DE3688936T2

DE3688936T2 - Perfusat zum aufbewahren von organen.

Info

Publication number: DE3688936T2
Application number: DE86906173T
Authority: DE
Inventors: Folkert Belzer; James Southard
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1985-10-03
Filing date: 1986-09-25
Publication date: 1993-12-23
Anticipated expiration: 2006-09-26
Also published as: DE3688936D1; EP0237567A1; US4798824A; AU6404486A; WO1987001940A1; US4873230A; AU608744B2; EP0237567B1; EP0237567A4

Description

Eine Nierenkonservierung, d. h. die Ex-Vivo-Lagerung von Nieren von Leichen, ist ein relativ neues Gebiet. Die Konservierung von Nieren von Leichen zur Transplantation ist in Spitälern allgemeine Praxis; Fortschritte waren jedoch auf das Verfahren von Versuch und Irrtum beschränkt. Obgleich dieses Vorgehen vom klinischen Standpunkt aus gesehen z. T. erfolgreich war, sind die tatsächlichen Prinzipien, die hinter diesen Erfolgen stehen, nicht gut verständlich.
Als die Nierentransplantation sich von einer reinen Forschungsarbeit zu einer klinischen Therapie für den Endzustand einer Nierenerkrankung entwickelte, entwickelte sich die Nierenkonservierung von der Forschungsstufe im Laboratorium zu einem eingeführten klinischen Verfahren. Zur Zeit sind die zwei am meisten verwendeten Verfahren zur Nierenkonservierung die einfache hypothermische Lagerung und die kontinuierliche Perfusion. Bei der einfachen hypothermischen Lagerung, dem gebräuchlichsten Verfahren der klinischen Nierenkonservierung, werden die Organe von der Spenderleiche entfernt und rasch abgekühlt. Dies wird normalerweise durch eine Kombination einer externen Kühlung und einer kurzen Perfusionsperiode erreicht, um die Kerntemperatur so rasch wie möglich zu senken. Die Nieren werden dann gelagert, in eine Spüllösung in einem einfachen Kunststoffbehälter eingetaucht und bei einer Temperatur von 0 bis 4ºC gehalten, indem der Behälter in Eis eingetaucht wird.
Die Vorteile dieses Verfahrens sind seine Einfachheit, die niedrigen Kosten und die Leichtigkeit des Transportes der Organe. Die Zusammensetzung der Spüllösung wurde für eine optimale Konservierung ausführlich untersucht.
Die zweite Methode der Nierenkonservierung, die ausgedehnten Untersuchungen im Laboratorium sowie klinischen Tests unterworfen wurde, ist die kontinuierliche pulsierende Perfusion. Die grundlegenden Bestandteile der kontinuierlichen Perfusion sind (1) ein pulsierender Fluß, (2) Hypothermie, (3) Membranoxygenierung, und (4) ein Perfusat, das Albumin und Lipide enthält. Mit geringen Abänderungen beinhalten alle zur Zeit verwendeten klinischen Konservierungen diese grundlegenden Prinzipien. Es existieren einige Vorteile der kontinuierlichen Perfusion bei der klinischen Transplantation. Erstens stellt die Perfusion ausreichend Zeit zur Verfügung, um die Leichentransplantation teilweise getrennt durchzuführen. Zweitens erlaubt sie einen Lebensfähigkeitstest vor der Implantation. Eine bedeutsame Verbesserung in den Ergebnissen der Transplantation von Leichennieren könnte erwartet werden, wenn die Konservierungszeit auf 5 bis 7 Tage verlängert werden könnte, die erforderlich ist für bestehende Methoden zur Testung gemischter Lymphozytenkulturen.
Die Fähigkeit, menschliche Nieren zwei oder drei Tage lang entweder durch einfache kalte Lagerung nach anfänglicher Spülung mit einer intrazellularen Elektrolytlösung oder durch pulsierende Perfusion mit einer Elektrolyt-Protein-Lösung erfolgreich zu konservieren, hat ausreichend Zeit gebracht für Tests auf Histo-Kompatibilität des Donors und des Empfängers, für einen Nierenaustausch zwischen Transplantationszentren, für eine sorgfältige preoperative Vorbereitung des Empfängers, Zeit zur Bereitstellung vorläufiger Donorkulturresultate, und vaskulare Reparaturen der Spenderniere vor der Implantation. Nieren, die 72 Stunden lang unter Verwendung einer hypothermischen pulsierenden Pertusion mit kryoprezipitiertem Plasma konserviert wurden, erwiesen sich als beträchtlicher Fortschritt bei der Konservierung menschlicher Nieren, und dies ist zur Zeit das bevorzugte Konservierungsverfahren. Eine Nierenorgankonservierung mit eiskalter intrazellularer Elektrolytspüllösung, gefolgt durch einfache kalte Lagerung, wurde für die menschliche Nierenkonservierung bis zu 61 Stunden erfolgreich angewendet.
Serumalbumin, in verschiedenen Formen, wird ausschließlich für die klinische Organkonservierung verwendet, um den notwendigen onkotischen Druck zu erzeugen. Diese Formen schließen kryoprezipitiertes Plasma, Plasmaproteinfraktionen, menschliches Serumalbumin, und Silicagel-behandeltes Plasma ein. Da diese Perfusate aber aus natürlich abgeleiteten Materialien hergestellt werden, sind Variationen unvermeidbar. Es würde deshalb besonders vorteilhaft sein, wenn ein Perfusat, das ein synthetisches Kolloid enthält, verfügbar wäre.
In der Vergangenheit wurde eine große Anzahl synthetischer kolloider Materialien experimentell auf die Wirksamkeit bei der Nierenkonservierung getestet. Diese Kolloide umfassen Dextrane, Polyvinylpyrrolidin, Pluronics, Hydroxyethylstärke (HES), Ficoll, Gummiarabikum und Polyethylenglykol. Keine dieser getesteten Substanzen war so wirksam wie Serumalbumin. HES war jedoch für die Konservierung 24 Stunden lang, und in einige Fällen 72 Stunden lang wirksam. Diese kolloidalen Materialien wurden alle in Perfusaten auf der Basis einer physiologischen Kochsalzlösung getestet. Neuerdings wurde eine hervorragende 24stündige Konservierung einer Hundeniere mit einem Perfusat beobachtet, das Gluconatanionen anstelle von Chlorid zusammen mit menschlichem Serumalbumin (HSA) als kolloid-osmotischen Träger enthielt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Konservierung von Nieren unter Verwendung eines Perfusats, das anstelle von menschlichem Serumalbumin HES enthält, bereitgestellt.
Wie vorstehend angegeben, stellten Perfusate auf der Basis von Serumalbumin (HSA) während der letzten 17 Jahre den Standard für die Konservierung von Nieren sowohl für experimentelle als auch für klinische Zwecke dar. Unglücklicherweise konnten mit diesen Perfusatarten nur Konservierungszeiten von drei Tagen erreicht werden. Obwohl beide Verfahren die Lebensfähigkeit der Niere bis zu drei Tagen konserviert, sind längere Konservierungszeiten konsequent schwierig zu erhalten. Selbst wenn durch diese Verfahren die Lebensfähigkeit bis zu drei Tagen aufrechterhalten wird, werden die Nieren außerdem beschädigt, wie dies durch die erhöhten Post-Transplantations-Creatinin- Serumspiegel und die Zeit der Rückkehr dieser erhöhten Werte auf normale Werte angezeigt wird. Frühere Perfusate wurden aus Elektrolytlösungen ausgewählt, die für intravenöse Infusion leicht verfügbar waren, und im wesentlichen eine extrazellulare Zusammensetzung besaßen.
Bisher waren keine akzeptierbaren Verfahren für eine Nierenkonservierung verfügbar. Diejenigen, die sich als klinisch wirksam erwiesen haben, sind auf eine Kurzzeitlagerung (drei Tage) beschränkt, und auf eine beträchtlich verringerte Lebensfähigkeit. Die vorliegende Erfindung beschreibt die biochemische Zusammensetzung eines Perfusats, das für hypothermisch perfundierte Nieren am besten geeignet ist, und ein neues synthetisches kolloidosmotisches Mittel, das eine beträchtlich verbesserte Langzeitkonservierung ergibt.
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung zur Konservierung eines Organs, das zur Implantation in einem Tier bestimmt ist, bereitgestellt, das in Form einer pharmakologisch annehmbaren Konservierungslösung vorliegt, die Hydroxyethylstärke umfaßt, und die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Hydroxyethylstärke ein Molekulargewicht von 150.000 bis 350.000 Dalton und einen Substitutionsgrad von 0,4 bis 0,7 besitzt, und im wesentlichen frei ist von Ethylenglykol, Ethylenchlorhydrin, Natriumchlorid und Aceton.
Erfindungsgemäß ist das bevorzugte Kolloid Hydroxyethylstärke mit einem Molekulargewichtsmittel von 200.000 bis 300.000 Dalton, insbesondere von 200.000. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Hydroxyethylstärke gegen destilliertes-deionisiertes Wasser oder auf andere Weise behandeltes Wasser dialysiert, um einige Verunreinigungen zu entfernen, von denen es bisher nicht bekannt war, daß sie auf die Wirksamkeit von Hydroxyethylstärkepräparaten einen nachteiligen Effekt besitzen. Die durch den Dialyseprozeß entfernten Materialien sind die kleinsten Hydroxyethylstärkekomponenten, einschließlich Ethylenglykol und Ethylenchlorhydrin-Nebenprodukten der Hydroxyethylierung, sowie das restliche Aceton und Natriumchlorid. Ethylenglykol und Ethylenchlorhydrin sind als toxisch bekannt. Ihre Entfernung ist deshalb, selbst wenn sie nur in geringer Menge vorhanden sind, wünschenswert.
Erfindungsgemäß umfaßt die Nierenperfusat-Zusammensetzung beispielsweise die folgenden Bestandteile, ist aber nicht darauf beschränkt: Tabelle 1
5% Hydroxyethylstärke mit einem Molekulargewicht von 200.000 bis 300,000 und einem Substitutionsgrad von 0,4 bis 0,7.
25 mM KH&sub2;PO&sub4;
3 mM Glutathion
5 mM Adenosin
10 mM Glucose
10 mM HEPES Puffer
5 mM Magnesiumglukonat
1,5 mM CaCl&sub2;
105 mM Natriumglukonat
200.000 Einheiten Penicillin
40 Einheiten Insulin
16 mg Dexamethason
12 mg Phenol rot
pH 7,4-7,5
Die Zusammensetzung enthält deshalb vorzugsweise 5 Gewichtsprozent der Hydroxyethylstärke und besitzt eine Osmolalität von 320 mOSm/l.
Die Kreatinin-Gehalte des Post-Transplantatserums in Hunden, die eine während drei Tagen mit dem Hydroxyethylstärke (HES)- Perfusat konservierte Niere empfingen, werden in Fig. 1 mit denen einer Albumin (HES)-perfundierten Niere verglichen. Mit HES als Teil des Perfusats tritt eine leichte Erhöhung des Serumkreatinins während der ersten 2-4 Tage nach der Transplantation auf, gefolgt von einer raschen Rückkehr zu normalen Werten.
Die Verlängerung der Konservierungszeit mit diesem basischen Perfusat war nicht erfolgreich, bis die Stärke vor der Herstellung des Perfusats dialysiert wurde. Wie in Fig. 2 gezeigt, ergab die dialysierte Stärke eine erfolgreiche Konservierung, obgleich die Nieren etwas erhöhte Serumkreatininwerte zeigten.
Mit dem Perfusat auf der Basis von HES wurde eine 7tägige Konservierung der Nieren erreicht. Wie die Fig. 3 zeigt, überlebten fünf von 17 Hunden (30%) eine 7tägige Konservierung. Bei allen 17 Hunden zeigte keiner Zeichen einer endothelen Beschädigung. Das Perfusat auf der Basis von HES verlängert deshalb die Konservierungszeit über die hinaus, die mit dem HSA-Perfusat möglich war.
Abgesehen vom HES-Zusatz ist das Perfusat vollkommen verschieden von anderen verwendeten Perfusaten. Chlorid wurde durch das höher molekulargewichtige (und weniger permeable) Glukonat ersetzt, um eine hypothermisch induzierte Zellschwellung zu unterdrücken. Adenosin und H&sub2;PO&sub4; wurden eingebaut, um die ATP-Synthese zu stimulieren. Gluthation wird zugegeben, um den Verlust an Gluthation von den perfundierten Organen zu unterdrücken und um als Antioxidans zu wirken. Die K+-Konzentration ist auf 25 mM erhöht, um den Verlust an introzellularem K+ bei Hypothermie zu Interdrücken, und H&sub2;PO&sub4; und HEPES werden als Puffer verwendet. Die Rolle einiger dieser Agentien hat sich während der Konservierung als nützlich für die Nieren erwiesen.

Beispiel 1

100 Gramm Hydroxyethylstärke wurden in 1 Liter destilliertemdeionisiertem Wasser gelöst, um eine 10% w/w-Lösung herzustellen. Die HES-Lösung wurde in Dialysebeutel (34 mm x 18 inches) gegeben, die eine Molekulargewichtsausschlußgrenze von 50.000 Dalton besaßen, und in einen 10-15 l-Behälter mit destilliertem-deionisiertem Wasser gegeben und 72 Stunden lang gerührt. Das Wasser wurde täglich gewechselt, und das HES wurde gesammelt und bis zur Verwendung bei -20ºC eingefroren.

Beispiel 2

In allen Fällen wurden erwachsene Hundemischlinge (15 bis 25 kg) verwendet. Die chirurgischen Eingriffe und die hypothermische pulsierende Perfusions-Konservierung wurden nach konventionellen Verfahren durchgeführt. Die Zusammensetzung des Perfusats ist in Tabelle 1 angegeben. Die Nieren wurden nach 72-stündiger Konservierung transplantiert, gefolgt von einer sofortigen kontralateralen Nephrektomie. Der Serumkreatiningehalt wurde nach der Transplantation täglich bestimmt.
Erfindungsgemäß wird eine verlängerte Konservierungszeit für klinische Organe bereitgestellt, und ein synthetisches Kolloid, das die Veränderungen verringert, die sich bei Perfusaten ergeben, die aus natürlich abgeleiteten Materialien hergestellt sind.
Die vorliegende Erfindung wurde insbesondere unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen im Detail beschrieben; für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist es jedoch klar, daß Abänderungen möglich sind, ohne das Wesen und den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Zusammensetzung zur Konservierung eines zur Implantation in einem Tier bestimmten Organes in Form einer Hydroxethylstärke umfassenden Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxethylstärke ein Molekulargewicht von 150.000 bis 350.000 Dalton und einen Substitutionsgrad von 0,4 bis 0,7 aufweist, und im wesentlichen frei von Ethylenglykol, Ethylenchlorhydrin, Natriumchlorid und Aceton ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxethylstärke ein Molekulargewicht von 200.000 bis 300.000 Dalton aufweist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxethylstärke ein Molekulargewichtsmittel von 200.000 Dalton aufweist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung eine Osmolalität von 320 mOSm/l besitzt.

3 mM Glutathion

5 mM Adenosin

10 mM Gluose

10 mM HEPES Puffer

5 mM Magnesiumglukonat

1,5 mM CaCl&sub2;

105 mM Natriumglukonat

200.000 Einheiten Penicillin

40 Einheiten Insulin

16 mg Dexamethason

12 mg Phenolrot, pro Liter

pH = 7, 4-7,5

7. Verfahren zur Konservierung eines zur Implantation in einem Tier bestimmten Organs, dadurch gekennzeichnet, daß man das Organ mit einer Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche infundiert.

8. Hydroxethylstärke mit einem Molekulargewicht von 150.000 bis 350.000 Dalton, einem Substitutionsgrad von 0,4 bis 0,7, die im wesentlichen frei ist von Ethylenglykol, Ethylenchlorhydrin, Natriumchlorid und Aceton, zur Verwendung zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Konservierung eines zur Implantation in einem Tier bestimmten Organs.