JPS6083580A - シユ−ドモナス属細菌の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性の高いシ生産する
方法に関する。

近年、固定化酵素または固定化微生物に関する技術の急
速な進歩と共に微生物寸たは酵素ある込はその固定化物
を種々の単位化学反応や複合化学反応の触媒として利用
しようとする動きが活発化しつつある。

ニトリルヒドラターゼは、ニトリル類を水和して相当す
るアミド類を生成せしめる酵素として、本発明者の中の
山田らに見出されており［Ａｇｒｌｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１７６　／／６３　（／り♂
２）参照〕、その具体的利用例としてニトリルヒドラタ
ーゼを有する細菌を用いアクリロニトリルからアクリル
アミドを生成させることが提案されている〔特開昭ｓｇ
−ｒｔｏり３号公報（特願昭、タＡ−／Ｉグ１．♂ざ号
）、Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、’１６　／／
ざ３　（／り♂２）参照〕０このような場合に、ニトリ
ルヒドラターゼ活性の高いシー−トモナス属菌体が高収
量で取得できれば、稗益するところは大きい。

このような観点から、本発明者らは既に一つの提案をな
してｂる（特願昭５ｔｒ−ｉり！７７号）。この提案に
かかるシー−トモナス属細菌の培養方法は、シー−トモ
ナス属に属してニトリルヒドラターゼを産生ずる能力を
有する細菌をニトリルヒドラターゼ酵素が誘導される条
件で培養Ｉ７てニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する
細菌菌体を製造するに際し、培地中にシスティンおよび
（−！たは）シスチンを存在させること、からなるもの
である。

発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を与える（を目的とし、上記シ
スティンおよびシスチン以外のα−アミノ酸にも同様な
効果が見出さハたことに基いて上記と同様の手段によっ
てこの目的を達成しようとするものである。

従って、本発明によるニトリルヒドラターゼ活性の高い
シー−トモナス属細菌の培養方法は、シー−トモナス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属に属してニトリルヒドラ
ターゼを産生ずる能力を有する細菌をニド、リルヒドラ
ターゼ酵素が誘導される条件で培養してニトリルヒドラ
ターゼ酵素活性を有する細菌菌体を製造するに際し、培
地中に少なくとも一種のα−アミノ酸（システィンおよ
びシスチンのそれぞれ単用およびこれら両者のみの併用
を除く）を存在させること、を特徴とするものである。

効果 培地にα−アミノ酸を添加してシー−トモナス属細菌の
培養を行なうと、単位培養液当シのニトリルヒドラター
ゼ活性が顕著に増大する。たとえば、α−アミノ酸を添
加すると、無添加の場合に比較して単位培養液当りのニ
トリルヒドラターゼ活性の収量を約２〜５倍近くまで向
上させることができる。

この単位培養液当シのニトリルヒドラターゼ活性の増大
は、菌体の濃度（すなわち、菌体の収量）および菌体自
体の活性（すなわち、菌体内のニトリルヒドラターゼの
量）の増大に因るものと解される。

本発明において使用する細菌は、ニトリルヒドラターゼ
活性を有し、ニトリル、特にアクリロニトリル、を水和
して対応アミド、特にアクリルアミド、を生成すること
ができるシー−トモナスｊ、何の細菌である。具体的に
は、例えば′、前記特願昭Ｓ乙−Ｉｆ弘ｔｌｒｇ号の明
細書に記載のシー−トモナス・クロロラフイスＢ２３　
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｇ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ
Ｂ２Ｊ）微工研条寄第ｔｔｒ７号およびシー−トモナス
ｓｐ＋ＰＳ　／　（Ｐ’ｇｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、
ＰＳ　／　）微工研条寄第１Ｉざ号などを挙げることが
できる。こＪｌら両画の詳細は、前記特開昭ｓｇ−ｇｔ
ｏり３号公報（特願昭５６−／ｆグｔｇｒ号明細書）に
記載されている。

活性向上剤 本発明においては、活性向上剤としてシスティンおよび
シスチン以外のα−アミノ酸の−ｆｉｉｉまたは二種以
上を使用する。これらは、それぞれ単独にまたは併用混
合して、使用することができる。

本発明において使用するα−アミノ酸は、Ｄ一体、Ｌ一
体およびり、Ｌ一体温合物のいずれでもよく、これらは
それぞれ単独で用いてもよく、甘た、２種以上混合して
用いてもよいことは上記した通りである。なお、効果の
点ではＬ一体が好ましいが、人手容易性の点からり、Ｌ
一体温合物が好ましいとめえよう。

α−アミノ酸はソリラパク構成員として知られているも
のが適当である。このよりなα−アミノ酸の好ましい具
体例は、後記実施例１にお込てその効果を示したもので
ある。なかでも、アラニン、バリン、メチオニン、アス
パラギン酸、フェニルアラニン、プロリンおよびグルタ
ミン酸が特に好１しく、これらのうちでもメチオニン、
アスパラギン酸およびグルタミン酸は活性が比較的安定
している点で有利である。これらのα−アミノ酸を併用
してもよいことは前記したところであるが、併用の相手
方としてシスティンおよび（または）シスチンを選ぶこ
とも本発明の範囲内である。

培養一本発明の実施 本発明の一般的実施態様を示すと次の通りであるＯ すなわち、炭素源、例えばグルコース、フラクトース、
シュークロース、デキストリン、クリセリン、エタノー
ルおよびコノ〜り酸など、窒素源、例えばアンモニア、
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ムおよび尿素など、有機栄養源例えば酵母エキス、肉エ
キス、麦芽エキス、カゼイン分解物およびペプトンなど
、および無機塩、例えばリン酸塩、マグネシラノ・、カ
リウム、鉄、その他微量金属など、その他、を適宜含有
する培地にα−アミノ酸の少なくとも７種を一時にある
いは逐次的に添加して０．／〜ｔｏ　Ｍ　／　！Ｊソト
ル、好１しくはｏ、ｓ−ｇ、ｏ９／リットル、の濃度で
存在させ、この培地にニトリルヒドラターゼ活性を有す
るシー−トモナス属の細菌を接馴して、好気的条件下に
培養を行なう。この培養は、酵素誘導剤を添加して、ニ
トリルヒドラターゼ酵素が誘導される条件で行なわれる
。酵素誘導剤としては、例えば、プロピオニトリル、イ
ンブチロニトリル、プロピオンアミドおよびインブチル
アミド（特願昭６７−　／ワタフタ０号）ならびにアク
リルアミド、メタクリルアミド、クロトンアミドおよび
ｎ−ブチルアミド（同時提出特許願（２））などが挙げ
られる（これらの酵素誘導剤は、培養中にその濃度が通
常／３．１９　／　Ｕットル未満、好筺しくはｉｏｉ／
リットル以下、となるように添加すれば効果的である）
。培地のｐＨはｔ〜り程度、好１しくは７〜ｒ程度、培
養温度はπ〜、？７℃程度、好１しくは２Ｊ〜３０℃程
度、培養時間は１〜３日程度で充分である。

実験例 実施例／ （１）菌の培養 下記の前培養条件で生育させた菌（シー−トモナス・ク
ロロラフイスＢ２３（微工研条寄第１♂７号））、２Ｖ
！を、下記の本培養条件で培養して、アクリルアミド生
成活性を調べた。

（１）前培養条件 ＭＹ培地（ペプトンｓＥ／リットル、酵母エキス３！ｑ
／リツトル、麦芽エキス３，９／リツトル、グルコース
ｓｉ／リットル、ｐＨ７，乙）、培養温度２ｇ”Ｃ１培
養時間ｉｓ時間、ｓｏｏｍ！、坂ロフラスコ（実容量１
００ｍ１）使用 （２）本培養条件 培地（シュクロース　ｔｏｌ／リットル、ＫＨ２ＰＯＩ
ＩＯ，ｊ／ｉ／リットル、Ｋ２ＨＰＯＩＩＯ１ｊ　、！
９　／リットル、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２０ｒｎｇ−／
リットル、α−ｙｔ）酸２．９　／　Ｉ）ットル）、イ
ンブチロニトリル　タｍｌ／リットル）、ｐＨ７，６、
培養温度、：）、３’Ｃ，Ｘ　夕θＯｍｌ坂口フラスコ
（実容量１００ｍ１）使用。

（２）　ヒドラターゼ活性の測定 アクリロニトリル水和によるアクリルアミド生成のヒド
ラターゼ活性は、培養液／ｍｌと’／ｌｏ　Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７ｊ））≠ｍｌとを混合し、これにさらに’
／１０　Ｍリン酸緩衝液（ＰＨｑ、ｏ　）　ｒｍｌを加
えて、７０℃でＩＯ分間反応させ、菌体を沢別してから
、ガスクロマトグラフィーでアクリルアミド（ＡＡ）を
定量することによって行なった。

活性は、比活性（ＳＡ）および全活性（ＴＡ）について
調べた。これらは、下記の通りに定義される。

ＳＡ：μモルＡＡ／ダー菌体／分 ＴＡ二μモルＡ　Ａ　／　ｔｎｌ−培地／分結果は、第
１表に示す通りであった。なお、活性は、得られた最高
活性の値で示した。

第１表 アミノ酸　培養時　菌体濃度＊２　活　性ＤＬ−Ａｌａ
　１１２　３，０１１　＋２３．Ｊ７　７０．Ａ２Ｌ−
Ｖａｌ　ＩＩ　３，０７　２３．３タ　７／ＪＩＬ−Ｍ
ｅｔ　３１　２．０１１　３６１３　７＋２，４１１Ｌ
−Ａｓｐ　３６　’１．’ｌｒ　ＩＡ、ｒｌ　７Ｊ’、
２ｒＬ−Ｌｙｅ　’ＩＩ　＋２．＋２１　２１１３！　
３９９７Ｌ−Ｐｈｅ　１１２　２、り０．２♂、／タ　
ｇｉ３ｊ′Ｌ−Ｐｒｏ　３１　ｊ、／ノ　２３，７２　
ｆ／、７ＹＬ−Ｔｒｐ　グー　２．／ｌ　２３，２Ａ　
！０，２１ＩＬ−Ｌｅｕ　３タ　３．／ｌ　／ｊｔ、ざ
ＩＩ　ｊＴＯ，ＯＳ；Ｌ−１１ｅ　３２　３，２♂　／
’１．１０　’ｌｔ、２ｊＬ−Ｇｌｕ　２乙　３．３ｔ
　２３，０６　７７、ｌＩ３Ｌ−Ａｒｇ　２Ａ　３．！
’！　／７．りθ　１，３．３７Ｌ−Ｈｉａ　３＋２３
，０１１　／７．Ｏ！　！／、７７Ｌ−Ｔｙｒ　ｊＪ　
、２．／／　、２３．０６　’Ｉ１．ＡＡ（Ｌ−Ｃｙｓ
　３２　２．’ｌ’ｌ　２Ａ、０１　Ａ３．Ａす（Ｌ−
ＣｙａＳ　３０　．２．ｌＩＩ　３１１．ｑ７　７３．
７＆）−＊５　１１２　１．１０　＋２２．２２　グ０
．００＊ｌ　Ａｌａ：アラニン Ｖａｌ：バリン Ｍｅｔ：メチオニン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ：　リジン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏニブロリン Ｔｒｐ：　）リプトフ７ン Ｌｅｕ：ロイシン １１ｅニイソロイシン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ａｒｇ：アルギニン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｔｙｒ：チロシン Ｃｙｓニジスティン ＣｙａＳ：ビスチン ＊２乾保菌体基準 ＊５アミノ酸無添加 実施例λ 実施例／で特に有効であったα−アミノ酸トシステイン
とを組合せて実施例１と同じ培養を行なった。たたし、
α−アミノ酸およびシスティンはそれぞれ、２ｇ　／　
リットルの濃度でｍ−た。なお、活性は、得られた最高
活性の値で示した。

第、２表 ＤＬ−Ａｌａ　３／　３．！Ｉ　２７．３！　タフ、り
／Ｌ−Ｖａｌ　３／　３，３１１　２７．３Ｙ　５Ｐ／
、４ｔＩＬ−Ｍｅｔ　３７　３．５２　＋２１１ＪＩＩ
　ＩＡ、７３Ｌ−Ａｓｐ　３／　ｊ、ｌＩＩ　ＩＡ、９
’ｌ　９２Ｊ３Ｌ−Ｐｈａ　３／　３．１０　３０．７
／　タ！１．２ＯＬ−Ｐｒｏ　ｊ／　３．ｊｒ　２り、
Ｏタ　１ｏ１１．１ｉｉＬ−Ｇｌｕ　３／　ＩＩ、Ｏ！
　＋２９３３　１０３ＡｌＯ−＊　３２　２．１１１１
　．２ｔ、（Ｈｔｊ、ｔ’ｌ＊Ｌ−システィンのみ 実施例３ 実施例コで有効であったＣｙａ−Ｇｌｕの組合せにいく
つかのα−アミノ酸を組合せて、芙力吊例コと同じ培養
を行なった。ただし、システィン、グルタミン酸および
α−アミノ酸は、それぞれ、２ＩＩ／リツトルの濃度で
用いた。なお、活性は、得られた最高活性の値で示した
。

第３表 Ｌ−Ｐｈｅ　３３　ｊ、１１．２　２！、１１　／４１
０．３Ｌ−Ｐｒｏ’　３／　６，０！　２！、１１　／
Ｓ；７．１１Ｌ−Ａｓｐ　３３　９１’ｌ　、２０．Ｉ
Ｊ　／２０．ＡＤＬ−Ａｌａ　３３　Ａ、０２　＋２．
２．ｊ／　／３ｊｊ−＊　３／　グ、０３　．２！、Ｊ
３　１０３．ＩＩ＊Ｌ−システィン＋Ｌ−グルタミン酸
のみ手続補正書 昭和５９年２月ｌψ［」 昭和５８年　特許願　第１９１６３６号３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 山　１）　秀　明 （ほか１名） ４、代理人　（郵便番号１００） 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ　シー−トモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）　属
   に属してニトリルヒドラターゼを産生ずる能力を有する
   細菌をニトリルヒドラターゼ酵素が誘導される条件で培
   養してニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する細菌菌体
   を製造するに際し、培地中に少なくとも一種のα−アミ
   ノ酸（ただし、システィンおよびシスチンのそれぞれ単
   用およびこれら両者のみの併用を除く）を存在させるこ
   とを特徴とする、シー−トモナス属細菌の培養方法。 ２培地中のα−アミノ酸の濃度が０．／〜ｔｏｅ／リッ
   トルである、特許請求の範囲第１項記載の培養方法。 ゼを産生ずる能力を有する細菌がシー−トモナス・り０
   ０ラフイスＢ　、ＺＪ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈ
   ｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　Ｂ２３）微工研条寄第１ざ７号
   またはシュードモナスｇｐ、　ＰＳ　／　（Ｐｇｅｕｄ
   ｏｍｏｎａｓ　ｓｐ。 久　α−アミノ酸が、アラニン、バリン、メチオニン、
   アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、フロリン
   、ドリフトファン、ロイシン、インロイシン、グルタミ
   ン酸、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、システィン
   およびシスチンからなる群から選ばれる（ただし、シス
   ティンおよびシスチンの単用およびこれら両者のみの併
   用を除く）、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか７項
   に記載の培養方法。