DE3137887A1 - Verfahren zum produzieren von bakterien mit hoher nitrilaseaktivitaet - Google Patents
Verfahren zum produzieren von bakterien mit hoher nitrilaseaktivitaetInfo
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1. NITTO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD., TOKYO / JAPAN
2. MITSUBISHI RAYON CO., LTD., TOKYO / JAPAN
Verfahren zum Produzieren von Bakterien mit hoher Nitrilaseaktivität
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung von Bakterien mit hoher Nitrilaseaktivxtat.
Mit dem Fortschreiten der Verwendung vom immobilisierten Enzymen und immobilisierten Mikroben, sind zahlreiche
Versuche unternommen worden, Mikroben oder Enzyme als Katalysatoren für verschiedene Reaktionen zu verwenden
.
Nitrilase ist als ein Enzym bekannt, welches Nitrile unter Bildung der entsprechenden Amide hydratisiert. Als
typisches Beispiel für eine solche Umsetzung, bei der Bakterien vom Genus Corynebakterium und Genus Nocardia
verwendet werden, findet sich in der US-PS 4 248 968 und Bakterien vom Genus Bacillus und Genus Bacteridium
im Sinne von Prevot, vom Genus Micrococcus und vom Genus Brevibakterium im Sinne von Bergy werden in US-PS
4 001 081 als solche, die eine Nitrilaseaktivität aufweisen und die Acrylnitril unter Bildung von Acrylamid
hydratisieren, erwähnt.
Gründliche Untersuchungen zum Auffinden eines Verfahrens zur Bildung von Bakterien mit hoher Nitrilaseaktivität
in hohen Ausbeuten, um diese Enzymquellen industriell zu erschliessen, haben nun dazu geführt,
dass festgestellt wurde, dass die Ausbeute an Nitrilase erheblich erhöht wird, wenn man die vorerwähnten Bakterien
in einem Kulturmedium inkubiert, welches eine wasserlösliche Eisenverbindung enthält. Die Erfindung
betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Bakterien mit hoher Nitrilaseaktivität und ist dadurch gekennzeichnet,
dass man Bakterien, die in der Lage sind, Nitrilase zu bilden, in einem eine wasserlösliche Eisenverbindung
enthaltenden Kulturmedium inkubiert.
Als crfindungsgemäss geeignete Bakterien kommen alle
solche, unabhängig von ihrer taxonomischen Klassifizierung, in Frage, die die Fähigkeit haben, Acrylnitril unter
Bildung von Acrylamid zu hydratisieren. Bevorzugte Beispiele sind Corynebakterium Stamm N-771 (Hinterlegungs:nummer
FERM 4445) , Corynebakterium Stamm N-774 (FERK 4446) und Nocardia Stamm N-775 (FERM 4447), die in
der vorerwähnten US-PS 4 240 968 genannt werden.
Die erfindungsgemäss verwendete wasserlösliche Eisenverbindung
kann ein anorganisches oder organisches Eisensalz oder eine Organo-Eisen-Komplexverbindung
sein. Beispiele für anorganische Salze sind Sulfate, Hydrochloride und für organische Salze Acetate und
Fumarate von zweiwertigem Eisen oder dreiwertigem Eisen, sowie Organo-Eisen-Komplexverbindungen aus Zitronensäure,
Bernsteinsäure, Ethylendiamintetraessigsäure oder Nitrilotriessigsäure und Eisen. Besonders bevorzugt
zur Erhöhung der Enzymaktivität von Bakterien sind Organo-Eisen-Komplexverbindungen, so dass das
Eisen in dem Kulturmedium als organische Komplexverbindung vorliegt. Die Menge an diesen Eisenverbindungen,
die dem Kulturmedium zugeführt werden, beträgt im allgemeinen wenigstens 0,2 mg/1, vorzugsweise
0,2 bis 500 mg/1 und insbesondere 1 bis 100 mg/1, berechnet als Eisen, obwohl man eine Wirkung auch schon
mit Mengen von weniger als 0,2 mg/1 beobachtet.
Die Erfindung kann durchgeführt werden, indem man einen Stamm der vorerwähnten Bakterien inkubiert und
dabei ein Kulturmedium verwendet, das Kohlenstoffquellen, wie Glukose, Maltose und Saccharose, enthält
und Stickstoffquellen, wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Harnstoff, organische
Nährmittel, wie Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Kaseinhydrolysat und Pepton und dergleichen,
und das anorganische Nährstoffe enthält, wie Phosphorsäuresalze, Kaliumsalze, Magnesiumsalze und andere
Metallsalze als in geringfügigen Mengen erforderliche Nährstoffe. Zu diesen gibt man dann eine wasserlösliche
Eisenverbindung der vorerwähnten Art um die Nitrilaseaktivität der Bakterien dadurch zu erhöhen. Die
Kultivierung wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 25 bis 300C, einem pH-Wert zwischen 5 und 8 unter
aeroben Bedingungen während 30 bis 100 Stundaidurchgeführt.
Die Erfindung wird nachfolgend ausführlich in den Beispielen erläutert.
Zum Messen der Nitrilaseenzymaktivität zum Hydratisieren
von Acrylnitril wird folgende Methode angewendet: Bakterien wurden aus dem Kulturmedium mit 0,05M
Phosphat abgetrennt und mit einer 0r05M Phosphatpuff orlösung (pH 7,5) gewaschen, wobei man gewaschene
Baktcrienzellen erhielt. Diese wurden als Enzymquelle verwendet und eine geeignete Menge einer Enzymlösung
(gewaschene Zellen: 1 bis 5 mg) wurde zu 5 ml einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,5), enthaltend 2,5 %
Acrylnitril, gegeben. Nachdem die vorerwähnte Phosphatpufferlösung
bis zu einer Gesamtmenge von 10 ml zugegeben worden war, wurde 10 Minuten bei 1O0C umgesetzt.
Das bei dieser Umsetzung gebildete Acrylamid wurde quantitativ mittels Gaschromatografie gemessen und das
Gewicht in mg an Bakterien, die 1 μπιοΐ/min an Acrylamid
unter den vorerwähnten Bedingungen bildeten, wurde als eine Einheit bewertet.
Die Prozentangaben in den Beispielen sind auf das Gewicht bezogen.
Ein Grundmedium (pH 7,5) aus 1 % Glukose, 0,5 % (NH4J3SO4, 0,1 % KH2PO4, 0,1 % MgSO4-7H2O, 0,01 %
NaCl, 0,01 % CaCl2'2H2O, 0,000004 % CuSO4-SH2O, 0,00001 %
KJ, 0,00002 % FeCl3-OH3O, 0,00004 % MnSO4-4H3O, 0,00002 %
Na3MoO4-2H2O, 0,00004 % ZnSO4-OH2O, 1 % Casaminosäure
(hergestellt von Difco Laboratories in USA) und 0,0002 % Thiaminhydrochlorid wurde in mittelgrosse
Reagenzgläser in einer Menge von jeweils 10 ml eingefüllt. Dazu wurde Ferrosulfat oder Ferrisulfat in einer
Menge zwischen 0 und 500 mg/1, als lösliches Eisen berechnet, in den in Tabelle 1 angegebenen Mengen gegeben
und dieso hergestellten Proben wurden 15 Minuten bei 1200C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde sterilisiertes
CaCO3 in einer Menge von 2 % zur Einstellung des
pH-Wertes zugegeben. Dazu wurden 0,05 ml eines Kulturmediums von Corynebakterium Stamm N-774 (FERM Nr. 4446),
das zuvor mit dem vorerwähnten Kulturmedium (enthaltend 0,001 % Ferrosulfat) inkubiert worden war, gegeben und
die Kultivierung wurde unter Schütteln während 3 Tagen bei 300C durchgeführt. Nach Beendigung der Kultivierung
wurden die Bakterien mittels einer Zentrifuge abgetrennt und mit einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH
7,5) gewaschen. Mit den gewaschenen Bakterienzellen wurde dann die Nitrilaseenzymaktivität zum Hydratisieren
von Acrylnitril gemessen und die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Aus Tabelle 1 geht hervor, dass
in dem Fall, dass eine wasserlösliche Eisenverbindung nicht zu dem Grundkulturmedium gegeben worden war, eine
Enzymbiidung kaum stattfand, obwohl das Bakterienwachstum
gut war. Es ist auch ersichtlich, dass die Enzymaktivität der Bakterien erheblich in Gegenwart einer
wasserlöslichen Eisenverbindung, wo~ durch eine grosse Menge an Enzym im Inneren
der Bakterien gebildet wurde, ansteigt.
Ein Grundkulturmedium wie-in Beispiel 1 wurde in vier
mittelgrosse Reagenzgläser in Mengen von jeweils 10 ml
eingefüllt. Dazu wurde Nichts, Ferrosulfat, Ferrizitrat
und Katriurrethylendiamintetraessigsäure-Eisenkomplex jeweili
gegeben und dann wurde 15 Minuten bei 120°C sterilisiert.
Nach dem Abkühlen wurde sterilisiertes CaCO-in einer Menge von 2 % zugegeben, um den pH einzustellen
und dann wurden 0,05 ml eines Kulturmediums von Corynebakterium Stamm N-774 (FERM Nr. 4446), wie in Beispiel
1 angewendet, zugegeben. Die Kultivierung wurde unter Schütteln während 3 Tagen bei 300C durchgeführt.
Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Bakterien wie in Beispiel 1 abgetrennt und die Enzymaktivität wurde
ebenr.o wie in Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse wer-
den in Tabelle 2 gezeigt. ■
Aus Tabelle 2 geht hervor, dass die Ausbeute an Enzym
in Gegenwart von den in einem Kulturmedium, dem eine wasserlösliche Eisenverbindung zugegeben worden war,
inkubierten Bakterien erheblich ansteigt, im Vergleich zu dom Fall, dass die Bakterien in einem Kulturmedium
ohne Zugabe inkubiert worden waren. Daraus geht hervor,
dass die Gegenwart des Eisenions in Form einer organischen Komplexverbindung besonders wirksam ist.
Ein Kulturmedium (pH 7,5), enthaltend 1,0 % Glukose, 0,5 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt und o,3 % Malzextrakt, wurde
in sechs Reagenzgläser in Mengen von jeweils 10 ml eingefüllt. Ferrosulfat wurde zu drei der Gläser in einer
Menge von 2 mg/1 als lösliches Eisen gegeben und dann wurde 15 Minuten bei 1200C sterilisert. Nach dem Kühlen
wurden 0,05 ml eines Kulturmediums von Coryncbakterium Stamm N-774 (FERM Nr. 4446) , Nocardiastamm N-775 (FERM
Nr. 4447) oder Brevibakterium imperial IAM 1654, die
durch vorherige Inkubierung erhalten worden v/aren (unter Verwendung des vorerwähnten Kulturmediums, zu dem eine
wasserlösliche Eisenverbindung nicht zugegeben worden war) zu den Reagenzgläser gegeben und die Kultivierung
wurde unter Schütteln während 48 Stunden bei 300C durchgeführt.
Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Bakterien abgetrennt und die Enzymaktivität wurde wie in
Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.
Aus Tabelle 3 geht hervor, dass die in einem Kulturmedium, dem eine wasserlösliche Eisenverbindung zugegeben
worden war, inkubierten Bakterien eine erhöhte Enzymaktivität im Vergleich zu solchen Bakterien aufwiesen,
- 10 -
die im gleichen Kulturmedium aber ohne Zugabe einer wasserlöslichen Eisenverbxndung inkubiert worden waren
und dass sich eine grosse Menge an Enzym im Innerender Bakterien bildete.
| wasserlösli Reagenz |
ehe Eisenverbxndung zugegebene Menge (Fe-Ion mg/1) |
Zellwachs tum (mg/ml) |
Enzymakti vität (Einheit/ mg Zelle) |
| keine Zu gabe (Kon trolle) |
5,29 | 0,1 | |
| Ferrosulfat | 0,05 | 4,83 | 0,2 |
| 0,2 | 5,08 | -3,9 | |
| 0,5 | 5,16 | 25,9 | |
| 1,0 | 5,66 | 36,4 | |
| 2,0 | 5,33 | 38,7 | |
| 10 | 5,66 | 38,6 | |
| 20 | 5,82 | 43,7 | |
| 100 | 5,58 | 43,0 | |
| 200 | 5,58 | 43,1 | |
| 500 | 5,33 | 42,8 | |
| Ferrisulfat | 1,0 | 5,08 | 38,4 |
| 2,0 | 5,29 | 40,6 | |
| 10 | 5,16 | 42,2 |
- 11 -
| Wasserlösliche Reagenz |
Eisenverbindung zugegebene Menge (Fe-Ion mg/1) |
Zellwachs tum (mg/ml) |
Enzymakti vität (Einheit/ mg Zelle) |
| keine Zugabe (Kontrolle) |
5,29 | 0,1 | |
| Ferros-lfat | 10 | 5,66 | 38,7 |
| Ferrizitrat | 11 | 5,66 | 53,3 |
| Natriumethylcn- diamintetraes- sigsäure- Eisenkomplex |
16 | 5,33 | 54,4 |
| Mikroorganis mus |
Menge an zuge gebenem Ferro- sulfat (Fe-Ion mg/1) |
Zellwachs tum (mg/ml) |
Enzymakti vität (Einheit/ mg Zelle) |
| Corynebakte- rium N-774 |
0 | 5,37 | 23,9 |
| 2 | 5,34 | 38,2 | |
| Nocardia N-775 | 0 | 4,96 | 7,8 |
| 2 | 5,04 | 15,2 | |
| Brevibacterium imperial |
0 2 |
4,63 4,54 |
0,3 1,5 |
Claims (5)
1. NITTO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD., TOKYO / JAPAN
2. MITSUBISHI RAYON CO., LTD., TOKYO / JAPAN
Verfahren zum Produzieren von Bakterien mit hoher Nitrilaseaktivität
PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Produzieren von Bakterien mit hoher
Nitrilaseaktivität, bei dem man Bakterien mit der Fähigkiet, Nitrilase zu bilden, inkubiert, dadurch
gekennzeichnet , dass man ein Kulturmedium,
enthaltend eine wasserlösliche Eisenverbindung, in einer Menge von wenigstens 0,2 mg/1,
berechnet als Eisen, verwendet.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η 1Q
zeichnet, dass die wasserlösliche Eisenverbindung ein anorganisches oder organisches
Eisensalz oder eine Organo-Eisen-Komplexverbindung
ist.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet,
dass die wasserlösliche Eisenverbindung in dem Kulturmedium in einer Menge von 0,2 bis 500 mg/1, berechnet als Eisen, vorhanden
ist.
4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubierung bei
einem pH von 5 bis 8 durchführt.
5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet,
dass die wasserlösliche Eisenverbindung in dem Kulturmedium in einer Menge von 1 bis 100 mg/1, berechnet als Eisen, vorliegt.
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP55135120A JPS594987B2 (ja) | 1980-09-30 | 1980-09-30 | ニトリラ−ゼ活性の高い細菌菌体の製造法 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| DE19813137887 Granted DE3137887A1 (de) | 1980-09-30 | 1981-09-23 | Verfahren zum produzieren von bakterien mit hoher nitrilaseaktivitaet |
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1981
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- 1981-09-30 US US06/307,268 patent/US4390631A/en not_active Expired - Fee Related
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