HU193607B

HU193607B - Process for production of sexual products applyable for natural or artificial insemination for mammates

Info

Publication number: HU193607B
Application number: HU852763A
Authority: HU
Inventors: Tamas Gulyas; Csaba Banhazi; Eszter Kovats
Original assignee: Innofinance Altalanos Innovaci
Priority date: 1985-07-18
Filing date: 1985-07-18
Publication date: 1987-11-30
Also published as: FI862989A0; FI862989A; NO862898D0; IT1213100B; JPS6284026A; ES2020352A6; DE3624422A1; DK344386A; RU1837888C; NL8601881A; SE8603164L; FI85440C; LU86518A1; BE905096A; SE462518B; FI85440B; NO862898L; US4753928A; IT8621057A0; FR2584930B1

Description

A találmány tárgya eljárás emlősök preés posztnatális életében, infantilis korában, prepubertásában és kifejlett állapotában nemi szerveik tevékenységének a szabályozása útján természetes vagy mesterséges megtermékenyítésre alkalmas ivartermékek előállítására és adott esetben azokból utód létrehozására, valamint az ivartermék-produkciónak a fajra jellemző életteljesítményhez képest történő megtöbbszörözésére.

A nemi működés stimulálására, ill. ovulációindukcióra elsősorban bizonyos haszonés tenyészállatok esetében széleskörűen alkalmaznak különböző hormonális készítményeket,, mint pl. szteroidokat, gonadotropinokatrili. legújabban GnRH-t, ill. ennek bizonyos szuperaktív analógjait. A jelenleg isimért anyagok, ill. eljárások csak a már érett, de valamilyen okból nem ovulált petesejt ovulációját indukálják, illetve a ciklus normális lefolyásában kialakult valamilyen gát hormonális hatásra bekövetkező egyszeri, impulzusszerű eltávolítására és ezen keresztül az ovuláció indukciójára alkalmasak. Jelenleg nem ismeretes olyan hormonkészítmény, ill. eljárás, amely általában a petefészek működését, a preantrális vagy a primordiális tüszők érését stimulálja, ill. a fejlődésnek indult tüszők számát fokozza.

Jelenleg ugyancsak nem ismeretes olyan készítmény, ill. eljárás, amelynek segítségével nem ivarérett állatokból, ill. olyan állatokból, amelyekben az ivartermékek fejlődése egy bizonyos korai szakaszban leállt, ill. intakt állatokból in vitro, ill. gonádokból poszt mortem megtermékenyítésre alkalmas ivartermékeket lehet előállítani.

Számos tenyészállat esetében a nem megfelelő tartás, ill. bizonyos nagyértékű egzotikus vad- és prémállatok esetében a nem természetes tartás következtében a gonádok működése, ill. az ivartermékek produkciója visszafejlődik, ill. leáll. Ezen állatok esetében az eddig ismert hormonkészítmények általában hatástalannak bizonyultak.

Az utóbbi időkben ismeretessé vált fajspecifikus GnRH származékok [J.A. King és R.P. Millar, J.Biol. Chem. 257, 10722—28 (1982); N.Sherwood és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. 80,-2794—2798 (1983)], valamint az a tény, hogy a szakirodalom beszámol különböző GnRH-szerü faktorok jelenlétéről a gonádokban, ill. az ováriumban [R.M. Sharpé és mtsai, Natúré 290, 785—787 (1981); N. Dekel és mtsai, Bioi. Repród. 28, 161 —166 (1983)], felvetették speciális szabályozási faktorok, ill. az ezekkel való kölcsönhatás lehetőségét.

Az általunk kidolgozott hal-, ill. madárspecifikus GnRH származékok halak esetében a 4457/83 alapszámú, magyar szabadalmi leírás szerint alkalmasak rabságban egyébként nem szaporodó halak esetében is ivartermékek előállítására. Ezt a hatást a tüszőfejlődés stimulálása révén érik el.

A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amellyel emlős magzatok vagy emlős állatok nemi szerveinek tevékenységét úgy serkenthetjük, hogy természetes vagy mesterséges megtermékenyítésre alkalmas ivartermékeiket elő tudjuk állítani és azokat utód létrehozására fel tudjuk használni. A találmány további célja, hogy hím- és nőivarú emlősállatok ivartermék-produkcióját a fajra jellemző életteljesítményhez képest megtöbbszörözzük.

találmány alapja az a felismerés, hogy az (I) általános képletü

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X,-X₂-X₃-Pro-X₄ (I) — amely képletben

X, jelentése glicilcsoport vagy bármilyen természetes vagy szintetikus D-aminosav-cso port,

X₂ jelentése olyan L-aminosav-csoport, amelynek oldallánca 1—4 szénatomos alkil-, fenil-, vagy triptofilcsoport,

X; jelentése olyan L-aminosav-csoport, amelynek oldallánca 1—4 szénatomos alkil vagy 2—4 szénatomos alkanoil-amid-csoport és

X₄ jelentése glicil-amid vagy 1—4 szénatomos alkil-amid-csoport — nonapeptid-, 1—4 szénatomos alkil-amid, illetőleg dekapeptid-amid, valamint e vegyületek sóinak és fémkomplexeinek alkalmazásával elérhető a fenti cél, vagyis nem ivarérett, valamint szezonális anösztruszban és nem természetszerű tartás által okozott anösztriában lévő emlős állatokból in vivő, és in \ itro intakt állatokból, valamint nemi szervekből poszt mortem természetes vagy mesterséges termékenyítésre alkalmas ivartermékeket állíthatunk elő, ill. azok mennyiségét giegtöbbizörözhetjük.

Az (1) általános képletü vegyületek előállítása ismert a 4458/1983 alapszámú,lajstromszámú magyar és a 4,410,514 sz. USA-beli szabadalmi leírásokból.

A fentiek alapján a találmány eljárás emlősök (továbbiakban: médiumok) pre- és posztnatális életében, infantilis korában, prepubertásában és kifejlett állapotában nemi szerveik tevékenységének a szabályozása útján természetes vagy mesterséges megtermékenyítésre alkalmas ivartermékek előállítására és adott esetben azokból utód létrehozására, valamint az ivartermék-produkciónak a fajra jellemző életteljesítményhez képest történő megtöbbszörözésére. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a médiumokat legalább egy, de legfeljebb 60 alkalommal, előnyösen 1—5 alkalommal 0.01—500 pm/ /testsúly kilogramm (tskg), előnyösen 1 — 100 pg/tskg (I) általános képletü vegyülettel kezeljük, és az ismételt kezelések között legalább két óra, de legfeljebb 7 nap, előnyösen 2—8 óra időtartamú szüneteket tartunk. A vegyüieteket előnyösen oldat, por, injekció vagy spray formájában alkalmazzuk. Az adagolás módja intramuszkuláris, intraperitoneális, szubkután, intrauterinális stb. lehet.

-2193607

Egyes állatfajoknál a találmány szerinti eljárás hatására az ivartermék-produkció fokozódik, más állatoknál (klinikai esetek) a csökkent értékű vagy szünetelő nemi tevékenység normalizálódik, és eléri a fajra jellemző értéket. A találmány szerinti eljárás alkalmas a nemi szervek hiperprodukciójának kiváltására és így a fajra jellemző ivartermék mennyiségének többszörözésére is (szuperovuláció).

A találmány szerinti eljárással a csírahám fokozott működésre késztetésével az ejakulátumban lévő motilis spermiumok számát növeljük.

A találmány szerinti eljárás lehetőséget nyújt olyan hipofízis-hiperprodukció kiváltására, amely után a hipofízis érzéketlenné válása miatt közömbös állapot alakul ki, így az eljárás fogamzásgátlásként is alkalmazható.

A találmány szerinti eljárással természetszerű és mesterséges, valamint laboratóriumi életkörülmények között is előállíthatjuk a végtermékeket.

Az (I) általános képletü GnRH analógok különböző ritmusú adagolásával szabályozott, fent ismertetett nemi működési formák eddig még nem közölt, új jelenségek.

A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők:

a. ) Az eljárás alkalmazásával a nem természetes körülmények között tartott emlősállatok gonádtevékenysége javítható, illetve normális működése helyreállítható, ezáltal utód létrehozására válnak alkalmassá.

b. ) Az eljárás alkalmas a petefészek hiperprodukciójának indukálására, ami lehetővé teszi a fajra jellemző ovulációs számú petesejtek többszörösének kinyerését, amelyeket in vitro termékenyítés után mint embriókat megőrizhetünk vagy recipiens állatokkal természetszerűen kihordathatunk.

c. ) Az eljárás alkalmas az emlősállatok infantilis egyedeiben gonád hiperstimuláció és ezzel szuperovuláció indukálására. így a médiumtól már abban az időben nyerhetünk utódokat, amikor maga a médium még nem ivarérett.

d. ) Az eljárás alkalmas sajátságos laboratóriumi körülmények között szervkultúrában, intakt petefészkekből poszt mortem, in vitro termékenyíthető petesejtek előállítására. így a médium halála után is nyerhetünk pl. nagy tenyészértékü állatokból utódokat.

e. ) Az eljárás segítségével kinyert ivartermékek forgalmazása lehetővé teszi a nagy földrészek közötti távolság által akadályozott fajok közötti hidridizációt, és így új haszonállatfajok kialakítására nyílik lehetőség.

f. ) Az eljárás alkalmas hím és nőivarú emlősállatok bármely korcsoportjában iparszerű termelési körülmények között nagy mennyiségű petesejt, spermium vagy embrió előállítására, ami lehetővé teszi pl. embrióit) tank létrehozását és az ivadékok interkonti rentális forgalmazását.

g. ) Az eljárás alkalmas emlősállatok szezonális anösztruszának és gátolt spermatogenézisének feloldására. így bármely időszakban állíthatunk elő ivadékokat, ezáltal a gazdasági létesítmények jobb kihasználását teszszük lehetővé.

h. ) Az eljárás alkalmas védett természeti ritkaságok mesterséges szaporítására.

i. ) Az eljárás hím- és nőivarú emlősállatokban egyformán alkalmas a hipofízis érzéketlenné válását előidézni, amivel a nem kívánt terhességet elkerülhetjük olyan esetekben is, amikor az ismert fogamzásgátló szerek nem alkalmazhatóak.

A találmány szerinti eljárás az alábbi kiviteli példákkal szemléltetjük.

1. példa

Szuperovuláció kiváltása infantilis nősténypatkányokban db 21-életnapos, 7—8 g-os infantilis nősténypatkányt fiziológiás sóoldatban oldott D-Phe , Gln⁸-GnRH analóggal kezeltünk intraperitoneálisan. Az állatokat — a kezelés módjától függően — különböző csoportokba osztottuk. Az 1-től 8 napig tartó kezeléssorozatban 1, illetőleg 2 pg-os előadagokaf adtunk naponta 1, ill. 2 alkalommal. A kezeléseket 5 ill. 10 pg-os adagokkal fejeztük be.

A kezelések befejezése után valamennyi állatot étergőzzel megöltük, a petefészküket kipreparáltuk. A petefészek eltávolítása a halál beállta után, 24 órával az utolsó kezelést követően történt. A kiértékelést vizuálisan és szövettani minták készítésével végeztük. A kontroll állatok petefészkein több fejlődő tüszőt találtunk, de egyik sem volt Gráf-tüsző méretű, ezenkívül sem sárgatestet, sem corpus haemorrhagicum-ot nem tudtunk kimutatni. Ezzel szemben valamennyi kezelt csoportban hormonhatást lehetett igazolni, amely tüszőnövekedésben, Gráf-tüszővé alakulásban, a nagy tüszők ovulációjában és szabályos sárgatestek kialakulásában nyilvánult meg. A petevezeték, valamint a méh méretnövekedése is bekövetkezett. A 60 db kezelt állat közül összesen 4 db nem reagált a kezelésre. Abban a csoportban, amely 4 napon át napi 2 alkalommal 2 pg GnRH analógot kapott, s ezt a 4. napon a 2 pg-os kezelés után 6 órával 10 pg-os dózis követte, valamennyi állat petefészkén közvetlenül az ovuláció előtt álló, felpuhult Gráf-tüszőket találtunk nagy menynyiségben. A végső érésen átesett Gráf-tüszők száma egyedenként 60 és 90 között változott, szemben a felnőtt állatokban fiziológiásnak tekinthető 12 darabbal szemben. Ugyanezt a kezelésmódot alkalmaztuk az állatok egy másik csoportjánál, azzal a különbséggel, hogy ez esetben a kezelést 6 napon át folytattuk. Ebben a csoportban a szuperovulációs teljesítményt a petefészkeken kialakult szabályos corpus luteumok darabszámával értékeltük. A fentiekben részletesen ismertetett

-3193607 csoportéhoz hasonlóan az állatokban a corpus luteumok darabszáma egyedenként 60 és 90 között változott. A szövettani értékelés ezeket az eredményeket teljes mértékben alátámasztotta.

A példában részletezett eljárással megvalósítottuk, hogy egyrészt az állatfajnak már az infantilis egyedeiben érett petesejteket állítottunk elő, másrészt a petesejtek számát is többszöröztük a felnőtt állatok fiziológiás értékéhez képest.

2. példa

Szuperovuláció kiváltása infantilis nőstényegéren

Az 1. példában részletezett kísérleti módszerrel összesen 105 db 5—6 g-os, 28-életnapos nőstényegeret kezeltünk. Az 1—8 napon át kezeit állatok 1—5 pg D-Phe⁶, Gin⁸, desGIy¹⁰—GnRH etil-amidot kaptak naponta 2 alkalommal. Az egyes kezelések között eltelt idő 4 óra volt. A petefészek eltávolítását az utolsó injektálás után 27 órával végeztük.

A kontrollcsoportok petefészkei matt sárga színűek, homogén szerkezetűek voltak, némelyik petefészken 1—2 növekvő tüsző volt látható. A kezelt állatok mindegyikének petefészkén, a megnagyobbodott petevezetéken és méhen lehetett észlelni a hormon hatását. Azoknak az állatoknak, amelyek három napon át naponta 1 alkalommal 1 pg dózist, majd a 3.-napi 1 pg-os dózis után 4 órával 5 pg fenti GnRH analógot kaptak, a petefészkeiken végső érésen átesett, hullámzó tapintató Gráf-tüszőket találtunk, egyedenként 45—70 közötti számban. Hasonló, de 5 napig tartó kezelést kapott másik csoportnál az előbb hivatkozott mennyiségű Gráf-tüszők helyén szabályos corpus luteumok alakultak ki. A szövettani vizsgálat eredménye azonos volt a vizuális kiértékelésével.

A kísérlet eredményei alátámasztották az l. példában ismertetett eljárást.

3. példa

Szuperovuláció kiváltása infantilis házinyúl kölykökben db 42-életnapos fehérgyöngy fajtájú, nagyüzemi körülmények között született házinyúl kölyköt három napon át, napi két alkalommal 5—5 pg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH analóggal kezeltünk intraperitoneálisan. Ekkor a kezelt állatokat két csoportra osztottuk úgy, vhogy egyik felét a 4. napon 50 pg hatóanyaggal kezeltük, míg a másik felét a kezelés előtt étergőzzel megöltük. Ez utóbbiak kifejlődött Gráf-tüszői, ill. ezek darabszáma szolgált kontrollként az 50 pg-os dózis hatására bekövetkező változás megállapítására. Az életben tartott állatoknál az ovuláció bekövetkeztét két egyed 10—10 órás, narkózis alatt végzett laparoszkópiás vizsgálatával (hasüregi tükrözésével) követtük figyelemmel. Az 50 pg-os dózisú kezelés 26 óra elteltével egyedenként 30—45 ovulációt, ill. corpus haemorrhagicum-ot eredményezett, ellentétben a kontroll állatok inaktív petefészkével, 4

Ezzel az eljárással a házinyúlnak már az infantilis egyedeiben sikerül előállítanunk érett petesejteket, valamint ezek számát — a fiziológiás értékekhez képest — többszörözn^:.

4. példa

Szuperovuláció kiváltása infantilis sertéseken db 100-életnapos infantilis koca malac>t hat napon át napi két alkalommal 10— 13 pg D-Phe⁶, Gin⁸—GnRH analóggal kezeltünk intramuszkulárisan. A vizsgálatot a kontroll állatok féloldali petefészkének eltávolításával, valamint a 3. példában részletezett \ izsgálatí módszerrel, a kialakult Gráf-tüszők, \alamint az ovuláció után kialakult corpus luteumok darabszámának összevetéséből állapítottuk meg. Az ovuláció bekövetkeztét laparoszkópiával detektáltuk. A 7. napon adott 00 pg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH analóg 41 óra elteltével 15—36 ovulációt eredményezett a kezelt 10 infantilis malacon. Az infantilis ser'ések kezelése ugyanarra az eredményre vehetett, mint az l—3, példákban ismertetett állatfajok esetében.

5. példa

Szuperovuláció kiváltása infantilis juhokon db 50-életnapos jerke-bárányt intramuszkulárisan injektáltunk napi két alkalommal 5 napon át 10 pg dózisú D-Phe⁶, Gin⁸, desGIy¹⁶—GnRH etil-amiddal. A 6. napon adott 70 pg hatóanyag egyedenként 3—9 ovulációt eredményezett. A kontrol! állatoknál nem történt változás. A kiértékeléseket mind a kezelt, mind a konroll állatoknál laparoszkópia segítségével végeztük. Az eredmények az 1—4. példákban ismertetettel megegyezőek voltak.

6. példa

Szuperovuláció kiváltása infantilis szarvasmarhán db 65-életnapos infantilis borjút 8 napon át kezeltünk napi 3 alkalommal 2 pg dózisú D-Phe⁸, Gin⁸, desGIy¹⁰—GnRH etil-amiddal. Egy nap szünet után, a 10. napon. 100—100 pg hatóanyagot adtunk az állatoknak intramuszkulárisan. Az utolsó injektálást követően mindkét oldali petefészket kioperáltuk; általában 5—11 db kifejlett Gráf-tüszőt regisztráltunk petefészkenként. A tüszők 50%-a már nem feszes tapintású, tehát közvetlenül ovuláció előtti tüsző volt.

Ez a kísérlet azt bizonyítja, hogy szarvasmarhán is elérhető, hogy már az infantilis állatból több érett petesejtet nyerjünk a felnőtt állatban fiziológiásnak tekinthető 1 db ovulációval szemben.

7. példa

Csimpánz fiziológiás oligospermiájának kezelése ncrmospermia elérése céljából

A kis csoportokban élő állatfajokra, de különösen a főemlősökre jellemző, a szakirodalomban többször publikált tény, hogy bár a falkában valamennyi hím aktív libidóval rendelkezik, csak a vezérhímek kopulálnak,

-4193607 míg a szubordinált hímek fiziológiásán és reverzibilisen oligospermiásak. Esetünkben a vezérhímtől gyűjtött és spermabankban tárolt sperma mellett kifejezetten inszeminálás céljából szükség volt a szubordinált 4 hím (valamennyi ivarérett) spermájára. Mindegyik állatot a kezelés megkezdése előtt narkózisban elektromos úton ejakuláltattuk. Az ejakulátuniokat sűrűség és motilitás szempontjából mikroszkóposán értékeltük, majd mélyhűtési (—196°C-os) próbának vetettük alá. Előző spermatológiai munkáinkban azt tapasztaltuk, hogy mikroszkóposán nehezen értékelhető defektes spermiumok a mélyhűtési körülményeket nem élik túl. A mélyhűtés után kapott kedvező spermakép a spermiogenézis rendben való lefutását mutatta. A vizsgált hímeknél a kezelések előtti ejakulátumok vizsgálata fiziológiás oligospermiát igazolt. Ezek után heti egy alkalommal a 60—90 kg közötti hím csimpánzoknak 1 ml fiziológiás nátrium-kloridban oldott 100 pg, D-Phe⁶, Gin⁸, desGIy¹⁰—GnRH etil-amidot adtunk intramuszkulárisan, sűrített levegős belövési technikát alkalmazva. Az első kezelést követő 4. héten narkózisban, elektromos úton nyert ejakulátumokban 40—60%-os arányban fiatal spermium-formálódási alakokat regisztráltunk, az ejakulátumok mélyhűtési próba után 10% alatti motilitásúak voltak. Az első kezelést követő 60 nap múlva narkózisban, elektromos úton nyert ejakulátumokban a defektes spermiumok száma 30% alá süllyedt, a motilitás meghaladta a 60%-ot. Az ejakulátumok kvalitatív és kvantitatív tulajdonságai megegyeztek a vezérhímtől nyert, valamint a szakirodalomban közölt értékekkel. Az ejakulátumok 1:1 arányú hígítása után a mélyhűtési próba pozitív volt, a 60%-os motilitás mindössze 45%-ra csökkent. Az ilyen minőségű sperma inszeminálási célra akár frissen, akár mélyhűtve messzemenően alkalmas.

Ezzel az eljárással elértük azt a célt, hogy szubordinált hímekből spermabankban tárolható, megfelelő mennyiségű és minőségű, megtermékenyítésre alkalmas ondót nyerjünk.

8. példa

Szezonális oligospermiában lévő bölénybika spermiogenézisének beindítása inszeminálás és mélyhűtéses tartósításra alkalmas ejakulátum gyűjtése céljából

Állatkerti tulajdonban lévő, kb. 700 kg súlyú európai bölénybikától május hónapban, narkózisban eletromos úton spermamintát vettünk, és megállapítottuk, hogy szezonális indokú oligospermia állapotában van. Ennek tünetei a következők voltak: a spermaminősítésben használatos 1500X-os nagyítású mikroszkóp látóterében a spermiumszám 5—20, a defektes spermiumok száma 75—80%, az ejakulátum sűrűsége 0.5 volt. Az ilyen minőségű sperma megtermékenyítésre alkalmatlan.

Ezek után heti 2 alkalommal 200—200 pg dózísú D-Phe⁶, Gin⁸—GnRH analóggal kezel8 tűk az állatot intramuszkulárisan, sűrített levegős belövési technika alkalmazásával. A kezelés megkezdésétől számított 55. napon narkózisban, 1 óra időeltolódással két alkalommal ejakuláltattuk az állatot. A két ejakulátumot egyesítettük; sűrűsége 4, motilitása 55%-os volt. Az így kapott spermát mélyhűtöttük, majd ellenőriztük a mélyhűtés hatására bekövetkezett motilítás-csökkenést. Ez mindössze 5%-os volt.

Ezzel az eljárással a tenyészállat spermiogenézisét sikerült úgy beindítani, hogy a megtermékenyítésre használhatatlan ejakulátum helyett igen jó minőségű, akár frissen, akár mélyhütés után több (14 db) nőstény inszeminálására alkalmas spermát nyertünk.

9. példa

Spermiogenézis beindítása szezonális oligospermiában lévő vörös rókán (Vulpes vulpes) \IIatkertben tartott, szezonális oligospermiában lévő vörös róka hímek spermiogenézisét kíséreltük meg beindítani azzal a céllal, hogy nagyüzemi tenyésztésben lévő nemes ezüst és kék rókákat inszeminálhassunk különleges és nagyértékű hidrid prémek előállítása céljából. A szakirodalomban ismert az a tény, hogy a rókák valamennyi alfaja egy évben csak egyszer ivarzik, és ezen az egy ivazáson kívül mindkét nem gonádjai teljesen inaktívak. Az egyes alfajok ösztrusza között több hónap az eltérés (vörös róka január, kék róka április-május). A vizsgálatok eredményeit a szezonális ösztruszban lévő populáció spermaképéhez hasonlítottuk, melynél az átlagos ejakulátum mennyiség 2 ml, a sűrűség 3 és a motilitás 50—60%-os volt. Ezt fogadtuk el fiziológiás értéknek.

A vizsgálatok során 5 db 8 kg átlagsúlyú iva'érett vörös róka kant április hónapban kezeltünk heti két alkalommal 1, 5, 10, 50 pg dózísú D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH analóggal hét héten át. A kezelés kezdetét követő 3. héten spermamintát vettünk. A mintákban a sperma m-szám a fiziológiás értéknek kb. 60— 70%-a volt, a degenerált spermiumok száma meghaladta a 40%-ot. A defektes alakok döntő többsége fiatal formálódású volt (nyakrészi középrészi plazmacsepp). A kísérlet kezdetétől eltelt 7. hét után az állatokat narkózisbar ismét ejakuláltattuk; valamennyitől eredményesen gyűjtöttünk ondót, amelynek térfogata ejakulátumonként 1,2 ml és 3,1 ml között változott, a sűrűség 3-as, a motilitás 65%-os vol:, számszerűen lényegesen meghaladta a f ziológiás mennyiséget. (A hímek el voltak zárva a nőstényektől, így kopulációs ürítésre nen volt lehetőségük.) A spermamintákat minőségük szerint csoportosítottuk, majd mé'yhütöttük. A hígítás és mélyhütés után, a —196°C-on tárolt sperma motilitása a viszszaolvasztást követően 45%-os volt. A mélyhűtött sperma felhasználásával kék rókáknál normális vemhességet értünk el GnRH oviláció programozás (lásd: 17. példa) és ins'.eminálási technika mellett. .

-5193607

Az 5 db róka egyszeri ejakuláltatásával összesen 56 adag megtermékenyítésre alkalmas ondó adagot állítottunk elő. Ezzel üzemi technológiát szolgáltattunk hibrid nemesprémek előállítására.

10. példa

Degenerált spermakép miatt infertilis szibériai tigris kezelése

Állatkerti tulajdonban lévő, 120 kg-os, 8-éves szibériai tigris kandúr három éve élt párban. A nőstény ösztruszában rendszeresen párzott, de utód egyik évben sem született. Azt, hogy a terhesség a nőstény hibájából nem következik be, ki kellett zárni, mert az ezt megelőző időszakban másik hímtől már volt vemhes, és a megszületett utódokat fel is nevelte.

A kérdéses hímből narkózisban elektromos úton spermamintát vettünk, és megállapítottuk, hogy az ejakulátum igen híg, látóterenként 4—5, rezgő mozgást végző degenerált spermium volt látható, a degenerációk formája a spermatogenézis fiatalabb fázisaira volt jellemző. Ezek után az állatot heti egy alkalommal 100 pg dózisú, 1 ml fiziológiás NaCl-ban oldott D-Phe⁶, Trp⁷, Leu⁸—GnRH analóggal kezeltük intramuszkulárisan, sűrített levegős belövési technikát alkalmazva. A hímet együtt tartottuk a párjával, a kezelések időtartama alatt is rendszeresen kopulált. A nőstény vemhes lett, 3 egészséges utódot ellett. Az ellés időpontjából következtetve valószínűsíthető, hogy a fertilis kopuláció az első kezelést követő 40—50 nap múlva következett be.

Az eljárás tehát alkalmas infertilis hím tigris degenerált spermaképének kezelésére és ezáltal utódok létrehozására.

11. példa

Fiziológiás normospermia stimulálása mélyhú'tést lehetővé tevő hiperspermia elérése céljából bengáli tigrisen

Állatkerti tulajdonban lévő 8 éves, kb. 200 kg súlyú bengáli tigris rendszeresen kopulált, a párja évekre visszamenően rendszeresen vemhesült. Ennek tudatában narkózisban, ivarzási szezonban elektromos úton spermaniintát vettünk, amelyről megállapítottuk, hogy sűrűsége 3-as, mötilitása 30% és az ejakulátum mennyisége 0,2 ml. Az ejakulátum a fiziológiás normospermia képét mutatta. Az ilyen kis mennyiségű ejakulátum mélyhűtése viszont technikai okokból nem megoldható. Az állat védelme és a májkárosodás elkerülése érdekében a narkózist legfeljebb 4-naponként lehet ismételni, és legfeljebb 4—5 órán keresztül lehet fenntartani. A sperniagyüjtésnek ez a módja kivitelezhetetlen. Eljárásunk során a hímet különzártuk a nősténytől, és 12 napon át naponta 10 pg dózisú D-Phe⁶, Gin⁸, desGly^l0-GnRH etil-amiddal kezeltük, melyet 1 ml fiziológiás NaCl-ban oldottunk és intramuszkulárisan, sürített levegős belövési technikával alkalmaztunk. A 12. napon narkózisban, elektromos úton 1 óra időintervallummal két alkalom6 mai ejakuláltattunfk; így 1, illetve 0,8 ml ondót nyertünk. A két minta együttes vizsgálatában a sűrűség 4-es, motilitás 70%-os volt. A spermamintákat mélyhűtöttük, 21 db mesterséges megtermékenyítésre alkalmas adagot készítettünk. A sperma visszaolvasztás utáni mötilitása 60%-os volt.

Ezzel az eljárással megvalósítottuk, hogy bengáli tigrisből spermabankban tárolható, jelentős mennyiségű ondót nyerjünk.

12. példa

Nem természetszerű tartás által okozott aspermia kezelése orángutánon

Állatkerti tulajdonban lévő 18-éves, kb. 350 kg súlyú hím orángután kölyök-korában került befogásra. Eddig 3 tulajdonosa volt. Kórelőzménye szerint párja sohasem volt, mindig egyedül volt elhelyezve, és sohasem kopulált. Jelenlegi helyén 11 éve él, fajtársa vagy párja nincs. Flegmatikus, teljesen inaktív, hospitalizáciős tüneteket mutat. Az állatkerthez megkeresés érkezett, hogy amennyiben az állat borneói alfajú és fertilis, úgy megvásárolnák. A kromoszóma-vizsgálat igazolta, hogy az állat a borneói alfajhoz tartozik, rendkívül ritka példány (a világon összesen 153 példány él). Kórelőzményében a fertilítást megkérdőjelező tényező volt az, hogy a főemlősök hímjeire jellemző agresszivitás és rendszeres maszturbálás a mintegy 5—6 évvel ezelőtt kialakult hospitalizáció ideje alatt teljesen megszűnt. Az állattól narkózisban elektromos úton spermamintát vettünk. Az ejakulátumban kizárólag a mellékmirigyek váladéka ürült, 3 részletben 1 — 1 cseppnyi, összesen 0,1 ml mennyiségben. Az ejakulátumban mozgó spermiumot nem találtunk, és az egész ejakulátumban összesen néhány db inaktív spermium volt. (Mikroszkópos vizsgálatnál 10 látótérben mindössze 1—2 darabot számláltunk.)

Ezt követően az állatot heti két alkalommal kezeltük 100 pg D-Phe⁶, Gin⁸, desGly¹⁰— GnRH etil-amiddal, az 1 —11. példákkal megegyező módon. A kezelés tartama alatt az állat mozgása megélénkült, aktívvá vált, amit viszont nem értékelhetünk a libidó növekedéseként, mert a belövések okozta félelem is kiválthatta. A kezelést az első belövést követő 47. napon befejeztük, és újabb narkózisban egy óra időközzel, két alkalommal ejaku Iá Itattunk; így összesen 3,2 ml ondót nyertünk. A spermium sűrűsége 3-as, mötilitása 35%-os volt. A degenerált spermiumok mennyisége 20% volt, amit gyakorlatilag teljes mértékben a fiatal fejlődési alakok tettek ki (nyakrészi középrészi plazmacseppek).

Az állat rendkívül nagy értéke, valamint a narkózist és ejakuláltatást végzők testi épségének védelme érdekében a kezelést nem folytattuk. A vevőt kielégítette a kontrollált spermakép, amely a fertilis főemlősökre jellemző értéknek felelt meg.

A fenti eljárással helyreállítottuk egy rendkívül nagyértékü természeti ritkaság fertilitását, valamint spermájának megőrzésével

-6193607

Π nemzetközi katalógusban jelzett géntartalékot képeztünk.

13. példa

Oroszlán ovariális gátlása kontracepció céljából

Az állatkertekben világszerte elterjedten mutatják be a nagy ragadozók közül az oroszlánt. A különböző panoráma és szafari elhelyezésmódokban követelmény mindkét nem egyszerre és azonos élettérben való bemutatása. A nagy ragadozók közül az oroszlán az egyetlen, amely rabságban kielégítő táplálkozási viszonyok mellett jól szaporodik. Az „oroszlán-piac abszolút telítettsége miatt kívánatos olyan fogamzásgátlási eljárás kidolgozása, amely az állat szempontjából veszélytelen, nem jár a külső megjelenés és viselkedési formák megváltozásával, valamint a fertilis kopuiáció ellenére gátolja a megtermékenyülést. A szexuál-szteroid alapú fogamzásgátlás rövid időn beiül bemutathatatlanságot okoz (kóros elhízás).

Eljárásunk során állatkerti tulajdonban lévő intakt, termékeny, élete során már ötször ellett kb. 200 kg-os nőstény oroszlánt kezeltünk 3-hetenként 2 alkalommal D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH analóggal. A kezelést úgy időzítettük, hogy egy 50 pg-os dózist 4 óra múlva 500 pg-os dózis követett, majd 3 hét szünetet tartottunk. A kezelést az említett háromhetes gyakorisággal az ösztrusz kezdetétől (április hónap) az ösztrusz fajra jellemző végét követő 50 napig (augusztus) folytattuk. Az állat normális viselkedési tüneteket mutatott, az ösztruszban rendszeresen párzott, a párja a vizsgálat szerint normospermiás volt. Az állat a kezelés időtartama alatt nem lett vemhes, sem viselkedésében, sem külső megjelenésében semmi rendellenességet nem tapasztaltunk.

14. példa

Nagyüzemi tartási viszonyok között pubertásban lévő sertés kocasüldők ivarzásának indukálása „első eredményes ivarzás¹* kiváltása céljából

A nagyüzemi tartási viszonyok között követelmény az állomány utánpótlására szánt tenyészállatok minél korábbi tenyésztésbe vétele, valamint a nagyüzemi technológiába beilleszthető szinkronizált termékenyítése és elletése. A nagy tömegben, intenzív takarmányozással gyors növekedésre kényszerített nőivarú állatok gonád aktivitása prepubertásban és pubertásban labilis, ezért fertilis ivarzások ritkán fordulnak elő, és a populációban szétszórtan jelentkeznek.

Kísérleteink céljára nagyüzemi sertéstelepen rendelkezésre álló 200 db potenciális tenyészkoca süldőből — az üzemi technológia szerinti legjobb fejlődési erély, legjobb takarmányértékesítő képesség stb. alapján — 60 db állatot kiválasztottunk. Ezeket véletlenszerűen 2 X 30 db-os csoportba osztottuk. Mindkét csoportot, szintén az üzemi technológiáknak megfelelően, 24 órán keresztül kopial12 tat uk és szomjaztattuk. Az állatokat fiziológiás sóoldatban oldott D-Phe⁶f Gln⁸-GnRH analóggal intramuszkulárisan injektáltuk a kiválogatással egyidőben, majd az injektálást 20—20 pg dózisú fenti analóggal 24 órás intervallumokban még kétszer megismételtük. A kezeletlen kontrollcsoportból és a kezelt csoportból is az első ivarzó a kiválogatást követő 5. napon jelentkezett. Mindkét állományt azonos istállóban, azonos légtérben, azonos körülmények között tartottuk az üzemi technológiában megengedett 26 napig. Ezalatt az idő alatt a kezeletlen kontrol! állományból 3 db (10%), a kezelt állományból 21 db (70%) eredményesen ivarzott. Eredményesnek csak a szabályosan leellett ivarzásckat fogadtuk el.

Ebben a kisérletsorozatban az ovuláció pontos időzítése nem szerepelt a célkitűzések között, mivel megfelelő mennyiségű tenyészkan nem állt.rendelkezésre. Ezért a 26 napon belüli „első eredményes ivarzás volt a kezelés célkitűzése. A kontroll állomány 10%-os vemhesülési eredménye az üzemi átlagnak megfelelő volt, így a kezelés hatására történt 60%-os növekedés igen komoly gazdasági hasznot jelent.

15. példa

Huzamos ideje meddő csincsillák kezelése db legalább 2 éve meddő csincsilla-nyu’at három napon át, napi két alkalommal kezeltünk 10—10 pg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH analóggal intraperitoneális injektálással. A t. napon az állatokat 75 pg GnRH analóggal injektáltuk, majd az üzemi technológiának megfelelően összeengedtük őket a bakkal. A csincsillák közül 4 hónapon belül 12 leellett.

Az előbbi kezeléssel párhuzamosan 3 db több, mint 2 éve meddő, különösen értékes prémü „black mutáns csincsillát 3 napon keresztül napi 2 alkalommal kezeltünk 10— 10 pg D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH analóggal intraperitoneális injektálással. A 4, napon az állatokat 75 pg GnRH analóggal injektáltuk, majd a szokásos módon összeengedtük őket a bakkal, 4 hónapon belül mind a három állat leellett.

Ezzel az eljárással megvalósítottuk azt a célkitűzést, hogy a huzamos ideje meddő, nagy értékű prémállatokat újra tenyésztésbe vontuk.

16. példa

Felnőtt vadmacska (Felis silvestris) szezonális anösztruszának feloldása db átlag 6 kg súlyú állatkerti vadmacska nőstényt, amelynek természetes körülmények közötti ciklusa február-márciusban van, augusztus hónapban D-Phe⁶, Gin⁸, desGly¹⁰— GnRH etil-amiddal kezeltünk. A kezelések megkezdése előtt a hasüreget narkózisban felnyitottuk, hogy mindkét petefészek állapotát megtekintsük. A hasüreg visszavarrása után az állatokat kétnaponkénti gyakorisággal, összesen 4 alkalommal kezeltük a hatóanyaggal, melyet intramuszkulárisan, fiziológiás sóoldatban adagoltunk. Az első és második 7

-7193607 injektálás között két óra idő szünetet tartottunk; az első dózis 100 pg, a második 500 pg volt. Ezt 48 óra múlva követte a harmadik dózis (100 pg), majd 2 óra múlva a negyedik, 500 pg-os dózis. A kezelés 0., 2., 4. és 8. napján a hasüreget narkózisban felnyitottuk, a petefészkek állapotának változását vizuálisan értékeltük. A kezelések befejeztével mindkét petefészket kioperáltuk, rögzítettük, és elvégeztük szövettani kiértékelésüket.

A kezelés 0. napján mindkét állat esetében a bal oldali petefészken 3—4 feltételezett szekunder tüsző, 1 db visszafejlődött régi sárgatest, a jobb oldali petefészken 5—6 db feltételezett szekunder tüsző volt látható. A kezelés hatására 4 nap után valamennyi szekunder tüsző Gráf-tüszővé fejlődött, leovulált, és a helyükön corpus luteummá alakuló corpus haemorrhagicum-ok voltak. A corpus haemorrhagicum-ok mellett vizuálisan nem számolható mennyiségű szekunder tüsző növekedett, amelyek a következő kezelések hatására továbbfejlődtek, és az utolsó 500 pg-os dózis hatására intrafollikuláris luteinizációval atretizáltak. A szövettani értékelés a vizuálisan tapasztaltakat teljes mértékben alátámasztotta.

A fenti kezelés hatására létrejött ovuláció azt bizonyítja, hogy macskafélék esetében szezonon kívül is létrehozható megtermékenyítés, és nem természetszerű tartásban is nyerhetünk utódokat.

17. példa

Szezonális anösztruszban lévő nőstény kékróka kezelése fertilis ösztrusz kiváltása céljából

Szezonális anösztruszban lévő nőstény kékrókát december hónapban narkózisban laparoszkópiával vizsgáltunk. Megállapítottuk, hogy mindkét oldali petefészek inaktív, azokon fejlődő tüszők vagy Gráf-tüszők nem láthatók.

Ezután az állatot napi két alkalommal 1—5 pg dózisú D-Phe⁶, Gin⁸—GnRH analóggal kezeltük 10 napon át intramuszkulárisan. A 10. napon, narkózisban újabb laparoszkópiát végeztünk. Megállapítottuk, hogy mindkét oldali petefészken nagy corpus luteumok vannak, amelyek számát — a technika tökéletlensége miatt — csak becsülni tudtuk, kb. 10—20 db volt. Ezzel egyidőben megállapítottuk, hogy a méhnyak nyitott.

Szintén december hónapban, mammális sorvadás miatt selejtezésre ítélt nőstényt hasonló módon napi két alkalommal 2—2 pg dózisú D-Phe⁶, Gin⁸—GnRH analóggal kezeltünk, aminek a hatását a méhnyak állapotának változásával követtük. Az első kezelést követő 6. napon a méhnyak felnyílt. Ekkor 50 pg dózisú hatóanyaggal kezeltük. 16 óra elteltével a petefészkek állapotát tükrözéssel vizsgáltuk, és közvetlenül ovuláció előtti állapotot regisztráltunk. Ezek után a hasüreget teljesen felnyitottuk, a petefészkeket kioperáltuk és az összesen 11 db Gráf-tüszőből punkcióval eltávolítottuk a petesejteket. 6 db 8 szabályos corona radiataval borított normális petesejtet találtunk.

A fenti eljárással szezonális anösztruszban, az évi rendes ivarzást nem zavarva, lehetővé tettük in vitro termékenyítésre alkalmas petesejtek, embriók előállítását. így lehetőségünk nyílik különleges hibrid ivadékok előállítására kevésbé értékes recipiens állatok felhasználásával.

18. példa

Infantilis házimacska (Felis cattus domesticus) petefészek-működésének stimulálása D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH analóggal

5db egyenként 0.3 kg súlyú, 45-életnapos ma< skakölyköt D-Phe⁶, Gin⁸—GnRH analóggal 2-naponkénti gyakorisággal, összesen 4 alkalommal, esetenként 100—100 pg dózisú anyaggal kezeltünk. A hatóanyagot fiziológiás sóoldatban, intramuszkulárisan adagoltuk A kezelés után az állatok mindkét oldali petefészkét narkózisban kioperáltuk és vizuálisan értékeltük. Ezt követően formaiinban rögzítettük, majd szövettani vizsgálatot végeztünk. Megállapítottuk, hogy mindkét oldali petefészken 5—7 corpus haemorrhagicum található. A kéreg alatt a világos, vajszínű petefészektől jól elváló fejlődő tüszőket találturk, amelyekből néhány Gráf-tüsző méretű volt. Hatóanyaggal nem kezelt állatoknál ezek a változások nem történtek meg.

Ezek az eredmények egyértelműen azt bizonyítják, hogy az infantilis házimacska petefészke a fenti eljárás hatására az ivarérett állatra jellemző szövettani és morfológiai sajátosságokat mutatja, így az állat a hagyományos értelemben vett biológiai ivarérettség elett alkalmassá válik in vitro termékenyítésre alkalmas petesejtek előállítására.

19. példa

Infantilis házimacska petefészek-működésének stimulálása D-Phe⁶, Trp⁷, Leu⁸— GnRH analóggal db egyenként 0,3 kg súlyú, 45-életnapos macskakölyköt D-Phe⁶, Trp⁷, Leu⁸-GnRH analóggal kezeltünk úgy, hogy narkózisban a baloldali petefészket a kezelések megkezdése előtt kioperáltuk, majd a médiumokat kétnaponként! gyakorisággal, összesen 3 alkalommal, esetenként 100—100 pg dózisú, fiziológiás NaCl-ban oldott hatóanyaggal intramuszkulárisan kezeltük. A kezelés után a megmaradt (jobb oldali) petefészkeket kioperáltuk, vizuálisan értékeltük, majd fixálás ulán szövettani vizsgálatot végeztünk.

A kezelés előtt kioperált petefészkek teljesen homogének, vajsárga színűek voltak, bennük fejlődő tüszőt sem vizuálisan, sem szövettanilag nem lehetett észlelni. A kezelés után a petefészkeken 7—8 db corpus haemorrhagcum-ot és sok (nem számolható) fejlődő tüszőt találtunk.

A kísérlet eredménye másik hatóanyag analóg alkalmazása esetében is teljes mértekben alátámasztotta a 18. példában ismertetett eredményeket, és további tapasztalato-8193607 kát adott arra vonatkozóan, hogy a petefészek további ciklusa fiziológiásán alakul.

20. példa

Infantilis nőstény házimacska (Felis cattus domesticus) primordiális tüszőinek (stimulálása) db 0,3 kg súlyú, 45-életnapos házimacska kölyköt D-Phe⁶, Gin⁸—GnRH analóggal kezeltünk úgy, hogy narkózisban a kezelés előtt a bal oldali petefészket kioperáltuk, majd a médiumot 3 napon át naponta háromszor az egyes kezelések között 4-órás időintervallumokat tartva, összesen 9 alkalommal esetenként 0.1 pg dózisú GnRH analóggal kezeltük. A hatóanyagot intramuszkulárisan adagoltuk fiziológiás NaCl és propilén glikol szuszpenzióban. A kezelések után narkózisban a megmaradt petefészkeket kioperáltuk, vizuálisan értékeltük, majd fixálás után szövettani vizsgálatot végeztünk. Vizuálisan mindkét petefészek homogén, vajsárga színű volt, a kezelt petefészek kismértékben megnagyobbodott. A kezeletlen petefészekben csak primordiális tüszőket értékelhettünk szövettanilag, míg a kezelt petefészek metszéslapján nem számolható mennyiségű (több száz) fejlődésnek indult, az antrum-képződés különböző stádiumában lévő tüszőt regisztráltunk.

A fenti eljárással megvalósítottuk a petefészek több száz primordiális tüszőjének egyidőben való stimulálását.

21. példa

Szarvasmarha petesejtek előállítása in vitro embriótenyésztés céljára poszt mortem szervkultúrából

Szarvasmarhákból, vágóhídon történt kábításuk és elvéreztetésük után 30—55 perccel eltávolítottuk az intakt petefészkeket, majd laboratóriumi körülmények között komplett adjuvánsban helyeztük el. A tápfolyadékhoz

D-Phe⁶, Gin⁸, desGly¹⁰—GnRH etil-amidot adtunk 10^-9 — 10'⁸ g/ml koncentrációban. A szervkultúrában tartott petefészek-állományok ovulációja 16—43 órát vett igénybe.

A petefészkekből in vitro spontán bekövetkezett ovulációkból és a punkcióval kinyert petesejtekből 85% volt képes a meiózis (ledukciós sejtosztódás) folytatására, és in vitro eredményesen megtermékenyíthető volt kapacitált szarvasmarha spermával. Az in vitro termékenyített petesejtek első két sejtosztódását figyeltük meg a kultúrában.

Ezzel az eljárással lehetőséget teremtet15 tünk arra, hogy a világszerte elterjedten használt szarvasmarha-inszeminálási technológiához hasonlóan, közvetlenül élő embriókat „inszeminálhassunk**, azaz transzplantáljunk. A vágóhidakon az üzemi igényeket messze meghaladó mennyiségű embrió előállítására van lehetőség a fenti eljárás felhasználásával.

Claims

25 Eljárás emlősök pre- és posztnatális életében, infantilis korában, prepubertásában és kifejlett állapotában nemi szerveik tevékenységének a szabályozása útján természetes \agy mesterséges megtermékenyítésre alkal30 nas ivartermékek előállítására és adott esetten azokból utód létrehozására, valamint ez ivartermék-produkció megtöbbszörözésére a fajra jellemző életteljesítményhez képest, azzal jellemezve, hogy a médiumokat legalább

35 egy, de legfeljebb 60 alkalommal, előnyösen 1—5 alkalommal 0,01—500 p.g/testsúlykilogramm, előnyösen 1 —100 μg/testsúlykilogramm (I) általános képletű vegyülettel kezeljük, és az ismételt kezelések között legalább

40 2 óra, de legfeljebb 7 nap, előnyösen 2—8 óra időtartamú szüneteket tartunk.