SE462518B - Foerfarande foer utvinning av foer naturlig och konstgjord befruktning laempade koensprodukter fraan daeggdjur - Google Patents

Description

15 20 25 50 55 462 518 2 lämpade könsprodukter kan framställas från ej könsmogna djur eller från djur, i vilka utvecklingen av könsproduk- terna har avstannat i ett visst tidigt skede, eller från intakta djur in vitro eller ur gonader post mortem.

Gonadernas funktion eller produktionen av könspro- dukterna undergår vid ett stort antal avelsdjur en till- bakagång eller upphör till följd av olämplig hållning, vid vissa högvärdiga exotiska vild- och pälsdjur till följd av den ej naturliga hållningen. Vid dessa djur har de hittills kända hormonpreparaten i allmänhet visat sig verkningslösa.

De artspecifika GnRH-derivat som blivit kända un- der den senaste tiden (J.A. King och R.P. Millar, J.

Biol. Chem. êâz, 10722 - 28 /l982/; N. Sherwood m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci. §Q, 2794 - 2798 /1985/) samt det faktum att facklitteraturen rapporterar om närvaron av olika GnRH-artade faktorer i gonaderna eller ovarierna (R.M. Sharpe m.fl., Nature ägg; 785 - 787 /1981/; N. De- kel m.fl., Biol. Reprod. §§, 161 - 166 /1985/) framkas- tar frågan om speciella reglerande faktorer och växelver- kan med dessa.

De i en egen äldre skyddsrätt (ungerska patentan- sökningen nr 4457/85) beskrivna fisk- respektive fågel- specifika GnRH-derivaten är lämpade i fallet utvinning av könsprodukter från sig i övrigt i fångenskap ej för- ökande fiskar. Denna verkan beror på en stimulering av follikelutvecklingen.

Uppfinningens mål var att utarbeta ett förfarande med vilket könsorganens verksamhet hos däggdjursembryon och däggdjur kan stimuleras på sådant sätt att för natur- lig eller konstgjord befruktning lämpade könsprodukter kan framställas och dessa kan användas för att frambringa avkommor. Uppfinningens mål är vidare att mångdubbla könsproduktalstringen hos hanar och honor av däggdjur - angivet på den för arten karakteristiska livsprestationen.

Uppfinningen är baserad på insikten att detta mål kan uppnås genom användning av nonapeptid-(Cl-C4-alkyl)- -amiderna eller dekapeptidamiderna med den allmänna for- 10 15 20 25 30 f; 6 2 5 'i 8 5 meln (I) sip-His-mrp-ser-myr-xl-xz-xš-Pre-xj (I) i vilken X1 är DPhe; X2 betecknar Trp eller Leu; X3 betecknar Leu eller Gln; Xu är glycylamid eller etylamid samt deras salter och metallkomplex, dvs att med dessa föreningar kan framställas för naturlig eller konstgjord befruktning lämpade könsprodukter från ej könsmogna samt i säsongmässig anöstrus eller i genom ej naturlig håll- ning betingad anöstri befintliga däggdjur in vivo och in vitro från intakta djur samt från könsorgan post mortem eller mängden av sådana könsprodukter kan mångdubblas.

Framställningen av föreningarna med den allmänna formeln (I) är känd från ungerska patentansökningen 4458/85 samt US-patentskriften 4 410 514.

Uppfinningen avser i enlighet därmed ett förfaran- de för utvinning av för naturlig eller konstgjord be- fruktning lämpade könsprodukter från däggdjur i pre- och postnatalt liv, i infantil ålder, förpuberteten och i ut- växt tillstànd (i det följande sammanfattningsvis: medier) genom reglering av verksamheten hos deras könsorgan, vi- dare eventuellt för alstring av avkommor från dessa köns- produkter och för - angivet på den för arten karakteris- tiska livsprestationen - mångdubbling av könsproduktalst- ringen. För förfarandet är kännetecknande att man be- handlar medierna åtminstone en gång men högst 60 gånger, företrädesvis l - 5 gånger, med föreningar med den all- männa formeln (I) i en mängd av 0,01 - 500 pg/kg kropps- vikt, företrädesvis l - 100/ng/kg kroppsvikt, och mellan 10 15 20 25 50 55 en: 4 de enskilda behandlingarna gör pauser om minst 2 timmar men högst 7 dagar, företrädesvis 2 - 8 timmar. Förening- arna användes företrädesvis i form av lösningar, pulver, injektioner eller sprayer, varvid appliceringen kan ske intramuskulärt, intraperitonealt, subkutant, intrauteri- närt osv.

Vid många djurarter ökas alstringen av könsproduk- ter genom förfarandet enligt uppfinningen; vid andra djur (kliniska fall) normaliseras minskad eller pauserande könsverksamhet och uppnår den för arten typiska intensi- teten. Förfarandet enligt uppfinningen är även lämpat för att utlösa en hyperproduktivitet hos könsorganen och därmed till mångdubbling av den för arten karakteristis- ka mängden könsprodukter (superovulation).

Genom förfarandet enligt uppfinningen stimuleras groddskivans funktion och därigenom ökar antalet motila fröceller i ejakulatet.

Förfarandet enligt uppfinningen är vidare lämpat för att utlösa en hyperproduktion hos hypofysen, efter vilken hypofysen blir okänslig och ett likgiltighetstill- stånd inträder; på detta sätt är förfarandet även lämpat för förhindrande av befruktning.

Med förfarandet enligt uppfinningen kan slutpro- dukterna framställas under naturliga och under konstlade samt under laboratoriemässigt upprätthàllna levnadsbe- tingelser.

De beskrivna, genom dosering av GnRH-analogerna i olika rytm reglerade formerna av könsfunktionerna är hit- tills ej beskrivna, nya fenomen.

Huvudfördelarna hos förfarandet enligt uppfinning- en kan sammanfattas som följer: a) Genom användning av förfarandet kan gonadverk- samheten hos under ej naturliga betingelser hållna dägg- djur förbättras eller den normala funktionen àterställas och djuren görs lämpade för alstring av avkommor. b) Med förfarandet kan en hyperproduktion indice- ras hos äggstockarna, varigenom i förhållande till det för ifrågavarande art karakteristiska antalet ovulatio- 10 15 20 25 50 55 5 462 518 ner en mångdubbling av äggcellen kan erhållas. Dessa kan efter en befruktning in vitro förvaras i form av em- bryon eller bäras ut av som mottagare fungerande djur. c) Med förfarandet kan i infantila exemplar av däggdjur en hyperstimulering av gonaderna och därigenom en superovulation induceras. På detta sätt kan från ett medium avkommor utvinnas redan vid en tidpunkt då mediet självt ännu inte är könsmoget. d) Förfarandet är under speciella laboratoriebe- tingelser, i organkulturer, lämpade för framställning av in vitro befruktbara äggceller från intakta äggstockar post mortem. På detta sätt kan efterkommor erhållas från högvärdiga avelsdjur även efter mediets död. e) Handeln med de med förfarandet framställda könsprodukterna möjliggör den genom avståndet mellan de stora världsdelarna hindrade hybridiseringen av arten och därigenom ges möjlighet till uppfödning av nya nytto- djursarter. f) Med förfarandet kan under industrimässiga pro- duktíonsbetingelser från godtyckliga åldersgrupper dägg- djur av hankön och honkön stora mängder äggceller, frön eller embryon framställas, vilket exempelvis möjliggör frambringandet av embryobanker och interkontinental han- del med avkommorna. g) Med förfarandet kan den säsongsbetingade anö- strusen och den hämmade spermatogenesen hos däggdjur hä- vas. Därigenom kan avkommor alstras vid varje tidpunkt, vilket leder till ett bättre nyttjande av de ekonomiska objekten. h) Förfarandet är lämpat för konstgjord förökning av under naturskydd stående sällsynta arter. i) Med förfarandet kan såväl i han- som i hon- däggdjur hypofysen göras okänslig och därigenom kan en ej önskad dräktighet undvikas även i fall då de kända antikonoeptionsmedlen inte är användbara.

Förfarandet enligt uppfinningen belyses närmare med hjälp av följande utföringsexempel 10 15 20 25 50 35 :z-:g sJl §ëÉ@PÉl_l G “flraäá Utlösning av en superovulation i infantila hon- råttor. 60 stycken 21 dagar gamla, infantila honråttor med vikten 7 - 8 g behandlades intraperitonealt med i fy- eielegiek kekeeltlöening löst n-Pneö, ams-Gunn. Beroen- de på behandlingens art indelades djuren i flera grupper.

I den mellan en dag och åtta dagar varande behandlingsse- rien administrerades för-dosen om l respektive 2/ng per dag respektive tvâ gånger per dag.

Efter behandlingarnas slut dödades samtliga djur med eterånga och deras äggstockar utopererades efter dö- dens inträdande 24 timmar efter den sista behandlingen.

Utvärderingen skedde visuellt och med hjälp av histolo- giska prov. I kontrolldjurens äggstockar hittades flera under utveckling varande folliklar men ingen nådde stor- leken hos Graaf's follikel och dessutom fanns varken gu- la kroppar eller Corpus haemorrhagicum närvarande. I motsats härtill kunde hormonverkan påvisas vid alla be- handlade grupper, vilken manifesterade sig i tillväxt av folliklarna, ombildningen till Graaf's folliklar, ovula- tion hos stora folliklar och utbildning av normala gula kroppar. Även äggledare och livmoder var förstorade.

Av ae eo benenaleae djuren vieeae teven fyre ingen re- aktion på behandlingen. Vid de djur som under fyra da- gar dagligen hade erhållit två gånger 2/ng GnRH-analog och på fjärde dagen sex timmar efter 2/ug dosen behandla- des med en dos av 10 g befann sig i äggstockarna omedel- bart före ovulationen stående, mjukblivna Graaf's follik- lar i stor mängd. Antalet slutligt mogna Graaf's follik- lar per djur låg mellan 60 och 90 medan normalvärdet i fallet utvuxna djur ligger vid 12. En andra grupp av djuren behandlades på samma sätt med den skillnaden att behandlingen sträckte sig över sex dagar. I fallet med denna grupp taxerades superovulationsprestationen efter antalet i äggstockarna uppkomna normala gula kroppar.

Liksom i fallet med de ovan utförligt beskrivna resulta- ten var antalet gula kroppar per djur även här mellan 60 10 15 20 25 50 35 7 462 518 och 90. Den histologiska utvärderingen bekräftade detta resultat i full utsträckning.

På det beskrivna sättet framställdes å ena sidan redan i ännu infantila exemplar av arten mogna äggceller och å andra sidan màngfaldigades antalet äggceller jäm- fört med det fysiologiska värdet hos de vuxna djuren.

Eë§a2§l_ê Utlösning av en superovulation vid infantila hon- möss.

På det i exempel 1 beskrivna sättet behandlades totalt 105 honmöss, vilka var 28 dagar gamla och uppvisa- de en vikt av 5 - 6 g. De under l - 8 dagar behandlade djuren fick dagligen två gånger l - 5/ng D-Pheö, Glns, desGly1O-GnRH-etylamid. Mellan de enskilda behandlingar- na låg en tid av fyra timmar. Äggstockarna avlägsnades 27 timmar efter den sista injektionen.

Kontrollgruppens äggstockar var av mattgul färg och homogen struktur och i många äggstockar befann sig 1 - 2 växande folliklar. I grupperna med behandlade djur kunde hormonets verkan iakttagas vid alla äggstockar, förstorade äggledare och livmodern. Vid de djur som en gång dagligen erhållit en dos om 1/ug och på tredje da- gen fyra timmar efter l/ug-dosen erhållit 5/ng av nämnda GnRH-analog stod i äggstockarna slutligt utmognade Graaf's folliklar, som kändes vågiga, och närmare bestämt 45 - 70 stycken per djur. Vid en liknande men under fem dagar behandlad grupp hade i stället för Graaf's folliklar bil- dats normala gula kroppar i nämnda antal. Resultatet från den histologiska undersökningen överensstämde med den visuella utvärderingen.

Resultaten bekräftade resultaten från förfarandet enligt exempel 1.

Exempgl_§ Utlösning av en superovulation hos infantila ka- niner. 20 under betingelserna för masshållning födda unga kaniner av rasen "Weisse Perle" i åldern 42 dagar 10 15 20 25 50 35 8 0 4íš2 5 š8 behandlades under tre dagar två gånger dagligen intrape- ritonealt med vardera 5/ng D-Pheö, Gln8-GnRH. Sedan in- delades djuren i två grupper. Den ena gruppen behandla- des på fjärde dagen med 50 ug aktiv substans och den and- ra gruppen dödades medelst eterånga. Antalet mogna Graaf's folliklar i den före behandlingen dödade gruppen tjänade som kontroll vid fastställande av den genom dosen 50/ug inträdande förändringen. Vid de vid liv lämnade djuren följdes inträdandet av ovulationen på två djur ge- nom en tio timmar varande, under narkos företagen laparo- skopisk undersökning (spegling av bukhålan). Behandling- en med 50/ng hade efter 26 timmar 50 - 45 ovulationer respektive Corpus haemorrhagicum per djur till följd, me- dan äggstockarna hos kontrolldjuren var inaktiva.

Med detta förfarande kunde redan från infantila exemplar av kanin framställas mogna äggceller och dessas antal mångfaldigas angivet på det fysiologiska värdet.

Exempel 4 Utlösning av en superovulation hos infantila svin. 20 infantila hongrisar, vilka var 100 dagar gamla, behandlades under sex dagar två gånger dagligen intramus- kuiärv med vardera 10/ng n-Phas, Gln -enas. För utvärde- ringen avlägsnades från kontrolldjuren en äggstock varde- ra, undersökningsmetoderna motsvarade de som beskrivits i exempel 5, antalet bildade Graaf's folliklar och anta- let efter ovulationen bildade gula kroppar jämfördes.

Ovulationens inträde iakttogs med laparoskopet. Den på sjunde dagen administrerade dosen av 100/ng D-Pheö, Glna- -GnRH hade efter 41 timmar till följd 15 - 56 ovulationer vid de tio behandlade grisarna. Behandlingen av de in- fantila grisarna ledde till samma resultat som i fallet med de i exemplen 1 - 5 nämnda djurarterna. Éxempel 5 Utlösning av en superovulation i infantila får.

Tio jerkelamm, som var 50 dagar gamla, behandla- des under fem dagar tvâ gånger dagligen med 10/ug D-Pheö, Gina, aesG1y1°-enas-etylamia intramuskuiärt. En på sjät- 10 15 20 25 50 55 4652 5'18 te dagen administrerad dos om 70/ug aktiv substans hade till följd 5 - 9 ovulationer per djur. Vid kontrolldju- ren inträdde inte någon förändring. Utvärderingen sked- de sàväl vid de behandlade djuren som vid kontrollen med- elst laparoskopi. Resultaten överensstämmer med de i ex- emplen l - 5 beskrivna.

Eëes2§l-§ Utlösning av en superovulation hos infantila nöt- kreatur. Åtta infantila kalvar, som var 65 dagar gamla, be- handlades under åtta dagar tre gånger dagligen med 2/ug D-Pneö, G1n8, des-Giylo-Gunn-etylamia. Efter en dags paus applicerades på den tionde dagen 100 g aktiv sub- stans intramuskulärt till djuren. Efter den sista injek- tionen uttogs båda äggstockarna; i allmänhet fann man om- kring 5 - ll utvecklade Graaf's folliklar per äggstock.

Hälften av folliklarna kändes inte längre hårda och stod följaktligen omedelbart inför ovulationen.

Detta experiment bevisar att även i fallet nöt- kreatur kan flera mogna äggceller utvinnas redan från in- fantila djur medan det vuxna nötet normalt ovulerar en- dast en äggcell. §šÉ§PÉl-2 Behandling av fysiologisk oligospermi vid schim- panser för att uppnå normospermi.

För de i små grupper levande djurarterna, speci- ellt emellertid för primaterna, är det i facklitteratu- ren upprepat publicerade faktumet karakteristiskt att al- la hanar i flocken visserligen har ett aktivt libido men att endast ledardjuren kopulerar, medan de underordnade hanarna är fysiologiskt och reversibelt oligospermiska.

I föreliggande fall behövdes förutom det från ledardju- ret uppsamlade och i spermabanken lagrade spermat uttryck- ligen i inseminationssyfte även spermat från de subordi- nerade fyra hanarna (alla könsmogna). Före behandlingen bringades djuren till ejakulation på elektrisk väg under narkos. Ejakulaten utvärderades under mikroskop med av- 10 15 20 25 50 35 4s2 518 1° seende på täthet och motilitet och underkastades sedan ett djupfrysningsprov (- 196 OC). Egna tidigare sperma- tologiska undersökningar visade nämligen att mikroskopiskt svåruppfattbara defekta fröceller inte överlever djupfrys- ningen. Den efter djupfrysningen erhållna fördelaktiga spermabilden visade, att spermiogenesen förlöper normalt.

Det före behandlingen från de undersökta hanarna tagna ejakulatet visade fysiologisk oligospermi. Därefter er- höll de 60 - 90 kg tunga schimpanserna en gång varje vecka 1oo mg n-Pneö, Gina, aeseiylo-Gnafl-etyiamia i 1 m1 fysiologisk koksaltlösning. Appliceringen skedde intra- muskulärt med en tryckluftsinskjutningsanordning. I de ejakulat som under den fjärde veckan efter den första be- handlingen utvanns på elektrisk väg under narkos kunde en andel av 40 - 60 % spermieförformer registreras, vil- kas motilitet efter djupfrysningsprovet låg under 10 %.

I de ejakulat som utvanns 60 dagar efter den första be- handlingen var andelen defekta fröceller lägre än 50 % och motiliteten översteg 60 %. Kvantitativa och kvalita- tiva egenskaper hos ejakulaten överensstämde med det från ledardjuret utvunna ejakulatets samt med facklitteratu- rens uppgifter. Vid djupfrysningen av de i förhållandet l : 1 utspädda ejakulaten sjönk den 60 %-iga motiliteten endast till 45 %. Sperma av denna kvalitet är såväl färs- ka som djupfrysta lämpade för inseminationsändamål.

På det beskrivna sättet kan för befruktning läm- pat, i spermabanken lagringsbart sperma i lämplig mängd och kvalitet utvinnas från subordinerade hanar. .äbsefßeskê Utlösning av spermiogenesen hos en säsongsbeting- at oligospermisk visenttjur i syfte att utvinna för inse- mination och för djupfrysningslagring lämpat ejakulat.

Från en i den zoologiska trädgårdens ägo befint- lig omkring 700 kg tung visenttjur togs i maj månad ett fröprov pà elektrisk väg under narkos. Det fastställdes att tjuren befann sig i tillståndet av säsongsbetingat oligospermi. Symtomen var följande: i synfältet för det för spermaundersökning i allmänhet utnyttjade 1500 10 15 20 25 50 55 11 462 518 gånger förstorande mikroskopet var spermietalet 5 - 20, andelen defekta fröceller uppgick till 75 - 80 % och spermiernas täthet till 0,5. Sperma av denna kvalitet är olämpligt för befruktning.

Tjuren behandlades nu intramuskulärt (medelst en tryokluftsinskjutningsanordning) två gånger varje vecka med vardera 200/ug D-Pheê, Gln8-GnRH. Den femtifemte da- gen efter behandlingens början bringades tjuren till eja- kulation två gånger med en timmes tidsmellanrum. De bå- da ejakulaten förenades; tätheten uppgick till 4, motili- teven till 55 %. des den genom djupfrysningen inträdande motilitetsminsk- Spermat djupfrystes och sedan bestäm- Denna uppgick till endast 5 %.

Med detta förfarande lyckades det att påverka avelsdjurets spermiogenes så att i stället för det för befruktning ej användbara ejakulatet kunde ett såväl i färskt tillstånd som efter djupfrysningslagring för be- fruktning av flera kor (totalt 14) lämpat sperma av myck- et god kvalitet utvinnas. ningen. ësaaeli Utlösning av spermiogenesen vid säsongsbetingat oligospermisk rödräv (Vulpes vulpes).

Spermiogenesen hos i djurpark hållna, säsongsbe- tingat oligospermiska rödrävar skulle påverkas i syfte att i uppfödningsstationer hållna ädelsilver- och blårä- var skulle kunna insemineras för att kunna framställa speciella och värdefulla hybridskinn. Från facklittera- turen är det känt att samtliga underarter av rävar löper endast en gång om året och att utanför denna enda period är gonaderna hos båda könen fullständigt inaktiva. Mel- lan östrus för de olika underarterna finns en tidsmässig skillnad på flera månader (rödräv: januari, blåräv: ap- ril till maj). Resultaten från undersökningarna jämför- des med spermabilden hos en i säsongsmässig östrus be- fintlig population, vid vilken den genomsnittliga ejaku- latmängden uppgick till 2 ml, tätheten till 5 och moti- liteten till 50 - 60 %. Detta betraktades som fysiolo- giskt värde. 10 15 20 25 30 55 q 12 .S __|_\ nu i* (N Fem könsmogna hanar av rödräv med medelvikten 8 kg behandlades med början i april under sju veckor två gånger per vecka med l, 5, 10, 50/ng D-Phe6, Gln8-GnRH.

Under den tredje veckan efter behandlingens början togs spermaprov. I proven uppgick antalet fröceller till om- kring 60 - 70 % av det fysiologiska värdet och antalet degenererade spermier översteg 40 %. De defekta former- na var till övervägande del ungformer (plasmadroppar vid halsdelens mellandel). Under sjunde veckan efter behand- lingens början samlades ejakulatet ånyo under narkos.

Från samtliga djur kunde frön med framgång tagas, ejaku- latets volym uppgick varje gång till mellan 1,2 och 5,1 ml, tätheten låg vid 5, motiliteten 65 % översteg nume- riskt det fysiologiska värdet väsentligt. (Handjuren var vid denna tid separerade från honorna så att det in- te fanns någon möjlighet för tömning genom kopulation.) Spermaproven indelades i grupper efter kvalitet och djup- frystes. Efter spädning och djupfrysning och slutligen upptining var motiliteten för det till à 196 °C kylda spermat 45 %. Under användning av det djupfrysta sper- mat kunde - under användning av GnRH-programmeringen (se exempel 17) och inseminationstekniken - normal dräktig- het uppnås vid blårävar.

Genom vid de fem rävarna företagen engångsejaku- latuttagning kunde 56 doser för befruktning lämpet sper- ma framställas. Tekniken är lämpad för framställning av hybridädelskinn i storfarmer.

E§ea2§l_l9 Behandling av en på grund av degenererad sperma- bild infertil sibirisk tiger.

En i den zoologiska trädgårdens ägo befintlig åt- ta år gammal sibirisk tiger med vikten 120 kg levde sedan tre år samman med en tigrinna. I honans östrus ägde par- ningar regelbundet rum men någon efterkommande infann sig aldrig. Att en dräktighet inte kom till stånd genom honans förskyllan måste uteslutas, eftersom tigerkatten genom en annan hane redan hade varit dräktig och även ha- de uppfött sina ungar. 10 15 20 25 50 35 15 462 518 Från tigerhannen uttogs under narkos ett sperma- prov på elektrisk väg. Ejakulatet var mycket tunt; per synfält var 4 - 5 degenererade spermier synbara, vilka utförde en vibrerande rörelse. Degenerationernas form var karakteristisk för de tidigare faserna av spermato- genes. Djuret behandlades en gång varje vecka intramus- kulärt (medelst en tryckluftinskjutningsanordning) med 1oo /ug n-Pneß, fßrp7, Leuß-Gnnfl löst i 1 m1 fysiologisk koksaltlösning. Tigern hölls tillsammans med sin tigrin- na och även under behandlingens gång ägde parningar re- gelbundet rum. Honan blev dräktig och födde tre friska små tigrar. Från tidpunkten för nedkomsten kan slutsat- sen dragas att den fertila kopulationen ägde rum 40 - 50 dagar efter den första behandlingen.

Förfarandet är i enlighet därmed lämpat för be- handling av den degenererade spermabilden hos infertil hantiger och på detta sätt för uppnående av efterkommande. §ëÉE2§l-ll Stimulering av fysiologisk normospermi vid en ben- galisk tiger för uppnående av hyperspermi, som möjliggör djupfrysning.

En i den zoologiska trädgårdens ägo befintlig åt- ta år gammal bengalisk tiger med en vikt omkring 200 kg parade sig regelbundet och hans hona hade tidigare varit dräktig varje år. Med kännedom härom uttogs från tigern under narkos ett spermaprov på elektrisk väg under par- ningstiden. Det fastställdes att spermats täthet upp- gick till 5, motiliteten 50 % och mängden ejakulat 0,2 ml. Ejakulatet visade bilden av fysiologisk normospermi.

En sådan ringa mängd ejakulat kan av tekniska skäl inte djupfrysas. För att undvika leverskada får narkosen fö- retagas högst varje fjärde dag och upprätthàllas i högst 4 - 5 timmar. Detta slags spermasamlande är ej genomför- bart.

Hanen behandlades inspärrad i en separat bur och under tolv dagar dagligen med 10/ng D-Phee, Glns, deSG1Y -GnRH-etylamid. Den aktiva substansen löstes i l ml fy- siologisk koksaltlösning och applicerades intramuskulärt 10 10 15 20 25 50 55 luv-sz 518 1” medelst en tryckluftinskjutningsanordning. På tolfte da- gen bringades djuret under narkos till ejakulation på elektrisk väg två gånger med en timmes mellanrum, varvid l ml respektive 0,8 ml sperma utvanns. Tätheten för de förenade proven uppgick till 4, motiliteten låg vid 70 %.

Spermaproven djupfrystes och uppdelades i 21 enkeldoser för konstgjord befruktning. Efter spermats upptining uppgick motiliteten till 60 %.

Pâ detta sätt kunde från en bengalisk tiger i en spermabank lagringsbart sperma utvinnas i betydande mängd.

E§sa2sl_lê Behandling av genom ej naturlig hållning förorsa- kad aspermi hos en orangutang.

En i den zoologiska trädgårdens ägo befintlig 18 år gammal orangutanghane med en vikt omkring 550 kg hade fångats som ungdjur. Han hade haft tre ägare efter var- andra. Enligt anamnesen hade han aldrig haft någon föl- jeslagarinna utan hade alltid hållits ensam och hade ald- rig parat sig. I zoon levde han sedan elva år utan art- kamrat och utan hona. Hans uppförande var flegmatiskt, inaktivt, kännetecknat av hospitalisationssymtom. Den zoologiska trädgården fick ett anbud enligt vilket en in- stitution skulle köpa djuret, om det hörde till Borneo- underarten och var fertilt. Kromosomundersökningen visa- de att djuret hör till Borneo-underarten, dvs är ett utomordentligt sällsynt exemplar (i hela världen finns det 153 exemplar). I anamnesen ifrågasattes fertilite- ten genom att den för hanprimaterna karakteristiska agg- ressiviteten och den regelbundna masturberingen sedan tidpunkten för den för 5 - 6 år sedan uppkomna hospitali- seringen fullständigt hade upphört. Från djuret uttogs under narkos ett spermaprov på elektrisk väg. I ejakula- tet hade uteslutande sekretionen från bikörtlarna tömts, tre gånger om vardera en droppe, totalt 0,1 ml. I eja- kulatet kunde inga rörliga spermier hittas utan endast några inaktiva fröoeller förelåg. (Vid den mikroskopis- ka undersökningen räknades i tio synfält totalt l - 2 10 15 20 25 50 55 15 462 518 stycken.) Djuret behandlades nu två gånger varje vecka med ioo/ng D-Pneö, Glns, aeseiylo-anna-etyiamia. Behandling- en skedde på det i exemplen 1 - ll beskrivna sättet. Un- der behandlingens gång blev djurets rörelser livaktigare, men det kunde inte anses som uppstigning av libido, ef- tersom det även kunde vara utlöst av ångesten före in- skjutningsinjektionerna. Behandlingen avslutades den 47:de dagen efter den första injektionen. Djuret bringa- des under förnyad narkos till ejakulation tvâ gånger med en timmes mellanrum, varigenom totalt 5,2 ml sperma ut- vanns. Spermats täthet uppgick till 5, motiliteten var 55 %. ken handlade det endast om unga utvecklingsformer (plas- madroppar vid halsdelens mellandel).

På grund av djurets höga värde och även intresset av att den personal som företog behandlingarna skulle be- hållas oskadda fortsattes behandlingen inte vidare. Kö- paren blev tillfredsställd av den kontrollerade sperma- bilden, som motsvarade de för fertila primater karakte- ristiska värdena.

På detta sätt kunde fertiliteten hos ett utomor- dentligt sällsynt, värdefullt djur återställas och genom förvaring av dess sperma kunde en i den internationella katalogen förtecknad genreserv bildas.

-Ešâälëâliâ Ovarial hämning hos lejon i antikonceptionssyfte.

I hela världens zoologiska trädgårdar visas lejon bland de stora rovdjuren. För de olika panoramorna och safariparkerna är det nödvändigt att visa båda könen sam- tidigt i ett och samma levnadsutrymme. Bland de stora rovdjuren är lejonet det enda som i fångenskap förökar sig gott vid tillräckliga försörjningsförhållanden. På grund av den absoluta mättnaden på "lejonmarknaden" är utarbetandet av ett befruktningsförhindrande förfarande önskvärt, som är ofarligt för djuret, inte framkallar nå- gon förändring i dess yttre utseende och dess uppförande och trots fertil kopulation förhindrar befruktningen.

Andelen degenererade fröceller var 20 %; i prakti- U 10 15 20 25 30 55 462 518 16 Befruktningsförhindrandet på basis av sexualsteroider le- der inom kort tid till sjuklig förfettning och förlust av djurets demonstrationsvärde.

En i den zoologiska trädgårdens ägo befintlig in- takt, fruktbar lejoninna med en vikt omkring 200 kg, som under sin levnad redan fött ungar fem gånger, behandlades var tredje vecka två gånger med D-Pheö, Glue-GnRH, närma- re bestämt först med 50/ng och efter fyra timmar med 500 /ng och sedan iakttogs en paus om tre veckor. Denna var tredje vecka skeende behandling företogs från östrus bör- jan till 50:de dagen efter den för arten karakteristiska sluttidpunkten för östrus (alltså från april till och med augusti). Djuret visade normalt uppförande och para- de sig regelbundet under östrus och ifrågavarande hane var enligt undersökning nomosperm. Lejoninnan blev inte dräktig under behandlingstiden och varken i hennes upp- trädande eller i hennes utseende kunde någon avvikelse från det normala iakttagas.

Eggmpel 14 Inducering av könsfunktionen hos under masshåll- ningsbetingelser i puberteten befintliga honunggrisar i syfte att för första gången utlösa det befruktningsbered- da tillståndet.

Under betingelserna för masshållning eftersträvas att insätta de för beståndets upprätthållande avsedda avelsdjuren så snart som möjligt för aveln och att syn- kronisera befruktningen och grisningen i intresse att få anpassning till en kontinuerlig teknologi. Den gonada aktiviteten hos i stor mängd hållna, genom intensiv ut- fodring till snabb tillväxt tvingade honunggrisar är la- bil under tiden för prepuberteten och puberteten och där- för förekommer det sällan och spritt över hela populatio- nen att det i sig befruktningsberedda tillståndet senare följs av en dräktighet.

För försökets ändamål utvaldes i en svinuppföd- ningsstation av de till förfogande stående 200 blivande avelssuggorna - på grund av bästa utveckling, bästa fo- derutnyttjningsförmàga osv - 60 djur. Dessa indelades 10 15 20 25 50 55 17 462 518 slumpartat i två grupper om vardera 50 djur. Båda grup- perna varken utfodrades eller gavs vatten under 24 tim- mar likaså i enlighet med denna stations teknologi. Dju- ren behandlades vid tidpunkten för deras utval intramus- kulärt med i fysiologisk koksaltlösning löst D-Pheö, sing-emma. nämnda förening upprepades med 24 timmars mellanrum yt- terligare två gånger. Såväl i den obehandlade kontroll- gruppen som i den behandlade gruppen inträdde det be- fruktningsberedda tillståndet hos det första djuret fem dagar efter djurens utval. Båda bestånden hölls i samma stall, samma luftrum, under identiska betingelser de ut- gående från teknologin tillåtna 26 dagarna. Under denna tid kom från den obehandlade kontrollgruppen tre djur (10 %) och av den behandlade gruppen 21 djur (70 %) fram- gångsrikt till befruktningsberett tillstånd. Som fram- gângsrika bokfördes endast sådana fall vid vilka det be- fruktningsberedda tillståndet följdes av normal dräktig- het och nedkomst.

I denna försöksserie sträckte sig målsättningen inte till exakt inställning av ovulationstidpunkten, ef- tersom inte tillräckligt med avelsgaltar stod till förfo- gande. Därför var màlsättningen “första framgångsrika befruktningsberedda tillståndet" inom 26 dagar. Andelen 10 % dräktiga djur i kontrollgruppen motsvarade drifts- medelvärdet. Därför betyder den genom behandlingen in- trädde 60 %-iga ökningen en betydande ekonomisk fördel.

Injektionerna med doser om vardera 20/ug av E§§9P§l-lÉ Behandling av under längre tid ofruktbara chin- chillor.

Tjugo chinchillor, som var ofruktbara sedan minst två år, behandlades medelst intraperitoneal injektion un- der tre dagar två gånger dagligen med vardera 10/ug D-Pheö, Glus-GnRH. På fjärde dagen applicerades 75/ng Sedan lämnades djuren åt hannarna i Tolv av chinchillorna födde av hormonanalogen. enlighet med teknologin. ungar inom fyra månader.

Parallellt med detta försök behandlades tre spe- 10 15 20 25 50 55. 462 518 18 ciellt värdefulla chinchillor ("Black"-mutanter), som va- rit ofruktsamma längre än två år, i tre dagar, två gånger dagligen med vardera 10/ug D-Pheö, Glns-GnRH. Den aktiva substansen administrerades som intraperitoneal injektion.

På fjärde dagen applicerades hormonanalogen i en dos av 75/ug och sedan lämnades djuren som vanligt åt hannarna.

Inom fyra månader födde alla tre djuren ungar.

Med detta förfarande kunde under längre tid ofrukt- samma, värdefulla pälsdjur ånyo komma i avel. §šÉ§BÉl-l§ Undanröjande av säsongsbetingad anöstrus hos vux- na vildkatter, (Felis silvestris).

Två i djurgårdens ägo befintliga honvildkatter med medelvikten 6 kg, vilkas cykel under naturliga beting- elser infaller under månaderna februari/mars, behandlades i augusti med n-Pheö, Gina, aeselylo-Gnnn-etylamia. Fö- re behandlingen öppnades under narkos bukhålan för inspek- tion av tillståndet hos de båda äggstockarna. Sedan buk- hålan åter sytts ihop, behandlades djuren under upprätt- hållande av tvådagars-pausen totalt fyra gånger med den aktiva substansen, vilken, löst i fysiologisk koksaltlös- ning, applicerades intramuskulärt. Mellan den första och den andra injektionen iakttogs en paus om två timmar; den första dosen uppgick till 100/ug, den andra till 500/ug.

Efter 48 timmar följde den tredje dosen (100/ng) och ef- ter ytterligare två timmar den fjärde (500/ng). På dag O, 2, 4 och 8 öppnades bukhålan under narkos och föränd- ringen i äggstockarnas tillstånd utvärderades visuellt.

Efter behandlingarnas slut avlägsnades båda äggstockarna operativt, fixerades och utvärderades histologiskt.

På dag O kunde vid båda djuren i den vänstra ägg- stocken iakttagas 3 - 4 sannolika sekundära folliklar, en tillbakabildad gammal gul kropp och i den högra ägg- stocken 5 - 6 sannolika sekundära folliklar. Genom be- handlingen hade efter fyra dagar alla sekundära follik- lar utvecklat sig till Graaf's folliklar, ovulationen ha- de ägt rum och i stället för folliklarna befanns i om- bildningen till gul kropp inbegripna Corpora haemorrha- 10 15 20 25 50 35 19 462 518 gica. Vid sidan av de senare växte i visuellt ej räk- ningsbar mängd sekundära folliklar, som fortsatte att ut- veckla sig genom verkan av de ytterligare behandlingarna och efter den sista 500/ng-dosen atretiserade med intra- follikulär luteinisering. De visuella konstaterandena stöddes i full utsträckning genom den histologiska utvär- deringen.

Den genom den beskrivna behandlingen inträdda ovu- lationen bevisar att befruktning vid kattarter kan upp- nås även utanför säsongen och avkommor kan uppnås även i ej naturlig hållning.

EëEEIEELlZ Behandling av en i säsongsbetingad anöstrus be- fintlig blårävshona i syfte att utlösa en fertil östrus.

En i säsongsbetingad anöstrus befintlig blårävsho- na undersöktes i december laparoskopiskt under narkos.

Det fastställdes att båda äggstockarna var inaktiva och ingen innehöll fellikler eller Gèeefe fellikler eem ul;- vecklade sig.

Djuret behandlades under tio dagar två gånger dag- ligen intramuskulärt med l - 5 g D-Pheö, Gln8-GnRH. På tionde dagen skedde under narkos förnyad laparoskopisk undersökning. I båda äggstockarna befann sig stora mäng- der gula kroppar, vilkas antal - vilket på grund av tek- niska bristfälligheter endast kunde uppskattas - uppgick till 10 - 20. Samtidigt fastställdes att livmoderhalsen var öppen.

Likaså i december behandlades en på grund av mam- mal förkrympning till uteslutning från avel dömd hona på liknande sätt två gånger dagligen med vardera 2/ng n-Pneö, Gina-ewa. Behenalingenepverken följaee på för- ändringen i livmoderhalsens tillstånd. På sjätte dagen efter den första behandlingen öppnade sig livmoderhalsen.

Därefter administrerades en dos om 50/ug. Efter sexton timmar undersöktes äggstockarnas tillstånd genom speg- ling; ovulationen förestod omedelbart. Nu öppnades buk- hålan fullständigt, äggstockarna opererades bort och från de totalt elva Graaf's folliklarna avlägsnades ägg- 10 15 20 25 50 55 _ 20 4í52 ö'š8 cellerna genom punktion. Sex normala äggceller hittades, vilka var betäckta med en normal Corona radiata.

Med detta förfarande möjliggjordes framställning av för in vitro befruktning lämpade celler, av embryon i säsongsbetingad anöstrus, utan störning av den normala årliga cykeln. Detta erbjuder möjligheten att framstäl- la speciella hybridavkommor under användning av mindre värdefulla recipientdjur. §ë§a2§l_lê Stimulering av äggstocksfunktionen hos infantila huskattor (Felis cattus domesticus) med D-Pheö, Gln8-GnRH.

Fem unga katter i åldern 45 dagar, som uppvisade en vikt vardera av omkring 0,5 kg, behandlades med mel- lanrum om två dagar totalt fyra gånger med vardera lOO /ug D-Phee, Gln8-GnRH. Den aktiva substansen löstes i fy- siologisk koksaltlösning och applicerades intramuskulärt.

Efter behandlingens slut avlägsnades båda äggstockarna operativt under narkos och utvärderades visuellt. Där- efter fixerades äggstockarna i formalin och underkasta- des histologiska undersökningar. I båda äggstockarna var 5 - 7 stycken Corpus haemorrhagicum närvarande. Un- der barken hittades från den ljusa, smörfärgade äggstock- en väl avskiljbara, i utveckling stadda folliklar, av vilka en del hade storleken av Graaf's follikel.

Dessa resultat bevisar entydigt att äggstocken hos ännu infantila huskatter genom verkan av det skild- rade förfarandet visar de för det könsmogna djuret karak- teristiska histologiska och morfologiska egenarterna.

På detta sätt blir djuret före den i vedertagen mening uppfattade biologiska könsmognaden lämpat för att fram- ställa för befruktning in vitro lämpade äggceller.

E§sa22l_l2 Stimulering av äggstocksfunktionen hos infantila huskatter med D-Phee, Trp7, Leu8-GnRH.

Fem unga katter i åldern 45 dagar, vilka vardera uppvisade en vikt av omkring 0,3 kg, behandlades med D-Phee, Trp7, Leu8-GnRH. Före behandlingen avlägsnades 10 15 20 25 50 55 21 462 518 vänstra äggstocken operativt. Till djuren administrera- des intramuskulärt med mellanrum om två dagar totalt tre gånger doser om vardera 100 g i form av med fysiologisk koksaltlösning beredd lösning. Efter behandlingens slut bortopererades den kvarvarande (högra) äggstocken, utvär- derades visuellt och underkastades histologiska undersök- ningar efter fixering.

Före behandlingen var de operativt avlägsnade ägg- stockarna helt homogena och av smörgul färg och några folliklar under utveckling kunde inte iakttagas i dem vare sig visuellt eller genom histologisk undersökning.

Efter behandlingen hittades i äggstockarna 7 - 8 stycken Corpus haemorrhagicum och många (ej möjliga att räkna) i utveckling stadda folliklar.

Detta resultat bekräftar de enligt exempel 18 er- hållna resultaten även för en annan hormonanalog i full utsträckning och förmedlar ytterligare erfarenheten om fysiologin för äggstockarnas fortsatta cykel. ëreimekêå* Stimulering av den primordiala follikeln hos in- fantila honhuskatter (Felis cattus domesticus).

Fem unga katter i åldern 45 dagar, vilka vardera uppvisade en vikt av omkring 0,5 kg, behandlades med D-Pheö, Gln8-GnRH. Före behandlingen avlägsnades den vänstra äggstocken operativt under narkos. Sedan erhöll djuren under tre dagar tre gånger dagligen med mellanrum om fyra timmar totalt nio gånger vardera 0,1/ng av den aktiva substansen intramuskulärt i form av en med fysio- logisk koksaltlösning och propylenglykol beredd suspen- sion. Efter behandlingens slut avlägsnades den kvarva- rande äggstocken operativt, utvärderades visuellt och underkastades histologiska undersökningar efter fixering.

Visuellt var båda äggstockarna homogena och av smörgul färg men den behandlade äggstocken var något större. I de obehandlade äggstockarna kunde endast primordiala fol- liklar iakttagas histologiskt medan vid snittytan hos de behandlade äggstockarna en ej räkningsbar mängd (flera hundra) i utveckling stadda, de olika stadierna i antrum- r I' 10 15 20 25 , ,-, 22 462 :v18 bildningen uppvisande folliklar registrerades.

Med detta förfarande var det möjligt att samtidigt stimulera flera hundra primordiala folliklar i äggstocken.

Ez§@2§l_êl Framställning av nötäggceller i syfte att odla em- bryon in vitro från en organkultur post mortem.

Från nötkreatur avlägsnades de intakta äggstockar- na 50 - 55 minuter efter det att djuren i slakthuset be- dövats och lämnats att förblöda och lades under laborato- riebetingelser i ett komplett adjuvans. Till näringsvät- skan sattes i en koncentration av 10-9 till lO-8 g/ml D-Pheö, Glns, desGly1O-GnRH-etylamid. De i organkulturen hållna äggstocksförràden ovulerade inom l6 - 45 timmar.

Av de från äggstockarna genom in vitro spontant skedda ovulationerna och efterföljande punktion utvunna äggcel- lerna var 85 % i stånd att fortsätta meiosen (den reduk- tiva celldelningen) och kunde med framgång befruktas in vitro med kapaciterat nötsperma. De första två celldel- ningarna av de in vitro befruktade äggcellerna i kulturen iakttogs.

Med detta förfarande bereddes möjlighet att på liknande sätt som vid den över hela världen utbredda tek- nologin med insemination vid nötkreatur direkt "insemine- ra", dvs transplantera, levande embryon. I slakterierna ges möjlighet att framställa en mängd embryon som långt överstiger behovet. ff

Claims (3)

43 462 518 PATENTKRAV

1. Förfarande för utvinning av för naturlig eller konst- gjord befruktning lämpade könsprodukter från däggdjur i pre- och postnatalt liv, i infantil ålder, förpuberteten och i utvuxet tillstånd (i det följande sammanfattningsvis: medier) genom reglering av verksamheten hos deras könsorgan, vidare eventuellt för alstring av avkommor från dessa köns- produkter och för - angivet på den för arten karakteristis- ka livsprestationen - mångdubbling av könsproduktsalstringen, k ä n n e t e c k n a t av att man behandlar medierna åtmin- stone en gång men högst 60 gånger, företrädesvis 1-5 gånger, med föreningar med den allmänna formeln (I) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-Xu (I) i vilken X är DPhe; X X X betecknar Trp eller Leu; betecknar Leu eller Gln; är glycylamid eller etylamid -|:(AJI\)|-\ i en mängd av 0,01 - 500 pg/kg kroppsvikt, företrädesvis 1 - 100 pg/kg kroppsvikt, och mellan de enskilda behand- lingarna gör pauser om minst två timmar men högst sju dagar, företrädesvis 2 - 8 timmar.

2. Förfarande för framställning av inom veterinärmedicinen för att påverka könsverksamheten hos däggdjur användbara läkemedelspreparat, k ä n n e t e c k n a t av att man blandar föreningar med den allmänna formeln (I), i vilken betydelsen för X1, X2, X3 och Xu är densamma som i krav 1, med de inom läkemedelsframställningen vanliga bärar- och/ eller hjälpsubstanserna och formulerar till läkemedels- preparat. 462 518 zu

3. Veterinärmedicinska preparat, k ä n n e t e c k n a d e av att de innehåller föreningar med den allmänna formeln (I) enligt krav 1. H. Användningen av föreningar med den allmänna formeln (I) enligt krav 1 för att påverka könsverksamheten hos däggdjur.