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DE2846408A1 - Verfahren zur photometrischen bestimmung der anwesenheit von protein in einem unbekannten material - Google Patents

Verfahren zur photometrischen bestimmung der anwesenheit von protein in einem unbekannten material

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Publication number
DE2846408A1
DE2846408A1 DE19782846408 DE2846408A DE2846408A1 DE 2846408 A1 DE2846408 A1 DE 2846408A1 DE 19782846408 DE19782846408 DE 19782846408 DE 2846408 A DE2846408 A DE 2846408A DE 2846408 A1 DE2846408 A1 DE 2846408A1
Authority
DE
Germany
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protein
sodium hydroxide
lowry
solution
ecm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19782846408
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English (en)
Inventor
Iii Robert E Hopkins
Kathleen Hughes
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baxter International Inc
Original Assignee
Baxter Travenol Laboratories Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Travenol Laboratories Inc filed Critical Baxter Travenol Laboratories Inc
Publication of DE2846408A1 publication Critical patent/DE2846408A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G01N33/683—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving metal ions
    • G01N33/6833—Copper, e.g. Folin-, Lowry-, biuret methods
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description

In der US Patentanmeldung Ser.No. 465 990 vom 1. Mai 1974 wird ein verbessertes Verfahren zur Feststellung winziger Endotoxinspuren durch Verwendung eines photometrxschen Analyseverfahrens von ausgefälltem ("clotted") Limulus-Protein beschrieben. Das Verfahren ist etwa 8 Mal empfindlicher als das übliche Ausfällungs (»clot-like»)-Analyseverfahren. Eine weitere Beschreibung dieses Verfahrens findet sich im Artikel von R.Nandan und D.Brown mit dem Titel 11A New in Vitro Pyrogen- Test: To Detect Picograms of Endotoxin Contamination in Intravenous Fluids Using Limulus Amoebocyte Lysate", J.Lab.Clin.Med., Bd. 89, Nr. 4, Seite 901-918 (April 1977).
Grundsätzlich wird das Limulus Lysatprotein mit dem unbekannten Material in Berührung gebracht, das in Anwesenheit von Picogrammengen an bakteriellem Endotoxin zur Bildung eines Nieder-
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If
Schlages aus mindestens einem Teil des anv/esenden Limulus Proteins/führt. Der Niederschlag wird zentrifugiert, und die überstehende, nicht ausgefälltes Limulus Protein enthaltende Flüssigkeit wird dekantiert.
Danach wird das ausgefällte Limulus Protein, üblicherweise in einer O,75N Natriumhydroxidlösung, erneut gelöst, worauf die Konzentration des anwesenden.Proteins gegen eine seriell verdünnte Standard-Endotoxinkurve mittels des bekannten Lowry-Proteintests bestimmt wird, um die Menge an ausgefälltem Protein festzustellen, die ihrerseits eine Funktion der Endotoxinkonzentration ist, wie durch die Standardkurve angezeigt wird.
Der bekannte Lowry-Test auf Protein wird z.B. im Buch von R.J. Henry mit dem Titel "Clinical Chemistry, Principles and Techniques", Seite 424-425, Harper and Row (2. AufIg. 1974;· plus den in den Fußnoten angegebenen Literaturstellen) diskutiert. Danach haben Folin und Denis gefunden, daß ein Phosphorwolfram-Phosphormolybdänsäure-Reagenz mit Proteinen und bestimmten-anderen Verbindungen eine blaue Färbung liefert. Das Verfahren wurde als Mittel zur Proteinfeststellung verbessert, indem man anstelle von .Natriumsalzen Lithiumsalze, insbesondere das Folin-Ciocalteau-Reagenz, verwendete.
Als weitere Verbesserung des Verfahrens wird das Protein gewöhnlich mit einer alkalischen Kupferlösung (gewöhnlich O,1N Natriumhydroxidlö sung) vorbehandelt; diese Vorbehandlung verbessert, wie festgestellt wurde, die Empfindlichkeit der Reaktion auf Protein erheblich. Die gebildete Farbe resultiert laut Angaben aue der Reduktion der Phospbavolfram-Phosphormolybdän-
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säuren durch den Kupferproteinkomplex und bestimmte, in den meisten Proteinen anwesende Aminosäuren. Darauf beruht der Lowry-Test.
Die obige Technologie kann durch das erfindungsgemäße Verfahren verbessert v/erden. Die oben beschriebenen, gefärbten Materialien sollen von dem hier verwendeten Ausdruck "proteinanzeigender Komplex vom Lowry-Typ" ("Lowry-type protein-indicating complex") umfaßt werden.
Obgleich das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise in Verbindung mit Limulus Lysatproteinen verwendet wird, werden zur erfindungsgemäßen Verwendung auch ähnliche durch Endotoxin ausgefällte Proteine anderer Krebsarten besonders bevorzugt.
Es wurde gefunden, daß der proteinanzeigende Komplex vom Lowry-Typ bei Behandlung nach bekannten Verfahren ziemlich unstabil ist, was bei quantitativen photometrischen Tests unter Anwen-
nur
dung von Lowry-Proteinverfahren/zu einem Endpunkt von kurzer Dauer führt. So zeigte z.B. in einem Test mit einer Endotoxinkonzentration vcn 200 Picogramm Endotoxin die Reaktionslösung nach 5 Minuten eine Absorbanz etwas oberhalb 0,9, nach der im Test vorgeschriebenen Inkubationszeit von 30 Minuten war die Absorbanz jedoch spontan auf etwa 0,7 gesunken.
Wenn ein Proteintestverfahren für die großtechnische, industrielle Verwendung vorgesehen wird, ist es selbstverständlich unzweckmäßig, einen Test mit einem unstabilen Endpunkt zu verwenden, da der Test auf wiederholter Basis in großem Umfang
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Umfang durchgeführt wird, und Verzögerungen in der Endanalyse unvermeidbar sind.
Es besteht daher das Bedürfnis nach einem photometrischen
Proteintest mit der in der obengenannten Patentanmeldung und
dem Artikel von Nandan l3eschriebenen, äußerst hohen Empfindlichkeit bei gleichzeitiger verbesserter Stabilität der Reaktionsmischung an deren Endpunkt.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt-, daß eine Verringerung der zum Lösen des ausgefällten Proteins in einer ProteinanalysB
(z.B. des oben beschriebenen Verfahrens) verwendeten, starken
Alkalis vor der photometrischen Analyse ^eine sehr erhebliche
Erhöhung der Stabilität des Endpunktes ergibt, so daß die Ablesbarkeit der maximalen optischen Dichte der Reaktionsmischung über eine längere Dauer bestehend bleibt.
Das starke Alkali ist insbesondere in einer Konzentration von 0,1 bis O,4N anv/esend, wobei der Verwender die
spezifische Konzentration zur Erzielung der gewünschten Zeitberechnung des Endpunktes auswählt.
Bei den unteren Konzentrationen des starken Alkalis innerhalb des obigen, bevorzugten Bereiches kann es nach dem Mischen
der Lowry-Testreagenzien eine Anfangperiode geben, in der die optische Dichte ansteigt. Nach einer kurzen Dauer, die von der Konzentration des zum erneuten Lösen des Proteinniederschlages verwendeten, starken Alkalis abhängt, erreicht die optische
Dichte des photometrischen Tests, die selbstverständlich eine Funktion der Menge an erneut gelöstem, anwesendem Protein-
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niederschlag ist, ein verlängertes Maximum. Dieses Maximum bleibt längere Zeit bestehen, erleichtert die sorgfältige Analyse des Tests und erlaubt weiterhin nach Wunsch Wiederholungen der Analysestufen.
Danach gibt es, wie in Tests unter Verwendung höherer Alkalikonzentrationen zum Lösen des Proteins, eine langsame Zersetzung bzw. Abbau des Komplexes, der die Anwesenheit von Protein im Lowry-Test anzeigt, was mit einer Verminderung der optischen Dichte verbunden ist.
Daher wird im bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren Limulus Lysat zu einem unbekannten Material zugefügt, der erhaltene Niederschlag wird, vorzugsweise durch Zentrifugieren, gesammelt, und die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert oder gegebenenfalls mit einer Pipette entfernt. Anschließend wird der Niederschlag erneut in starkem Alkali, z.B. einer Natriumhydroxidlösung einer Konzentration von 0,1 bis 0,4N, gelöst.
Dann wird die erhaltene Testmischung photometrisch, vorzugsweise nach einem Lowry-Proteinverfahren gemäß Beschreibung im oben genannten Artikel, analysiert, um gegen eine Standardkurve ähnlich behandelter, seriell verdünnter Endotoxinlösungen verglichen zu werden, und man erhält einen stabilen, langen Endpunkt, während dem die maximale optische Dichte gemessen werden kann und dann mit der Standardkurve verglichen werden kann, um die Anwesenheit von Endotoxin im unbekannten Material zu bestimmten.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit anderen Proteintests, z.B. zur quantitativen Analyse von menschlichem Serumalbumin in quantitativer V/eise, verwendet v/erden, indem man zuerst das menschliche Serumalbumin in einer Natriuinhydroxidlösung einer Konzentration von 0,1 bis 0,4N löst und dann die erhaltene Lösung einer Lowry-Analyse zur Erzielung eines quantitativen photometrischen Ednpunktes unterwirft. Das Verfahren kann auch mit jedem anderenn Protein verwendet werden, das in einer Natriumhydroxidlösung der bevorzugten Konzentration löslich ist.
Obgleich Natriumhydroxid erfindungsgemäß als starkes Alkali bevorzugt wird, können auch andere Alkalimetallhydroxide, wie Kalium- oder Cäsiumhydroxid, und starke quaternäre Ammoniumhydroxide, wie Tetraäthyiammoniumhydroxid, verwendet werden. Gegebenenfalls sind auch schwächere Alkalimaterialien mit einer der 0,1 bis 0,4N Natriumhydroxldösung äquivalenten Hydroxylionenkonzentration als Alternative geeignet.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1_
Die in allen, in diesem Beispiel verwendeten Glaswaren anwesenden .Pyrogene- wurden durch trockene Wärme in einem Ofen bei 2500C. 4 Stunden lang entfernt. Die Tests erfolgten in sterilen, pyrogenfreien Kulturteströhrchen, die sofort nach Zugabe der Reaktionsteilnehmer mit Kunststoffmaterial abgedeckt wurden, um eine Verunreinigung aus der Luft zu verhindern.
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A. Dieser "besondere Versuche sollte das typische Verhalten des Lowry-Froteintests an seinem Endpunkt bei Verwendung gemäß Nandan und Brown (vgl. den oben genannten Artikel) zeigen, wobei eine Modifikation des Lowry1sehen Verfahrens auf Gesamtprotein gemäß Beschreibung von Lowry et al, in J.Biol.Chem., 193:265-275 (1951) angewendet wurde.
Alle Reagenzien wurden in dest. V/asser hergestellt. Lowry-Kupferreagenz: Grundlösung = 5 g CuSO^x^HoO in 1 1 0,085N Kaliumnatriumtartrat.
Natriumcarbonat, Grundlösung = 2 g Na2CO, in 100 ecm 0,1N NaOH. Lowry-Kupferarbeitsreagenz = hergestellt durch Verdünnen von 2,0 ecm des Lowry-Kupfergrundreagenz auf 100 ecm mit der Natriumcarbonatgrundlösung.
Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagenz (2N Lösung) = von der Firma Fisher Scientific Company, New Jersey, im Handel.
Folin-Arbeitsreagenz = hergestellt durch Verdünnen von 1 Teil Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagenzlösung mit ,1 Teil dest. Wasser.
O,75N Natriumhydroxid = hergestellt durch entsprechendes Verdünnen von standardisiertem 1ON Natriumhydroxid, das von der Firma Fisher Scientific Comp, im Handel ist.
Menschliches, kristallisiertes Albumin wurde von der American Hospital Supply Corp. bezogen. Das Albumin wurde in O,75N Natriumhydroxidlösungsproben auf die folgenden Albuminkonzentrationen in unterschiedlichen Proben der Natriumhydroxidlösung gelöst: 20, AO, 80 und 160 Microgramm pro 0,2 ecm.
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0,2 ecm jeder dieser Lösungen wurde in ein Kulturteströhrchen gegeben.
1 ecm des Lowry-Kupferarbeitsreagenz wurde zu jew-eils 0,2 ecm Proteinlösungsprobe zugegeben und die Mischung 10 Minuten bei Zimmertemperatur (25° + 2°C.) stehen gelassen. Nach dieser Zeit wurde 0,1 ecm Folin-Arbeitsreagenz zugefügt und die Lösung sofort gemischt.
Es wurden mehrere Proben jeder Albuminkonzentration hergestellt und die Absorbanz jeder Mischung als Funktion der Zeit vom endgültigen Mischen der Bestandteile in einem Gilford 300N Spektrophotometer bei 500 Nanometers gemessen. Die Ergebnisse waren wie folgt:
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Zeit; min Tabelle I ,2 ecm (jeweils 2 Proben) 80 ;O,519 0 160
5 40 0,508 ;0,490 0 ,911;O,934
10 O,282;O,280 0,486 >O,447 0 ,866;0,867
15 Optische Dichte von Proteinlösungen bei
unterschiedlichen Proteinkonzentrationen
(Mikroftramm/0,2 ecm)		 O,266;O,267 0,441 10,407 · 0 ,790;O»801
20 Mikrogramra/0 0,242;0,242 0,399 ;O,364 0 ,736fO,753
co
O 		25 20 O,224;O,218 0,356 ;0,319 0 ,683fO,680
co
09 		30 0,144; 0,148 Ο,198·,Ο,196 0,321 ;O,298 0 ,608*,O,628
CO 35 0>l41;01i41 O,172;O,179 0,292 ;0,264 0 ,575;O1577
*x»
O 		40 0,14270,126 0,157>0,152 0,253 ,497tO,520
Us
σ>
co		 0,116; 0,119 Ot141>0,140
0 ,098JO1IOO
Ο,090;Ο,089
0,078;O,081
0,086;O,072
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Wie ersichtlich, zeigt sich innerhalb von 30 Minuten ein schwerer Abfall der optischen Dichte; dieser ist selbst innerhalb von 10 Minuten nach dem Mischen der Reaktionsteilnehmer erheblich.
B. Der Versuch von Beispiel 1A wurde wiederholt, wobei jedoch die zum Lösen des Albumin verv/endete Konzentration an Natriumhydroxid nicht 0,7DN sondern 0,3N betrug. Es wurden mehrere Proben jeder Albuninkonzentration hergestellt und die Absorbanz jeder Mischung als Funktion der Zeit vom endgültigen Minchen der Beetandteile in einem Gilford 300N Spektrophotometer bei 500 Nanaometern gemessen. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Tabelle II
optische Dichte von Proteinlösungen bei unterschiedlicher Proteinkonzentration
t (i'i 1 λvu,._rai?.r::/0, 2 ecm)
O, 2 cc;n
UQ 8Ö TbO
0,308
0,312
0,307
0,306
0,303
0,300
Wie ersichtlich, nahm in der aufgezeichneten Dauer von 25 Minuten zwischen Minute 5 und 30 nach Mischen der Reaktionsteilnehmer die optische Dichte um weniger als 10 % in allen Fällen ab. Damit muß die Abnahme der optischen Dichte in derselben Dauer zwischen 30 und <';0 % in Beispiel 1A verglichen werden.
Zeit; 0 20
mm 0 ,373
5 0 ,373
10 0 ,173
15 0 ,373
20 0 ,172
25 ,171
30
0,539 0,868
0,530 0,858
0,526 0,852
0,523 0,840
0,528 0,829
0,510 ' 0,811
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C. Beispiel 1A wurde mit einer Konzentration der zum Lösen des Albumins verwendeten Natriumhydroxidlösung von O,4N anstelle von O,75N wiederholt.
Wie oben wurden mehrere Proben jeder Albuminkonzentration hergesiELlt und die Absorbanz jeder Mischung wie oben gemessen. Es wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:
Tabelle III
optische Dichte von Proteinlösungen bei unterschiedlicher Proteinkonzentration (Mikrogramm/0,2 ecm)
Zeit· Mikroprarrm/0,2 ecm [
min' 20 w üu ίου
5 0 ,158
10 0 ,152
15 0 ,153
20 O ,150
25 O ,149
30 0 ,149
0,277 0,485 0,805
0,272 0,480 0,796
0,277 0,474 0,786
0,271 0,465 0,771
0,258 0,455 0,752
0,252 0,441 0,724
Wie ersichtlich, ist in diesem Beispiel auch die Abnahme der optischen Dichte zwischen der 5· und 30. Minute höchstens etwa 10 % im Gegensatz zum sehr erheblichen Abbau innerhalb derselben Dauer unter den Bedingungen von Beispiel 1A.
Allgemein erzielt man äquivalente Ergebnisse, wenn der Versuch von Beispiel 1C an dem bekannten Oyama-Eagle-Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Proteinkonzentrationen wiederholt wird (vgl. Oyama und Eagle "Measurement of Cell Growth in Tissue Culture With a Phenol Reagent (Foiin-Ciocalteau)", Proc.Soc.Exptl.Biol.Med., 91:305-307 (1956)), wobei der Abbau
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der optischen Dichte zwischen der 5. und 30. Minute gewöhnlich unter 10 % lag.
D. Beispiel 1A wurde mit einer zum Lösen des Albuminniederschlages verwendeten Natriumhydroxidkonzentration von 0,25N anstelle von 0,7511 wiederholt. Es wurden mehrere Proben jeder Albuminkonzentration hergestellt und die Absorbanz jeder Mischung wie oben gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle
IV aufgeführt.
Tabelle IV
optische Dichte von Proteinlösungen bei unterschiedlicher Proteinkonzentration (Mikrogramm/O,2 ecm)
Zeit; Mikrogramrn/0,2 ecm
min 2(3 2+0 ! TEÖ
5 0,168 0,302 0,884
10 0,167 . 0j300 0,876
15 0,170 0,303 0,875
20 0,171 0,302 0,875
25 0,172 0,303 . 0,872
30 0,173 0,303 0,882
Wie ersichtlich, zeigt sich unter diesen Reaktionsbedingungen in der Dauer von der 5. bis zur 30. Minute nur ein geringer oder ganz unerheblicher Abfall der optischen Dichte. Die vorkommenden Abweichungen der optischen Dichte werden hauptsächlich den normalen statistischen Abweichungen der Versuchsergebnisse zugeschrieben.
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E, Beispiel 1A wurde mit einer 0,2N Natriumhydroxidlösung anstelle der 0,75N Natriumhydroxidlösung zum Lösen des Albuminproteins wiederholt.
Es wurden mehrere Proben jeder Albuminkonzentration hergestellt und die Absorbanz ^eder Mischung in oben beschriebener Weise gemessen; die Ergebnisse sind in Tabelle V aufgeführt.
Tabelle V
optische Dichte von Proteinlösungen bei unterschiedlicher Protenkonzentration (Mikrogramrn/0,2 ecm)
Zeit; Mikroframm/O,2 ecm 20 40 80 160
min 0,167 0,306 0,537 0,861
5 0 ,182 0,332 0,583 0,943
10 0 ,193 0,349 0,607 0,959
15 0 ,199 0,354 0,608 0,959
20 0 ,197 0,352 0,607 0,957
25 O ,198 0,355 0,607 0,954
30
Unter.diesen Reaktionsbedingungen ist es zweckmäßig, nach dem Mischen der Reaktionsteilnehmer mindestens etwa 15 Minuten zu warten, bevor man die photometrische Ablesung der Proteinkonzentration durchführt, weil die optische Dichte in einer Zeit von etwa 15 Minuten auf ihr Maximum ansteigt, was zeigt, daß die Reaktion bis dahin nicht beendet ist. Dann bleibt die Reaktionsmischung längere Zeit stabil und ist somit ein geeignetes Reaktionssystem, wenn es gewünscht wird, die Reaktionsmischung über längere Zeit aufrechtzuerhalten.
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F. Beispiel 1A wurde nochmal mit einer O,1N Natriumhydroxidlösung anstelle der zum Lösen des Alburainproteins verwendeten O,75N Lösung wiederholt.
Es wurden mehrere Proben jeder Albuminkonzentration hergestellt und die Absorbanz jeder Mischung in oben beschriebener Weise gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI aufgeführt.
Tabelle VI
optische Dichte von Proteinlösungen bei unterschiedlicher Proteinkonzentration (Mikrogramm/O,2 ecm)
Zeit; 20 Mikrograrnm/0,2 ecm 80 1bÜ
min 0,157 hO 0,498 0,852
5 0 ,164 0,289 0,529 0,907
10 0,177 0,300 0,562 0,956
15 0,185 0,320 0,590 0,983
20 0,192 0,337 0,598 0,985
25 0,195 0,346 0,602 0,985
30 0,350
Unter diesen Reaktionsbedingungen steigt die optische Dichte kontinuierlich innerhalb von etwa 30 Minuten oder mehr auf ihr Maximum und nivelliert sich dann unter Erzeugung einer praktisch maximalen Stabilität zur sorgfältigen Analyse oder Lagerung der Reaktionsmischung, wobei die maximale optische Dichte erhalten bleibt.
Beispiel 2
A. Limulus Amoebocytenlysat wurde hergestellt, indem die Amoebocytenzellen in dest., nichtpyrogenischem Viasser lysiert und die unlöslichen Anteile von der erhaltenen Lösung abfil-
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triert wurden. Wie in Beispiel 1 wurden alle Glaswaren und ähnliche, in diesem Beispiel verwendete Materialien durch trockene Wärme in einem Ofen bei 25O0C. A- Stunden pyrogenfrei gemacht, wobei auch die übrigen Vorsichtsmaßnahmen ergriffen wurden, um eine Sterilität aufrechtzuerhalten. Dann wurde die filtrierte Lösung zu einem trockenen Pulver lyophilisiert, und Anteile von 22 bis 30 mg (11 bis 13 mg Protein) des Pulvers wurden in Phiolen verschlossen.
Zur Verwendung in diesem Beispiel wurde jede Phiole mit 3 ecm einer Q,5-gew.-$bigen wässrigen Magnesiumchloridlösung zu einer Lösung rekonstituiert.
0,1 ecm dieser Lösung wurden mit 0,1 ecm Endotoxinlösurig (Difco E.CoIi Endoto;-;in) gemischt. Wie in der folgenden Tabelle VII gezeigt, wurden verschiedene Konzentrationen der Endotoxinlösung verwendet. Die Endotoxinlysatmiscbungen v/urden 1 Stunde bei 37°C. bebrütet und dann 5 bis 10 Minuten abkühlen gelassen.
Anschließend wurden die Endotoxinlysatröhrchen bei 12100 G 10 Minuten zentrifugiert, wobei die überstehende Flüssigkeit durch Absaugen entfernt wurde. Dann wurde 0,2 ecm 0,75N Natriumhydroxidlösung zugefügt.
Anschließend wurde jedem Röhrchen 1 ecm des oben beschriebenen Lowry-Kupferarbeltsreagenz zugefügt, wobei jedes Röhrchen 10 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen wurde.
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Danach wurde 0,1 ecm des oben beschriebenen Folin-Arbeitsreagenz unter heftigem Rühren mittels einer Vortex-Maschine zugefügt. Von dieser Zeit au wurde die optische Dichte wie oben wiederholt, jedoch bei 660 Nanometem, gemessen. Die Ergebnisse waren wie folgt:
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rabelle VU
optische Dichte von Limulus Proteinlösunsen nach Ausfällung durch verschiedene Endcitoxinkonzentrationen (/)
Zeit min
Picpgraiin/ccni (.jeweils 2 Proben) Ϋ ξ
ΟΓΫΛ 20°
50
Kontrolle (2 Proben)
10 0 ,915;0,806 0,616;0,635 0,437;0,445 0,250;0,276
15 0 t805;0,775 0,561;0,554 0,420;0,435 0,244;0,245
20 O,696;0,733 0,543;0,514 0,425;0,423 O,2O6;o,213
25 O ,669;0,667 O,509;0,505 0,335;0,373 0,204/0,220
30 0 ,685:0,657 0,462;0,464 0,293;0,310 0,197;0,165
35 0 ,οδδΓΟ^δΙ 0,412;0>421 0,307;0,276 0,164',0,171
40 0 ,579)0,558 0,392;0,413 0^265,-0,247 0.135J0,118
0,233;0,171 0>158;C,088
0,107;0,140 0,093,*0,140 O,13O;o,112 0,239)0,095
Wie ersichtlich, gibt es in der Zeit von 10 bis AO Minuten nach Zugabe des Folin-Arbeitsreagenz und Bildung des gefärbten Materials, was gemäß dem Lowry-Test die Anwesenheit von Protein anzeigt, einen erheblichen Verlust der optischen Dichte.
B. Beispiel 2A wurde wiederholt, wobei die Konzentration der zum Lösen des zentrifugierten Proteins verwendeten Natriumhydroxidlösung O.25N anstelle von 0,75N betrug. Es wurden mehrere Proben mit unterschiedlichen Endotoxinkonzentrationen hergestellt und die Absorbanz jeder Probe mit den folgenden
Ergebnissen gemessen:
Tabelle VIII
optische Dichte von Limulus Proteinlösungen riach Ausfüllung durch verschiedene Endotoxinkonzentrationen (Picogramm Endotoxin pro ecm)
negative
Zeit; Picoftramm/ccm (.jeweils 2 Proben) Kontrolle
min TÖö 50 Ϊ2 (2 Proben)
1,251; 1,032 0,856/0,800 0,365)0,370 0,224)0,198
1,297; 1,328 O,826;O,843 0,410/0,387 0,231/0,266
1,273; 1,291 0,864/0,855 O,407;O,452 0,270/0,237
.1,266; 1,287 O,873;O,888 0,507/0,420 O,238;Oj248
1,262; 1,295 O,919;O,936 O,235;o,393 0,238/0,255
1,237; 1,262 0,919/0,913 Ο,428ϊΟ,389 0,224/0,229
Wie ersichtlich, sind die Ergebnisse dieses Versuches ähnlich wie die von Beispiel 1D mit menschlichem Serumalbumin, wobei eine ähnliche Konzentration von 0,25N der Natriumhydroxidlösung zum Lösen des Albumins verwendet wurde. Bei diesen Ergebnissen bleiben die Kurven der optischen Dichte gegenüber der Zeit gewöhnlich in der Periode von 5 bis 30 Minuten flach. Im vorliegenden Versuch scheint die Kurve in mindestens einigen
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Fällen noch leicht anzusteigen, und zwar in ähnlicher Weise, die im vorhergehenden Beispiel für die stärker verdünnten Natriumhydroxidlösungen gezeigt.
C. Beispiel 2A wurde mit einer zum Lösen des zentrifugierten Proteins verwendeten Natriumhydroxidkonzentration von 0,3N anstelle von O,75N wiederholt. Es wurden mehrere Proben mit unterschiedlicher Endotoxinkonzentration hergestellt und die Absorbanz jeder Proben wie oben mit den folgenden Ergebnissen
gemessen:
Tabelle IX
optische Dichte von Limulus Proteinlösungen nach Ausfällung durch unterschiedliche Endotoxinkonzentrationen (PicoKramm Endotoxin pro ecm)
Zeit; Picogramm pro ecm (jeweils 2 Proben) neg.Kontr. min 100 pO TS (2 Proben)
5 O,921;O,938 0,465,'0^48S 0,259;0,303 O,180;O,189
10 O,924;O,929 O,484;O,502 O,318;O,286 O,212;O,180
15 O,924;O,897 O,485;O,483 O,259;O,268 O,200;O,212
20 · O,909>°,923 Ο,492;Ο,495 O,3O5;O73i9 O,i98;O,203
25 0,898)0,921 0,482-,0,47S 0,277^,27I O,187;Qj200
30 0,924>0,898 O,483;O,516 0,273;0,326 0
Wie ersichtlich, bleiben die Kurven der optischen Dichte gegen die Zeit über die Periode von 5 bis 30 Minuten allgemein flach, im Gegensatz zu den Ergebnissen von Beispiel 2A unter Verwendung einer höheren Natriumhydroxidkonzentration zum Lösen des Proteins.
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Claims (2)

  1. Patentansprüche
    Y- Verfahren zur photometrisGhen Bestimmung der Anwesenheit von Protein in einem unbekannten Material, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein in einer 0,1 bis 0,4N Natrium-
    (äquivalenten)
    hydroxid entsprechenden/Alkaiilösung löst, mit dem Protein einen proteinanzeigenden Komplex vom Lowry-Typ bildet und photometrisch auf Anwesenheit des proteinanzeigenden Komplexes analysiert«
  2. 2.- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex mit Folin-Ciocalteau-Phenol-Reagenz und Lowry-Kupferreagenz unter alkalischen Bedingungen gebildet wird.
    3·- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, -dadurch gekennzeichnet, daß als Alltalilösung eine 0,2 bis 0,4N Natriumhydroxidlösung verwendet wird.
    4,- Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Anwesenheit von Protein aus Limulus Lysat in einem unbekannten Material durch Bildung eines proteinanzeigenden Komplexes vom Lowry-Typ mit dem Protein unter alkalischen Bedingungen und photometrische Analyse auf Anwesenheit des proteinanzeigenden Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer ersten Stufe das Protein in einer 0,1 bis 0,4N Natriumhydroxid äquivalenten Alkalilösung löst, wodurch das proteinanzeigende Komplex eine verbesserte Stabilität zeigt.
    5·- Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex mit einem Folin-Ciocalteau-Phenol-Reagenz und einem Lowry-Kupferreagenz in Anwesenheit einer im wesentlichen 0,1N Natriumhydroxid äquivalenten Alkalilösung gebildet
    wird* 909819/0669
    ORIGINAL INSPECtED
    6,- Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
    daß die zum Lösen des Proteins verwendete Alkalilösung eine
    0,2 bis 0,3N Natriumhydroxidlösung ist.
    Der Patentanwalt:
    909819/0669
DE19782846408 1977-11-04 1978-10-25 Verfahren zur photometrischen bestimmung der anwesenheit von protein in einem unbekannten material Withdrawn DE2846408A1 (de)

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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5415797A (en) * 1977-06-14 1979-02-05 Seikagaku Kogyo Co Ltd Detection and measurement of toxin in cells
US4376819A (en) * 1979-09-14 1983-03-15 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Biological extracts and method for making same
US4276050A (en) * 1980-01-10 1981-06-30 Abbott Laboratories Method for systemic endotoxin detection
IL59383A (en) * 1980-02-14 1983-03-31 Technion Res & Dev Foundation Micromethod for the determination of endotoxins with limulus amebocyte lysate
GB8912787D0 (en) * 1989-06-02 1989-07-19 Alam Aftab Protein assay system
GB9017880D0 (en) * 1990-08-15 1990-09-26 Cambridge Innovation Brokers Assay
GB9026822D0 (en) * 1990-12-11 1991-01-30 Alam Aftab Protein assay method and kit
DE69233570T2 (de) * 1991-09-09 2006-07-27 Canon K.K. Quantitativer Nachweis von Verbindungen in Coexistenz im System mit anderen Verbindungen
US20050048655A1 (en) * 2003-04-18 2005-03-03 Novitsky Thomas J. Kit for detecting endotoxin
US20050026239A1 (en) * 2003-04-18 2005-02-03 Associates Of Cape Cod, Inc. Kit for detecting endotoxin in aqueous solutions
CN104297182B (zh) * 2014-10-21 2017-01-18 南京大学 一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2897058A (en) * 1957-05-08 1959-07-28 Galat Alexander Albumin detecting method and means
US3558278A (en) * 1967-12-26 1971-01-26 Baxter Laboratories Inc Determination of albumin
US3915805A (en) * 1970-05-25 1975-10-28 Univ Johns Hopkins Quantitative detection of endotoxin in biological fluids
US3954663A (en) * 1972-12-18 1976-05-04 Teikoku Horinine Mfg. Co. Ltd. Process for the preparation of Limulina lysate
US3884637A (en) * 1973-03-21 1975-05-20 Pierce Chemical Co Method and composition for the determination of albumin
US3873272A (en) * 1974-02-20 1975-03-25 Baxter Laboratories Inc Reagent and method for albumin determination
US3944391A (en) * 1974-12-27 1976-03-16 Preventive Systems, Inc. In vitro process for detecting endotoxin in a biological fluid
US4038029A (en) * 1976-01-20 1977-07-26 Worthington Biochemical Corporation Limulus lysate turbidity test for pyrogens
US4023933A (en) * 1976-06-10 1977-05-17 The University Of Georgia Protein-assay reagent and method
US4038147A (en) * 1976-06-15 1977-07-26 Becton, Dickinson And Company Method for detecting endotoxins

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US4104030A (en) 1978-08-01

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