DE3322847A1 - Verfahren zur stabilisierung von biologischen zellen sowie danach stabilisierte biologische zellzusammensetzungen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Stabilisierung von biologischen
• Zellen sowie danach stabilisierte biologische Zellzusammensetzungen Die Erfindung bezieht sich auf die Stabilisierung von biologischen Zellen, wie Blutteilchen zur Verwendung in Bezugs-bzw. Vergleichareagenzien, wie dies in Blutteilchenzähl-und -größenbestimmungs- bzw. -klassiereinrichtungen der Fall ist. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Stabilisierung von biologischen Zellen, welche zur Fixierung mit einem Polyaldehyd einer entsprechenden Behandlung untenorfen worden sind.
• Bei der Shtwicklung verbesserter elektronischer Blutteilchenzähl- und-bestimmungs- bzw. -klassiereinrichtungen, wie der unter dem Warenzeichen "Coulter" vertriebenen Geräte, hat die fortschreitende Differenzierung zwischen Teilchenarten, wie sie durch die Größenverteilungen ermittelt amrden, eine stetige Verbesserung der Vergleichslösungen mit bekannten bzw. üblichen Teilchenkonzentrationen und -verteilungen im Hinblick auf ihre Vertzendung als Kontrollsubstanzen erf orderlich gemacht, um sicherzustellen, daß die Geräte zuverlässig arbeiten. Frisches menschliches Blut kann zwar dahin1ehend modifiziert werden, daß man aus ihm hämatologische Vollblut-Vergleichs- bzw.-Bezugssubstanzen herstellt, jedoch haben solche Suspensionen eine begrenzte Lagerzeit und verlieren ihre Stabilität selbst bei Kühllagerung nach etwa 30 Tagen.
• Eine solche Instabilität führt zu einer Veränderung des mittleren Zellvolumens (MCV),wodurch sich die Teilchen weniger zuverlässig unterscheiden lassen.
• Beim Versuch, einen flüssigen Blutkontrollstandard durch Gefrieren mit Diol- oder Triolzusätzen zu stabilisieren, lehrt die US-Patentschrift Nr. 4 199 471 eine Behandlung, bei der rote Blutkörperchen zunächst mit einem Aldehyd behandelt werden, um ihnen dann langsam Diol oder Triol zuzusetzen und das entstandene Produkt anschließend in einer Pufferlösung zu belassen.
• Die Betonung bei dieser Patentschrift auf die Zugabe von Diol oder Triol - anstelle einer Umsetzung - wird durch die Verwendung von Formaldehyd als bevorzugtem Aldehyd in den Beispielen der offenbarten Behandlungsmethode veranschaulicht.
• Nach einem anderen Verfahren, welches in der US-Patentschrift Nr. 4 160 644 offenbart ist, wird ein Blutplättchenkontrollreagenz durch die Zugabe einer geringen Menge von festem Polyäthylenglycol entweder zu der Plättchensuspension oder aber dem Verdünnungsmittel für die Plättchensuspension stabilisiert, wodurch eine Stabilisierung sowohl in bezug auf Zeit als auch auf Bewegung erreicht wird; flüssiges Polyäthylenglycol mit einem niedrigeren Molekulargewicht hat sich als unwirksam erwiesen.
• Die Verwendung von å jeweils getrennten Bezugskontrollreagenzien für die verschiedenen Teilchenarten hat sich als schwierieter erwiesen als die Vefliendung von Vollblutkontrollreagen len. Beispiels1zeise ist es in j jedem Blutplättchenzählsystem, in dem anhand der chara'teristischen Größenordnungen und Volumenverteilungen der Plättchen in der Blutprobe zwischen PLttchen des menschlichen Organismus und anderen Zellen unterschieden wird, erforderlich, daß die Vergleichssubstanz auch die Plättchengrößenordnungen weitgehendst simuliert.
• Vergleichsreagenzien mit Plättchen oder simulierten Plättchen, die nur einen eng begrenzten Größenverteilungsbereich aufweisen, würden sich nicht zur Vermittlung eignen, ob die Größenverteilungsgrenzen richtig eingestellt sind. Aus diesem Grunde muß'das Vergleichsreagenz einen mittleren Größenwert aufweisen, der zwischen der oberen und unteren Grenze liegt, sowie ein Volumenverteilungshistogramm, welches sich der normalen Logarithmusverteilung frischer menschlicher Blutplättchen stark annähert.
• Um das Problem der Herstellung eines Produkts mit der geeigneten Größe und Form, dem geeigneten Volumen und der geeigneten Elektroresistenz sowie mit der entsprechenden Temperatur- und Zeitstabilität, einer einheitlichen Teilchenverteilung und der mikrobiologischen Hemmung zu lösen, sind bislang viele Technologien erprobt worden. Bisher sind im wesentlichen synthetische Teilchen, wie Polystyrollatex, nicht-tierische Hefe und Pollenzellen, chemisch fixierte Blutplättchen vom Menschen oder anderen Säugetieren sowie sonstige chemisch fixierte tierische Zellen untersucht worden. Dabei können die synthetischen Teilchen sehr stark den mittleren Volumen- und Größenverteilungsspezifikationen angenähert werden, jedoch lassen sich gleichmäßige, stabile und einheitliche Suspensionen nur sehr schwer herstellen.
• Darüber hinaus stellt die sphärische Form dieser Teilchen eine unterschiedliche elektronische "Form" für einen sogenannten "Coulter-Zahler" dar, so daß diese Volumen hinsichtlich der Differenz in der Form mittels eines willkürlich gewählten Form-Faktors "korrigiert" werden müssen.
• Die Einführung eines undefinierten ma«hematischen Faktors in das Vergleichsverfahren ist unerl m scht. Pollen und Hefen weisen dieselben Nachteile auf, und darüber hinaus sind sie von Einsatzmaterial zu Einsatzmaterial unterschiedlich und auch nicht immer verfügbar. Menschliche und sonstige tierische Blutplättchen lasse, sich nur schwer und unter hohem Kostenaufwand sammeln und herstellen. Die heute üblichen Konservierungsverfahren führen zu einer erheblichen Schrumpfung der Plättchen, was die Volumenverteilung der Normalpopulation aus dem Gleichgewicht bringt; durch diese verschlechterte Volumenverteilung werden die Plättchen auch beim Altern negativ beeinflußt, wodurch die Verwendbarkeit des Blutplättchenkontrollreagenz stark beeinträchtigt wird.
• In einem in der US-Patentschrift Nr. 3 553 310 offenbarten Verfahren werden biologische Zellen, beispielsweise Erythrozyten von Ziegen und mikrobiologische Zellen, zur Bildung von konservierten und gegen Lyase stabilisierten Teilchen durch chemische Fixierung in Form einer Umsetzung mit Aldehyden, insbesondere Glutaraldehyden, stabilisiert. Wenn auch die Fixierung mit einem Aldehyd im Hinblick auf die Ueilchenstabilität erstrebenswert ist, so kann eine solche Fixierung auch zu einer Vernetzung zwischen den Teilchen mit unerwünschter Agglut/inierung führen.
• Typischerweise reagiert nur eine der Aldehydgruppen von Glutaraldehyd (1,5-Pentandialdehyd, OHCCH2CH2CXO) mit einer biologischen Zelle, beispielsweise einem Ersthrozyt-Membran-Proteinmolekül (RBC) und läßt die andere Aldehydgruppe für die Vernetzung mit anderen benachbarten funktionellen Gruppen an derselben Zelle oder an anderen Zellen frei.
• Andere vermutete Mechanismen für diese Reaktion schließen die Bildung eines Glutaraldehyddimeren ein, welches eine C=C-Gruppe mit einem aktiven beta-Wasserstoffatom enthält.
• Die Kondensierung an dieser Stelle läßt beide Aldehydgruppen frei.
• Glutara ldehyddimer In-beiden Fällen erfolgt eine Pseudo-Hämagglutinierung (d.h. eine Vernetzung zwischen einander benachbarten Zellen), was zur Bildung von Zellklümpchen führt, die sich sehr schnell absetzen und dasu neigen, auf dem Boden des Reaktionsbehälters einen Belag zu bilden. Obwohl dieser Prozeß langsam abläuft, beeinträchtigt er nachhaltig die Stabilität und Anwendbarkeit jeder auf diese Art und Weise durchgeführten Analogkontrolle.
• Erfindungsgemäß können biologische Zellen, die mit Polyaldehod behandelt worden sind, zur Verhinderung einer Zellezu-Zelle-Vernetzung dieser Zellen stabilisiert werden, und zwar durch Bildung eines Acetals, das die nicht reagierte Aldehydfunktionalität schützt.
• Das Verfahren zur Herstellung von mit Acetalresten stabilisierten biologischen Zellen umfaßt die Umsetzung von mit Polyaldehyd behandelten biologischen Zellen mit einem Alkohol unter- sauren Beding; danach kann zur Stabilisierung der Acetalbildung der pH-Wert auf einen basischen Wert angehoben werden.
• Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stabiligiert das entstandene cyclische Acetal die mit dem Aldehyd behandelten biologischen Zellen dadurch, daß zur Umsetzung mit dem freien Aldehyd ein 1,3-Dialkohol oder ein 1,2-Dialkohol, insbesondere Xthylenglycol, verwendet wird.
• Die erfindungsgemäß stabilisierten biologischen Zellen eignen sich insbesondere als menschliche Blutteilchen, die analog zu Vergleichsreagenzien sind, wie sie in den hämatologischen Testeinrichtungen vom Typ "Coulter" Verwendung finden ("Coulter" und 'tCoulter Counter" sind eingetragene Warenzeichen der Firma Coulter Electronics, Ins.).
• Im allgemeinen sind biologische Zellen, beispielsweise Erythrozyten von Säugetieren und Vögeln, die als menschliche Blutteilchenanaloga verwendet worden sind, unter Verwendung eines Aldehyds, insbesondere Glutaraldehyd, wie im einxlnen von Pearse in "Histochemistry: Theoretical and Applied??, 3. Ausgabe, Bnd 1 (1968) in Kapitel 5 beschrieben, fixiert worden. Wenngleich Glutaraldehyd der für die Fixierung der erfindungsgemäß stabilisierten biologischen Zellen bevorzugte Aldehyd ist, können geeigneterweise auch andere Polyaldehyde, wie zum Beispiel die Dialdehyde, die sich von Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure und Adipinsäure ableiten, fiir die Fixierung biologischer Zellen Verwendung finden.
• Ganz allgemein können erfindungsgemäß die nicht umgesetzten oder freien Aldehydgruppen an den mit Polyaldehyd behandelten biologischen Zellen zur Bildung von Acetalen mit Alkohol umgesetzt werden, welche eine nachfolgende Vernetzung von Zelle zu Zelle verhindern und die biologischen Zellen im Hinblick auf die Verwendung in Suspensionen mit einer größeren Lagerstabilität ohne die Gefahr einer Agglutsiniermg stabilisieren. Als geeignete Alkohole zur Umsetzung mit Aldehyden zur Bildung von Acetalen können beispielsweise Alkohole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bei vorliegender Erfindung verwendet werden.
• Die nach der Erfindung vorzugsweise verwendeten Alkohole reagieren mit dem Aldehyd unter Bildung eines cyclischen Acetals. Solche Alkohole sind beispielsweise die Glycole, die benachbart zu den Hydroxylgruppen nicht sterisch gehindert sind, beispielsweise Trimethylenglycol (1,3-Propandiol), das zur Bildung eines 6-gliedrigen cyclischen Acetals mit Aldehyd reagiert. Am meisten für die erfindungsgemäße Veflrendung bevorzugt werden die 1,2-Dialkohole die mit dem Aldehyd unter Bildung eines 5-gliedrigen Acetals reagieren, wodurch besonders stabilisierte biologische Zellen erhalten werden und die Beständigkeit gegenüber einer Agglutz-inierung der Zellen bei einer Suspension gefördert wird. So sind Propylenglycol, und insbesondere Äthylenglycol, Beispiele für die am meisten bevorzugten 1,2-Dialkohole. Weniger bevorzugt ist Glycerin, ein Beispiel eines Triols, das in der Lage ist, cyclisches Acetal zu bilden, jedoch eine freie Hydroxylgruppe aufweist, die dann unter Vernetzung zwischen biologischen Zellen unter verminderter Beständigkeit gegen ein Aggluttinieren reagieren kann. Andere Alkohole, die sich für die erfindungsgemäße Verwendung eignen, sind zum Beispiel 1,2-Cyclopentandiol und 1,2-Cyclohexandiol.
• Zur Herstellung der stabilisierten biologischen Zellen nach der erfindung werden die mit Polyaldehyd behandelten Zellen zur Förderung der Acetalbildung mit Alkohol unter sauren Bedingungen behandelt; insofern wird die Bildung von Acetal durch die Umsetzung in Gegenwart von Überschußalkohol zur Gewährleistung einer lIydroxyl-Äquivalent-Funktionalität begünstigt, die größer ist als das reagierende freie Aldehyd-Squivalent. Wenn beispielsweise eine Natriumchloridlösung mit 0,25 °ó Glutaraldehyd zur Umsetzung in einer Suspension von annähernd 75 000 bis 100 000 Zellen/mm3 verwendet wird, liefert die Umsetzung mit Jthylenglycol, das bis zu einer Lonzentration von etwa 3 Volumenprozent, bezogen auf das Volumen der Gesamt suspension, zugegeben wird, einen geeigneten EDerschuß an alkoholischen Hydroxylgruppen.
• Es ist gefunden worden, daß die rleaktionslösung als einem pH-Wert von vorzugsweise im Bereich von aImShernd 2, S>- bis 2,9 gehalten werden kann, um die Acetalbildung bei mit Aldehyd behandelten biologischen Zellen, wie tierischen Erythrozyten, in einer überschüssige Hydroxylgruppen enthaltenden Lösung zu fördern. Im Anschluß daran kann die entstandene Reaktionslösung basisch, vorzugsweise leicht über neutral, eingestellt werden.
• Ferner ist gefunden worden, daß die Binstellung der entstandenen Reaktionslösung auf einen pH-Wert von vorzugsweise im Bereich von annähernd 7,2 bis 7,6 besonders wirksam ist für die Stabilisierung der mit Acetal stabilisierten biologischen Zellen. Eine geeignete basische Einstellung wird durch die Zugabe einer üblichen Phosphat-Pufferlösung erreicht; gegebenenfalls können auch geringe Anteile einer starken Base, beispielsweise 6-n Natriumhydroxidlösung zugesetzt werden.
• Bin Beispiel für die Stabilisierungsreaktion nach der Erf indung ist folgende Umsetzung, in der eine mit Glutaraldehyd behandelte Erythrozyte (RBC) unter Bildung einer cyclischen Äthylenglycolacetalstabilisierung der Zelle reagiert, die besonders stabil bei der basischen Einstellung der Reaktionslösung ist: Dic erfinålngsgemaß hergestellten biologischen Zellen sind für die Verwendung als menschliche Blutteilchenanaloga in BezuSs- bzw. Vergleichslösungen entwickelt worden, wie sie in hämatologischen Zähl- und Größenbestimmungs- bzw. Klassiereinrichtungen verwendet werden. Bei solchen Anwendungen können die saabilisierten Zellen in einem Verdünnungsmedium suspendiert werden, das zur Verhinderung einer unerwünschten Transacetalisierung vorzugsweise einen geeigneten Alkohol sowie darüber hinaus ein übliches Bakterizid und übliche Entschäumungsmittel mit einer Pufferlösung zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von etwa 7,4 enthält. Die besten Ergebnisse bei der Herstellung von menschlichen Blutteilchenanaloga sind durch die Rerstellung von tierischen Erythrozyten, wie von roten Blutkörperchen vom menschen oder Ziegen, erzielt worden, die erfindungsgemäß stabilisiert worden sind. Beispielsweise sind erfindungsgemäß Erythrozyten von Ziegen beim Vermischen eines menschlichen Blutteilchenanalogs mit einer Teilchengröße im Bereich von 2 bis 20 µm³ und einer mittleren logarithmisch-normal Volumenpopulatation stabilisiert worden. In ähnlicher Weise sind erfindungsgemäß menschliche Erythrozyten für die Verwendung als Analogon eines Beukozyts des menschlichen Organismus oder einer weissen Blutzelle (I{BC) verwendet worden. Die stabilisierten Zellen können entweder als alleinstehende Analoga oder als Vollblutsimulierungen für Vergleichsreagenzien Verwendung finden.
• Folgendes sei ein Beispiel für die erfindungsgemäße Behandlung von Säugetiererythrozyten: Beispiel Frisches Ziegenblut wird unter aseptischen Bedingungen in ein Anticoagulans gesammelt. Das Blut wird langsam zentrifugiert und das Plasma und das Anticoagulans entfernt. Die Erythrozyten werden dreimal mit mit Phosphat gepuffertem Natriumchlorid gewaschen, wobei der pH-Wet bei annähernd 410 Milliosmol/kg (mOsm/kg) eingestellt wird. Etwa 100 bis 150 ml der frisch gewaschenen Erythrozyten werden in 2-1 Natriumchloridlösung, 410 m0sm/kg, suspendiert und mit einem magnetischen Rührer gerührt. Dann werden 500 ml Natriumcloridl;sung (410 mOsm/kg), die 0,31 Gew.-%, bezogen auf das Volumen, Glutaraldehyd enthält, mit einer Geschwind:it:-keit von 10 bis 15 ml/min zugetropft. Das Rühren wird 15 Minuten fortgesetzt, und anschließend fügt man 500 ml einer Natriunchloridlösung (410 mOsm/kg), die 0,44 Gew.-% Glutaraldehyd, bezogen auf das Volumen, enthält, hinzu.
• Nach weiterem 15-minütigem Rühren werden 120 ml Xthylenglycol und 75 ml 1-m Glycin-0;5-m HCl-Pufferlösung vom pH 2,4 zugesetzt und das entstandene Produkt dann 30 Minuten lang gerührt. Der Ehd-pH-Wert beträgt 2,8 + 0,1. Der erhaltenen Lösung werden dann etwa 100 ml 2-m Phosphatpufferlösung vom pH 7,4 zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,4 + 0,2 zu bringen. Die Erythrozyten werden über Nacht stehengelassen. Nachdem der Uberstand dekantiert worden ist, werden die Erythrozyten dreimal mit Wasser gewaschen. Dann werden die Erythrozyten nochmals in einem Suspensionsmedium auf eine Zahl von 1 Million + 500 000/ml suspendiert, zur Auflösung der Klümpchen 1 bis 2 Stunden in ein Ultraschallbad gegeben und anschließend, vor der Endlagerung, durch einen 20 µm-Mikroaggregatfilter gefiltert. Das Präparat ist bei Raumtemperatur stabil.
• Rezeptur für ein Suspensionsmedium Ili Wasser 800 ml auf ein belie-NaH2PO4 H20 0,2 g biges Volumen Na2HP04 7H20 0,2 g mit destilliertem Athylenglocol 150 ml Wasser auffüllen Natriumsalz des und durch ein 0,2 4-Chlor-3,5-Xylenols 0,5 g µm-Filter fil-Na2-Äthylendiamintetraessigsäure 0,25g trieren.
• Isopropanol 100 ml Bei Anwiendlmgen wie der Simulierung sowohl lymphoider als auch mylolder menschlicher Leukozyten können stabilisierte reellen verschiedener Arten zum Erhalt der gewünschten Zwei-Volutnen-Zell-Fopulation miteinander vermischt werden, wobei trnischerweise für ein genaues menschliches teukozytanalogon in einem Vollblutreagens mittlere Zellvolumenbereiche von sowohl 70 bis 90 T m3 als auch über 100 µm³ erforderlich sinde Der Fachmann wird ohne weiteres die große Breite der Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäß stabilisierten biologischen Zellen erkennen. Die vorstehend aufgeführten Beispiele sollen dabei nicht einen normalen Ersatz äquivalenter Komponenten im Rahmen dessen, was man vom Fachmann erwarten darf, ausschließen.

Claims (19)

1. Verfahren zur Stabilisierung von biologischen Zellen sowie danach stabilisierte biologische Zellzusammensetzungen.

   Patentansprüche X Stabilisierte biologische Zellzusammensetzung, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellzusammensetzung so behandelt wird, daß sie mindestens einen Äcetalrest aufweist, in der R1 R2, R3 und R4 Reste mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen sind.
2. 2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Acetalrest eine cyclische Struktur aufweist. 3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclische Struktur umfaßt, wobei R
3. 3 CH2 und R4 CH2CH2 ist.
4. 4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclische Struktur umfaßt, wobei R3 CH2 und R4 CH2 ist.
5. 5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Zelle ein tierisches Erythrozyt umfaßt.
6. 6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das tierische Frythrozyt mindestens ein Glied von menschlichen Erythrozyten oder von Erythrozyten von Ziegen umfaßt.
7. 7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Suspensionsverdünnungsmittel diese stabilisierten Zellen enthält.
8. 8. Verfahren zur Stabilisierung der Fixierung von mit einem l~oloaldehyd behandelten biologischen Zellen, um eine Vernetzung von Zelle zu Zelle zu verhindern, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: (a) Umsetzen der mit Aldehyd behandelten biologischen Zellen mit mindestens einem Alkohol in einer Lösung,die zur Bidung von Acetal sauer gehalten ist, und anschließendes (b) basisches Einstellen der in Schritt (a) erhaltenen Produktlösung.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die saure Reaktionslösung in Schritt (a) auf einem pH im Bereich von annähernd 2,3 bis 2,9 gehalten wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die saure Reaktionslösung in Schritt (a) durch Zugabe einer Lösung von Glycin und Salzsäure beibehalten wird.
11. -11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der -Alkohol mindestens ein 1,2-Diol ist.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das 1,2-Diol Xthylenglycol ist.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der basische Zustand in Schritt (b) durch Zugabe einer Phosphat-Pufferlösung in einer Menge bewirkt wird, die ausreicht, um einen pH im Bereich von annähern 7,2 bis 7,6 sicherzustellen.
14. 14. Verfahren nach den Ansprüchen 8, 9, 10, 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyaldehyd Glutaraldehyd ist.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die biologischen Zellen tierische Erythrozyten sind.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die tierischen Erythrozyten Erythrozyten von Ziegen zur Verçendung als Menschenblutplättchenanaloga in Bezugs- bzw. Vergleichslösungen sind, welch letztere zur Verwendung bei elektronisch arbeitenden hämatologischen Labor-Testeinrichtungen geeignet sind.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die tierischen Erythrozyten menschliche Erythrozyten zur Verwendung als menschliche weiße Blutkörperchenanaloga in Bezugs- bzw. Vergleichslösungen sind, welch letztere zur Verwendung in elektronisch arbeitenden hämatologischen Labor-Te3teinrichfungen geeignet sind.
18. 18. Stabilisierte biologische Zellzusammensetzung, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8.
19. 19. Suspension von stabilisierten biologischen Zellen, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8.