befruchtete Eier und Zellen von niederen Organismen wie Pilzen, Protisten und Bakterien.
• In einer Umsetzung entfernen die latent gemachten α-Ketoaldehyde die Wirtsproteinbeschichtung, welche körperfremde Zellen tarnt, und verhindert die Ausbildung einer solchen Beschichtung. Sobald diese Beschichtung entfernt ist, sind die natürliche Killerzellen des Immunsystems des Wirtsorganismus in der Lage, die körperfremden Zellen zu erkennen und zu töten.
• Bei einer anderen Umsetzung blockieren die latent gemachten α-Ketoaldehyde die Proteinsynthese und inhibieren damit die Zellteilung. Die niedrigeren Homologen der α-Ketoaldehyde (z.B. die aliphatischen C-3- und C-4-Homologen) sind in der Lage, die Zellwand zu penetrieren und die Proteinsynthese von dort zu inhibieren. Die höheren Homologen (z.B. > 0-5 der aliphatischen Serie), welche nicht in der Lage sind, die Zelloberfläche zu penetrieren, können zusammen mit den niedrigeren Homologen die Proteinsynthese einer sich teilenden Zelle durch Reaktion mit einem arginin-reichen Protein blockieren. Dieses Protein erscheint auf der Zelloberfläche bei der Initiierung der Zellteilung und ist wesentlich für die Zellteilung (Stein, S.M. und Berestecky J.M. : Cancer Res. 34: 3112 (1974); Stein S.M. und Berestecky J.M.: Cell Physiol: 85: 242 (1975)).
• Als ein Ergebnis dieser Erkenntnisse ist es nun möglich, latent gemachte α-Ketoaldehyde zur therapeutischen Behandlung von Krankheiten und Zuständen einzusetzen, welche durch die Anwesenheit von körperfremden Zellen in einem Vertebrat-Wirtsorganismus hervorgerufen werden. Im folgenden sind die α-Ketoaldehyde, Verfahren zum Latentmachen der α-Ketoaldehyde und der Mechanismus beschrieben, durch welche α-Ketoaldehyde die Proliferation von körperfremden Zellen in einem Vertebrat-Wirtsorganismus inhibieren.
α-Ketoaldehyde
• α-Ketoaldehyde sind eine Reihe von chemischen Verbindungen, abgeleitet von Glyoxal (CHO-CHO), einem Dialdehyd mit zwei Kohlenstoffatomen. Der einfachste α-Ketoaldehyd, Methylglyoxal (2-Oxopropanol) kommt in normalen Zellen natürlich vor. Er wird kontinuierlich aus verschiedenen metabolischen Quellen gebildet (Ohmori S., et al. "Biosynthesis and Degradation of Methylgloyoxal in Animals" in Enzymology and Molecular Biology of Carbonyl Metabolism 2, (Ed: Flyyn T.J.) Allan R. Liss Inc. Publisher pages 397-412 1989). Innerhalb einer Zelle besteht die Aufgabe der α-Ketoaldehyde in der Steuerung der Zellteilung. Basierend auf dieser Teilnahme an internen selbstregulatorischen Prozessen der Zellteilung werden α- Ketoaldehyde "autobiotics" genannt (Egyud, L.G., J. Biochem., 96:19c (1965); Egyud, L.G., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 54:200 (1965)). Methylglyoxal (CH&sub3;-CO-CHO) mit drei Kohlenstoffatomen (C-3) ist das erste Glied einer aliphatischen Reihe, worin jeweils das folgende Glied durch eine -CH&sub2;-Einheit erweitert ist (nämlich C-4 Ethylglyoxal CH&sub2;-CH&sub2;-CO-CHO; C-5 Propylglyoxal CH&sub3;-CH&sub2;-CH&sub2;-CO- CHO; usw.). Glieder der aliphatischen Reihe bis zu C-5 sind in Wasser löslich oder in Fettlösemitteln. Die höheren Glieder der Serie (C-6 bis C-12) sind Feststoffe und löslich nur in organischen Lösemitteln. Der Rest der synthetischen Verbindungen sind verhältnismäßig löslich in Wasser oder einer Mischung von Wasser/organischen Lösemitteln.
• α-Ketoaldehyde können aus den entsprechenden Aldehyden oder 2-Ketonen durch Selenigsäure-Oxidation nach N. Rabjohn (Org. Reactions:5:332.1949) und H.L. Riley et al. (JCS.: 1932: 1875) durch Hydrolyse von α-Oximinoketonen (Cox;JCS.: 1936: 129, Taylor, JCS.;:1926: 2822) oder durch Kupfer(II)säure-Oxidation von 2-Keto-alkoholen (Christaensen et al.; Chem. Ind. 1259, (1958) oder US-Patente in den Chem. Abst. 51: 2072b 1957, ibid 51: 7446. 1957. Florkin, Stotz Comphenz. Biochem. 10: 85 1963) . Die α-Ketoaldehyde können sodann durch fraktionierte Destillation isoliert werden. Das reine Produkt in cis- und trans-Konfiguration kann durch präparative Gaschromatographie erhalten werden. Eine Anzahl von α-Ketoaldehyde (z.B. Methylglyoxal, Phenylglyoxal und Hydroxymethyglyoxal) sind auch im Handel erhältlich. β-substituierte α-Keto-butyraldehyde sind unter den Warenzeichen "Kethoxal" und "Methoxal" erhältlich.
• Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich α-Ketoaldehyd auf eine Reihe von chemischen Verbindungen, die die Aldehydradikal-Sequenz gebunden an eine Struktur von großer Vielfalt enthält. Über 30 α-Ketoaldehyde, welche aliphatische, aromatische, heterozyklische, polyzyklische Einheiten enthalten, wurden synthetisiert und sind in der US-Patentschrift Nr. 4 066 650 mit dem Titel "Keto-Aldehyd-Amin-Additionsprodukte und Verfahren zur Herstellung derselben" beschrieben. Die Lehren des Egyud-Patents sind hierin durch Referenz eingeschlossen. Die bevorzugten α- Ketoaldehyde sind jedoch ohne Einschränkung Methylglyoxal, Phenylglyoxal und chlorierte Derivate wie z.B. Chlormethylglyoxal, Dichlormethylglyoxal, Chlorphenylglyoxal und Dichlorphenylglyoxal. Die sterische Chemie der chlorierten Derivate machen diese besonders wirksam zur die Umsetzung mit Thiolen an einer Zelloberfläche.
Latentmachung
• α-Ketoaldehyde, welche sich auf dem Äußeren von Vertebrat-Zellen befinden, sind relativ toxisch. Zudem werden sie leicht interzellular metabolisiert zu den entsprechenden β-Hydroxysäuren in Gegenwart von Glutathion durch Glyoxalase-Enzyme, welche in allen lebenden Zellen anwesend sind (z.B. Tier-, Pflanzen-, Bakterienzellen). Glyoxalase-Enzyme sind besonders aktiv in roten Blutzellen. α-Ketoaldehyde können jedoch so modifiziert werden, daß sie geschützt gegen den Angriff der Glyoxalase sind, während zur gleichen Zeit ihre in vivo-Toxizität herabgesetzt und ihre Spezifität erhöht wird.
• "Latentmachung" bezieht sich auf chemische oder physikalische Maßnahmen zum Schutz der Aldehydfunktion der α-Ketoaldehyde gegen signifikante Modifikation oder Destruktion durch die in vivo-Umgebung. Latent gemachte α-Ketoaldehyde bleiben daher im Blutstrom eines Patienten länger als freie α-Ketoaldehyde.
• Der Anmelder die Halbwertszeit von freien und latent gemachten α-Ketoaldehyden bestimmt durch Injektion von mit C¹&sup4; radiomarkiertem Methylglyoxal in Mäuse. Die in vivo Zersetzung sowohl von freiem als auch von latent gemachtem Methylglyoxal wurde durch das radiomarkierte C¹&sup4; verfolgt, welches in der Atemluft oder im Urin der Maus festgestellt werden kann. Mit freien α-Ketoaldehyden beträgt die Halbwertszeit etwa 30 Minuten. Die Halbwertszeit von latent gemachten α-Ketoaldehyden ist auf mindestens 12 Stunden verlängert. Die Latentmachung schützt auch die Wirtszellen vor den toxischen Effekten der α-Ketoaldehyde.
• Die Latentmachung kann auf chemischem Wege, auf physikalischem Wege oder sowohl auf chemischem und physikalischem Wege erfolgen. So beschreibt beispielsweise die US- Patentschrift Nr. 4 066 650, mit dem Titel "Keto-Aldehyd- Amin-Additionsprodukte und Verfahren zur Herstellung derselben" von L.G. Egyud auf chemischem Wege latent gemachte α-Ketoaldehyde umfassend Additionsprodukte von mono-substituierten Ketoaldehyden mit einem sekundären Amin.
• α-Ketoaldehyde können somit auf chemischem Wege latent gemacht werden durch die Umsetzung mit primären Aminen. In diesen monosubstituierten Derivaten ist allein die Aldehydfunktion in eine Reaktion vom Additionstyp involviert. Das gebildete "Aldimin" setzt sich weiterhin unter wasserfreien Bedingungen zu einer labilen "Schiff'schen Base" um, die eine Azomethin-Bindung enthält. Die Azomethin-Bindung dissoziiert wegen ihrer umgebungsbedingt-geschwächten Aminogruppe leicht zu den Stammverbindungen. Das Aldimin, welches schnell unter saurer Katalyse in Wasser gebildet wird, kann den Ketoaldehyd in vivo durch die Aktion nichtspezifischer Amidasen freisetzen.
• Die Aldimin-Moleküle unterliegen jedoch der unkontrollierten Polymerisation unter Bildung eines zyklischen Triazin-Derivates in Wasser, sogar bei neutralem pH und niederer Temperatur. Das zyklische Derivat ist stabil. Es ist kein Enzym bekannt, das die Zersetzung der zyklischen Struktur bewirken könnte. Die chemische Struktur und Reinheit von chemisch latent gemachten α-Ketoaldehyden kann durch physikalische Methoden belegt werden, z.B. u.a. durch die CHNO-Analyse, durch Schmelzpunkt, Siedepunkt, sichtbare Spektroskopie, UV-Spektroskopie, Flüssig-Chromatographie, IR-Spektroskopie, NMR, Massenspektroskopie, Dünnschicht-Chromatographie, Hochdruck-Flüssigchromatographie und Gaschromatographie.
• Ein Beispiel eines auf physikalischem Wege latent gemachten α-Ketoaldehyds ist ein α-Ketoaldehyd, der in ein Einkapselungsmittel eingeschlossen ist. Beispiele für Einkapselungsmittel umfassen Liposome, Stärken und gewebeverträgliche synthetische Chemikalien (z.B. Kunststoffe). Einkapselungsmittel sorgen für eine kontrollierte Freigabe des α-Ketoaldehyds über einen längeren Zeitraum. So ist z.B. die Freigabe von Methylglyoxal aus einem Polymethylacrylat-Einkapselungsmittel erst nach etwa 175 Stunden abgeschlossen (Nozawa, Y. and S.W. Fox, J. Pharm. Sci 70:385-386 (1981)). Diese kontrollierte Freigabe an spezifischen Stellen (d.h. "homing") begrenzt die Konzentration des freien α-Ketoaldehyds im Blutstrom zu jeder Zeit und verhindert daher toxische Nebeneffekte und Stoffwechselreaktionen.
• Liposome sind ein bevorzugtes Einkapselungsmittel. Liposome werden aus wasserunlöslichen polaren Lipiden (z.B. Phosphorlipiden) in Gegenwart von überschüssigem Wasser gebildet. Die hochgeordneten Anordnungen sind in einem System von konzentrischen geschlossenen Membranen einer ununterbrochenen biomolekularen Schicht von Lipidmolekülen angeordnet, getrennt voneinander durch Wasser-Moleküle. Liposome können nach einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden (Szoka, F., Jr. et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980), Willschut, J. in Liposome Methodology, eds. Laserman, L.E. und J. Barbet, INSERM, Paris, S. 11 (1982)). Je nach dem für die Herstellung einsetzten Verfahren bestehen Liposome aus einer oder mehreren Lamellen. Alle Liposome, gleichgültig, ob multilamellar oder unilamellar, schließen ein wäßrige Phase ein, in welcher wasserlösliche Substanzen eingekapselt und mit variablen Geschwindigkeiten freigegeben werden können. Alternativ können lipidlösliche Substanzen oder wasserlösliche Moleküle mit hydrophoben Anteilen in die Lipidphase des Liposoms eingebaut werden.
• Liposome können aus einer Vielzahl von amphiphilen Lipiden hergestellt werden. Am meisten werden Phosphorlipide eingesetzt, welche die Hauptkomponenten biologischer Membranen sind. Die amphiphile Natur der Phosphorlipide (d.h. die Kombination eines polaren Kopfteils und eines hydrophoben Schwanzteil innerhalb eines Moleküls) ist verantwortlich für die zweilagige Anordnung nach Hydratation, wobei die hydrophylen Kopfteile jeweils im äußeren Teil der zweilagigen Anordnung lokalisiert sind und die hydrophoben Fettsäureketten einander direkt entgegengesetzt im inneren Teil der zweilagigen Anordnung ausgerichtet sind. Wenn auch ein amphiphiles Lipid allein zur Bildung von Liposomen genügt, können die Eigenschaften des Liposoms dadurch verbessert werden, daß andere wasserlösliche Verbindungen in die Struktur eingebaut werden. Aus diesem Grunde können sich Liposome in Dimension, Zusammensetzung, Ladung (z.B. neutral, positiv oder negativ) und Struktur (z.E. multilamellar, unilamellar) unterscheiden.
• Beispiele 1 und 2 der vorliegenden Erfindung beschreiben im Detail die Verfahren zur Herstellung von liposomalen-α -Ketoaldehyden. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung sind Liposome optimal, welche eine Größe zwischen etwa 0,02 bis 25 um aufweisen. Liposomale-α-Ketoaldehyde können allerdings in Zusammensetzung und Struktur variieren.
• In den Organismus injizierte Liposomen sammeln sich normalerweise in der Leber und Milz. Forscher haben festgestellt, daß Liposome auch Kongregate an entzündeten Stellen bilden (Ostro, M.J. und P.R. Cullis, Am. J. Hosp. Pharm., 46:1576-1587 (1989). An Stellen von Infektion, Entzündung und Tumoren ist die Gefäßversorgung des Organismus unvollständig und unterbrochen. So ist es möglich, daß Liposom-Partikel aus der Zirkulation aussickern und in den umgebenden Geweben eingeschlossen werden. Es wird angenommen, daß an einer solchen Stelle Zellen (z.E. Makrophage) die Liposompartikel beseitigen (Mertz, E.T., Biotechnology, Vol. 5, Seite 6 (1987)).
• Wenn auch Stellen im Körper, wo körperfremde Zellen vorliegen, entzündet sein können, wenn Liposom-α-Ketoaldehyde in vivo injiziert werden, wurde doch gefunden, daß diese spezifisch in der Nähe von körperfremden Zellen akkumulieren, und zwar in einem größeren Ausmaß, als Liposome, die keine α-Ketoaldehyde enthalten, akkumulieren.
• Eine Erklärung für die erhöhte Aggregation von liposomalen-α-Ketoaldehyden in der Nachbarschaft von körperfremden Zellen ist die elektronische Anziehung. Liposom-Präparate in Anwesenheit von α-Ketoaldehyden bedingen die "Umkapselung" derselben in der inneren wäßrigen Phase und auch die "Einkapselung" in der Lipidphase. Einkapselung Produziert -CO-CHO-Gruppen, welche aus der Lipidoberfläche herausragen. Die -CO-CHO-Gruppen haben eine positive Netto-Ladung. Diese Gruppen können daher als "homing"- Einrichtung wirken, indem sie das mit α-Ketoaldehyd beladene Liposom auf die Oberfläche der körperfremden Zelle dirigieren, und zwar angezogen durch die hochreaktiven negativ geladenen -SH-Gruppen (Mehrishi J.N. und D.R. Grassetti, Nature 224:563-564 (1969); Mehrishi J.N. Progress in Biophys. and Mol. Biol., 25:3 (1972).
• Die angelagerten Liposome können sodann in die körperfremde Zelle durch Pinozytose oder Fusion gelangen, worauf der α-Ketoaldehyd aus der Lipidmembran freigesetzt wird.
• Eine erhöhte Zulieferung von anderen bioaktiven, wasserlöslichen Molekülen zu körperfremden Zellen kann durch Einbeziehung der Biomoleküle in die wäßrige Phase eines liposomalen-α-Ketoaldehyds erreicht werden.
Aktionsmechanismus von latent gemachten α-Ketoaldehyden
• Die Aldehydfunktion eines α-Ketoaldehyds kann mit Thiol- oder Amino-Gruppen reagieren. Die Keton-Funktion eines α- Ketoaldehyds reagiert mit den gleichen Gruppen, jedoch in einem geringeren Ausmaß. Die Umsetzung von α-Ketoaldehyden mit Thiolen führt zu Hemimercaptalen, während die Reaktion mit primären Aminen zu sehr instabilen Aldiminen oder Schiff'schen Basen führt. In Proteinen und Nukleinsäuren reagieren α-Ketoaldehyde mit den Guanidin-Radikal des Arginins, der 5-Aminogruppe des Lysins und der Sulfhydryl-Gruppe des Cysteins (Shauenstein, E. et al., Aldehydes in Biological Systems, Pion Ltd., London, S. 115 (1977)). Die zwischen α-Ketoaldehyden und Proteinen eintretenden Reaktionen führen zur Deaktivierung von bestimmten Enzymen, insbesondere von Sulfhydryl-Enzymen (Shauenstein, E. et al., id; S. 5).
• Umsetzungen zwischen α-Ketoaldehyden und Zellproteinen verursachen eine Vielzahl von wichtigen Zellveränderungen. So inhibieren z.B. α-Ketoaldehyde die Zellproliferation primär durch Umsetzung mit den funktionellen Sulfhydryl-Gruppen, welche an der Protein-Biosynthese beteiligt sind (Shauenstein, E. et al., Aldehydes in Biological Systems, Pion Ltd., London, S. 122 (1977)). Eine starke Inhibierung der Proteinsynthese durch α-Ketoaldehyde erfolgt in vitro bei Konzentrationen, welche die Zellrespiration oder intermediären Stoffwechsel nicht beinflussen. Die Dauer der Inhibierung ist abhängig von dem Verhältnis der Zellzahl zu der Menge des α-Ketoaldehyds, die in dem Medium anwesend ist (Otsuka, H. und L.G. Egyud, Can. Res., 21:1498 (1967); Otsuka, H. und L.G. Egyud, Curr. Mod. Biol., 2:106 (1968)). Inhibierte Zellen nehmen die Zellteilung nach Zugabe von thiol-enthaltenden Verbindungen wieder auf (z.B. 1,2-Dithioethan, British Antileusit (BAL), Cystein) jedoch nicht mit Glutathion, was die Beteiligung von zellularen -SH-Radikalen beim Prozess der Inhibierung nahelegt.
• Die Inhibierung der Zellteilung ist wahrscheinlich auch abhängig von Reaktionen zwischen α-Ketoaldehyden und arginin-reichen Proteinen, welche auf der Oberfläche der Zelle während der S- und G-2-Phasen der Mitose in Erscheinung treten (Stein, S.M. und J.M. Berestecky, Cancer Res., 34:3112 (1974); Stein; S.M. und J.M. Berestecky, J.Cell Physiol., 85:243 (1975)). Stein und Mitarbeiter haben gefunden, daß bei der Umsetzung mit Phenylglyoxal, ein α-Ketoaldehyd, das in Zellen mit argin-reichen Proteinen nicht eindringen kann, zu Zellen führt, die nicht teilen können und welche durchlässig werden und absterben.
• Somit wurde gefunden, daß alle bislang getesteten α-Ketoaldehyde die Zellteilung inhibieren, und zwar in unterschiedlichen Maßen, was indiziert, daß die biologische Aktivität im Zusammenhang mit der -CO-CHO-Funktion steht. Die Zelloberfläche ist die primäre Angriffsfläche für die Inhibierung der Zelleinteilung durch α-Ketoaldehyde, welche die Zellmembran nicht penetrieren können (d.h. Homologe der Aliphaten höher als C-5). Ihr inhibierender Einfluß auf die Zellteilung ist ausschließlich abhängig von Umsetzungen mit Cystein-, Arginin-, Lysin- und Histidin- Resten auf der Zelloberfläche. Die niederen Homologen der Aliphaten (z.B. C-3 und C-4) vermögen die Zellwand zu penetrieren. Ihr Einfluß auf die Inhibierung kann sowohl von den äußeren als auch von den inneren Rezeptoren der Zelle abhängen. Die lnhibierung der Zellproliferation durch α-Ketoaldehyde konnte für eine Anzahl von Bakterien, Schimmelpilzen, Hefen, Pflanzen und tierischen Zellen in Gewebekultur festgestellt werden.
• Es wurde gefunden, daß Krebszellen bis zu 10- bis 20-fach sensibler auf die Inhibierung durch α-Ketoaldehyde sind als normale Zellen (Shapiro, R., Ann. NY Acad. Sci., art. 2, S. 624 (1969)). Dies kann auf die Tatsache zurückgeführt werden, daß Krebszellen einen Überschuß an Amino- und Thiol-Gruppen auf ihrer Oberfläche haben (d.h. mehr als bei der Zellteilung normaler Zellen).
• Bei der Zellteilung ist der physikalische Status sowohl des Inneren als auch der Zellmembran betroffen. Wegen herabgesetzter Kohäsion, bedingt durch Freisetzung von - SH-Radikalen aus den -S-S-Bindungen, wird das Innere einer Zelle halbflüssig, so daß die inneren Komponenten sich bewegen und ihre Lage verändern können. Gleichzeitig verändert sich auch die Zellmembran. Die Zelloberfläche wird abweisend, um in der Lage zu sein, unabhängig von den umgebenden Zellen sich zu bewegen. Die sich teilende Zelloberfläche verändert sich, um die interzellularen Disulfid-Bindungen zu -SH aufzubrechen, was die sich teilende Zelle von den umgebenden Zellen ablöst. Normale Zellen bilden nach erfolgter Zellteilung Innenraum und Zelloberfläche auf das Aktivitätsniveau und die Struktur zurück, welche vor der Zellteilung bestand. Damit verbinden sich die durch Zellteilung gebildeten Zellen wieder mit den benachbarten Zellen und die Oberflächenbindungen stellen sich wieder auf die normaler Werte ein.
• Wenn jedoch eine Zelle aus irgendwelchen Gründen bösartig wird, kehrt diese Zelle nach der Teilung nicht mehr zum normalen Zustand zurück. Das bedeutet, daß die Oberflächen von Krebszellen nicht die normalen Bindungs-Eigenschaften besitzen. Damit steht es den Krebszellen frei, Metastasen auszubilden und sich zu anderen Stellen und Organen des Organismus hinzubewegen. Da körperfremde Zellen ungebunden sind, besitzen sie weiterhin eine größere Anzahl von freien -SH-Gruppen auf ihrer Oberfläche (Mehrishi, J.N. und D.R. Grassetti, Nature, 224:563-564 (1969); Mehrishi, J.N., Progress in Biophys. and Mol. Biol., A2:3 (1972))
• Die Anwesenheit von Viren oder Bakterien in Zellen steht in ähnlicher Weise im Zusammenhang mit einer erhöhten Zahl von -SH-Gruppen auf der Oberfläche einer infizierten Zelle. In der Tat weisen alle körperfremden Zellen einen Überschuß an Amino- und Thiol-Gruppen auf ihrer Zelloberfläche auf. Aus diesem Grund sind körperfremde Zellen wesentlich sensibler gegenüber Inhibierung durch α-Ketoaldehyde als körpereigene Zellen. Diese Tatsache trägt wahrscheinlich zu dem hohen therapeutischen Index der latent gemachten α-Ketoaldehyde bei.
• Zellen, in welche Mikroorganismen (z.B. Bakterien, Viren usw.) eingedrungen sind oder Zellen, welche aus verschiedenen Gründen veränderte Zelloberflächen aufweisen (z.E. Krebszellen, befruchtete Eier), sind "fremd" oder "nicht eigen" für den Wirtsorganismus. Veränderte oder körperfremde Zellen werden routinemäßig als fremd in vivo erkannt und normalerweise markiert, zerstört und eliminiert durch Zellen des Immunüberwachungssystems (ISS). Einige körperfremde Zellen widerstehen allerdings dem Immunsystem eines Wirtsorganismus, indem sie Protein des Wirtsorganismus ihrem "fremden" Transplantationsantigen- Bereich anheften.
• Figur 1 ist ein Diagramm, das das Anheften von Wirtsprotein an das Transplantationsantigen einer körperfremden Zelle darstellt. Wenn auch die Figur lediglich ein Transplantationsantigen wiedergibt, weist eine Zelle überlicherweise viele solcher Bereiche auf. Das Transplantationsantigen besteht aus zwei Proteinen: β-2-Mikroglobulin (B-2-M); und dem wesentlichen Gewebeverträglichkeitskomplex-I (MHC-Klasse I). B-2-M ist elektronisch (d.h. durch Van-der-Waal'sche Kräfte) assoziiert mit dem MHC- Klasse I der Wirtszelle. Das Wirtsprotein ist durch B-2-M über kovalente Isopeptid-Bindungen zwischen der γ- Carboxylgruppe der Glutaminsäure und der ε-Aminogruppe des Lysins gebunden. Die Isopetid-Bindungen zwischen den benachbarten Proteinketten sind durch die Aktion der Gewebetransglutaminase gebildet, welche in der Zellmembran enthalten ist. Die Bindung von Wirtsprotein an das Transplantationsantigen "tarnt" die körperfremde Zelle so, daß sie durch die natürlichen Killerzellen (NK) des Immunsystems des Wirts nicht erkannt wird.
• Figur 2 ist ein Diagramm, das die Tarnung einer körperfremden Zelle und die Aufhebung der Tarnung durch Reaktion mit einem α-Ketoaldehyd darstellt. Schritt 1 der Figur 2 zeigt eine körpereigene Zelle, die durch Interaktion mit einem "Effektor" körperfremd-I (NS-I) gemacht ist. Ein Effektor kann ein Virus-, Bakterien- oder Pilz- Pathogen, ein krebsverursachendes Agenz oder, wenn die körperfremde Zelle ein befruchtetes Ei ist, eine Samenzelle sein,.
• Der Unterschied zwischen einer körperfremden und einer körpereigenen Zelle ist exprimiert in den Transplantationsantigenen (TA). Natürliche Killerzellen (NK) des Wirtsorganismus erkennen im allgemeinen die verschiedenen Transplantationsantigene von körperfremden Zellen. Auf diese Weise vernichten die natürlichen Killerzellen spezifische körperfremde Zellen.
• Die Körperfremd-I (NS-I)-Zellen können dem Erkanntwerden dadurch entkommen, daß sie nur eine kurze Lebenszeit aufweisen, (d.h. normale Zellen während der Zellteilung (45 min.)) oder durch Tarnung. Die Zelltarnung erfolgt in zwei unterschiedlichen Schritten. In dem ersten irreversiblen Schritt (Schritt 2 der Figur 2) bindet Gewebetransglutaminase (E), ein Enzym das in der Zellmembran vorliegt und durch Kalziumionenzufuhr aktiviert wird, beliebiges zur Verfügung stehendes Wirtsprotein an B-2-M (in Figur 1 dargestellt) und transformiert die Zelle zu Körperfremd-II (NS-II). Das gebundene Wirtsprotein verbirgt die Erkennungsbereiche vor den natürlichen Killerzellen, so daß die Zelle nicht als "körperfremd" erkannt wird.
• Ein Überzug mit einem einzelnen Protein, wie bei den NS- II-Zellen, vermag jedoch Zellen nicht gut genug gegen hochaktive Killerzellen schützen. Aus diesem Grund ist ein befestigter Zellüberzug aus mehrschichtigem Protein hergestellt. Im zweiten Schritt werden NS-II-Zellen zu Körperfremd-III (NS-III) tranformiert. Im Schritt III sondert die NS-II-Zelle ein Protein ab, das Procoagulanz das in Anwesenheit von Kalziumionen in der Lage ist, im abgekürzten Verfahren auf der Zelloberfläche Hämostase herbeizuführen durch Aktivierung von Prothrombin. Procoagulanz (P) katalysiert die Umwandlung von Prothrombin (PTH) zu Thrombin (TH). Thrombin katalysiert zwei Reaktionen: die Umwandlung des Proenzyms Faktor XIII (FXIII) zur Plasmatransglutaminase Faktor XIIIa (FXIIIa); und die Umwandlung von Fibrinogen (FG) zum einfädigen Fibrin (MFF) über den NS-III-Bereich. Einfädiges Fibrin (MFF) hat keine dreidimensionale Zugfestigkeit. Aus diesem Grund wird einfädiges Fibrin (MFF) vernetzt durch Faktor XIIIa (F-XIIIa) zu einem dreidimensionalen mehrschichtigen Fibrin-Koagulat oder -gerinsel in situ und mit β-2-Mikroglobulin in Anwesenheit von Kalziumionen. Das stabile Fibrin-Koagulat umgibt und tarnt das Körperfremd-III (NS-III)-Transplantationsantigen.
• α-Ketoaldehyde haben jedoch große elektronische π-Obitale und wirken daher als Elektronenakzeptoren. Kommen α-Ketoaldehyde in Kontakt mit den Fibrin-Koagulaten, welche die körperfremden Zellen umgeben und tarnen, wird die elektrostatische Bindung zwischen MHC-I und dem β-2-Mikroglobulin des Transplantationsantigens beeinträchtigt. Dies führt dazu, daß das β-2-Mikroglobulin und der daran gebundene Fibrin-Überzug sich vom MHC-I separieren. Mit der Separierung ist die Tarnung aufgehoben und die körperfremde Zelle ist dem Angriff und der Destruktion durch das Immunsystems des Wirtsorganismus zugänglich.
• α-Ketoaldehyde reagieren auch mit Sulfhydryl-Gruppen im aktiven Bereich der Cysteinproteinasen (nämlich Transglutaminase-Enzyme und Procoagulanz), α-Ketoaldehyde (KA) entfernen den Fibrin- "Überzug" und verhindern eine Rückbildung desselben über die Transplantationsantigen-Bereiche. Ohne den schützenden Überzug sind die "körperfremden"-Bereiche der Fremdzellen-Erkennung und der Destruktion durch natürliche Killerzellen (NK) des Immunsystems des Wirtsorganismus ausgesetzt, in Figur 2 als "vernichtete Zellen" bezeichnet.
• Die Rolle der Transglutaminase bei der Maskierung der Körperfremdheit (Antigenität) eines befruchteten Säugetier-Eies zur erfolgreichen vollständigen Implantation, Angiogenese und Plazenta-Bildung ist wohl dokumentiert (Lampe, L., Szuleszet nogyogyaszt, (Obstetrics, Gynecology) Vol. I, S. 6 Medicina Publisher, Hungary 1981) . Das Ei wird körperfremd durch Zellfusion mit der "Effektor"- Samenzelle (Schritt 1 in Figur 2) . Der körperfremde Fötus ist ursprünglich überzogen mit Uteroglobulin, ein Protein, das im Überschuß im Uterus zwischen dem 12. und 18. Tag der Regel aufgefunden wird (Schritt 2). Dieser Uberzug geht sodann über zum Fibrin (Schritt 3), nachdem das befruchtete Ei implantiert ist. Die Fibrin-Bildung um das befruchtete Ei ist das Ergebnis einer lokalen Aktivierung der Hämostase durch ein vom befruchteten Ei produziertes Procoagulanz. Eine Schicht, genannt Nitabuch's Fibrin-Schicht, ist in der Decidua noch um die 36. Woche der Schwangerschaft anwesend und separiert den Fötus von der Mutter. (Lampe L. in Szuleszet es nogyogyaszat (Obstetrics and Gynecology) Vol. I, S. 96 Medicina Publisher, Hungary, 1981)).
• Das "zweistufige" Maskierverfahren ist ebenso wohldokumentiert für Krebszellen. Normale Zellen werden dadurch Krebszellen, daß sie mit einem Ef fektor interagieren (z.B. Carzinogenen, UV-Bestrahlung usw.). Im ersten Schritt der Tarnung (Schritt 2) nehmen veränderte Zellen "mit minimaler Abweichung" jegliches Protein, das in der Zirkulation erreichbar ist, auf und verbinden es mit dem neu entstandenen Antigenitätsbereich über die Reaktion mit Gewebe-Transglutaminase. Sobald die veränderte Zelle bösartig wird, wird Krebsprocoagulanz gebildet. Wie in Schritt 3 der Figur 2 dargestellt aktiviert das Krebsprocoagulanz (P) die Hämostase, und es wird Fibrin abgeschieden über die Transplantationsantigene der Krebszelle (Gordon, S.G., "Cancer Procoagulant," in Hemostasis and Cancer (ed. L. Muszbek) CRC Press, S. 19 (1987)).
• Eine gleichartige Abscheidungsfolge für Protein durch Gewebetransglutaminase und Procoagulanz kann in Zellen induziert werden durch den Angriff von Agenzien, welche die Membranen der Wirtszellen durchdringen oder sich an die Membranen anlagern (z.B. Bakterien, Viren, Pilze usw.) oder auf den Oberflächen von freilebenden, nichtzelldurchdringenden Agenzien (z.B. Parasiten, Pilze, Bakterien usw.) zu deren eigener Verteidigung.
• Zusammenfassend kann gesagt werden, daß sobald latent gemachte α-Ketoaldehyde an einer körperfremden Zelle lokalisiert sind, es für ihren Angriff in vivo zwei Verfahrensweisen gibt. Nach der einen Verfahrensweise wird die Proteinsynthese inhibiert und dadurch das Wachstum und die Proliferation der körperfremden Zelle verhindert. Nach der zweiten Verfahrensweise entfernen die latent gemachten α-Ketoaldehyde den Schutzüberzug, der körperfremde Zellen tarnt und verhindern deren Wiederausbildung. Sobald dieser Überzug entfernt ist, sind die körperfremden Zellen dem Erkanntwerden, dem Angriff und der Destruktion durch natürliche Killerzellen des Wirtsorganismus ausgesetzt.
• Aus diesem Grund ziehen Chemotherapien auf der Basis von α-Ketoaldehyden den eigenen Immun-Respons des Patienten zum Erkennen und Zerstören fremder Krebszellen tatsächlich zur Mitarbeit heran, während mit konventionellen Chemotherapien der normale Immun-Respons des Patienten eliminiert oder herabgesetzt wird.
Nutzen
• Latent gemachte α-Ketoaldehyde sind geeignet zur Kontrolle jeglicher Krankheiten und Zustände, welche bedingt sind durch die Anwesenheit von körperfremden Zellen in einem Wirtsorganismus.
• Mit Kontrolle soll gesagt sein, daß α-Ketoaldehyde geeignet sind sowohl zur Verhinderung von Krankheiten oder Zuständen bedingt durch die Anwesenheit von körperfremden Zellen in einem Wirtsorganismus, als auch zur Behandlung dieser Krankheiten oder Zustände, wenn sie sich bereits manifestiert haben.
• Ein Vorteil der Anwendung von latent gemachten α-Ketoaldehyden zur Behandlung von durch die Anwesenheit von körperfremden Zellen in einem Wirtsorganismus hervorgerufenen Krankheiten besteht darin, daß diese Behandlungsweise resistent hinsichtlich Mutationen ist. Dies ist darauf zurückzuführen, daß α-Ketoaldehyde in Wirtszellen natürlich vorkommen und daher in körperfremden Zellen keinen Verteidigungsmechanismus auslösen. Die Verabreichung von latent gemachten α-Ketoaldehyden ist besonders geeignet zur Behandlung u.a. der folgenden Krankheiten: Krebs, Viruskrankheiten (z.B. AIDS, Grippe, Masern, Mumps, Windpocken, Zoster, Hepatitis, Diabetes), durch Bakterien ausgelöste Krankheiten (z .B. Lungenentzündung, Bronchitis, Meningitis, Carditis, Periodontitis, Rindermastitis) und durch Pilze ausgelöste Krankheiten (z.B. Histoplasmosis, Blastomycosis, Candiadiasis), welche sämtlich auf die Infektion und Proliferation von körperfremden Zellen in einem Vertebrat-Wirtsorganismus zurückzuführen sind.
• Ein Vorteil der Anwendung von latent gemachten α-Ketoaldehyden bei der Behandlung von Krankheiten, die durch die Anwesenheit von körperfremden Zellen in einem Wirtsorganismus ausgelöst werden, liegt darin, daß latent gemachte α-Ketoaldehyde die Blut-/Gehirn-Barriere passieren können. Damit sind beispielsweise latent gemachte α-Ketoaldehyde geeignet zur Behandlung von AIDS-Patienten und zur Verhütung der Demenz, die regelmäßig ein Symptom der Krankheit ist.
• Weiterhin wird Krebs verursacht, wenn körpereigene Zellen eines Vertebraten körperfremd werden. Latent gemachte α- Ketoaldehyde können daher eingesetzt werden als antineoplastisches Agenz. Beispiel 3 beschreibt die Wirkung, welche Methylglyoxal (MG) und liposomales Methylglyoxal (L-MG) auf Tumore bei Mäusen hat. Sowohl MG als auch L-MG erwiesen sich als gleichermaßen wirksam für die örtliche Behandlung. L-MG erwies sich allerdings als weit wirksamer bei der systemischen Behandlung von Tumoren. Es wurde weiterhin gefunden, daß mit L-MG behandelte, tumorbehaftete Mäuse resistent gegen die Rückbildung von Tumoren sind. Es hat auch den Anschein, daß eine Immunität auch dann zustande kommt, wenn Krebs mit latent gemachten α- Ketoaldehyden behandelt wird. Diese Immunität könnte wichtig sein zur Verhinderung des Wiederauftretens von Krebs.
• Latent gemachte α-Ketoaldehyde können als antineoplastisches Agenz statt der chirurgischen Tumorbehandlung oder nach der chirurgischen Tumorentfernung eingesetzt werden. Metastasenkontrolle und Verhinderung der Bildung von neuen Metastasen sind möglich, Behandlungen welche notwendig werden mögen wegen "Chirurgischem Spilling" oder wegen bereits bestehender, nicht zugänglicher Metastasen. Hämodialyse oder die Verabreichung von Diuretica in Verbindung mit der Behandlung mit latent gemachten α-Ketoaldehyden ist möglich, um die Blockierung der glomerularen Nierenfiltration durch nekrotischen Tumor-Zellbruch zu verhindern.
• α-Ketoaldehyde können weiterhin zur Geburtskontrolle eingesetzt werden. In einem frühen Stadium der embryonalen Entwicklung bilden sich befruchtete Eier zu einem "Trophoblast" aus. Die äußere Schicht eines Trophoblasten besteht aus einer einlagigen Schicht von spezialisierten Zellen, deren Funktion es ist, den sich entwickelnden Embryo in die Uteruswand zu implantieren, arterielle und venöse Blut-Verbindungen zu schaffen und die Bildung der Plazenta zu initiieren. Diese aggressiven, fermentativen und invasiven Zellen sind insofern mit Tumorzellen vergleichbar, als sie ihre äußere Oberfläche mit Wirtsprotein tarnen.
• Beispiel 4 beschreibt Experimente, die aufzeigen, daß latent gemachte α-Ketoaldehyde bei der Geburtskontrolle eingesetzt werden können. Tägliche Verabreichungen von latent gemachten α-Ketoaldehyden an tragende weibliche Mäuse führte zu 83,3 % zu einer Verhinderung der Schwangerschaft.
• Latent gemachte α-Ketoaldehyde sind auch als Radiosensibilisatoren geeignet. Experimente, die in Beispiel 5 beschrieben sind, zeigen, daß die Verabreichung von latent gemachten α-Ketoaldehyden an einen Vertebrat- Wirtsorganismus zu einem um den Faktor von etwa 5 bis 10 erhöhte Wirksamkeit der Stahlenbehandlung führen. Aus diesem Grunde gestattet die Verabreichung von α-Ketoaldehyden in Verbindung mit Strahlenbehandlung niedrigere Strahlendosen und damit die Herabsetzung der durch die therapeutische Strahlenbehandlung bewirkten Effekte von Schwindel und Haarausfall.
• Latent gemachte α-Ketoaldehyde vermögen auch die "Akzeptanz" von transplantierten Geweben (z.B. Haut, Pankreas, Leber, Nieren, Herz, Lunge) zu beeinflussen. Damit kann die Verabreichung von latent gemachten α-Ketoaldehyden intra- und interspecies Transplantate ermöglichen. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Anwesenheit von α-Ketoaldehyden in vivo die Proteinsynthese inhibiert und damit die Antigen-Bildung, welche verantwortlich für die Initiierung des Abstoßungsmechanismus ist. Die Verabreichung von latent gemachten α-Ketoaldehyden während und für einen kurzen Zeitraum nach der Transplantation (z.B. 60 Tage) würde dem Einsatz von Drogen, die die Abstoßung bekämpfen, überflüssig machen. Latent gemachte α-Ketoaldehyde könnten, falls erforderlich, so lange verabreicht werden, bis das Transplantat oder die Transplantationsplastik mit der Zeit "körpereigen" wird.
• Beispiel 6 beschreibt ein Experiment, wobei liposomales Methylglyoxal intravenös an Mäuse verabreicht wird, die einer Hauttransplantation unterzogen werden. Eine Vorbehandlung für 10 Tage vor der Transplantation, gefolgt durch eine Nachbehandlung über 25 Tage führte dazu, daß das Transplantat über 26 bis 30 Tage nicht abgestoßen wurde und zu einer 10%igen Abstoßung über 31 bis 40 Tage. Interessanterweise wurde beobachtet, daß die Gewebeakzeptanz fortdauerte, sogar nach der Absetzung der biochemischen Substanz. Es hat den Anschein, daß der Einsatz der biochemischen Substanz dem Fremdgewebe die "Adoption" ermöglicht.
• Latent gemachte α-Ketoaldehyde sind weiterhin geeignet als Antikoagulantien. Wie bereits in Zusammenhang mit Figur 2 erläutert wurde, reagieren a-Ketoaldehyde mit den Sulfhydryl-Gruppen der Transglutaminase-Enzyme. Damit inhibieren die chemischen Substanzen die Bildung von Fibrin. Somit kann die Verabreichung von latent gemachten α-Ketoaldehyden in vivo an einen Vertebrat als Prophylaktikum gegen die Bildung von Blutgerinnsel eingesetzt werden.
• Beispiel 9 beschreibt ein Experiment, das den Effekt der α-Ketoaldehyde bei der Blut-Koagulation aufzeigt. Gerinnungszeiten von mit α-Ketoaldehyden behandeltem Plasma wurden verglichen mit den Gerinnungszeiten eines Kontrollplasmas. Chlormethylglyoxal und Dichlormethylglyoxal erwiesen sich als die wirkungsvollsten Antikoagulantien.
• α-Ketoaldehyde werden generell an Wirbeltiere (Vertebrate) verabreicht, u.a. an Fische, Affen und Säugetieren einschließlich Menschen. Eine wirksame Behandlung erfordert ein konstantes Blutniveau im subtoxischen Bereich. Hierfür kann durch kontinuierliche Verabreichung Sorge getragen werden. Die Verbindungen dieser Erfindung können eingesetzt werden im Gemisch mit konventionellen Trägern, z.B. pharmazeutisch annehmbaren organischen oder anorganischen Trägersubstanzen, die für die parenterale, enterale (z.B. oral) oder örtliche Anwendung geeignet sind und nicht nachteilig mit den aktiven Verbindungen reagieren.
• Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger sind u.a. Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Gummi-Arabicum, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Polyethylenglykole, Gelatine, Karbohydrate wie z.B. Laktose, Amylose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, viskoses Paraffin, Parfumöl, Fettsäureester, Hydroxymethylzellulose, Polyvinylpyrrolidon usw. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert sein und falls erforderlich mit Hilfsmitteln gemischt sein, z.B. Schmierstoffe, Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Netzmittel, Emulgatoren, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Drucks, Pufferlösungen, Farbstoffe, Geschmacksstoffe und/oder aromatische Substanzen und dergleichen, welche nicht nachteilig mit den aktiven Verbindungen reagieren. Sie können auch, falls erwünscht, mit anderen aktiven Agenzien, z.E. Enzyminhibitoren, kombiniert werden, um zusätzlich den metabolischen Abbau herabzusetzen, sowie Sulfhydrylgruppen-Fänger, wie z.B. α-Keto-ene.
• Zur parenteralen Anwendung sind insbesondere injizierbare sterile Lösungen geeignet, vorzugsweise ölige oder wäßrige Lösungen, sowie auch Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, einschließlich Suppositorien. Ampullen stellen geeignete Dosierungseinheiten dar.
• Für die enterale Anwendung (einschließlich oral und über die Nasenschleimhäute) sind insbesondere Tabletten, Dragees, Flüssigkeiten, Tropfen, Suppositorien oder Kapseln geeignet. Ein Sirup, Elixier oder dergleichen kann mit einem gesüßten Träger eingesetzt werden.
• Für die örtliche Behandlung werden nicht-sprayfähige Darreichungsformen, viskose bis halbfeste oder feste Darreichungsformen eingesetzt, die einen für die örtliche Anwendungen geeigneten Träger enthalten und mit einer dynamischen Viskosität vorzugsweise größer als Wasser. Geeignete Formulierungen umfassen u.a. Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremes, Salben, Puder, Einreibungsmittel, Aerosole, welche soweit erforderlich sterilisiert oder mit Additiven versehen sind, wie z.B. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Netzmittel, Puffer oder Salze zur Beeinflussung des osmotischen Drucks. Zur örtlichen Anwendung sind auch sprayfähige Aerosolpräparate geeignet, worin das aktive Ingredienz vorzugsweise in Kombination mit einem festen oder flüssigen inerten Trägermaterial, verpackt ist in einer Spritzflasche oder im Gemisch mit einem unter Druck befindlichen, flüchtigen, normalerweise gasförmigen Treibmittel, z.B. Druckluft.
• Die durchschnittliche tägliche Dosis an liposomalem Methylglyoxal, bestimmt mit Mäusen von 26g ± 2g Körpergewicht mit Dosierungskonzentrationen von 260 mg/kg Maus beträgt etwa 6,5 mg in 0,1 ml IV injizierbar. Diese Werte können für andere Spezies anhand einer Konversionstabelle übertragen werden, welche bezogen ist auf die äquivalente Körperoberfläche, und dies führt zur "Körperoberflächen- Dosis"-Beziehung (Freireich, E.J. et al., Can. Chem. herap. Rep., 50:219 (1966).
• Die konkret bevorzugten Mengen der aktiven Verbindung im speziellen Anwendungsfalle variieren je nach der zur Anwendung kommenden spezifischen Verbindung, den besonderen Zusammensetzungen der Formulierung der Art der Anwendung und der speziellen Lage und dem zu behandelnden Organismus. Die Verabreichungen für einen bestimmten Wirtsorganismus können unter Anwendung konventioneller Überlegungen festgelegt werden, z.B. durch ein geeignetes konventionelles pharmakologisches Protokoll.
• Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert, deren Auswahl in keiner Weise den Erfindungsumfang beschränken soll.
Beispiel 1 Herstellung von liposomalem Methylglyoxal (L-MG)
• Das Lecithin-Cholesterin-Methylglyoxal-Gewichtsverhältnis des folgenden liposomalem Methylglyoxals ist 6:3:3. Die Methylglyoxal- und Cholesterin-Gehalte können über einen weiten Bereich variieren. So kann beispielsweise der Methylglyoxalgehalt von 0,5 bis 4 varriieren, der Cholesteringehalt im Gewichtsverhältnis von 0 bis 3. Der Lecithin-Gehalt ist jedoch nicht variabel.
• Zunächst werden 6 g Eilecithin (Sigma) und 3 g Cholesterin (Sigma) in Chloroform gelöst.
• Für die weitere Verarbeitung können zwei Verfahren benutzt werden:
• 1. Zu der Lösung werden 3 g Methylglyoxal in Wasser (7,5 ml 40%ige wäßrige Lösung, Aldrich) zugegeben und gemischt. Das Wasser wird aus dem Gemisch durch wiederholte azeotrope Destillation in einem Vakuum bei Badtemperatur (nicht über 30ºC) entfernt. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und das Lösemittel wie oben abgezogen. Die Verfahrensschritte werden drei- bis viermal wiederholt, so daß alles Wasser entfernt ist. Zu dem erhaltenen Lipidfilm, der das Methylglyoxal enthält, wird physiologische Kochsalzlösung zugegeben, mit Hand geschüttelt, 9 Minuten beschallt mit einer Abgabeleistung von 1.500 bis 2.000 Decibel. Darauf wird das Endvolumen auf 130 ml eingestellt.
• 2. Das Chloroform wird durch Vakuumdestillation (Badtemperatur 20ºC) entfernt. Zum erhaltenen Lipidfilm werden 3 g Methylglyoxal (7,5 ml 40%ige wäßrige Lösung, Aldrich) zugegeben und sodann auf 100 ml mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Der Lipidfilm wird im Rundkolben durch Schütteln mit der Hand in Wasser suspendiert und die Suspension beschallt (auf Eis 9 min. mit einer Abgabeleistung von 150 - 2.000 Decibel). Das Endvolumen des Sonikats wird auf 130 ml mit Kochsalzlösung eingestellt.
• Die beschallte Liposomsuspension wird bei 10ºC zwei Stunden zentrifugiert (10.000 Upm). Der Überstand wird gesammelt und die Menge Methylglyoxal in der Lösung durch Titration nach Friedmann bewertet (Friedmann TFJ:JBC:73, 331, 1927). Das Präzipitat wird resuspendiert in 100 ml Kochsalzlösung und zentrifugiert (60 min. bei 10ºC und 10.000 Upm). Das gesammelte Präzipitat wird resuspendiert in Kochsalzlösung auf die für die in vivo Behandlung erforderliche Konzentration.
Beispiel 2 Herstellung von liposomalem Phenylglyoxal (PhG)
• Das Lecithin-Cholesterin-Phenylglyoxal-Gewichtsverhältnis des folgenden liposomalem Phenylglyoxals ist 6:2:2. Eilecithin (360 mg), Cholesterin (120 mg) und Phenylglyoxal-Monohydrat (136 mg) werden gemischt und in Chloroform gelöst. (Phenylglyoxal ist löslich in Chloroform, Methanol und Ethanol und mäßig löslich in Wasser.) Das Chloroform wird durch Evaporation im Vakuum bei Raumtemperatur entfernt. In dem Rundkolben bleibt ein dünner Film zurück.
• Der dünne Film, der das Phenylglyoxal enthält, wird mit 20 ml physiologischer Kochsalzlösung gemischt, mit Hand geschüttelt, und die erhaltene Suspension 2 Minuten auf Eis beschallt. Die gebildete Liposom-Suspension wird 2 Stunden bei 10ºC und 10.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand (Supernate) wird gesammelt und das in der Lösung enthaltene Phenylglyoxal nach Friedmann bewertet. Die Menge des Phenylglyoxals in dem Präzipitat wird berechnet, und es wird resuspendiert in physiologischer Kochsalzlösung auf die benötigte Konzentration und bei Raumtemperatur gelagert. In einem typischen Experiment wird 4 mg/ml Phenylglyoxal zur in vivo Behandlung benutzt. Die Phenylglyoxal enthaltenden Liposome sind stabil für 5 bis 6 Tage bei Raumtemperatur. Nach längerer Lagerung bildet sich ein Präzipitat, welches durch Beschallung resuspendiert werden kann.
Beispiel 3 In vivo Behandlung von Tumoren mit physiologisch latent gemachtem Methylglyoxal
• Methylglyoxal, das in gleicher Weise sowohl in der wäßrigen als auch in der Lipidphase löslich ist, wurde in Liposom von 8 bis 20 um im Durchmesser eingekapselt, wie im Detail in Beispiel 1 beschrieben. Gruppen von Mäusen wurden mit Sarcoma-180-Zellen entweder subcutan (sc) oder intraperitonal (ip) geimpft (3 Millionen Zellen, Lebensfähigkeit 89 %), gefolgt von einer intravenösen (iv) oder intraperitonalen Behandlung mit Methylglyoxal (MG) oder mit in Liposom eingekapselten Methylglyoxal (L-MG) (10 Tage, 260 mg/kg Maus pro Tag, Tabelle 1). Tabelle 1 S-180-Zell-Impfung ip (örtlich) iv (systemisch) Kontrolle Anmerkung: T/C% (Test/Kontrolle) x 100 und I% = 100 - T/C% (I% ist die Inhibierung des Tumorwachstums)
• MG und L-MG erwiesen sich bei der örtlichen Behandlung als gleich wirksam. Bei der systemischen Behandlung der Tumore erwies sich jedoch L-MG sehr viel wirksamer als MG. Durch den Einsatz von physikalisch latent gemachtem Methylglyoxal wurde eine erhöhte Menge von α-Ketoaldehyd an die Ziel-Tumorzellen herangebracht.
• Die physikalisch-pathologische Untersuchung der mit Tumor behafteten Mäuse, behandelt mit liposom-eingeschlossenem Methylglyoxal (L-MG), zeigt von Anfang an einen sehr schnellen Anstieg der Leukozyten im zirkulierenden Blut und in den Tumorbereichen. Dies ist wahrscheinlich auf eine ziemlich starke Aktivierung des Reticuloendothelial- Systems (RES) zurückzuführen, was zu einem Abbau an Masse der bösartigen Zellen führt. Die Leukozyten akkumulieren weiter und führen zu einer schnellen Nekrose der Krebszellen. Statt der Zelltrümmer ergibt sich das Erscheinungsbild eines reaktiven Granulationsgewebes. Diese Phänomene treten bei den nicht mit Tumor behafteten Kontrollsubjekten nicht auf.
• Mit L-MG behandelte, tumor-behaftete Mäuse haben auch vergrößerte Milzorgane wegen des deutlichen Anstiegs der hämatopoetischen Aktivität und eine erhöhte Anzahl von Megakaryozyten und Normoblasten innerhalb des roten Breis. Leukozytbildung wurde ebenfalls gelegentlich beobachtet, und zwar in solchen sekundären Bereichen wie Leber und Nieren. Pankreas, Leber, Lunge, Haut und Muskeln erschienen normal. In den meisten Fällen wurde in den Tubuli der Nieren ein veilchenblaues homogenes Material gefunden. Diese Schädigung ist wahrscheinlich auf die unzureichende Exkretion der metabolischen Produkte unter semi-anurischen Bedingungen zurückzuführen. Verabreichung von Diuretika oder Mannit mag vermutlich diesen Zustand beheben.
• In die mit L-MG behandelten tumor-behafteten Mäuse wurden sodann Sarcoma-180-Zellen injiziert (sc oder ip). Diese Zellen entwickelten sich jedoch nicht zu Tumoren.
Beispiel 4 Verhinderung der Trächtigkeit in Mäusen durch Verabreichung von latent gemachteten α-Ketoaldehyden
• Sechs fünf Monate alten weiblichen CD-1-Mäusen wurde intraperitonial N-1 Hydroxyacetonylmaleimid für 12 Tage injiziert (50 Mikrogramm/20 g Maus in Kochsalzlösung: maximales Volumen 0,6 ml/A/D). Einer anderen Gruppe von solchen Mäusen wurde intraperitoneal Kochsalzlösung für 12 Tage (0,4 ml) injiziert. Diese zweite Gruppe diente als Kontrollgruppe.
• Zwei erfahrene männliche Tiere wurden zu jeder Gruppe von weiblichen Tieren gegeben und mit ihnen acht Tage lang zusammengelassen, in welcher Zeit die weiblichen Tiere ihre tägliche Injektion erhielten. Bis zum 12. Tag der Injektion wurden auf jedem der weiblichen Tiere Kopulationspfropfen festgestellt und Anzeichen der Trächtigkeit an den weiblichen Tieren der Kontrollgruppe am 15. bis 16. Tag des Experiments. Die weiblichen Tiere der Kontrollgruppe warfen Junge am 20. bis 23. Tag und die der Testgruppe am 24. bis 27. Tag (Tabelle 2). Tabelle 2 Kontrolle 12 weiblich Test 12 weiblich geboren Verhältnis der Jungtiere: 45 % männl., 55 % weibl. Regelwerte: Gestation Östrus-Dauer Trophoblast-Bildung Implantation
• Das Experiment wurde zwei Monate später mit den gleichen weiblichen Tieren wiederholt, wobei diesmal die weiblichen Tiere der Kontrollgruppe der Testgruppe und die weiblichen Tiere der Testgruppe der Kontrollgruppe zugeordnet wurden. Das Ergebnis des zweiten Experiments ergab 83,3 % Verhinderung der Trächtigkeit bei den behandelten Tieren. Die Kontrollgruppe lieferte 102 Jungtiere (T/C = 100 %).
Ergebnisse:
• Latent gemachtes Methylglyoxal verhindert die Implantation von befruchteten Mäuseeiern. Zwei Mäuse gebaren Jungtiere von reduzierter Größe diese hatten wahrscheinlich eine verzögerte Ovulation, was anscheinend recht häufig bei Mäusen ist. Die Behandlung hatte keinen Effekt auf den Reproduktionszyklus der weiblichen Tiere.
Beispiel 5 Bestrahlungs-Behandlung
• Thiol-enthaltende Verbindungen schützen Zellen gegen Schäden durch ionisierende Bestrahlung. Verbindungen, welche den freien -SH-Gehalt von Zellen herabsetzen, machen sie daher empfindlicher gegen Strahlungsschäden. Ashwood-Smith berichtete in einer Serie von Veröffentlichungen (J. Radiat. Biol., 15:285 (1969), daß die Sensitivität von Bakterien und Säugetierzellen gegen γ-Strahlung signifikant erhöht werden kann durch eine Herabsetzung des Thiol-Gehalts.
• In vitro durchgeführte Experimente bestätigen diese Erkenntnisse: Mäusen mit aszitischen Sarcoma-180-Zellen (20 Millionen) wurde liposomales Methylglyoxal (120 mg/kg Maus) injiziert. Zehn Minuten nach der Injektion wurden die Mäuse mit einer γ-Strahlenquelle bestrahlt (612 RAD- Äquivalent von 400 R Gesamtkörperbestrahlung, berechnete Lethaldosis LD = 50/30 Tage). Die Behandlung wurde dreimal jeweils in Abständen von vier Tagen wiederholt. Positive Kontrollen wurden der Behandlung mit Methylglyoxal oder der Bestrahlung allein unterworfen. Einen Tag nach der letzten Bestrahlung wurden die Tiere getötet, die aszitische Flüssigkeit gesammelt und die bösartigen Zellen gezählt. Tabelle 3 Kontrolle (allein) RAD = Bestrahlung, MG = Methylglyoxal P % Promotion % , I % = Inhibitor
Beispiel 6 Bekämpfung des Abstoßmechanismus
• Die hier beschriebenen Experimente wurden mit Schweizer Albino-Mäusen (Zufallsvermehrung, weiß, weibliche Tiere, durchschnittliches Körpergewicht 26 ± 3 g; Charles River CD-1-Stamm) und Inzucht-C3HStCrl-Mäusen (zimtgrau, weibliche Tiere, durchschnittliches Körpergewicht 10º2 g; Charles River Stammbuchzüchter aus der L.C. Strong Foundation) durchgeführt und othotopische Hauttransplantate wurden in beiden Richtungen gemacht, d.h. weiß auf grau und grau auf weiß.
• Es wurde Standard Transplantationstechnik angewendet (Billingham, R.E. und W.K. Silvers in Transplantation of Tissues and Cells, The Wistar Institute Press, Philadelphia, S. 8, (1961)) : Von mit Nembutal anästhesierten Tieren wurden 4 bis 6 "pinch"-Transplantate (volle Dicke, 3 bis 4 mm im Durchmesser) der dicht geklammerten und sterilisierten Haut vom Brustkorb aufgenommen und unmittelbar transplantiert. Die Transplantate wurden in den "Betten" (anstelle der pinch-Transplantate) positioniert und durch "tulle gras" (vaselinimprägnierte Gaze) und durch gipsimprägnierte Bandage um den Thorax in dieser Position fixiert.
• Die Bandagen wurden am sechsten bis neunten Tag nach Transplantation entfernt und die weitere Entwicklung der Transplantate durch makroskopische Beobachtung verfolgt.
• Es wurden positive und negative Kontrollen auf Hautabstoßung gleichzeitig gemacht:
• 1. Vier positive Kontroll-Isotransplantate (weiß zu weiß und grau zu grau) wurden bereitgestellt. Sie zeigten eine Konfluenz und Vereinigung der zugeschnittenen Transplantate mit der umgebenden Haut und "Betten" in sieben bis zehn Tagen. Am 21. bis 28. Tag hatte die Fell-aufweisende Haut einen vollständig neuen Wuchs von Haaren regeneriert, welcher nicht vom ursprünglichen Bewuchs hinsichtlich Farbe, Dichte und Orientierung zu unterscheiden war.
• 2. Vier negative Kontroll-Heterotransplantate (weiß zu grau und grau zu weiß) wurden ohne Behandlung bereitgestellt. Sie zeigten keine Konfluenz und Einheitlichkeit mit dem umgebenden Gewebe, welches örtlich Entzündungen aufwies. Am 10. bis 12. Tag nach Transplantation waren intravasculare Thromben, kapillare Risse und Austreten von Blut die ersten Zeichen, daß die Transplantationen Nekrose und Abstoßung entwickelten, was dann auch am 18. bis 25. Tag eintrat.
• Die Heterotransplantate mit Behandlung erfolgten in drei Versionen mit liposomalem Methylglyoxal (mit jeweils einer Dosis von 3,744 mg/kg/Tier/Tag) intravenös verabreicht in einer Gesamtmenge von 1,0 ml/Tier/Tag.
• a. Die Tiere wurden zehn Tage mit der Zusammensetzung behandelt, bevor die Transplantate ausgetauscht wurden, und die Behandlung wurde beendet am Tag der Transplantation.
• b. Die Tiere wurden nicht behandelt, bevor die Transplantate ausgetauscht wurden, die Behandlung jedoch begann am Tag der Transplantation und dauerte zehn Tage fort.
• c. Tiere wurde zehn Tage mit der Droge behandelt, bevor die Transplantate ausgetauscht wurden, die Behandlung wurde für 25 Tage nach der Transplantation fortgeführt. Tabelle 5 Versuch Zahl der Mäuse Transplantat* Behandlung+ Ergebnisse Postive Kontrolle Negative Vorbehandlung für 10 Tage Nachbehandlung für 10 Tage Vorbehandlung für 10 Tage und Nachbehandlung für 25 Tage 100%ige Akzeptanz in 21-28 Tagen 100%ige Abstoßung in 10-25 Tagen %ige Abstoßung am Tag Keine Abstaßung am 26.-30. Tag + Behandlung: Tägliche Injektion mit 3,744 mg/kg Methylglyoxal-Malcimid in 1,0 ml Salzwasser, durch intraperitoneale Applikation/Maus/Tag * Das w steht für weiße Mäuse (Swiss Albino, Zufallsvermehrung, Charles River CD-Stamm). Das g steht für zimtgraue Mäuse (C3HStCrol, Inzucht-Stamm) ANMERKUNG: Die Prozentwerte in den Resultaten sind kummulative Werte
Beispiel 7 Wirkung von α-Ketoaldehyd (KA) auf die Proliferation von Schimmelpilzen (Fungi) in vitro (1) Stammlösungen in 26 % 2-Propandiol:
• Methylglyoxal (MG) (Molgewicht: 72,06) 0,958 M
• Chlormethylglyoxal (CMG) (Molgewicht: 106,51) 0,995 M
• Dichlormethylglyoxal (DCMG) (Molgewicht: 140,45) 0,854 M
(2) Mikroorganismen:
• Penicillium notatum
• Aspergillus niger
• Anmerkung: Zahlreiche L. penicillium, eine Gattung von Schimmelpilzen, werden gelegentlich als Parasiten an Menschen gefunden (nämlich P. montoyai, P. buffardi, P. minimum usw.), andere, wie P. notatum, werden in der Käseindustrie eingesetzt.
• L. aspergillus, eine Gattung von ascomycetous fungi, umfaßt einige der einfachen Schimmelpilze. Einige von ihnen sind wie A. auricularis, A. barbae, A. mucoroides usw. A. niger wird im äußeren Ohr gefunden und verursacht Otomykosis. Es verursacht auch Krankheiten in Tieren, welche Korn konsumieren, das damit infiziert ist.
(3) Versuch:
• Die Mikroorganismen wurden auf Saburand's Dextrose Agar (Scott) bei 35ºC als Stammkulturen gezogen. Für Versuchszwecke wurden die Sporen auf Mueller-Hilton-Agarplatten (7 cm Durchmesser) gegeben. Die Testverbindungen wurden auf Testplättchen "sensi disks", 6 mm Durchmesser, Whatmann Nr. 17 Papier) auf die Schalen in Volumen von 10, 20, 30, 40 ul mit dem Lösemittel, aufgemacht auf 40 ul Schalenvolumen mit dem Lösemittel. Die Platten wurden bei Raumtemperatur und in der Dunkelheit für 40 Stunden inkubiert. Der Durchmesser der Hemmhöfe um die Testplättchen wurde gemessen. Ergebnisse: Penicillin Aspergillus
Anmerkung:
• Mit Penicillin: Starkes Wachstum, scharfkantig, klare Hemmhöfe.
• Mit Aspergillus: Starkes Wachstum, etwas "verwischt"-kantig, klare Hemmhöfe.
• Die Hemmhöfe mit CMG und DCMG blieben unverändert bei der höchsten Konzentration für acht Tage. Dann entwickelte die Penicillin-Platte einen zweiten Ring um den Hemmhof: eine weiße Zone durchschnittlich 10 bis 15 Millimeter im Durchmesser. Unter dem Mikroskop wurde festgestellt, daß die Sporenbildung in diesem Bereich inhibiert war, während die Myzelentwicklung nicht beeinträchtigt war. Da der Rest der Platte stumpf grün gefärbt war, was auf die Anwesenheit von Sporen hinweist, zeigen Myzel- und Sporenentwicklung dieses Pilzes eine verschiedene Sensitivität zu Methylglyoxal (MG).
Beispiel 8 Effekt von α-Ketoaldehyd auf die Proliferation von Candida albicans
• Candida albicans (C. cerviceae) ist eine Hefe, die zu über 90 % im normalen menschlichen GI-Trakt anwesend ist. Die Zahl wird durch das Immunüberwachungssystem (ISS) relativ konstant gehalten. Weiterhin verursachen Immunsupressoren wie antineoplastische Drogen generalisierte Candidiasis bei immungeschwächten Patienten: 15 - 35 % der Leukämiepatienten sterben an Candidiasis. Andere Krebsfälle weisen hohe C. albicans Infektion als Todesursache auf.
• Candidas sind sehr wirksame Hefen, die sich ohne weiteres den meisten Konditionen anpassen. Sie sind refraktär Antibiotika gegenüber. 5-Flur-cytosin (5FC) ist ein wirksames Agenz, jedoch mit einer kurzlebigen Aktion: es durchdringt die Zellwand von albicans, jedoch nicht die Zellwand von menschlichen Zellen. Es weist somit eine niedere Toxizität gegenüber dem Wirtsorganismus auf, während nach einer kurzzeitigen Aktion die albicans adaptieren.
• Candida albicans wurde von Dr. Scott, Hoffmann La Roche, erhalten.
1. Stammlösungen
• Stammlösungen der folgenden Testverbindungen, ausgenommen DOV, wurden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst. DOV wurde in Wasser gelöst. Methylglyoxal Chlormethylglyoxal 3,3 Dichlormethylglyoxal 3-Acetylmethylglyoxal N-Hydroxyacetonylmaleimid Kethoxal 2,4-Dioxovalerin-Säure Maleimid Phenylglyoxal (begrenzte Löslichkeit) 5-Fluorcytosin Amphotericin-B
2. Aktivitätsversuch:
• C. albicans aus klinischen Proben isoliert wurde bis zur Trübung in SubbaRow's-Medium bei 35ºC gezüchtet. Eine Impföse mit Hefesuspension wurde gleichmäßig auf der Oberfläche einer Mueller-Hilton-Agar-Platte (7 cm Durchmesser) mit einem sterilen Baumwollapplikator ausgebreitet und zwei Stunden inkubiert. Die Testverbindungen wurden auf die Oberfläche der Testplättchen (Whatmann Nr. 17 Papier, 6 mm Durchmesser) in einem Volumen von 5, 10, 20 und 50 ul Stammlösung plaziert und zu einem Endvolumen von 50 ul mit Kochsalzlösung aufgemacht. Die Platten wurden sodann abgestellt und bei einer Temperatur von 37ºC 24 Stunden (*) und 48 Stunden (**) gehalten und sodann die Durchmesser der Hemmhöfe festgestellt. Die Platten wurden auch fotografiert. 3. Ergebnisse: Test Verbindungen mm Durchmesser Hemmhöfe vernachlässigbar
(B) Inhibierung von C. albicans 1. Stammlösungen
• wie oben angegeben
2. Aktivitätsversuch
• Es wurde eine Stammkultur von C. albicans eingesetzt. Von der aus klinischen Proben isolierten Hefe wurde eine Stammkultur (Nachfolgekultur) auf halbfestem "Trypsoy"- Agar-Platten angelegt. Eine Impföse des Mikroorganismus wurde auf SubbaRow's-Medium (SRB, 5 ml) überführt und die Wachstumsrate 12, 24 und 38 Stunden bei 36ºC beobachtet. Eine gleichmäßig gute Wachstumsrate wurde mit den Nachfolgekulturen bei beliebigen Inkubationszeiten festgestellt. Aus den Nachfolgekulturen wurden alle 48 Stunden Übertragungen in SRB vorgenommen, um den Versuchsstamm für Versuche zur Verfügung zu halten. Aus den 24 bis 48 Stunden-SRB-Kulturen wurde eine Impföse trüber Lösungen überführt und entweder auf (a) Trypsoy-Agar-Platten oder auf (b) EBM-Agar-Platten, welche mit Pferde- und Kalbsserum angereichert waren, ausgebreitet und 24 bis 48 Stunden bei 36ºC inkubiert. Die Plattenkultur (a) zeigte starkes Wachstum in 24 Stunden, während Plattenkultur (b) nur leichtes Wachstum sogar bei 48 Stunden erkennen ließ. Platte (a) wurde ausgewählt zu Versuchen hinsichtlich der Wachstumsinhibierung mit Ketoaldehyden.
• Ein Milliliter SRB-Kultur (24 bis 48 Stunden Wuchs) wurde mit 10 ml Trypsoy-Agar gemischt, auf 38ºC erwärmt und schnell in sterile Petrischalen gegossen (7 cm), gleichmäßig ausgebreitet und verfestigen lassen. Die ausgewählten Testverbindunden (in 30 ul Gesamtvolumen, wie oben) wurden in Testplättchen (6 mm Durchmesser, Whatmann Nr. 17) auf die infizierte Agar-Oberfläche aufgebracht. Die Platten wurden 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das Ausmaß der Inhibierung, klare Zonen um die Testplättchen herum, wurde gemessen und registriert. In einigen Fällen wurden auch Kontaktfotografien mit den Platten gemacht (Die dunklen Zonen auf den Bildern (kein Wachstum) sind die Inhibierungsbereiche von C. albicans.
• Die Versuche wurden durchgeführt, um Variationen der Inhibierung aufzufinden im Hinblick auf (i) die variable Menge an Hefe und (ii), einem dreidimensionalen Bereich der Platten. Jedes Ergebnis ist das statistische Mittel von 20 Versuchen mit verschiedenen Mengen von C. albicans. mm Hemmhofdurchmesser (30 ul Test, 24 Std. Inkubation) Anmerkung: s+/- ist die Standardabweichung
• Anmerkung: Mit großem Inoculum sind die Inhibierungseffekte deutlich festzustellen in 24 Stunden. Mit leichtem Inoculum, obgleich die Inhibierung sehr wenig oder keinen Durchbruch zeigt (zeitweise Inhibierung) erfordert das relativ langsame Wachstum von C. albicans eine Verlängerung der Inkubationszeit bis zu 4 Tagen (wenn der Hintergrund uniform wird).
Beispiel 9 Die Effekte von α-Ketoaldehyden auf die Blutkoagulation (1) Versuch
• 200 ul Thromboplastin (Ortho) wurden mit 10 ul Ketoaldehyd (KA)-Stammlösung gemischt. Es wurden sodann 100 ul citriertes menschliches Blutplasma zugefügt und die Gerinnungsbildungszeit (in Sekunden) wurde mit einem Fibrionometer gemessen. Der Effekt des Ketoaldehyds auf die Koagulationszeit wurde bewertet durch den Vergleich der Gerinnungszeit des KA-behandelten Plasmas mit der unbehandelten Kontrolle. Das Resultat (d%) wurde aus einer speziellen Chart entnommen, welche die Gerinnungsaktivität ausdrückt.
• Alle Messungen wurden dreifach vorgenommen. Der Versuch wurde bei 37ºC (Wasserbad) in speziellen Röhrchen vorgenommen und alle Lösungen wurden vorgewärmt.
2. KS Stammlösungen - in physiologischer Kochsalzlösung
• Methylglyoxal (MG 0,988 M
• Chlormethylglyoxal (CMG) 0,940 M
• 3,3-Dichlormethylglyoxal (DCMG) 0,551 M
• 3-Acetylmethylglyoxal (AcMG) 0,890 M
• Phenylglyoxal (PhG) 0,694 M
• 3-Phenylglyoxal (PMG) 0,856 M
3. Versuche:
• (i) Plasminogen und Ketoaldehyd wurden 1 bis 2 sec. vor dem Blutplasma zugegeben. Ergebnisse: Sekunden Koagulationszeit Gerinnung Kontrolle hart infinit nein
• (ii) Das Plasminogen und KA wurden zu verschiedenen Zeiten Inkubiert, bevor das Blutplasma zugeführt wurde.
Ergebnisse:
• (a) Mit Plasma von einem Patienten mit Prothrombin (Gerinnungszeit 26 s d% = 19). "Normal" (gesund), Blutplasmagerinnungszeit 10 - 12 s d% = 100) Ergebnisse: Inkubationszeit Gerinnungszeit d% Sekunden
• (b) mit normalem Plasma: Gerinnungszeit = 11,7 sec. d% = 100 verdünnt Kontrolle (Ende des Versuchs)
• (c) Ein Vergleichsversuch wurde durchgeführt, worin das Blutplasma durch Blut insgesamt eretzt wurde (Kontrolle

Claims (12)

1. Ein physikalisch gebundener α-Ketoaldehyd zur therapeutischen Anwendung, zum Beispiel zur Behandlung einer durch körperfremde Zellen in einem Wirtsorganismus verursachten Krankheit.

2. Ein α-Ketoaldehyd gemäß Patentanspruch 1, gebildet durch Einschluß eines α-Ketoaldehydes in ein Einkapselungsmittel, zum Beispiel ein Liposom von beispielsweise einer ausgewählten Größe im Bereich von 0,02 bis 25 Mikrometer.

3. Ein α-Ketoaldehyd gemäß Patentanspruch 1 oder Patentanspruch 2 zur spezifischen Eliminierung von körperfremden Zellen in einem Vertebrat-Wirt, und worin zum Beispiel die körperfremden Zellen Krebszellen, durch Bakterien infizierte Zellen, durch Viren infizierte Zellen (zum Beispiel HIV-infizierte Zellen), befruchtete Eier, Pilze, Protisten, Bakterien oder Viren sind.

4. Ein α-Ketoaldehyd gemäß Patentanspruch 1 oder Patentanspruch 2 zur

(a) Entfernung und Verhinderung der Wiederausbildung der Proteinhülle, wie sie auf einer körperfremden Zelle in einem Vertebrat-Wirt ausgebildet ist; oder

(b) Inhibierung der Teilung einer körperfremden Zelle innerhalb eines Vertebrat-Wirts; oder

(c) Inhibierung der Proteinsynthese in einer körperfremden Zelle innerhalb eines Vertebrat-Wirts; oder

(d) Erhöhung der Effektivität einer Strahlenbehandlung in einem Vertebrat-Wirt; oder

(e) Inhibierung einer Transplantat-Abstoßung in einem Vertebrat-Wirt; oder

(f) Inhibierung von Blutkoagulat-Bildung in einem Vertebrat-Wirt; oder

(g) Verhinderung einer Krankheit oder eines Zustandes, der durch Anwesenheit einer körperfremden Zelle in einem Vertebrat-Wirt bedingt ist.

5. Eine Zusammensetzung bestehend aus oder enthaltend ein Liposom, in das ein α-Ketoaldehyd und ein bioaktives Molekül eingeschlossen ist, wobei das α-Ketoaldehyd in dem Lipidanteil des Liposoms eingeschlossen ist, zur Anwendung um das bioaktive Molekül zu einer körperfremden Zelle innerhalb des Vertebrat-Wirts zu dirigieren, zum Beispiel eine körperfremde Zelle im Wirtshirn.

6. Eine Zusammensetzung, enthaltend ein α-Ketoaldehyd eingekapselt in die Lipidphase eines Liposoms, wobei sich seine CO-CHO-Gruppe aus der äußeren Oberfläche des Liposoms heraus erstreckt, und eine therapeutische Verbindung, welche in der wäßrigen Phase des Liposoms eingekapselt ist.

7. Eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein α-Ketoaldehyd, eingekapselt in die Lipidphase eines Liposoms, wobei sich seine CO-CHO-Gruppe heraus erstreckt aus der äußeren Oberfläche des Liposoms, eine therapeutische Verbindung eingekapselt in die wäßrige Phase des Liposoms und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

8. Eine Zusammensetzung nach Patentanspruch 5 oder Patentanspruch 6, worin das Liposom eine ausgewählte Größe im Bereich von 0,02 bis 25 Mikrometer hat.

9. Eine Zusammensetzung enthaltend oder bestehend aus einem α-Ketoaldehyd eingekapselt in die Lipidphase eines Liposoms, wobei sich seine CO-CHO Gruppe aus der äußeren Oberfläche des Liposoms heraus erstreckt.

10. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Liposome des Patentanspruchs 9 in einem pharmazeutischem Trägermaterial enthält oder daraus besteht, wobei das Trägermaterial zum Beispiel für die lokale Anwendung geeignet ist.

11. Verwendung des physikalisch gebundenen α-Ketoaldehyds nach Patentanspruch 1 oder Patentanspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Anwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Krankheit oder eines Zustandes, der durch die Anwesenheit einer körperfremden Zelle in einem Vertebrat-Wirt hervorgerufen wird.

12. Verwendung des physikalisch gebundenen α-Ketoaldehyds nach Patentanspruch 1 oder Patentanspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Anwendung zur

(a) Behandlung oder Prävention von Krebs, bakteriellen Infektionen, viralen (HIV) Infektionen, und Pilzinfektion (zum Beispiel candidiasis); oder

(b) Erhöhung der Effektivität einer Strahlenbehandlung, Inhibierung einer Transplantat-Abstoßung oder Inhibierung einer Blutkoagulat-Bildung; oder

(c) Geburtenkontrolle.