DE60100170T2

DE60100170T2 - Physiologisches medium für perfusion, konservierung und lagerung von isolierten zellen-, gewebe- und organproben

Info

Publication number: DE60100170T2
Application number: DE60100170T
Authority: DE
Inventors: Douglas Rees
Original assignee: RES DEL INTERNAT Ltd; RES-DEL INTERNATIONAL Ltd HENLEY-ON-THAMES
Current assignee: RES DEL INTERNAT Ltd; RES-DEL INTERNATIONAL Ltd HENLEY-ON-THAMES
Priority date: 2000-01-20
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2021-01-23
Also published as: GB0001172D0; US20030077655A1; EP1164841A1; EP1164841B9; AU2696001A; ATE236520T1; EP1164841B1; US6946241B2; DE60100170D1; WO2001052647A1; ES2197140T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Formulierung eines physiologischen, flüssigen Mediums, das die grundlegenden, synergistischen Komponenten enthält, um seine universelle Verwendung bei der Konservierung der zellulären und funktionalen Integrität in vitro von verschiedenen Zell-, Gewebe- und Organtypen zu ermöglichen, die aus verschiedenen Säugetierspezies isoliert sind.
Historisch geht das Muster von physiologischen Perfusionslösungen zurück auf die von dem französischen Physiologen Claude Bernard in den 1870er Jahren vorgeschlagene These, der seine Theorie über das Milieu interieur vorstellte, die grundsätzlich darauf hindeutete, daß, um das Gesamte (Person) aufrechtzuerhalten, man sicherstellen sollte, daß die umgebenden, extrazellulären Bedingungen in allen Beziehungen ausgeglichen sein sollten. Leider hat die Fehlinterpretation oder Verkennung von Bernards Milieu interieur die Forscher dazu gebracht, die extrazellulären mit den intrazellulären Phasen der Zellfunktion durcheinanderzubringen und weitgehend die Notwendigkeit zu übersehen, die Zelle als eine Gesamteinheit zu betrachten. Die basischen Salzlösungen, die gegenwärtig für in vitro- oder isolierte Organ-/Gewebestudien benutzt werden, sind abgeleitet von der einfachen Formulierung, die von Sidney Ringer für das isolierte, perfundierte Froschherz verwendet wurden. In ähnlicher Weise sind empirisch entwickelte, basische Salzlösungen für isolierte Säugetierpräparate benutzt worden. Die übliche Verwendung von phosphat-Zbicarbonatgepufferten Salzlösungen wurde initiiert von Krebs und Henseleit (Z. Physiol. Chem. 210: 33–36) für Studien an isolierten Homogenaten von Mitochondrien, das heißt intrazellulären Organellen der Schweineleber. Später gestand Krebs in seiner klassischen Arbeit (Biochem. Biophys. Acta. 4: 249–269) über die Untersuchung des Sauerstoffverbrauchs in Gewebeteilen von verschiedenen Organen einer Vielzahl von Lebewesenspezies zu, daß Substratschwund bei isolierten Gewebe-/Organpräparaten über die Zeit ein Gesichtspunkt war, der bei der Zusammensetzung von früheren physiologischen Lösungen nicht berücksichtigt worden ist. Wie bereits erwähnt, macht eine korrekte Interpretation der Hypothese von Bernard es notwendig, daß die gesamte Zelle metabolische Homöostase beinhalten sollte.
Traditionell sind über 60 Jahre Phosphat-Bicarbonatpuffer in Perfusions/Konservierungslösunsen für Säugetier- und Humangewebe/-organe benutzt worden und werden mit fragwürdiger Gültigkeit auch gegenwärtig noch verwendet. Es ist von Interesse festzustellen. daß es seit 40 Jahren bekannt ist, daß unorganische Phosphationen Glycolyse und oxidative Phosphorylierung, Kreatinkinase und die bei der sauerstofffreien Radikalspülung involvierten Enzyme hemmen. wobei die letzteren bei zahlreichen organischen Systemen verwickelt sind in Reperfusionschäden und Ödembildung. Die Aufrechterhaltung des pH-Wertes über die Zeit wird weiterhin kompliziert durch die Instabilität von phosphatgepufferten Perfusions- und Konservierungslösungen, hervorgerufen durch das Ausfällen von Calciumphosphat und Bicarbonat und noch verstärkt durch die Veränderung ihrer Dissoziationskonstanten über den Temperaturbereich von 4–37°C.
Die GB-A-2,270,614 beschreibt eine wässrige Lösung für die Perfusion, Lagerun und Reperfusion von Organen, enthaltend Calcium-, Kalium- und Magnesiumchloride, Histidin. Mannit, Lactiobionat, Glutamat und Glutathion.
Die GB-A-2,213,362 beschreibt eine Perfusarlösung, die ein Lactiobionat und eine Hydroxyethylstärke enthält. Der beschreibende Abschnitt dieses Dokumentes betont die Wichtigkeit des Einbindens eines Adenosintriphosphat(ATP)-Vorläufers, wie etwa Adenosin, um den ATP-Spiegel während der Reperfusion aufrechtzuerhalten.
Die WO 93/04127 beschreibt eine Transplantationslösung, die Wasser. ein Puffersystem und Pyruvat enthält.
Die vorliegende Erfindung gibt eine Antwort auf die noch vorhandene Notwendiskeit, eine Lösung zu liefern. um die schädlichen Effekte von unorganischen Phosphationen auf den Zellstoffwechsel und assoziierte zelluläre Funktionen zu beseitigen, wobei sie auch dazu beitragen soll, die natürlichen physiologischen Prozesse zu verstärken, die wesentlich sind für die Konservierung von isolierten Zell-. Gewebe- und Organpräparaten von Säugetierspezies, beispielsweise während des Transpones von für die Transplantation vorgesehenen Organen. Derartige Organe werden sehr schnell schlecht. und viele nützliche Organe können nicht verwendet werden, wenn zu viel Zeit zwischen der Entnahme und der Auslieferung an einen vorgesehenen Empfänger verstreicht. Die erfindungsgemäße Lösung verlängert die Sicherheitsperiode.
Die vorliegende Erfindung sorgt für ein physiologisches Medium, das eine wässrige Lösung in sterilem, gereinigtem Wasser enthält, aus

(i) einer Salzkomponente, enthaltend:
(a) von 100 bis 150 mMol/l Natriumionen,
(b) von 2,5 bis 6,2 mMol/l Kaliumionen
(c) von 0,1 (vorzugsweise 0,15) bis 2,5 mMol/l Calciumionen
(d) von 0,4 bis 25 mMol/l Magnesiumionen, und
(e) von 96 bis 126 mMol/l Chloridionen;
(ii) einer Pufferkomponente, enthaltend
(f) von 21 bis 27 mMol/l Bicarbonationen, und
(g) von 1 bis 12 mMol/l BES, MOPS oder BES;
(iii) einer Substratkomponente, enthaltend:
(h) 2 bis 11 mMol/l Glucose
(i) 50 bis 150 μMol/l Glycerin und
(j) 7 bis 15 μMol/l Cholin;
(iv) einer Aminosäurekomponente, enthaltend:
(k) 5 bis 400 μMol/l Glutamat
(l) 5 bis 200 μMol/l Aspartat und
(m) 100 bis 2000 μMol/l Glutamin;
(v) einer Co-Enzym-Komponente, enthaltend
(n) 1 bis 120 nMol/l Thiamin-Cocarboxylase;
(vi) einer Vitaminoidkomponente, enthaltend:
(o) 40 – 70 μMol/l D- oder DL- oder L-Carnitin;
(vii) einer Proteinkomponente, enthaltend:
(p) 5 bis 200 m I. E./l Schweine- oder Humaninsulin.

Entsprechend einer Ausführungsform enthält die Salzkomponente

(c) von 1,0 bis 2,5 mMol/l Calciumionen, und
(d) von 0,4 bis 2,4 mMol/l Magnesiumionen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines physiologischen Mediums wie oben beschrieben, welches darin besteht, daß man sterilem, gereinigtem Wasser unter ständigem Umrühren bis zum Erreichen des gewünschten Volumens in der folgenden Reihenfolge beifügt: Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, das TES, MOPS, oder BES, Thiamin, Carnitin, Cholin, Glycerin, Insulin, Aspartat, Glucose, Glutamat, Glutamin und Natriumbicarbonat, anschließend filtriert und in einem sterilen, versiegelten Behälter abspeichert.
Es ist zu bemerken, daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kein von einem Tier abgeleitetes Serumprotein, wie etwa fötales Rinderserum oder Rinderserumalbumin enthalten, die von der FDA für derartige Anwendungen in der Einzelzell- oder Humangewebe-/Organ-Biotechnologie verboten worden sind.
Pufferkomponenten:
Hinsichtlich der Komponenten der erfindungsgemäßen Lösung wurde ein natürliches, physiologisches Puffersystem, nämlich NaHCO₃/pCO₂, für die erfindungsgemäße Lösung in Kombination mit dem zwitterionischen Good-Puffer, BES (Good et al. Biochemstry 5: 467–477) genommen, welches aufgrund seines idealen pK_a über einen Temperaturbereich von 10–37°C wirksam ist, um einen stabilen pH-Wert zu liefern, ein wesentliches Erfordernis für die Zellkonservierung. BES hat sich bei Langzeitstudien als nicht-toxisch gegenüber gleichförmig kultivierten Säugetierzellen erwiesen und hat eine vernachlässigbare Bindung für Ca²⁺ oder Mg²⁺, wodurch das potentielle Risiko des Niederschlags von bivalenten Ionen entfällt, was stattfindet, wenn konventionelle Bicarbonat/Phosphat- oder Doppelphosphat-Pufferlösungen verwendet werden. Tatsächlich konnte experimentell nachgewiesen werden, daß 10x-Konzentrate der erfindungsgemäßen Lösungen eine Haltbarkeit (gelagert bei 3–8°C) von mehr als 14 Monaten haben. Als Alternativen für die Verwendung von N,N-bis-(2-hydroxyethyl)-2-amino-ethansulfonsäure (BES) ist es möglich, Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) oder N-tris-(hydroxymethyl)-methyl-2-amino-ethansulfonsäure (TES) zu verwenden.
Ein Hauptunterscheidungsmerkmal der erfindungsgemäßen Lösung gegenüber üblichen Perfusionssalzlösungen ist die Abwesenheit von unorganischem Phosphat, welches während der vergangenen 80 Jahre als Puffervehikel benutzt worden ist, obwohl unorganische Phosphatradikale sich während der letzten 40 Jahre als solche herausgestellt haben. die Glycolyse und oxidative Phosphorylierung, Kreatinkinaseaktivität und die Freien Radikale-Spülenzyme unterbinden.
Von unorganischem Phosphat ist berichtet worden, daß es einen hemmenden Effekt auf die Glycolyse hat, indem es mit dem Zusammenwirken von Mg²⁺ mit den geschwindigkeitslimitierenden Enzymen. Hexokinase und Phosphofructokinase, und bezüglich der Löslichkeit von Kreatinkinase interferiert. Zahlreiche Forscher haben in einem Versuch zur Kompensation des Hemmeffektes auf Glycolyse und die damit verbundene Abnahme der physiologischen Leistungsfähigkeit, die aus phosphatgepufferten Salzlösungen resultieren. in ihre Perfusatsalzlösungen oder Transplantationslösungen Pyruvat mit nichtphysiologischen Serumspiegeln (d. h. 2.0–25,0 mMol gegenüber 0.2 mMol) einbezogen (siehe die o. g. WO 98/04127). Untersuchungen, die an isoliener, perfundierter/perifundierter Rattenleber durchgeführt worden sind, haben gezeigt, daß ein Austritt von Lactatdehydrogenase (LDH) nach nur 10 Minuten mit der Krebs & Henseleit-Salzlösung aber nicht während 300 Minuten mit der erfindungsgemäßen Lösung (siehe Beispiel 1) auftrat. Unter den letzteren Bedingungen würde die weitere Zugabe von Pyruvat kontraindiziert, da es von Pyruvat bekannt ist, daß es die H₄- und H₃M-Untereinheiten von LDH in der Leber und auch in dem Herz hemmt. Es ist nochmals zu betonen, daß für die Konservierung von isolierten Geweben/Organen alle Versuche unternommen werden sollten, die metabolische Homöostase bezüglich des zellulären Spiegels zu behalten, indem die „Selbstregulierung" der enzymatischen Funktion aufrechterhalten wird.
Die bevorzugten Salzkomponenten umfassen:
13,32 mMol/l Natriumionen. 5,00 mMol/l Kaliumionen, 1,25 mMol/l Calciumionen, 0,45 mMol/l Magnesiumionen als Chloridsalze und 118.40 mMol/l Chloridionen als Natrium- Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze.
Die bevorzugte Pufferkomponente umfaßt: 2,00 mMol/l Bicarbonationen als Natriumsalz und 5,0 mMol/l N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-amino-ethansulfonsäure (BES).
Substratkomponenten
Die erfindungsgemäße Lösung bezieht sich auf eine Anzahl von essentiellen Substraten, um die metabolische Homöostase der isolierten Organe/Gewebe zu erhalten. Glucose und Glyzerin haben sich als zufriedenstellend für die Erfüllung des Energiebedarfs von isolierten Geweben und Organen herausgestellt, selbst wenn sie infolge des Einschlusses von physiologischen Insulinspiegeln nicht das bevorzugte Substrat für das Organ (z. B. das Herz) sind. Abgesehen von ihrer Fähigkeit, abgebaut werden zu können, haben Glycerin und Glucose ebenfalls Freie Radikale-spül- und membranstabilisierende Eigenschaften, die sich als extrem wichtig für die Aufrechterhaltung der physiologischen Lebensfähigkeit von isolierten Geweben und Organen herausgestellt haben. Die Substratkomponente enthält vorzugsweise 10 mMol/l D-Glucose, 110 μMol/l Glycerin und 10,0 μMol/l Cholin als das Chloridsalz.
Aminosäurekomponenten:
Aspartat und Glutamat sind ebenfalls in die erfindungsgemäßen Lösungen aufgenommen worden, um den oxidativen Stoffwechsel zu verbessern, indem sie TCA-zyklische Zwischenprodukte auffüllen, wodurch selbst bei ischämischen Insult hoch energiereiche Phosphatspiegel aufrechterhalten bleiben. In ähnlicher Weise ist Glutamat bei der Aufrechterhaltung von intrazellulären Oxidations-Reduktions-Potentialen involviert. Im wesentlichen wird davon ausgegangen, daß durch Optimierung der Aspartat-Malat- und Glycerinphosphat-Überträger die Zellen ein optimales NAD/NADH-Gleichgewicht beibehalten und dadurch die Adenin-Nukleotid-Spiegel aufrechterhalten.
Vorzugsweise enthält die Aminosäurekomponente 300 μMol/l L-Glutamat als Natriumsalz, 20 μMol/l L-Aspartat als Natriumsalz und 400 μMol/l L-Glutamin.
Co-Enzym-Komponenten:
Thiamin-cocarboxylase spielt eine wesentliche Rolle bei der Oxidation von α-Ketosäuren, und es ist in den Zusammensetzungen enthalten, um die Akkumulation von Pyruvat und Pyruvataldehyd und dadurch Zelltoxizität zu verhindern.
In dem Tricarbonsäurezyklus ist TPP ein Kofaktor bei dem Stoffwechsel von α-Ketoglutarsäure, um durch oxidative Decarboxlierung Succinyl-Co-Enzym A oder durch reduktive Animation Glutamat zu bilden.
Im wesentlichen ist TPP beteiligt bei zahlreichen, untereinander zusammenhängenden, biochemischen Bahnen, insbesondere derjenigen der Pentose-Phosphat- und glycolytischen Bahnen.
Das Thiamin kann beispielsweise eingesetzt werden als Thiaminpyrophosphat oder als Thiamindiamid.
Die Co-Enzymkomponente enthält vorzugsweise 40,0 nMol/l Thiamin als Thiaminpyrophosphatchlorid.
Vitaminoidkomponente
Vom Vitaminoid, Carnitin, ist berichtet worden, daß es Mehrfacheffekte bei der Verbesserung der Herzfunktion hat, anders als nur durch einfaches Optimieren des oxidativen Stoffwechsels, und zwar derart, daß es die Verwertung von alternativen Substraten verbessert, wobei es zusätzlich die Koronardurchblutung verbessern kann. L-Carnitin wird bevorzugt gegenüber D- oder DL-Isomeren, da es keine Hemmung des Acetyl-Coenzym A-/freie Fettsäure-Stoffwechsel bewirkt. Die Vitaminoidkomponente enthält vorzugsweise 50,0 μMol/l [-]-β-Hydroxy-γ-trimethylamino-butyrathydrochlorid (L-Carnitin). Im Rahmen dieser Erfindung war mit der Einlagerung des L-Isomers von Carnitin in die Formulierung der Lösung beabsichtigt, den Transport von langkettigen Fettsäuren von dem Zytosol in die Mitochondrienmatrix bezüglich der β-Oxidation zu optimieren und dadurch das intramitochondriale Acetyl CoA/CoA-Verhältnis zu puffern durch Stimulieren der Synthese von Acetyl-Carnitin aus der Carnitin-Acetyltransferase. Diese Reduktion in dem Verhältnis von Acetyl-CoA/CoA wird in einem Abfluß von Acetyl-Carnitin aus den Mitochondrien mit einer assoziierten Stimulation der Pyruvatdehydrogenase und einer Umkehr der Fettsäurehemmung der Glucoseoxidation resultieren. Schließlich ist die Optimierung der Freie-Fettsäureverwendung als einer Energiequelle wesentlich für alle Zelltypen, aber dieses muß einhergehen mit der Konservierung der Kohlehydrat(Glucose)-Verwertung durch optimiertes Funktionieren der Enzyme, die an der Glycolyse, z. B. Hexokinase, Glucokinase, Phosphorfructokinase, beteiligt sind.
D- oder DL-Isomere von Carnitin sind beim Erfüllen dieser Funktion weniger effektiv.
Insulinkomponenten:
Die Verwendung von rekombinantem Humaninsulin (ausgedrückt in E. coli) verhindert nicht nur das Risiko einer antigenetischen oder viralen Kontamination der Empfängerzellen/-gewebe/-organe, wie es der Fall sein kann mit Insulin, das von anderen Säugetier- oder Tierspezies abgeleitet ist, sondern es führt zu einem besseren Zusammenpassen, das erzielt wird von Insulinmolekülen zur Humaninsulin-Rezeptorstruktur, d. h. die Rezeptorspezifizität wird optimiert, um die vielen zugeordneten Funktionen von Insulin in zellulären Prozessen zu behalten.
Die Proteinkomponente enthält vorzugsweise 28,0 m.LE./l rekombinantes Humaninsulin (ausgedrückt in E. coli).
Wenige der beschriebenen Formulierungen von Perfusat- und Konservierungslösungen haben über die letzten 60 Jahre Insulin enthalten, und diejenigen, die es haben, dosierten Insulin in unnatürlichen Mengen, zum Beispiel 10–50 × 10^–6 m.LE./l (d. h. etwa um ein Millionenfaches konzentrierter als in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen). Der Grund fußt auf der Tatsache, daß in derartigen Konzentrationen nur eine kleine Menge des Insulins in Form von Einzelmolekülen existiert. Der Rest des Insulins ist in Form großer Aggregate von Insulinmolekülen vorhanden, die in ihrer Wirkung ineffektiv sind, d. h. Einzelmoleküle des Insulins werden benötigt, um die Insulinrezeptoren an Zellmembranen zu stimulieren.
Im wesentlichen beziehen sich die biochemischen Effekte von Insulin nicht einfach auf dessen Fähigkeit, den Kohlenstoffstoffwechsel zu regulieren und den verbesserten Transport von zirkulierender Glucose in die Zellen, sondern auch (i) die Verbesserung der intrazellulären Glucokinaseaktivität und der Aminosäureeinlagerung in Proteine, (ii) Sti mulierung der DNA-Übertragung, (iii) erhöhte Lipidsynthese und (iv) Stimulierung von Natrium, Kalium und unorganischen Phosphaten in die Zellen.
Die Erfindung erkennt an, daß bei Fehlen von spezies-spezifischem Insulin tiefgreifende Veränderungen in der Gesamtbilanz des zellulären Stoffwechsels auftreten werden, zum Beispiel erhöhte Gluconeokinese von Protein, erhöhte Lipolyse und Ketogenese. Das Nettoergebnis wird eine totale Unterbrechung in der metabolischen Homöostase und Zellfunktion sein.
Die Verwendung von rekombinantem Humaninsulin in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung im Gegensatz zu von tierischem Serum abgeleiteten Insulin bezieht sich nicht nur darauf, den FDA-Vorschriften zu genügen, sondern auf die Tatsache, daß ein besseres Harmonieren mit den Humaninsulinrezeptoren erreicht wird, d. h. die Rezeptorspezifizität wird optimiert werden.
Deshalb sind bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen normale Serumspiegel des Insulins angewendet worden, und dieses konnte nur erreicht werden durch Ansäuern des Insulins, um die Bildung von Insulinaggregaten zu verhindern, so daß einzelne Molekularspezies von Insulin in der Lösung existieren können.
Die Verwendung von alkalischen oder pH-neutralen Lösungen bewirkt nicht diese Molekulardispersion der Insulinmoleküle.
Antibiotische Komponenten:
Vorzugsweise ist eine antibiotische Komponente einbezogen, um sicherzustellen, daß bei zufälliger Kontamination durch Mikroorganismen während des Transports jede Vermehrung derartiger Mikroorganismen verhindert werden kann. Die antibiotische Komponente enthält vorzugsweise 10–150 mg/l, insbesondere 100 mg/l D-[-]-threo-2-dichloracetamid-l-(p-nitrophenyl)-1,3-propandiol (Chloramphenicol). Andere Antibiotika können benutzt werden, wobei aber Sorge dafür getragen werden muß, sicherzustellen, daß das spezielle verwendete Antibiotikum nicht interferiert mit den gelagerten oder transportierten Geweben oder Organen.
Ionisch:
Die Konzentrationen der Ionenspezies in den erfindungsgemäßen Lösungen berücksichtigen die Aktivitätskoeffizienten jeder Ionenspezies und nicht einfach ihre Gesamtserumkonzentrationen. So muß zum Beispiel die Serumbindung von Ca²⁺ und Mg²⁺ unterschieden werden von den aktuellen freien ionisierten Spiegeln dieser Ionen. Magnesiumionen sind wichtig bei einer Anzahl kritischer Zellreaktionen, und ihre extrazellulare Präsenz soll die Mitochondrien-Atmungsaktivität stimulieren und die Effekte eines schnellen Calciumzuflusses und Kaliumabflusses verändern. Es muß gleichfalls eine adäquate Konzentration an Calciumionen in der Konservierungslösung vorhanden sein, um das Calciumparadox zu vermeiden, welches beobachtet werden kann, wenn anschließend nach Reperfusion und Transplantation das Spenderorgan dem Gesamtserumcalciumspiegel ausgesetzt wird. Die Ionenleitfähigkeit der erfindungsgemäßen Lösungen ist zusätzlich vergleichbar zu der von Humanserum, nämlich 12,6 msek cm^–1, und erhält als solches den Ionenstatus der Zellmembran und die Aktivitäten des enzymischen Anteils. Von wesentlicher Bedeutung bei der Majorität von Konservierungslösungen sind die Kalium- und Natriumspiegel, indem die Kaliumionenkonzentration einige 25x höher und die des Natriums 5–15x geringer ist als ihre Serumspiegel.
Osmolarität:
Eine erfindungsgemäße Lösung ist isosmotisch gegenüber Humanserum (ca. 290 mOsMol/l) und scheint nicht die Einlagerung von Plasmaexpandern zu benötigen, wie es dadurch demonstriert ist, daß nur geringere Veränderungen (ca. 8%) bei der Hydratation während einer Langzeit (d. h. 4–52 Stunden)-hypothermischen Perfusion des isolierten Rattenherzes und viszeralen Nervenmuskelpräparaten auftreten. Dieses kann dadurch erklärt werden, daß die Zellmembrane in Kontinuität mit einer 99%igen Gelzwischenraumphase liegt, wodurch ein natürliches, kolloidales Puffern gegenüber überschüssigem Donnan-Ionen-Gleichgewicht-Austausch durch die Zellmembran entsteht. Die Majorität des osmotischen Drucks wird durch Na⁺ geliefert und dessen begleitenden Anionen, und nur eine geringe Komponente (ca. 0,5%) kann Plasmaproteinen zugeordnet werden, wodurch nicht das Einbringen von onkotischen Stoffen in die erfindungsgemäßen Lösungen rechtfertigt. Die Praktikalität des Einführens von onkotischen Mitteln wie bei anderen kommerziell erhältlichen Perfusat-Konservierungslösungen wird weiterhin kompromittiert durch ihre Affinität zu Ca²⁺ und Mg²⁺, da eine vorhergehende Dialyse in frischer Lösung notwendig ist. um nicht die kationische Zusammensetzun des Perfusats zu stören. Die labile Natur von Polypeptidexpandern macht diese auch unpraktisch aufgrund ihrer Veranlagung gegenüber mechanischer Denaturierung, wie sie auftritt bei ihrer Zubereitung und während der Zirkulation duch eine Perfusionsgerät. Da diese Kolloidalexpander im wesentlichen nicht toxisch sind, ist leider ihre Anwendung in Konservierungsfluiden kontraindiziert. da beispielsweise (1) eine erhöhte Viskosität die Dicke der „unbewegten" Schicht um Zellen anwachsen läßt, wodurch die Diffusion von Metaboliten behindert wird, (2) eine Veränderung des Oberflächenmembran-bioelektrischen Potentials den Zellmetabolismus und die Rezeptoraktivitäten unterbricht, (3) Antigenizität von eiweißartigen Expandern, (4) Agglutination und Hämolyse von RBCs and (5) Blockierung der Mikrovaskulafur und Ischämie.
Unter anderen potentiellen Anwendungsgebieten für die erfindungsgemäßen Lösungen sind diejenigen als Spül-, Aufbewahrungs-/Konservierungs-/Transportmedium für Humanknochenmarkzellen bei 4°C (siehe Beispiel 6) und Säugetierembryonen (u. a. während 12–43 Stunden bei 20–37°C (siehe Beispiel 4). In der Landwirtschaft könnte dieses benutzt werden für Embryonen solcher Spezies wie Schafe, Ziegen. Rotwild, Rindvieh, Schweine und Pferde.
Ein weiteres potentielles Anwendungsgebiet ist eine nicht-gefrorene Lösung als Speichermedium für Sperma für 24–43 Stunden bei 20–25°C. Die für diesen Zweck bisher angewandten Techniken sind nur beschränkt auf das Einfrieren des Spermas mit höchst unterschiedlichem Erfolg. Die Lösung ist insbesondere nützlich für Schweinesperma, da Schweinesperma im Vergleich zu Rindersperma nicht eingefroren werden kann.
In vitro-Anwendungen zwecks Begleitung einer Vielzahl von animalischen Organ-/ Gewebepräparaten, die für physiologische und pharmakologische Medikamentenerprobungstechniken am lebenden Tier in der wissenschaftlichen Forschung auf studentischem Ausbildungsniveau verwendet werden zur Untersuchung von beispielsweise

a) perfundierten (kanülenförmig)/perifundierten Maus-, Ratten-, Meerschweinchen-Herz/ Herz-Lunge-, -Leber-, -Nierenpräparaten
b) perifundierten, viszeralen Muskelpräparaten, zum Beispiel Blutgefäßen, G.I-Trakt, reproduktiven Traktbiopsien
c) perifundierten Säugetier-Skelettmuskelbiopsien, beispielsweise Maus, Ratte, Kaninchen, Mensch
d) perifundierten Gewebeteilen, z. B. Leber, Gehirn

Die erfindungsgemäße Lösungszusammensetzung ist gegenüber der Methode, mit welcher Vorratslösungen zubereitet und gelagert werden, anfällig, ebenso wie gegenüber der Reihenfolge, in der sie zugefügt werden. Das folgende Beispiel ist eine Möglichkeit des bevorzugten Verfahrens des Kombinierens der verschiedenen Komponenten in den Zusammensetzungen.
Beispiel 1
Verfahren zur Herstellung der RS-I-Lösung
Gemäß dem folgenden wurde Thiaminpyrophosphat (Co-Carboxylase), Sigma C4655 zubereitet als eine 0,4 mg/ml-Vorratslösung in MilliQ (endotoxin-freiem) gereinigtem Wasser und in Dunkelglas-Ampullen gefriergelagert. Cholinchlorid (Sigma C7527) wurde zubereitet als 17,5 mg/ml-Vorratslösung in MilliQ endotoxin-freiem, gereinigtem Wasser und in Glasampullen gefriergelagert. Rekombinantes Humaninsulin (Sigma 10259) wurde zubereitet als eine 0,5 I. E/ml-Vorratslösung in endotoxin-freiem, MilliQ-gereinigtem Wasser, das mit 0,1 N Salzsäure auf pH 2,4 sauer gemacht worden war, und in Glasampullen gefriergelagert.
Bei den folgenden Zubereitungen wurde sowohl beim anfänglichen Umrühren als auch beim abschließenden Verdünnen durchgehend endotoxin-freies, MilliQ-gereinigtes Wasser verwendet.
Für die Zubereitung wurde ein nicht rostender Stahlbehälter mit 8 1 MilliQ gefüllt, und die folgenden Ingredienzien wurden ausgewogen und unter ständigem Umrühren in der folgenden Reihenfolge zugesetzt: 642,96 g Natriumchlorid (CFK0484), 37,28 g Kaliumchlorid (BDH 10198), 18,38 g Calciumchloriddihydrat (BDS 10117), 9,14 g Magnesiumchlorid-hexahydrat (BDH101494) und 106,61 g BES-freie Säure (Sigma B6266), 1,84 mg Thiaminpyrophosphat (Sigma C9655) (unter Verwendung von 4,6 ml der Vorratslö sung), 0,9899 g L-Carnitin (Sigma C0238), 0,1397 g Cholinchlorid (Sigma 7527) in Form von 8 ml der Vorratslösung, 1,013 g Glycerin (Sigma G2025), 2.3 I. E. rekombinantes Humaninsulin (5 ml der Vorratslösung). 0.310 g L-Aspartatnatriumsalz (Sigma A6683), 180,2 g wasserfreie D-Glucose (Sigma G7021), 5,07 g L-Glutamatnatriumsalz (Sigma G5389) und 5,84 g L-Glutamin (Sigma G5763). Das Ganze wurde bis zum vollständigen Auflösen umgerührt, und anschließend wurde das abschließende Volumen von 10 l durch Beifügung von weiterem MilliQ-gereinigtem Wasser zubereitet.
Die Lösung wurde durch ein Sterilfilter (0,2 μm Sanobran PH) in sterile, versiegelte 100 ml-Glasflaschen gefiltert.
Diese Lösung ist ein 10x-Konzentrat der für die Verwendung beabsichtigten Lösung. Für die Verwendung kann sie mit der entsprechenden Menge MilliQ verdünnt werden.
Für die Verwendung als eine Perfusions- und Konservierungslösung können 100 ml des Konzentrats mit 900 ml doppelt-deionisienem oder endotoxin-freiem MilliQ-gereinigtem Wasser auf 1 l unter Zugabe von 2,1 g endotoxin-freiem Natriumbicarbonat (Sigma S4019) verdünnt und vor der Verwendung bei 8–10°C gelagert werden. Natriumbicarbonat wird den Konzentraten nicht zugesetzt, bevor sie gelagert werden. da eine längere Lagerung des Bicarbonationen enthaltenden Konzentrats zum Ausfällen von Calciumcarbonat führen kann.
Für die Verwendung als eine Perfusions- und Konservierungslösung kann jeder Liter der Lösung 100 mg/l Chloramphenicol (Sigma C3175) enthalten, um die Gefahr einer bakteriellen Kontamination zu verhindern. wie sie, wenn atmosphärischen Bedingungen ausgesetzt. während längerer Perioden des in vitro-Experimentierens auftreten kann.
Die folgenden Faktoren sind sehr wichtig bei der Zubereitung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen. Die am meisten kritischen Faktoren sind:

1. Die Methode des Aufbaus der erfindungsgemäßen Lösungen und insbesondere:
2. Die Verwendung von endotoxin-freiem MilliQ-Wasser bei der Herstellung sämtlicher Vorratslösungen und der 10x-Konzentrat-Flaschen für die erfindungsgemäß hergestellten Lösungen.
3. Die Methode der Zubereitung der erfindungsgemäßen, sterilen Vorratslösungen und -konzentrate ohne Autoklavbehandlung oder Bestrahlung – zum Beispiel führt Bestrahlung, um Sterilität zu erreichen, zum Abbau von Glutamin und wahrscheinlich TPP.
4. Die Verwendung von Glasflaschen für die gesamte Lagerung der erfindungsgemäßen Vorrats- und 10x-Konzentratlösungen.
5. Die Zubereitung von gelöstem Insulin durch Säuerung auf pH 2,4 plus Gefrierlagerung von Insulinvorratslösungen.
6. Die Zubereitung von Thiaminpyrophosphat plus TPP-Vorratslösungen, die unter Dunkelbedingungen gefriergelagert werden (siehe den folgenden Grund).
7. Die Zubereitung von Cholinchlorid plus Gefrierlagerung der Vorratslösungen.
8. Die Verwendung von Magnesiumchloridhexahydrat (d. h. 6 H₂O). Dieses ist wichtig, da, wenn das dehydrierte Salz verwendet wird, dann, wenn es Wasser absorbiert, das Gewicht, welches zur Berechnung des genauen Magnesiumionengehaltes benutzt wird, falsch sein wird – dies ist ein häufiger Grund für die falsche Zubereitung von Krebs- Lösungen in bezug auf die genauen Mg-Ionen- und Ca-Ionen-Spiegel.

Es ist nicht möglich, irgendeine der bevorzugten Komponenten bei der Zubereitung der erfindungsgemäßen Lösungen fortzulassen. Sämtliche Komponenten arbeiten synergistisch zusammen, um den physiologisch ausbalancierten Gesamteffekt zu bewirken. Dieses ist die Voraussetzung, warum die Verwendung von Humaninsulin und L-Carnitin nur zum Gesamtergebnis der Lebensfähigkeit dieses vielseitigen Säugetier-Flüssigmediums beiträgt.
Herstellung:

1. Vorratslösungen: Verschiedene Vorratskonzentrationen der erfindungsgemäßen Lösungen, nämlich 1x; 10x und 20x; für die Langzeitbevorratung wurden zubereitet und mit Erfolg untersucht, wobei jedoch die bevorzugten Vorratskonzentrationen 10x-Konzentrate waren, wobei endotoxin-freies MilliQ-Wasser benutzt wurde, und für die Lagerung unter Dunkelbedingungen bei 3–8°C eine Sterilfiltration in versiegelte 100 ml-Flaschen erfolgte. Vorratslösungen wurden für die Benutzung als 1x-Konzentratlösungen durch Zusatz von 100 ml 10x-Konzentrat-Vorratslösungen zu 900 ml doppelt-deionisiertem oder endotoxin-freiem MilliQgereinigtem Wasser rekonstituiert, wobei 2,1 g Natriumbicarbonat zugesetzt wurden, um einen End-pH-Wert von 7,22 ± 0,04 bei 20 °C zu ergeben. Sterile Vorrats-l0x-Konzentrationen der erfindungsgemäßen Lösungen haben ein pH von 4,6 ± 0,2, und sie haben sich über Zeiträume von bis zu 5 Jahre als haltbar erwiesen. Wenn bei 3–8 °C gelagert, liegt die empfohlene Lagerfähigkeit von 10x-Vorratskonzentraten der erfindungsgemäßen Lösungen bei 14 Monaten.
2. Cocarboxylase: Vorratslösungen von Thiaminpyrophosphatchlorid (Cocarboxylase) werden zubereitet mit 18,4 g/ml unter Verwendung von endotoxin-freiem MilliQ Wasser, sterilgefiltert in dunkle, versiegelte Ampullen, um den Photonabbau von Thiaminpyrophosphat zu verhindern, und sie werden vor dem Aufbau zu 10x-Vorratskonzentraten der erfindungsgemäßen Lösungen gefriergelagert.
3. Insulin: Rekombinantes Humaninsulin wird als sauer gemachte (pH 2,4), konzentrierte Vorratslösungen mit 0,5 m I. E/ml zubereitet, wobei endotoxin-freies MilliQ-Gereinigtes Wasser benutzt wurde, und es wurde in versiegelte Ampullen sterilgefiltert und vor dem Hinzufügen von Vorratskonzentraten der erfindungsgemäßen Lösungen gefriergespeichert.
4. Cholin: Vorratslösungen von Cholinchlorid werden mit 17,4 mg/ml zubereitet, wobei endotoxin-freies, MilliQ-gereinigtes Wasser verwendet wird. und sie werden vor dem Aufbau von Vorratskonzentraten der erfindungsgemäßen Lösungen in versiegelten Ampullen gefriergelagert.
5. Chloramphenicol ist kein wesentlicher Bestandteil der erfindungsgemäßen Lösungen, aber es wird vorzugsweise zugesetzt, entweder zu Lagerzwecken, oder, nachdem die Vorratsampullen geöffnet worden sind, um Sterilität zu gewährleisten, wenn die Lösungen während Perfusions- oder Perifusions- oder Nichtperfusions-Konservierungsprozeduren längere Zeit der Atmosphäre ausgesetzt sind.

Die folgenden weiteren Beispiele zeigen die Verwendung der erfindungsgemäßen Lösungen.
Die beiliegenden Zeichnungen sind Diagramme, die in den Beispielen wie folgt erläutert sind:
1 ist ein im Beispiel 2 erläutertes Diagramm;
2 ist ein im Beispiel 3 erläutertes Diagramm;
die 3 und 4 sind im Beispiel 6 erläuterte Diagramme.
Beispiel 2
Konservierung von physiologischen und pharmakologischen Funktionen.
Ein erfindungsgemäßes physiologisches Medium, welches gemäß Beispiel 1 zubereitet worden ist und im folgenden als RS-I-Lösung bezeichnet wird, ist erfolgreich als ein Perfusions- und Konservierungsmedium bei physiologischen und pharmakologischen Untersuchungen angewandt worden, wobei eine Vielzahl von verschiedenen Geweben und Organen verwendet wurden, die von einer Vielzahl von Säugetierspezies, einschließlich menschlicher Biopsien, isoliert worden waren.
Die Art der Formulierung basiert auf der chemischen und physikalischen Zusammensetzung von Humanserum, was sich dabei auf seine „universelle Anwendbarkeit" und die erhaltenen Ergebnissen bezieht (siehe Tabelle 1).
Die Verwendung eines nicht-phosphatgepufferten Systems zur Aufrechterhaltung stabiler pH-Werte von isolierten Embryonen (s. Beispiel 5) und Humanzellen (s. Beispiel 6) und Geweben/Organen bei der Lagerung bei 3–10 °C oder bei der Perfusion bei 20-37°C (Tabelle 1) bestätigt die kontradiktorische Verwendung von üblichen, phosphatgepufferten Medien (Tabelle 2).
Dieser Punkt wurde durch Untersuchungen bestätigt, die dazu dienten, die nachteiligen Effekte von phosphatgepufferten Medien (zum Beispiel Krebs & Henseleit; Dulbecco) mit einer nicht-phosphatgepufferten RS-I-Lösung zu vergleichen (s. Tabelle 3). Die Verwendung von phosphatgepufferten Lösungen ist kontraindiziert bei der Lagerung von Lebertransplantaten, und zwar basierend auf den Ergebnissen, die bei isolierten Rattenleberbiopsien erhalten wurden, bei denen ein signifikanter Verlust von Lactatdehydrogenase (LDH) nach nur 10-minütiger Perfusion mit Krebs & Henseleit-Perfusat beobachtet wurde (1). Der Zusatz von Pyruvat zu dem Perfusat (wie von anderen vorgeschlagen, siehe beispielsweise WO 98/04127) zum Ausgleichen der Inhibierung von Glykolose durch Phosphationen ist kontraindiziert, da Pyruvat dafür bekannt ist, die Inhibierung der H₄- und H₃M-Untereinheiten von LDH in der Leber zu bewirken, wodurch die beobachtete Verschlimmerung noch mehr akzentuiert würde.
Tabelle 1 Funktionale Lebensfähigkeit von RS-I erhaltenen Säugetier-Gewebe-/ Organpräparaten
Es wird die Aufmerksamkeit auf 1 gelenkt, einem Vergleich der Lactathydrogenase(LDH)-Aktivität, gemessen bei Perfusaten der isolierten Rattenleber während der Perfusion/Perifusion mit RS-I-Lösung
und Krebs-Henseleit-Salzlösung
) in einem Res-Del®-Perfusionsbad.
Eine Analyse des zeitlichen Verlaufs des Austritts von LDH unter Verwendung eines Wiederholungsmessungs-Anovaprogramms zeigt einen hoch signifikanten (p < 0,001) Austritt des intrazellulären Enzyms aus isolierten Rattenleberpräparaten (n = 5) bei einer K & H-Salzlösung gegenüber einer RS-I-Lösung. Es ist zu beobachten, daß der Austritt von Lactat-Dehydrogenase (LDH) von in einer Krebs-Henseleit-Salzlösung gehaltenen Präparaten innerhalb der ersten 10 Minuten auftrat, während ein LDH-Austritt bei RS-I-Perfusaten bis 90 Minuten nicht signifikant war und ein definitiver Austritt nur nach 240 Minuten auftrat.
Jede Barriere zeigt einen Fehler von diesem Mittel (SEM).
Beispiel 3
Als eine Diagnoselösung für Medikamentenerprobungs-Auswenung.
Die standardisierte und stabile Zusammensetzung der RS-I-Lösung hinsichtlich der Lagerung über der Zeit, ein Charakteristikum, welches bei üblichen phosphatgepufferten Lösungen nicht zu finden ist, gewährleistet, daß die isolierten Präparate bei jedem Medikamententest normale physiologische Reaktionen im Vergleich zu sich verringernder Reaktionsfähigkeit zeigten, die bei phosphatgepufferten Lösungen beobachtet werden konnte (z. B. Krebs und Henseleit-, Tyrodes-. Hanks-Salzlösungen).
Bei Untersuchungen, die dazu dienten, die verbesserte Lebensfähigkeit bei der Verwendung der RS-I-Lösung gegenüber der üblichen Krebs- & Henseleit-Salzlösung bei isolierten Rattenzwerchfellpräparaten zu testen, wurde festgestellt, daß nach einstündiger Perfusion eine 18,6%ige Verringerung des neural ausgelösten Zuckreflexes bestand, und zwar verglichen mit einer 2,9%igen Verringerung bei RS-I-perfundierten Präparaten (Tabelle 3).
Diese Beobachtung wurde weiterhin durch Untersuchungen bestätigt, um den potenzierten Effekt von Betamethason (Betnesol®; Glaxo Ltd, NZ) auf neural ausgelöste Zuckreflexe bei diesem Präparat zu demonstrieren (Parr et al. British J. Anaesthesia, 67, 447–451; Robinson et al. Anesth. Analg. 74, 762–765), wobei es imperativ war, daß die Präparate unter „kontrollierten" Bedingungen während der experimentellen Zeitperioden nicht irgendeine Verringerung hinsichtlich der tetanischen Abklingens zeigen sollten, um die Hypothese zu bestätigen, daß Betamethason einen potenzierten Effekt von Neurotransmitter-Freisetzung hat. Ein solches wurde als nicht zutreffend befunden, selbst wenn man die Krebs- und Henseleit-Salzlösung während der ersten 30 Minuten der experimentellen Zeitperiode benutzte (siehe Tabelle 3 und 2).
In weiteren Reihen von Untersuchungen wurde das klassische Meerschweinchen-Ileum-Präparat in einer RS-I-Lösung untersucht, und es wurde gefunden, daß normale pharmakolosische Reaktionen für bis zu 7 Tage fortfuhren zu funktionieren und aufzutreten. Derartige Präparate wurden alternativ bei 8–10°C in einer RS-I-Lösung gelagert und anschließend erfolgreich bei Medikamentenuntersuchungen angewendet, um die Anzahl von Tieren zu verringern, die geopfert werden mußten.
Es wird daher angenommen, daß die Gültigkeit aller die Medikamentenerprobung betreffenden aufgezeichneten Reaktionen, bei denen eine phosphatgepufferte Lösung als ein diagnostisches Perfusat verwendet wird, ernsthaft durch die schädlichen Effekte gefährdet sind, von deren Auftreten früher berichtet wurde (Tabelle 2).
Tabelle 3
Beispiel 4
Als eine kardioplegische Lösung bei Herz-Bypass- und Transplationsbehandlungsmethoden.
Der Beginn der Herz-Bypass- Transplantationschirurgie hat die Suche nach verbesserten kardioplegischen Vehikel beschleunigt, da die Verlängerung der kardioplegischen Haltezeit die Durchführung einer hoch qualifizierten Herzchirurgie ohne die gegenwärtigen 45-minütigen Zeitbeschränkungen ermöglichen wird.
Es würde gleichfalls den Spenderpoolkreis in zeitlicher Hinsicht und hinsichtlich der gegenwärtigen geographischen Einschränkungen erweitern, und es würde wirkungsvoller die Verwendung von Spenderorganen erleichtern, indem Gewebe-Überkreuzvergleiche beim Empfänger überflüssig werden.
Eine kardioplegische Lösung kann dazu benutzt werden, zwei Hauptzwecken zu dienen. Erstens im Fall einer in vivo-Chirurgie, wie etwa Koronar-Bypass- und Ventilersatz-Chirurgie, bei der das Herz für eine relativ kurze Periode (weniger als 45 Minuten) mit einer Kombination von Hypothermie (gering oder extrem) und einer eine Anzahl von kardioplegischen Lösungen zum Stillstand gebracht wird.
Es kann zweitens eine Situation für die Anwendung einer kardioplegischen Lösung im Fall der Transplantationschirurgie auftreten, wobei das Herz dem Spender entnommen wird und in einer kardioplegischen Konservierungslösung, RS-C, zum Beispiel RS-I mit 25,0 mMol/l Magnesiumsulfat, zum Empfänger transportiert wird, um das Gewebe in dem metabolischen Zustand zu konservieren.
Die wesentlichen Ziele einer kardioplegischen Lösung, wie sie von Buckberg (7. Thoracic Cardiovasc. Surg. 77, 803–815) zusammengefaßt sind, bestehen darin:

– den Herzmuskel gegen schädliche Effekte von Ischaemie zu schützen,
– die Energiebedürfnisse des Muskels zu reduzieren, aber eine Umgebung zu schaffen, in der die Energieerzeugung andauert,
– das Herz zuverlässig zum Stillstand zu bringen.

Eine kardioplegische Lösung muß diese Ziele erfüllen und ebenso die negativen Effekte von Azidose und Ödemen verhindern und die Membran stabilisieren, um unnötigen Verlust an intrazellulären Ionen zu verhindern.
In dieser Studie wurde eine horizontal ausgerichtete Version des Langendorff-Herzpräparates in einem Res-Del® 589-Perfusionsbadsystem isoliert und dazu benutzt, die Lebensfähigkeit von kardioplegischem RS-C abzuschätzen. Das verwendete modifizierte Langendorff-Präparat ermöglichte gleichzeitige Messungen der Herzschlaggeschwindigkeit und von isovolumetrischen Veränderungen in dem Präparat über einen Online-Drucker-Transducer.
Koronarströmungsraten und eine Analyse der elektrokardiographischen Aktivität wurden ebenso gemessen.
Die angewandten kardioplegischen Techniken waren entweder eine der kontinuierlichen Infusion der kardioplegischen Lösung in der retrograden Richtung oder, wie üblicherweise in der Herz-Bypass-Chirurgie praktiziert, eine „einfach" entgegengesetzte Bolusinjektion der kardioplegischen Lösung. Es wurde die Annahme gemacht, daß eine kontinuierliche Infusion die Entwicklung von Ischaemie oder Hypoxie während kardioplegischer Episoden ausschließen würde. Die erhaltenen Ergebnisse in den Tabellen 4 – 6 zeigten an, daß eine 100%ige Konservierung in der funktionalen Aktivität in den zum Stillstand gebrachten Herzen für Perioden von bis zu 6 Stunden über einen Temperaturbereich von 20–30°C erreicht worden ist.
Interessanterweise schien die prozentuale Genesung nicht von koronaren Strömungsgeschwindigkeiten abzuhängen, die bei Untersuchungen negativ waren, die über 3-6 Stunden durchgeführt wurden.
Tabelle 4
Tabelle 5
Tabelle 6
Beispiel 5
Als eine „Spül"- und „Stand"-Lösung bei Tierembryo-Transplantationsmethoden
In voneinander unabhängigen Versuchen wurde die RS-I-Lösung als ein „Spül"-, „Stand"- und Inkubationsmedium für (unter anderem) Säugetier-Embryonen gegenüber kommerziell erhältlichen, phosphatgepufferten Medien über 12–18 Stunden untersucht.
Bei diesen Untersuchungen wurde Ziegenembryo bei 38°C während 12–18 Stunden in Dulbecco- und Whittingham- und RS-I-Medien inkubiert, um die Überlebensraten abzuschätzen.
Die Ergebnisse zeigten an, daß die RS-I-Lösung eine überragende Konservierung (75%) erbrachte, im Vergleich zur Dulbecco- (24%) und Whittingham-Lösung (38%) als Medium für eine Langzeitinkubation von Embryonen (Tabelle 7).
Bei einer anderen, unabhängig davon an Rinder-Embryonen durchgeführten Studie wurde die Auswahl von Good-Pufferlösungen, im Vergleich zu Good-Pufferlösungen, HEPES und MOPS und üblicher phosphatgepufferter Lösung, PBI, abgeschätzt.
Diese Resultate zeigen, daß nur bei RS-I BES-gepufferter Lösung die Embryonen eine Entwicklungsverbesserung zeigen (Tabelle 8), selbst wenn sie durch anfängliche Inkubation in PBI-Lösung und eine erwartete Hemmung ihres metabolischen Status beeinträchtigt sind (siehe Tabelle 2).
Tabelle 7
Tabelle 8
Die RS-I-Ergebnisse bei diesen Versuchen waren beeinträchtigt, da Alle Rinderembryonen „durchspült" und „gehalten" waren in einer BSA-angereicherten Phosphatlösung (PBI) für bis zu 6 Stunden vor der Versuchsdurchführung in den verschiedenen Arten von Good-gepufferten Medien.
Die zusätzliche Verwendung von RS-I bei solchen Anwendungen bei der Embryokonservierung während der „Standphasen" beruht auf der Tatsache, daß sie sich hinsichtlich der Zellen-, Gewebe- und Organkonservierung als gleich effektiv unter niedrigen hypothermischen Bedingungen erwiesen hat.
Beispiel 6
Als ein „Standmedium" für Normal-Humanknochenmark
In voneinander unabhängigen Versuchen, die bei der Life Technologies Inc. N. Y., USA, durchgeführt wurden, wurde eine RS-I-Lösung gegenüber üblichen mit Serumzusätzen versehenen oder serumfreien Mediumformulationen als Standmedium für die zeitweilige Lagerung von frisch entnommenen Humanknochenmarkzellen abgeschätzt.
Die experimentellen angewandten Verfahrensweisen bestanden im Mischen von einem ml Knochenmark mit einem ml der folgenden Testmedien:

– IMDM + 20% FBS
– StemPro^TM-34 ohne rekombinante Wachstumsfaktoren
– RS-URes-Del Media lot 3106
– RS-URes-Del Media lot 7002

Die Proben von Medium und Mark wurden dann bei 4°C plaziert. Aliquots von Mark wurden für die strömungszytrometrische Analyse mit Antikörpern gefärbt.
Weitere Aliquots des Knochenmarks wurden eingepflanzt in StemPro^TM-34, ergänzt mit den rekombinanten Humanwachstumsfaktoren: Stammzellenfaktor 100 ng/ml), IL-3 (50 ng/ml) und GM-CSF (25 ng/ml). Diese Zellen wurden 6 Tage lang bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ und Luft inkubiert.
Nach Lagerung während 24 und 48 Stunden bei 4°C wurden, wie oben beschrieben, Aliquots des Knochenmarks in den angegebenen Medien für Zellzählungen und Lebensfähigkeit entnommen. Aliquots wurden auch für die strömungszytometrische Analyse und ex vivo-Zellexpansion wie beschrieben eingefärbt.
Während des Zeitablaufs dieser Studie blieb die Zellenlebensfähigkeit, wie durch Trypan Blau-Farbstoffexklusion ermittelt, im wesentlichen bei 100% für die Knochenmarkzellen, unabhängig von dem Mediumansatz. Während der Lagerung bei 4°C erfolgte eine geringfügige, aber nicht signifikante Zunahme der Zellenanzahl bei allen der untersuchten Ansätze (s. 3).
Das Proliferationspotential der Stammzellen in dem Knochenmark durch Kultur von Aliquots des Marks in StemPro^TM-34 mit einem Zusatz von einer Kombination der rekombinanten Humanwachstumsfaktoren demonstrierte die Verbesserung der Zellexpansion.
Aliquots der in den verschiedenen untersuchten Medienansätzen gelagerten Knochenmarkzellen wurden in StemPro^TM-34 mit dem Zusatz von rekombinanten Humanwachstumsfaktoren SCF (100 ng/ml), IL-3 (50 ng/ml) und GM-CSF (25 ng/ml) gezüchtet. Man ließ die Zellen 6 Tage lang wachsen, und dann wurden die Zellenzahlen mit einem Coulter-Zähler bestimmt.
Sämtliche untersuchten Mediumansätze zeigten eine ähnliche Abnahme bei der Proliferation der Stammzellen nach 24- und 48-stündiger Lagerung bei ... (4).
Es wurde der Schluß gezogen, daß die RS-I-Lösung verwendet werden könnte als eine Alternative zu phosphatgepufferten Medien, um die veröffentlichten, nachteiligen Effekte auf isolierte Säugetierzellen, -gewebe und –organe zu umgehen (s. Tabelle 2).

Claims

Ein physiologisches Medium, das eine wässrige Lösung in sterilem gereinigtem Wasser enthält aus (i) einer Salzkomponente, enthaltend: (a) von 100 bis 150 mMol/l Natriumionen, (b) von 2,5 bis 6,2 mMol/l Kaliumionen (c) von 0,1 bis 2,5 mMol/l Calciumionen (d) von 0,4 bis 25 mMol/l Magnesiumionen, und (e) von 96 bis 126 mMol/l Chloridionen; (ü) einer Pufferkomponente, enthaltend (f) von 21 bis 27 mMol/l Bicarbonationen, und (g) von 1 bis 12 mMol/l TES, MOPS oder BES; (iii) einer Substratkomponente, enthaltend: (h) 2 bis 11 mMol/l Glucose (i) 50 bis 150 μMol/l Glycerin und (j) 7 bis 15 μMol/l Cholin; (iv) einer Aminosäurekomponente, enthaltend: (k) 5 bis 400 μMol/l Glutamat (l) 5 bis 200 μMol/l Aspartat und (m) 100 bis 2000 μMol/l Glutamin; (v) einer Co-Enzym-Komponente, enthaltend (n) 1 bis 120 nMol/l Thiamin-Cocarboxylase; (vi) einer Vitaminoidkomponente, enthaltend: (o) 40–70 μMol/l D- oder DL- oder L-Carnitin; (vii) einer Proteinkomponente, enthaltend: (p) 5 bis 200 m I. E./l Schweine- oder menschliches Insulin.
Ein physiologisches Medium nach Anspruch 1, welches enthält (viii) eine antibiotische Komponente, enthaltend: (q) 10 bis 150 mg/l Chloramphenicol.
Ein physiologisches Medium nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Salzkomponente erhält: (c) von 1,0 bis 2,5 mMol/l Calciumionen, und (d) von 0,4 bis 2,4 mMol/l Magnesiumionen.
Ein physiologisches Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Salzkomponente 135,32 mMol/l Natriumionen, 5,00 mMol/l Kaliumionen, 1,25 mMol/l Calciumionen, 0,45 mMol/l Magnesiumionen als Chloridsalze, und 118,40 mMol/l Chloridionen als Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze enthält.
Ein physiologisches Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Pufferkomponente 25,00 mMol/l Bicarbonationen als Natriumsalz und 5,0 mMol/l N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-amino-ethansulfosäure (BES) enthält.
Ein physiologisches Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Substratkomponente 10 mMol/l D-Glucose, 110 μMol/l Glycerin und 10,0 μMol/l Cholin als das Chloridsalz enthält.
Ein physiologlisches Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Aminosäurekomponente 300 μMol/l L-Glutamat als Natriumsalz, 20 μMol/l L-Aspartat als Natriumsalz und 400 μMol/l L-Glutatmin enthält.
Ein physiologisches Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Co-Enzym-Komponente 400 nMol/l Thiamin als Thiaminpyrophosphatchlorid enthält.
Ein physiologisches Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Vitaminoidkomponente 50,0 μMol/l [-]-β-hydroxy-γ-thrimethylaminobutyrathydrochlorid (L-Carnitin) enthält.
Ein physiologisches Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Proteinkomponente 28,0 m I. E./l rekombinantes menschliches Insulin (ausgedrückt in E. coli) enthält.
Ein physiologisches Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die antibiotische Komponente enthält 100 mg/l D-[-]-theo-2-dichloracetamid-I-(pnitrophenyl)-1,3-propansäure (Chloramphenicol).
Ein Verfahren zur Herstellung eines physiologisches Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 11, welches darin besteht, daß man sterilem, gereinigtem Wasser unter ständigem Umrühren bis zum Erreichen des gewünschten Volumens in der folgenden Reihenfolge beifügt: Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Claciumchlorid, Magnesiumchlorid, das TES, MOPS, oder BES, Thiamin, Carnitin, Cholin, Glycerin, Insulin, Aspartat, Glucose, Glutamat, Glutamin und Natriumbicarbonat, anschließend filtriert und in einem sterilen, versiegelten Behälter abspeichert.
Konzentrate für die Herstellung eines physiologischen Mediums nach einem der Ansprüche 1 bis 11, die Salz-, Puffer-, Substrat-, Aminosäure-, Co-Enzym-, Vitaminoid- und Proteinkomponenten enthalten und lösbar sind mit serilem, gereinigten Wasser, um dieses physiologisches Medium zu erhalten.
Konzentrate für die Herstellung eines physiologischen Mediums nach einem der Ansprüche 1 bis 11, die die Salz-, Puffer-, Substrat-, Aminosäure-, Co-Enzym-, Vitaminoid- und Proteinkomponenten mit Ausnahme von Natriumbicarbonat enthalten und mit sterilem, gereinigten Wasser unter Zugabe von Natriumbicarbonat lösbar sind, um dieses physiologische Medium zu erhalten.