DE2008493C3 - Hämatologische Kontrollflüssigkeit - Google Patents
Hämatologische KontrollflüssigkeitInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine hämatologische Kontroll- jo
flüssigkeit zur Verwendung bei hämatologischen Diagnosen, insbesondere als Bezugskontrollmittel für eine
Reihe von hämatologischen Routinebestimmungen.
Bisher bestand in der Hämatologie ein Mangel an stabilen Kontrollmitteln für hämatologische Bestimmungen.
Mit dem Aufkommen von automatisierten Vorrichtungen, die in der Lage sind, hämatologische
Mehrfachbestimmungen durchzuführen, entwickelte sich ein Bedarf an Bezugsproben für manuelle und
maschinelle Analysen. mi
In der US-PS 34 06 121 wird eine stabile Suspension
roter menschlicher Blutzellen zur Verwendung als Zählstandard beschrieben, worin ein Stabilisierungsmedium
verwendet wird, das im wesentlichen aus einer Osmiumtetraxid enthaltenden Kochsalzlösung besteht. >
Eine solche Flüssigkeit kann jedoch nicht als Bezugskontrolle zum Zählen von weißen menschlichen
Blutzellen dienen.
In der US-PS 3412 037 wird ein Verfahren zur
Herstellung eines stabilisierten Standards zur Kalibrierung einer Blutzählapparatur beschrieben, worin das
Stabilisierungsmittelmedium eine Kochsalzlösung von Hefe ist Hefe ist jedoch ein blutfremdes Material,
während man bestrebt ist Bezugskontrollen zu verwenden, die möglichst der Zusammensetzung von normalem,
menschlichem Blut entsprechen.
Aufgabe der Erfindung war es, eine stabilisierte hämatologische Kontrollflüssigkeit für Mehrfachanalysen
zu schaffen, mit der auch weiße Blutzellen bestimmt werden können, die annährend der Zusammensetzung
von normalem, menschlichem Blut entspricht und praktisch keine blutfremden Mine) enthält
Gelöst wird diese Aufgabe durch eine hämatologische Kontrollflüssigkeit mit den Merkmalen gemäß dem
kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs ί.
Vorteilhafte Weiterbildungen der erfindungsgemäßen hämatologischen Kontrollflüssigkeit sind in den
Patentansprüchen 2—8 beschrieben.
Durch die Erfindung wird ein stabiles Kontrollmittel für Mehrfachanalysen geschaffen, das in einem einzigen
Mittel Bezugskontrollen zum Zählen von roten und weißen Blutzellen, zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes
und zur Hämatokritbestimmung vereinigt, und das eine mathematische Berechnung des mittleren
Volumens, der mittleren Hämoglobinkonzentration und des mittleren Hämoglobinwertes der Blutkörperchen
ermöglicht
Die erfindungsgemäße hämatologische Kontrollflüssigkeit besteht in einer stabilen Zellsuspension, die
annährend der Zusammensetzung von normalem, menschlichen Blut entspricht Dagegen hat mit Oxal-
oder Zitronensäure behandeltes menschliches Blut nur eine begrenzte Lagerstabilität Die roten Blutzellen
hämolysieren allmählich und verändern sich in Größe und Gestalt Desgleichen erfahren weiße Blutzellen
degenerierende Veränderungen. Die weißen Blutzellen des Menschen sind für Kontrollzwecke nicht geeignet
besonders nicht in Gegenwart roter Blutzellen, da sie nicht beständig sind und ein Lysozym-Enzym ausscheiden,
das die roten Blutzellen angreift Rote Blutzellen von Vögeln hingegen sind größer als die menschlichen
roten Blutzellen und haben etwa die Form und Größe der menschlichen weißen Blutzellen. Es zeigte sich, daß
rote Blutzellen von Geflügel wie Gänse, Hühner, Enten und vorzugsweise die roten Blutzellen des Truthahns in
Form und Größe den menschlichen weißen Blutzellen am ähnlichsten sind und sich für das ei rindungsgemäße
Verfahren zur Stabilisierung mit Tannin (tanning process) seht gut eignen. Diese stabilisierten »simulierten«
weißen Biutzellen sind ein guter Ersatz für menschliche weiße Blutzellen in dem erfindungsgemäßen
Kontrollprodukt
Es wurde gefunden, daß frische, menschliche rote Blutzellen, die durch Suspension in menschlichem
Plasma oder Serum mit einem Zusatz an metallischem Konservierungsmittel stabilisiert sind, brauchbare rote
Blutzellen als Bestandteil für das erfindungsgemäße Gemisch darstellen. Plasma oder Serum liefern einige
Elektrolyte und Proteine, die für die metabolische Stabilität der roten Blutzellen erforderlich sind.
Ausgewählte Purine oder Pyrimidine können als zusätzliches Konservierungsmittel zugesetzt werden.
Die nicht mit Tannin stabilisierten roten Blutzellen können vor der Bestimmung der Zahl der weißen
Blutzellen und zur anschließenden Hämoglobinbestimmung sehr leicht hämolysiert werden.
Suspensionen von menschlichen roten Blutzellen und »simulierten« weißen Blutzellen werden in einem
solchen Verhältnis gemischt, daß die endgültige Zahl der
roten und weißen Blutzellen, der Hämoglobingehalt und das Ergebnis der Hämatokritbestimmung in den für
menschliches Blut als normal angesehenen Bereich fallen.
Im menschlichen Blut liegt die Zahl der roten Blutzellen normalerweise im Bereich von
4 000 000-5 000 000 Zellen/mnv» und die Zahl der
weißen Blutzellen zwischen 5000 und 10 000 Zellen/ mm3. Der Hämoglobingehalt beträgt normalerweise
12 —16 g/100 mL Der Begriff »Hämatokrit« bedeutet
das Verhältnis des Volumens der verdichteten (packed) roten Blutzeilen zum Volumen des gesamten Blutes. Das
normale Verhältnis ist beim Menschen etwa 45%. Das mittlere Volumen der Blutkörperchen ist das Verhältnis
des Volumens der verdichteten roten Blutzellen in ml/1 Blut zu der Zahl der roten Blutzellen in Million pro m3.
Die mittlere Hämoglobinkonzentration der Blutkörperchen ist ein Index für das mittlere oder durchschnittliche
Gewicht des Hämoglobins pro 100 ml der verdichteten roten Blutzellen in Prozenten. Der mittlere Hämoglobinwert
ist das Verhältnis des Hämoglobingehalts in g/l zu der Anzahl der roten Blutzellen in Million pro mm3.
Es ist offensichtlich, daß ein KontroUprodukt auf Vergleichsbasis genau das anzeigen muß, woraus eine
Versuchsblutprobe in bezug auf die vorstehend beschriebenen Bestimmungen besteht Es ist weiterhin
offensichtlich, wie wichtig es ist, daß das Kontrollprodukt
eine Nachbildung unbehandelter Zellen ist. Wenn
ein KontroUprodukt beispielsweise Z Jlen von wesentlich
verschiedener Größe enthsHt, sind die Versuchsergebnisse
ungenau, wenn nicht vollkomrcn bedeutungslos.
Die nach dem hier beschriebenen Verfahren behandelten Zellen liefern ein ausgezeichnetes Kontroll-
und Ausgleichsystem, das bei hämatologischen Bestimmungen unbedingt erforderlich ist
Im folgenden wird zur Erläuterung der Erfindung ein Beispiel für die Herstellung einer hämatologischen
Kontrollflüssigkeit beschrieben.
Der nachstehend verwendete Begriff »Salzlösung« kann eine der folgenden drei Lösungen bedeuten: eine
0,9 gew.-%ige wäßrige Natriumchloridlösung, die als »Lösung A« bezeichnet wird; eine O,45°/oige wäßrige
Natriumchloridlösung, genannt »Lösung B« oder eine gepufferte Salzlösung (Lösung C). Bei der Herstellung
der »simulierten« weißen Blutzellen als Kontrollsubstanz ist es wichtig, daß die 0,45%ige Lösung (Lösung B)
verwendet wird, weil bei dieser Konzentration die gewöhnlich ovale Form der roten Blutzellen von
Geflügel in vorteilhafter Weise in eine mehr runde Form, wie sie die menschlichen weißen Blutzellen
aufweisen, umgewandelt wird.
Die erste Stufe des Verfahrens zur Stabilisierung der roten Blutzellen von Geflügel besteht darin, daß die
roten Blutzellen in der Salzlösung zu einer Suspension mit einer Konzentration bis zu 50 VoI.-% suspendiert
werden. Obwohl eine Konzentration von 50% brauchbar ist, wird vorzugsweise eine Konzentration von etwa
5 bis 10 Vol.-%, insbesondere von 8%, verwendet Diese
Suspension wird mit einem gleichen Volumen einer 1-bis 3 gew.-%igen Lösung von Quecksilber^I)-chlorid in
Salzlösung gemischt
Die zweite Stufe besteht aus einem mindestens 12stündigem, vorzugsweise etwa 19- bis 20stündigen
Erhitzen des entstandenen Gemisches bei 37°C. Die festen Stoffe werden durch Zentrifugieren und Abtrennen
gewonnen und anschließend erneut in Salzlösung zu einer 2- bis 6%igen und vorzugsweise 4%igen
Suspension suspendiert
In der dritten Stufe wird die vorstehend beschriebene Suspension unter sorgfältigem Mischen mit einem
gleichen Volumen einer 0,0025%igen (Gewicht/Volumen)
Lösung von wäßrigem Tannin in Salzlösung vereinigt; anschließend wird das entstandene Geirisch
inkubiert und das feste Gemisch durch Zentrifugieren ίο und Abtrennen gewonnen. Die Tannin enthaltende
Salzlösung ist eine gepufferte Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,2 und ist die vorstehend erwähnte
»Lösung C«. Sie besteht aus folgenden Bestandteilen in den angegebenen Mengenverhältnissen (pro Liter):
0,9%ige Salzlösung 500 ml
0,15molare Dinatriumphosphatlösung 385 ml
0,15molare Kaliumphosphatlösung 115 ml
0,15molare Kaliumphosphatlösung 115 ml
Salzlösung gewaschen und anschließend in steriler Alsever-Lösung rekonstituiert
Die Herstellung der Suspension der menschlichen roten Blutzellen wird unter sterilen Bedingungen
durchgeführt Rote Blutzellen von jeder Blutart können dafür verwendet werden, jedoch wird vorzugsweise die
Blutgruppe 0 verwendende sich für diese Gruppe leicht Spender finden lassen. Das in einer antikoagulierend
wirkenden sauren Citrat-Dextroselösung gesammelte Blut der Gruppe 0 wird zentrifugiert; die überstehende
Flüssigkeit wird entfernt und beiseite gestellt die Pufferschicht der weißen Blutzellen entfernt und
verworfen. Die verdichteten roten Blutzellen werden mehrmals mit Alsever-Lösung gewaschen, in Alsever-Lösung
rekonstituiert und bei 2—8° C gelagert
Das für die endgültige Suspension der menschlichen roten Blutzellen verwendete resuspendierende Medium
wird aus einem defibrinierten Plasma hergestellt, das mit den suspendierten menschlichen roten Blutzellen
serologisch verträglich ist d. h. Bhitzellen der Gruppe A
mit Plasma der Gruppe A, Blutzellen der Gruppe B mit
Plasma der Gruppe B und Blutzellen der Gruppe 0 mit Plasma der Gruppe 0. Defibriniertes Plasma der Gruppe
AB (fehlende Antikörper A und B) ist verträglich mit roten Blutzellen der Gruppe A, B und 0. Die
überstehende Plasmaflüsrigkeit wird durch Behandlung mit Rinderthrombin defibriniert und anschließend im
Verhältnis 1 :3 mit Alsever-Lösung verdünnt.
Zur weiteren Stabilirierung des aus frischen Blutzellen
bestehenden Bestandteils der endgültigen Zellsus-
>o pension wird das suspendierende Medium mit einem
Surin oder Pyrimidin als metabolischem Konservierungsmittel (metabolic preservative) in solcher Menge
versetzt, daß eine Endkonzentration von etwa 34—35 mg pro ml der Zellsuspension erhalten wird. Ein
besonders wirksames Konservierungsmittel ist Adenin (6-Aminopurin oder ein pharmazeutisch verträgliches
ι·! Erläuterung der Erfindung.
In einem wäßrigen sauren Citrat-Dextrose-Antikoagulant
gesammeltes Blut der Gruppe 0 wurde unter : sterilen Bedingungen mit 200 Upm 20 Minuten zentrifugiert
Die überstehende Flüssigkeit wurde vorsichtig abgesaugt wobei darauf geachtet wurde, daß in dem
Grenzbereich zwischen den roten Zellen und der
Oberstehenden Flüssigkeit keine roten Zellen oder die
weiße Pufferschicht in die überstehende Flüssigkeit abgezogen wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde
zur nachstehend beschriebenen Verdünnung mit Alsever-Lösung und Verwendung als resuspendierendes
Mittel aufbewahrt
Die Pufferschicht (weiße Blutzellen) wurde vorsichtig über den verdichteten roten Blutzellen entfernt, wobei
gegebenenfalls eine dünne Schicht der roten Zellen mit abgezogen wird. Die verdichteten roten Zellen wurden
zweimal mit AIsever-Lösung gewaschen, zentrifugiert
und bei 2—80C bis zum Mischen mit stabilisierten
»simulierten« weißen Bhtzellen gelagert
15
Rote Blutzellen von Geflügel, vorzugsweise eines Truthaiins, wurden viermal mit Salzlösung (Lösung A)
gewaschen (wobei sie nach jedem Waschen 20 Minuten bei 3300 Upm zentrifugiert wurden) und nach dem
letzten Waschen zu einer 8voL°/oigen Suspension in Salzlösung (Lösung A) resuspendiert 1OO ml dieser
8%igen Suspension wurden mit 100 ml einer 1 gew.%igen Lösung von Quecksilber(II)-ch!orid in
Salzlösung (Lösung A) versetzt; die erhaltene Suspension wurde sorgfältig gemischt Anschließend wurde sie
19 Stunden bei 37° C inkubiert, viermal mit destilliertem
Wasser gewaschen (obei sie nach jedem Waschen 5 Minuten bei 1200 upm zentrifugiert wurde) und in
Salzlösung (Lösung A) zu einer 4voL%igen Suspension resuspendiert Diese 4%ige Suspension wurde mit
einem gleichen Volumen einer 0,0025%igen (Gewicht pro Volumen) Lösung von Tannin in gepufferter
Salzlösung (Lösung C) versetzt, und das entstandene Gemisch wurde sorgfältig gemixt 30 Minuten bei 500C
inkubiert, zentrifugiert und dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
Das überstehende Plasma, das aus dem in einem wäßrigen sauren Citrat-Dextrose-Antikoagulant ge- 4n
sammelten Blut der Gruppe 0 erhalten wurde, wurde im Verhältnis 1 :3 mit AIsever-Lösung verdünnt Das
verdünnte Plasma wurde unter Zusatz von Rinderthrombin
(hergestellt von Parke-Davis % Co, Detroit,
Michigan) in einer Konzentration von 1 Einheit/ml defibriniert und 1 Stunde bei 37" C inkubiert Das
klumpige Material wurde heftig geschüttelt und die Klumpen aufzubrechen und durch ein Filter (Whatman
Nr. 50), das sich auf einem Büchner-Trichter über einer Saugflasche befand, filtriert Adeninsulfat wurde in einer
Konzentration von 70 mg/100 ml zugesetzt; zur Beschleunigung der Auflösung wurde das Gemisch auf
37° C erhitzt; anschließend wurde die Lösung nacheinander durch Filterkörper mit einer Porengröße von 0,45
und 0,22 Milliporen (0,45 und 0,22 Millipore filter pads)
filtriert
Die Arbeitsweise von Beispiel III wurde wiederholt, wobei das Plasma der Gruppe 0 durch Plasma der
Gruppe AB ersetzt wurde.
Beispie! V
Die nach Beispiel II hergestellten »simulierten« weißen Blutzeilen wurden in steriler Alsever-Lö^ung bis
zu einem Hämatikritwert von etwa 24% rekonstituiert Diese Lösung enthäItetwa750 000- 800 000 Zellen/mm3.
Zwei ml dieser Suspension wurden unter Zusatz von 100 ml des nach Beispiel III oder IV hergestellten
resuspendierenden Mittels weiter verdünnt
Ein Volumen der nach Beispiefl hergestellten, verdichteten menschlichen Blutzellen der Gruppe 0
(etwa 90% Hämatokrit) wurde mit einem gleichen Volumen der verdünnten Suspension der »simulierten«
weißen Blutzellen versetzt
Die als Endprodukt erhaltene Zellsuspension mit einem Gehalt von etwa 34—35 mg Adenin pro 100 ml
wies etwa 4 000000—5 000000 rote Blutzellen pro
mm3,5000 -10 000 weiße Blutzellen pro mm3,12 -16 g
Hämaglobin pro 100 ml und43-47% Hämatokrit auf.
Aliquote Teile (2^5 ml) der Endsuspension in Glasfläschchen
verteilt hielten sich bei Lagerung bei 2-8° C etwa 4 Wochen.
Claims (8)
1. Hämatologische Kontrollflüssigkeit, dadurch
gekennzeichnet, daß sie aus einer Suspension von Frischen menschlichen roten Blutzellen und von
mit Tannin stabilisierten roten Geflügelblutzellen in einem ein antikoagulierend wirkendes Mittel enthaltenden,
serologisch verträglichen menschlichen Plasmamedium besteht, wobei die Konzentration der ι ο
Geflügelblutzellen etwa 5000 bis 10 000 Zellen pro mm3 und die Konzentration der menschlichen roten
Blutzellen etwa 4 000 000 bis 5 000 000 Zellen pro mm3 beträgt.
2. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die frischen
menschlichen roten Blutzellen rote Blutzellen der Gruppe 0 sind.
3. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit
Tannin stabilisierten roten Geflügelblutzellen rote Blutzellen eines Truthahns sind.
4. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das antikoagulierend
wirkende Mittel in dem menschlichen Plasmamedium saure Citrat-Dextrose Lösung ist
5. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmamedium
aus mit AIsever-Lösung in einem Volumenverhältnis
von etwa 1 :3 verdünntem, defibrinierten
menschlichen Plasma in einem aus wäßriger saurer Citrat-Dextrose-Lösung bestehenden antikoagulierend
wirkenden Mittel besteht
6. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet daß das defibrinierte
menschliche Plasma Plasma der Gruppe 0 ist
7. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch
5, dadurch gekennzeichnet daß das defibrinierte menschliche Plasma Plasma der Gruppe AB
ist
8. Hämatologische Kontrollflüssigkeit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß sie pro
100 ml etwa 34-35 mg 6-Aminopurin oder eines seiner pharmazeutisch verträglichen Säure-Additionssalze
enthält
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