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Verfahren zur Gewinnung von 2-Glutaminsäure
Unter den bisher bekannten Mikroorganismen, welche l-Glutaminsäure erzeugen, findet sich unter vielen als neu beschriebenen Mikroorganismen der Micrococcus glutamicus (Kinoshita et al : Japanische Patentschrift Nr. 243. 382 ; Bulletin of Agricultural Chemical Society of Japan, Bd. 22, Nr. 3, S. 176 bis 185 [1958]). Alle 1-Glutaminsäure erzeugenden Organismen, einschliesslich des Micrococcus glu- tamicus, benötigen, wie gefunden wurde, für ihr Wachstum Biotin, d. h., dass diese Organismen biotin- abhängig sind. Dementsprechend wurde in vielen Fällen, etwa entsprechend der japanischen Patent- schrift Nr. 263. 709 oder der brit.
Patentschrift Nr. 849, 280, der Mikroorganismus in einem einen sub- optimalen Gehalt an Biotin aufweisenden Nährmedium gezüchtet. Es wurde auch gezeigt (s. bei- spielsweise franz. Patentschrift Nr. 1. 266. 757), dass ein zweckloses übermässiges Wachstum vonl-Glut- aminsäure bildenden Mikroorganismen in einem wässerigen, natürliche Nährstoffe enthaltenden Me- dium (welches Wachstum durch verschiedene durch das Nährmedium gegebene Faktoren, z. B. Biotin oder andere Vitamine, gefördert wird), durch das Wachstum des Mikroorganismus verhindernde Mittel, beispielsweise Penicillin, in geeigneter Weise eingedämmt werden kann und hiebei Vorteile bei der
Herstellung von 1-Glutaminsäure erzielt werden können.
Es wurde nun gefunden, dass es durch Kombination dieser beiden bekannten Verfahren überraschenderweise möglich ist, die Ausbeute an 1-Glutaminsäure bei der Gärung gegenüber dem Bekannten beträchtlich zu verbessern. Dies gelingt bei einem Verfahren zur Gewinnung von 1-Glutaminsäure durch Vergärung kohlehydrathaltiger Substrate mit 1-Glutaminsäure bildenden Mikroorganismen, wobei dem Gärsubstrat a) Biotin bzw. diesem in ihrer zellteilungsfördernden Wirkung gleichwertigen Stoffe und b) Wachstumsinhibitoren, wie Stoffe mit bactericiden oder bacteriostatischen Eigenschaften, zugesetzt werden, wenn gemäss der Erfindung die Gärung in üblicher Weise bei einem Zusatz an Biotin bzw.
gleichwertigen Stoffen von weniger als 5 y/l begonnen wird und, nachdem Glutaminsäure im Nährmedium festgestellt werden kann (zweckmässig nach der Warburg-Methode in Vorversuchen unter gleichenBedingungen bestimmt), zusätzlich 5 - 1000 y/l, vorzugsweise 10 - 500 y/l, Biotin bzw. gleichwertige Stoffe und gleichzeitig Wachstumsinhibitoren für den Mikroorganismus in Mengen von 0, 1 bis 500 y/ml eingebracht werden, die Gärung zu Ende geführt und die Isolierung der Säure aus der Kulturflüssigkeit in üblicher Weise vorgenommen wird.
Wenn auch derzeit die Theorie zur Begründung des durch das erfindungsgemässe Verfahren erzielten Effektes keinesfalls feststeht, so kann doch folgendes angenommen werden : Bei für das Wachstum des Mikroorganismus suboptimaler Konzentration des Biotins (5 y/l) wachsen die Mikroorganismen so lange unter Bedingungen, die für die Bildung eines an der l-Glutaminsäurebildung beteiligten Enzymsystems günstig sind, bis sie selbst dieses Enzymsystem erzeugen, worauf der ausgesprochen auf die Anreicherung der 1-Glutaminsäure im Nährmedium gerichtete Metabolismus durch den in einer geeigneten Fermentationsstufe (nach Feststellung von 1-Glutaminsäure im Nährmedium) erfolgenden Zusatz einer überoptimalen Menge an Biotin und von Wachstumsinhibitoren,
wie organischen und anorganischen In- hibitoren und Antibiotika, kräftig unterstützt wird. In der Folge werden 1-Glutaminsäure im Nährmedium mit besserer Ausbeute erhalten und mit höherer Konzentration angereichert. Der biochemische Einfluss der für das erfindungsgemässe Verfahren wesentlichen überoptimalen Biotinkonzentration ist nach
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lin, Benzyl-penicillin-ss-diäthylaminoäthyl-hydrojodid, Streptomycin, Erythromycin, Chloramphenicol,
Natriumlaurylsulfat, Natriumdodecylsulfat, Trimethyl-hexadecylammoniumchlorid (Nippon-YushiCor- poration, Handelsname "Cation PB"), Trimethyldodecylammoniumchlorid (Nippon YushiCorporation,
Handelsname "Cation BB"), Alkyldimethylbenzylalky1chlorid (Nippon Yushi Corporation,
Handelsna- me n Cation M2") und Polyoxyäthylensorbitanalkylester (Kao Sekke Corporation, Handelsname"Ema- sol 3130"). Diese Stoffe können in Konzentrationen von 0, 1 bis 500 y/ml, einzeln oder in Kombination dem Nährmedium zugesetzt werden.
Im folgenden wird das erfindungsgemässe Verfahren an Hand von Ausführungsbeispielen näher er- läutert. Das erfindungsgemässe Verfahren ist jedoch nicht auf die in den Beispielen angegebenen Organismen und Reagenzien beschränkt. Es können ohne weiteres auch andere 1-Glutaminsäure erzeugende
Mikroorganismen und andere Wachstumsinhibitoren verwendet werden.
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geimpft. Während der gesamten Fermentationsdauer wurde die Temperatur auf 330 C und der PH-Wert auf 7,0 gehalten, wobei mit einer Geschwindigkeit von 3 l Luft/min gelüftet und mit 500 Umdr/min gerührt wurde.
Nach Beginn der Fermentation wurde im Fermentationsmedium Glutaminsäure in Abständen nach der Methode von Warburg bestimmt und es konnte nach 4 stündiger Fermentationsdauer Glutaminsäure festgestellt werden.
7 h nach Beginn der Fermentation wurden dem Nährmedium 750 ml einer 400 g/l reduzieren- de Zucker enthaltenden verzuckerten Stärkelösung zugesetzt, um im Nährmedium die Konzentration der reduzierenden Zucker bei 130 g/l zu halten. Weiters wurden dem Nährmedium 450 y (150 y/l) Biotin und 12 000 y (4 y/ml) Penicillin zugesetzt. Die Fermentation wurde sodann fortgesetzt.
Die Fermentation wurde 48 h nach Fermentationsbeginn beendet. Zu diesem Zeitpunkt enthielt das
Nährmedium 60,4 g/l 1-Glutaminsäure.
Zu Vergleichszwecken wurden weitere Versuche vorgenommen, im Rahmen derselben bei sonst gleichbleibenden Bedingungen der Zusatz weiterer verzuckerter Stärkelösung und der Zusatz von Biotin und Penicillin zu andern Zeitpunkten erfolgte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben :
Tabelle 1
EMI3.2
<tb>
<tb> Zeitpunkt <SEP> der
<tb> weiteren <SEP> Zusätze <SEP> Blindin <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> verFermentationsbeginn <SEP> (1) <SEP> (3) <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 9 <SEP> 11 <SEP> such
<tb> Gehalt <SEP> des <SEP> Nährmediums <SEP> an <SEP> l-Glutaminsäure <SEP> in <SEP> g/l <SEP> bei
<tb> Fermentationsende <SEP> (20,5) <SEP> (42,8) <SEP> 57,5 <SEP> 60,4 <SEP> 58, <SEP> 2 <SEP> 57,3 <SEP> 50,7
<tb>
EMI3.3
der 400 g/l reduzierende Zucker enthaltenden verzuckerten Stärkelösung zugesetzt, um die Konzentration des Fermentationsmediums an reduzierendem Zucker bei 130 g/l zu halten, wobei jedoch bei sonst gleichen Bedingungen dem Fermentationsmedium im weiteren Verlaufe der Fermentationkeine verzuckerte Stärkelösung und auch kein Biotin bzw. Penicillin zugesetzt wurde.
Aus den obigen Versuchen ergibt sich, dass im Rahmen der Fermentation dann eine grössere Menge an 1-Glutaminsäure erhalten werden kann, wenn dem Fermentationsmedium 4 h nach Fermentationsbeginn Biotin in für das Wachstum des Mikroorganismus überoptimalen Mengen und weiters Penicillin zugesetzt wird.
Beispiel 2 : Die Arbeitsweise gemäss Beispiel 1 wurde unter Verwendung verschiedener Penicillinkonzentrationen wiederholt, wobei jedoch die Zugabe der Hilfsstoffe 7 h nach Fermentations-
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beginn erfolgte. Die nach 48stündiger Fermentationsdauer erhaltenen Ergebnisse der Glutaminsäurebestimmung sind in Tabelle II angeführt.
Tabelle II
EMI4.1
<tb>
<tb> Penicillin <SEP> Vergl. <SEP> - <SEP>
<tb> y/l <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> Versuch
<tb> 1-Glutaminsäure <SEP> g/l <SEP> 52,1 <SEP> 57,5 <SEP> 59,8 <SEP> 62,1 <SEP> 60,3 <SEP> 57,3 <SEP> 51,7
<tb> 1-Glutaminsäure
<tb> + <SEP> l-Pyrrolidoncarbonsäure
<tb> g/l <SEP> (57,7) <SEP> (69,3) <SEP> (70,1) <SEP> (71, <SEP> 1) <SEP> (70,0) <SEP> (65,7) <SEP> (55,3)
<tb>
Beispiel 3 : Die Arbeitsweise gemäss Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Fermentationsmedien wiederholt, welche zu Beginn der Fermentation 40,50, 60,70, 80 bzw. 90 g/l reduzierende Zucker enthielten, wobei die Zugabe der Hilfsstoffe nach 8 stündiger Fermentation vorgenommen wur- de.
Die nach 48stündiger Fermentationsdauer erhaltenen Analysenergebnisse sind in der Tabelle III angegeben.
Tabelle III
EMI4.2
<tb>
<tb> Anfangskonzentration <SEP> an <SEP> reduzierendem <SEP> Zucker
<tb> in <SEP> g/l <SEP> 40 <SEP> 50 <SEP> 60 <SEP> 70 <SEP> 80 <SEP> 90
<tb> 1-Glutaminsäure
<tb> mg/ml <SEP> 58, <SEP> 8 <SEP> 59,3 <SEP> 61,2 <SEP> 64,2 <SEP> 65,3 <SEP> 64, <SEP> 4 <SEP>
<tb> l-Glutaminsäure <SEP> + <SEP>
<tb> 1-Pyrrolidoncarbonsäure
<tb> in <SEP> g/l <SEP> (62, <SEP> 5) <SEP> (63, <SEP> 3) <SEP> (64,5) <SEP> (89,9) <SEP> (87,7) <SEP> (88,1)
<tb>
Beispiel 4 :
Die Arbeitsweise gemäss Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch der Fermentationsbrühe nach 8stündiger Fermentationsdauer eine 400 g/l reduzierende Zucker enthaltende verzukkerte Stärkelösung in solchen Mengen zugesetzt wurde, dass sich eine Steigerung des Gehaltes der Fermentationsbrühe an reduzierendem Zucker um 100,110, 120,130, 140 bzw. 150 g/l ergab. Die Zugabe der übrigen Hilfsstoffe erfolgte ebenfalls 8 h nach Fermentationsbeginn. Die nach 48stündiger Fermentationsdauer erhaltenen Analysenergebnisse sind in Tabelle IV angegeben.
Tabelle IV
EMI4.3
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> der
<tb> Fermentationsbrühe
<tb> an <SEP> reduzierenden <SEP> Zucker
<tb> in <SEP> g/l <SEP> nach <SEP> Zugabe
<tb> weiterer <SEP> Zuckerlösung <SEP> 130 <SEP> 140 <SEP> 150 <SEP> 160 <SEP> 170 <SEP> 180
<tb> 1-Glutaminsäure <SEP> 58,1 <SEP> 57,0 <SEP> 60,1 <SEP> 61,1 <SEP> 61,2 <SEP> 65,1
<tb> g/l
<tb>
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Tabelle IV (Fortsetzung)
EMI5.1
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> der
<tb> Fermentationsbrühe
<tb> an <SEP> reduzierenden <SEP> Zucker
<tb> in <SEP> g/l <SEP> nach <SEP> Zugabe
<tb> weiterer <SEP> Zuckerlösung <SEP> 130 <SEP> 140 <SEP> 150 <SEP> 160 <SEP> 170 <SEP> 180
<tb> 1-Glutaminsäure
<tb> + <SEP> 1-Pyrrolidoncarbonsäure <SEP> g/l <SEP> (73,2) <SEP> (69, <SEP> 1) <SEP> (70, <SEP> 0) <SEP> (78,6) <SEP> (83, <SEP> 2) <SEP> (80, <SEP> 0)
<tb>
Beispiel 5 :
Die Arbeitsweise gemäss Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei die in Tabelle V ange- gebenen Hilfsstoffe in Mengen von 5 y/ml bzw. 10 y/ml nach 8stündiger Fermentationsdauer zugegeben wurden, um den Einfluss verschiedener Wachstumsinhibitoren auf die Ausbeute an l-Glutaminsäure zu bestimmen.
Tabelle V
EMI5.2
<tb>
<tb> Wachstumsinhibitoren <SEP> erhaltene <SEP> 1-Glutaminsäure
<tb> 5y/ml <SEP> l <SEP> y/ml <SEP>
<tb> Anorganische <SEP> Mercurichlorid
<tb> Inhibitoren <SEP> 54,3 <SEP> 53,2
<tb> Organische <SEP> MercuriphenylInhibitoren <SEP> acetat <SEP> 55,5 <SEP> 56,3
<tb> Acrinol <SEP> 52,6 <SEP> 54,3
<tb> Penicillin <SEP> 63,4 <SEP> 61,3
<tb> Leocillin <SEP> 60,2 <SEP> 58,4
<tb> Streptomycin <SEP> 61,3 <SEP> 57, <SEP> 3
<tb> Antibiotika <SEP> Aureomycin <SEP> 58, <SEP> 7 <SEP> 59, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Arythromycin <SEP> 59,8 <SEP> 57,3
<tb> Chloramphenicol <SEP> 60, <SEP> 1 <SEP> 59, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kanamycin <SEP> 58,2 <SEP> 57,3
<tb> Natrium-lauryl-
<tb> @@@@@@@@@@ <SEP> sulfat <SEP> 56, <SEP> 4 <SEP> 54.
<SEP> 4 <SEP>
<tb> Oberflächen- <SEP> Cation <SEP> PB <SEP> 56,3 <SEP> 55,3
<tb> aktive <SEP> Stoffe <SEP> Emasol <SEP> 3130 <SEP> 55,5 <SEP> 56,1
<tb> Vergleichsversuch <SEP> 50,3
<tb>
Beispiel 6 : Die Arbeitsweise gemäss Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch die in der folgenden Tabelle VI angegebenen, dem Biotin in ihrer Wirksamkeit analogen Verbindungen dem Fermentationsmedium 8 h nach Fermentationsbeginn zugesetzt wurden.
Die nach 48stündiger Fermentation erhaltenen Analysenergebnisse waren folgende :
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Tabelle VI
EMI6.1
<tb>
<tb> Konzentration <SEP> nach <SEP> dem <SEP> Menge <SEP> an <SEP> entstandener
<tb> Biotin-Analoga <SEP> Zusatz <SEP> in <SEP> y/1 <SEP> 1-Glutaminsäure <SEP> in <SEP> g/1
<tb> d, <SEP> 1-Desthiobiotin <SEP> 300 <SEP> 60,2
<tb> d, <SEP> l-Biotinsulfoxyd <SEP> 300 <SEP> 59,3
<tb> Vergleichsversuch-50, <SEP> 0
<tb>
Beispiel 7: Als Kohlenstoffquelle für das Nährmedium wurde in diesem Falle Rübenmelasse verwendet, wobei nach 8stündiger Fermentationsdauer verschiedene Mengen an Biotin und Penicillin zugesetzt wurden.
Es wurde eine Kultur von Micrococcus glutamicus ATCC 13 031 verwendet.
EMI6.2
EMI6.3
<tb>
<tb> Zucker <SEP> 40,0 <SEP> g/l <SEP> (aus <SEP> der <SEP> Melasse <SEP> stammend)
<tb> NH4H2PO4 <SEP> 1,0 <SEP> g/l
<tb> (NHHPO <SEP> 1,0 <SEP> g/l
<tb> MgSO. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> MnSO. <SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP> g/l <SEP>
<tb>
Die verwendete Rübenmelasse enthielt, wie durch einen Bio versuch mit 1-Arabinose bestimmt wurde, 41, 4y/g Biotin, so dass im Nährmedium anfänglich BiotinmiteinerKonzentrationvon3, 15 y/l enthalten war.
Zugesetzte Hilfsstoffe :
Zucker 100 g/l (in Form von Rübenmelasse)
Biotin und Penicillin in den in den Tabellen VII und VIII angegebenen Mengen.
1. Tabelle VII bringt die Ergebnisse der Glutaminsäurebestimmung bei Zusatz von 4 pg Penicil- lin/ml zum Nährmedium und wechselnden Zusätzen an Biotin zum Nährmedium.
Tabelle VII
EMI6.4
<tb>
<tb> Zugesetzte <SEP> Menge
<tb> an <SEP> Biotin <SEP> pg/ml <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> 150 <SEP> 500 <SEP> 1000
<tb> 1-Glutaminsäure <SEP> g/l <SEP> 53,0 <SEP> 56, <SEP> 0 <SEP> 57,5 <SEP> 58,5 <SEP> 62, <SEP> 3 <SEP> 65,7 <SEP> 65,0
<tb> l-Glutaminsäure <SEP> +
<tb> 1-Pyrrolidoncarbonsäure
<tb> g/l <SEP> 59, <SEP> 0 <SEP> 63, <SEP> 3 <SEP> 64, <SEP> 2 <SEP> 65, <SEP> 7 <SEP> 70, <SEP> 0 <SEP> 73, <SEP> 2 <SEP> 73, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
EMI6.5
l50 pg/ml zugesetzten Biotins und wechselnden Penicillinmengen im Nährmedium.
Tabelle VIII
EMI6.6
<tb>
<tb> Zugesetzte <SEP> Menge
<tb> an <SEP> Penicillin
<tb> jg/ml <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> l-Glutaminsäure <SEP> g/l <SEP> 15, <SEP> 3 <SEP> 50,1 <SEP> 57, <SEP> 8 <SEP> 62,2 <SEP> 62,0 <SEP> 59, <SEP> 7 <SEP> 57, <SEP> 5
<tb>
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Tabelle VIII (Fortsetzung)
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<tb>
<tb> Zugesetzte <SEP> Menge
<tb> an <SEP> Penicillin
<tb> g/ml <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> 1-Glutaminsäure
<tb> + <SEP> l-Pyrrolidoncarbonsäure <SEP> g/l <SEP> 16,7 <SEP> 56,5 <SEP> 65,5 <SEP> 70,2 <SEP> 70, <SEP> 0 <SEP> 68,3 <SEP> 66,0
<tb>