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KR0131276B1 - 니트릴 하이드라타제를 생성하는 신규한 균주-로도코커스 로도코러스 - Google Patents

니트릴 하이드라타제를 생성하는 신규한 균주-로도코커스 로도코러스

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Publication number
KR0131276B1
KR0131276B1 KR1019940012239A KR19940012239A KR0131276B1 KR 0131276 B1 KR0131276 B1 KR 0131276B1 KR 1019940012239 A KR1019940012239 A KR 1019940012239A KR 19940012239 A KR19940012239 A KR 19940012239A KR 0131276 B1 KR0131276 B1 KR 0131276B1
Authority
KR
South Korea
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strain
nitrile hydratase
activity
medium
units
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Expired - Lifetime
Application number
KR1019940012239A
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English (en)
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KR950018447A (ko
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스테파노피치 야넨코 알렉산드라
보리소브나 아스타우로바 올가
페트로비치 보로닌 세르게이
바실리에브나 게르아시모바 타티야나
보리소비치 키르사노브 니콜라이
니콜라에비치 파우코브 블라디미르
니콜라에브나 폴야코바 인가
지오르기에비치 데바보브 블라디미르
Original Assignee
비타리 그리고리비치 파라스케보브
고스다르스트베니 나우체노-이쩰도바텔스키 인스티튜트 제네티키 아이 셀렉트시프로미셀렌니흐 미코로오르가니즈모브(기니젠네티카)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 니트릴 하이드라타제 활성이 높고, 지방족 및 방향족 니트릴을 이에 상응하는 아미드로 수화시킬 수 있는 신규한 균주 로도코커스 로도코러스를 제공한다.

Description

니트릴 하이드라타제를 생성하는 신규한 균주 - 로도코커스 로도코러스
본 발명은 생물공학에 관계하고, 니트릴 하이드라타제 활성이 높아서, 니트릴로부터 아미드를 생산하는데에 이용될 수 있는 신규한 박테리아 균주에 관한 것이다.
니트릴 하이드라타제(nitrile hydratase) 효소는 니트릴에서 아미드로의 전환을 촉진시키는 효소로서, 다수의 박테리아 균주에서 감지된다.
박테리아 배양과정에서 니트릴 하이드라타제를 생성시키기 위해서는 영양배지에 유도물질(inducer)을 주입시킬 필요가 있다. 이러한 유도물질로서, 니트릴, 유기산, 아미드(미국특허 제4,555,487호, 유럽특허 제0,109,083호, 유럽특허 제 0,204,555호), 요소 또는 이의 유도체(유럽특허 제 0,362,829호) 등이 이용될 수 있다.
또한, 유도물질을 요구하지 않는 균주들로는 코리네박테리아속 균주 N774(미국특허 제 4,248,968호)와 로도코커스속 균주 S-6(미국특허 제 5,179,014)가 공지되어 있다. 그러나, 균주 N774는 니트릴 하이드라타제 활성이 너무 낮고(비활성 (specific activity): 50-60units/mg, 아크릴아미드 μmol/분/세포건중량 mg 으로 측정될 수 있다), 기질인 니트릴의 범위가 좁으며 (기질로서 지방족 니트릴만 사용할 수 있다), 효소의 열안정성이 낮다(N774의 적정온도는 35℃이다)는 단점이 있다. 균주 S-6은 생성된 아미드를 산으로 가수분해시키는 활성을 갖고 있어 아미드의 생성량을 급격히 감소시키는 단점이 있다. 또한 균주 S-6니트릴 하이드라타제의 온도 안정성이 낮고(30℃ 이하), 생산성(productivity)이 낮은(용액 중에 아크릴아미드를 20% 이하로 축적한다) 단점이 있다. 또한 두 균주 N774와 S-6을 배양하기 위해서는 값비싼 영양배지 성분이 이용된다(펩톤, 이스트(yeast) 추출물, 육즙(meat extract)).
얻은 결과 및 기술적 본질의 관점에서, 본 발명에 가장 근접한 균주는 로도코커스속 균주 Jl(유럽특허 제 0,362,829호) 균주로서 지방족 및 방향족 니트릴에 대해 니트릴 하이드라타제 활성을 갖고 잇다. 그러나, 이 균주를 배양하기 위해서는 비타민, 이스트 추출물 및 펩톤을 함유한 영양배지를 사용해야만 하는 단점이 있다.
또한, 균주 Jl은 높은 니트릴 하이드라타제 활성을 얻기 위해서는, 유도물질로서 고농도의 요소(7.5-12g/ℓ)를 요구한다는 단점이 있다. 따라서, 이 균주를 요소를 함유하지 않은 배지에서 배양하는 경우, 니트릴 하이드라타제 비활성은 3.35units/mg 정도이다.(총활성:17.7units/㎖, 아크릴아미드 μmol/분/배양액체㎖로 측정될 수 있다). 7.5g/ℓ의 요소를 함유한 배지를 사용하는 경우, 비활성은 497units/mg이고, 총활성은 2480units/㎖이다. 이로부터 요소는 니트릴 하이드라타제의 유도물질로서, 그리고 질소원으로서 이용되어 두가지 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 균주의 성장에는 요소의 함량이 2g/ℓ 이하이면 충분하고(이때, 균주 Jl의 니트릴 하이드라타제 비활성은 36.5units/mg이고, 총활성은 189units/㎖이다), 고농도의 요소는 유도작용(induction)에 필요할 뿐이다. 따라서, 균주 Jl의 배양 후에, 배지에는 거의 대부분의 요소가 남게된다.
따라서, 본 발명의 목적은, 비타민, 아미노산 또는 니트릴 하이드라타제의 합성의 유도물질로서 작용하는 다른 화합물들(니트릴, 아미드 또는 요소)을 함유하지 않은 단순한 합성배지에서 배양하는 동안에, 높은 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 균주를 제공하는 것이다.
상기한 목적은 유도물질 없이, 지방족 니트릴, 예를 들면 아클리로니트릴과 방향족 니트릴, 예를 들며 3-시아노피리딘을, 이에 상응하는 아미드, 예를 들면 아크릴아미드와 니코틴아미드로 수화시키는 반응을 촉진하는 니트릴 하이드라타제를 생성할 수 있는 로도코커스 로도코러스 균주 M33을 개발함으로써 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 균주는 요소를 함유하지 않은 배지에서는 비활성 200-457units/mg 및 총활성 360-350units/㎖(탄소원에 따라서 달라짐)의 니트릴 하이드라타제를 생성하며; 2g/ℓ의 요소를 함유한 배지에서는, 비활성 180units/mg 및 총활성 1368units/㎖의 니트릴 하이드라타제를 생성한다. 균주 M33의 특징은 아미다제(amidase)활성이 완전히 없다는 것이다. 아미다제는 생성된 아미드를 이에 상응하는 산으로, 예를 들면 아크릴아미드를 아크릴산으로 가수분해시키는 반응을 촉진하는 효소이며, 따라서 아미드의 생성량에 심각한 악영향을 미친다.
본 발명에 의해 제공되는 균주는 탄소원으로서 피루베이트(pyruvate), 아세테이트 또는 글루코스를 0.1-4%의 농도로 함유하고, 질소원으로서 암모니움, 질산염 또는 요소를 0.4-2%의 농도로 함유하는 단순 합성배지에서 성장할 수 있다. 균주 M33은 성장에 비타민, 아미노산, 이스트추출물을 요구하지 않는다.
로도코커스 로도코러스 균주 M33은, 로도코커스 로도코러스 균주 M8(RF 특허 제 1731814호)로부터, 1단계에서는 클로로아세트아미드, 2단계에서는 아세트아미를 함유한 선택성 배지를 이용하여 두 단계의 직접 선택(direct selection)에 의해 수득할 수 있다.
보다 구체적으로, 균주 M8로부터 균주 M33을 얻는 방법을 설명하면,
1단계 : 균주M8을, K2HPO40.5g/ℓ; KH2PO40.6g/ℓ; MgSO40.5g/ℓ; FeSO40.005g/ℓ;C0Cl20.01g/ℓ;피루브산나트룸 5g/ℓ;아세트아미드 1g/ℓ를 함유한 배지에서, 30℃에서 48시간동안 선배양하여 얻은 배양액 0.1㎖를, 아세트아미드 대신에 클로로아세트아미드 1g/ℓ를 함유한 것을 제외하고는 동일한 조성의 배지를 가진 플레이트에 분무하였다. 30℃에서 3-4일간 배양하여 얻은 콜로니들 중에서, 니트릴 하이드라타제 활성을 잃어버린 클론을 발견하였다.
2단계 ; 니트릴 하이드라타제 활성이 없는 클론을, K2HPO40.5g/ℓ; KH2PO40.6g/ℓ; MgSO40.5g/ℓ; FeSO40.005g/ℓ; CoCl20.01g/ℓ; 피루브산나트륨 5g/ℓ; NH4Cl 1g/ℓ를 함유한 배지에서, 30℃에서 48시간동안 선배양하여 얻은 배양액 0.1㎖를, NH4Cl 대신에 아세트아미드 1g/ℓ 함유한 것을 제외하고는 동일한 조성의 배지를 가진 플레이트에 분무하였다. 30℃에서 3-4일간 배양하여 얻은 콜로니들 중에서, 니트릴 하이드라타제 활성이 높은 클론을 M33이라 명명하였다.
본 발명에 의해 제공되는 신균한 균주 M33은 니트릴, 아미드 또는 요소 등의 유도물질을 함유하지 않는 배지에서 니트릴 하이드라타제를 생성할 수 있다(표 1).
표 1에서 보는 바와 같이, 균주 M33을 요소를 함유하지 않은 영양배지에서 배양하는 경우, 니트릴 하이드라타제 비활성은 457units/mg이었다. 동일 조건에서, 모균주 M8을 배양하는 경우, 니트릴 하이드라타제 비활성은 8units/mg이었다. 참고로 비교하자면, 요소를 함유하지 않은 배지에서 균주 Jl을 배양하는 경우, 니트릴 하이드라타제 비활성은 3.4units/mg이었다.(유럽특허 제 0,362,829호, 미국특허 제 5,089,411호) 따라서, 균주 Jl과 모균주인 M8과는 달리, 균주 M33은 유도물질을 함유하지 않은 배지에서도 니트릴 하이드라타제를 생성할 수 있으며, 아미다제 활성은 20배정도 적다.
균주 M33는 러시아 균주센터에 VKM Ac-1515D로 기탁되었고, 배양-형태학적-생리학적-생화학적 특성은 다음과 같다.
형태학적 특성:
균주 M33의 세포는 비운동성이고, 그람양성이다. 포자는 생성되지 않으며, 산에 내성이 있다. 18-20시간이 경과하면, 세포는 길고(20㎛) 약간 분지쇄의 필라멘트를 형성하고, 48-72시간 후에는 짧은 막대모양으로 분절되어 구균이 된다.
배양상 특성:
글루코스와 이스트 추출물을 함유한 한천배지에서 48시간동안 배양하면, 균주 M33은 옅은 분홍색에서 분홍-오렌지색을 띠는 직경 1㎜의 둥근 콜로니를 만든다. 육즙-펩톤 브로스에서 배양하는 경우, 필름이나 앙금 등이 형성된다. 이 Litmus 밀크에서는 변화가 없다.
생리학적인 특징:
균주는 절대 호기성이고, 질산염을 환원시킨다. MR 및 VP 테스트에서 음성이다. 균주는 황화수소(hydrogen sulfide)를 생성하며, 옥시다제-음성, 카탈라제와 포스파라제-양성이다. 균주는 전분과 셀룰로오스는 가수분해시키지 못하나, 트윈 60과 80은 가수분해시킨다. 세포는 탈지분유, 72℃에서의 15분간 가열에 대하여 내성이 없다. 균주는 pH 6-9에서, 온도 -5∼45℃에서 성장가능하다. 다음의 당과 알콜로부터 산을 생성한다. : 글루코스, 프락토스, 말토스, 사카로스, 솔비톨, 만니톨 및 글리세롤. 단일 당에서는 가스가 발생하지 않는다. 질소원으로서, 암모니움, 질산염 및 요소가 이용된다. 탄소원으로서, 말토스, 만니톨, 솔비툴, 글루코스, 글리세롤, 락테이트, 피루베이트, 벤조에이트, p-/m-히드록시벤조에이트, 티로진(tyrozin)이 이용되고; 람노스(rhamnose), 갈락토스, 이노시톨, α-케토글루타르산염은 이용되지 않는다.
생화학적 분석 결과에 의하면, 균주 M33의 세포벽은, 메조-디아미노피멜린산(meso-diaminopimelic acid), 아리비노스 및 갈락토스로 구성되어 있었고, 이는 IV형 세포벽을 갖는 코리네폼 박테리아의 특성이다. 또한 세포들은 로도코커스의 특성인 지질 A(LCH)로 구성된다.
따라서, 균주 M33은 코리네폼 박테리아의 일반적인 특성을 갖고 있다. 전술한 특성들과 Bergy's Manual of Systematic Bacteriology에 따르면, 균주 M33은 로도코커스속 로도코러스종에 관련되어 잇다.
균주 M33을 영양배지에서, 25-30℃에서 24-72시간 동안 배양하여, 높은 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 M33 세포를 얻는다.
세포 배양액을 원심분리한 후 이어서 10mM의 인산염 완충액에 세포를 재현탁시켜서 얻은 세포 현탁액을 니트릴을 아미드로 전환시키는데 이용한다.
이러한 방법으로 수득한 세포들은 높은 니트릴 하이드라타제 활성을 갖고 있으며, 광법위한 온도 4-50℃, pH 3-10에서, 지방족 및 방향족 니트릴로부터 이에 상응하는 아미드로의 수화반응을 촉진할 수 있다.
니트릴 하이드라타제 활성은 다음과 같은 방법으로 측정한다. 10mM의 인산염 완충액(pH7.6)중의 2% 니트릴 용액 1㎖를 세포건중량 0.04mg을 포함하는 세포현탁액 1㎖와 혼합한다. 반응은 20℃에서 5분간 실시하고, 진한 염산 20㎖를 첨가하여 반응을 중단시킨다. 생성된 아미드의 농도는 가스크로마토그래피로 결정한다.
니트릴 하이드라타제 활성은 다음의 units으로 표현된다.
1 units은 , 전술한 조건에서 니틀릴로부터 아미들를 1μmol/분의 속도로 생성하는데 요구되는 효소의 양으로서 정의한다.
비활성(specific activity)은 아미드 μmol/분세포건중량 mg 또는 units/mg으로 나타낸다
전체 활성(total activity)은 아미드 μmol/분/배양액 ㎖, 또는 units/㎖로 나타낸다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
균주 M33의 세포들을 질소원으로서 질산나트륨을 함유한 영양배지에서 요소가 없는 조건에서 배양하였다.
균주 M33을 하기의 조성으로된 배지에서 30℃에서 48시간동안 선배양하여 얻은 배양액 5㎖를, 동일 조성의 영양배지 150㎖를 포함하는 Erlenmeyer 플라스크(750㎖)에 넣었다.
플라스크는 48시간동안 30℃에서 교반기상에서 배양하였다. 세포들의 니트릴 하이드라타제 활성은 기질로서 아크릴로니트릴을 이용하여 결정하였다. 균주 M33에서 니트릴 하이드라타제 비활성은 200units/mg이었고, 총활성은 360units/㎖이었다.
또한, 요소를 함유하지 않은 배지에 배양된 균주 M33의 비활성은, 균주 Jl의 활성에 비해 60배 이상이다. 이때, 균주 M33을 배양하는데에 배지 성분들-글루코스와 질산나트륨-은 시판되고 있는 것을 사용하였다.
[실시예 2]
균주 M33을, 실시예 1에서의 배지에서, 글루코스를 20g/ℓ의 동량으로, 질산나트륨 대신에 요소를 2g/ℓ의 양으로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조성의 배지에서 30℃에서 48시간동안 선배양하여 얻은 배양액 5㎖를, 동일 조성의 영양배지 150㎖를 포함하는 Erlenmeyer 플라스크(750㎖)에 첨가한 후 30℃에서 48시간동안 교반기상에서 배양하였다. 니트릴 하이드라타제 활성은 기질로서 아크릴로 니트릴을 이용하여 결정하였다. 세포수득량은 7.6g/ℓ이었고, 비활성은 180units/mg, 총활성은 1386units/㎖이었다.
[실시예 3]
균주 M33을 실시예 1에서와 동일하게 배양하였다.
세포들은 원심분리에 의해 분리시킨 후, 10mM의 인산염 완충액으로 세척하고, 다시 10mM의 인산염 완충액에 재현탁시켰다. 반응은 기질로서 다양한 니트릴을 이용하여 표준조건에서 실시하였다. 반응을 진한 염산을 첨가하여 중단시킨 후 생성된 아미드의 농도를 가스크로마토그래피로 결정하였다.
위의 표로부터 명백하게 알수 있는 바와 같이, 균주 M33은 지방족과 방향족 니트릴 모두의 수화반응을 촉진시킬 수 있다.
[실시예 4]
균주 M33을 실시예 1에서와 동일하게 배양하였다. 증류수(pH7.6) 40㎖를 포함한 100㎖ 플라스크에, M33 균체와 3-시아노피리딘을 각각 농도가 0.5mg/㎖, 8%가 될 때까지 첨가하였다. 플라스크는 30℃에서 혼합 배양시켰다. 60분 후에, 10%의 니코틴아미드 용액을 수득하였다. 니코틴산과 3-시아노피리딘은 반응혼합물에 존재하지 않았다.
[실시예 5]
증류수(pH7.6) 400㎖을, 기계적인 교반기가 장착되어 있고 온도가 12-20℃의 범위로 조절되어 있는 1.5ℓ의 철강 반응기에 넣었다. 실시예 1에서와 동일하게 배양하여 얻은 로도코커스 로도코러스 M33 균체 272mg(건중량)을 증류수에 재현탁시켰다. 그런 다음, 순수 아크릴로니트릴을, 그의 용액중의 농도가 2%를 초과하지 않는 속도로, 반응 혼합물에 첨가하였다. 용액의 조성에 대한 정량 및 정성 분석은 기체 액상 크로마토그래피로 실시하였다. 아크릴로니트리은 총 173g이 반응기에 들어갔다. 8시간 후에, 46%(중량/용적)의 아크릴아미드 용액을 수득하였다. 아크릴아미드의 수율은 99%에 가깝다. 부산물로서 아크릴로니트릴과 아크릴산은 검출되지 않았다.
따라서, 본 발명에 의해 제공되는 신규한 균주 M33은 높은 니트릴 하이드라타제 활성을 갖고 있으며, 지방족 및 방향족 니트릴을 이에 상응하는 아미드로 수화시킬수 있다. 공지된 균주들과는 달리, 돌연변이주 M33은 니트릴 하이드라타제 합성의 유도물질을 함유하지 않은 배지에서 배양하여도 니트릴 하이드라타제를 생성할 수 있다. 이로써, 세포배양 배지로서, 비타민을 함유하지 않고, 탄소원으로서 포도당을, 질소원으로서 질산나트륨(또는 칼륨)을 함유한 배지를 이용하는 것이 가능하다. 또한 이 배지는 니트릴 하이드라타제의 유도물질로서 특정한 화합물들(아미드, 니트릴 또느 고농도의 요소)을 함유하지 않는다. 균주 M33의 또다른 장점은 아미다제 활성이 전혀 없기 때문에, 니틀릴의 촉매전환과정에서 아미드로부터 산을 생성하는 것을 방지할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 로도코커스 로도코러스 균주 M33은 니트릴 하이드라타제를 생산하는 균주로서 유용하며, 니트릴로부터 지방족 및 방향족 아미드를 생산하는데에 이용될 수 있다.

Claims (1)

  1. 니트릴 하이드라타제(nitrile hydratase)를 생성하는 신규한 균주 로도코커스 로도코러스 M33(VKM Ac-1515D).
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