FR2584930A1 - Procede d'obtention de produits genitaux de mammiferes convenant pour la fecondation naturelle et artificielle - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION EST RELATIVE A UN PROCEDE D'OBTENTION DE PRODUITS GENITAUX DE MAMMIFERES. CE PROCEDE SE CARACTERISE EN CE QU'ON TRAITE LES SUJETS AU MOINS UNE FOIS MAIS AU PLUS 60FOIS PAR DES COMPOSES CORRESPONDANT A LA FORMULE GENERALE:GLP-HIS-TRP-SER-TYR-X-X-X-PRO-XDANS UNE PROPORTION DE 0,01 A 500MGKG DE POIDS CORPOREL. APPLICATION A LA FECONDATION NATURELLE ET ARTIFICIELLE DE MAMMIFERES.

Description

La présente invention concerne un procédé d'obten-

tion de produits génitaux sexuels de mammifères convenant pour la fécondation naturelle et artificielle au cours de la vie prénatale ou postnatale, de l'enfance, de la prépuberté et à l'état adulte, par régulation de l'activité de leurs organes génitaux. L'invention concerne, en outre aussi, éventuellement, la production de descendants à partir de ces produits génitaux, ainsi qu'une augmentation de la production

de produits génitaux (par rapport à la vitalité caractéris-

tique de l'espèce).

Pour stimuler la fonction sexuelle et/ou pour induire l'ovulation, on utilise en premier lieu différents produits hormonaux répandus chez les animaux comestibles et les animaux reproducteurs, comme par exemple des stéroides, des hormones gonadotropes ou des gonadotropines ou très récemment la GnRH (hormone libérant l'hormone gonadotrope)

et certains analogues hyperactifs de ces hormones. Les subs-

tances ou procédés que l'on connaît actuellement induisent seulement l'ovulation des ovocytes déjà mûrs, mais non libérés pour une raison quelconque, ou ils conviennent seulement pour supprimer brusquement en une fois par action hormonale un obstacle présent dans le déroulement normal du cycle et induire ainsi l'ovulation. On ne connaît pas actuellement de produit hormonal, ni de procédé, provoquant une stimulation générale de la fonction ovarienne, accélérant le processus de maturation du follicule préantral ou du follicule primordial

ou augmentant le nombre des follicules en cours de développe-

ment. On ne connaît pas actuellement, non plus, de produit et/ou de procédé permettant de préparer à partir d'animaux non sexuellement murs (adultes) ou d'animaux chez qui le développement des produits génitaux a été stoppé à un stade antérieur prédéterminé, ou bien in vivo à partir d'animaux intacts, et/ou post mortem à partir des gonades,

des produits génitaux convenant pour la fécondation.

La fonction des gonades et/ou la production des produits génitaux, subit un retard de développement ou reste stoppée chez de nombreux animaux reproducteurs parce qu'ils sont maintenus dans des conditions non appropriées, chez certains animaux sauvages et à fourrures exotiques de grande

veleur en raison du maintien dans des conditions non natu-

relles. Dans le cas de ces animaux, les produits hormonaux

connus antérieurement se sont avérés en général sans effet.

Les dérivés de la GnRH spécifique de l'espèce que l'on a fait connaître ces derniers temps (J.A. King et R.P. Millar, J. Biol. Chem. 257, 1072228i19827; N. Sherwood et autres, Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 27942798/19837), ainsi que le fait que la littérature spécialisée parle de la présence de différents facteurs hormonaux de type GnRH dans les gonades ou les ovaires (R.M. Sharpe et autres,

Nature 290, 785-787/19817; N. Dekel et autres, Biol. Reprod.

28, 161-166(1983_), soulèvenet la question de facteurs de

régulation spéciaux et de l'interaction avec ceux-ci.

Les dérivés de la GnRH spécifique des poissons ou des oiseaux décrits dans un titre de propriété industrielle plus ancien (demande de brevet hongrois n 4457/83) conviennent pour obtenir des produits génitaux dans le cas de poissons

ne se multipliant pas d'eux-mêmes par ailleurs en captivité.

Cet effet repose sur une stimulation du développement des

follicules.

L'invention a pour but de fournir un procédé

permettant de stimuler l'activité des organes sexuels d'em-

bryons de mammifères et de mammifères, de façon à permettre d'obtenir des produits génitaux convenant pour la fécondation naturelle ou artificielle et de les utiliser pour produire des descendants. L'invention a, en outre, pour but d'augmenter la production de produits génitaux de mammifères mâles et

femelles (par rapport à la vitalité caractéristique de l'es-

pèce). L'invention repose sur le fait qu'on peut atteindre ce but en utilisant les nonapeptidalkyl (en C1 à C4)-amides ou les décapeptidamides répondant à la formule générale (I) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xl-X2-X3-Pro-X4 (I) dans laquelle X1 représente un groupe glycyle ou un reste quelconque de D-amino-acide naturel ou synthétique; X2 représente un reste de Lamino-acide renfermant, en tant que chaîne latérale, un groupe alcoyle comportant 1 à 4

atomes de carbone, un groupe phényle ou un groupe trypto-

phyle; X3 représente un reste de L amino-acide renfermant, en tant que chaîne latérale, un groupe alcoyle comportant 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe alcanoylamide comportant 2 à 4 atomes de carbone, et X4 représente un groupe glycylamide ou groupe alkylamide comportant 1 à 4 atomes de carbone,

ainsi que leurs sels et leurs complexes métalliques, c'est-

à-dire qu'on peut obtenir des produtis génitaux convenant pour la fécondation naturelle ou artificielle avec ces composés à partir de mammifères immatures sexuellement, ainsi que de mammifères en période anoestrale saisonnière ou en anoestrie provoquée par le maintien dans des conditions non naturelles, in vivo et in vitro à partir d'animaux intacts, ainsi qu'à partir d'organes sexuels post mortem, ou en accroître la

quantité.

La préparation des composés répondant à la formule générale (I) est connue par la Demande de Brevet hongrois

n 4458/83, ainsi que par le Brevet US n 4 410 514.

En conséquence, l'invention a pour objet un procédé d'obtention de produits génitaux convenant pour

la fécondation naturelle et artificielle à partir de mammi-

fères au cours de la vie prénatale et postnatale, de l'enfance, de la prépuberté et à l'âge adulte (on dira, en résumé: sujets dans la suite) par régulation de l'activité des organes génitaux, et éventuellement de production de descendants à partir de ces produits génitaux, et d'augmentation de la production de produits génitaux (par rapport à la vitalité caractéristique de l'espèce). Ce procédé est caractérisé en ce qu'on traite les sujets au moins une fois, mais au plus 60 fois, de préférence 1 à 5 fois, par des composés répondant à la formule générale (I), à une dose de 0,01 à 500pg par kg de poids corporel, de préférence de 1 à 100l g/kg de poids corporel, et l'on observe entre les différents traitements des pauses d'au moins 2 heures, mais d'au plus 7

jours, de préférence de 2 à 8 heures. On utilise, de préfé-

rence, les composés sous la forme de solutions, de poudres, d'injections ou de pulvérisations, et l'application peut

avoir lieu par voie intramusculaire, intrapéritonéale, sub-

cutanée, intra-utérine, etc...

Chez certaines espèces animales, le procédé selon l'invention augmente la production de produits génitaux, tandis que chez d'autres animaux (cas cliniques), l'activité

sexuelle diminuée ou arrêtée est normalisée et atteint l'inten-

sité typique pour l'espèce. Le procédé selon l'invention convient également pour déclencher une hyperproductivité des organes génitaux et, par suite, pour augmenter la quantité

de produits génitaux caractéristique de l'espèce (hyper-

ovulation). Le procédé selon l'invention stimule la vésicule germinative et augmente ainsi le nombre de cellules séminales

motiles dans l'éjaculat.

Le procédé selon l'invention convient en outre pour déclencher une hyperproduction de l'hypophyse après laquelle l'hypophyse devient insensible, de sorte qu'un état d'équilibre s'établit; ainsi, le procédé convient

également pour empêcher la conception.

Avec le procédé selon l'invention, on peut préparer les produits finaux dans des conditions de vie naturelles et artificielles, ainsi que dans des conditions de vie de

laboratoire.

Les formes des fonctions sexuelles régulées par dosage des analogues de GnRH à un rythme variable décrites

sont de nouveaux phénomènes non encore décrits antérieurement.

On peut résumer les principaux avantages du procédé selon l'invention de la façon suivante. a) L'application du procédé permet d'améliorer l'activité des gonades de mammifères maintenus dans des conditions non naturelles et/ou de rétablir le fonctionnement

normal, les animaux devenant aptes à la production de descen-

dants.

b) Le procédé permet d'induire une hyperproduction des ovaires, ce qui permet d'obtenir une multiplicité de gonocytes par rapport au nombre des ovulations caractéristiques de l'espèce envisagée dans chaque cas. On peut les conserver après une fécondation in vitro sous la forme d'embryons ou bien les extraire d'animaux jouant le rôle de récepteurs ou accepteurs.

c) Le procédé permet d'induire chez des mammifères-

sujets dans l'enfance une hyperstimulation des gonades et, par suite, une hyperovulation. On peut ainsi obtenir déjà d'un sujet un descendant à un moment o le sujet lui-même

n'est pas encore mûr sexuellement.

d) Le procédé convient dans des conditions de laboratoire spéciales, pour des cultures d'organes, pour produire des ovocytes fécondables in vitro à partir d'ovaires intacts post mortem. On peut ainsi obtenir à partir d'animaux reproducteurs de grande valeur des descendants, même après la

mort du sujet.

e) Les échanges de produits génitaux obtenus par le procédé permettent l'hybridation des espèces entravée par la distance entre les continents et donne par suite la possibilité de sélectionner de nouvelles espèces d'animaux utiles.

f) Le procédé permet de produire dans des condi-

tions de production industrielles, à partir de groupes d'âge quelconques mammifères mâles et femelles, de grandes quantités d'ovocytes, de sperme ou d'embryons, ce qui permet, par exemple, la création de banques d'embryons et les échanges

intercontinentaux des descendants.

g) Le procédé permet de supprimer l'anoestrus

saisonnier et l'inhibition de la spermatogénèse de mammifères.

De ce fait, on peut produire des descendants à tout moment,

ce qui entraîne une meilleure utilisation des objets écono-

miques. h) Le procédé convient pour la multiplication artificielle d'espèces rares dans le cadre de la sauvegarde

de la nature.

i) On peut, par le procédé, insensibiliser l'hypo-

physe tant chez les mammifères mâles que chez les mammifères femelles, et l'on peut ainsi éviter une gestation fâcheuse, même dans des cas pour lesquels les moyens contraceptifs

connus ne sont pas applicables.

On va expliquer à présent l'invention avec davan-

tage de détails sur les exemples non limitatifs qui suivent.

EXEMPLE 1

Déclenchement de l'hyperovulation chez des rattes d'âge infantile.

On traite 60 sujets parmi des rattes d'âge in-

fantile âgées de 21 jours, pesant 7 à 8 grammes, en leur administrant par voie intrapéritonéale de l'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH dissous dans une solution de chlorure de sodium physiologique. Selon le type de traitement, on subdivise les animaux en plusieurs groupes. Dans la série de traitements d'une durée comprise entre un jour et 8 jours, on administre des doses préalables de 1 ou 2 ug par jour, respectivement

deux fois par jour.

Une fois les traitements achevés, on tue tous les

animaux au moyen de vapeur d'éther et l'on extrait chirurgi-

calement leurs ovaires après la mort, 24 heures après le dernier traitement. On effectue les examens visuellement et à l'aide d'échantillons histologiques. Dans les ovaires des animaux-témoins, on trouve plusieurs follicules en cours de développement, mais aucun n'atteint la taille de follicules de De Graaf, de plus il n'y a ni corps jaunes ni Corpus haemorrhagicum. Par contre, on peut, dans tous les groupes traités, mettre en évidence une action hormonale qui se

manifeste par la croissance des follicules, leur transforma-

tion en follicules de De Graaf, l'ovulation de grands folli-

cules et la formation de corps jaunes normaux. Même les trompes utérines et l'utérus grossissent. Parmi les 60 animaux traités, 4 en tout ne réagissent pas au traitement. Chez les animaux qui ont reçu quotidiennement, pendant 4 jours, deux fois 2 pg d'analogue de GnRH et ont été traités le quatrième jour 6 heures après la dose de 2 pg par administration d'une dose de 10 "g, il y a dans les ovaires abondance de follicules de De Graaf ramollis, précédant juste l'ovulation. Le nombre de follicules de De Graaf ayant atteint le stade final de maturité par animal est compris entre 60 et 90, alors que, dans le cas d'animaux adultes, la valeur normale est de 12. On traite un second groupe d'animaux de la même façon, sauf que le traitement s'étend sur 6 jours. Dans le cas de ce groupe, on évalue le degré d'hyperovulation d'après

le nombre des corps jaunes normaux apparus dans les ovaires.

De façon analogue au cas des produits décrits indiqués précé-

demment, le nombre de corps jaunes par animal est ici aussi

compris entre 60 et 90. L'examen histologique confirme com-

plètement ce résultat.

De la façon décrite, on produit d'une part déjà des ovocytes mûrs chez des sujets infantiles de l'espèce, et d'autre part, le nombre d'ovocytes est accru par rapport

à la valeur physiologique des animaux adultes.

EXEMPLE 2

Déclenchement d'une hyperovulation chez des souris femelles

d'âge infantile.

De la façon décrite dans l'Exemple 1, on traite souris femelles en tout, âgées de 28 jours et pesant à 6 g. Les animaux traités 1 à 8 jours reçoivent deux fois par jour 1 à 5 ug d'analogue éthylamide D-Phe6, Gln8,

de glyl1 -GnRH. Un intervalle de 4 heures sépare les diffé-

rents traitements. On retire les ovaires 27 heures après la

dernière injection.

Les ovaires du groupe-témoin sont de couleur

jaune mat et de structure homogène; on trouve 1 ou 2 folli-

cules en croissance dans certains ovaires. Dans les groupes des animaux traités, on peut observer l'effet de l'hormone dans tous les ovaires, sur les trompes utérines agrandies et sur l'utérus. Chez les animaux qui ont reçu une fois par jour une dose de 1 jg et le troisième jour, quatre heures après la dose de lg, 5 gg de l'analogue de GnRH cité,

on trouve dans les ovaires des follicules de De Graaf complè-

tement mûrs, onduleux au toucher, en fait 45 à 70 unités par animal. Dans un groupe traité de façon analogue, mais pendant 5 jours, il se forme, au lieu des follicules de

De Graaf, des corps jaunes normaux dans le nombre indiqué.

Le résultat de l'examen histologique concorde avec l'appré-

ciation visuelle.

Ces résultats confirment les résultats du procédé

selon l'Exemple 1.

EXEMPLE 3

Déclenchement d'une hyperovulation chez les lapins d'âge infantile. On traite trois jours, deux fois par jour, en leur administrant par voie intrapéritonéale, 5 ug chaque fois d'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH, 20 jeunes lapins de la race "Perle Blanche", âgés de 42 jours, nés dans les conditions de maintien de la masse. On subdivise alors les animaux en deux groupes. On traite l'un des groupes, le quatrième jour, en administrant 50j3g d'agent actif, on tue l'autre groupe avec de la vapeur d'éther. Le nombre de follicules de De Graaf mûrs dans le groupe tué avant le traitement sert de témoin pour la constatation des modifications provoquées par la dose de 50 jg. Chez les animaux laissés en vie, on suit le début de l'ovulation sur deux animaux par un examen laparoscopique (examen au miroir de la cavité abdominale), effectué sous anesthésie. Le traitement par administration de "g entraîne au bout de 26 heures, par animal, 30 à 45 ovulations ou Corpus haemorraghicum, tandis que les ovaires

des animaux-témoins sont inactifs.

On peut produire par ce procédé des ovocytes mûrs déjà à partir de lapins d'âge infantile et leur nombre

est accru par rapport à la valeur physiologique.

EXEMPLE 4

Déclenchement d'une hyperovulation chez des porcs d'âge infantile. On traite 20 cochons de lait femelles d'âge infantile, âgés de 10 jours, pendant 6 jours, deux fois par jour, en leur administrant par voie intramusculaire pg d'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH chaque fois. Pour l'examen, on retire de chacun des animaux-témoins un ovaire, les méthodes d'examen correspondent à celles décrites dans l'Exemple 3, on compare le nombre de follicules de De Graaf formés et le nombre des corps jaunes formés après l'ovulation. On observe le début de l'ovulation au laparoscope. La dose de 100pg d'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH administrée au septième jour entraîne, au bout de 41 heures, sur les 10 cochons de lait traités, 15 à 36 ovulations. Le traitement des cochons de lait dans l'enfance entraîne le même résultat que dans le

cas des espèces d'animaux indiquées dans les Exemples 1 à 3.

EXEMPLE 5

Déclenchement d'une hyperovulation chez des moutons d'âge infantile. On traite 10 agneaux Jerke âgés de 50 jours, pendant cinq jours, en leur administrant deux fois par jour, par voie intramusculaire, 10 Àg d'analogue éthylamide D-Phe6,

Gln8, desGly10-GnRH. Une dose de 70 Gg d'agent actif, adminis-

trée le sixième jour, entraîne 3 à 9 ovulations par animal.

Chez les animaux-témoins, il n'y a pas de modification.

On effectue l'examen, tant chez les animaux traités que chez les animauxtémoins, par laparoscopie. Les résultats concordent avec ceux décrits dans les Exemples 1 à 3.

EXEMPLE 6

Déclenchement d'une hyperovulation chez des génisses d'âge infantile. On traite 8 jeunes veaux âgés de 65 jours, pendant 8 jours, en leur administrant trois fois par jour 2p0g d'analogue éthylamide D-Phe6, Gln8, desGly10-GnRH. Après une pause d'une journée, on administre par voie intramusculaire ,g d'agent actif. Après la dernière injection, on prélève

les deux ovaires; on trouve en général environ 5 à 11 folli-

cules de De Graaf développés par ovaire. La moitié des folli-

cules n'est plus dure au toucher, et elle est donc juste

au stade précédant l'ovulation.

Cette expérience prouve que, même dans le cas de génisses, on peut déjà obtenir à partir d'animaux d'âge infantile davantage d'ovocytes mûrs, alors que la génisse

adulte ne produit normalement par ovulation qu'un ovocyte.

EXEMPLE 7

Traitement de l'oligospermie physiologique chez des chimpanzés,

pour obtenir la normospermie.

Pour des espèces animales viant en petits groupes, mais en particulier pour les primates, le fait suivant,

publié à plusieurs reprises dans la littérature est caracté-

ristique, à savoir que tous les mâles de la horde ont une libido active, mais que seuls les animaux meneurs copulent, tandis que les mâles subordonnés présentent une oligospermie physiologique et réversible. Dans le cas présent, on a besoin, non seulement du sperme recueilli chez l'animal meneur et stocké dans la banque de sperme surtout pour l'insémination, mais également du sperme des 4 mâles subordonnés- (tous sexuellement mûrs). Avant le traitement, on fait éjaculer les animaux sous anesthésie par des moyens électriques. On évalue au microscope la densité et la motilité des éjaculats, puis on leur fait subir un essai de congélation (-196 C). Des essais spermatologiques antérieurs particuliers ont en effet montré que des cellules séminales défectueuses difficiles

à déceler au microscope ne survivent pas à la congélation.

L'image de sperme favorable obtenue après la congélation montre que la spermiogénèse (spermatogénèse) se déroule normalement. L'éjaculat prélevé avant le traitement sur

les mâles examinés présente une oligospermie physiologique.

Ensuite, les chimpanzés, qui pèsent 60 à 90 kg, reçoivent une fois par semaine 100.g d'analogue éthylamide D-Phe6, Gln8, desGly10-GnRH dans 1 ml de solution physiologique de chlorure de sodium. L'application est effectuée par voie intramusculaire au moyen d'un instrument d'injection à air comprimé. Dans les éjaculats que l'on a obtenus au cours de la quatrième semaine après le premier traitement sous anesthésie, par des moyens électriques, on peut enregistrer à 60 % de formes prématurées de spermatozoïdes dont la

motilité est inférieure à 10 % après l'essai de congélation.

Dans les éjaculats obtenus 60 jours après le premier traite-

ment, la proportion des cellules séminales défectueuses est

inférieure à 30 % et la motilité est supérieure à 60 %.

Les propriétés quantitatives et qualitatives des éjaculats concordent avec celles de celui qui est prélevé sur l'animal meneur, ainsi qu'avec les indications de la littérature spécialisée. Lors de congélations des éjaculats dilués dans

la proportion de 1: 1, la motilité de 60 % descend à seule-

ment 45 %. Le sperme de cette qualité convient aux fins

d'insémination, tant à l'état frais que congelé.

On peut prélever sur des mâles subordonnés, de la façon décrite, du sperme stockable dans la banque de sperme, dans une quantité et une qualité qui conviennent

pour la fécondation.

EXEMPLE 8

Déclenchement de la spermiogénèse (spermatogénèse) chez un bison présentant une oligospermie saisonnière pour obtenir un éjaculat convenant pour l'insémination et pour le stockage à l'état congelé. Sur un bison pesant environ 700 kg, appartenant au jardin zoologique, on prélève un échantillon de sperme, électriquement sous anesthésie, vers le mois de Mai. On

constate que le bison se trouve en état d'oligospermie sai-

sonnière. Les sympt8mes sont les suivants: dans le champ du microscope à agrandissement 1.500, en général utilisé pour l'examen du sperme, le nombre de spermatozoïdes est de à 20, la proportion des cellules séminales défectueuses est de 75 à 80 % et la densité du sperme est de 0, 5. Un

sperme de cette qualité ne convient pas pour la fécondation.

On traite alors l'animal en lui administrant

par voie intramusculaire (au moyen d'une instrument d'injec-

tion à air comprimé) deux fois par semaine 200,g chaque fois d'analogue DPhe6, Gln8-GnRH. Le cinquante-cinquième jour après le début du traitement, on fait éjaculer l'animal deux fois, à un intervalle d'une heure. On réunit les deux éjaculats; la densité est de 4, la motilité de 55 %. On congèle le sperme, puis l'on détermine la diminution de

motilité due à la congélation. Elle n'est que de 5 %.

On parvient par ce procédé à influencer de telle

façon la spermiogénèse qu'on peut obtenir, au lieu de l'éja-

culat non utilisable pour la fécondation, un sperme de très - bonne qualité, convenant à la fois à l'état frais et après un stockage à l'état congelé pour féconder plusieurs vaches

(au total 14).

EXEMPLE 9

Déclenchement de la spermiogénèse chez des renard communs

(Vulpes vulpes) présentant une oligospermie saisonnière.

On cherche à influer sur la spermiogénèse de renards communs maintenus dans le parc zoologique (ou renards roux) présentant une oligospermie saisonnière, de façon à pouvoir inséminer des renards argentés et bleus, pour pouvoir produire des fourrures (robes) hybrides particulières

et de grande valeur. Il est connu par la littérature spécia-

lisée que tous les genres de renards ne sont chauds qu'une fois par an et qu'en dehors de cette seule période, les gonades des deux sexes sont entièrement inactives. Entre les oestrus des différents genres, il y a des intervalles de temps de plusieurs mois (renard commun: Janvier; renard bleu: Avril à Mai). Les résultats des essais ont été comparés à l'image de sperme d'une population en oestrus saisonnier pour laquelle la quantité moyenne d'éjaculat est de 2 ml, la densité de 3 et la motilité de 50 à 60 %. On considère

celle-ci comme valeur physiologique.

On traite cinq renards rouges mâles sexuellement mûrs pesant 8 kg en moyenne, début avril, pendant sept semaines, en leur administrant deux fois par semaine 1, 5, 10, Ag d'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH. La troisième semaine après le début du traitement, on prélève des échantillons de sperme. Dans les échantillons, le nombre de cellules géminales est d'environ 60 à 70 % de la valeur physiologique, le nombre de spermatozoides dégénérés dépasse 40 %. Les formes défectueuses sont en majorité des formes jeunes (gouttes de plasma à la partie centrale du col) . La septième semaine après le début du traitement, on recueille de nouveau de l'éjaculat sous anesthésie. On peut prélever du sperme avec succès sur tous les animaux, le volume de l'éjaculat est compris entre 1, 2 ml et 3,1 ml, la densité est de 3, la motilité de 65 % dépasse numériquement considérablement la valeur physiologique. (Les animaux mâles-sont pendant

ce temps séparés des animaux femelles, il n'y a pas de possi-

bilité d'évacuation par copulation). On subdivise les échan-

tillons de sperme en groupes selon la qualité et on les congèle. Après la dilution et la congélation et enfin la décongélation, la motilité du sperme congelé à -1960C est de %. En utilisant le sperme congelé, on peut obtenir (en utilisant la programmation GnRH (voir Exemple 17) et la technique de l'insémination) une gestation normale chez

les renards bleus.

On peut préparer, par un seul prélèvement d'éja- culat effectué sur les cinq renards, 56 doses de sperme convenant pour la fécondation. La technique convient pour préparer des fourrures hybrides précieuses dans de grandes fermes.

EXEMPLE 10

Traitement d'un tigre de Sibérie infertile à cause d'une

image de sperme dégénérée.

Un tigre de Sibérie âgé de 8 ans, appartenant au

jardin zoologique, vit depuis trois ans avec une tigresse.

Lors de l'oestrus de la femelle, des accouplements ont lieu régulièrement, mais sans reproduction. L'absence de gestation par la faute de la femelle doit être exclue, du fait que la tigresse a déjà été pleine à la suite d'accouplements avec un

autre mâle et a également élevé ses petits.

On prélève sur le tigre mâle, électriquement, sous anesthésie, un échantillon de sperme. L'éjaculat est très dilué, 4 ou 5 spermatozoides dégénérés par champ optique sont visibles, ils effectuent un mouvement frétillant. La forme des dégénérescences est caractéristique des phases précoces de la spermatogénèse. On traite l'animal une fois par semaine, en lui administrant par voie intramusculaire (au moyen d'un instrument d'injection à air comprimé) 100.iig d'analogue D-Phe6, Trp7, Leu8-GnRH, dissous dans 1 ml de solution physiologique de chlorure de sodium. On laisse le tigre avec sa tigresse et des accouplements ont lieu

régulièrement, même pendant la durée du traitement. La tigres-

se est pleine et met au monde trois petits tigres en bonne santé. On peut déduire de la date de la naissance que la copulation fertile a eu lieu 40 à 50 jours après le premier

traitement.

Le procédé convient donc pour le traitement de l'image de sperme dégénérée de tigres mâles et ainsi pour

obtenir des descendants.

EXEMPLE 11

Stimulation d'une normospermie physiologique sur un tigre du

Bengale pour obtenir une hyperspermie permettant la congéla-

tion. Un tigre du Bengale âgé de 8 ans, pesant environ

kg, appartenant au jardin zoologique, s'accouple réguliè-

rement, sa femelle a auparavant été pleine chaque année. En

connaissance de ces faits, on prélève sur le tigre électri-

quement, sous anesthésie, à l'époque de l'accouplement, un échantillon desperme. On constate que la densité du

sperme est de 3, la motilité de 30 % et la quantité de l'éja-

culat de 0,2 ml. L'éjaculat présente l'image d'une normos-

permie physiologique. On ne peut, pour des raisons techniques, congeler une quantité d'éjaculat aussi réduite. Pour éviter de détériorer le foie, on doit effectuer l'anesthésie au plus tous les quatre jours et la maintenir au maximum 4 à 5

heures. Ce mode de collecte du sperme n'est pas réalisable.

On enferme le mâle dans une cage séparée et

on le traite tous les jours pendant 12 jours en lui adminis-

trant 10 pg d'analogue éthylamide D-Phe6, Gln8, desGly10-GnRH.

On dissout l'agent actif dans 1 ml de solution physiologique de chlorure de sodium et on l'applique par voie intramusculaire au moyen d'un instrument d'injection à air comprimé. Le douzième jour, on fait éjaculer l'animal électriquement sous anesthésie deux fois, à un intervalle d'une heure, et l'on récupère ainsi 1 ml et respectivement 0,8 ml de sperme. La densité des échantillons réunis est de 4, la motilité est de

%. On congèle les échantillons de sperme et on les sub-

divise en 21 doses séparées pour la fécondation artificielle.

Après la décongélation du sperme, la motilité est de 60 %.

On peut ainsi prélever sur un tigre du Bengale en quantité importante du sperme pouvant être stocké dans une

banque de sperme.

EXEMPLE 12

Traitement d'une aspermie provoquée par le maintien dans des

conditions non naturelles chez un orang-outang.

Un ourang-outang mâle âgé de 18 ans, pesant environ 350 kg, appartenant au jardin zoologique, a été

capturé alors que c'était un jeune animal. Il a eu successi-

vement trois propriétaires. Selon l'anamnèse, il n'a jamais eu de compagne, mais a toujours été laissé seul et ne s'est jamais accouplé. Il vit au zoo depuis 11 ans, sans compagnons

de son espèce et sans femelles. Son comportement est flegma-

tique, inactif, caractérisé par des symptômes d'hospitalisa-

tion. On fait au jardin zoologique une proposition selon laquelle une institution achèterait l'animal s'il appartient au genre de Bornéo et est fertile. L'examen chromosomique

montre que l'animal appartient au genre de Bornéo, c'est-à-

dire est un sujet extrêmement rare (il y a 153 sujets dans le monde entier). Au cours de l'anamnèse, la fertilité est mise en question par le fait que l'agressivité caractéristique

des primates mâles et la masturbation régulière ont complète-

ment cessé depuis le moment de l'hospitalisation qui a eu lieu il y a environ 5 ou 6 ans. On prélève électriquement sous anesthésie un échantillon de sperme sur l'animal. Seules les sécrétions des glandes secondaires ont été déchargées dans l'éjaculat, trois fois une goutte, au total 0,1 ml. On ne peut trouver dans l'éjaculat de spermatozoïdes mobiles, il y a seulement quelques cellules séminales inactives. (A l'examen microscopique, on dénombre au total 1 ou 2 unités

dans 10 champs optiques).

On traite alors l'animal en lui administrant deux fois par semaine 100 pg d'analogue éthylamide D-Phe6, Gln8, desGly10-GnRH. Le traitement est effectué de la façon

décrite dans les Exemples 1 à 11. Pendant la durée du traite-

ment, les mouvements de l'animal deviennent plus vifs, plus actifs, mais l'on ne peut l'attribuer à une augmentation de la libido, car cela peut aussi avoir été déclenché par la peur des injections à la seringue. On achève le traitement le 47ème jour après la première injection. On fait éjaculer l'animal deux fois en le réanesthésiant, à un intervalle d'une heure, ce qui permet de récupérer 3,2 ml de sperme au total. La densité du sperme est de 3, la motilité est de 35 %. La proportion de cellules séminales dégénérées est de 20 %, il ne-s'agit pratiquement que de formes de

développement précoces (goutte de plasma au milieu du col).

En raison de la valeur extrêmement élevée de l'animal, et également pour sauvegarder l'intégrité du personnel

effectuant le traitement, on ne poursuit pas le traitement.

L'acheteur est satisfait de l'image de sperme contrôlée, qui correspond aux valeurs caractéristiques des primates

fertiles.

On peut ainsi rétablir la fertilité d'un animal précieux extrêmement rare et constituer, en conservant son sperme, une réserve de gènes ayant une désignation dans

le catalogue international.

EXEMPLE 13

Inhibition de l'activité ovarienne chez des lions aux fins

de contraception.

Dans les jardins zoologiques du monde entier, on

présente le lion parmi les grands animaux féroces (carnas-

siers). Pour les panoramas différents et les parcs pour safaris, il faut présenter les deux sexes ensemble, dans un seul et même cadre de vie. Parmi les grands carnassiers, le lion est le seul qui se reproduit bien en captivité dans des conditions alimentaires suffisantes. En raison de la saturation absolue du "marché des lions", il est souhaitable d'élaborer un procédé anticonceptionnel sans danger pour l'animal, ne produisant pas de modification de son aspect extérieur et de son comportement et empêchant la conception malgré une copulation fertile. Les procédé anticonceptionnels à base de stéroides sexuels entraînent, en peu de temps, une dégénérescence graisseuse pathologique et la perte de la

*valeur démonstrative de l'animal.

On traite une lionne fertile pesant environ kg, intacte, appartenant au jardin zoologique, qui a déjà mis bas cinq fois au cours de sa vie, en lui administrant deux fois toutes les trois semaines de l'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH de la façon suivante: d'abord 50,pg, au bout de 4 heures 500 pg, puis l'on observe une pause de trois semaines. On effectue ce traitement qui a lieu toutes les trois semaines du début de l'oestrus au cinquantième jour après la date de terminaison de l'oestrus caractéristique

de l'espèce (donc d'Avril à Août). L'animal présente un com-

portement normal et s'accouple régulièrement pendant l'oestrus, le mâle en question présente un état de normospermie selon l'examen. La lionne n'est pas pleine pendant la durée du

traitement, et l'on n'observe d'anomalies ni dans son compor-

tement, ni dans son aspect.

EXEMPLE 14

Déclenchement de l'activité sexuelle de pourceaux femelles à

la puberté dans des conditions de maintien à une masse impor-

tante, pour le premier déclenchement de l'état de fertilité.

Dans les conditions de maintien de la masse, on s'efforce d'utiliser les animaux reproducteurs prévus pour la conservation de l'effectif, pour la reproduction

aussitôt que possible, ainsi que de synchroniser la féconda-

tion et la mise-bas dans le sens d'une adaptation à une technologie continue. L'activité gonadique de pourceaux

femelles maintenus à une grande masse, obligés à une croissan-

ce rapide par une alimentation intensive, est labile à l'épo-

que de la prépuberté et de la puberté, c'est pourquoi il arrive rarement et de façon disséminée dans la population

totale que l'état de fertilité en soi soit suivi ultérieure-

ment par une gestation.

Pour les objectifs de l'expérience, on sélectionne soixante animaux dans un centre d'élevage de porcs parmi 200 futures truies (sur la base du meilleur développement, du meilleur rendement de la nourriture, etc...). On les répartit au hasard en 2 groupes de 30 animaux chacun. On laisse les deux groupes 24 heures sans nourriture ni boisson, également selon la technologie de ce centre. On traite les animaux, au moment de leur sélection, en leur administrant par voie intramusculaire de l'analogue DPhe6, Gln8-GnRH dissous dans une solution physiologique de chlorure de sodium. on répète deux fois encore, à intervalles de 24 heures, les injections avec des doses de 20,3g du composé indiqué chacune. Tant dans le groupe-témoin non-traité que dans le groupe traité, l'état de fécondité apparaît chez le premier animal 5 jours après la sélection des animaux. On maintient 26 jours les deux groupes dans la même étable, dans le même volume d'air, dans des conditions identiques autorisées du point de vue de la technologie. Pendant ce temps, 3 animaux du groupe-témoin

non-traité (10 %), 21 animaux du groupe traité (70 %) par-

- viennent à l'état fécondable. On ne comptabilise comme réus-

site que les cas pour lesquels l'état de fécondité est suivi

par une gestation et une mise-bas normales.

Dans cette série d'essais, l'objectif ne s'étend pas à l'établissement précis de l'instant d'ovulation, caron

ne dispose pas de suffisamment de verrats (ou mâles reproduc-

teurs). Par conséquent, l'objectif est le "premier état de fécondité" en 26 jours. La proportion de 10 % d'animaux en gestation dans le groupetémoin correspond à la moyenne de l'exploitation. Par suite, l'augmentation de 60 % obtenue

par le traitement implique une utilité économique considéra-

ble.

EXEMPLE 15

Traitement de chincillas stériles depuis assez longtemps.

On traite 20 chincillas, stériles depuis au moins deux ans, par injection intrapéritonéale, trois jours,

deux fois par jour, de 10 pg d'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH.

Le quatrième jour, on applique 75 pg de l'analogue hormonal.

Ensuite, on laisse les animaux à leur chaleurs, selon la

technologie. 12 des chinchillas mettent bas en 4 mois.

Parallèlement à cet essai, on traite 3 chinchillas de particulièrement grande valeur (mutants "black"), stériles depuis plus de 2 ans, pendant trois jours, deux fois par

jour en leur administrant 10>ig chaque fois de D-Phe6, Gln8-

GnRH. On administre l'agent actif par injection intrapérito-

néale. Le quatrième jour, on applique l'analogue hormonal à une dose de 75 pg, puis on laisse les animaux à leurs chaleurs, comme d'habitude. En 4 mois, les trois animaux

mettent bas.

Ce procédé permet de faire reproduire de nouveau des animaux à fourrure de grande valeur, stériles depuis

assez longtemps.

EXEMPLE 16

Suppression de l'anoestrus saisonnier de chats sauvages

adultes (Felis silvestris).

On traite en Août deux chattes sauvages apparte-

nant au jardin zoologique, pesant 6 kg en moyenne, dont le cycle se place, dans des conditions naturelles, les mois de Février/Mars, en leur administrant l'analogue éthylamide D-Phe6, Gln8, desGly10-GnRH. Avant le traitement, on ouvre sous anesthésie la cavité abdominale pour contrôler l'état des deux ovaires. Après avoir recousu la cavité abdominale, on traite quatre fois en tout les animaux, en observant des pauses de deux jours, par l'agent actif que l'on applique

par voie intramusculaire, dissous dans une solution physio-

logique de chlorure de sodium. Entre la première injection et la seconde, on observe une pause de deux heures; la première dose est de 100,tg, la seconde de 500pg. 48 heures après, on applique la troisième dose (100,0g) et, deux heures encore après, la quatrième dose (500,g). Aux jours 0, 2, 4 et 8, on ouvre la cavité abdominale sous anesthésie, et l'on évalue visuellement l'état des ovaires. Après l'achèvement des traitements, on retire les deux ovaires chirurgicalement, on

les fixe et on les examine histologiquement.

Le jour O, on observe, dans le cas des deux animaux, dans l'ovaire de gauche, 3 ou 4 follicules secondaires présumés, un corps jaune ancien reconstitué et, dans l'ovaire de droite, 5 ou 6 follicules secondaires présumés. Sous

l'effet du traitement, au bout de 4 jours, tous les follicu-

les secondaires se transforment en follicules de De Graaf, l'ovulation a lieu, et, au lieu des follicules, on trouve des Corpora haemorrhagica au cours de leur transformation en corps jaune. A côté de ces derniers, il se développe, dans une quantité non dénombrable visuellement, des follicules

qui continuent à se développer sous l'effet des autres traite-

ments et subissent une atrésie avec lutéinisation intra-

folliculaire après la dernière dose de 500fig. Les constata-

tions visuelles sont entièrement confirmées par l'examen histologique.

L'ovulation qui se produit sous l'effet du traite-

ment décrit montre que l'on peut obtenir chez les félins la fécondation même hors saison, et que l'on peut même obtenir

des descendants dans des conditions non naturelles.

EXEMPLE 17

Traitement d'une femelle de renard bleu en anoestrus saison-

nier pour déclencher un oestrus fertile.

On effectue un examen laparoscopique sous anes-

thésie en Décembre sur une femelle de renard bleu en anoestrus saisonnier. On constate que les deux ovaires sont inactifs, ne contiennent pas de follicules en développement ou de

follicules de De Graaf.

On traite l'animal 10 jours en lui administrant deux fois par jour, par voie intramusculaire, 1,5,g d'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH. Le dixième jour, on effectue un nouvel examen laparoscopique sous anesthésie. Dans les deux ovaires, on trouve de gros corps jaunes dont le nombre (que l'on ne peut qu'apprécier en raison d'insuffisances techniques) est de 10 à 20. On constate en même temps que le col de l'utérus

est ouvert.

On traite, également en Décembre, de façon ana-

logue, en lui administrant deux fois par jour 2 Ag d'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH, une femelle condamnée à ne pas reproduire à cause d'une atteinte mammaire. On suit l'effet du traite- ment sur la modification de l'état du col de l'utérus. Le sixième jour après le premier traitement, le col de l'utérus s'ouvre. On administre ensuite une dose de 50pg. 16 heures après, on examine l'état des ovaires par laparoscopie; l'ovulation est imminente. On ouvre alors entièrement la cavité abdominale, on extrait les ovaires, et l'on retire par ponction les ovocytes des follicules de De Graaf au

nombre de 11 au total. On trouve six ovocytes normaux recou-

verts d'une Corona radiata normale.

Ce procédé permet la production d'ovocytes appro-

priés pour la fécondation in vitro, d'erQbryons au cours de l'anoestrus saisonnier, sans perturbation du cycle annuel normal. Cela offre la possibilité de produire des descendants hybrides particuliers en utilisant moins d'animaux-h8tes de

grande valeur.

EXEMPLE 18

Stimulation de la fonction ovarienne de chats domestiques d'âge infantile (Felis cattus domesticus) par l'analogue

D-Phe6, Gln8-GnRH.

On traite 5 jeunes chats âgés de 45 jours, présen-

tant chacun un poids d'environ 0,3 kg, à intervalles de deux jours, en leur administrant en quatre fois en tout pg d'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH chaque fois. On dissout l'agent actif dans une solution physiologique de chlorure de sodium et on l'applique par voie intramusculaire. Après l'achèvement du traitement, on retire chirurgicalement les

deux ovaires sous anesthésie et on les examine visuellement.

On fixe ensuite les ovaires dans de la formaline et on les soumet à des examens histologiques. Il y a dans les deux ovaires 5 à 7 unités de Corpus haemorrhagicum. Sous la croûte, on trouve les follicules en cours de développement, faciles à séparer des ovaires clairs couleur beurre, dont certains

ont la taille de follicules de De Graaf.

Ces résultats prouvent sans ambiguité que l'ovaire de chats domestiques encore dans l'enfance présente, sous l'effet du procédé décrit, les particulairités histologiques et morphologiques caractéristiques de l'animal sexuellement mûr. Ainsi, l'animal convient, avant la maturité sexuelle biologique au sens courant, pour la production d'ovocytes

convenant pour la fécondation in vitro.

EXEMPLE 19

Stimulation de la fonction ovarienne de chats domestiques

d'âge infantile par l'analogue D-Phe6, Trp7, Leu8-GnRH.

On adminsitre à 5 jeunes chats âgés de 45 jours,

pesant chacun environ 0,3kg, l'analogue D-Phe6, Trp7, Leu8-

GnRH. Avant le traitement, on retire chirurgicalement l'ovaire gauche. on administre aux animaux par voie intramusculaire à intervalles de deux jours, trois fois en tout, des doses de ug chacune de solution préparée sous la forme de solution physiologique de chlorure de sodium. Après l'achèvement du traitement, on extrait chirurgicalement l'ovaire restant (droit), on l'examine visuellement et, après fixation, on lui fait subir des examens histologiques. Après le traitement, on trouve dans les ovaires 7 ou 8 unités de Corpus haemorrhagicum et beaucoup de follicules (non dénombrables)

en cours de dévleoppement.

Ce résultat confirme entièrement ce qui a été

trouvé selon l'Exemple 18, même pour un autre analogue hormo-

nal et ouvre la voie d'autres expériences sur la physiologie

du reste du cycle des ovaires.

EXEMPLE 20

Stimulation des follicules primordiaux de chattes domestiques

d'âge infantile (Felis cattus domesticus).

On administre à 5 jeunes chats âgés de 45 jours, qui présentent un poids d'environ 0,3 kg chacun, l'analogue

D-Phe6, Gln8-GnRH. Avant le traitement, on retire chirurgica-

lement l'ovaire gauche sous anesthésie. On administre alors

aux animaux pendant trois jours, 3 fois par jour, à inter-

valles de 4 heures, neuf fois en tout 0,1 pg de l'agent actif par voie intramusculaire chaque fois, sous la forme d'une suspension préparée avec une solution physiologique

de chlorure de sodium et du propylène-glycol. Après l'achève-

ment du traitement, on retire chirurgicalement l'ovaire restant, on l'examine visuellement et, après la fixation on lui fait subir des examens histologiques. A l'oeil nu, les deux ovaires sont homogènes et de couleur jaune beurre, l'ovaire traité est un peu plus gros. Dans les ovaires non

traités, on ne peut déceler histologiquement que des folli-

cules primordiaux, tandis que, sur la surface de coupe des

ovaires non traités, on enregistre une quantité non dénombra-

ble (plusieurs centaines) de follicules en cours de développe-

ment, présentant les divers stades de la formation de l'antre.

On parvient par ce procédé à stimuler plusieurs centaines de follicules primordiaux de l'ovaire en même

temps.

EXEMPLE 21

Production d'ovocytes de boeuf pour la culture embryologique

in vitro à partir d'une culture d'organes post mortem.

On retire les ovaires intacts de génisses 30 à 55 minutes après les avoir tuées à l'abattoir et les avoir

laissées se vider de leur sang et on les place dans un adju-

vant complet dans des conditions de laboratoire. Au liquide nutritif, on ajoute de l'analogue éthylamide D-Phe6, Gln8, desGly10-GnRH à une concentration de 10-9 à 10-8. Les restes d'ovaires maintenus dans la culture d'organes ovulent en 16 à 43 heures. Parmi les ovocytes extraits des ovaires par des ovulations spontanées in vitro, puis ponction, 85 % sont capables de poursuivre la meiose (division cellulaire réductrice) et d'être fécondésavec succès in vitro avec du

sperme de boeuf préparé. On observe les deux premières divi-

sions cellulaires des ovocytes fécondés in vitro dans la culture.

Ce procédé permet, de façon analogue à la techno-

logie de l'insémination chez les boeufs, mondialement répandue, d'"inséminer" directement des embryons vivants, c'est-à-dire de les transplanter. On a la possibilité, dans les abattoirs, de produire une quantité d'embryons dépassant largement les besoins.

Claims (4)

REVENDICATIONS

1 ) Procédé d'obtention de produits génitaux appropriés pour la fécondation naturelle et artificielle à

partir de mammifères au cours de la vie prénatale et post-

natale, dans l'enfance, au cours de la prépuberté et à l'âge adulte (apellés dans la suite: sujets) par régulation de l'activité des organes génitaux, et aussi éventuellement de production de descendants à partir de ces produits génitaux et d'augmentation de la production de produits génitaux (par

rapport àla vitalité caractéristique de l'espèce), caracté-

risé en ce qu'on traite les sujets au moins une fois, mais au plus 60 fois, de préférence 1 à 5 fois, par des composés répondant à la formule générale (I) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xl-X2-X3-Pro-X4 (I) dans laquelle

X1 représente un groupe glycyle ou un reste de D-amino-

acide naturel ou synthétique quelconque; X2 représente un reste de Lamino-acide renfermant, en tant que chaîne latérale, un groupe alcoyle comportant 1 à 4

atomes de carbone, un groupe phényle ou un groupe trypto-

phyle; X3 représente un reste de L-amino-acide renfermant, en tant que chaîne latérale, un groupe alcoyle comportant 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe alcanoylamide comportant 2 à 4 atomes de carbone, et X4 représente un groupe glycylamide ou alkylamide comportant 1 à 4 atomes de carbone, dans une proportion de 0,01 à 500 g/kg de poids corporel, de préférence de 1 à 100,g/kg de poids corporel, et l'on observe entre les différents traitements des pauses d'au moins 2 heures, mais d'au plus 7 jours, de préférence de 2 à 8 heures.

2 ) Procédé d'obtention de produits médicamenteux utilisables en médecine vétérinaire pour agir sur l'activité sexuelle de mammifères, caractérisé en ce que l'on mélange des composés répondant à la formule générale (I) dans laquelle la signification de X1, X2, X3 et X4 est la même que dans

la revendication 1, avec les supports usuels dans la prépara-

tion des médicaments et/ou des adjuvants, et on leur donne la formulation de produits médicamenteux.

3 ) Produits de médecine vétérinaire, caracté-

risés en ce qu'ils renferment des composés répondant à la

formule générale (I) selon la revendication 1.

4 ) Application de composés répondant à la formule

générale (I) selon la revendication 1 à l'action sur l'acti-

vité sexuelle de mammifères.