DE2841642C2

DE2841642C2 - Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Tryptophan

Info

Publication number: DE2841642C2
Application number: DE2841642A
Authority: DE
Inventors: Won-Gi Bang; Joachim Prof. Dr. Klein; Siegmund Dr. 3300 Braunschweig Lang; Hermann Prof. Dr. 5170 Jülich Sahm; Fritz Prof. Dr. Wagner
Original assignee: Wagner Fritz Prof Dr 3300 Braunschweig
Current assignee: Amino GmbH
Priority date: 1978-09-25
Filing date: 1978-09-25
Publication date: 1983-03-03
Also published as: DE2841642A1

Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Die Ansprüche 2 bis 18 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

L-Trytophan ist eine essentielle Aminosäure, die als Nahrungs- und Futtermittelzusatz verwendet wird. Außerdem besteht ein Bedarf an L-Typtophan für medizinische Zwecke. Es sind eine Reih von Verfahren zur Herstellung von L-Typtophan beKannt. Beispielsweise läßt es sich durch Hydrolyse von Proteinen gewinnen oder durch biotechnische Herstellung mit Hilfe von Mikroorganismen in Kohlenhydrat- oder Methanol-haltigen N thrsubstraten. Die L-Trytophan-Ausbeuten bzw. Prod iktivitäten sind bei dem erwähnten Verfahren aber ve hältnismäßig gering.

Die indische Paten schrift 61 235 betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von L-Trytophan, bei dem in einer wachsenden Submerskultur von einer L-Trytophan auxotrophen Mutante von Escherichia coli ATCC 12 783 in Gegenwart von Kohlenhydraten, Polyalkoholen und/oder organischen Säuren als Kohlenstoff und Encrgiec|Lielle und unter Zusatz von Indol und D,L-Serin im Mengenverhältnis 1 zu 2 umgesetzt wird. Die Ausbeute an L-Tryptophan liegt bei 9,5 g/l, die Produktivität bei 0,59 g/l/h.

Ferner wird in der japanischen Patentschrift

4S 81 591 ein Verfahren zur Herstellung von L-Trytophan mit Hilfe immobilisierten Escherichia coli ATCC 9637 oder Proteus vulgaris JFO 3045 beschrieben.

Nach diesem Verfahren werden für die Umsetzung von Indol und D,L-Serin Mikroorganismen verwendet, die neben der notwendigen L-Tryptophansynthetase-Aktivität auch eine hohe Aktivität an Tryptophanase besitzen. Tryptophanase katalysiert jedoch die Spaltung von gebildetem L-Trytophan zu Indol, Pyruvat und Ammoniak. Nach diesem Verfahren werden Ausbeuten von 15 g/l und eine Produktivität von 0,62 g/l/h erhalten nach Umsetzung von Indol und D,L-Serin im Mengenverhältnis 1 zu 2.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Nachteile der Verwendung einer teuren Kohlenstoff- und Energiequelle und einen Überschuß an D,L-Serin der bekannten Verfahren zu vermeiden und L-Tryptophan mit ruhenden freien ELcoli-Zellen oder mit immobilisierten E.coli-Zellen in einer anorganischen Salzlösung in Gegenwart von lipophilen Adsorbentien oder nichtionischen Tensiden aus indol und L-Serin zu erzeugen. Gelöst wird diese Aufgabe mit dem erfindungsgemäßen Verfahren. Diese Lösung führt überraschend zu hohen Ausbeuten und verbesserten . Produktivitäten.

Bei der Umsetzung von Indol und L-Serin zu L-Tryptophan kann die Ausbeute an L-Trytophan deutlich erhöht werden, indem man die wäßrige Suspension der E.coli-Zellen mit einem nichtionischen Tensid versetzt. Der Einfluß verschiedener Tenside auf die Ausbeutesteigerung an L-Trytophan ist aus der folgenden Tabelle 1 zu ersehen.

Tabelle 1

die Ausbeutesteigerung aus der folgenden Tabelle 2 zu ersehen.

Tabelle 2

Nichtionisches Tensid
(1 ml/100 ml)

Ausbeute an L-Tryptophan (g/100 ml)

Polyoxy äihylen-octyl-pheool-äther Polyoxyithylen-octyl-phenol-äther Polyoxyäthylen-sorbitan-monolaurate Polyoxyithylen-sorbitan-moaopalmitat Polyoxyitkykn-sorbitiD-monooleat Polyoxyäthylen-fiycerin-monolaunt Polyoxyithyten-fiycerin-mooooleat Potyoxyithylen-glycerin-trioleat

0.33 .46 .13 .08 .10 .10

.10 .14 .14

Die Ergebnisse in Tabelle 1 wurden unter folgenden Bedingungen erhalten: In 100 ml 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 8,0) werden 0,5 g E.coli-Zellfeuchtmasse suspendiert und mit 1 g Indol, 1 g L-Serin, 1 mg Pyridoxalphosphat sowie mit 1 ml des entsprechenden Tensids versetzt. Die Reaktionsmischung wird bei 37°C und 24 Std. inkubiert und anschließend das gebildete t>o L-Tryptophan bestimmt.

Durch einen Zusatz eines lipophilen Adsorbens kann die Umsetzung von Indol und L-Serin zu L-Trytophan mit einer wäßrigen E.coli-Zellsuspension ebenfalls deutlich gesteigert werden. . h5

Am Beispiel der Verwendung des lipophilen Adsorbens Amberiite XAD-2 in Abhängigkeit von der eingesetzten Menge des Adsorbens ist der Einfluß auf

Amberiite XAD-2	Ausbeute an
	L-Tryptophan
(g/100 ml)	(g/100 ml)
0	0.34
2	0.71
4	1.44
6	1.53
8	1.35
10	1.10

Die Ergebnisse in Tabelle 2 wurden unter folgenden Bedingungen erhalten:

In 100 ml 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 8,0) werden 0,5 g Ecoli-Zellfeuchtmasse suspendiert und mit 1 g Indol, 1 g L-Serin, 1 mg Pyridoxyalphosphat sowie mit der entsprechenden Menge an Amberiite XAD-2 versetzt und bei 37⁰C 24 Std. inkubiert. Danach wird das gebildete L-Tryptophan bestimmt.

Die für die Umsetzung von Indol und L-Serin zu L-Trytophan notwendigen E.coli-Zellen werden in vorteilhafter Weise nach physikalischem Einschluß in eine Polymermatrix zur Produktion von L-Tirytophan eingesetzt. Die Herstellung derartiger immobilisierter Zellen kann nach bekannten Verfahren beispielsweise mit folgenden Stoffen erfolgen: Polyacrylamid, Polymethacrylamid oder Polyepoxid/Polyamin. Die immobilisierten E.coli-Zellen weisen gegenüber den freien Zellen bei der Umsetzung von Indol und L-Serin zu L-Tryptophan eine weitaus höhere Langzeitstabilität in bezug auf die Enzymaktivität auf.

Das Verfahren der Erfindung wird durch die folgenden Ausführungen beispielhaft beschrieben.

Das Verfahren der Erfindung verwendet Escherichia coli W 3110. Stämme von E.coli W 3110 sind aus The Journal of Biological Chemistry, Vol. 249, Nr. 24, Ausgabe Dezember 1974, Seite 7757 bekannt.

Beispiel 1

Ein 80-1-Bioreaktor, ausgerüstet mit einem lntensor, wird mit 50 1 Nährsalzlösung, enthaltend:

50OgK₂HPO₄
300 g NaNH₄HPO₄ ■ 4 H₂O
30Og(NH₄J₂SO₄
100 g Citronensäure · H₂O
1OgMgSO₄ · 7H₂O

gefüllt und 30 Min. bei 121°C sterilisiert. Nach Abkühlung auf 37°C werden aseptisch 750 g Glucose auf 2,5 g L-Tryptophan zugesetzt und mit 5000 ml einer 10-Std.-Vorkultur von Escherichia coli W 3110 beimpft und bei einer Belüftungsrate von 1,0 Vol./Vol./Min, gezüchtet. Während des Wachstums wird durch automatische Zugabe einer 12,5vol.-%igen Ammoniaklösung ein pH-Wert von 7,0 konstant gehalten. Nach 10 Std. wird die Zellmasse durch Zentril'ugation abgetrennt. Es werden 900 g Zeilfeuchtmasse, entsprechend 170 g Zelltrockenmasse, erhalten. Die Zellfeuchtmasse wird direkt als Enzymquelle für die folgenden Beispiele verwendet.

Beispiel 2

Von der im Beispiel gewonnenen Zellfeuchtmasse werden 0,5 g in 100 ml 0,1 molarem Na-K-Phosphatpuffer pH 8,0 in einem 500-ml-Erlenmeverkolben suspendiert und mit 1 g Indol, 1 g L-Serin, 1 mg Pyridoxalphosphat und 1 ml Polyoxyäthylen-octyl-phenol-äther versetzt und 24 Stunden bei 37° C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 120 UpM inkubiert Nach Abtrennung der Zellmasse werden 1,46 g Tryptophan = 83,9% der Theorie, bezogen auf Indol, erhalten.

Beispiel 3

Von der in Beispiel 1 gewonnenen Zellfeuchtmasse werden 50 g in 1000 ml 0,1 molarem Na-K-Phosphatpuffer pH 8,0 in einem 5000-ml-Erlenmeyerkolben suspendiert und mit 87 g Indol, 78,1 g L-Serin, 100 mg Pyridoxalphosphat und 100 ml Polyoxyäthylen-octylphenoläther versetzt und 60 Stunden bei 37° C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 120 UpM inkubiert Es werden 141,4 g L-Tryptophan = 93,2% der Theorie, bezogen auf Indol, bzw. 93,3% der Theorie, bezogen auf L-Serin, erhalten. Die Produktivität beträgt 2,35 g/l/ Stunde.

Beispiel 4

Von der in Beispiel 1 gewonnenen Zellfeuchtmasse werden 0,5 g in 100 ml 0,1 molarem Na-K-Phosphatpuffer pH 8,0 in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben suspendiert und mit 1 g Indol, 1 g L-Serin, 1 mg Pyridoxalphosphat und 6 g Amberlite XAD-2 versetzt und 24 Std. bei 37°C auf einer Rotationsschüttelmasc'vine bei 120UpM inkubiert Es werden 1,53 g = 87,9% d.Th., bezogen auf Indol, erhalten.

Beispiel 5

2,5 g der nach Beispiel 1 gewonnenen Zellfeuchtmasse werden in 45 ml 0,9gew.-%iger Kochsalzlösung suspendiert und nacheinander versetzt mit:

a. 40 ml Monomerlösung, enthaltend 9,5 g Acrylamid und 1,0 g Ν,Ν'-Methylendiacrylamid in Wasser,

b. 2,5 ml einer wäßrigen 5,0gew.-%igen 3-Dimethylaminopropionitril-Lösung,

c. 2,5 ml einer wäßrigen 5,0gew.-%igen Kaliumperoxodisulf at-Lösung.

Die erhaltene Suspension wird in einer Stickstoffatmosphäre unter Rühren bei Raumtemperatur in 250 ml Dibutylphthalat und 0,2 ml Pluronic L-61 eingetragen. Nach 20 Min. ist die Polymerisation beendet; die gebildeten, perlförmigen immobilisierten Zellen werden abfiltriert und mit 0,9gew.-%iger Kochsalzlösung gewaschen. Es werden 55 g immobilisierte Zellen (Feuchtgewicht) erhalten mit einer realtiven Aktivität von 56% im Vergleich zu freien Zellen.

Beispiel 6

11 g der nach Beispiel 5 erhaltenen immobilisierten Zellen werden in 100 ml 0,1 molarem Na-K-Phosphatpuffer pH 8 suspendiert, mit 1 g Indol, 1 g L-Serin, 1 mg Pyridoxalphosphat und 1 ml Polyoxyäthylen-octyl-phsnol-äther versetzt und wie in Beispiel 2 inkubiert Nach 24 Stunden werden 1,2 g L-Try»ophan = 68,9% der Theorie, bezogen auf Indol, erhalten.

Beispiel 7

11 g der nach Beispiel 5 erhaltenen immobilisierten Zellen werden in 100 ml 0,05 molarem Na-K-Phosphat-

K) puffer pH 8,0 suspendiert und mit 0,2 g Indol, 0,2 g L-Serin und 1 mg Pyridoxalphosphat versetzt und wie in Beispiel 2 inkubiert Nach 24 Std. werden die immobilisierten Zellen abgetrennt Im Filtrat sind 0,33 g L-Tryptophan = 94,8% d. Th, bezogen auf Indol, enthalten.

Die abgetrennten immobilisierten Zellen werden wie zuvor erneut in 100 ml 0,05 molarem Phosphatpuffer pH 8,0 aufgenommen, mit 0,2 g Indol, 0,2 g L-Serin und 1 mg Pyridoxalphosphat versetzt und 24 Std. inkubiert Nach 20maliger Wiederholung dieses Ansatzes mit den gleichen immobilisierten Zellen werden noch 0,3 g L-Tryptophan = 86,2% d. Th, bezogen auf Indol, erhalten. Die immobilisierten Zellen besitzen nach 20maliger Verwendung noch 90% der Ausgangsaktivitat

Beispiel 8

55 g der nach Beispiel 5 erhaltenen immobilisierten

jo Zellen werden in einem Rührreaktor in 500 ml 0,1 molarem Na-K-Phosphatpuffer suspendiert Bei einer Temperatur von 37° C wird der Rührreaktor von einer Substratlösung, die pro Liter 0,1 molarem Na-K-Phosphatpuffer (pH 8,0) 1,5 g Indol, 1,5 g L-Serin und 10 mg Pyridoxalphosphat enthält, kontinuierlich mit einer Flußrate von 30 ml/pro Stunde unter Zurückhaltung der immobilisierten Zellen durchströmt. Nach 2 Tagen sind in der ausströmenden Reaktionslösung 2,2 g L-Tryptophan pro Liter enthalten, nach 50 Tagen kontinuierlichem Betrieb noch 1,8 g L-Tryptophan. Die immobilisierten Zellen besitzen somit nach 50 Tagen noch 82% der Ausgangsaktivität. ·

Das Verfahren der Erfindung bringt gegenüber der Arbeitsweise nach dem Stand der Technik erhebliche Vorteile.

Nach dem Verfahren der Erfindung werden durch die Verwendung von nichtionischen Tensiden oder von lipophilen Adsorbentien bei der Umsetzung von Indo! und L-Serin im Mengenverhältnis von etwa 1 :1 hohe Ausbeuten und damit eine wesentlich verbesserte Produktivität erzielt.

Ein weiterer Vorteil des Verfahrens der Erfindung liegt in der Verwendbarkeit immobilisierter Zellen, die eine sehr gute Langzeitstabilität des Biokatalysators bedingt.

Außerdem gestattet das Verfahren der Erfindung eine kontinuierliche Prozeßführung, worin eine besondere Wirtschaftlichkeit liegt und wodurch die Herstellung von Biokatalysatoren einer praktisch gleichbleibenden Qualität möglich wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung einer L-Trypto- s phan auxotrophea Trytophanase negativen Mutante von Escherichia coli W 3110 und einer Nährsalzlösung, die assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen und anorganische Salze enthält, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 28 bis 40⁰C und einem konstanten pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 die Mutante von Escherichia coli unter Zugabe geringer Menge L-Tryptophan gezüchtet und nach Beendigung des Wachstums die gebildete Zellmasse von der Suspension abgetrennt, die flüssige Phase ausgeführt, danach in Stufe 2 die Zeilfeuchtmasse aus Stufe 1 in einer anorganischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 8,5 suspendiert, Indol, L-Serin, Pyridoxalphosphat und ein geeignetes, nichtionisches Tensid oder ein lipophiles Adsorbens zugegeben und die Komponenten bei einer Reak tionstemperatur von 28 bis 42° C umgesetzt werden, danach das gebildete L-Tryptophan von der Zellmasse abgetrennt, diese ausgeführt und das L-Tryptophan in bekannter Weise aus der Lösung gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 eine Zellkonzentration von 0,2 bis 8,0 Gewichtsprozent eingesetzt wird. 3η

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2. dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 als anorganische Pufferlösung ein 0,05 bis 0,15 molarer Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,8 bis 8,2 verwendet wird. Ji

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 Indol und L-Serin im Mengenverhältnis von etwa 1 :1 und in Konzentrationen von 0,2 bis t0Gew.-% eingesetzt werden.

'5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 —4, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 Pyridoxalphosphat in einer Konzentration von 0,01 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die eingesetzte Zellfeuchtmasse, verwendet wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1—5, dadurch 4S gekennzeichnet, daß in Stufe 2 nichtionische Tenside, die mit Indol in wäßrigen Systemen Micellen bilden, in einer Konzentration von 1 bis 10 Gew.-% eingesetzt werden.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1—5, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 lipophile Adsorbentien, die Indol in wäßrigen Systemen reversibel adsorbieren, in einer Menge von etwa 2 bis 8 Gew.-% eingesetzt werden.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 —7, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 immobilisierte Zellen verwendet werden.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 die Mikroorganismen nach physikalischem Einschluß in einer Polymerma- ^ho trix verwendet werden.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 die Produktion von L-Tryptophan kontinuierlich in einem hydrostatisch oder hydromechanisch betric- ^fl5 benen Reaktor bei einer Reaktionstemperatur von 36 bis 38° C erfolgt.

11. Verfahren nach den Ansprüchen ! bis 10.

dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1 L-Trytophan in einer Menge von 5 bis 100 mg zugegeben wird.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 — Ii, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung der Zellmasse in Stufe 1 in einer Zeitdauer bis etwa 10 h e* folgt und diese nach der Abtrennung von der flüssigen Phase in die Stufe 2 eingeführt wird.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 — 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung der Zellmasse in Stufe 1 bei einer Belüftungsrate von 1,0 VoiyVolVMin. erfolgt.

!4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 — 13, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 die Umsetzung der Komponenten in einer Zeitdauer von etwa 24 bis 60 h unter Schüttelung erfolgt.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 — 14, dadurch gekennzeichnet, daß die in Stufe 2 abgetrennte, immobilisierte Zellmasse in einer anorganischen Pufferlösung suspendiert, erneut in Stufe 2 eingeführt und mit Indol, L-Serin, Pyridoxalphosphat umgesetzt und dieser Kreislauf so lange wiederholt wird, wie die immobiiisierten Zellen ausreichende Aktivität aufweisen.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 1 — 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückführung der immobilisierten Zellmasse in die Stufe 2 mindestens 20mal erfolgt.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 die immobilisierte Zellmasse beim Durchströmen eines Rührreaktors in diesem durch eine geeignete Vorrichtung zurückgehalten und das gebildete L-Tryptophan aus der Lösung in bekannter Weise gewonnen wird.

18. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2 die immobilisierte ZHImasse mindestens 50 Tage zurückgehalten und erst nach Verminderung der Aktivität ausgeführt wird.