DE3333246A1

DE3333246A1 - Verfahren zur herstellung von l-phenylalanin

Info

Publication number: DE3333246A1
Application number: DE19833333246
Authority: DE
Inventors: Wayne Elliott 21045 Columbia Swann, Md.
Original assignee: Genex Corp
Current assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-10-01
Filing date: 1983-09-14
Publication date: 1984-04-05
Also published as: CA1206435A; AU1864883A; PL243972A1; ES526165A1; SE8305151L; BE901938R; IL69672A0; FI833552L; BR8305366A; CH658670A5; JPS5991890A; FR2533941B1; GB8325797D0; ZA836626B; FI833552A0; NL8303369A; LU85019A1; GR79053B; BE897889A; DK452783A

Description

GENEX CORPORATION, ROCKVILLE, MARYLAND / USA

Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin aus einer Phenylalanin-ammoniaklyase (PAL)-katalysierten Umsetzung von t-Zimtsäure und Ammoniak. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin, bei dem eine hohe Aktivität des PAL-Katalysators beibehalten und der Katalysator wiederverwendet werden kann.

L-Phenylalanin ist eine essentielle Aminosäure, die für die Ernährung und auf medizinischem Gebiet wichtig ist. L-Phenylalanin ist technisch aus einer Anzahl von Proteinen, exnschliesslich Ovalbumin und Lactalbumin, isoliert worden. Bei einem bekannten Laboratoriums verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin verwendet

man das Enzym Phenylalanin-ammoniak-lyase (nachfolgend zu PAL abgekürzt), um die umkehrbare Umsetzung: L-Phenyalanin ■> trans-Zimtsäure + Ammoniak (GB-PS 1 489 468, 19. Oktober 1977) zu katalysieren. 5

Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt im allgemeinen bei 80:20 zugunsten der t-Zimtsäure und zahlreiche Versuche sind unternommen worden, um ein hohes Niveau für die Umwandlung in L-Phenylalanin zu erreichen. In GB-PS 1 489 468 wird offenbart, dass man eine Ausbeute an L-Phenylalanin, die der theoretischen 20 %-igen nahe kommt, erreicht, wenn man grosse Mengen an Zellen verwendet, die den PAL-Katalysator enthalten, sowie einen überschuss an Ammoniumionen.

Bei diesem Verfahren besteht die Quelle der Ammoniumionen vorzugsweise aus Ammoniumchlorid und die Umsetzung wird vorzugsweise bei einem pH zwischen 8,5 und 9,7 durchgeführt.

Yamada S., et al, Appl. Environ. Microbiol., 42:773-78 (1981), berichtet, dass man die Umwandlungsausbeute auf mehr als 70 % erhöhen kann, wenn man den pH der Substratlösung auf 10,0 mit Salzsäure einstellt. Diese Bedingungen sind jedoch so gravierend, dass die PAL-Aktivität der wiedergewonnenen Zellen stark vermindert wird, so dass die Wiederverwendung des Enzyms in der Praxis nicht möglich ist. Darüber hinaus haben Yamada et al festgestellt, dass die Immobilisierung des zellularen Enzyms keinen Vorteil gegenüber der Verwendung von intakten Zellen ergibt. Obwohl man zwar am Anfang des Verfahrens L-Phenylalanin in hohen Konzentrationen erhalten kann, wird das Verfahren dadurch,

dass man das katalytische Enzym nicht wiederverwenden kann, unwirtschaftlich für eine grosstechnische Anwendung.

Es besteht somit ein Bedürfnis zur Herstellung von L-Pheny!alanin aus t-Zimtsäure und Ammoniak, bei dem man eine hohe Ausbeute an L-Phenylalanin erzielt und das PAL eine ausreichende katalytische Aktivität beibehält, so dass man es wiederverwenden kann.

Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin aus t-Zimtsäure zur Verfügung zu stellen, bei dem man das Produkt in hohen Konzentrationen erhält und man das PAL-Enzym wiederholt verwenden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin zu zeigen, bei denen man die Umsetzung entweder in einem zellfreien diskontinuierlichen System oder in einem System mit immobilisierten Zellen oder Enzymen durchführen kann.

Verbunden mit dieser Aufgabe ist es auch, ein wirtschaftliches Verfahren zur Verwendung von PAL bei der Herstellung von L-Phenylalanin zu zeigen.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Umsetzen von t-Zimtsäure und Ammoniak in Gegenwart von Phenylalanin-ammoniak-lyase wurde dahingehend verbessert, dass man hohe Ausbeuten an L-Phenylalanin erhält und dass die PAL eine hohe

katalytische Aktivität beibehält. Unter kontrollierten ümsetzungsbedingungen wird die Stabilität von PAL derart erhöht/ dass man es wiederholt zur Herstellung von L-Thenylalanin in hohen Konzentrationen verwenden kann.

Um dieses Ergebnis zu erreichen, wird die Substratlösung hergestellt, indem man t-Zimtsäure mit einer Quelle für Ammoniumionen umsetzt. Die Ammoniumionenquelle kann jedes nicht-halogenhaltige Ammoniumsalz sein. Der pH der Substratlösung wird auf einen Bereich von etwa 8,0 bis 10,0 unter Verwendung einer nichthalogenhaltigen Säure eingestellt und dann gibt man die Lösung zu einer PAL-Quelle, z.B. aus einem System aus freien intakten Zellen oder einem System aus immobilisierten Zellen oder Enzymen, die PAL enthalten.

Erfindungsgemäss wird eine Substratlösung aus t-Zimtsäure und eine Ammoniumionenquelle hergestellt. Die Ammoniumionenquelle kann entweder direkt durch Zugabe eines Ammoniumsalzes aus entweder einer organischen Säure oder einer Mineralsäure zu der t-Zimtsäure eingeführt werden oder man stellt sie in der Substratlösung her, indem man Ammoniumhydroxid und eine nichthalogenhaltige Säure vermischt.

In GB-PS 1 489 468 wird beschrieben, dass eine bevorzugte Quelle für Ammoniumionen eine Mischung aus Ammoniumchlorid und Ammoniumhydroxid ist (Seite 3, Zeilen 25 bis 26). Bei dem Verfahren gemäss Yamada et al verwendet man Ammoniumchlorid. Im Gegensatz zu

diesen Lehren wurde nun festgestellt, dass es vorteilhaft ist, wenn das Ammoniumsalz keine Halogenionen enthält. Es wurde gefunden, dass die Gegenwart von Halogen in den Substratlösungen die katalytische Aktivität von PAL hemmt. Deshalb sind bevorzugie Ammoniumsalze Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumeitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat. Ein besonders bevorzugtes Ammoniumsalz ist Ammoniumsulfat.

Es ist auch wünschenswert, dass man das Ammoniumsalz zu der Substratlösung in einer hohen Konzentration gibt. Die Konzentration der Ammoniumionen liegt im allgemeinen bei 0,1 bis 7,5M und vorzugsweise etwa 1 bis 5M. Die hohen Konzentrationen an Ammoniumsalz erhöhen die Konzentration an Ammoniak in den System und wirken auch als Puffer, so dass man die pH-Einstellung bei der Umsetzung einfacher kontrollieren kann.

Liegt die Konzentration an Ammoniumionen innerhalb der angegebenen Bereiche, dann beträgt die Konzentration an t-Zimtsäure in der Lösung im allgemeinen etwa 30 bis etwa 200 mMol und vorzugsweise etwa 60 bis etwa '150 mMol.

Yamada et al haben gelehrt, dass die Substratlösung auf einen pH von 10,0 eingestellt werden sollte. Beim erfindungsgemässen Verfahren kann man den pH jedoch auf einen Bereich von etwa 8 bis etwa 10 einstellen und vorzugsweise auf einen Bereich von etwa 8,5 bis

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etwa 9,5. Weiterhin wird in dem Bericht von Yamada gelehrt, dass man den pH der Substratlösung mit Salzsäure einstellen soll. Dadurch werden erhebliche Mengen an Chlorid in das Substrat eingebracht. Bei der vorliegenden Erfindung jedoch wird der pH der Substratlösung mit einer nicht-halogenhaltigen Säure eingestellt. Bevorzugte Säuren zum Einstellen des pH's sind Schwefelsäure, Phosphorsäure und Essigsäure, obwohl man auch andere nicht-halogenhaltige Säuren verwenden kann. Eine ganz besonders bevorzugte Säure ist Schwefelsäure, weil diese bei der Zugabe der Ammoniumhydroxid enthaltenden Substratlösung unter Ausbildung von Ammoniumsulfat reagiert, welches ein bekanntes enzymstabilisierendes Mittel ist.

Die Substratlösung gibt man zu der PAL enthaltenden Kulturbrühe, den abgetrennten Zellen davon oder dem isolierten Enzym. Das PAL wird nach üblichen aus dem Stand der Technik bekannten Methoden hergestellt.

Die PAL-katalysierte Umsetzung erfolgt unter L-Phenylalanin-bildenden Bedingungen, bei denen man vorzugsweise eine Reaktionstemperatür von etwa 10 bis etwa 45⁰C wählt. Unter den erfindungsgemässen Bedingungen wird die Stabilität von PAL erhöht, so dass man sie wiederholt zur Herstellung von L-Phenylalanin in hohen Konzentrationen verwenden kann.

Beim erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin kann man entweder ein System mit einem Ansatz aus freien Zellen oder mit immobilisierten Zellen oder einem Enzymsystem verwenden. Bei dem

Ansatzsystem handelt es sich um ein einfaches diskontinuierliches oder kontinuierliches System. Wird die PAL in einer Säule immobilisiert, so kann man die Säule durch einen einfachen Durchgang in Betrieb nehmen oder man kann im Kreislauf fahren oder ein kontinuierliches zugeführtes Kreislaufsystem anwenden. Ein bevorzugtes Verfahren zum immobilisieren des PAL-Enzyms oder der Zellen, welche das Enzym enthalten, wird in der US-Patentanmeldung Serial-Nr.

400 141 vom 20. Juli 1982 offenbart. Werden die PAL-Enzyme oder Zellen, welche das Enzym enthalten, in einer Säule immobilisiert, dann wird die Säule im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 10 bis etwa 4O⁰C und vorzugsweise etwa 18 bis etwa 3O⁰C gehalten, während man die Substratlösung durch die Säule hindurchpumpt .

Das Reaktionsgemisch wird durch übliche Methoden, wie sie bei der L-Phenylalanin-Produktion bekannt sind, . analysiert. Verwendet man Schwefelsäure anstelle von Salzsäure in der Substratlösung, dann wird das L-Phenylalanin in etwa einer 8-bis 10-fachen Menge der Menge produziert, die man erhält, wenn man Salzsäure verwendet. Ist das PAL-Enzym immobilisiert worden, dann werden annähernd 50 % der Aktivität nach 41-tägiger Betriebszeit beibehalten. Dies steht im Gegensatz zu der 20 %-igen Aktivitätsbeibehaltung nach 24 Stunden, wie sie von Yamada et al berichtet wird.

Das L-Phenylalanin kann aus dem Reaktionsgemisch durch übliche Verfahren isoliert werden.

Die nachfolgenden Beispiele beschrieben die Erfindung ohne sie zu limitieren.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium wurde wie folgt hergestellt:

Zu 1 1 entionisiertem Wasser werden 10g Pepton, 10g Hefeextrakt, 0,5 g D, L-Phenylalanin, 5 g Natriumchlorid und 5 g L-Isoleucin gegeben. Der pH der Lösung wird mit Schwefelsäure auf 6,0 eingestellt und dann erfolgt während 10 Minuten eine Autoklavenbehandlung bei 12O⁰C und 1,05 bar (15 psi). Dies ergibt dann ein Standardeinleitungsmedium für Kulturröhrchen und Schüttelkolben.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man zum Medium jedoch 100 mMol Kaliumjodid (KJ) zugibt. Dies ergibt ein hohes Einleitungsselektionsmedium (high inducing selection medium).

Beispiel 3

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt,

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wobei man jedoch 200 mMol Kaliumjodid zu dem Medium gibt. Auch hierdurch erhält man ein hohes Einleitungs· selektionsmedium.

Beispiel 4

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man jedoch 15 g Hefeextrakt verwendet und Pepton weglässt. 200 mMol Kaliumjodid werden erhalten und hierdurch erhält man ein hohes Einleitungsschüttelkolben-Produktionsmedium.

Beispiel 5

Ein Fermentationsmedium wird nach dem Verfahren von Beispiel 4 hergestellt, wobei jedoch Natriumchlorid und L-Isoleucin fortgelassen wurden. Hierdurch erhält man ein hohes Einleitungsfermentationsproduktionsmedium,

Beispiel 6

Drei Kulturmedien wurden wie in Beispiel 1, 2 und 3 hergestellt. Ein PAL-produzierender Stamm Rhodotorula rubra (ATCC Nr. 4056), der über Nähragar "Slants" erhalten wurde, wurde zum Okulieren von 4,5 cm³ der

Reagenzglaskulturen verwendet. Die Gläser wurden dann in eine Schüttelvorrichtung bei 30⁰C mit 250 üpm gestellt. Sieben Übertragungen (0,2 cm³) aus jedem Reagenzglas wurden nach 24 oder 48 Stunden zu 4,5 ml frischem Kulturmedium durchgeführt. KuItürröhrchen wurden verwendet, um 200 cm³ des Mediums in 1000 ml-Schüttelkolben zu inokulieren. Nach 30 Stunden und nach 54 Stunden wurde 1 Kolben eines jeden Mediums abgeerntet. Die Zellausbeute nach .30 Stunden betrug im Durchschnitt 14 g Paste/1 und nach 54 Stunden durchschnittlich 29 g Paste/1. Die PAL-Aktivität von dem Ansatz mit 100 mMol Kaliumjodid war um 31 % höher als beim Kontrollversuch. Die PAL-Aktivität bei dem Absatz mit 200 mMol Kaliumjodid war um 39 % höher als beim Kontrollversuch.

Beispiel 7

Die allgemeine Verfahrensweise von Beispiel 6 wurde in dem 200 mMol Kaliumjodid hohen 'Einleitungsmedium zum Züchten von R. rubra-Zellen durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 25 Selektionsübertragungen der 200 mMol Kaliumjodidkultur durchgeführt wurden. 24 Stunden nachdem der Schüttelkolben inokuliert worden war, wurden 2,5 % des Mediums zum Inokulieren von 15 frischen Schüttelflaschen (Endflaschen (final flask)) verwendet und nach 24-stündiger Kultivierung wurden die Kolben abgeerntet. Die Zellausbeuten und die PAL-Aktivität wurde bei einigen der Kolben und bei dem

letzten gepoolten Zeilpastenprodukt festgestellt. Die höchste PAL-Aktivität in einem 28,7 g Paste/Liter-Medium betrug 18,4 U/Paste (25 U PAL/1). (1 Einheit = 1 Mol L-Phenylalanin, umgewandelt in t-Zimtsäure und Ammoniak/Min bei 30⁰C) . Die Aktivität wurde bestimmt, indem man die Methode von Kalghatgi und Subba Rao, Biochem. J. 149:65-72 (1975) , modifizierte. Das letzte gepoolte Zellprodukt enthielt 15,0 Einheiten PAL/g Paste bei 27 g Paste/1 Durchschnittszellausbeute (405 U PAL/1).

Beispiel 8

Eine Substratlösung aus zimtsaurem Ammonium wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt. Zimtsäure wurde zu Ammoniumhydroxid (28 %) bis zur Auflösung gegeben. Dann wurden Wasser und Säure zugegeben um das Substratvolumen bzw. den pH einzustellen. Die Zimtsäurekonzentration, die Ammoniakkonzentration und der pH (Mengender zugegebenenen Säure)variieren in den nachfolgenden Beispielen und deshalb verändert sich auch die Menge des gebildeten Ammoniumsalzes.

Beispiel 9

Die Wirkung von hohen Konzentrationen an Halogen auf PAL wurde untersucht, indem man verschiedene Säuren

zum Senken des pH-Wertes der Substratlösung verwendete. Zwei Substrate wurden nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 8 hergestellt (60 mMol CA; 7,5M NH₃; pH 10,0). Lösung A wurde unter Verwendung von Salzsäure auf den pH eingestellt und die Lösung B wurde unter Verwendung von Schwefelsäure eingestellt. R. rubra-Zellen, die wie in Beispiel 4 kultiviert worden waren, wurden in einem gerührten, mit einem Wassermantel versehenen Becherglas bei 30⁰C vorgelegt. Von Zeit zu Zeit wurden Proben genommen und auf L-Phenylalanin untersucht, unter Verwendung von Dünnschichtchromatografie und einem enzymatischen Assay von L-Aminosäureoxidase. Es wurde festgestellt, dass Substratlösung A (enthaltend Ammoniumchlorid) das PAL-Enzym inhibierte. Die Zellen in der Substratlösung B produzierten die 10-fache Menge an L-Phenylalanin (nach 24-stündiger Umsetzung) als die Zellen in der Substratlösung A.

Beispiel 10

Das allgemeine Verfahren gemäss Beispiel 9 wurde wiederholt, wobei man Phosphorsäure und Schwefelsäure verglich. Die R. rubra-Zellen in dem mit Phosphorsäure pH-regulierten Substrat bildeten 90 % der Menge an L-Phenylalanin, die man mit einem Substrat erhielt, bei dem man Schwefelsäure zum Anpassen des pH-Wertes verwendete.

Beispiel 11

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 9 wurde wiederholt unter einem Vergleich von Essigsäure und Schwefeisäure. In diesem Fall war die Menge an gebildetem L-Phenylalanin gleich.

Beispiel 12

Zellen wurden nach dem Verfahren von Beispiel 6 hergestellt. Diese Zellen wurden zur Untersuchung der Wiederverwendbarkeit (Stabilität) der Gesamtzellen verwendet. Es wurden 3 Substrate hergestellt aus 60 mMol t-Zimtsäure, 7,5M Ammoniak, wobei der pH mit Schwefelsäure auf 10,0, 9,0 bzw. 8,0 eingestellt wurde. Die Zellen (4,5 g Zellpaste) wurden in jedes Substrat (45 cm³) während 16 Stunden bei 30⁰C gegeben. Die L-Phenylalanin-Konzentration wurde durch ein L-Aminosäureoxidase-rAssay und Dünnschichtchromatografie bestimmt. Die Zellen wurden zentrifugiert, gewaschen und dann 16 Stunden in ein frisches Substrat gegeben. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle gezeigt.

PH	Ansatz I mg/ml L-PHE	Ansatz II mg/ml L-PHE	% Aktivitäts beibehaltung
8	0,22	0,12	55
9	0,95	0,78	82
10	2,02	0,43	21

Diese Ergebnisse zeigen, dass man bei einem pH von zwar die zweifache Anfangsaktivität gegenüber pH erhält, dass aber nach einem Ansatz die pH 9,0-Zellen eine um 163 % höhere Aktivität als die pH 10,0-Zellen hatten.

Beispiel

Ein 2 Wochen-Stabilitätstest wurde wie in Beispiel durchgeführt. Die pH-Werte im Reaktor wurden jedoch auf 8,75, 9,00 und 9,25 eingestellt und die Ammoniakkonzentration betrug 5,5M. Dieser 14 Tage-Test wurde mit sechs hintereinander durchgeführten Batch-Assays von freien R. rubra-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle gezeigt.

	mg an gebildetem L-Phenylalanin/h/g Trockengewicht Zellen (% der beibe haltenen Anfangsaktivität)	Reaktions-pH 9,00	9,25
Tage bei dem angege benen pH	8,75	5,7 3,8 (67) 3,5 (61)	5,7 4,2 (74) 4,0 (70)
1 7 14	5,9 3,6 (61) 3,5 (59)

Die Ergebnisse zeigen, dass unter geeigneten Bedingungen PAL wiederverwendet werden kann zur Herstellung von L-Phenylalanin und dass die Retentionsniveaus der Aktivität bei den freien Zellen hoch sind.

Beispiel 14

Die Zellpaste von Beispiel 7 wurde nach dem in US-Patentanmeldung Serial No. 400 141 beschriebenen Verfahren immobilisiert. Das Substrat (80 mMol; 4,8M NH

3'

pH 9,23) wurde durch eine Säule, die mit immobilisierten R. rubra-Zellen gefüllt war, von unten nach oben gepumpt. Die Fliessgeschwindigkeit variierte zwischen 0,1O₇ 0,25 und 0,50 SV^h"¹ bei 22⁰C und 0,25 und 0,50 SV¹¹"¹ bei 28⁰C. Der Abfluss wurde auf L-Phenylalanin

untersucht und die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle gezeigt.

Tempe ratur	Fluss (SVh-1)	gebilde tes L-PHE	Produktivi tät (g/l/h)
CN OO CM CM	0,10 0,25 0,50 0,25 0,50	5,4 2,7 2,1 3,8 2,8	0,54 0,68 1 ,05 0,95 1,40

Bei 0,1 Sv wurde eine 40 %-ige Umwandlung des Substrates unter Ausbildung von 5,4 g L-Phenylalanin/1 bei 22⁰C festgestellt.

Beispiel 15

Die Kultur- und Immobilisierungsbedingungen von Beispiel 14 wurden wiederholt. Eine Säule von immobilisierten R. rubra-Zellen, enthaltend PAL, wurde verwendet, um die Halbwertszeit der Produktivität der Säule unter bestimmten Bedingungen festzustellen. Das Substrat bestand aus 75 mMol CA; 4,5M NH₃ und der pH

war auf 9,25 eingestellt und der Ansatz wurde bei 23⁰C mit einer Fliessrate von 0,25 Sv kontinuierlich durchgeführt. Die Halbwertszeit der Produktivität betrug 41 Tage (siehe Fig. 1). Dieser Versuch zeigt, dass man immobilisierte PAL über einen langen Zeitraum verwenden kann, wobei kontinuierlich L-Phenylalanin gebildet wird.

Beispiel 16A

Ein Fermentationsmedium wurde wie in Beispiel 5 hergestellt und verwendet, um R. rubra in einem 10 Liter-Fermentator zu züchten. Die Fermentatorsaat wurde wie in Beispiel 3 hergestellt. Proben der Zellen wurden periodisch aus dem Fermentator abgeerntet. Die Zellen wurden auf PAL-Aktivität untersucht, um die optimale Erntezeit zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass 6 Stunden nach der Spitzenaktivität weniger als 50 % der Spitzenaktivität zurückblieben. Es wurde auch festgestellt, dass das gesamte L-Phenylalanin aus dem Medium vor der Spitzenaktivitat verbraucht war.

Beispiel 16B

Beispiel 16A wurde wiederholt. Direkt nach dem Auftreten der Spitzenaktivitat wurde D, L-Phenylalanin

(5 g/10 1) in den Fermentator gegeben. In der ersten Stunde fiel die PAL-Aktivität wie in Beispiel 16A ab. Die PAL-Aktivität stabilisierte sich dann aber innerhalb der nächsten 3 Stunden vor der Ernte (siehe Fig. 2).

Beispiel 17

Zellen wurden hergestellt und immobilisiert nach dem Verfahren von Beispiel 14. Als Substrat wurden jedoch 75 mMol CA; 4,5M NH_ verwendet und der pH betrug 9,43 bei 23⁰C und die Fliessrate SV*¹"¹ 0,50. In der Säule wurden 1,9g L-Phenylalanin/1 Bettvolumen Träger/h produziert. Die Konzentration an L-Phenylalanin im Abfluss betrug 3,8 g/l.

Beispiel 18

Zellen wurden hergestellt und immobilisiert nach dem Verfahren von Beispiel 14. Die immobilisierten Zellen wurden in eine Säule gepackt und 352 cm³ Substrat (75 mMol CA; 4,5M NH-,; pH 9,4) wurden durch

H —1

die Säule bei 1,0 S\/ . im Kreislauf gefahren. Proben des gepoolten Substrats wurden in gewissen Zeitintervallen entnommen und die L-Phenylalanin-Konzentration wurde durch ein enzymatisches L-Aminooxidase-Assay und durch Dünnschichtchromatografie festgestellt,

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgezeichnet.

Kreislauf- zeit (h)	L-Phenylala- nin (g/l)	% Umwandlung
7	2,8	23
21,5	4,6	37
24	5,0	40
44,5	6,8	55

Dieses Beispiel zeigt, dass unter den Reaktionsbedingungen L-Phenylalanin in hohen Konzentrationen und mit einer hohen Umwandlungsrate hergestellt werden kann unter Verwendung von immobilisierten PAL enthaltenden Zellen.

Claims

PATENTANWÄLTE

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . DIPL.-I NG. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN . DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K.FDCHSLE . DRj RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 · D-8000 M O NCH EN 81 . TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-29619 (PATHE)

39 171 o/wa

GENEX CORPORATION, ROCKVILLE, MARYLAND / USA

Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin

PATENTANSPRÜCHE

. )Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, bei dem man

(a) trans-Zimtsäure mit einer Quelle für

Ammoniumionen unter Ausbildung einer Substratlösung umsetzt,

(b) den pH-Wert der Lösung einstellt, und

(c) die Substratlösung mit Phenylalaninammoniak-lyase unter L-Phenylalinin-bildenden Bedingungen unter Ausbildung von L-Phenylalanin behandelt,

dadurch gekennzeichnet , dass man

(i) als Ammoniumquelle ein Ammoniumsalz, das im wesentlichen kein Halogen enthält, verwendet und

(ii) den pH-Wert der Substratlösung mit einer Säure einstellt, die im wesentlichen kein Halogen enthält.
10
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der pH der Substratlösung auf den Bereich von etwa 8 bis etwa 10 eingestellt wird.
3. Verfahren gemäss Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass der pH der Substratlösung auf den Bereich von etwa 8,5 bis etwa 9,5 eingestellt wird.
4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man die Quelle für Ammoniumionen aus Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumeitrat und Ammoniumacetat auswählt.
5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Quelle für Ammoniumionen Ammoniumsulfat ist.
6. Verfahren gemäss Ansprüchen 1,2 oder 3, dadurch

gekennzeichnet , dass man die pH-Wert der Substratlösung mit einer Säure aus der Gruppe Schwefelsäure, Phosphorsäure und Essigsäure einstellt.
5
7. Verfahren gemäss Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass man den pH-Wert der Substratlösung mit Schwefelsäure einstellt.
8. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man die Konzentration

an Ammoniumionen in einem Bereich von etwa 0,1M bis etwa 7,5M einstellt.
15
9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass man die Konzentration

der Ammoniumionen auf einen Bereich von etwa 1M bis etwa 5M einstellt.
20
10. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man die Konzentration von t-Zimtsäure in der Lösung auf einen Bereich von etwa 30 bis etwa 200 mMol einstellt.
11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , dass man die Konzentration an t-Zimtsäure in der Lösung auf einen Bereich von etwa 60 bis etwa 150 mMol einstellt..
12. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man die Phenylalanin-

ammoniak-lyase wiederverwendet.
13. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Phenylalanin Phenylalanin-ammoniak-lyase-enthaltende intakte Zellen zu der Substratlösung in einem absatzweise arbeitenden Reaktor gibt.
14. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch g e k e η η 10

zeichnet, dass das absatzweise System ein einfaches diskontinuierliches System ist.
15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch g.e k e η η zeichnet, dass man bei dem ansatzweisen

'-> System die Beschickung kontinuierlich vornimmt.
16. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η"-zeichnet , dass die Phenylalanin-ammoniaklyase immobilisiert ist oder sich auf einem wiederverwendbaren Träger befindet.
17. Verfahren gemäss Ansprüchen 1 oder 16, dadurch gekennzeichnet , dass die Phenylalaninammoniak - lyase auf einer Säule immobilisiert ist.
18. Verfahren gemäss Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , dass die Säule bei einer Temperatur von etwa 10 bis etwa 4O⁰C gehalten wird, während man die Substratlösung durch die Säule pumpt.
19. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , dass man die Säule auf einer Temperatur von etwa 18 bis etwa 30⁰C hält, während die Substratlösung durch die Säule gepumpt wird.