DE3218121A1

DE3218121A1 - Arzneimittel zur tumorbehandlung

Info

Publication number: DE3218121A1
Application number: DE19823218121
Authority: DE
Inventors: Des Erfinders Auf Nennung Verzicht
Original assignee: LESKOVAR PETER DR ING
Current assignee: LESKOVAR PETER DR ING
Priority date: 1982-05-14
Filing date: 1982-05-14
Publication date: 1983-11-17

Description

Die Erfindung betrifft Arzneimittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen. ZahlreicKe Forschungsarbeiten in

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verschiedenen Ländern beschäftigen sich mit den für die Tumor- und Metastasenveränderung verantwortlichen immunologischen Kontrol3 mechanismen und haben bereits jetzt viel zum besseren Verständnis beigetragen. Danach kommt den Makrophagen eine zentrale Bedeutung bei der Erkennung und selektiven Abtötung von Tumorzellen zu. Die überwiegend sessilen Makrophagen gehören zu den Phagozyten, also denjenigen Zellen, die Gewebe trümmer, Fremdkörper, Mikrobien und andere Zellen aufnehmen und verdauen, die amöboid beweglichen Makrophagen zeichnen sich durch einen großen spindelförmigen Zellkern mit zahlreichen Vakuolen aus. Es hat sich nun herausgestellt, daß in zwei kritischen Phasen der Tumorentstehung und -entwicklung, nämlich in der kritischen Frühphase der Erstetablierung von spontan oder induziert transformierten Einzelzellen und in der zweiten kritischen Phase der Metastasenbildung nach Dissipation und Ansiedlung der Primärtumorzellen in Sekundärorganen die Aktivierung der für die natürliche Immunabwehr gleichfalls verantwortlichen NK-,NC- und K-Leukozyten nur über aktivierte Makrophagen verläuft bzw. nur in deren Anwesenheit funktioniert. Nach einigen Untersuchungen sollen selbst bei der spezifischen Cytotoxicität der T-Lymphozyten Makrophagen beteiligt sein, dies führt zu einer Erhöhung der Imraunogenität durch Umwandlung der Antigene zu sogenannten Superantigenen. Vorbedingung für die unspezifische Tumorizidität der Makrophagen, die genau zwischen transformierten und normalen Zellen in syn-, allo- und gar xenogenen Systemen unterscheiden können und keine Resistenz, die sonst regelmäßig bei Cystostatika und Bestrahlung beobachtet wird, auslösen, ist deren Aktivierung; nicht aktivierte Makrophagen sind ineffektiv. Nach spezifischer oder unspezifischer Stimuliert werden Makrophagen selektiv tumorizid. Diese Eigenschaft ist so ausgeprägt, daß bisher noch keine Tumorzel1subpopu- lationen beobachtet worden sind, die den aktivierten pr\py

Makrophagen gegenüber Resistenz entwickeln würden, im Gegensatz zu der regelmäßig beobachteten Resistenz einiger weniger Tumorzellclones gegenüber allen Cytostatika und Bestrahlung. Dieser Umstand ist deshalb von besonderer Bedeutung, da man heute weiß, daß jeder Tumor aus einer großen Anzahl von Subpopulationen besteht, die sich im Phänotyp, Karyotyp, Rezeptoranwesenheit, Immunogenität, Antigenstruktur, Metastasenneigung und Ansprechbarkeit auf Cytostatika und Bestrahlung unterscheiden. Durch die Resistenz der Subpopulationen können Tumore später zu Rezidiven führen. Durch die selektive Abtötung der nicht resistenten Tumorzeil cones gewinnen die resistenten Tumorzellen sogar einen Selektionsvorteil. Dies wird besonders plausibel, wenn man die Erkenntnisse amerikaniscl Forscher ins Auge faßt, wonach Subpopulationen innerhalb des Primärtumors eine große phänotypische Diversität entwickeln, sobald sie aus dem Tumorzusammenhang, wie z.B. bei Versuchen in Form der Monoklonierung mit anschließender Koloniebildung, befreit werden. Die Zellen unterliegen danach im Tumorgewebe einer gegenseitigen Kontrolle. Wie Forschungen in Israel festgestellt haben, kontrolliert der Primärtumor auch die Metastasen, die nach Entfernung des Primärtumors "explodieren" können. Auch im Tierversuch zeigt sich, daß eine niedrige Zahl von Tumorzellen zwar zu kleinerem Tumor führt, die Metastasien jedoch ausgeprägter sein kann. Da die Aktivierung von NK-ZeI] en, die in erster Linie für die Verhinderung des Angehens von den ersten transformierton Zellen und später von (lon disseminierten Tumorzellen in den Prämikrometastasen verantwortlich gemacht werden, über die Makrophagenaktivierung verläuft, ergibt sich daraus die zentrale Rolle der Makropliagen bei der Bekämpfung von Tumorzellen. Es ist auch bereits bekannt, daß die Makrophagenaktivierunj eine direkte Funktion der Immunstimulatorzugänglichkeit

ist, wie am Beispiel der immunpotenzierenden synthetischen Polyanionen oder am Beispiel von bakteriellen Lipopolysachariden gezeigt werden konnte.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Zugänglichkeit von Immunstimul artien oder Cytotoxika zu verbessern. Zur Lösung dieser Aufgabe werden Arzneimittel vorgeschlagen, die dadurch gekennzeichr sind, daß sie einen Gehalt an in Liposomen und/oder Erythrozyten enkapsulierten Immunstimulantien oder Cytotoxika aufweisen, wobei die Tranport-Liposomen bzw. -Erythrozyten im Falle der Cytotoxika an der Oberfläche mit assoziierten oder kovalent gebundenen tumorspezifischen Immunglobul inen beladen sein müssen. Die Liposomen sind diskrete Zellpartikel, die im wesentlichen aus Phopholipiden bestehen und in multilamellärer Form vorliegen. Die Liposomen werden in erster Linie durch Makrophagen phagozytiert bei der sogenannten "clearance" der Liposomen aus der Blutbahn. Nach der Phagocytose werden die in den Liposomen enthaltenen Verbindungen über Phagolysosomen in das Cytoplasma internasiliert. Wie man bereits von Untersuchungen mit Liposom-enkapsuliert Muramyl-Dipeptiden oder MAF (makrophagen-aktivierender Faktor her weiß, üben diese immunstimulierenden Substanzen schon in einer Konzentration, die nur l/5oo bis 1/20.000 der Dosierung der gleichen Substanz im liposomfreien System beträgt, auf die Makrophagen eine starke stimulierende Wirkung aus. Die Liposomen lassen sich nach dem in Cancer Research 39> 88l pp J979 beschriebenen Verfahren mit verschiedenen Verbindungen beladen, wobei im vorliegenden Fall Immunstimulantien oder Cytotoxika angesetzt werden. Anstelle der Liposomen können auch autolo homologe heterologe, gegebenenfalls vorbehandelte Erythrozyten, gut phagocytierbare, inaktivierte Bakterienstämme oder auch homo- oder heterologe Makrophagen, die

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zuvor In-vitro die Itnmunstimulator-enthaltenden Erythrozyten internalisiert hatten, eingesetzt werden. Auf diese Weise lassen sich die Immunstimulatoren in hoher Konzentration und gezielt an die Zielzellen und die körpereigenen Makrophagen weitergeben.

1. Als tumorspezifische Itnmunstimulantien eignen sich erfindungsgemäß:

1.1. Membranfragmente und/oder Membranextrakte von Metastasenzellen

1.2. Membranfragmente und/oder Membranextrakte von in ihrer Oberflächenstruktur gezielt veränderten Primärtumor- und Metastasenzellen wobei die Ausgangstumorzellen mit heterophilen Antikörpern voropsonisiert sein können.

Die gezielte Membran- (Zeil oberflächen-) Veränderung kann durch nachfolgende Behandlungsarten verwirklicht werden:

1.2.1. Behandlung der Tumorzellen mit Lektinen und Protektinen

1.2.2.1. mit concanavalin A (Con A), welches spezifisch die dL-D-Gl uco.se und .s-D-Mannose-Saccharidengruppei an der Zelloberfläche bindet

1.2.1.2. mit WGA (Agglutinin aus Weizenkeimlingen), welches für die endständigen N-Acetyl-D-Glucosamingruppen spezifisch ist

1.2.1.3· mit SDA (Agglutinin aus Sojabohnen), das mit den N-Acetyl-D-QJ actοsamin-Endgruppen spezifisch

reagiert
1.2.1.4. mit dem Agglutinin aus Ricinus communis, welches spezifisch die D-Gnlnctose- und L-Arabinose-Endgruppen bindet.

Weitere interessante PflanzenagRlutinine sind noch Extrakte aus Lotus tetragonolobus, Phaseolus limensis, Dolichos biflorus, Limabohnen (PHA) Phytolacca americana, Laburnum alpinum, Vicia cracca, Sophora japonica, solanum tuberosum, Satnbucus nigra, Maraamius oreades u.a.

Auch proteolytisch teilgespaltene Lektine, die ihre Spezifität beibehalten haben, sind interessant, weil sie die Kontaktinhibition restaurieren und die Oberfläche von Tumorzellen immunogener gestalten können. Sehr interessante Gruppe stellen.auch die Protektine dar. Zu diesen tierischen Agglutininen gehören Extrakte aus Helix pomatia, Helix hortensis, Otala lactea, Salmo sal ar, Salmo irideus etc.

1.2.2. Behandlung der Tumorzellen (Primärtumor- und Metastasenzellen) durch Enzyme, die die Oberflächengruppen abspalten

1.2.2.1. mit RDE (-"receptor destroying enzyme", Neuraminidase, sialidase): Abspaltung der en&tä'ndigen Neuraminsäure-Einheiten

1.2.2.2. mit spez. Glycosidasen (J^- und ß-Glycosidasen): Abspaltung endständiger Saccharideinheiten

1.2.2.3· mit spez. Glycosaminidasen (Mucopolyaaccharidasen Abspaltung endständiger Glycosamine bziv. Oberfl ächenmucopolysaccharide

1.2.2.4. mit proteolytischen Enzymen (pronase, Papain u. Trypsin): Abspaltung von Mucoproteiden u. Lipoproteiden der Zelloberfläche

1.2.2.5- evil.leichte Behandlung mit Elast(in)ase, CoI1agcnase, Phosphatase u. RNase.

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1.2-3- Behandlung der Turnorzellen mit Perjodat

1.2.4. Vorsichtige Vorbehandlung der Lyophilisierten Tumorzellen durch lipoide Lösungsmittel

1.2-5· Behandlung der Tumorzellen mit Iodoacetat oder Iodoacetamid oder N-Athylmaleimid, die alle mit den Sulfhydrygruppen reagieren

1.2.6. Behandlung der Tumorzellen mit Dinitrophenylaminocaproat oder TNBS (2,k,6-Trinitrobenzylsulfonsäure)

1.2.7- Behandlung der Tumorzellen mit (DNCB)

(Dinitrochlorbenzol) oder DNBB (Dinitrobrombenzol)

1.2.8. Behandlung der Tumorzellen mit Formaldehyd-Lösung oder Guanidin/Harnstoff. Die milde Behandlung der Tumorzellen mit Formalin ist deshalb von besonderem Interesse da, wie bei Diphterie-Toxoid, die immunologisi Spezifität nach der Behandlung der Zellen nicht verloren geht und man von einem weiteren Vorteil profitieren könnte, nämlich der Tatsache, daß Antisieren gegen ein mit Formaldehyd behandeltes Protein Kreuzreaktivi mit anderen formaldehydbehandelten Proteinen (Zellen) eingehen, se bst wenn zwischen den nativen Formen der Proteinzellen keine Kreuzreaktivität besteht. Die letztgenannte Eigenschaft formal inbehandelter Zellproteine dürfte nur ein Sonderfall einer allgemeineren Beobachtung sein, wonach denaturierte Protein sehr oft immunologische Kreuzreaktivität aufweisen. Diese Eigenschaft formal inbehandelt er Tumorzel1-Oberflächenproteine könnte eine wichtige Rolle bei der angestrebten Durchbrechung der "smal1-dose"-Paralyse gegenüber Tumor-, si)oziell Metastaspnzel 1 en spielen.

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1-2.9- Behandlung der Tumorzellen mit Glutardialdehyd 3.2.1ο. Behandlung der Tumorzellen mit Picrylchiorid

1.2.11. Behandlung dor Tumorzellen mit einigen Farbstoff' die mit Proteinen (der Zeil oberfläche) stabile Verbindungen eingehen, zum Beispiel: Coomassie R-25o; Amjdoschwarz 1 oB; Nigrosin; Dibromotrisulfofluorescein; Procion Brilliant Blue RS; Fast Green (F.C.F., Food Green 3); Xylene Brilliant Cyanine G (Coomassie Brilliant Blue G 25o) Red W und FDNB

1.2.12. Kovalente Bindung von Proteinen (flags") und kontrolliert synthetisierten Polypeptiden an Primärtumor- und bevorzugt an Metastasenzelloberflächenstrukturen zwecks Immunogenitätssteigerung.

Synthetische Polypeptide können linear oder verzweigt sein, z.B. in Form eines Hauptstranges mit Seitenketten. Sie können aus einer einzigen Aminosäureart aufgebaut sein, z.B. als Poly-d,1-Alanin oder Polytyrosin oder auch aus 2 oder 3 verschiedenen Aminosäuren kombiniert Werden diese Ketten als Heptene an Antigene angehängt, so können sie die Immungenität des Träger-Antigens günstig oder ungünstig beeinflussen. Poly-d,1-Alanin als Hapten setzt die .Immunogenität des Trägers herab. Polytyrosinketten steigern die Immunogenität des Trägerantigens und können sogar Gelatine immunogen machen. Im allgemeinen steigert Verschiedenheit der Aminosäuren eines synthetischen Antigens seine Immunogenität. Wesentliche Anforderungen an ein solches Antigenmolekül sind eine stabile Grundstruktur, eine nicht zu hohe elektrische Ladung und Position der imraunogßn wichtigen Tyrosine an den exponierten Stellen der Seitenkett

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Die kovrlente Bindung von immunogenitätssteigernden Proteinen an die Tumorzelloberfläche kann mit Hilfe der speziell in der Affinitätschromatographie vielfach erprobten Techniken wie EDAC, BrCN, N-Hydroxysuccinimid-Ester und BDB (Bis-diazobenzidin) erfolgen.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung über hexaazotiertes Pararosanilin. 1.2.13· Di elmmunogenität könnte gesteigert und die "low-zone"/"1ow-zone"/"smal1-dose" Toleranz durchbrochen werden, wenn Primärtumor- und vorzugsweise Metastasenzellen mit Myelomzellen hybridisiert und Zellmembranfragmente und -extrakte so gebildeter Hybridome als Liposom-Enkapsulate injiziert werden.

Man weiß von den Versuchen mit den (nichtenkapsulierten) Interspezies-Hybridomzellen her daß diese Hybridome nach der Inokulierung zum Unterschied zu den ursprünglichen Tumorzellen nicht angehen, weil sie wegen der homoloj oder heterologen Histokompatibilitätsantigene an der ZeIlob<;rf1äche immunologisch abgestossen werden. Dies ist ein wichtiger Gesichtspunkt bei den .Überlegungen zur Durchbrechung der oben erwähnten "1ow-zone"/"small-dose"-Toleranz also der Paralyse des Immunapparates in 2 kriti Abschnitten dor Tumorentwicklung, in der Frühph der Etablierung erster transformierter Zellen und in der 2. äußerst kriti:sehen Phase der Etabii «-rung dissorainiertor Mctasinsenzellen in Kolonion (Prämiltrometastnsen), wodurch ein kurabler Primärtumor zum inkurablen Metastasenbegleiteten Tumor wird. Die Tatsache, daß disse minierie Turnorzellen als gut zugängliche Einzel

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und Mikroaggregate in Her Blutbnhn dor immunologischen Surveillance entgehen können, l^:ißt sich kaum anders als durch die erwähnte "low-zone"/"small-dose"-Paralyse deuten. Ausschlaggebend dürfte hierbei das ".shedding" der(Tumor (neo) antigene) (TATA₁TSTA) in die Blutbahn sein, d.h. das persistierende, gleichmäßige Ausscheiden von geringen Mengen (schwacher) Immunogene, der labilen und speziell in Form von Immunkomplexen leicht von der Tumorzellmembran ablösbaren Tumorantigene.

Der erfindungsgemäße Vorschlag, durch gezielte Veränderung der Tumorzelloberfläche, sei es durch kontrollierte enzymatische oder chemische Behandlun bzw. kovalente Kopplung von immunogenitätssteigermi Proteinen und synthetischen Polypeptiden, sei es durch Hybridisierung (Interspezies-Zellhybride), die Kreuzreaktivität zu erhöhen und durch diese Xenogenisation "schlafende", inaktive Clones der kleinen Lymphozyten("memory cells") zur Proliferati und zellvermittfilter Zytotoxizität anzuregen, erhäl starke Impulse in neuesten Erkenntnissen der Immungenetik, wonach, wie am Modell des 3-1'L-Tumors gezeigt, inokulierte Tumorzellen nur in jenen Mäusestämmen zur Metastasierung befähigt waren, die einen identischen H-2 -Haplotyp aufwiesen. So geringe Unterschiede wie beispielsweise Differenzen im H-2^k, h-2^d, H-2^a oder H-2^S-Haplotyp des MHC der Mausest; mme reichten aus, um das Angehen der Metastasen zu verhindern.

2. Als unspezifische Immunstimulantien eignen sich erfindungsgemäß Liposom- und Erythrozyten-Enkapsulate von:

2.1. Interferon (z.H. Recombinant Interferon A, generell: fibroepithelles leukozitäres und immuninduziertes, d.h. ciurch Antigen- und/oder

Mitogen-Kontakt induziertes Interferon) 2.2. Interferon-Inducers

2.2.1. Polyribonucleotide (stabilisiert mit CM-Zellulose und Polylysin)

2.2.1.1-Einstranghomopolymure poly rl.

2. 2 . 1 . 2 . Doppel stranghoraopol ymere P⁰^-Y rl: rC

poly rA:rU

2.2.1.3-Alternierende Copolymere: poly rI:rC/poly rA:rU 2.2.1.4 Homopolymere-Copolymere: poly rl:poly rC:rG

2.2.2. Polydesoxyribonucleotide (stabilisiert m. CN-Zellulose und Polylsin)

2.2.2.1 Homopolymer e poly dA : dT

2.2.2.2 Polydesoxyribonucleotid-Analoge poly sI:sC

(Thiophosphat an Stelle von Phosphat

2.2-3. Polyribonuclcotid-Aggregate poly rl:rC/DEAE-

Dextran

poly rl:rC/poly-L-Ly s in

(Die Bindung an poly-L-Lysin erhöht die Stabilität)

2.2.4. Niedermolekulare Interferon-Inducers Tilorone (Bis-diäthylamino-äthylfluorenon), kationische Farbstoffe wie Acridin und Quinacrin, Propan-diamin, Mercaptoalkylamine, BL-2o8o3» MA-56,AET,U-25/l66, PMA (=Phorbol-Myristat-Acetat), Cimetidine.

2.2.5* Andere Immunostimulatoren, die z.T. über Interferon-Induktion der Immunabwehr steigern, sind

2.2.5-1 Bakterien und ihre Extrakte (Lipopolysaccharide, Lipid A, Endotoxine, Toxoide) BCG, Brucella abortus, Bruceila melitensis, Corynebacterium parvum, Haemophilus influenzae, Klebsieila aerogenes, Listeria monocytogenes u.a.

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2.2 ·5·2. Lektine und Protektine, z.T. proteolytisch vorgespalten ConcanavalIn A, WGA, SBA, PHA, PNA, Phytohämagglutinine (Lektine) aus Phaseolus limensis, Lotus tetragonolobus, Dolichos biflorus, Phytolacca americana etc. sowie Protaktine aus Helix hortensis, Helix pomatia, Otala lactea, Salmo salar, SaI mo irideus etc.

Von besonderem Vorteil sind Kombinationen ι von 2.2.3.I. und 2.2-3.2. z.B. von BCG und Con A sowie von 2.2.3-2. und Neuraminidasevorbehandelten 2.2.3.1· z.B. PNA (=peanut agglutinin) und Neuraminidasevorbehandelten BCG. Der Effekt kann durch gleichzeitige Injizierung von unveränderten oder in ihrer Oberflächenstruktur gezielt veränderten (Primärtumoroder Metastasen-) Zellen noch verstärkt werden. Interessant sind auch basische Polymere (Polylsin, Protaminsulfat). An Stelle von BCG kann der Methanol-Extrakt aus BCG (MER) oder die gereinigte aktive Substanz aus BCG (MDP, Muramyl-Dipeptid) verwendet werden.

2.2.5·3· Planzenextrakte Lentinan und Pachymaran bzw. Carboxymethyl-Pachymaran

2.2-5·^· KLH (Keyhole-limpet-hemocyanin, Leatil, Levatnisol, Zymosan, TNP-KLH (Trinitrophenyl-KeyhoIe-Iimpet-hemocyanin)

2.2.5-5· Statolon, Pyran-copolymere (Maleinsäure-Divinyläther-Copolymere), COAM (n.Claes), Levan, Triton WR I339

2.2.5.6. Thymus-Hormon (Thymus-Extrakt)

2.2.5*7· 13-cis-Retinoid, wasserlösliche Selen-Verbindungen (z.B. Na-Selenit) und li-Salze

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2.2.5.8. Oxazolone (ein T-Zeil-Stiraulator)

2.2.5.9. Ca (PO^)₂, BeSO^, Vit.A/Bentonit

102.5.lo. Hiu I u. II, Wax C, US-behandelte Bakterien

3. Zur direkten oder indirekten Unterstützung der aktiven Phagoxytose empfiehlt sich erfindungsgemäß die Liposom-Enkapsulierung von:

3.1. Prostaglandin-Inhibitoren (Indomethaxin, Aspirin)

3.2. Inhibitoren der Enzyme Superoxid-Dismutase und Katalase.

Eine ähnliche Wirkung könnte der lokale Entzug von Ascorbinsäure, Glutathion und Vitamin E als Elektronen-Akzeptoren haben.

Vorteilhaft ist die Enkapsulierung von Peroxydase, weiterhin von Peroxid (Persulfat=Persulfat= Peroxodisulfat,Hypohalid), allein oder mit Halid kombiniert, sowie von Katalase-Inhibitor Aminotriazol, mit dem Ziele, den vom Makrophagen ausgehenden tumoriziden Effekt über H O₀ zu unterstützen bzw. zu stärken. Interessant in dieser Beziehung sind neueste Forschungsergebnisse, nach denen das H_Q0 reduzierende und hiermit inaktivierende Glutathion die Tumorzelle vor Zellyse durch den Makrophagen schützt und durch Unterbindung der Glutathionnachbildung mittels BCNU-vermittelter spezifischer Hemmung des beteiligten Enzyms Glutathion-Reduktase dieser protektive Effekt rückgängig gemacht werden kann. 3-3. Dibutyryl-CAMP, Ionophor A 23 I87 und Mitogene (allgemein), die über die Regulierung des

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intrazellulären Ca die Lymphozytenproliferation stimulieren.

Da die Mitogen-stimulierte Lymphozytentransformation, die die eigentliche Mobilisierung der kleinen Lymphozyten ("memory cells") einleitet,

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nur in Anwesenheit von (extra/.ßl lulärcn) Ca -Ionen erfolgen kann und die Mitogene de Cn -Influx in di<; Lyraphozyten induzieren, und da dieser Ca -Influx durch Dibutyryl-cGMP beschleunigt (und durch Dibutyryl-cAMP inhibiert) wird, ist eine Liposom-Enkapsulierung von Dibutyryl-cGMI¹ als eine der Möglichkeiten zur Anregung der Lymphozyten zur Proliferation in Betracht zu ziehen. Eine weitere Möglichkeit ergibt sich durch die Enkapsulierung von Ionophor A 23187, welches die Lymphozytenproliferation fördert.

Da nach den modernen Theorien die Phagozytose,Exotyzos und die Lysosom-Phagosom-Fusion durch die intrazelluläre Ca -Konzentration überwacht werden, indem die merabranvermittelten Signale über Ca -Influx bzw. Mobilisierung intrazellulärer Ca -Depots den basalen Ca -Spiegel kurzseitig von Io M auf Io -Io M anheben und hierdurch das Funktionieren des intrazellulären Actin/Myosin-Mechanismus im Mikrofilaraent- und Mikrotubuius-System (Cytoskeleton) ermöglichen, kann ein Transport von Ca -Ionen vZ.D. als CaCl , in Liposomen enkapsuliert) durch die Zellmembran unter Umgehung der Membranionensperre zur Makrophagenstimulierung führen, wobei durch die Wahl einer günstigen Ca -Depotform der Effekt protrahiert werden kann. Die Wirkung des oben erwähnten Ionophors A231Ö7 dürfte auf die Mobilisierung des intrazellulären Ca -Depots zurückgehen; interessanterweise können bereits extrem niedrige Konzentrationen des erwähnten Ionophors (Io ) die Zelle (z.B. den Makrophagen) weitgehend unabhängig von extrazellulären Ca und Mg machen.

Da Substanzen mit Affinität für hydrophobe Regionen der Makrophagenmembran dieselbe permeabler für

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(zweiwertige) Ionen machen, kann es von Vorteil sein, die Liposom-Oberflache mit Proteinen, reich an nichtpolaren Seitenketten oder solchen, die durch spezielle Formen der Denaturierung stark hydrophoben Charakter erhalten haben, zu beladen.

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3. h. Da bei Tumorygression niedrige und bei Tumorregression hohe CAMP-Spiegel gefunden wurden und da man eine CAMP-CGMP-Regulierung der Zeilproliferation annimmt, kann eine lokale (intrazelluläre) Stimulierung der Adenylcyclase einen tumorhemmenden Effekt haben, daher Liposom-Enkapsulierung von Theophyllin, Caffein, Catecholaminen (ine 1.Epinephrin,Norepinephrin und Isoproterenol) und anderen cAMP-Stimulatoren (die erstgenannten zwei Methylxanthine erhöhen den cAMP-Spiegel über die Phosphodiesterase-Hemmung, die Catecholamine dagegen über die Adenyl-Cyclase-Stimulierung, oder direkte cAMP-Enkapsulierung.

') . 5 . Liposom-Enkapsulierung von Thioglykol lat (Makrophagen-Aktivator).

k. Erfindurtgsgemäße Stimulierung der Liposom-Phagozytose ("Liposom-Clearance") bzw. der Liposom-Membran-Fusion durch:

k.l. Polyäthylenglybol (PAG=PEG)

PEG verstärkt die Ag/Ak(Antigen/Antikörper) Reaktion. Dieser Umstand ist insbesondere deshalb interessant, da das PEG (in einer rel. hohen Konzentration von ^ιίο%) bei der Zellfusion (Zellhybridierung) nach Köhler und Milstein eingesetzt wird.

Mit PEG kombinierte Liposomen können zu einer erleichterten Phagozytose und hiermit Internalisierung des Liposomengehalts in phagozytierenden Zellen Anlaß geben. Die optimale Konzentration und Polymerisationagrad (Molgewicht)

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des PEG müßten empirisch herausgefunden werden (Orientierungswert :'t?6-ige PEG-Lösung, MG 6000). Eine 'i%-ige PEG-Lösung beschleunigt wesentlich die Ag/Ak-Reaktion und verkürzt die btnötigte Inkubationsdauer.

Eine 12,5%ige PEG-Lösung präzipitiert selektiv die an Antikörper gebundenen kurzkettigen Proteine und Peptide bei homogener ("soluble-phase")RIA.

k.2 Polyvinylpyrrolidon

4.3- Polyvinylalkohol

k.k. Polyvinylacetat

k.5' Hydroxyäthylstärke

Ί.6. Dextran, Dextransulfat, Polysucrose,

Dextran (poy) phosphat xnd Phtalsäure-Ester Dextran (z.B. als 'i%ige Lösung) und Polysucrose (z.B. als l't%-ige Lösung) erhöhen die Rosettenbildung (Bindung von SRBC and T-Lymphozyten); es werden auch bei minimaler SRBC-Beladung (Opsonisierung) mit Immunglobulinen Rosetten gebildet und die Empfindlichkeit gesteigert, Von der hämatologisch-imtnunologischen Arbeit her kennt man die gute Verträglichkeit der unter 3-6. aufgeführten Substanzen.

Bekanntlich wird Dextran zur Leukozytensedimentierung und als Blutexpander verwendet.

PhtaLsäure-Ester werden zur Gradientenzentrifugation der Zellen verwendet.

4t«7· Geringer Zusatz (bei lokaler Anwendung) von

Ammonsulfat
Ammonsulfat erleichert den Ag/Ak-Kontakt

^;*-8. Cholesterol

Das freie und das (an der C -Hydroxylgruppe) veresterte Cholesterol können einen wichtigen

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Einfluß auf die Inkorporation von Liposon-.en ausüben. Es sollte in MuI ti!amellarvesikeln integriert werden (Cholesterol-haltige Liposonivesikeln). Interessant Kare seine Wirkung auf Fusion und Phagozytosc unterschiedlich aufgebauter Liposome in Anwesenheit auch von PEG oder DMSO/Glyccrin/Glycerin-monooleat. Die Komplement-Bindung bei der Cytolyse durch T-Lymphozyten erfolgt nur, wenn der Membrangehalt an freiem Cholesterol 35 Molprozente überschreitet, während die Antikörper-Bindung unabhängig vom CJiol esterol gehal t der Zemmmembran erfolgt.

^li.<). AET: Auch AET erhöht die Empfindlichkeit der Ag/Ak-Reaktion und kann mit Liposomen kombiniert, die Phagozytose und Internalisierung des Liposom-onkapsulierten Materials beschleunigen.

4.1ο. Geringer Zusatz von Ag/Ak-Kontakt erhöhenden Substanzen.

Aus der Immunchemie stammt die Erfahrung, daß die Ag/Ak-Reaktion (Präzipitat-Linie,Halo-Linie durch Formaldehyd (lo^ige Lösung), Tannin (1%-ige Lösung), ß-N'aphtoquinon-'l-sulfonat u. Ninhydrin (je l?oig) intensiviert wird.

U.U. Geringer Zusatz von Zellmembranpermeabilität steigender Substanzen DMSO und Glycerin erhöhen die Zellmembranpermoabilitat. Beide sind gute kryoprotektive Mittel. Eigene

kryobiologische Untnrsucliungen haben gezeigt, daß auch das oben bcsproclicno PEG ausRPzcichnete kryoprc.t t-kt i VO Eigenschaften besitzt.

h . 1 2 . Geringer Zu.sal/. von sorni pol aron Verbindungen (Acetamid, Formamid).

Wogen des halbpolaren Charakters, der zwischen lipophobon und lipophilen Hereichen vermitteln kann,

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sind. Acetamid und Form.inii.d Lm Zusair.mcnhniiy; mit der Liposom-Forschung von Intercssso. ¹1.13 · Geringer Zusatz von ( a )kat ionischen ( b ) anionischen und (c) η ich t ion i se he? π Ton si don. Spuren von Ten.siden ( ober flaehenak fc L von Substanzen) sind wegen ihrer starken Beo in f 1 ussursjc der* Zellmembran und ihrer Rigidität von zentralem Interesse bei dem Studium der Liposom-Zellmembran-Interaktion.

Besonders intersssant sind dabei Verbindungen, bei denen basische Gruppen mit langen aliphatischen Ketten (mit 12 oder mehr C-Atotnen) kombiniert sind, da immunologische Untersuchungen gezeigt haben, daß Verbindungen diesen Typs wie quaternäre Ammoniumverbindungen, substituierte Guanidine und Benzamidine eine klare ndjuvante Wirkung aufweisen.. Dieser Adjuvanscffekt wird mit der Fähigkeit in Zusammenhang gebracht, Zellmembranen aktiv zu beeinflussen. Tatsächlich weiß man von vielen Adjuvantien, daß sie in der Lage sind, Lysosomen in amöboiden Makrophagen aufzulösen wie von Saponin, Vitamin A, Endotoxin· 'i.13·! Beispiele kationischer oberflächenaktiver

Substanzen sind Benzyldimethy1-alkylammoniumchlorid (Ilyamine· 35oo , Benzalkoniumchl orid) ; Benzyldiisobbutylphenoxyäthoxydime thyl Ammoniumchlorid (Benzethoniumchlorid, Ilyamine I622, Phemerol); Cety1trimethylammoniumhromid (CTAB, Hexadecy1-trimethyiammoniumbromid);

N-Benzyl-N, N-dimethy L-N- ( h- 1 ,1,3, 3-t e trarai- thy lbuty 1 )-

äthoxy^
phenoxy/ithyl) -ammoniumch l.orid ; N-Denzy L-N , N-

dimethy1-N-Ci-(I,1,3,3-tetramethylbuty1)-tolyloxyäthoxyäthyl)-ammoniumchlorid

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Ί.13.2 Heispiele anionischer· oberflächenaktiver Substanzen sind Butan-l-sulfonsäure-Na-Snlz ; Dodecan-1-suIfonsäure-Na-SaIz; Hexadecan-1-suIfonsäure-Na-SaIz; Octadecan-l-sulfonsäure-Na-SaIz; Tetradecan-1-sulfonsäure-Na-Salz; Schwefelsäuredecylester-Na-Salz; Schwefelsäureoctylester-Na-Salz; Schwefelsäureoctadecylester-Na-Salz

Ί.13·3· Beispiele teil- oder nichtionischer oberflächenaktiver Substanzen: Nonylphenolpolyäthylenglycoläther; Tetrapropylenbenzolsulfonsäuremethylester; Octylphenolpolyäthylenglycoläther; Polyäthylenglycolmonolauryläther; Polyäthylenglykolmonostearyläther; Polyäthylenglykolmonostearat.

Besonders interessant ist beim Liposom-Studium der kombinierte Zusatz von PEG und Polyäthylenglycolmonolaur^ither (bzw. PEG und sein Monostearyläther oder PEG und sein Derivat Monostearat), d.h. die Kombinierung der Liposom-Phospholipide mit PEG und den aus PEG abgeleiteten nichtionischen Tensiden. Tenside könnten mit Formamid und/oder Acetamid kombiniert werden.

't.l't. Liposom-Enkapsulierung bzw. Phosphatid (Phospholipid) beimischung zum System Mineralöl-Emulgierungsmittel Mannitol-Oleat oder Lanolin) im inkompletten oder kompletten (d.h. mit abgetöteten Mykobakterien versehenen) Freunds Adjuvans könnte den Adjuvansoffekt während der Makrophagensensibilisierung erhöhen. Auch hier können PEG,AET,Tenside, speziell kationische und nichtionische in geringsten Dosierungen weitere Vorteile mit sich bringen. Von besonderem Interesse sind auch quaternäre (Ammonium)basen , da sie schon allein als Adjuvantien wirken können.

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^.15 Liposom-Enkapsulierung bzw. Adsorption an kolloidale Suspension von Aluminiumhydroxyd oder Aluminiumphosphat oder Bentonit/Montmoril1onit, in Kombination auch mit PEG, AET, Tensiden, Mineralöl/Emu 1 ga tor usw. sind ebenso von Vor·t ei 1.

5· Erfindungsgemäße Weiterentwicklung von multilnmellürcn Liposom-Vesikeln

5.1- Bei der Weiterentwicklung der Liposomen zwecks Erhöhung der Interaktion Liposom-Zellmembran und Erleichterung der Internalisierung des Liposominhaltes kommen auch Kombinationen der obenerwähnten Phosphoglyceride mit weiteren Verbindungen in Betracht wie Phosphat tidyLäthanolamin (Cephalin), Phosphatidyliriositol, Diphosphatidykgkycerol (Cardiolipin), Sphingosin ( 4t-Sphingosin(^-Spingenin), Dihydrosphingosin (Sphinganin), Phytosphingosin (Ί-Hydroxysphinganin), 't,8-Sphingadien, Sphingomyelin, Cerebrosid (Gluccocerebrosid, Galactocerebrosid und sein Sulfatester, das SuIfatid, Di-, Tri und Tetrahexosid, saurem GlycosphingolIpid (Gangliosid) u.a. Neben dem erwähnten Lysolecithin (Lysophosphatidylcholin) können noch andere Lysophosphoglyceride (z.B. Lysophosphatidylethanolamin oder Lysophosphatidylserih)sowie synthetische Produkte, die LPA, d.h. die Lysophospholipid-Analoga, wie l-Octadecyl-glycero-3-phosphochoIin, 1-Octadecyl-2-methyl-glycero-3-phosphocholin, l-Stearyl-2-methylglycero-3-phosphocholin, Hexadecylphosphorylcholin und l-Dodecylpropandiol-3-phosphocholin bzw. die entsprechenden Derivate (Analoga) des Lysophosphatidylserins, des Lysophosphattidyläthanolamins und des Lysophosphatidylinositols eingesetzt werden. 5-2. Gegebenenfalls können diese Verbindungen auch in Kombination mit Gallensäuren, ("Chylomicron"-Effekt") sowie mit immobilizirrtnn Loktinen od«»r Protektinen, (z.B. ConA/Sepharose) Vorwondung finden.

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6. Tumorselektive Chemotherapie durch EnkapsuIierung

von cytotoxisehen Substanzen in Liposonien und Erythrozyten, die an der Oberfläche mit tumorspezifiachon Immunolobulinen (in kovalentnr Bindung) beladen sind.

Neben der Stimulierung der körpereigenen Immunabwehr durch bestimmte in Liposomen enkapsulierte Substanzen ergibt sich aber auch die Möglichkeit, die Liposomen zum Transport cytotoxischer Substanzen(an die Tumorzielzelle) , allein oder in Kombination mit Immunstimulantien, einzusetzen, um eine selektive Abtötung der transformierten Zellen bei weitgehender Verschonung von gesunden Gewebezellen zu erzielen, wobei die Liposomen an der Oberfläche mit tumorspezifischen Immunglobulinen beladen sein müssen. •Durch Bindung starker Toxine wie Rizin, Abrin, Modeccin, Gelonin, Diphterie-Toxin etc an die F ( ab ) ,,-Fragment e von Immunglobulinen ist es möglich Chimären, sog. "Immunotoxine" zu synthetisieren, die die Zielzellen, z.B. die Tumorzellen, "aufzusuchen" und selektiv abtöten. Folgende dieser Immunotoxine hat man schon im Tierexperiment oder in der Gewebekultur erfolgreich getestet:

Monoklonal.es IgM-Fragment gegen das Thy 1,2-Antigen, kombiniert mit Rizin A; monoklonale Antikörperfragmente gegen ein kolorektales Tumorantigen, kombinieri mit Rizin A; antiidiotypische Antikörper gegen Immunglobuline eines B-ZeIL-Lymphoms, kombiniert mit Rizin A; IgG(F)ab)_O-Antiserum gegen L 121o Leukemieze11 en, kombiniert mit Diphterie-A-Fragment und F(ab)_O-Antilymphozyten-Globulin, kombiniert mit Diphtorietoxin A. Mit Abrin, konjugiert mit Anti-Thy1.1-F(ab)_o, konnte Lymphom der AKR-Mäuse erfolgreich gehei it werden.

Auch Vinbln.stin, Daunomycin, ADR, Act i tioinyc in 0, Methothrexat , 1-ß-D-Arab ino furanosy1cytos in u.a. wurden als Liposom-Enkapsulate getestet und brachten Vorteile gegenüber der klassischen Verabreichungsform.

6.1. Enkapsulierung von Cytotoxikn/Cytostatika. Erfindungsgemäß können die bei "Xmmunotoxinen" aufgeführten Toxine sowie die bisher in Verbindung mit Liposomen nicht beschriebenen Zytostatika der allgemeinen Klassen Alkylantien (BusuIfnn=Myleran, Chlorambucil-Leukeran, Cyclophosphamid^Endoxan= Cytoxan,DBM=Myelobromal,HN2=Mustargen, Phenylalanin-Mustard, ThIoTEPA=TSPA₁TEM), Antimetabolite (Azacytidin,Cytosin-arabinosid=Ara-C=Cytosar,5-^ Li=5-Fluorouracil, 6-Mercaptopurin=6-MP=Purinetho1, TTG«Thioguanin) , Mi tose-Inhibitoren(Vincristin-sulfat) Antibiotika (Mitomycin C, Dleomycin,VP-l6) sowie andere Zytostatika (BCNU,CCNU,cis-Platinum (II), Hydroxyurea, DTIC,Mitotan-o,p-DI)D und Stathmokinetika (Colcemide,Anguidin) als Liposom - und/oder Erythrozyt Enkap.sulate eine tumorselektive Chemotherapie mit minimalen Nebenwirkungen ermöglichen.

6.2. Kovalente Bindung der Liposome an HPD

Das HPD(=IIaematoporphyrin-Derivat) wird laut neuester amerikan. Literatur selektiv an Tumorgewebe gebunden. Man kann daher die LiDosomen (an Stelle der Ig) an HPD assoziieren bzw. !covalent binden und als Transportmittel für Zyt?statika und Toxine anwenden.

6-3· Kovalente Bindung der Liposome an Hormone (bei hormonabhängigen Tumoren)

Bei hormonabhängigen Tumoren wie Prostata- und Mamma-Tumoren ist eine kovalente Bindung (Konjugierung) von Liposom-Vesikeln an synthetische bzw. halbsynthetische Hormone möglich, da die Hormonrezeptoren die OrganscIektivitat ermöglichten.

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6.4. Kovalente Bindung er Liposome an Tumormarker

Interessant ist auch eine Konjugierung von Liposom-Vosikeln an CEA₁AFP und Tennessee-Antigen, wenn diese Tumorantigene durch Anreicherung und Reinigung z.b. mit Hilfe von HPLC, präparativer Elektrofokussierung, Affinitätschromatographie oder- Chromatofokussierung zur Verfügung stehen.
6.5· Tumorzellproliferationsbeeinflussende Substanzen

Von Interesse sind, bei direkter oder indirekter über Liposom-Transportvesikeln Applikation, Substanzen wie Auxine, indolsubstituierte Carbonsäuren (Indolyl-3-buttersäure), naphtyl-bzw. phenyl substituierte Essigsäuren(1-Naphtylessigsäure), Derivate von Phenoxycarbonsäuren^,4-Dichlorphenoxyessigsäure;2,k,5-Trichlorphenoxy-essigsäure; 2-Methyl-'t-chlorphenoxy-essigsäure) und Derivate der Naphtoxycarbonsäuren(2-Naphtoxy-essigsäure) wegen der Beeinflussung der Tumorzellproliferation. 6.6. Cytochalasin

An Antitumor-Ig kovalent gebundene Liposomen können auch Träger von Cytochalasin sein, welches Störung der Kern-Cytoplasma-Interaktion in der Tumorzelle verursacht.
6-7- Spezifische Inhibitoren von Collagenase III und IV

Nach den allerneuesten Erkenntnissen amerikanischer Forscher sind Collagenase HI und IV (als Exoenzyme) das Merkmal, der Selektionsvorteil, der die metastasierenden Tumorzellinien von den nicht-metastasierenden Subpopulationen

unterscheidet. Eine Enkapsulierung von spezifischen Collagenase-Ilemmern ( ζ . B. von Collagen-Antimetaboliten/St rukturanaloga) in mit Antituraor-Ig beladenen Liposom-Vesikeln ist daher von Interesse. 6.8. Butyrat

Butyrat induziert als "reverse transformation agent" Wachstumshemmung und/oder morphologische und biochemische Redifferenzierung transformierter Zellen.

Im folgenden wird die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert.

Beispiel

Phosphatidylcholin (aus Hühnerei) und Phosphatidylserin (aus Rindergehirn) können in chromatographischer Reinheit kommerziell bezogen werden.

Zur Herstellung von raultilamellären Vesikeln kann man beide Phospholipide im 1:1- oder im 7:3-molaren Verhältnis in Chloroform auflösen. Vorteilhaft ist eine Ί,95=^.95=ο,1-raolare Mischung von Ei-Phosphatidylcholin, Rinder-Phosphatidylserin und Lysolecithin, gelöst in Chloroform, weil sich

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im Versuch gezeigt hatte, daß die dabei entstehenden Liposomen negative Ladui g bzw. ein Zeta-Potential aufweisen, welches eine etwa 12fach erhöhte Phagotytoae bzw. Membranfusionierung als beispielsweise die elektrisch neutralen Liposomen aus Ei-Phosphatidylcho1 in zur Folge hat.

Nach der Choroformvordampfung im Rotationsverdampfer werden wasserlösliche Immunostimulatoren im mit 5-lo% FCS (FBS-Foetale Kalbserum) versehenen Zellkulturmedium (z.B. RPMI l6^o oder CMEM oder TC 199 oder HIlSS) zugesetzt, die Mischungmit einem hochtourigen Gerät 2o-6o min lang emulgiert und die entstandenen, Testsubstanz enthaltenen Liposomen durch auf Injektionsspritzen aufschraubbaren Milliporefilter filtriert. Die Liposome werden auf einen Totallipidgehalt von ca luMol/ml Zellkulturmedium eingestellt und sollten nicht langer als 2k Stunden stehen. Der durchschnittliche Liposomeninhalt soll ca 2~3ul±lo% pro Mol Phospholipid betragen.' Das Liposom-enkapsulierte Material soll den zu stimulierenden Makrophagen in einer Dosierung gegeben werden, daß loo uMol Phospholipid auf I₁Io Makrophagen anfallen. Diese Liposomdosierung entspricht einer absoluten Menge von ca o,25jj1 des enkapsulierten Materials pro I₁Io Makrophagen.

Während bei der mechanischen Mischung der nach Abdampfen des organischen Lösungsmittels und "Emulgierung" inj wässrigen Medium entstehenden Liposomen Vesikeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ^-^ογη\ entstehen, kann der mittlere Durchmesse!- durch Ultraschall-Behandlung der "Emulsion" auf o,o5pn herabgesetzt werden. Die mechanisch erzeugten Liposomen sind aus konzentrischen Phospholipid-Bilayern multilamellar aufgebaut, wobei der

interlaraellare Raum 5^-75^ beträgt. Die durchschnittliche Schichtdicke der Phospho1ipLd-Bi1ayer beträgt 5o X. In diese Zwischenräume wird das wasserlösliche Material wie Immunostimulatoren bzw. Cytostatika und Lektine, in die Liposorn-Bi layer die 1 ipophilen Verbindungen eingebaut. Bei nicht-molekulardispersen Wirksubstanzen wird dieser regelmäßig konzentrische Auf>au gestört, es kommt viel mehr zu einer Art Beladung der partikulären Effektormateria1 en mit multilamellarer Liposomaußenschicht. Die fehlende Antigenität der Liposomaußenschicht verhindert Immunantworten vom verzögerten Typ bei gleichzeitig erleichterter Membranannäherung und Fusion. Durch Ersatz von Dicetylphosphat in einem 1:2:1-Gemisch von Lezithin, Cholesterol und Dicetylphosphat durch Stearylamin kann die negative Oberflächen ladung des Liposome zur positiven umgewandelt werden. Dies ist deshalb von Bedeutung da man beispielswiese von Proteinen, die bei pH7» o-7,'l positiv geladen sind, weiß, daß sie wesentlich höhere Immunogenität aufweisen, wenn sie in positiv geladenen Liposomen enkapsuliert werden. Auch das Lezithin: Cho1 esterol-Verhä1tnis ist wichtig. Günstig ist oft die Oberflächenbeladung der Liposomvesikeln mit'denaturierten Immunglobulinen und

an (aktivem) C3-Komplement. Günstig ist, wie an/derer Stelle erwähnt, die gleichzeitige Applikation von Adjuvantien wie Saponin, M. tuberculosis, B. pertussis u.a. Bei Lipoaom-Injizierung entstehen an der Injektionsstelle keine Granulome. Liposomen zeigten bei der Anwendung beim Menschen keinerlei negativen Effekte, eine rapide Mobilisierung von der Injektionsstelle und eine beträchtliche Retentionszeit in der Lymphknoten. Liposomen sind biodegradierbar.

Claims

ν Arzneimittel zur Tumorbehandlung. Patentansprüche.

1. Intravasal zu verabreichende Arzneimittel zur Tumorbehandlung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an in Liposomen und/oder Erythrozyten enkapsulierten Immunetimulartia oder Cytotoxica.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an in Liposomen und/oder Erythrozyten enkapsulierten, gegebenenfalls einer Membranveränderung unterzogenen Membranfragmenten oder Membranextrakten von Primärtumor- oder Metastasezellen.

3· Arzneimittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an enkapsuliertem Interferon, Interferoninducern und/oder anderen an sich bekannten Immunstimulantien·

km Arzneimittel nach Anspruch 1-3, gekennzeichnet durch einen Zusatz von die Antigen-Antikörperreaktion verstärkenden Substanzen,

5. Arzneimittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Peroxydbildnern, Immunotoxinen oder spezifischen Cytostatika, die in Liposomen und/oder Erythrozyten enkapsuliert sind, welche an der Liposomoberfläche monoklonale oder präabsorbierte Heteroantikörper gegen Tumorantigene (TSTA, TATA) tragen.

ORIGINAL INSPECTED