DE3624422C2

DE3624422C2 -

Info

Publication number: DE3624422C2
Application number: DE3624422A
Authority: DE
Inventors: Tamas Gulyas; Csaba Dr. Szekszard Hu Banhazi; Zoltan Dr. Graf; Aniko Dr. Horvath; Gyoergy Dr. Keri; Eszter Dr. Kovats; Istvan Dr. Budapest Hu Teplan
Original assignee: INNOFINANCE ALTALANOS INNOVACIOS PENZINTEZET BUDAPEST HU
Current assignee: INNOFINANCE ALTALANOS INNOVACIOS PENZINTEZET BUDAPEST HU
Priority date: 1985-07-18
Filing date: 1986-07-18
Publication date: 1991-07-11
Also published as: FI862989A0; FI862989A; NO862898D0; IT1213100B; JPS6284026A; ES2020352A6; DE3624422A1; DK344386A; RU1837888C; NL8601881A; HU193607B; SE8603164L; FI85440C; LU86518A1; BE905096A; SE462518B; FI85440B; NO862898L; US4753928A; IT8621057A0

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von D-Phe⁶, Gln⁸- GnRH, D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH-ehtylamid und/oder D-Phe⁶, Trp⁷, Leu⁸-GnRH.

Das Symbol GnRH ist, beispielsweise in der US-PS 39 14 412, als "natürliches follikelstimulierendes luteinisierendes Hor mon freisetzendes Hormon" definiert.

Zur Stimulierung der Geschlechtsfunktion beziehungs weise zum Induzieren der Ovulation werden in erster Linie bei Nutz- und Zuchttieren verbreitet verschiedene Hormonpräparate, wie Steroide, Gonadotropine beziehungsweise neuestens GnRH und gewisse superaktive Analoge dieses Hormons verwendet. Die bekannten Substanzen beziehungs weise Verfahren induzieren nur die Ovulation der bereits rei fen, aber aus irgendeinem Grund nicht freigesetzten Eizelle beziehungsweise sind nur dazu geeignet, ein im normalen Ab lauf des Zyklus vorhandenes Hemmnis durch hormonale Wirkung für einmal, impulsartig zu beseitigen und dadurch die Ovula tion zu induzieren. Gegenwärtig ist kein Hormonpräparat be ziehungsweise Verfahren, welches die Funktion des Eierstockes allgemein stimuliert, den Reifungsprozeß des prä antralen oder der primordialen Follikels fördert beziehungs weise die Anzahl der in der Entwicklung begriffenen Follikel erhöht, bekannt.

Es ist auch kein Präparat beziehungsweise Ver fahren, mit dessen Hilfe aus nicht geschlechtsreifen Tieren beziehungsweise aus Tieren, in denen die Entwicklung der Geschlechtsprodukte in einem bestimmten frühen Abschnitt stehengeblieben ist, oder aus intakten Tieren in vitro be ziehungsweise aus Gonaden post mortem zur Befruchtung geeignete Geschlechtsprodukte herstestellt werden können, bekannt.

Die Funktion der Gonaden beziehungsweise die Erzeugung der Geschlechtsprodukte unterliegt bei zahlreichen Zuchttieren infolge ungeeigneter Haltung beziehungsweise bei bestimmten hochwertigen exotischen Wild- und Pelztieren infolge der nicht natürlichen Haltung einer Rückentwicklung oder bleibt stehen. Im Falle dieser Tiere haben sich die bisher bekannten Hormonpräparate im allgemeinen als wirkungslos erwiesen.

Die in letzter Zeit bekannt gewordenen artspezifi schen GnRH-Derivate (J.A. King und R.P. Millar, J. Biol. Chem. 257 [1982], 10 722 bis 10 728; N. Sherwood und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Scj. 80 [1983], 2 794 bis 2 798 sowie die Tatsache, daß im Fachschrifttum über die Gegenwart unter schiedlicher GnRH-artiger Faktoren in den Gonaden beziehungsweise Ovarien be richtet wird (R. M. Sharpe und Mitarbeiter, Nature 290 [1981], 785 bis 787; N. Dekel und Mitarbeiter, Biol. Reprod. 28, [1983] 161 bis 166, werfen die Frage spezieller regelnder Faktoren und der Wechsel wirkung mit diesen auf.

Die in der DE-OS 34 46 959 beschriebenen fisch- be ziehungsweise vogelspezifischen GnRH-Derivate sind im Falle von sich im übrigen in der Gefangenschaft nicht vermehrenden Fischen geeignet, Geschlechtsprodukte zu gewinnen. Diese Wirkung beruht auf einer Stimulierung der Follikelentwicklung.

Ferner sind aus der US-PS 44 10 514 Peptide der Formel

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-R₆-Trp-Leu-Pro-R₁₀-NHR,

worin R₆ ein D-Isomer eine α-Aminosäure unter anderen D-Phenylalanylrest bedeutet, R₁₀ unter anderen für einen Glycylrest stehen kann und R unter anderen Wasserstoff dar stellen kann, bekannt. Als Wirkung dieser Verbindungen ist die Förderung des Laichens von Fischen angegeben, wobei ledig lich spekulativ bemerkt ist, daß sie auch Wirkungen auf das Fortpflanzungssystem von Säugetieren haben könnten. Diese hypothetische Bemerkung ist auf keine einzige spezielle Ver bindung gerichtet.

Weiterhin sind in der EP-OS 1 45 258 Nonapeptid- und Decapeptid- Analoge von LHRH (GnRH), die als LHRH-Agonisten verwend bar sind, beschrieben. Als Formel dieser Peptide ist

(pyro)GLu-His-A-Ser-B-C-D-E-Pro-F,

worin A für einen Tryptophylrest stehen kann, B einen Tyrosylrest bedeuten kann, C einen substituierten D-Alanyl- oder D-Homoarginylrest bedeuten kann, D für eine Tryptophanyl- oder Leucylrest stehen kann, E einen Glutaminyl- oder Leucylrest darstellen kann und F für einen Glycinamid- oder Glycin(äthyl)-amidrest stehen kann. Es ist angegeben, daß diese Derivate zur Beeinflussung der Geschlechtstätigkeit von Säugetieren geeignet sind. Weiterhin ist bei der Schilderung des Standes der Technik auf Seite 3, Zeilen 19 bis 34 ange geben, daß der Ersatz des Glycylrestes in der 6-Stellung durch eine D-Aminosäure (unter anderem D-Phe) in einer Reihe von Analogen von LHRH eine erhöhte Wirksamkeit erzielt. Diese Angabe bezieht sich aber auf Peptide, die in der 8-Stellung einen Argininrest aufweisen. Ferner sind an der genannten Stelle dieser Druckschrift, die als Abgrenzung gegenüber dem damaligen Stand der Technik anzusehen ist, nur Polypeptide anderer Grundstruktur als die im folgenden festgelegten er findungsgemäßen unter Nennung zahlreicher Literaturstellen erwähnt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Möglich keit zur Beeinflussung der Geschlechtstätigkeit von Säugetieren, mit welcher die Tätigkeit der Geschlechts organe von Säuretierembryonen und Säugetieren derart stimuliert werden kann, daß zur natürlichen oder künst lichen Befruchtung geeignete Geschlechtsprodukte hergestellt und diese zur Schaffung von Nachkommen verwendet werden können, wobei die Geschlechtsprodukterzeugung männlicher und weiblicher Säugetiere, bezogen auf die für die Art charakteristische Lebensleistung, vervielfacht werden kann, zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von D-Phe⁶, Gln⁸- GnRH, D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH-ethylamid und/oder D-Phe⁶, Trp⁷, Leu⁸-GnRH zur Beeinflussung der Geschlechtstätig keit von Säugetieren gelöst.

Die Erfindung beruht demgemäß auf der überraschenden Feststellung, daß bei Verwendung der erfindungsgemäß spezifizierten Peptide es möglich ist, aus nicht geschlechts reifen sowie in saisonalem Anöstrus oder in durch nicht na türliche Haltung bedingter Anöstrie befindlichen Säugetieren in vivo und in vitro aus intakten Tieren sowie aus Ge schlechtsorganen post mortem zur natürlichen oder künstlichen Befruchtung geeignete Geschlechtsprodukte herzustellen bzw. deren Menge zu vervielfachen.

Gegenüber dem aus der US-PS 44 10 514 der EP-OS 1 45 258 be kannten Stand der Technik ist der vorliegende Gegenstand insbesondere aus den folgenden Gründen eine Erfindung.

a) Die in der US-PS 44 10 514 genannte Bemerkung vermag dem Fachmann für die Verwendung der beanspruchten Ver bindungen keine Anregung zu geben, denn es fehlt dort jegliche Konkretisierung. Darüber hinaus zeigt diese Be merkung, daß überhaupt keine Versuche in Richtung auf die Anwendung bei Säugetieren gemacht wurden.
b) Es fehlt in der US-PS 44 10 514 jeglicher spezielle Hin weis, welche der dort umfaßten sehr großen Anzahl von Verbindungen eine Wirkung bei Säugetieren haben mögen. Es liegt also beim vorliegenden Gegenstand eine spezifi sche Auswahl vor. Der US-PS 44 10 514 ist nämlich nicht der geringste hypotetische Hinweis zu entnehmen, daß ge rade die an dritter Stelle des Anspruches genannte Ver bindung, die besonders gute, die Geschlechtstätigkeit von Säugetieren beeinflussende Wirkung hat.
c) Diese Wirkung wurde aber für die dritte Verbindung des Anspruches dadurch gezeigt, daß sie selbst bei Tieren, deren Geschlechtstätigkeit bisher nicht zu beeinflussen war, wie einem infertilen sibririschen Tiger mit degene rierten Spermabild, eine sehr gute Wirkung zeigt. Davon ist nicht nur in der US-PS 44 10 514, sondern auch in der EP-OS 1 45 258 keine Rede.
d) Zwar ist aus der Abhandlung des Standes der Technik in der EP-OS 1 45 258 bekannt, daß der Ersatz von Gly in der 6-Stellung durch eine D-Aminosäure (unter anderem auch D-Phe) in einer Reihe von Analogen von LHRH eine erhöhte Wirksamkeit erzielt. Dies kann aber aus den folgenden Gründen nicht auf die vorliegende Erfindung hinführen.

Zunächst bezieht sich die dortige Angabe auf Peptide, die in der 8-Stellung einen Argininrest aufweisen. Diesen Weg hat die vorliegende Erfindung aber nicht eingeschla gen.

Ferner sind aus der genannten Stelle der EP-OS 1 45 258, die als Abgrenzung gegenüber dem damaligen Stand der Technik anzusehen ist, nur Polypeptide anderer Grund struktur unter Nennung zahlreicher Literaturstellen er wähnt. Daher vermag auch die Kombination der US-PS 44 10 514 und der EP-OS 1 45 258 die Erfindung nicht nahezulegen.

In der NL-OS 84 03 889 wird ein Verfahren zur Herstellung von zur natürlichen oder künstlichen Befruchtung geeigneten Geschlechtsprodukten aus geschlechtsreifen Fischen be schrieben, während durch die erfindungsgemäße Verwendung der oben spezifizierten Verbindung die Geschlechtstätigkeit von Säugetieren beeinflußt wird.

Die DE-OS 34 46 997 beschreibt im wesentlichen die gleichen Gona doliberinderivate, die auch erfindungsgemäß verwendet werden, jedoch zur Vermehrung von Fischen.

Die US-PS 40 05 063 hat den Einsatz von Nonapeptiden, die von den erfindungsgemäß verwendeten verschieden sind, für die Induzierung der Ovulation in Warmblütern zum Inhalt.

Die US-PS 39 14 412 betrifft ein Verfahren zur Induzierung der Ovulation in Warmblütern unter Einsatz der gleichen bzw. ähnlichen Verbindungen, die in der US-PS 40 05 063 beschrieben werden. Von den in den beiden zuletzt genannten US-Patentschriften beschriebenen Verbindungen unterschei den sich die erfindungsgemäß eingesetzten hauptsächlich darin, daß sie als Substituenten X₃ keinen Rest von Arginin enthalten können.

Die Vorteile, die bei Verwendung der erfindungsgemäß spezi fizierten Verbindungen gegenüber den US-Patentschriften 40 05 063 und 39 14 412 erzielt werden, sind folgende:

Unter Einsatz der bekannten superaktiven GnRH-Analoga kann die Follikulogenesis bzw. Spermatogenesis nicht stimuliert werden, und zwar im Gegensatz zu den erfindungsgemäß einge setzten Verbindungen, weil bei einer Behandlung mit den bekannten Verbindungen die Desensibilisierung der gonado tropen und der steroidalen Hormone erfolgt. Demgegenüber tritt im Falle der Verwendung der erfindungsgemäß ein gesetzten Verbindungen keine Desensibilisierung der ge nannten Hormone auf

Da die erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen keine Desensibilisierung hervorrufen, kann unter Verwendung dieser Substanzen die Geschlechtsfunktion der Tiere stimuliert werden, was unter Einsatz der aus den beiden genannten US-Patentschriften bekannten Verbindungen nicht möglich ist.

Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Nona paptidalkylamide bzw. Dekapeptidamide der allgemeinen Formel I ist aus der DE-OS 34 46 997 sowie der US-PS 44 10 514 bekannt.

Zweckmäßig werden erfindungsgemäß die Verwendungen in der Weise verwendet, daß die Medien mindestens 1mal, höchstens jedoch 60mal, vorzugsweise 1- bis 5mal mit ihnen in Mengen von 0,01 bis 500 µg/kg Körpergewicht, vor zugsweise 1 bis 100 µg/kg Körpergewicht, behandelt und zwischen den einzelnen Behandlungen Pausen von min destens 2 Stunden, höchstens jedoch 7 Tagen, vorzugs weise 2 bis 8 Stunden eingehalten werden.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen können in Form von veterinärmedizinischen Präparaten, bevorzugt in Form von Lösungen, Pulvern, Injektionslösungen oder Sprays, vorliegen. Ihre Verabreichung kann vorteilhaft intra muskulär, intraperitoneal, subkutan oder intrauterinär erfolgen.

Durch den Einsatz der erfindungsgemäß definierten Ver bindungen kann die Tätigkeit der Geschlechtsorgane der Säugetiere ge regelt werden. Gegebenenfalls können aus den mit ihrer Hilfe gewonnenen Geschlechtsprodukten Nachkommen erzeugt werden.

Bei manchen Tierarten wird durch die erfindungsgemäße Ver wendung der oben definierten Verbindungen die Erzeugung von Geschlechtsprodukten gesteigert, bei anderen Tieren (klini schen Fällen) wird die verminderte oder pausierende Geschlechtstätigkeit normalisiert und erreicht die für die Art typische Intensität.

Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen sind auch zur Auslösung einer Hyperproduktivität der Geschlechts organe und damit zur Vervielfachung der für die Art charakteristischen Menge an Geschlechtsprodukten (Super ovulation) geeignet.

Durch die erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen wird die Funktion der Keimhaut stimuliert, wodurch die Anzahl der motilen Samenzellen im Ejakulat ansteigt.

Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen bewirken ferner eine Auslösung einer Hyperproduktion der Hypophyse, nach welcher die Hypophyse unempfindlich wird und dadurch ein Gleichgültigkeitszustand eintritt. Auf diese Weise ist durch den erfindungsgemäßen Einsatz der oben definierten Verbin dungen bei höheren Dosen auch eine Empfängnisverhütung möglich.

Ferner können durch die erfindungsgemäße Verwendung der oben definierten Verbindungen die Endprodukte unter natürlichen und unter künstlichen sowie unter laboratoriumsmäßig auf rechterhaltenen Lebensbedingungen hergestellt werden.

Die beschriebenen, durch Dosierung der GnRH-Analoge in unterschiedlichem Rhythmus geregelten Formen der ge schlechtlichen Funktionen sind nicht vorbekannte neue Er scheinungen.

Die Hauptvorteile der Erfindung sind zusammengefaßt wie folgt.

a) Durch den erfindungsgemäßen Einsatz der oben definierten Ver bindungen kann die Gonadentätigkeit von unter nicht natürlichen Bedingungen gehaltenen Säugetieren verbes sert bzw. die normale Funktion wiederhergestellt wer den, die Tiere werden zur Erzeugung von Nachkommen ge eignet gemacht.
b) Durch die erfindungsgemäße Verwendung der oben definierten Verbin dungen kann eine Hyperproduktion der Eierstöcke induziert werden, wodurch ein Mehrfaches an Eizellen, bezogen auf die für die jeweilige Art charakteristische Anzahl der Ovulationen, gewonnen werden kann. Diese können nach einer in vitro erfolgenden Befruchtung in Form von Embryos aufbewahrt oder von als Empfänger wirkenden Tieren ausgetragen werden.
c) Durch die erfindungsgemäße Verwendung der oben definierten Verbin dungen kann in infantilen Exemplaren von Säugetieren eine Hyper stimulierung der Gonaden und dadurch eine Superovulation induziert werden. Auf diese Weise können von einem Medium schon zu einem Zeitpunkt, zu welchem das Medium selbst noch nicht ge schlechtsreif ist Nachkommen gewonnen werden.
d) Die erfindungsgemäße Verwendung der oben definierten Verbin dungen eignet sich unter speziellen Laboratoriumsbedin gungen in Organkulturen zur Herstellung von in vitro be fruchtbaren Eizellen aus intakten Eierstöcken post mortem. Auf diese Weise können aus hochwertigen Zuchttieren auch nach dem Tode des Mediums Nachkommen gewonnen werden.
e) Der Vertrieb, der unter dem erfindungsgemäßen Einsatz der oben de finierten Verbindungen hergestellten Geschlechtsprodukte ermöglicht die durch die Entfernung zwischen den großen Erd teilen gehinderte Hybridisierung der Arten und dadurch ist die Möglichkeit zur Züchtung neuer Nutztierarten gegeben.
f) Durch die erfindungsgemäße Verwendung der oben definierten Verbin dungen können unter großtechnischen beziehungsweise industriemäßigen Produktionsbedingungen aus beliebigen Altersgruppen männlicher und weiblicher Säugetiere große Mengen an Eizellen, Samen oder Embryos hergestellt werden, was zum Beispiel die Schaffung Embryobanken und den interkontinentalen Vertrieb der Nachkommen ermöglicht.
g) Durch den erfindungsgemäßen Einsatz der oben definierten Verbin dungen können der saisonbedingte Anöstrus und die gehemmte Sper matogenese von Säugetieren aufgehoben werden. Dadurch sind zu jedem Zeitpunkt Nachkommen erzeug bar, was zu einer besseren Nutzung der wirtschaft lichen Objekte führt.
h) Durch die erfindungsgemäße Verwendung der oben definierten Ver bindungen ist eine künstliche Vermehrung von unter Na turschutz stehenden seltenen Arten möglich.
i) Mit den erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen kann sowohl in männlichen als auch in weiblichen Säugetieren die Hypophyse unempfindlich gemacht werden und da durch kann eine unerwünschte Trächtigkeit auch in Fällen, in denen die bekannten Empfängnisverhütungsmittel nicht anwendbar sind, vermeiden werden.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Auslösung einer Superovulation an infantilen weiblichen Ratten

60 Stück 21 Tage alte, infantile weibliche Ratten von 7-8 g Gewicht wurden intraperitoneal mit in physiologischer Kochsalzlösung gelöstem D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. Abhängend von der Art der Behandlung wurden die Tiere in mehrere Gruppen eingeteilt. In der zwischen einem Tag und 8 Tagen dauernden Behandlungsreihe wurden Vordosen von 1 beziehungsweise 2 µg 1mal beziehungsweise 2mal pro Tag verabreicht. Die Behandlung wurde mit Dosen von 5 beziehungsweise 10 µg pro Tag beendet.

Nach Beendigung der Behandlung wurden sämtliche Tiere mit Ätherdampf getötet, und ihre Eierstöcke wurden nach Eintritt des Todes, 24 Stunden nach der letzten Behandlung herausoperiert. Die Auswertung erfolgte visuell und an Hand histologischer Proben. In den Eierstöcken der Kontrolltiere wurden mehrere in der Entwicklung befindliche Follikel gefunden, aber keines erreichte die Größe Graf'scher Follikel, auch waren weder Gelbkörper noch Corpus haemorrhagicum vorhanden. Demgegenüber konnte bei allen behandelten Gruppen Hormonwirkung nachgewiesen werden, die sich im Wachstum der Follikel, der Umbildung zu Graf'schen Follikeln, der Ovulation großer Follikel und der Herausbildung normaler Gelbkörper äußerte. Auch Eileiter und Gebärmutter waren vergrößert. Von den 60 behandelten Tieren zeigten insgesamt 4 keine Reaktion auf die Behandlung. Bei den Tieren, die 4 Tage lang täglich zweimal 2 µg GnRH-Analog erhalten hatten und am 4. Tag 6 Stunden nach der 2 µg-Dosis mit einer Dosis von 10 µg behandelt worden waren, befanden sich in den Eierstöcken unmittelbar vor der Ovulation stehende, weich gewordene Graf'sche Follikel in großer Menge. Die Anzahl der endgültig reifen Graf'schen Follikel pro Tier lag zwischen 60 und 90, während im Falle ausgewachsener Tiere der Normalwert bei 12 liegt. Eine zweite Gruppe der Tiere wurde auf die gleiche Weise behandelt mit dem Unterschied, daß sich die Behandlung über 6 Tage erstreckte. Im Falle dieser Gruppe wurde die Superovulationsleistung nach der Anzahl der in den Eierstöcken entstandenen normalen Gelbkörper bewertet. Ähnlich wie im Falle der weiter oben ausführlich beschriebenen Ergebnisse war die Anzahl der Gelbkörper pro Tier auch hier zwischen 60 und 90. Die histologische Auswertung bestätigte dieses Ergebnis in vollem Maße.

Auf die beschriebene Weise wurden einesteils bereits in noch infantilen Exemplaren der Art reife Eizellen hergestellt, zum anderen wurde die Anzahl der Eizellen verglichen mit dem physiologischen Wert der erwachsenen Tiere vervielfacht.

Beispiel 2

Auslösung einer Superovulation an infantilen weiblichen Mäusen

Auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise wurden insgesamt 105 weibliche Mäuse behandelt, die 28 Tage alt waren und ein Gewicht von 5-6 g aufwiesen. Die 1-8 Tage lang behandelten Tiere bekamen täglich zweimal 1-5 µg D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH- äthylamid. Zwischen den einzelnen Behandlungen lag eine Zeit von 4 Stunden. Die Eierstöcke wurden 27 Stunden nach der letzten Injektion entfernt.

Die Eierstöcke der Kontrollgruppe waren von mattgelber Farbe und homogener Struktur, in manchen Eierstöcken befanden sich 1-2 wachsende Follikel. In den Gruppen der behandelten Tiere konnte an allen Eierstöcken, vergrößerten Eileitern und der Gebärmutter die Wirkung des Hormons beobachtet werden. Bei den Tieren, die täglich einmal eine Dosis von 1 µg und am 3. Tag vier Stunden nach der 1 µg-Dosis 5 µg des genannten GnRH-Analogs erhalten hatten, waren in den Eierstöcken endgültig ausgereifte, sich wellig anfühlende Graf'sche Follikel zu finden, und zwar pro Tier 45-70 Stück. Bei einer ähnlich, aber 5 Tage lang behandelten Gruppe hatten sich an der Stelle der Graf'schen Follikel normale Gelbkörper in der genannten Anzahl gebildet. Das Ergebnis der histologischen Untersuchung stimmte mit dem der visuellen Auswertung überein.

Die Ergebnisse bestätigten die Ergebnisse mit dem Mittel gemäß Beispiel 1.

Beispiel 3

Auslösung einer Superovulation an infantilen Kaninchen

20 unter den Bedingungen der Massenhaltung geborene junge Kaninchen der Rasse "Weiße Perle" im Alter von 42 Tagen wurden drei Tage lang täglich zweimal intraperitoneal mit je 5 µg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. Dann wurden die Tiere in zwei Gruppen eingeteilt. Die eine Gruppe wurde am 4. Tag mit 50 µg Wirkstoff behandelt, die andere Gruppe mittels Ätherdampf getötet. Die Anzahl der reifen Graf'schen Follikel in der vor der Behandlung mit 50 µg Wirkstoff getöteten Gruppe diente als Kontrollgruppe bei der Feststellung der durch die Dosis von 50 µg eingetretenden Veränderung. Bei den am Leben gelassenen Tieren wurde der Eintritt der Ovulation an zwei Tieren durch eine 10 Stunden lang dauernde, unter Narkose vorgenommene laparoskopische Untersuchung (Spiegelung der Bauchhöhle) verfolgt. Die Behandlung mit 50 µg hatte nach 26 Stunden pro Tier 30-45 Ovulationen beziehungsweise Corpus haemorrhagicum zur Folge, während die Eierstöcke der Kontrolltiere inaktiv waren.

Auf die obige Weise konnten bereits aus infantilen Exemplaren von Kaninchen reife Eizellen hergestellt und deren Anzahl, bezogen auf den physiologischen Wert, vervielfacht werden.

Beispiel 4

Auslösung einer Superovulation an infantilen Schweinen

20 infantile weibliche Ferkel, die 100 Tage alt waren, wurden 6 Tage lang täglich zweimal intramuskulär mit je 10 µg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. Zur Auswertung wurde aus den Kontrolltieren je ein Eierstock entfernt, die Untersucheungsmethoden entsprachen den in Beispiel 3 beschriebenen, die Anzahl der gebildeten Graf'schen Follikel und die Anzahl der nach der Ovulation gebildeten Gelbkörper wurde verglichen. Der Eintritt der Ovulation wurde mit dem Laparoskop beobachtet. Die am 7. Tag verabfolgte Dosis von 100 µg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH hatte nach 41 Stunden an den 10 behandelten Ferkeln 15-36 Ovulationen zur Folge. Die Behandlung der infantilen Ferkel führte zu dem gleichen Ergebnis wie im Falle der in den Beispielen 1-3 genannten Tierarten.

Beispiel 5

Auslösung einer Superovulation an infantilen Schafen

10 Jerke-Lämmer, die 50 Tage alt waren, wurden 5 Tage lang täglich zweimal mit 10 µg D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH- äthylamid intramuskulär behandelt. Eine am 6. Tag verabreichte Dosis von 70 µg Wirkstoff hatte pro Tier 3-9 Ovulationen zur Folge. Bei den Kontrolltieren trat keine Veränderung ein. Die Auswertung erfolgte sowohl bei den behandelten Tieren wie auch bei der Kontrollgruppe mittels Laparoskopie. Die Ergebnisse stimmten mit den in den Beispielen 1-3 beschriebenen überein.

Beispiel 6

Auslösung einer Superovulation an infantilen Rindern

8 infantile Kälber, die 65 Tage alt waren, wurden 8 Tage lang täglich dreimal mit 2 µg D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH-äthylamid behandelt. Nach einem Tag Pause, am 10. Tag wurden den Tieren intramuskulär 100 µg Wirkstoff appliziert. Nach der letzten Injektion wurden beide Eierstöcke entnommen; im allgemeinen wurden pro Eierstock etwa 5-11 entwickelte Graf'sche Follikel gefunden. Die Hälfte der Follikel fühlte sich nicht mehr so hart an, stand demnach unmittelbar vor der Ovulation.

Dieser Versuch beweist, daß auch im Falle von Rindern schon aus infantilen Tieren mehrere reife Eizellen gewonnen werden können, während das erwachsene Rind normalerweise nur eine Eizelle ovuliert.

Beispiel 7

Behandlung physiologischer Oligospermie bei Schimpansen zwecks Erzielung von Normospermie

Für in kleinen Gruppen lebende Tierarten, insbesondere jedoch für die Primaten ist die in der Fachliteratur mehrfach publizierte Tatsache charakteristisch, daß zwar alle Männchen in der Horde eine aktive Libido haben, aber nur die Leittiere kopulieren, während die untergeordneten Männchen physiologisch und reversibel oligospermisch sind. Im vorliegenden Fall wurde außer dem vom Leittier gesammelten und in der Spermabank gelagerten Sperma ausgesprochen zum Zweck der Insemination noch das Sperma der subordinierten 4 Männchen (alle geschlechtsreif) benötigt. Vor der Behandlung wurden die Tiere unter Narkose auf elektrischem Wege zur Ejakulation gebracht. Die Ejakulate wurden unter dem Mikroskop nach Dichte und Motilität bewertet und dann einer Tiefkühlprobe (-196°C) unterzogen. Eigene frühere spermatologische Untersuchungen hatten nämlich gezeigt, daß mikroskopisch schlecht erfaßbare defekte Samenzellen die Tiefkühlung nicht überleben. Das nach der Tiefkühlung erhaltene günstige Spermabild zeigte, daß die Spermiogenese normal abläuft. Das vor der Behandlung von den untersuchten Männchen genommene Ejakulat zeigte physiologische Oligospermie. Danach erhielten die 60-90 kg schweren Schimpansen wöchentlich einmal 100 µg D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH-äthylamid in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung. Die Applikation erfolgte intramuskulär mit einem Preßlufteinschußgerät. In den Ejakulaten, die in der 4. Woche nach der ersten Behandlung unter Narkose, auf elektrischem Wege gewonnen wurden, konnte ein Anteil von 40-60% Spermium-Vorformen registriert werden, deren Motilität nach der Tiefkühlprobe unter 10% lag. In den Ejakulaten, die 60 Tage nach der ersten Behandlung gewonnen wurden, war der Anteil der defekten Samenzellen geringer als 30%, und die Motilität überstieg 60%. Quantitative und qualitative Eigenschaften der Ejakulate stimmten mit denen des vom Leittier gewonnenen sowie mit den Angaben der Fachliteratur überein. Beim Tiefkühlen der im Verhältnis 1 : 1 verdünnten Ejakulate sank die 60%ige Motilität nur auf 45%. Sperma dieser Qualität ist sowohl frisch wie auch tiefgekühlt für Inseminationszwecke geeignet.

Auf die beschriebene Weise kann aus subordinierten Männchen zur Befruchtung geeignetes, in der Spermabank lagerbares Sperma geeigneter Menge und Qualität gewonnen werden.

Beispiel 8

Auslösung der Spermiogenese bei einem saisonbedingt oligospermischen Wisentstier zum Zwecke der Gewinnung von zur Insemination und zur Tiefkühllagerung geeignetem Ejakulat

Von einem im Besitz des zoologischen Gartens befindlichen, etwa 700 kg schweren Wisentstier wurde im Monat Mai unter Narkose, auf elektrischem Wege eine Samenprobe genommen. Es wurde festgestellt, daß der Stier sich im Zustand saisonbedingter Oligospermie befand. Die Symptome waren folgende: im Gesichtsfeld des zur Spermauntersuchung im allgemeinen benützten, 1500fach vergrößernden Mikroskops war die Spermiumzahl 5-20, der Anteil der defekten Samenzellen betrug 75-80% und die Dichte des Spermas 0,5. Sperma dieser Qualität ist zur Befruchtung ungeeignet.

Das Tier wurde nun intramuskulär (mittels eines Preßlufteinschußgerätes) wöchentlich zweimal mit je 200 µg D-Phe⁶, Gln⁸- GnRH behandelt. Am 55. Tag nach Beginn der Behandlung wurde das Tier zweimal, mit einer Stunde Zeit dazwischen, zur Ejakulation gebracht. Die beiden Ejakulate wurden vereinigt; die Dichte betrug 4, die Motilität 55%. Das Sperma wurde tiefgekühlt und dann die durch das Tiefkühlen eingetretene Motilitätsverminderung bestimmt. Diese betrug nur 5%.

Auf diese Weise gelang es, die Spermiogenese des Zuchttieres so zu beeinflussen, daß statt des zur Befruchtung nicht verwendbaren Ejakulats ein sowohl im frischen Zustand wie auch nach einer Tiefkühllagerung zur Befruchtung mehrerer Kühe (insgesamt 14) geeignetes Sperma sehr guter Qualität gewonnen werden konnte.

Beispiel 9

Auslösung der Spermiogenese bei saisonbedingt oligospermischen Rotfüchsen (Vulpes vulpes)

Die Spermiogenese von im Tierpark gehaltenen, saisonbedingt oligospermischen Rotfüchsen sollte zu dem Zweck beeinflußt werden, daß die in Zuchtstationen gehaltenen Edelsilber- und Blaufüchse inseminiert werden können, um besondere und hochwertige Hybridfelle herstellen zu können. Aus der Fachliteratur ist bekannt, daß sämtliche Unterarten der Füchse nur einmal im Jahr läufig sind und außerhalb dieser einen Periode die Gonaden beider Geschlechter völlig inaktiv sind. Zwischen dem Östrus der einzelnen Unterarten besteht eine zeitliche Differenz von mehreren Monaten (Rotfuchs: Januar, Blaufuchs: April bis Mai). Die Ergebnisse der Untersuchung wurden mit dem Spermabild einer im saisonalen Östrus befindlichen Population verglichen, bei der die durchschnittliche Ejakulatmenge 2 ml, die Dichte 3 und die Motilität 50-60% betrug. Dies wurde als physiologischer Wert betrachtet.

Fünf geschlechtsreife männliche Rotfüchse von durchschnittlich 8 kg Gewicht wurden beginnend im April sieben Wochen lang wöchentlich zweimal mit 1, 5, 10, 50 µg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. In der 3. Woche nach Beginn der Behandlung wurden Spermaproben genommen. In den Proben betrug die Anzahl der Samenzellen etwa 60-70% des physiologischen Wertes, die Anzahl der degenerierten Spermien überstieg 40%. Die defekten Formen waren zum überwiegenden Teil Jungformen (Plasmatropfen am Mittelteil des Halsteiles). In der 7. Woche nach Beginn der Behandlung wurde unter Narkose erneut Ejakulat gesammelt. Von sämtlichen Tieren konnte erfolgreich Samen genommen werden, das Volumen des Ejakulats betrug zwischn 1,2 ml und 3,1 ml, die Dichte lag bei 3, die Motilität 65%, überstieg numerisch den physiologischen Wert wesentlich. (Die männlichen Tiere waren in dieser Zeit von den weiblichen getrennt, zu einer Entleerung durch Kopulation bestand keine Möglichkeit.) Die Spermaproben wurden nach Qualität in Gruppen eingeteilt und tiefgekühlt. Nach dem Verdünnen und Tiefkühlen und schließlich dem Auftauen war die Motilität des auf -196°C gekühlten Spermas 45%. Unter Verwendung des tiefgekühlten Spermas konnte - unter Anwendung der GnRH-Programmierung (s. Beispiel 17) und der Inseminationstechnik - bei Blaufüchsen eine normale Trächtigkeit erreicht werden.

Durch bei den fünf Füchsen vorgenommene einmalige Ejakulatabnahme konnten 56 Dosen zur Befruchtung geeigneten Spermas hergestellt werdne. Die Technik ist zur Herstellung von Hybridedelfellen in Großfarmen geeignet.

Beispiel 10

Behandlung eines wegen degenerierten Spermabildes infertilen sibirischen Tigers

Ein im Besitz des zoologischen Gartens befindlicher, 8 Jahre alter sibirischer Tiger von 120 kg Gewicht lebte seit drei Jahren mit einer Tigerin zusammen. Im Östrus des Weibchens fanden regelmäßig Paarungen statt, aber Nachwuchs stellte sich nie ein. Daß die Trächtigkeit durch Schuld des Weibchens nicht zustandekam, mußte ausgeschlossen werden, weil die Tigerkatze früher von einem anderen Männchen schon trächtig gewesen war und ihre Jungen auch aufgezogen hatte.

Von dem Tigermännchen wurde unter Narkose, auf elektrischem Wege eine Spermaprobe genommen. Das Ejakulat war sehr dünn, pro Gesichtsfeld waren 4-5 degenerierte Spermien sichtbar, die eine zitternde Bewegung vollführten. Die Form der Degenerationen war für die jüngeren Phasen der Spermatogenese charakteristisch. Das Tier wurde wöchentlich einmal intramuskulär (mittels eines Preßlufteinschußgerätes) mit 100 µg D-Phe⁶, Trp⁷, Leu⁸-GnRH, gelöst in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung, behandelt. Der Tiger wurde zusammen mit seiner Tigerin gehalten, und auch während der Zeitdauer der Behandlung fanden regelmäßig Paarungen statt. Das Weibchen wurde trächtig und gebar drei gesunde kleine Tiger. Aus dem Zeitpunkt der Geburt kann geschlossen werden, daß die fertile Kopulation 40-50 Tage nach der ersten Behandlung stattfand.

Das Mittel ist demnach zur Behandlung des degenerierten Spermabildes infertiler männlicher Tiger und auf diese Weise zur Erzielung von Nachwuchs geeignet.

Beispiel 11

Stimulierung physiologischer Normospermie an einem bengalischen Tiger zur Erzielung von die Tiefkühlung ermöglichender Hyperspermie

Ein im Besitz des zoologischen Gartens befindlicher, 8 Jahre alter bengalischer Tiger von etwa 200 kg Gewicht paarte sich regelmäßig, sein Weibchen war früher in jedem Jahr trächtig gewesen. In Kenntnis dessen wurde von dem Tiger unter Narkose, auf elektrischem Wege in der Paarungszeit eine Spermaprobe genommen. Es wurde festgestellt, daß die Dichte des Spermas 3, die Motilität 30% und die Menge des Ejakulats 0,2 ml betrug. Das Ejakulat zeigte das Bild physiologischer Normospermie. Eine derart geringe Menge Ejakulat kann aus technischen Gründen nicht tiefgefroren werden. Um eine Leberschädigung zu vermeiden, darf die Narkose höchstens alle 4 Tage vorgenommen und höchstens 4-5 Stunden lang aufrechterhalten werden. Diese Art des Spermasammelns ist nicht durchführbar.

Das Männchen wurde in einen getrennten Käfig gesperrt und 12 Tage lang täglich mit 10 µg D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH-äthylamid behandelt. Der Wirkstoff wurde in 1 ml physiologischer Kochsalzslösung gelöst und mittels eines Preßlufteinschußgerätes intramuskulär appliziert. Am 12. Tag wurde das Tier unter Narkose, auf elektrischem Wege zweimal, mit einer Stunde Zeit dazwischen, zur Ejakulation gebracht, dabei wurden 1 ml beziehungsweise 0,8 ml Sperma gewonnen. Die Dichte der vereinigten Proben betrug 4, die Motilität lag bei 70%. Die Spermaproben wurden tiefgekühlt und in 21 Einzeldosen zur künstlichen Befruchtung aufgeteilt. Nach dem Auftauen des Spermas betrug die Motilität 60%.

Auf diese Weise konnte von einem bengalischen Tiger in einer Spermabank lagerbares Sperma in bedeutender Menge gewonnen werden.

Beispiel 12

Behandlung einer durch nicht natürliche Haltung verursachten Apsermie an einem Orang-Utan

Ein im Besitz des zoologischen Gartens befindlicher, 18 Jahre alter männlicher Orang-Utan von etwa 350 kg Gewicht war als Jungtier eingefangen worden. Er hatte nacheinander drei Eigentümer gehabt. Der Anamnese nach hatte er nie eine Gefährtin gehabt, sondern war immer allein gehalten worden und hatte sich nie gepaart. Im Zoo lebter er seit 11 Jahren ohne Artgenossen und ohne Weibchen. Sein Verhalten war phlegmatisch, inaktiv, von Hospitalisationssymptomen gekennzeichnet. Der zoologische Garten bekam ein Angebot, demzufolge eine Institution das Tier kaufen würde, wenn es zu der Borneo-Unterart gehört und fertil ist. Die Chromosomenuntersuchung wies aus, daß das Tier zu der Borneo-Unterart gehört, d. h. ein außerordentlich seltenes Exemplar ist (auf der ganzen Welt gibt es 153 Exemplare). In der Anamnese stellte die Tatsache, daß die für die männlichen Primaten charakteristische Aggressivität und das regelmäßige Masturbieren seit der Zeit der vor etwa 5-6 Jahren entstandenen Hospitalisation völlig aufgehört hatten, die Fertilität in Frage. Von dem Tier wurde unter Narkose, auf elektrischem Wege eine Spermaprobe genommen. In das Ejakulat war ausschließlich die Ausscheidung der Nebendrüsen entleert worden, dreimal je ein Tropfen, insgesamt 0,1 ml. Im Ejakulat konnten keine beweglichen Spermien gefunden werden, lediglich einige inaktive Samenzellen waren vorhanden. (Bei mikroskopischen Untersuchung wurden in 10 Gesichtsfeldern insgesamt 1-2 Stück gezählt.)

Das Tier wurde nun wöchentlich zweimal mit 100 µg D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH-äthylamid behandelt. Die Behandlung erfolgte auf die in den Beispielen 1-11 beschriebene Weise. Während der Zeitdauer der Behandlung wurden die Bewegungen des Tieres lebhafter, aktiver, aber das konnte nicht als Anstieg der Libido gewertet werden, denn es konnte auch von der Angst vor den Einschußinjektionen ausgelöst sein. Die Behandlung wurde am 47. Tag nach der ersten Injektion beendet. Das Tier wurde in erneuter Narkose zweimal, mit einer Stunde Zeit dazwischen, zur Ejakulation gebracht, wodurch insgesamt 3,2 ml Sperma gewonnen wurden. Die Dichte des Spermas betrug 3, die Motilität war 35%. Der Anteil der degenerierten Samenzellen betrug 20%, praktisch handelte es sich nur um junge Entwicklungsformen (Plasmatropfen am Mittelteil des Halsteils).

Wegen des außerordentlich hohen Wertes des Tieres und auch im Interesse der Unversehrtheit des die Behandlung vornehmenden Personals wurde die Behandlung nicht weiter fortgesetzt. Den Käufer befriedigte das kontrollierte Spermabild, das den für fertile Primaten charakteristischen Werten entsprach.

Auf diese Weise konnte die Fertilität eines außerordentlich seltenen, wertvollen Tieres wiederhergestellt und durch Aufbewahrung seines Spermas eine im internationalen Katalog verzeichnete Genreserve gebildet werden.

Beispiel 13

Ovariale Hemmung an Löwen zum Zwecke der Kontrazeption

In den Tiergärten der ganzen Welt wird unter den großen Raubtieren der Löwe gezeigt. Für die unterschiedlichen Panoramen und Safari-Parks ist es erforderlich, beide Geschlechter gleichzeitig, in ein und demselben Lebensraum zu zeigen. Unter den großen Raubtieren ist der Löwe das einzige, das sich in Gefangenschaft bei zureichenden Ernährungsverhältnissen gut vermehrt. Wegen der absoluten Sättigung des "Löwenmarktes" ist die Ausarbeitung eines empfängnisverhütenden Verfahrens wünschenswert, das für das Tier ungefährlich ist, in seiner äußeren Erscheinung und seinem Verhalten keine Veränderung hervorruft und trotz fertiler Kopulation die Empfängnis verhütet. Die Empfängnisverhütung auf der Basis von Sexualsteroiden führt innerhalb kurzer Zeit zu krankhafter Verfettung und dem Verlust des Demonstrationswertes des Tieres.

Eine im Besitz des zoologischen Gartens befindiche intakte, fruchtbare Löwin von etwa 200 kg Gewicht, die in ihrem Leben schon fünfmal geworfen hatte, wurde alle drei Wochen zweimal mit D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt, und zwar zuerst mit 50 µg, nach 4 Stunden mit 500 µg, und dann wurde eine Pause von drei Wochen eingehalten. Diese alle drei Wochen stattfindende Behandlung wurde vom Beginn des Östrus bis zum 50. Tag nach dem für die Art charakteristischen Endzeitpunkt des Östrus (also vom April bis zum August) vorgenommen. Das Tier zeigte normales Verhalten und paarte sich während des Östrus regelmäßig, das betreffende Männchen war gemäß der Untersuchung normosperm. Die Löwin wurde während der Zeit der Behandlung nicht trächtig, und weder in ihrem Verhalten noch in ihrem Aussehen waren Abweichungen vom Normalen zu beobachten.

Beispiel 14

Induzierung der Geschlechtstätigkeit von unter den Bedingungen der Massenhaltung in der Pubertät befindlichen weiblichen Läufern zum Zweck der erstmaligen Auslösung des empfängnisbereiten Zustandes

Unter den Bedingungen der Massenhaltung wird angestrebt, die zur Aufrechterhaltung des Bestandes vorgesehenen Zuchttiere so bald wie möglich für die Zucht einzusetzen sowie die Befruchtung und das Abferkeln im Interesse der Anpassung an eine kontinuierliche Technologie zu synchronisieren. Die gonade Aktivität von in großer Masse gehaltenen, durch intensive Fütterung zu schnellem Wachstum gezwungenen weiblichen Läufern ist in der Zeit der Präpubertät und der Pubertät labil, deshalb kommt es selten und über die gesamte Population verstreut vor, daß der an sich empfängnisbereite Zustand später von einer Trächtigkeit gefolgt ist.

Für die Zwecke des Versuches wurde in einer Schweineaufzuchtstation von den zur Verfügung stehenden 200 zukünftigen Zuchtsäuen - auf Grund von Faktoren wie der besten Entwicklung und der besten Futterverwertungsfähigkeit - 60 Tiere ausgesucht. Diese wurden wahllos in 2 Gruppen zu je 30 Tieren eingeteilt. Beide Gruppen wurden, ebenfalls der Technologie auf dieser Station entsprechend, 24 Stunden lang weder gefüttert noch getränkt. Die Tiere wurden zum Zeitpunkt ihrer Auswahl intramuskulär mit in physiologischer Kochsalzlösung gelöstem D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. Die Injektionen mit Dosen von je 20 µg der genannten Verbindung wurden in 24stündigen Abständen noch zweimal wiederholt. Sowohl in der unbehandelten Kontrollgruppe wie auch in der behandelten Gruppe trat der empfängnisbereite Zustand beim ersten Tier 5 Tage nach der Auswahl der Tiere ein. Beide Bestände wurden in dem gleichen Stall, dem gleichen Luftraum, unter identischen Bedingungen die von der Technologie her zulässigen 26 Tage lang gehalten. Während dieser Zeit gelangten von der unbehandelten Kontrollgruppe 3 Tiere (10%), von der behandelten Gruppe 21 Tiere (70%) erfolgreich in empfängnisbereiten Zustand. Als erfolgreich wurden nur diejenigen Fälle verbucht, bei denen der empfängnisbereite Zustand von normaler Trächtigkeit und Geburt gefolgt war.

In dieser Versuchsreihe erstreckte sich die Zielstellung nicht auf das genaue Einstellen des Ovulationszeitpunktes, weil nicht genügend Zuchteber zur Verfügung standen. Deshalb war die Zielstellung der "erste erfolgreiche empfängnisbereite Zustand" innerhalb von 26 Tagen. Der Anteil von 10% trächtigen Tieren in der Kontrollgruppe entsprach dem Betriebsdurchschnitt. Daher bedeutet der durch die Behandlung eingetretene 60%ige Anstieg einen bedeutenden wirtschaftlichen Nutzen.

Beispiel 15

Behandlung von über längere Zeit unfruchtbaren Chinchillas

20 Chinchillas, die wenigstens seit 2 Jahren unfruchtbar waren, wurden mittels intraperitonealer Injektion drei Tage lang täglich zweimal mit je 10 µg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. Am 4. Tag wurden 75 µg des Hormonanalogs appliziert. Dann wurden die Tiere der Technologie entsprechend zu den Böcken gelassen. 12 der Chinchillas warfen innerhalb von 4 Monaten.

Parallel zu diesem Versuch wurden 3 besonders wertvolle Chinchillas ("Black"-Mutanten), die länger als 2 Jahre unfruchtbar waren, 3 Tage lang täglich zweimal mit je 10 µg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. Der Wirkstoff wurde als intraperitoneale Injektion verabreicht. Am 4. Tag wurde das Hormonanalog zu einer Dosis von 75 µg appliziert, dann wurden die Tiere wie üblich zu dem Bock gelassen. Innerhalb von 4 Monaten warfen alle drei Tiere.

Mit diesem Mittel konnten über längere Zeit unfruchtbare, hochwertige Pelztiere erneut in Zucht genommen werden.

Beispiel 16

Beseitigung des saisonbedingten Anöstrus erwachsender Wildkatzen (Felis silvestris)

Zwei im Besitz des Tiergartens befindliche weibliche Wildkatzen von durchschnittlich 6 kg Gewicht, deren Zyklus unter natürlichen Bedingungen in die Monate Februar/März fällt, wurden im August mit D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH-äthylamid behandelt. Vor der Behandlung wurde zur Inspektion des Zustandes beider Eierstöcke unter Narkose die Bauchhöhle geöffnet. Nachdem die Bauchhöhle wieder zugenäht worden war, wurden die Tiere unter Einhaltung zweitägiger Pausen insgesamt viermal mit dem Wirkstoff behandelt, der, in physiologischer Kochsalzlösung gelöst, intramuskulär appliziert wurde. Zwischen der ersten und der zweiten Injektion wurde eine Pause von zwei Stunden eingehalten; die erste Dosis betrug 100 µg, die zweite 500 µg. Nach 48 Stunden folgte die dritte Dosis (100 µg) und nach zwei weiteren Stunden die vierte (500 µg). Am 0., 2., 4. und 8. Tag wurde die Bauchhöhle unter Narkose geöffnet, die Veränderung des Zustandes der Eierstöcke visuell gewertet. Nach Beendigung der Behandlung wurden beide Eierstöcke operativ entfernt, fixiert und histologisch ausgewertet.

Am 0. Tag waren im Falle beider Tiere im linken Eierstock 3-4 mutmaßliche sekundäre Follikel, ein zurückgebildeter alter Gelbkörper und im rechten Eierstock 5-6 mutmaßliche sekundäre Follikel zu sehen. Durch die Behandlung hatten sich nach 4 Tagen alle sekundären Follikel zu Graf'schen Follikeln entwickelt, die Ovulation hatte stattgefunden, und an der Stelle der Follikel befanden sich in der Umbildung zum Gelbkörper begriffene Corpora haemorrhagica. Neben letzteren wuchsen in visuell nicht zählbarer Menge sekundäre Follikel, die sich durch die Wirkung der weiteren Behandlung weiterentwickelten und nach der letzten 500 µg-Dosis mit intrafollikulärer Luteinisierung atretisierten. Die visuellen Befunde wurden durch die histologische Auswertung in vollem Umfang gestützt.

Die durch die beschriebene Behandlung eingetretene Ovulation beweist, daß bei Katzenarten auch außerhalb der Saison Befruchtung erreicht werden kann und auch in nicht natürlicher Haltung Nachkommen erzielt werden können.

Beispiel 17

Behandlung eines im saisonbedingten Anöstrus befindlichen Blaufuchsweibchens zwecks Auslösung eines fertilen Östrus

Ein im saisonbedingten Anöstrus befindliches Blaufuchsweibchen wurde im Dezember unter Narkose laparoskopisch untersucht. Es wurde festgestellt, daß beide Eierstöcke inaktiv waren, keine sich entwickelnden Follikel oder Graf'sche Follikel enthielten.

Das Tier wurde 10 Tage lang täglich zweimal intramuskulär mit 1-5 µg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. Am 10. Tag erfolgte unter Narkose eine erneute laparoskopische Untersuchung. In beiden Eierstöcken befanden sich große Gelbkörper, deren Anzahl - die infolge technischer Unzulänglichkeiten nur geschätzt werden konnte - 10-20 betrug. Gleichzeitig wurde festgestellt, daß der Gebärmutterhals offen war.

Ebenfalls im Dezember wurd ein wegen mammaler Verkümmerung zum Ausschluß aus der Zucht verurteiltes Weibchen in ähnlicher Weies täglich zweimal mit je 2 µg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. Die Wirkung der Behandlung wurde an der Veränderung des Zustandes des Gebärmutterhalses verfolgt. Am 6. Tag nach der ersten Behandlung öffnete sich der Gebärmutterhals. Danach wurde eine Dosis von 50 µg verabreicht. Nach 16 Stunden wurde der Zustand der Eierstöcke durch Spiegelung untersucht; die Ovulation stand unmittelbar bevor. Nun wurde die Bauchhöhle vollständig geöffnet, die Eierstöcke wurden herausoperiert, und aus den insgesmt 11 Graf'schen Follikeln wurden die Eizellen durch Punktion entfernt. Sechs normale Eizellen wurden gefunden, die von einer normalen Corona radiata bedeckt waren.

Auf diese Weise wurde im saisonbedingten Anöstrus die Herstellung von zur in vitro Befruchtung geeigneten Eizellen, von Embryos ohne Störung des normalen jährlichen Zyklus ermöglicht. Das bietet die Möglichkeit zur Herstellung besonderer Hybridnachkommen unter Verwendung weniger wertvoller Rezipiententiere.

Beispiel 18

Stimulierung der Eierstockfunktion infantiler Hauskatzen (Felis cattus domesticus) mit D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH

Fünf junge Katzen im Alter von 45 Tagen, die ein Gewicht von je etwa 0,3 kg aufwiesen, wurden in Abständen von 2 Tagen insgesamt viermal mit je 100 µg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. Der Wirkstoff wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und intramuskulär appliziert. Nach Beendigung der Behandlung wurden unter Narkose beide Eierstöcke operativ entfernt und visuell ausgewertet. Anschließend wurden die Eierstöcke in Formalin fixiert und histologischen Untersuchungen unterzogen. In beiden Eierstöcken waren 5-7 Stück Corpus haemorrhagicum vorhanden. Unter der Rinde wurden von dem hellen, butterfarbenen Eierstock gut abtrennbare, in der Entwicklung befindliche Follikel gefunden, von denen einige die Größe Graf'scher Follikel hatten.

Diese Ergebnisse beweisen eindeutig, daß der Eierstock noch infantiler Hauskatzen durch die Wirkung des verwendeten Mittels die für das geschlechtsreife Tier charakteristischen histologischen und morphologischen Eigenarten zeigt. Auf diese Weise wird das Tier vor der im herkömmlichen Sinne verstandenen biologischen Geschlechtsreife geeignet, zur Befruchtung in vitro geeignete Eizellen herzustellen.

Beispiel 19

Stimulierung der Eierstockfunktion infantiler Hauskatzen mit D-Phe⁶, Trp⁷, Leu⁸-GnRH

5 junge Katzen im Alter von 45 Tagen, die ein Gewicht von je etwa 0,3 kg aufwiesen, wurden mit D-Phe⁶, Trp⁷, Leu⁸-GnRH behandelt. Vor der Behandlung wurde der linke Eierstock operativ entfernt. Den Tieren wurde in Abständen von 2 Tagen insgesamt dreimal Dosen zu je 100 µg in Form von mit physiologischer Kochsalzlsösung bereiteter Lösung intramuskulär verabreicht. Nach dem Abschluß der Behandlung wurde der verbliebene (rechte) Eierstock herausoperiert, visuell ausgewertet und nach der Fixierung histologischen Untersuchungen unterzogen.

Vor der Behandlung waren die operativ entfernten Eierstöcke völlig homogen und von buttergelber Farbe, sich entwickelnde Follikel konnten in ihnen weder visuell noch durch histologische Untersuchung wahrgenommen werden. Nach der Behandlung wurden in den Eierstöcken 7-8 Stück Corpus haemorrhagicum und viele (nicht zählbare) in der Entwicklung befindliche Follikel gefunden.

Dieses Ergebnis bestätigt die gemäß Beispiel 18 erhaltenen Befunde auch für ein anderes Hormonanalog in vollem Maße und vermittelt weitere Erfahrungen über die Physiologie des weiteren Zyklus der Eierstöcke.

Beispiel 20

Stimulierung des primordialen Follikels infantiler weiblicher Hauskatzen (Felis cattus domesticus)

5 junge Katzen im Alter von 45 Tagen, die ein Gewicht von je etwa 0,3 kg aufwiesen, wurden mit D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH behandelt. Vor der Behandlung wurde unter Narkose der linke Eierstock operativ entfernt. Dann erhielten die Tiere 3 Tage lang täglich dreimal, in Abständen von 4 Stunden insgesamt neunmal je 0,1 µg des Wirkstoffes intramuskulär in Form einer mit pyhsiologischer Kochsalzlösung und Propylenglykol bereiteten Suspension. Nach Abschluß der Behandlung wurde der verbliebene Eierstock operativ entfernt, visuell ausgewertet und nach der Fixierung histologischen Untersuchungen unterzogen. Visuell waren beide Eierstöcke homogen und von buttergelber Farbe, der behandelte Eierstock war etwas größer. In den unbehandelten Eierstöcken konnten nur primordiale Follikel histologisch wahrgenommen werden, während an der Schnittfläche der behandelten Eierstöcke eine nicht zählbare Menge (mehrere hundert) in Entwicklung begriffener, die unterschiedlichen Stadien der Antrumbildung zeigender Follikel registriert wurde.

Mit diesem Mittel gelang es, mehrere hundert primordiale Follikel des Eierstockes gleichzeitig zu stimulieren.

Beispiel 21

Herstellung von Rindereizellen für die Zwecke der Embryozüchtung in vitro aus einer Organkultur post mortem

Aus Rindern wurden 30-55 Minuten, nachdem sie auf dem Schlachthof betäubt und ausbluten gelassen worden waren, die intakten Eierstöcke entfernt und unter Laboratoriumsbedingungen in ein komplettes Adjuvans gelegt. Zu der Nährflüssigkeit wurde in einer Konzentration von 10^-9 bis 10^-8 g/ml D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH-äthylamid gegeben. Die in der Organkultur gehaltenen Eierstockbestände ovulierten innerhalb von 16-43 Stunden. Von den aus den Eierstöcken durch in vitro spontan erfolgte Ovulationen und anschließende Punktion gewonnenen Eizellen waren 85% zur Fortsetzung der Meiose (der reduktiven Zellteilung) fähig und konnten mit kapazitiertem Rindersperma in vitro erfolgreich befruchtet werden. Die ersten zwei Zellteilungen der in vitro befruchteten Eizellen in der Kultur wurden beobachtet.

Mit diesem Mittel wurde die Möglichkeit geschaffen, ähnlich wie bei der weltweit verbreiteten Technologie der Insemination bei Rindern, unmittelbar lebende Embryos zu "inseminieren", d. h. zu transplantieren. Auf den Schlachthöfen ist die Möglichkeit zur Herstellung einer den Bedarf weit übersteigenden Menge von Embryos gegeben.

Claims

Verwendung von D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH, D-Phe⁶, Gln⁸, des Gly¹⁰-GnRH- ethylamid und/oder D-Phe⁶, Trp⁷, Leu⁸-GnRH zur Beeinflussung der Geschlechtstätigkeit von Säugetieren.