DE2223340B2 - Verfahren zur stabilisierung von glucose-isomerase in bakterienzellen - Google Patents
Verfahren zur stabilisierung von glucose-isomerase in bakterienzellenInfo
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Description
25
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung der Glucose-Isomerase-Aktivität, die in Bakterienzellen
enthalten ist, durch Behandlung der Bakterienzellen mit Glutaraldehyd. Das entstehende stabilisierte
Enzym kann zur Umwandlung von Glucose in Fructose verwendet werden und dann erneut für weitere
Umwandlungen verwendet werden, wobei nach jeder Verwendung eine minimale Verringerung der Enzymaktivität
eintritt.
Es ist bekannt, daß ein Glucose-Isomerase-Enzym
verwendet werden kann, um die Umwandlung von Glucose (Dextrose) in Fructose (Lävulose), die eine
höhere Süßkraft besitzt als das Ausgangsmaterial, zu katalysieren. Es ist auch bekannt, daß Glucose-Isomerase
erzeugt wird durch Fermentation von Organismen, wie Pseudomonas hydrophila, Streptomyces flavovireus,
Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Streptomyces albus, Streptomyces olivaceus und
ähnlichen in geeigneten Nährmedien. Die Glucose-Iso·
merase wird innerhalb der Bakterienzellen gebildet, die
während ihrer Produktion wachsen. Die Zellen können von der Fermentationsbrühe abfiltriert und direkt als
Quelle für die Glucose-Isomerase verwendet werden. Wahlweise können die Zellen durch Filtration gewonnen
und dann nach bekannten Verfahren zerstört werden. Die entstehenden aufgebrochenen Zellen und
der freigesetzte Inhalt können ebenfalls als Quelle zur Glucose-Isomerase verwendet werden. Ferner können
die Zellen aufgestoßen und die Zelltrümmer durch Zentrifugieren entfernt werden. Die überstehende
Flüssigkeit kann direkt als Quelle für Glucose-Isomerase verwendet werden, oder das Enzym kann von dieser
Flüssigkeit nach bekannten Verfahren als Pulver gewonnen werden.
Die nach all diesen bekannten Verfahren gebildete Glucose-Isomerase war für kommerzielle Zwecke nicht
geeignet wegen der hohen Anwendungskosten des Enzyms. Die Kosten für die Enzymproduktion waren
hoch wegen der aufwendigen Nährmedien, die notwendig
waren, und der verhältnismäßig geringen Enzymausbeute verglichen mit der Produktion anderer Enzyme.
Es ist daher notwendig, das Glucose-Isomerase nach der Verwendung zurückgewonnen und erneut für andere
Umwandlungen von Glucose in Fructose verwendet werden kann.
Die Glucose-Isomerase kann besonders leicht zurückgewonnen und erneut verwendet werden, wenn sie noch
in den ursprünglichen Bakterienzellen enthalten ist. Die Bakterienzellen können leicht von dem zuckerhaltigen
Reaktionsmedium abgetrennt werden. Nach den bekannten Verfahren war jedoch eine lohnende Wiederverwendung
der Bakterienzellen nicht möglich, da die Zellen ungefähr 50% ihrer Glucose-Isomerase-Aktivität
während jeder Verwendung verloren.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung
von Glucose-Isomerase in Bakterienzellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Bakterienzellen,
die Glucose-Isomerase-Aktivität enthalten, mit Glutaraldehyd behandelt.
Die Bakterienzellen, die Glucose-Isomerase-Aktivität
enthalten* und für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, können nach bekannten Verfahren
gebildet werden. Die bevorzugten enzymhaltigen Zellen werden erzeugt durch Züchtung unter submersen
aeroben Bedingungen einer Kultur von Streptomyces olivaceus NRRL 3583 oder dessen Mutanten in einem
Medium enthaltend geeignete Nährstoffe. Die entstehenden Bakterienzellen werden von der Fermentationsbrühe abfiltriert oder abzentrifugiert.
Die so gewonnenen Bakterienzellen werden dann in einem wäßrigen Medium suspendiert und mit Glutaraldehyd
vermischt. Der Glutaraldehyd wird in einer Menge von ungefähr 0,1 bis ungefähr 50 Gewichtsprozent,
bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, verwendet. Vorzugsweise wird der Glutaraldehyd in
einer Menge von ungefähr 10 bis ungefähr 50 Gewichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht der
Zellen, verwendet. Die Bakterienzellen besitzen anfangs
einen pH-Wert von ungefähr 8,5. Wenn die Bakterienzellen
mit dem Glutaraldehyd behandelt werden, sinkt der pH-Wert unter Umständen auf ungefähr 6,5. Wenn
der Anfangs-pH-Wert oberhalb von 8,5 liegt oder wenn der pH-Wert während der Behandlung auf weniger als
6,5 sinkt, sollten geeignete Puffersubstanzen zugesetzt werden, um den pH-Wert der Bakterienzellen im
Bereich von ungefähr 6,5 bis ungefähr 8,5 zu halten.
Die Bakterienzellen sollten ungefähr eine halbe bis ungefähr 2 Stunden mit dem Glutaraldehyd behandelt
werden. Die bevorzugte Behandlungsdauer beträgt ungefähr 1 bis ungefähr 11/2 Stunden.
Die Behandlungstemperatur ist nicht in engen Grenzen kritisch und kann günstigerweise von ungefähr
15 bis ungefähr 60° C betragen. Die Glucose-Isomerase-Aktivität der Ausgangsbakterienzellen und des mit
Glutaraldehyd behandelten Materials wurden nach folgendem Verfahren bestimmt.
Es wurde eine 62,5°/oige (Gew/Vol.) wäßrige Lösung
von Glucose hergestellt, indem man unter Rühren langsam 625 g wasserfreie Glucose zu 300 ml heißem
destilliertem Wasser zugab. Die Lösung wurde auf Zimmertemperatur abgekühlt, und hierzu wurden
125 ml Im wäßrige Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
vom pH-Wert 8,5, 125 ml Im wäßrige Lösung von Magnesiumsulfat und 50 ml 0,025m wäßrige
Lösung von Kobaltchlorid zugesetzt Das entstehende Gemisch wurde dann mit destilliertem Wasser auf 11
verdünnt
10 ml der oben angegebenen Glucoselösung wurden in einen 25-ml-Meßkolben gegeben. Es wurde eine
ausreichende Menge des zu untersuchenden Enzyms
zugegeben, um zu einer Reduktion der spezifischen Rotation von ungefähr 2,9 bis ungefähr 7,5° zu kommen,
wie später beschrieben wird. Der Kolbeninhalt wurde dann mit destilliertem Wasser auf 25 ml verdünnt, und
das entstehende Gemisch wurde 2 h bei 60° C stehengelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zusatz
von 1 ml einer 0,5m wäßrigen Lösung von Perchlorsäure abgebrochen. Das Gemisch wurde dann mit
15000UpM 20 min zentrifugiert, und die optische
Drehung (in Grad) der überstehenden Flüssigkeit wurde durch bekannte Verfahren bestimmt Es wurde eine
Blindprobe auf die gleiche Weise, aber ohne das Enzym, gemacht. Die optische Drehung der Blindprobe wurde
ebenfalls bestimmt. Die spezifische Rotation [<x] |5 der
Probe bzw. der Blindprobe betrug 2<x oder den doppelten Wert der beobachteten optischen Drehung.
Die prozentuale Umwandlung von Glucose in Fructose wurde durch die folgende Formel berechnet:
Prozentuale_ Q] Blindprobe - !»robe
dl"
Jn,,
Die Enzymaktivität in Glucose-Isomerase-Einheiten (GIE) der untersuchten Enzymprobe wurde nach der
folgenden Formel berechnet:
|xg gebildete Fructose
mg oder ml verwendetes Enzym
mg oder ml verwendetes Enzym
CrFt/1
wobei die μ% gebildete Fructose durch Multiplikation
des oben berechneten Wertes für die prozentuale Glucose-Umwandlung mit dem Faktor 6,25 · IO6 berechnet
wurden. Eine Glucose-Isomerase-Einheit ist die Menge an Enzym, die 1 μ Mol Glucose pro Minute unter
den Versuchsbedingungen in Fructose umwandelt. 3$
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Eine Kultur von Streptomyces olivaceus NRRL 3583 wurde unter Rühren in ein Fermentationsgefäß
gegeben, das 101 eines wäßrigen Gemisches mit 0,7% Xylose, 0,3% raffinierte Maisstärke, 1,0% Peptone,
0,5% Fleischextrakt, 0,25% Hefeextrakt, 0,50% Natriumchlorid
und 0,05% Magnesiumsulfat und einen pH-Wert von 7,0 enthielt. Alle oben angegebenen
Prozentwerte beziehen sich auf Gew/Vol. Es wurde mit
400 UpM gerührt und Luft mit einer Geschwindigkeit von 3 Volumina Luft pro Volumen des Mediums in
1 Minute durchgeleitet. Die Fermentation wurde 24 h bei 320C fortgesetzt. Die Gärbrühe wurde mit
40000UpM zentrifugiert, um die Bakterienzellen abzutrennen. Ein Anteil der Bakterienzellen wurde
gefroren und lyophilisiert.
3 g der gefriergetrockneten ganzen Zellen wurden in 50 ml wäßrigem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan bei
einem pH-Wert von 8,5 suspendiert und die Suspension unter Rühren mit 0,1 g einer wäßrigen Lösung von 25
Gewichtsprozent Giutaraldehyd (0,83 Gewichtsprozent Giutaraldehyd, bezogen auf das Trockengewicht der
Zellen) unter Rühren bei Raumtemperatur (ungefähr 2O0C) Vh Stunden behandelt. Die behandelten Zellen,
die eine Aktivität von 145GIE/g hauen, wurden abfiltriert und zu einer wäßrigen Lösung von 62,5
Gewichtsprozent Glucose, enthaltend 0,001 Gewichtsprozent Kobaltchlorid und 0,01 Gewichtsprozent
Magnesiumchlorid, zugegeben. Das entstehende Gemisch wurde 2 Stunden bei 70°C umgesetzt, wobei
ungefähr 4,5% Glucose in Fructose umgewandelt wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren von
dem Reaktionsmedium entfernt und das Fructose-Dextrose-Gemisch dekantiert
Die Zellen wurden untersucht, und es zeigte sich, daß
sie die gleiche Glucose-Isomerase-Aktivität besaßen wie vor ihrer Anwendung. Die Zellen wurden dann
erneut verwendet, um eine frische Glucoselösung unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben zu
behandeln, und sie wurden wieder zurückgewonnen und untersucht Dieses Verfahren wurde insgesamt 12mal
wiederholt Danach besaßen die Zellen noch 56% ihrer ursprünglichen Glucose-Isomerase-Aktivität. Die Zellen,
die nicht mit Glutaraldehyd behandelt worden waren, verloren nahezu ihre gesamte Glucose-Isomerase-Aktivität
nach 2maliger Anwendung.
Eine Fermentationsbrühe, enthaltend Streptomyces olivaceus NRRL 3583 Bakterienzellen, wurde auf die in
Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt. Ein Anteil dieser Fermentationsbrühe wurde zentrifugiert, und 3 g
der nassen Bakterienzellen wurden isoliert Diese Zellen wurden dann in 50 ml Wasser suspendiert und mit 0,1 g
einer wäßrigen Lösung von 25 Gewichtsprozent Glutaraldehyd mit einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 bei
Raumtemperatur 1 Stunde behandelt. Die behandelten Zellen, die eine Aktivität von 265GIE/g besaßen,
wurden abfiltriert und wie in Beispiel 1 verwendet, um Glucose in Fructose umzuwandeln. Die Zellen wurden
insgesamt 12mal zurückgewonnen und für frische Glucose verwendet. Die Zellen besaßen danach noch
60,7% ihrer ursprünglichen Glucose-Isomerase-Aktivität.
Eine Fermentationsbrühe, enthaltend Streptomyces olivaceus NRRL 3583 Bakterienzellen, wurde auf die in
Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt. Eine aliquote Menge der gesamten Fermentationsbrühe, enthaltend
3 g ganze Zellen, wurde mit 0,2 g einer wäßrigen Lösung von 25 Gewichtsprozent Glutaraldehyd (1,67 Gewichtsprozent
Glutaraldehyd, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen) unter Rühren bei Raumtemperatur bei
einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 1 Stunde lang vermischt. Die behandelten Zellen, die eine Aktivität von
271 Gl E/g besaßen, wurden abfiltriert und auf die in
Beispiel 1 beschriebene Weise verwendet, um Glucose in Fructose umzuwandeln. Die Zellen wurden zurückgewonnen
und insgesamt 12mal für frische Glucose verwendet. Danach besaßen die Zellen noch 61,6% ihrer
ursprünglichen Glucose-Isomerase-Aktivität.
Eine Fermentationsbrühe, enthaltend Streptomyces olivaceus NRRL 3583 Bakterienzellen, wurde auf die in
Beispiel 1 angegebene Weise hergestellt. Ein aliquoter Anteil der gesamten Fermentationsbrühe, enthaltend
4 g ganze Zellen, wurde mit 0,4 g einer wäßrigen Lösung von 25 Gewichtsprozent Glutaraldehyd (2,5 Gewichtsprozent
Glutaraldehyd, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen) 1 Stunde unter Rühren bei Raumtemperatur
vermischt Der pH-Wert wurde nicht eingestellt Zu Beginn der Reaktion besaß das Zellgemisch einen
pH-Wert von 8,4. Am Ende der Reaktion betrug der pH-Wert 6,8. Die behandelten Zellen, die eine Aktivität
von 387GIE/g besaßen, wurden abfiltriert und zur
Umwandlung von Glucose in Fructose auf die in
Beispiel 1 beschriebene Weise verwendet. Die Zellen wurden zurückgewonnen und insgesamt 15mal für
frische. Glucose verwendet. Die Zellen besaßen danach noch 100% der ursprünglichen Glucose-Isomerase-Aktivität.
Eine Fermentationsbrühe, enthaltend Streptomyces olivaceus NRRL 3583 Bakterienzellen, wurde auf die in
Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt, wobei ein ι ο Fermentationsgefäß von 378,51 verwendet wurde. Die
Fermentationsbrühe besaß eine Gesamtaktivität von 1 350 000 GIE und enthielt 3,18 kg Bakterienzellen,
bezogen auf das Trockengewicht (425GlE/g). Der
pH-Wert der Fennentationsbrühe wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt. 3,18 kg einer
wäßrigen Lösung von 50 Gewichtsprozent Glutaraldehyd, die auf eine Konzentration von 0,5 bis 0,6%
(Gew/Vol.) verdünnt war, wurde zu der Fermentationsbrühe
innerhalb von 30 bis 40 Minuten unter Rühren zugegeben (50 Gewichtsprozent Glutaraldehyd, bezogen
auf das Trockengewicht der Zellen). Das entstehende Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur IV2 Stunden
unter leichtem Rühren umgesetzt 0,5% (Gew/Vol.) Diatomeenerde wurden als Filterhilfe zugesetzt und die
Fermentationsbrühe über einen Rotationsvakuumfilter filtriert. Der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen,
um Reste der Fermentationsbrühe zu entfernen. Die Bakterienzellen besaßen eine Gesamtaktivität von
1 215 000 GIE oder 90% der ursprünglichen Aktivität.
Eine Glucoselösung wurde hergestellt durch Vermischen von 102 kg Glucose in 2081 Wasser (49,2%
Glucose Gew/Vol.). Zu dieser Lösung wurde Kobaltchlorid in einer Menge von 0,001% (Gew/Vol.) und
Magnesiumchlorid in einer Menge von 0,01% (GewV Vol.) zugegeben. Ein Anteil der wie oben hergestellten
mit Glutaraldehyd behandelten Bakterienzellen mit einer Gesamtaktivität von 407 250 GIE wurde ebenfalls
zu der Glucoselösung zugegeben. Das entstehende Gemisch wurde 24 Stunden bei 600C gerührt, wobei der
pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 7,7 bis
7,9 gehalten wurde. Die Bakterienzellen wurden von dem Reaktionsgemisch abfiltriert, das 40,2% Fructose
enthielt. Die gesammelten Bakterienzellen wurden erneut für eine frische Glucoselösung auf die oben
beschriebene Weise verwendet. Dieses Verfahren wurde wiederholt, bis die Bakterienzellen insgesamt
9mal verwendet worden waren. Bei dem 9. Ansatz ergab die Glucose-Isomerase-Aktivität in den Bakterienzellen
38,8% Fructose, was noch eine Wirksamkeit von 96,5%, bezogen auf die ursprüngliche Wirksamkeit, bedeutet.
Es wurden Kulturen von Streptomyces venezuelae ATCC 21 113, Streptomyces oüvochromogenes ATCC
21 114, Streptomyces phaeochromogenes NRRL 3559, Streptomyces ochromogenes NRRL 2120 und Streptomyces
flavovirens NRRL 2685 in dem in Beispiel 1 beschriebenen Medium gezüchtet. Man ließ die Zellen
18 bis 43 Stunden in einem 10-1-Fermentator mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 UpM bei einem pH-Wert
von 7,0 und 3O0C wachsen, wobei ein Volumen Luft pro Volumen des Fermentators in der Minute durchgeleitet
wurde. Die Menge von jeweils ungefähr 101 wurde in 2
Teile geteilt. Die eine Hälfte wurde filtriert und getrocknet. Die andere Hälfte wurde mit 7 Gewichtsprozent
Glutaraldehyd (bezogen auf das Trockengewicht der Zellen) bei einem pH-Wert von 8,2 ungefähr
1 Stunde vermischt. Sie wurde dann filtriert und getrocknet. Jeder Anteil der Zellen wurde auf die
Glucose-Isomerase-Aktivität untersucht. Anteile von jedem Ansatz der Zellen wurden dann mit Anteilen von
30 Gewichtsprozent wäßriger Dextrose-Lösung vermischt und 22 Stunden bei einem pH-Wert von 7,2 auf
6O0C erhitzt. Die Zellen wurden jeweils in einer solchen
Menge verwendet, daß man die gleiche anfängliche Glucose-Isomerase-Aktivität erhielt (ungefähr 4 GIE
pro g Dextrose). Die Zellen wurden dann abfiltriert und mit einem frischen Ansatz Dextrose-Lösung vermischt.
Das entstehende Gemisch wurde dann erneut 22 Stunden bei einem pH-Wert von 7,2 auf 6O0C erhitzt.
Die Zellen wurden wieder abfiltriert. Proben der Zellen wurden nach der 1. und nach der 2. Anwendung zur
Umwandlung von Dextrose in Fructose entnommen, und es wurde die Glucose-Isomerase-Aktivität dieser
Proben gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. Dabei bezeichnet der Ausdruck
»behandelt« die erfindungsgemäß mit Glutaraldehyd behandelten Zellen. Die »prozentuale Aktivität« gibt
den Prozentsatz an Glucose-Isomerase-Aktivität an, die nach der 2. Anwendung noch vorhanden ist, bezogen auf
die Glucose-Isomerase-Aktivität nach der 1. Anwendung.
| 1S Stamm | Prozentuale | Aktivität |
| behandelt | nicht be handelt |
|
| Streptomyces venezuelae 40 ATCC 21 113 |
35.0 | 13.1 |
| Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 114 |
67,0 | 12,5 |
| Streptomyces phaeochromo genes NRRL 23 559 |
58,0 | 13,1 |
| 45 Streptomyces ochromogenes NRRL 2120 |
27,4 | 20,6 |
| Streptomyces flavovirens NRRL 2685 |
27,3 | 143 |
Aus diesen Werten geht hervor, daß die Behandlung mit Glutaraldehyd bei allen Zellen zu einer Stabilisierung
der Glucose-Isomerase-Aktivität führt.
Ein bekanntes in Polyacrylamidgel eingebautes Glucoseisomerase-Enzympräparat (Applied Microbiology,
Bd. 21,1971, S. 588 bis 593) erwies sich bereits nach
einmaliger Anwendung als inaktiv. Im Gegensatz hierzu besitzen erfindungsgemäß stabilisierte Bakterienzellen
nach 12maliger Anwendung etwa 60% ihrer Aktivität {$.
Beispiele 1 bis 3) bzw. nach 15maliger Anwendung noch
100% ihrer Aktivität (s. Beispiel 4).
Claims (4)
1. Verfahren zur Stabilisierung von Glucose-Isomerase in Bakterienzellen, dadurch gekenn- s
zeichnet, daß man Bakterienzellen, die Glucose-Isomerase-Aktivität
enthalten, mit Glutaraldehyd behandelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Glutaraldehyd in einer Menge ι ο
von ungefähr 0,1 bis ungefähr 50 Gewichtsprozent, vorzugsweise ungefähr 10 bis ungefähr 50 Gewichtsprozent,
bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit
Glutaraldehyd bei einem pH-Wert von ungefähr 6,5 bis ungefähr 8,5 durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterienzellen verwendet,
die durch Streptomyces olivaceus gebildet worden sind.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14319471A | 1971-05-13 | 1971-05-13 | |
| US14319471 | 1971-05-13 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2223340A1 DE2223340A1 (de) | 1972-11-23 |
| DE2223340B2 true DE2223340B2 (de) | 1976-02-19 |
| DE2223340C3 DE2223340C3 (de) | 1976-10-07 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2644496A1 (de) * | 1976-06-04 | 1977-12-15 | Roquette Freres | Verfahren zur herstellung von unloeslichen teilchen mit enzymatischer aktivitaet und die dabei erhaltenen teilchen |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2644496A1 (de) * | 1976-06-04 | 1977-12-15 | Roquette Freres | Verfahren zur herstellung von unloeslichen teilchen mit enzymatischer aktivitaet und die dabei erhaltenen teilchen |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO135424B (de) | 1976-12-27 |
| IL38923A (en) | 1974-10-22 |
| BR7202502D0 (pt) | 1973-05-24 |
| BE783410A (fr) | 1972-09-01 |
| FR2137869B1 (de) | 1974-07-26 |
| US3779869A (en) | 1973-12-18 |
| IT1046202B (it) | 1980-06-30 |
| NL155887B (nl) | 1978-02-15 |
| DE2223340A1 (de) | 1972-11-23 |
| AU3981372A (en) | 1973-05-10 |
| FR2137869A1 (de) | 1972-12-29 |
| NL7205718A (de) | 1972-11-15 |
| NO135424C (de) | 1977-04-05 |
| CA978113A (en) | 1975-11-18 |
| GB1376983A (en) | 1974-12-11 |
| DK130652B (de) | 1975-03-17 |
| DK130652C (da) | 1978-11-13 |
| JPS5622514B1 (de) | 1981-05-26 |
| LU65327A1 (de) | 1972-08-23 |
| IL38923A0 (en) | 1972-09-28 |
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